KR20040090400A

KR20040090400A - ｅＮＯＳ 발현에 기인하는 질병의 예방 또는 치료제

Info

Publication number: KR20040090400A
Application number: KR10-2003-7017283A
Authority: KR
Inventors: 가와시마세이노스께; 요꼬야마미쯔히로
Original assignee: 다이이찌 산토리 파마 가부시키가이샤
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2003-03-20
Publication date: 2004-10-22
Also published as: BR0303571A; CA2451516A1; JP2003277265A; EP1488793A1; EP1488793A4; US20040198738A1; CN1533277A; JP4836388B2; WO2003080063A1; CN1330309C

Abstract

본 발명은 eNOS 유전자 발현 산물이 eNOS 고유의 기능을 발현하지 못하는 상태에 기인하는 질병 및 병태를 예방 또는 치료하기 위하여, 어떤 부작용 없이 높은 안전성을 갖는 한편 최적으로 기능하도록 eNOS 를 활성화시키는 치료제를 제공하고자 하는 것이다. 보다 구체적으로, 유효성분으로서 하기 화학식 I 로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, eNOS 의 증가에 의해 발생되는 질병 및 병태의 예방 또는 치료용 약물:

[화학식 I]

[식 중, R¹및 R²가 각각 수소를 나타내거나, 또는 R¹및 R²가 함께 단일결합을 형성하고; R¹및 R²가 각각 수소를 나타내는 경우, R³은 -CH(OH)CH(OH)CH₃, -CH(OCOCH₃)CH(OCOCH₃)CH₃, -CH₃, -CH₂OH 또는 페닐을 나타내거나, 또는 R¹및 R²가 함께 단일결합을 형성하는 경우, R³은 -COCH(OH)CH₃를 나타낸다].

Description

ｅＮＯＳ 발현에 기인하는 질병의 예방 또는 치료제{PREVENTIVES OR REMEDIES FOR DISEAES CAUSED BY eNOS EXPRESSION}

혈관 내피는 혈관 긴장 또는 혈전 형성에 중요한 역할을 하는 영역으로서 알려져 있다. 1980 년에, 내피 유도된 이완 인자 (EDRF)의 존재가 처음으로 보고되었다. 그 후, 1987 년에, EDRF 의 정체가 일산화질소 (NO)라는 것이 입증되었다. NO 는 L-아르기닌이 NG-히드록실-L-아르기닌을 거쳐 L-시트룰린으로 산화되는 경우 생성된다. 상기 반응은 NO 합성효소 (NOS)로서 알려진 효소에 의해 촉매된다. NOS 는 혈관 내피, 신경계, 신장, 혈소판, 심근, 평활근 등과 같은 광범위한 기관에 존재한다. 생성된 NO 는 각종 작용을 하며, 이는 전신 순환의 제어에 중요한 역할을 한다.

NOS 를 암호화하는 유전자는 클로닝되었으며, 구조 분석이 실시되었다. 그 결과, NOS 는 칼모둘린 (CaM), 플라빈 및 NADPH 와 같은 조효소에 결합 부위를 가질 뿐만 아니라, 본 발명의 유효 성분인 화학식 I 에 속하는 (6R)-L-에리트로-5,6,7,8-테트라하이드로비옵테린 (이하 "BH4")에도 결합 부위를 갖는 것으로 발견되었다. 또한, BH4 가 NOS 기능의 제어에 실질적으로 참여한다는 것도 제안되었다. 즉, NOS 는 BH4 존재하에 커플링에 의해 이량체를 형성하여, NO 를 생산할 수 있게 된다 (Kekkan (혈관) 2001: 24(2), 63~67). 지금까지, 일본 특허공개 제 10-338637 호는 BH4 가 NOS 의 기능을 활성화하여 NOS 기능의 감소에 기인하는 질병에 대해 예방 또는 치료 효과를 제공한다는 것을 개시하고 있다. 유사하게, 일본 특허공개 제 11-246410 호는 BH4 가 NOS 의 기능을 활성화하여 인슐린 내성과 관련된 혈관 기능의 이상을 수반하는 질병에 대해 예방 또는 치료 효과를 제공한다는 것을 개시하고 있다. 또한, WO 99/43324 호는 BH4 가 NOS 의 기능을 활성화하여 약물성 신장병증에 대한 예방 및 치료 효과를 제공한다는 것을 개시하고 있다.

이처럼, 내피 의존성 혈관확장 반응은 동맥경화, 고지혈증, 심부전증, 고혈압 및 당뇨병 등과 같은 각종 질병에서 약화된다. NO 가 심근 허혈의 발생 위험을 감소시킴으로써, 또는 이들 질병에 기인한 운동 내성의 저하를 역전시킴으로써 상기 질병들을 경감시키는 역할을 한다는 것은 명백하게 되었다. 또한, 그의 각종 작용때문에, NO 는 혈관구축의 유지, 및 또한 혈관 리모델링과 깊이 관련되었다는 것이 발견되었다. NO 가 유기체의 항동맥경화증 인자로서 기능할 것이라는 가능성이 제안되었다. 예로서, 동맥경화증의 동물 모델로서, 내피성 NO 합성효소 (eNOS) 유전자 결핍 마우스 (ApoE-KO/eNOS-KO)는 NO 를 충분히 생산하지 못하며, 이러한 마우스에서 동맥경화증이 더욱 가속화된다는 것이 보고되어 왔다 (Kuhlencordt PJ 등, Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice, Circulation 2001; 104: 448~454).

그러나, 한편, 동맥경화증은 ApoE-KO/eNOS-Tg (eNOS 과잉발현 마우스)에서 더욱 가속화된다는 것이 발견되었다 (American Heart Asociation's Scientific Sessions, 2001. 11. 16, 초록 번호 1312, Overexpression of Endothelial Nitiric Oxide Synthase Accelerates Atherosclerotic Lesion Development in ApoE-Deficient Mice).

또한, 유전성 고지혈증 토끼 (와타나베 유전가능한 고지혈증 토끼: WHHL)의 동맥경화 혈관의 내피 세포 중에서의 cNOS 의 발현 (구성 NO 합성효소)은 mRNA 및단백질 수준에서 감소되지 않고, 다소 증가한다는 것이 발견되었다. 따라서, 동맥경화 혈관에서 내피 의존성 혈관확장 반응의 감소 메카니즘은 NOS 그 자체의 감소에 의해 유발되지 않는다는 것이 고려되어 왔다 (NO to Byotai/Chiryo (NO 와 병태/치료), p. 36, 1995, Kawashima). 또한, 동맥경화 혈관에서 감소된 내피 의존성 혈관확장 반응은 그 안에서 NO 의 생산 증가를 수반할 수 있다는 것이 보고되었다 (Harrison 등, JCI 86: 2109~2116, 1990). 따라서, eNOS 의 증가와 NO 의 관계, 또는 eNOS 의 증가와 병태의 관계는 아직 해명되지 않았다.

고지혈증 치료를 위한 스타틴 약물 (Laufs U 등, Upregulation of endothelial nitric oxide synthase by HMG Co A reductase inhibitors. Circulation 1998; 97; 1129~1135), 고혈압 및 심부전증 치료를 위한 ACE 저해제, AT1 안타고니스트 (Onozato ML 등, Oxidative stress and nitric oxide synthase in rat diabetic nephropathy: Effect of ACEI and ARB. Kidney Int. 2002; 61: 186~194), Ca 안타고니스트 (Ding Y 등, Nifedipine and diltiazem but not verapamil upregulate endotherlial nitric oxide synthase expresssion. J. Pharmacol Exp Ther. 2000; 606~609), 등과 관련하여, 이들 약제가 eNOS 유전자의 발현을 증가시킴으로써 또는 eNOS mRNA 를 안정화시킴으로써 eNOS 를 증가시킨다는 것이 언급되어졌다. 그러나, 그들 각각의 약물 효능의 발현에서, 스타틴 약물은 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA) 를 저해하고, ACE 저해제는 안지오텐신 전환 효소를 저해하며, AT1 안타고니스트는 안지오텐신 수용체를 길항하며, Ca 안타고니스트는 Ca 채널을 통한 Ca 이온의 세포내로의 유입을 제어한다. 따라서, 표적 질병 또는 병태에 대한 이들 약물의 효능이 eNOS 유전자의 발현의 증가 또는 eNOS mRNA 의 안정화를 통한 eNOS 의 증가 메카니즘에 기인한다고 할 수 없다.

최근, 혈관 내에서의 NO 생산능이 회복 또는 향상되도록 eNOS 유전자를 유기체 내로 도입시키는 시도가 이루어져 왔다. Channon 등은 토끼 내로의 eNOS 또는 nNOS 유전자의 도입이 동맥경화 혈관에서 NO의 혈관확장 작용의 발현을 일으킨다는 것을 보여주었다 (Channon 등, Circulation 98: 1905~1911, 1998). 또한, Qian 등은, 고콜레스테롤식으로 사육한 토끼 내로 eNOS 유전자를 도입하는 경우, 경동맥 혈관에서 세포 접착 인자의 발현 및 염증 세포 침투가 감소하는 것을 보여주었다 (Qian 등, Circulation 99: 2979~2982, 1999). 그러나, 이들 발견에 대한 일부 비판은 단지 단기 및 국소화된 효과만이 제안된 한편, 장기 및 전신 효과는 연구되지 않았다고 지적하고 있다. 또한, Kawashima 등은 eNOS 유전자의 과잉 발현이 동맥경화를 더욱 악화시킨다는 것을 발견하였다 (American Heart Asociation's Scientific Sessions, 2001. 11. 16, 초록 번호 1312). 이들의 발견은, 그의 치료효과를 달성하기 위해 eNOS 유전자 치료를 실시한 경우, eNOS 유전자의 장기 발현 또는 국소화된 과잉 발현이 그 질병을 더욱 악화시킬 수 있다는 부인할 수 없는 가능성이 있을 것임을 제안한다.

본 발명은 하기 화학식 I:

[식 중, 각 기호는 하기 기재된 정의를 나타낸다]

로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로서 함유하는 약물에 관한 것으로, 상기 약물은 eNOS 의 증가와 관련된 질병 또는 병태 (physiological condition), 또는 eNOS 단백질의 양 및 NO 의 생산이 과다하거나 또는 충분하지만 진전되는 병태를 효과적으로 예방 또는 경감시키며, 여기에서 상기 예방 또는 경감은 병태의 진전을 억제하거나 또는 이로부터 회복함에 의해, 또는 eNOS 의 원래 기능을 복구함에 의해 그 질병 또는 병태에 대한 치료 효과를 촉진시킴으로써 발효된다.

도 1 은 eNOS 트랜스제닉 (transgenic) ApoE-결핍 마우스들 (ApoE-KO/eNOS-Tg)에서 eNOS 의 과잉 발현을 나타내는 그래프이다;

도 2 는 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스들의 확장된 병변 (lesion) 영역을 나타내는 그래프이다;

도 3 은 BH4 의 투여에 의한 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스들의 병변 영역의 감소를 나타내는 그래프이다;

도 4 는 고콜레스테롤식으로 사육된 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스의 플라크 (plaque) 부위에서의 수퍼옥시드 (superoxide)의 생산이 BH4 의 투여에 의해 감소되었음을 나타내는 그래프이다; 및

도 5 는 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스들에서 NO 의 생산이 BH4 의 투여에 의해 현저히 감소되었음을 나타내는 그래프이다.

발명의 개시

유기체 내에서 eNOS 는 NO 를 생산함으로써 각종 유형의 조절을 수행하는 역할을 한다. 본 발명의 발명자들은, eNOS 의 상기 역할의 발현에는 유기체 내에서 NO 의 농도 및 활성 산소가 양호한 조건으로 유지되는 것이 필요하다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은, 상기의 양호한 조건이 소실되는 경우, eNOS 의 적절한 효소 작용이 충분히 발현될 수 없거나, 또는 발현되는 경우라도 유기체 내에서 활성 산소가 증가되어, 증가된 활성 산소가 치료 중인 질병을 악화시키거나 또는 새로운 질병을 일으킨다는 것을 추가로 발견하였다. 즉, 본 발명자들은, eNOS 유전자의 발현 및 NO 의 생산이 모두 과잉이거나 또는 충분하다 하더라도, 질병 또는 병태가 (예로서, 동맥경화증) 악화된 상태에서 과량의 활성산소가 생산된다는 것을 발견하였다.

상기 질병을 예방 및/또는 치료하기 위하여, 본 발명자들은 NOS 가 커플링되지 않은 형태로 존재하는 경우 (NOS 가 이량체를 형성하지 않는 경우) 활성 산소를 생산한다는 사실에 주목하였다. 그 후, 본 발명자들은 커플링 반응 (이량체 형성)에 연루된 가장 중요한 인자인 BH4 가 상기 문제를 해결할 수 있는 물질이라고 추정하였다. eNOS 유전자의 과잉 또는 추가 발현 또는 eNOS mRNA 의 안정화로 인해 다량의 eNOS 가 존재하는 경우, BH4 의 공급은 부족하게 될 것이며, 즉 BH4 의 양은 불충분하게 될 것이다. 따라서, 그러한 상태에서, NOS 는 커플링되지 않은 형태로 존재하며, 활성 산소를 생성하는 것으로 생각된다. 이에따라, 본 발명자들은 eNOS 의 기능이 BH4 의 투여에 의해 정상화 될 수 있을 것이라고 생각하였다.

집중적인 연구 결과, 본 발명자들은, eNOS 유전자의 과잉 발현에 기인한 동맥경화 또는 혈관 죽종 (atheroma)을 갖는 실험 동물 모델에 BH4 를 투여한 경우, 이들 질병의 진전이 예방됨을 놀랍게도 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 증가된 eNOS 의 기능을 활성화시키는 BH4 의 효과가 eNOS 의 증가에 기인하는 질병 또는 병태를 예방 및 치료하는데 유용하다는 것을 발견하여, 본 발명을 달성하였다.

따라서, 본 발명은 유효 성분으로서 하기 화학식 I 로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, eNOS 의 증가에 의해 기인하는 질병또는 병태의 예방 또는 치료용 약물에 관한 것이다:

[화학식 I]

[식 중, R¹및 R²는 각각 수소 원자를 나타내거나, 또는 R¹및 R²는 함께 단일 결합을 형성하며, R¹및 R²각각 동시에 수소 원자를 나타내는 경우, R³은 -CH(OH)CH(OH)CH₃, -CH(OCOCH₃)CH(OCOCH₃)CH₃, -CH₃, -CH₂OH 또는 페닐기를 나타내고, R¹및 R²가 함께 단일 결합을 형성하는 경우, R³은 -COCH(OH)CH₃를 나타낸다].

eNOS 의 증가로 인해 eNOS 가 그의 적절한 기능을 나타내지 않는 상황에 기인하는 질병 또는 병태의 예들은 하기를 포함할 수 있다: (1) eNOS 유전자의 비정상 발현에 의한 eNOS 의 과잉 발현에 의해 기인하는 질병 또는 병태; (2) 유전자 치료법에서 외부로부터 eNOS 유전자가 도입되고, 그러한 상태 하에서 eNOS 가 과잉 발현되거나 또는 발현된 eNOS 가 그의 적절한 기능을 나타내지 못하여, 예측되는 치료 효과가 수득될 수 없거나, 또는 그 병태가 악화될 수 있는 경우 관찰되는 상태; 및 (3) 스타틴 약물, ACE 저해제, AT1 안타고니스트 또는 Ca 안타고니스트의 투여에 의해 증가된 eNOS 가 예측되는 기능을 나타내지 않아, 그 치료 효과가 수득될 수 없거나, 또는 그 병태가 악화되는 경우 관찰되는 상태.

본 발명의 약물은, eNOS 의 증가로 인해 eNOS 가 그의 적절한 기능을 나타내지 않는 상태, eNOS 유전자가 과잉 발현된 상태, 또는 상기 상태의 발현이 예측되는 경우의 치료를 위하여, BH4 의 치료적 또는 예방적 투여에 유용하거나; 또는 eNOS 유전자의 도입과 조합한 BH4 의 투여에 유용하다. eNOS 유전자의 도입과 조합하여 본 발명의 약물을 투여하는 경우, 상기 약물은 유전자 도입 전, 실질적으로 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 약물의 투여는 유전자 도입 후 장기간 동안 계속될 수 있다.

eNOS 의 증가, 또는 eNOS 유전자의 과잉 발현으로 인해 eNOS 가 그의 적절한 기능을 나타내지 않아, 따라서 본 발명의 약물이 요구되는 상태는 심혈관계 질병, 동맥경화증, 폐동맥 고혈압 등의 형태를 취할 것이다. 이들 질병과 관련하여, eNOS 가 과잉 발현하였는지 또는 유기체 내에서 적절하게 기능하지 않는지를 진단하기 위하여, 조직 (예로서, 혈관 조직) 중의 활성 산소의 양을 조직화학적으로 측정할 수 있다.

eNOS 증가를 위한 약제, 예로서 스타틴 약물, ACE 저해제, AT1 안타고니스트 또는 Ca 안타고니스트와 조합하여 본 발명의 약물을 투여하기 위하여, 본 발명의 약물은 이들 약제의 투여 전, 투여 동안 또는 투여 후에 투여될 수 있거나, 또는 이들 약제와의 혼합물로서 투여될 수도 있다. 예로서, 스타틴 약물은 아트로바스타틴, 플라바스타틴, 심바스타틴, 메바스타틴 등을 포함한다. ACE 저해제는 알라세프릴, 이미다프릴, 에날라프릴, 캅토프릴, 퀴나프릴, 트랜도프릴, 페린도프릴, 라미프릴 등을 포함한다. AT1 안타고니스트는 로사르탄 등을 포함하고, Ca안타고니스트는 니페디핀, 딜티아젬 등을 포함한다. 이들 약제는 동맥경화증, 고지혈증, 고혈압, 심부전증, 및 허혈성 심장병과 같은 질병에서 혈관 리모델링을 저해하는데 사용되고, 당뇨성 신장병증을 치료하는데 사용된다.

본 발명의 치료제의 유효 성분인 상기 화학식 I 에 의해 표시되는 화합물은 공지이다. 이들은 악성 고페닐알라닌혈증, 우울증, 파킨슨씨병, 및 기타 질병에 대한 치료제로서 유용하다는 것이 알려져 있다. 예로서, 추가 정보를 위해 일본 특허공개 제 59-25323 호, 제 59-76086 호, 제 61-277618 호, 및 제 63-267781 호 참조.

상기 화합물은 적절한 염으로서 사용될 수 있다. 이러한 여의 예들은, 염화수소산, 인산, 황산 또는 붕산과 같은 무기산, 및 아세트산, 포름산, 말레산, 푸마르산 또는 메탄술폰산과 같은 유기산을 포함하는 약리학적으로 비독성인 산의 염들을 포함한다.

본 발명의 유효 성분인 화학식 I 로 표시되는 화합물의 특정 예들은 하기 화합물들 및 그의 약학적으로 유효한 염들을 포함한다:

(6R)-L-에리트로-5,6,7,8-테트라하이드로비옵테린 (BH4):

,

(6R, S)-5,6,7,8-테트라하이드로비옵테린,

1',2'-디아세틸-5,6,7,8-테트라하이드로비옵테린:

,

세피압테린:

.

6-메틸-5,6,7,8-테트라하이드롭테린:

,

6-히드록시메틸-5,6,7,8-테트라하이드롭테린:

, 및

6-페닐-5,6,7,8-테트라하이드롭테린:

.

상기 화합물들 중, 바람직한 화합물들은 5,6,7,8-테트라하이드로비옵테린 및 그의 염들이다. 또한, 이들 중, 가장 바람직한 화합물은 BH4 또는 그의 염이다.

본 발명의 치료제는 화학식 I 로 표시되는 화합물을, 일반 방법에 의해 일반적인 약학 제제에 사용되는 담체와 혼합하여, 이들을 경구, 직장 및 비경구 (정맥내 및 척추내 포함) 투여에 적합한 약제로 전환시킴으로써 제조된다.

상기 약학 제제에 사용되는 담체는 투여 형태에 따라 다를 수 있지만, 이러한 담체의 일반적인 예는 부형제, 결합제 및 붕괴제를 포함할 수 있다.

부형제의 전형적인 예들은, 전분, 락토오스, 사카로오스, 글루코오스, 만니톨 및 셀룰로오스를 포함하고, 결합제의 예들은 폴리비닐피롤리돈, 전분, 사카로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 및 검 아라빅을 포함한다. 붕괴제의 예들은 전분, 한천, 젤라틴 분말, 셀룰로오스, 및 CMC 를 포함한다. 그러나, 일반적으로 사용되는 한, 상기 기재된 품목 외의 부형제, 결합제 및 붕괴제도 사용될 수 있다.

상기 담체들에 추가하여, 본 발명의 치료제는 바람직하게는 유효 성분의 안정화를 위한 산화방지제를 함유한다. 사용되는 산화방지제는, 약학 제제에 일반적으로 사용되는 것들로부터 적절하게 선택될 수 있다. 그러한 산화방지제의 예들은 아스코르브산, N-아세틸시스테인, L-시스테인, dl-α-토코페롤 및 천연 토코페롤을 포함할 수 있다. 이들은 유효성분(들) (하나 이상의 유형)을 안정화하는데 필요한 양으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 산화방지제는 유효 성분에 대하여 바람직하게는 0.2 내지 2.0:1 의 중량비로 사용된다.

경구 투여에 적합한 본 발명의 약물은 정제, 설하정, 캡슐, 분말, 가루약, 과립 또는 세립제 (parvules)의 형태로, 또는 시럽, 에멀션 또는 비수성 액체 중의현탁액, 예로서 포션 (potion) 형태로 제공될 수 있다.

과립의 경우, 예로서 하나 이상의 유효 성분(들) 및 하나 이상의 보조 성분들, 예로서 상기 담체, 산화방지제를 균일하게 혼합하고, 상기 혼합물을 과립화하고, 체를 사용하여 입자 크기를 조정함으로써 제조할 수 있다. 정제의 경우, 하나 이상의 유효 성분(들)을 필요에 따라 하나 이상의 보조 성분들과 함께 압축 또는 성형함으로써 제조할 수 있다. 캡슐은, 하나 이상의 유효 성분(들)을 필요에 따라 하나 이상의 보조 성분들과 균일하게 혼합하여 분말 또는 과립을 수득한 후, 그들을 충전기 등을 사용하여 적절한 캡슐 내로 충전함으로써 제조될 수 있다. 직장 투여용 약제는, 유효 성분(들)을 카카오 버터와 같은 일반 담체와 함께 혼합함으로써 제조되어, 좌약으로서 제공될 수 있다. 비경구 투여용 제제는, 건조 고체 형태의 하나 이상의 유효 성분(들)을 질소로 정화된 멸균 용기 내로 봉입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 건조 고체 제제는 임의의 소정량의 비경구 투여용 멸균수 중에 분산 또는 용해시켜 환자에게 투여될 수 있다.

이들 약제의 제조시, 상기 기재된 산화방지제를 바람직하게는 유효 성분(들) 및 일반 담체에 첨가할 수 있다. 또한, 완충제, 풍미 첨가제, 계면활성제, 증점제, 그리스 (grease) 및 윤활제로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 보조 성분들을, 바람직한 경우 여기에 추가로 첨가할 수 있다.

투여되는 유효 성분 (즉, 화학식 I 로 표시되는 화합물)의 양은 투여 경로, 치료될 증상, 및 치료될 환자에 따라 자연히 변하지만, 어떤 경우에는 그 양은 의사가 정할 수 있다.

예로서, 적합한 투여량은 0.1 내지 50 mg/kg (체중)/일 의 범위 내이며, 전형적으로 바람직한 투여량은 0.5 내지 10 mg/kg (체중)/일 의 범위 내이다.

상기 유효 성분의 바람직한 투여량은 하루 일 회 투여될 수 있거나, 또는 하루에 적절한 간격으로 2 회 내지 4 회로 나누어 투여될 수 있다.

투여 기간은, 본 발명의 약물에 의해 처리되는 증상을 관찰하면서, 적절하게는 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 약물을, eNOS 를 증가시키는 것으로 생각되는 약물, 예로서 스타틴 약물, ACE 저해제, AT1 안타고니스트 또는 Ca 안타고니스트와 함께 투여하는 경우, 본 발명의 약물의 투여 기간은 이들 약제의 사용 기간과 거의 동일하다. 그러나, 투여 기간은 상기 사용 기간보다 더 길거나 또는 더 짧도록 설정될 수도 있으며, 그러한 기간도 본 발명의 범주에 포함된다.

유효 성분을 기타 성분들과 혼합하지 않고 단독으로 투여할 수 있다. 그러나, 투여량을 용이하게 제어하기 위하여 또는 기타 이유로, 표적 질병에 따라 기타 유효 성분들도 약으로서 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약물은, 유효성분으로서 화학식 I 로 표시되는 화합물과 함께, NOS 의 기질, 조효소 또는 보조인자인 L-아르기닌, 플라빈 (예로서, FAD, FMN 등) 및 칼슘으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 보조 유효 성분으로서 함유할 수 있다. 이들 유효 성분들을 혼합함으로써, 화학식 I 로 표시되는 화합물의 단독 사용시에 수득될 수 있는 치료 효과에 비해 훨씬 뛰어난 치료 효과의 수득을 기대할 수 있다. 본 발명의 약물에 함유된 상기 각 성분의 비율은 특별히 한정되지 않는다. 예로서, L-아르기닌, 플라빈 및 칼슘으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분의, 화학식 I 로 표시되는 화합물에 대한 중량비는 0.1 내지 10, 바람직하게는 0.5 내지 2 일 수 있다.

이러한 혼합 제제를 치료에 사용하는 경우, 그의 적합한 투여량은 유효 성분의 총 양으로서, 0.1 내지 50 mg/kg (체중)/일 의 범위 내이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/kg (체중)/일 의 범위 내이다.

치료를 위해, 의사는 연령, 증상 등을 고려하여 사용되는 제제를 유효 성분으로서 화학식 I 로 표시되는 화합물만을 함유하는 제제, 또는 상기 화합물 뿐만 아니라 기타 유효 성분들도 함유하는 제제 중에서 적절하게 선택할 것이다.

본 발명에 사용되는 유효 성분은 가장 바람직하게는 (6R)-L-에리트로-5,6,7,8-테트라하이드로비옵테린 (BH4) 또는 그의 염이다. 그러나, 상기의 유사체, 예로서 (6R, S)-5,6,7,8-테트라하이드로비옵테린, 1',2'-디아세틸-5,6,7,8-테트라하이드로비옵테린, 세피압테린, 6-메틸-5,6,7,8-테트라하이드롭테린, 6-히드록시메틸-5,6,7,8-테트라하이드롭테린, 6-페닐-5,6,7,8-테트라하이드롭테린, 또는 그의 염도 사용될 수 있다. 그러나, 유기체 중에 존재하는 천연 물질인 BH4 가 당연히 바람직하다. 마우스에서 BH4 2염산염의 급성 독성은 경구투여에 대해 2 g/kg (체중) 이상이며, 따라서 거의 독성이 없다. 또한, 일본 특허공개 제 59-25323 호에서 파킨슨 병의 치료에 대한 기재로부터 명백하듯이, 광학적으로 순수하지 않은 물질인, (6R, S)-5,6,7,8-테트라하이드로비옵테린의 독성은 매우 약하다. 따라서, 이 화합물 또한 본 발명의 치료에 사용될 수 있다. 상기 기재된 화합물들 외에 화학식 I 로 표시되는 화합물들은 거의 급성 독성을 갖지 않는다.

본 발명은 하기 실시예들에서 더욱 설명될 것이다. 그러나, 이 예들은 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 의도는 아니다.

발명의 개요

본 발명의 목적은, 증가된 eNOS 의 기능을 활성화하여, eNOS 유전자의 발현산물이 그의 적절한 기능을 나타내지 않는 상태에 기인하는 질병 또는 병태를 예방 또는 치료하는, 부작용이 적은 안전한 치료제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은, 발현된 또는 증가하여 발현된 eNOS 의 기능을 활성화하는 그의 능력을 통하여, eNOS 유전자의 발현을 가능하게 하거나 또는 eNOS 유전자의 발현을 촉진시키거나 또는 eNOS mRNA 를 안정화하는 것을 포함하는, eNOS 를 증가시키는 약제 또는 유전자 치료제의 투입에 의한 각종 질병의 치료 방법에서 보조제 (secondary agent)로서 사용될 수 있는, 부작용이 적은 안전한 치료제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은, 발현 또는 증가된 발현에 의해 제공되는 치료 효과를 장기간에 걸쳐 및/또는 지속적으로 유지하는 그의 능력을 통하여, eNOS 유전자의 발현을 가능하게 하거나 또는 eNOS 유전자의 발현을 촉진시키는 것을 포함하는 각종 질병의 치료 방법에서 보조제로서 사용될 수 있는, 부작용이 적은 안전한 치료제를 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은, eNOS 가 그의 적절한 기능을 나타내지 않는 상태와 관련된 질병 또는 병태, 또는 eNOS 단백질의 양이 과잉이거나 또는 충분한 경우 진행되는 병태를 효과적으로 예방 또는 개선하거나, 또는 eNOS 를 증가시킴에 의한 질병 또는 병태의 치료에서 eNOS 의 NO 생산 기능을 양호한 상태로 유지시켜, 상기 치료제가 환자의 일상생활의 질을 상승시킬 수 있도록 하는, 부작용이 적은 안전한 치료제의 제공에 관한 것이다.

실시예 1 (과립제, 세립제)

폴리비닐피롤리돈 (Coridon 30) 1 (중량)부를 멸균 정제수에 용해시켰다. 그 후, 아스코르브산 10 부 및 L-시스테인 염산염 5 부를 거기에 첨가하여 균질 용액을 수득하였다. 그 후, BH4 2염산염 10 부를 거기에 더 첨가하여 균질 용액을 제공하였다.

수득된 용액을 부형제 (만니톨 또는 락토오스) 59 부 및 붕괴제 [옥수수 전분 또는 히드록시프로필셀룰로오스 (LH-22)] 15 부에 첨가하였다. 이 혼합물을 혼련하고, 과립화 및 건조한 후, 체에 의해 크기에 따라 분류하였다.

실시예 2 (정제)

락토오스 58 부 및 미세결정성 셀룰로오스 15 부를 실시예 1 에 기재된 것과 같은 유효 성분의 균질용액 내로 혼합시켰다. 그 후, 마그네슘 스테아레이트 1 부를 거기에 추가로 첨가하고, 혼합 후, 이 혼합물을 정제화하였다.

실시예 3 (캡슐)

0.2 % 마그네슘 스테아레이트를 윤활제로서 실시예 1 에서 제조된 과립 내로 혼합시키고, 상기 과립을 캡슐 내에 충전시켰다.

실시예 4 (주사제)

BH4 2염산염 1.5 g

아스코르브산 1.5 g

L-시스테인 염산염 0.5 g

만니톨 6.5 g

상기 성분들을 멸균 정제수 내에 용해시켜 용액 100 ㎖ 를 제조하였다. 이 용액을 멸균시키고, 각 1 또는 2 ㎖ 의 용액을 바이알 또는 앰플에 넣은 후, 동결건조시키고 밀봉하였다.

실시예 5 (주사제)

BH4 2염산염 2.0 g 을 산소 부재 하에서 멸균 정제수에 용해시켜 용액 100 ㎖ 를 제조하였다. 이 용액을 멸균하고, 실시예 4 에서와 동일한 방식으로 밀봉하였다.

실시예 6 (좌약)

BH4 2염산염 150 부

아스코르브산 150 부

L-시스테인 염산염 50 부

상기 성분들을 혼합하여 균질한 분말을 만들었다. 그 후 이 분말을 9,950 부의 카카오 버터에 분산시켰다.

실시예 7 (과립)

BH4 2염산염 5 부

아스코르브산 5 부

L-시스테인 염산염 2 부

상기 성분들을 혼합하여 균질 용액을 제조하였다.

만니톨 55 부, 폴리비닐피롤리돈 1 부, 히드록시프로필셀룰로오스 14 부, 및 L-아르기닌 또는 칼슘 5 부를 균일하게 혼합하여, 상기 용액에 첨가하였다. 이렇게 수득된 혼합물을 혼련하고, 과립화하고, 건조한 후, 체를 사용하여 크기에 따라 분류하였다.

실시예 8 (과립)

BH4 2염산염 5 부

아스코르브산 5 부

L-시스테인 염산염 5 부

만니톨 52 부

폴리비닐피롤리돈 (코리돈 (Coridon) 30) 1 부

히드록시프로필셀룰로오스 (LH-22) 12 부

L-아르기닌 또는 칼슘 10 부

상기 성분들을 사용하였으며, 과립화 및 체를 통한 크기 분류를 실시예 7 에서와 동일한 방식으로 실시하였다.

실시예 9 (과립)

BH4 2염산염 5 부

아스코르브산 5 부

L-시스테인 염산염 2 부

상기 성분들을 혼합하여 균질 용액을 제조하였다.

L-아르기닌 또는 칼슘 10 부, 만니톨 50 부, 폴리비닐피롤리돈 (코리돈 30) 1 부, 및 히드록시프로필셀룰로오스 (LH-22) 9 부를 균일하게 혼합하여, 상기 용액에 첨가하였다. 이렇게 수득된 혼합물을 혼련하고, 과립화하고, 건조한 후, 체를 사용하여 크기에 따라 분류하였다.

실시예 10 eNOS 발현의 확인

eNOS 트랜스제닉 마우스를 ApoE-결핍 마우스 (ApoE-KO 동질 접합체)와 교배하여, eNOS 를 과잉발현하는 eNOS 트랜스제닉 ApoE-결핍 마우스 (ApoE-KO/eNOS-Tg)를 만들었다 (American Heart Asociation's Scientific Sessions, 2001. 11. 16. 초록 번호 1312). 이 eNOS 트랜스제닉 ApoE-결핍 마우스는, 유전자 증폭방법 (PCR 법)에 따라 eNOS 유전자를 증폭하고, 증폭된 유전자의 양을 측정함으로써 선별될 수 있었다. 12 주령의 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스의 대동맥으로부터 단백질을 추출하고, eNOS 의 발현을 면역 블롯팅에 의해, 농도계를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 1 에 나타내었다. 상기 도에서, WT, AeNOS-Tg, ApoE-KO 및 poE-KO/eNOS-Tg 는 각각 야생형, eNOS 트랜스제닉, ApoE-결핍 및 eNOS 트랜스제닉 ApoE-결핍 마우스를 나타낸다. 그래프는 6 개의 독립적인 실험의 평균값 ± 표준편차를 나타낸다. 별표는 WT 에 대하여 p < 0.01 를 나타내고, 십자 표시는 WT 에 대하여 p < 0.05 를 나타내며, 두 개의 십자 표시는 ApoE-KO 에 대하여 p < 0.05 를 나타낸다.

트랜스제닉 마우스의 eNOS 단백질의 양은 야생형 마우스에서의 양보다 명확히 더 많으며, 트랜스제닉 마우스는 eNOS 를 과잉 발현함을 나타내었다.

실시예 11 대동맥동 (aortic sinus) 의 병변 영역 (1)

실시예 10 에서 만들어진 37 마리의 마우스들 (ApoE-KO/eNOS-Tg)을 4 주령에서 이유 (離乳)시키고, 그 후 12 주 동안 고콜레스테롤식 (1.25 % 콜레스테롤, 7.5 % 카카오 버터, 7.5 % 카세인, 및 0.5 % 나트륨 콜레이트)으로 사육하였다.

그 후, 16주령 마우스들을 펜토바르비탈로 마취시키고, 대동맥을 10 U/㎖ 헤파린을 함유하는 생리식염수로 관류시켰다 (perfused). 그 후, 좌심실의 중심부로부터 장골 대동맥의 분기부까지에 해당하는 대동맥을 적출하여, 4 % 의 파라포름알데히드에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 적출한 대동맥의 먼 부분 (distal portion) (대동맥 궁으로부터 장골 대동맥의 분기부까지)으로부터 주변 조직을 제거하였다. 이 대동맥을 길이 방향으로 개방시켜, 실리콘 코팅된 디쉬 상에서 고정시킨 후, 수단 III (Sudan III)로 염색시켰다. 수득된 밝은 현미경 화상을 NIH 1.61 Imaging Software 를 사용하여 분석하였다. 병변 형성 영역을 병변 면적/대동맥의 총 면적으로 표시하였다. 결과를 도 2 에 나타내었다. 도에서, * 는 ApoE-KO 수컷에 대하여 p < 0.0001 을 나타내고, 십자 표시는 ApoE-KO 암컷에 대하여 p < 0.001 을 나타낸다.

병변 영역이 eNOS 트랜스제닉 ApoE-KO 마우스들에서 증가되고, 따라서 동맥경화증이 촉진됨을 발견하였다.

실시예 12 대동맥동의 경화성 병변 영역 (2)

군 (group) 당, 실시예 10 에서 만들어진 6 내지 8 마리의 마우스들 (ApoE-KO/eNOS-Tg)을 사용하였다. BH4 비투여군을 고콜레스테롤식으로 사육하고 (실시예 10 참조), BH4 투여군은 BH4 를 10 mg/kg/일 로 첨가한 고콜레스테롤 식으로 사육하였다. 실시예 11 에서와 동일한 실험을 실시하고, 대동맥을 적출하고, 동일한 화상 분석을 실시하였다. 결과를 도 3 에 나타내었다. 도에서, * 는 BH4 가 투여되지 않은 수컷 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스들에 대하여 p < 0.05 를 나타내었고, 십자 표시는 BH4 가 투여되지 않은 암컷 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스들에 대하여 p < 0.01 을 나타내었다.

BH4 를 투여한 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스들에서, 병변 영역이 감소되었으며, 동맥경화가 억제되었다.

실시예 13 수퍼옥시드의 생산

실시예 12 와 동일한 방식으로 BH4 가 첨가된 또는 BH4 가 비첨가된 고콜레스테롤식으로 8 주 동안 사육한 6 내지 8 마리의 마우스들 (12 주령, ApoE-KO/eNOS-Tg)로 이루어지는 군들을 준비하였다. 이들 마우스들로부터 대동맥을 적출하고, 주변 조직을 제거하고, 잔여 부분을 pH 7.4 의 PBS 로 충전한 흑색 실리콘 디쉬 상에 놓았다. 샘플을 광 차단 박스 내에 두어 외부 광의 간섭을 피한 후, MCLA 를 최종 농도 20 ㎛/L 로 상기 챔버에 첨가하였다. 그 후, MCLA (2-메틸-6-(4-메톡시페닐)-3,7-디하이드로이미다졸[1,2-a]피라진-3-온-히드로클로라이드) 및 수퍼옥시드 음이온간의 반응 결과로서 생성된 발광을 5 분 동안 측정하였다. 이 측정을 3 회 반복하였다.

발광 데이타를 컴퓨터에 제공하여, 수득된 비선형 그레이 스케일 (gray scale) 화상들을 슈도컬러 (pseudocolor) 화상으로 전환시켰다. 수퍼옥시드로인한 화학발광의 강도를, WinLight 32 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 수단 III 로 염색된 영역으로서 플라크 영역을 정의하였다. 약 10 개의 플라크 영역 및 10 개의 비-플라크 영역 (0.0012~0002 ㎠)을 각 마우스들로부터 임의 선택한 후, 측정하였다. 각 화학발광 신호 강도에서 백그라운드 레벨 (background level)을 차감시켰다. 도 4 는 야생형 마우스의 측정값을 1.0 으로 설정함으로써 계산하여 수득된 결과를 나타낸다. 상기 결과를 상대치로서 나타내었다. 그래프는 각 군의 6 내지 10 마리 마우스들의 평균 ±표준편차를 나타낸다. 도에서, * 는 BH4 가 투여되지 않은 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스들에 대해 p< 0.01 을 나타낸다.

BH4 투여군에서, 고콜레스테롤식으로 사육한 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스들에서 그들의 플라크 영역에서 수퍼옥시드의 생산이 현저히 감소하였으며, 따라서 이는 BH4 가 수퍼옥시드 저해 작용을 갖는다는 것을 나타내었다.

실시예 14 NO 의 생산

8 주 동안 고콜레스테롤식으로 사육한 12 주령 마우스들 (ApoE-KO/eNOS-Tg)로부터 대동맥 궁 내지 장골 대동맥의 분기부 부분을 함유하는 대동맥을 적출하였다. 적출 직후, 주변부를 pH 7.4 의 PBS 로 제거하였다. 샘플을 1.5 mmol/L 염화칼슘을 함유하는 인산 버퍼 (pH 7.4)로 충전한 흑색 디쉬에 놓고, 이를 외부 광의 간섭을 피하기 위하여 광 차단 박스 내에 위치시켰다.

디아미노플루오레세인-2 디아세테이트 (DAF-2 DA)를 최종 농도 10 μ몰/L 로 여기에 첨가하였다. 그 후, 샘플을 5 분 동안 상온에 두고, 그 후 485 nm 의청색광으로 여기시켰다. DAF-2 DA 및 NO 간의 반응 결과 발생된 형광을, 532 nm 의 중심을 갖는 밴드 필터가 장착된 루미노그래프 (luminograph)를 사용하여 검출하고, 515 nm 의 파장 강도에서 1 초 동안 측정을 실시하였다. 대동맥 내피로부터의 NO 의 생성을 시험하기 위하여, 샘플을 1 μ몰/L 아세틸콜린 용액에 5 분 동안 두고, 그 후 형광 화상을 측정하였다. 각 실험 완료 후, 측정된 샘플이 플라크 영역인지 또는 비플라크 영역인지를 결정하기 위하여, 샘플을 수단 III 로 염색하고 관찰하였다. 측정 데이타를 컴퓨터에 입력하고, NightOWL-화상 시스템으로부터 제공된 WinLight 32 소프트웨어를 사용하여 비플라크 영역을 분석하였다. 대동맥의 콜라겐 섬유의 비특이적 발광 또는 반사를 제거하기 위하여, DAF 반응 후의 측정에서 백그라운드 측정값을 차감시켰다. 10 개 이상의 비플라크 영역 (0.0005 내지 0.001 ㎠)을 임의 선택하고, NO 와의 반응 결과 생성된 형광을 측정하였다. 생성된 NO 의 양을 picowatt/㎠ 로 나타내었다. 샘플을 아세틸콜린 용액 중에 둔 후 수득된 측정값으로부터, 샘플을 아세틸콜린 용액 중에 두지 않은 조건 하에서 수득된 측정값을 차감함으로써 내피로부터 생산된 NO 의 양을 수득하였다. 결과를 도 5 에 나타내었다. 그래프는 독립적인 6 개의 실험의 평균값±표준편차를 나타낸다. 도에서, * 는 BH4 를 투여하지 않은 ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스들에 대하여 p < 0.01 을 나타낸다.

ApoE-KO/eNOS-Tg 마우스들에서, 분석된 영역 (비플라크 영역)에서 NO 의 생산이 현저히 증가되었으며, 따라서 이는 BH4 가 NO 의 생산 촉진 작용을 갖는다는 것을 나타내었다.

본 발명은 eNOS 의 증가로 인해 eNOS 가 그의 본래 기능을 제공하지 않는 상태, eNOS 유전자가 과잉 발현되는 상태, 또는 이러한 상태에 기인하는 각종 질병들에 유효한 예방 또는 치료제를 제공한다.

Claims

유효성분으로서 하기 화학식 I 로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 내피 NO 합성효소 (eNOS)의 증가에 기인하는 질병 또는 병태의 예방 또는 치료를 위한 예방 또는 치료제:

[화학식 I]

[식 중, R¹및 R²가 각각 수소원자를 나타내거나, 또는 R¹및 R²가 함께 단일결합을 형성하고, R¹및 R²가 각각 수소원자를 나타내는 경우, R³은 -CH(OH)CH(OH)CH₃, -CH(OCOCH₃)CH(OCOCH₃)CH₃, -CH₃, -CH₂OH 또는 페닐기를 나타내며, R¹및 R²가 함께 단일결합을 형성하는 경우, R³은 -COCH(OH)CH₃를 나타낸다].
제 1 항에 있어서, eNOS 의 증가에 기인하는 질병 또는 병태가 심혈관 질병인 예방 또는 치료제.
제 1 항에 있어서, eNOS 의 증가에 기인하는 질병 또는 병태가 동맥경화증인예방 또는 치료제.
유효성분으로서 제 1 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, eNOS 의 증가에 기인하는 질병 또는 병태의 악화를 예방 또는 치료하기 위한 예방 또는 치료제.
제 4 항에 있어서, eNOS 의 증가에 기인하는 질병 또는 병태가 심혈관 질병인 예방 또는 치료제.
제 4 항에 있어서, eNOS 의 증가에 기인하는 질병 또는 병태가 동맥경화증인 예방 또는 치료제.
유효성분으로서 제 1 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, eNOS 의 증가에 기인하는 질병 또는 병태에 대한 치료 효과 촉진용 치료제.
제 7 항에 있어서, eNOS 의 증가에 기인하는 질병 또는 병태에 대한 치료효과가 심혈관 질병에 대해 제공되는 치료제.
제 7 항에 있어서, eNOS 의 증가에 기인하는 질병 또는 병태에 대한 치료효과가 동맥경화증에 대해 제공되는 치료제.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, R³이 L-에리트로-CH(OH)CH(OH)CH₃인 예방 또는 치료제.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, eNOS 의 증가가 eNOS 유전자 발현의 증가에 기인한 예방 또는 치료제.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, eNOS 의 증가가 eNOS 유전자의 도입과 관련된 예방 또는 치료제.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, eNOS 의 증가가 eNOS 의 증가를 촉진시키는 약제의 투여에 기인한 예방 또는 치료제.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, eNOS 의 증가를 촉진시키는 약제를 추가로 함유하는 예방 또는 치료제.