JP2006503808A - 神経保護及び神経再生用の抗原提示細胞 - Google Patents
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Abstract
中枢神経系(CNS)若しくは末梢神経系(PNS)の損傷、障害又は疾患の治療において、CNS若しくはPNSでのニューロンの変性を防止若しくは阻害するための、又は神経の再生を促進するための医薬組成物及び方法は、(a)神経系(NS)特異的抗原又はその類似体、(b)NS特異的抗原若しくはその類似体由来のペプチド、(c)コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド若しくはポリペプチド、及びポリGlu50Tyr50から成る群から選択されるコポリマー、並びに(d)非自己抗原、から成る群から選択される作用物質をパルスされた抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を含む。
Description
本発明は、組成物及び方法に関し、さらに具体的には適当な抗原をパルスされた抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を含む組成物、及び中枢神経系(CNS)又は末梢神経系(PNS)におけるニューロンの変性を防止若しくは阻害するための、又は神経再生を促進するための方法に前記抗原をパルスされた細胞を使用することに関する。
略号:APC:抗原提示細胞、APL:改変ペプチドリガンド、CNS:中枢神経系、BBB:Basso、Beattie及びBresnahanのオープンフィールド移動尺度、DC:樹状細胞、EAE:実験的自己免疫性脳脊髄炎、GM−CSF:顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、MBP:ミエリン塩基性タンパク質、MHC:主要組織適合複合体、NS:神経系、PNS:末梢神経系、RT−PCR:逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、SCI:脊髄損傷
神経系には、脳と脊髄から成る中枢神経系(CNS)と、脳と脊髄以外の神経と神経節から成る末梢神経系(PNS)が含まれる。神経系の傷害は、穿通外傷や鈍性外傷のような外傷性損傷、又はアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、糖尿病性神経障害、老人性認知症、及び虚血などの疾患又は障害に起因する可能性がある。
免疫系はたいていの組織で防御、修復及び治癒に必須の役割を演じるが、CNSではその独特な免疫特権が原因となって、免疫反応は比較的限定されている。損傷後に哺乳類のCNSが機能的回復を達成できないことは、損傷した組織と免疫系の間の対話が無効なことを反映している。よって、CNSと血中マクロファージとの限られたコミュニケーションは、切断された軸索が再成長する能力に影響するが、活性化マクロファージを移植するとCNSの軸索の再成長が促進されることが示された(Rapalinoら、1998)。
哺乳類のCNSのニューロンは損傷後に自然に再生しないことから、CNS損傷はしばしば運動機能や知覚機能の永続的な欠陥を招くおそれがある。
脊髄損傷(SCI)は、しばしば著しく転帰不良であり、それは直接損傷したニューロンに対する傷害と再生に乏しいことだけが原因ではなく、初期損傷を免れた隣接するニューロンに対する二次的な傷害も原因となる。これらの二次的な事象は、正常レベルに比べ毒性過剰の生理学的物質や自己化合物の分解産物のような、損傷が誘発する破壊性自己化合物の活性によって主に引き起こされる(Faden、1993)。よって、SCIからの回復は傷害の広がりを防止すること(すなわち神経保護)によって、及び細胞体がまだ生存している傷害を受けた繊維の再増殖を促進すること(すなわち再生)によって改善できる可能性がある(Bassoら、1996;Bavettaら、1999;Bazanら、1995;Beattieら、1997;Behrmannら、1994;Betheaら、1999;BleschとTuszynski、1997;Bregman、1998;Brewerら、1999;ConstantiniとYoung、1994;Croweら、1997;Franzenら、1998;Haubenら、2000;Liuら、1994;Moalemら、1999)。
CNSの損傷への免疫の関与は、回復に有害な作用を有し、二次的な傷害を媒介することに活発な役割を演じると長い間考えられてきた。一次病変は局所炎症を含めた変化を引き起こす。ごく最近まで、炎症細胞は傷害の拡散を部分的に担うため、脊髄損傷後の免疫活性を全て回避し最小化すべきであるという意見の一致がみられた。したがって、メチルプレドニゾロンのような大用量の抗炎症剤を用いた治療によって、脊髄損傷後の炎症を減らすことに試行が集中した。
最近2、3年の研究は、もしも適正に調節されるなら、細胞性免疫は損傷した脊髄の再増殖に中心的な役割を演じることを示す証拠をもたらした(Butovskyら、2001;Haubenら、2001;Haubenら、2000;Haubenら、2001;Haubenら、2000)。脊髄損傷又は視神経損傷後に適正に調節された免疫応答は、損傷を免れた繊維を二次変性から保護し、傷害を受けた繊維の細胞体を救い、切断された軸索の再増殖を促進することを助ける。中枢神経系(CNS)関連ミエリン抗原に特異的なT細胞を受動免疫又は能動免疫すると、視神経挫滅又は脊髄挫傷のラット及びマウスモデルにおいて二次変性が減少する(Fisherら、2001;Haubenら、2000;Moalemら、1999;Yolesら、2001)。さらに、完全に離断した脊髄又は視神経に、自己坐骨神経で活性化したマクロファージを局所移植すると、機能の回復を幾分伴う再生性増殖が生じる(Franzenら、1998;Lazarov−Spieglerら、1996;Rapalinoら、1998)。
米国特許第5800812号、第6117424号及び第6267955号は全て本出願人に譲渡されているが、哺乳動物のCNSにおける軸索の再生の促進に自己単核食細胞を使用するための方法と組成物を開示している。例えば損傷した脊髄における、損傷部又はその近辺で哺乳動物のCNSに投与する前に、神経セグメント、真皮、皮膚のような刺激性組織と共に、又は1つ若しくは複数の前記刺激性組織で馴化した培地と共に、或いは刺激性細胞若しくは刺激性細胞で馴化した培地と共に、或いは少なくとも1つの生物活性作用物質、例えばGM−CSF、IL−2、IL−3、IL−4、IL−10のようなサイトカインと共に、単核食細胞を培養することによってそれらの細胞を好ましくは活性化する。
本出願人のPCT公報WO99/60021は、損傷又は疾患の影響を改善するためにCNS又はPNSにおける変性を防止又は阻害するための組成物を記載している。その組成物は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、それ由来のペプチド又はそれで活性化されたT細胞のような神経系(NS)特異的抗原を含む。本出願人のPCT公報WO02/055010は、損傷又は疾患の影響を改善するための、CNS若しくはPNSにおける神経再生を促進するための、又は変性を弱めるか阻害するための医薬組成物を開示している。その医薬組成物は、CNS特異的抗原由来の自己ペプチドの変更によって得られるペプチドか、又はそのような変更CNSペプチドによって活性化されたT細胞を含む。その変更は、自己ペプチドの1つ又は複数のアミノ酸残基を種々のアミノ酸残基と置換することにあり、前記変更CNSペプチドは自己ペプチドによって認識されるT細胞受容体を依然として認識できるが、親和性は低い。
コポリマーCop1及びそれを用いて活性化されたT細胞は、神経保護性を付与しグルタミン酸塩の毒性からCNS細胞を保護することが示された。PCT公報WO01/52878及びWO01/93893は共に本出願人のものであるが、Cop1、Cop1関連ペプチド及びポリペプチド、並びにそれを用いて活性化されたT細胞が、グルタミン酸塩の毒性からCNS細胞を保護し、さらにCNS又はPNSにおいてニューロンの変性を防止若しくは阻害するか、又は神経の再生を促進することを開示している。WO03/0022140も本出願人のものであるが、(以前はポリGTと呼ばれポリYEとも名付けられた)コポリマーであるポリGlu50Tyr50、及びそれを用いて活性化されたT細胞がグルタミン酸塩の毒性からCNS細胞を保護し、さらにCNS又はPNSにおいてニューロンの変性を防止若しくは阻害するか、又は神経の再生を促進することも開示している。具体的には、前記出願では、視神経繊維において生存している網膜神経節細胞数が、アジュバント及びPBSを免疫されたマウスよりもCop1又はポリGlu,Tyrを免疫されたマウスで有意に大きかったことを示した。上に引用した個々の及び全ての特許及び特許出願は、ここに完全に開示されるかのごとく、これによってその全体が参照として組み入れられる。
効果的な免疫応答は、2つの主要な細胞群、すなわちリンパ球(B細胞及びT細胞)と抗原提示細胞を必要とする。抗原を単独で認識できるB細胞上の膜結合抗体とは異なり、膜上のT細胞受容体は、主要組織適合複合体(MHC)分子と呼ばれる細胞膜糖タンパク質と結合した抗原のみを認識できる。MHC分子には主に2種がある。MHCクラスI分子はほぼ全ての有核細胞に発現し、MHCクラスII分子は抗原提示細胞(APC)にのみ発現する。表面にCD4膜糖タンパク質が存在することが特徴的なヘルパーT(TH)細胞は、APCの表面のMHCクラスII分子と共に表出される抗原を認識すると活性化する。
APCはまず抗原をインターナリゼーションし、次にMHCクラスII分子と結合した抗原の一部を膜上に表出する。TH細胞はAPCの膜上で抗原−MHCクラスII分子複合体を認識しその複合体と相互作用する。さらにAPCは付加的な補助刺激シグナルを生成し、TH細胞を活性化させる。
多様な細胞がAPCとして機能できる。これらの細胞の顕著な特性は、MHCクラスII分子を発現できることと、補助刺激シグナルを送達できることである。3種の細胞、樹状細胞、マクロファージ及びBリンパ球がプロAPCとして分類されている。
樹状細胞(DC)は造血幹細胞から骨髄系系列を介して派生するが、発生の正確な経路は完全には解明されていない。DCは単球/マクロファージ系列の一部として発生するか、又は全く別個の系列から発生するかは明らかでない。血液DCは骨髄のミエロイド系前駆細胞から発生し、組織において多様な種類のDCに分化する。それらのDCは組織の特異的部位に応じて、ランゲルハンス細胞(表皮と粘膜)、間質DC(心臓、肺、肝臓、腎臓、消化管)、指状かん入DC(二次リンパ組織のT細胞領域及び胸腺髄質に存在)及び循環DC(血液及びリンパ、血中白血球の0.1%を構成する)に分類される。
種々の部位に存在するDCは種々の形態と機能を有するが、それらの全てがMHCクラスII分子及びB7補助刺激ファミリーの構成成分、すなわち糖タンパク質B7−1及びB7−2、の両者を高レベル構成性発現するプロAPCである。このことから、ナイーブTH細胞に対してMHCクラスII分子と共に抗原を効果的に提示すること、及び完全なT細胞活性化に必要な補助刺激シグナルを送達することも可能となる。その補助刺激シグナルはナイーブT細胞を増殖させ、特異的な機能を成し遂げるエフェクターT細胞に分化させる。これらの特徴のために、DCはAPCとして機能できるようになる前に活性化される必要があるマクロファージ及びB細胞よりも強力なAPCであるとみなされている。ノンプロAPCとして分類される他の数種の細胞を、MHCクラスII分子及び補助刺激シグナルを発現するように誘導できる。
相当数の文献が、樹状細胞(DC)の主要な役割を一般に免疫応答の、特に自己免疫応答の促進とモジュレーションであるとしている(Knightら、2002;Linkら、2001)。DCは主要な機能が抗原提示である免疫細胞である。DCはナイーブT細胞を刺激し、T細胞応答の質を調節し、一次免疫応答を開始する並はずれた能力を有する(MellmanとSteinman、2001)。DCの作用は活発な自己免疫の付与から免疫寛容の付与まで多様であり、DCはT細胞の分化に変化を引き起こすことができる(Dittelら、1999;Turley、2002;Xiaoら、2001)。
免疫制御に果たすDCの多様な活性は、DCのサブセット及び系列の多様性並びにまだ未熟であるもののDCの機能的柔軟性と相関する(Liu、2001)。これらの細胞の成熟状態、並びにそれらの細胞が活性化するときの量と状況は、生じる休止免疫応答の性質を決定する。DCの分化の別個の3段階について最近記載され、DCが部分的に成熟しているか半成熟しているときに寛容が付与される一方で、完全に成熟したDCのみが免疫原性であることが示唆された。T細胞介在性免疫応答を誘導する決定的シグナルは、DCからの前炎症性サイトカイン、具体的にはインターロイキン(IL)−12、IL−6及びTNF−αの放出を伴うCD86(B7.2)及びMHCクラスII(MHC−II)分子の発現であると考えられる(LutzとSchuler、2002)。
DCはナイーブヘルパーT細胞と細胞傷害性T細胞の両方を感作する独特の能力を保持することから、感染症、癌及び自己免疫疾患の免疫応答のモジュレーションにDCを使用できる可能性があることに多くの関心が集まった。癌の免疫療法、並びに細菌、ウイルス及び他の病原体感染の免疫療法に樹状細胞性ワクチンが提案された。
本出願のいかなる節におけるいかなる参照の引用又は確認も、そのような参照が本発明の従来技術として利用できるという承認として解釈するものではない。
本発明によると、ミエリン塩基性タンパク質配列由来ペプチド(MBP87−99)又は前記ペプチドのアミノ酸91をアラニンに置換した類似体(MBP−A91)をパルスされた樹状細胞を局所注射すると、脊髄挫傷後のラットが劇的に回復することが発見された。
よって、一側面では本発明は、抗原提示細胞(APC)及び薬学的に許容性の担体を含む医薬組成物を提供し、ここで前記APCは、
(a)神経系(NS)特異的抗原又はその類似体、
(b)NS特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
(c)コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド、コポリマー1関連ポリペプチド及びポリGlu50Tyr50から成る群から選択されるコポリマー、並びに
(d)非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされたものである。
(a)神経系(NS)特異的抗原又はその類似体、
(b)NS特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
(c)コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド、コポリマー1関連ポリペプチド及びポリGlu50Tyr50から成る群から選択されるコポリマー、並びに
(d)非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされたものである。
本発明のAPCにはヒト単球、マクロファージ、B細胞及びさらに好ましくは樹状細胞が含まれるが、それらに限定されない。
本発明の医薬組成物は神経保護、すなわちCNS若しくはPNSにおけるニューロンの変性の防止若しくは阻害に、又は神経再生の促進に、具体的には軸索の傷害を生じているか軸索の傷害を伴うものを含めたCNSの損傷、障害又は疾患の治療に有用である。
別の側面では、本発明は神経保護の方法、すなわちCNS又はPNSにおけるニューロンの変性を防止又は阻害する方法を提供する。その方法は、それを必要とする個体に、上記作用物質(a)〜(d)から成る群から選択される作用物質をパルスされた有効量のAPCを投与することを含む。
具体的な一実施形態ではこの神経保護方法は、軸索の傷害を生じたか、又は軸索の傷害を伴うものを含めたCNSの損傷、障害又は疾患におけるニューロンの変性を防止又は阻害することを目的とする。
さらなる側面では、本発明はCNS又はPNSにおける神経再生を促進する方法を提供し、その方法はそれを必要とする個体に、上記作用物質(a)〜(d)から成る群から選択される作用物質をパルスされた有効量のAPCを投与することを含む。
本発明によると、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)ペプチドを特異的にパルスされたDCをラットの脊髄挫傷部位に注射した。この注射の目的は、損傷部位に豊富に存在する抗原に対する十分に制御された適応免疫応答を刺激することであった。我々は、MBPペプチドをパルスされたDCを使用すると、免疫系を活用する方法が得られるであろうと仮定し、損傷した脊髄組織の保護と再生の両面に対するMBPペプチドの機能を探索した(Haubenら、2000;Rapalinoら、1998)。併発する自己免疫疾患のリスクを低下させる一方で良好な転帰を得ようと、我々は改変ペプチドリガンドである、位置91のアミノ酸リシンをアラニンと置換したMBPセグメント(アミノ酸87〜99)でもDCをパルスした。この変更ペプチド(MBP−A91)は、弱自己反応性T細胞を活性化することによって実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘導するリスクなしに自己免疫を誘導して、本来の脳炎誘発ペプチドと交差反応することが示された(Gaurら、1997)。損傷した脊髄を有するラットにワクチンとして使用すると、そのペプチドは防御性自己免疫を誘発できる(Haubenら、2001b)。結果は、MBP由来ペプチドをパルスされたDCは、SCI後に局所又は全身のどちらかに注射されるならば、移動活動の回復を促進することを示した。MRIによって形態学的及び解剖学的に測定した組織の保存性にも回復が現れた。
一側面では、本発明はヒトAPC及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供し、ここで前記APCは、
(a)神経系(NS)特異的抗原又はその類似体、
(b)NS特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
(c)コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド、コポリマー1関連ポリペプチド及びポリGlu50Tyr50から成る群から選択されるコポリマー、並びに
(d)非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされたものである。
(a)神経系(NS)特異的抗原又はその類似体、
(b)NS特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
(c)コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド、コポリマー1関連ポリペプチド及びポリGlu50Tyr50から成る群から選択されるコポリマー、並びに
(d)非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされたものである。
本明細書において使用されるように、「APC」という用語は、限定することなしに末梢血から得られた単球、組織又は腔を含めた部位から得られるマクロファージ、骨髄又は血液から得られたマクロファージ前駆細胞を培養することによって誘導されたマクロファージ、脾臓、リンパ節皮膚及びリンパ液を含めた部位から得られた樹状細胞(DC)、骨髄又は血液から得られるDC前駆細胞を培養することによって誘導されたDC、並びに骨髄又は血液から得られたB細胞を含むことを意図する。
ヒトAPCは循環から、又はAPCが属する組織から得ることができる。末梢血は、単球、マクロファージ、DC及びB細胞の、容易に利用できる態勢の整った供給源であり、本発明の好ましい実施形態に係り供給源として使用される。他の供給源からのAPCは当技術分野で十分に公知であり、そのようなAPCには、限定することなしに、腹腔又は胸腔のような漿膜腔から得られたマクロファージ、肺胞マクロファージ、及び(肝臓における)クッパー細胞及び(CNSにおける)小膠細胞のような種々の用語で知られている可能性のある他の組織(例えば肝臓、脾臓、胸腺)に関連するマクロファージがある。さらにAPCには、Bリンパ球と、いっそう好ましくはDCがある。
一実施形態ではAPCは、これによって完全に開示されたとして本明細書に参照として組み込まれる本出願人のPCT/IL02/00930に記載されているような、血液から調製できるヒトマクロファージ又は単球である。前に指摘した米国特許第5800812号、第6117424号及び第6267955号に記載したように、単球及びマクロファージを真皮、皮膚又は神経分節のような組織と共に培養することによって、それらの細胞を任意選択でまず刺激してもよい。
好ましい一実施形態では、APCは、皮膚の表皮(ランゲルハンス細胞)のような非リンパ組織及び脾臓、骨髄、リンパ節及び胸腺のようなリンパ組織、並びに血液(血液DC)及びリンパ(ベール細胞)を含めた循環系を含めた、ヒトDCが存在する組織から得ることができるヒトDCである。ヒト末梢血は、容易に利用できる態勢の整ったヒトDCの供給源であり、本発明の好ましい実施形態に係る供給源として使用される。さい帯血はヒトDCの別の供給源であり、望まれるならばさい帯血はDCの供給源として使用でき、そのDCは必要ならば後で使用するために凍結保存できる。
本発明に特に好ましいのは、治療用製剤を投与される被験者の末梢血から精製された自己DCの使用である。
APC、具体的にはDCは、ヒト末梢血を含めてそれらの細胞が属する組織に少数しか存在しないため、それらのAPCを使用するには濃縮するか単離しなければならない。濃縮法は当業者に十分公知であり、濃縮法には限定することなしに水ひ、Percoll勾配のような適当な密度の材料を通過する遠心分離のような反復密度勾配分離法、及び正の選択、負の選択及びそれらの組合せ、並びに適当な表面に選択的に接着させた後、低温で又は低濃度の二価陽イオンでの取り出し、機械的取り出し又はリドカイン存在下での取り出しがある。
好ましい一実施形態では、APCはFicol又はPercoll勾配で分画し、Percollの界面から富単球画分を回収し、適当な培地で再懸濁し、テフロン(登録商標)バッグに入れて37℃で培養することによって、末梢血から得られる。
いったんDCが得られたら、それらのDCを適当な培地で培養して、細胞数を増やし、かつ/又は抗原の取込み、プロセシング及び提示に最適な状態にDCを維持する。
ヒトではDCは3つのサブセット、すなわち共にミエロイド系である、表皮の基底層及び基底層上層に局在するランゲルハンス細胞(LC)、及び真皮及び大部分の臓器に存在する間質DC又は皮膚DC、並びに血液及びリンパ系器官に存在するCD4+、CD11c−、CD13−、CD33−及びCD123+であるリンパ系DCを含む。
本発明のDCは、好ましくはリンパ系サブセット由来の自己DCである。血液、骨髄及びリンパ系組織からDCを単離するための標準法でそれらのDCを単離することができる。好ましくは細胞の少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも70%、いっそうさらに好ましくは少なくとも80%、及びなおさらに好ましくは少なくとも90%がDCである。実質的に精製されたDCの調製物、例えば細胞の少なくとも95%がDCであるような調製物が特に好ましい。
インビトロDC培養系によって高度に純粋なDCを多数作り出すことが可能である。DCは骨髄又は末梢血に存在するCD34+造血前駆細胞から培養でき(Cauxら、1997、1996)、CD34+前駆細胞から分化した3種の血液前駆細胞であるCD14+単球(Sallustoら、1994)、CD11c+前駆細胞及びCD11c−前駆細胞(Geijtenbeekら、2000)からも培養できる。
本発明に係り、血液から単離されたDCはHoら、2002が記載したように外因性サイトカインなしに培養できるし、又はDCは少なくとも1つの生物学的に活性な刺激性作用物質を含有する培地で培養される。その作用物質にはトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)、βインターフェロン(IFN−β)、IFN−γ、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターロイキン2(IL−2)、IL−3、IL−4、IL−6、IL−10、単球遊走活性化因子(MCAF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、コロニー刺激因子1(CSF−1)、神経栄養因子3(NT−3)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、リピドA、トリペプチドfMet−Leu−Phe(Fmlp)、ムラミルジペプチド(MDP)、カルシウムイオノホアA23187、ビタミンD3結合タンパク質、T細胞類似体であるCD40リガンド(CD40L)、及びリポ多糖(LPS)のような細菌産物があるが、それらに限定されない。
一実施形態では、血液又は骨髄のCD34+細胞由来の機能的DCをカルシウムイオノホア処理と組み合わせた二段階培養によって作り出すことができる。その培養では、第一段階でCD34+造血前駆細胞をSCF、IL−3、IL−6及びG−CSFが存在する培地で約10日間培養し、次にDCを誘導するためにGM−CSF、IL−4及びTNF−α存在下で7〜11日間培養しカルシウムイオノホア剤A23187で処理する(Liuら、2002)。補助刺激分子(CD86、CD80)の発現はイオノホア剤でさらに処理することによって上向き調節される。
別の実施形態では、GM−CSF及びIL−13を含む培地で、さらに好ましくはGM−CSF及び/又はIL−4の存在下でDCを培養する。本発明によると、GM−CSF及びIL−4の存在下で7日間培養すると大量のDCが得られた。好ましい一実施形態では、インビトロ培養でDCの「成熟性」を適当な状態に維持するために、GM−CSF、IL−4又はそれらの両方の存在下で、好ましくはそれぞれ約500unit/mlの組合せで細胞を培養する。
プラスチック組織培養フラスコのような適当な細胞培養装置で、又はさらに有利には疎水性培養バッグで、DCを培養できる。閉鎖系でDCを発生させ、抗原を負荷し、成熟させることができることから、その培養バッグの方が、臨床用DCワクチンの調製に適することが示された(Guyreら、2002)。
成熟時にDCは表現型と機能に大きな変化を遂げる。エンドサイトーシス受容体と食作用受容体が消失する一方で、高レベルのMHCクラスII分子の表面発現、T細胞刺激に必要な補助刺激分子(CD80、CD86及びCD40)の上向き調節、及び成熟DCの独特のマーカーであるCD83の発現が起こる(BanchereauとSteinman、1998)。接着分子(ICAM−1及びVLA4)を含めた他の数種の分子も上向き調節される。後期エンドソームでの抗原(Ag)プロセシングは外来細胞及び感染性微生物の短鎖ペプチドへの分解を必要とし、その短鎖ペプチドは膜タンパク質のMHCIIと結合する。MHCIIのAg提示能を最大化するために、成熟DCはMHCII分子の生合成を一過性に増加させ、最も顕著にはMHC分子は細胞膜に大規模に輸送され、そこではエンドサイトーシスの速度が低下しているためにMHC分子の半減期が延長する(Pierreら、1997)。多数のMHCII分子が細胞膜に蓄積し、さらに補助刺激分子の発現が増加することで、Tリンパ球に対する高度に効率的なAg提示が可能になる。細胞表面ではこれらの分子は数日間安定で、CD4+T細胞による認識に利用され得る。
本発明の一実施形態では、APC、好ましくはDCは、上記のように好ましくは活性化後に、NS特異的抗原、好ましくはCNS特異的抗原又はその類似体をパルスされる。「NS特異的抗原」という用語は、ここではT細胞を特異的に活性化し、活性化後に活性化T細胞が患者のNSの損傷、障害又は疾患部位に蓄積するNS抗原のことを呼ぶ。本発明のNS特異的抗原の例には、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)、S−100、βアミロイド、Thy−1、P0、ミエリン抗原P2、神経伝達物質受容体、Nogoタンパク質(Nogo−A、Nogo−B及びNogo−C)、及びNogo受容体(NgR)があるが、それらに限定されない。この定義には前記NS特異的抗原の類似体も含まれる。
別の実施形態では、APC、好ましくはDCは上に定義されるNS特異的抗原に由来するペプチドをパルスされる。本明細書において使用されるように、「NS特異的抗原由来ペプチド」という用語は、NS特異的抗原の配列内に含まれるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
さらに好ましい実施形態では、そのペプチドはヒトMBP配列(配列番号1、Genbank寄託番号307160)に由来する、すなわちそのペプチドはMBP配列内に含まれる配列を有する。これらのMBPペプチドには、MBPの残基75〜95、86〜95、82〜98及び好ましくは残基87〜99を含むペプチドがあるが、それらに限定されない。好ましい一実施形態では、MBPペプチドは、ヒトMBPのアミノ酸残基87〜99(ここではMBP87−99と呼ぶ)から成る配列番号2のペプチドであり、
ValHisPhePheLysAsnIleValThrProArgThrPro
の配列である。
ValHisPhePheLysAsnIleValThrProArgThrPro
の配列である。
本発明の別の好ましい実施形態では、APC、好ましくはDCは、ここで「改変ペプチドリガンド」又は「APL」と呼ぶ改変ペプチドをパルスされる。その改変ペプチドはNS抗原由来ペプチドの類似体であり、MHC結合部位ではなくTCR結合部位の重要なアミノ酸が改変されることによって、その改変ペプチドは脳炎誘発しないが依然としてT細胞受容体を認識する。
さらに好ましい実施形態では、本発明の変更CNSペプチドは配列番号2のMBPペプチドの類似体であり、そのペプチドには、MBP87−99のLys残基91をGly(MBP−G91、配列番号3)若しくはAla(MBP−A91、配列番号4)に置換したペプチドか、又はPro残基96をAla(MBP−A96、配列番号5)に置換したペプチドがあるが、それらに限定されない。これらのペプチドの配列を以下に示す。
多発性硬化症の治療のためにUS5948764に開示されたような、ヒトMBPの残基86〜99由来で、位置91、95又は97を改変したような他の類似体も本発明に包含される。
さらなる実施形態では、APC、好ましくはDCはCop1、又はCop1関連ペプチド若しくはポリペプチドをパルスされる。コポリマー1又はCop1は、4つのアミノ酸であるチロシン−グルタミン酸−アラニン−リシンから成るランダム共重合体であり、MBPと機能的に交差反応し抗原提示をMHCクラスII上でMBPと競合できる。酢酸グラチラマーの一般名で知られている酢酸塩の形のCop1は、COPAXONE(登録商標)(Teva Pharmaceuticals Ltd.、ペターティクヴァ、イスラエル)の商品名で多発性硬化症の治療用に数か国で承認されている。共に2001年1月22日出願の米国特許出願第09/756301号及び第09/765644号に記載されているように、Cop−1関連ポリペプチドを調製できる。両出願は、これによってここに完全に開示されたかのごとく参照によりその全体が組み込まれる。Cop−1関連ペプチドはWO/005249に開示され、その全体の内容はこれによって参照によりここに組み込まれる。
さらに別の実施形態では、APC、好ましくはDCは、上に指摘した本出願人のWO03/022140に指摘された、以前はポリGTと呼ばれpEYとも名付けられたポリGlu50Tyr50をパルスされる。
いっそうさらなる実施形態では、APC、好ましくはDCは、卵アルブミン及び破傷風毒素を例とするが、それらに限定されない非自己抗原をパルスされる。次に、前記非自己抗原を以前に免疫されたことのある、必要とする個体に、その非自己抗原をパルスされたDCを局所移植する。通常は、その非自己抗原の免疫は損傷の発生後すぐに実施され、パルスされたDCがその6〜14日後にその損傷部位に移植される。このように、非自己抗原に特異的なT細胞が、他の特異性を有するT細胞に混じって損傷部位に達するが、前記特異的T細胞のみがAPC上に露出する抗原によって活性化され、神経保護作用を表出する。この点で、非自己抗原である卵アルブミンに特異的なT細胞が、損傷部位に蓄積するが神経保護作用を有さないことが本発明者らによって示されたことに気付くと興味深い(Hirschbergら、1998)。しかし、本発明によると卵アルブミンが損傷部位に移植されたAPCによって提示されると、卵アルブミンを予め免疫することによって発生した卵アルブミン特異的T細胞は損傷部位に蓄積し、活性化して神経保護作用を発揮する。非自己抗原が破傷風毒素の場合、損傷直後の免疫は通常必要ではない。それは、人口の大部分となる個体が過去に破傷風毒素を免疫されているからである。
本発明によると、培養後にDCをすぐに使用することもできるし、凍結保存することもできる。さらなる使用には、DCを収集し、例えば10%ジメチルスルホキシド及び2%ヒトアルブミンを含有する溶液のような凍結保護剤で処理し、バッグに入れ、そのバッグを−80℃の冷凍庫に直接入れるか、−1℃/minの古典的な液体窒素速度調節冷凍庫を使って凍結保存する。凍結した調製物を用時に解凍し患者に投与する。抗原をパルスする前にDCを凍結して貯蔵し、それから抗原をパルスして患者に投与することもできる。DCの免疫表現型及びT細胞刺激能はDCの凍結と解凍によって変化しなかったことを複数の研究が示した(Garderetら、2001)。
本発明の医薬組成物の調製には、滅菌した薬学的に許容できる担体に、抗原をパルスされた細胞を懸濁する。好ましい実施形態では、その薬学的に許容できる担体はPBS、培地又はその細胞が懸濁される薬学的に許容できる流体である。しかし、代替的な薬学的に許容できる担体は、当業者にたやすく明らかとなるであろう。
本発明の医薬組成物は、中枢神経系(CNS)又は末梢神経系(PNS)におけるニューロンの変性の防止若しくは阻害に、又は神経再生の促進に有用であり、具体的には、軸索の傷害を生じるか、軸索の傷害を伴うものを含めて、CNS若しくはPNSの損傷、障害若しくは疾患により引き起こされるニューロンの変性の防止又は阻害に有用である。
その損傷、障害又は疾患は、脳、脊髄又は視神経を含めたPNS又はCNSのいかなる部位にも位置し得る。そのような損傷、障害又は疾患の一例は、脊髄損傷、鈍性外傷、脳の直撃又は対側衝撃、穿通外傷、神経外科手術又は他の手技を施行する際に被る外傷を含めた外傷である。そのような損傷、障害又は疾患の別の例は、出血性卒中又は虚血性卒中を含めた卒中である。そのような損傷、障害又は疾患のさらに別の例は、眼関連疾患、例えば緑内障、年齢関連黄斑変性、視神経障害又は網膜変性である。PNS又はCNSの損傷、障害又は疾患のいっそうさらなる例には、糖尿病性神経障害、老人性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経(ベル)麻痺、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ビタミン欠乏症、てんかん、健忘症、不安、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、オピエート耐性及び依存症がある。
被験者が、遺伝、代謝、毒性、栄養、感染又は自己免疫起源の神経障害のような、中枢神経系又は末梢神経系の他の疾患も有しているか否かにかかわりなく、本発明の組成物及び方法は、軸索の傷害を生じるおそれのあるCNS損傷、障害又は疾患を治療するために有用である。
本発明は、CNS若しくはPNSにおけるニューロンの変性を防止若しくは阻害するための、又は神経の再生を促進するための方法もさらに提供し、その方法は、それを必要とする個体に抗原をパルスされた細胞、好ましくは本明細書において記述するような抗原をパルスされた有効量の樹状細胞を投与することを含む。
NS抗原をパルスされたAPC、好ましくはDCは患者の局所又は全身に、例えば静脈内、皮下、皮内、気管内又は鼻腔内に投与され得る。
好ましい実施形態では、APC、好ましくはDCはCNS損傷直後に投与され、神経外科的に適した手法で、例えばガラス製マイクロピペット又は注射筒を用いてCNS損傷部位に、又はその部位の近くに導入される。しかし、本発明は、CNSが損傷、障害又は疾患を負った後のいかなる時点で、例えば1週間以内、2週間以内又はそれを超えてDCを投与することも包含している。
ヒトに使用するときの、抗原をパルスされた細胞の至適用量は、本明細書において記述されたラットの実験から導き出すことができる。そのラットの実験によると、局所投与で脊髄損傷を治療するときの至適用量は、ラットの脊髄1つあたり5×105個のDC、i.v.投与では106個のDC、s.c.投与では2×106個のDCであることが分かった。当業者に明白であるように、治療される病変又は損傷部位で影響を受けている神経繊維の数に比例して用量を増減できる。ヒトでは、細胞の量と注射の回数は細胞の遊走特性と傷害を受けた繊維の領域に応じて計算しなければならないであろう。神経変性障害の治療には、注射するDCの数は傷害を受けた組織の面積あたりで計算すべきである。
本発明の一実施形態では、付随する自己免疫疾患のリスクなしに良好な転帰を得ようと、ミエリン抗原、すなわちペプチドMBP87−99を特異的にパルスしたDCが使用された。代替的に、MBP−A91と名付けた改変ペプチドリガンドをパルスされたDCが使用された。そのペプチドリガンドは本来の脳炎誘発ペプチドと交差反応するが実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘導せず、損傷した脊髄を有するラットに適用すると防御自己免疫を誘導できたことが示された(Haubenら、2001b)。
本明細書において述べた結果は、インビトロでミエリン由来脳炎誘発ペプチドMBP87−99又は非脳炎誘発性MBP−A91をパルスされた骨髄由来DCを局所投与することによって処理されたラットが、脊髄挫傷から劇的に回復したことを示した。機能的回復の増進は、オープンフィールドにおける移動に、並びに形態学的及び免疫細胞化学的に測定された神経組織の生存の向上に現れた。形態解析から、空洞形成の減少及び新芽形成の増加を実証した。
脊髄損傷からの回復が、十分に制御された局所免疫応答を増強することによって助長できることを認識して、本発明は、抗原又はワクチンの全身投与によって活性化されたT細胞を注射することよりもむしろ、ミエリン抗原に感作された効果的なAPC、すなわちDCを局所投与する有効性を実験した。本明細書における結果は、ビヒクルを注射された対照に比べ、選択されたペプチドをパルスされたDCの注射を受けた脊髄損傷ラットで、有意に回復が向上したことを示した。
損傷が誘導する自己破壊過程は不完全な脊髄損傷(SCI)後に重大な機能的喪失を引き起こす。自然免疫応答の細胞要素(マクロファージ)及び適応免疫応答の細胞要素(T細胞)の両方は、適正に活性化され調節されるなら、SCI後に外傷後再増殖と保護を促進する。樹状細胞(DC)はエフェクターT細胞及び制御性T細胞の活性化を誘発し、自然免疫系と適応免疫系の機能を連結する。これらの細胞は病原性作用物質に対する身体応答も開始及び調節し、外来抗原及び自己抗原の両方に対する免疫応答を制御する。本出願の本明細書において、MBP由来の脳炎誘発性又は非脳炎誘発性ペプチドをパルスされた骨髄由来DCを損傷後12日以内に(全身的に又は病変部位への局所注射により)投与するとき、損傷後の注射によって重症の不完全SCIからの有意かつ顕著な回復が生じることが示される。成熟T細胞を欠如したDCレシピエンドでは有意な保護はみられなかった。フローサイトメトリー、RT−PCR及び増殖アッセイはここで調製され使用されたDCが成熟していて免疫原性であったことを示した。まとめると、本結果はDC介在性神経保護がT細胞依存性全身免疫応答の誘導を介して達成されたことを示している。神経組織のより良好な保存並びに嚢胞及び瘢痕組織の形成の減少は、DCで処理されたラットにおける機能的回復の改善を伴った。抗原特異的DCの使用は、自己免疫応答の一過性誘導を介して、免疫介在性修復及び維持、並びに自己破壊性化合物からの保護という最大の利益を得るための効果的な方法となり得る。
本発明の範囲を制限しようと望むことなしに、本発明の好ましい側面を例示するために以下の実施例を提供する。
材料と方法
(a)動物
近交系のLewis又はSprague−Dawley(SPD)成ラット(10〜12週齢、200〜250g)をWeizmann科学研究所動物繁殖センター(レホヴォト、イスラエル)から調達した。照明と温度を調節した室内でラットを飼育し、各実験で齢を合わせた。実験動物の管理のための国立衛生研究所及びWeizmann科学研究所のガイドラインに従って全ての動物を取り扱った。
(a)動物
近交系のLewis又はSprague−Dawley(SPD)成ラット(10〜12週齢、200〜250g)をWeizmann科学研究所動物繁殖センター(レホヴォト、イスラエル)から調達した。照明と温度を調節した室内でラットを飼育し、各実験で齢を合わせた。実験動物の管理のための国立衛生研究所及びWeizmann科学研究所のガイドラインに従って全ての動物を取り扱った。
(b)抗原
変更(非脳炎誘発)MBPペプチドを、脳炎誘発ペプチドであるMBPアミノ酸87〜99の、リシン残基91をアラニンに置換することによって誘導した(A91、Weizmann科学研究所、レホヴォト、イスラエルで合成)。実験に使用した全てのペプチドは逆相HPLC(RP−HPLC)による確認では>95%の純度を有した。卵アルブミンをSigma、イスラエルから購入した。
変更(非脳炎誘発)MBPペプチドを、脳炎誘発ペプチドであるMBPアミノ酸87〜99の、リシン残基91をアラニンに置換することによって誘導した(A91、Weizmann科学研究所、レホヴォト、イスラエルで合成)。実験に使用した全てのペプチドは逆相HPLC(RP−HPLC)による確認では>95%の純度を有した。卵アルブミンをSigma、イスラエルから購入した。
(c)RT−PCR(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)
TRI Reagent(登録商標)を用いて総RNAを抽出した。第一鎖cDNA合成反応では、RNAを65℃で5分間温置し、氷冷し、次にオリゴdTプライマー、50mMのTris−HCl(pH8.3)、75mMのKCl、3mMのMgCl2、20mMのDTT、0.5mMのdNTP混合物、及びSuperScript II RNアーゼ逆転写酵素(Life Technologies、ロックヴィル、メリーランド州)200Uの存在下で42℃で1時間逆転写した。プライマー50〜70pmol、0.1mMのdNTP混合物、10mMのTris−HCl(pH8.8)、1.5mMのMgCl2、50mMのKCl及び0.1%のTriton X−100の存在下でDyNAzyme II DNAポリメラーゼ(Finnzymes Oy、リヒトントゥンティー、フィンランド)0.6Uを用いて、生成したcDNAを増幅した。サイクリング条件は、94℃で30秒間の変性、60℃で1分間のアニーリング、72℃で2分間の伸長、及び最終サイクル後の72℃で7分間であった。L−19では24サイクル、IL−6では34サイクル、TNF−αでは33サイクル及びIL−12p−40では34サイクルでcDNA試料を増幅した。PCR産物を1.5%アガロースゲルで電気泳動してから臭化エチジウムで染色して可視化した。以下のプライマーを使用した。
TRI Reagent(登録商標)を用いて総RNAを抽出した。第一鎖cDNA合成反応では、RNAを65℃で5分間温置し、氷冷し、次にオリゴdTプライマー、50mMのTris−HCl(pH8.3)、75mMのKCl、3mMのMgCl2、20mMのDTT、0.5mMのdNTP混合物、及びSuperScript II RNアーゼ逆転写酵素(Life Technologies、ロックヴィル、メリーランド州)200Uの存在下で42℃で1時間逆転写した。プライマー50〜70pmol、0.1mMのdNTP混合物、10mMのTris−HCl(pH8.8)、1.5mMのMgCl2、50mMのKCl及び0.1%のTriton X−100の存在下でDyNAzyme II DNAポリメラーゼ(Finnzymes Oy、リヒトントゥンティー、フィンランド)0.6Uを用いて、生成したcDNAを増幅した。サイクリング条件は、94℃で30秒間の変性、60℃で1分間のアニーリング、72℃で2分間の伸長、及び最終サイクル後の72℃で7分間であった。L−19では24サイクル、IL−6では34サイクル、TNF−αでは33サイクル及びIL−12p−40では34サイクルでcDNA試料を増幅した。PCR産物を1.5%アガロースゲルで電気泳動してから臭化エチジウムで染色して可視化した。以下のプライマーを使用した。
(d)ラット樹状細胞の調製
DCを以前に記載された方法(Lutzら、1999;Talmorら、1998)を幾分修正して骨髄から発生させた。安楽死させた雄性成SPDラット(7〜11週齢)から大腿骨と脛骨を取り出し、筋肉と結合組織を除き、70%エタノールに3分間浸して消毒してから、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。骨の両端をハサミで切断し、23Gの注射針をつけた注射筒を用いカルシウム及びマグネシウムを含有しないPBSで髄を流し出した。強くピペッティングして細胞塊を壊した。赤血球をACK緩衝液で溶解させた。骨髄細胞を計数し、250ml容のフラスコに2〜5×106細胞/mlの濃度で広げた(総量15ml)。ペニシリン及びストレプトマイシン(100μg/ml)、L−グルタミン(2mM)、β−メルカプトエタノール(50μM)、ピルビン酸塩(1mM)、非必須アミノ酸(1:100)、及び10%熱不活性化ウシ胎仔ろ過血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(以後DC培地と呼ぶ)に細胞を増殖させた。サイトカインである組換えマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(rmGM−CSF、PeproTech、ロッキーヒル、ニュージャージー州)及び組換えマウスインターロイキン4(rmIL−4、PeproTech)を共に20ng/mlの濃度で第0日に添加した。第2日及び第4日に培地をサイトカイン類を補充したDC培地と交換し、浮遊細胞を捨てた。第7日に細胞を集め、遠心分離し、特異的抗原(20μg/ml)を含有する新鮮DC培地(サイトカインを添加せず、2×106細胞/ml)に再懸濁した。細胞にパルスし(すなわち抗原と共に2時間培養し)、新鮮DC培地で洗浄し、注射まで氷冷して保存した。注射の直前に細胞を遠心分離し、PBSに再懸濁した(局所注射にはPBS5μlに5×105個の細胞、静脈内(i.v.)注射にはPBS1mlに1×106個の細胞、皮下(s.c.)注射にはPBS1mlに2×106個の細胞)。局所注射では細胞をハミルトンシリンジに入れ、損傷部位の脊髄に注射した。s.c.注射では、細胞を頚部の2か所の注射部位に注射した(各0.5ml)。i.v.注射では細胞を尾静脈に注射した。
DCを以前に記載された方法(Lutzら、1999;Talmorら、1998)を幾分修正して骨髄から発生させた。安楽死させた雄性成SPDラット(7〜11週齢)から大腿骨と脛骨を取り出し、筋肉と結合組織を除き、70%エタノールに3分間浸して消毒してから、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。骨の両端をハサミで切断し、23Gの注射針をつけた注射筒を用いカルシウム及びマグネシウムを含有しないPBSで髄を流し出した。強くピペッティングして細胞塊を壊した。赤血球をACK緩衝液で溶解させた。骨髄細胞を計数し、250ml容のフラスコに2〜5×106細胞/mlの濃度で広げた(総量15ml)。ペニシリン及びストレプトマイシン(100μg/ml)、L−グルタミン(2mM)、β−メルカプトエタノール(50μM)、ピルビン酸塩(1mM)、非必須アミノ酸(1:100)、及び10%熱不活性化ウシ胎仔ろ過血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(以後DC培地と呼ぶ)に細胞を増殖させた。サイトカインである組換えマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(rmGM−CSF、PeproTech、ロッキーヒル、ニュージャージー州)及び組換えマウスインターロイキン4(rmIL−4、PeproTech)を共に20ng/mlの濃度で第0日に添加した。第2日及び第4日に培地をサイトカイン類を補充したDC培地と交換し、浮遊細胞を捨てた。第7日に細胞を集め、遠心分離し、特異的抗原(20μg/ml)を含有する新鮮DC培地(サイトカインを添加せず、2×106細胞/ml)に再懸濁した。細胞にパルスし(すなわち抗原と共に2時間培養し)、新鮮DC培地で洗浄し、注射まで氷冷して保存した。注射の直前に細胞を遠心分離し、PBSに再懸濁した(局所注射にはPBS5μlに5×105個の細胞、静脈内(i.v.)注射にはPBS1mlに1×106個の細胞、皮下(s.c.)注射にはPBS1mlに2×106個の細胞)。局所注射では細胞をハミルトンシリンジに入れ、損傷部位の脊髄に注射した。s.c.注射では、細胞を頚部の2か所の注射部位に注射した(各0.5ml)。i.v.注射では細胞を尾静脈に注射した。
(e)脊髄損傷
Rompun(キシラジン、10mg/kg、Vitamed、イスラエル)及びVetalar(ケタミン、50mg/kg、Fort Dodge Laboratories、フォートドッジ、アイオワ州)を筋肉内注射することでラットを麻酔した。T8レベルの椎弓切除によってラットの脊髄を露出させた。麻酔導入の1時間後に椎弓切除した脊髄に、NYUインパクターを用いて50mmの高さから10gの棒を落とした(「重症の」損傷と定義)(Bassoら、1996;Haubenら、2000;Haubenら、2000;Young、1996)。NYUインパクターは、十分に校正した挫傷を脊髄に負わせることが示された装置である。
Rompun(キシラジン、10mg/kg、Vitamed、イスラエル)及びVetalar(ケタミン、50mg/kg、Fort Dodge Laboratories、フォートドッジ、アイオワ州)を筋肉内注射することでラットを麻酔した。T8レベルの椎弓切除によってラットの脊髄を露出させた。麻酔導入の1時間後に椎弓切除した脊髄に、NYUインパクターを用いて50mmの高さから10gの棒を落とした(「重症の」損傷と定義)(Bassoら、1996;Haubenら、2000;Haubenら、2000;Young、1996)。NYUインパクターは、十分に校正した挫傷を脊髄に負わせることが示された装置である。
(f)DC投与のための実験プロトコル
骨髄由来の培養DCに、MBPペプチド87−99、MBP由来改変ペプチドA91又は卵アルブミン(20μg/ml)を2時間パルスし、得られたDCをPBSで洗浄し、注射直前に適当な数と体積に調整した。(e)に上述したようにNYUインパクターを用いてSPDラット又はLewisラットの脊髄にT9レベルで挫傷を負わせた。対照群のラットにはPBS5μlを注射するかパルスされていないDCを注射した。SCIの直後に、処理群には損傷部位の局所に、又は頚部の隣接する2部位の皮下に、又は尾静脈内に、PBSに懸濁した(d)に記録した濃度のDCを注射した。対照ラットには処理ラットと同体積のPBSをそれぞれ局所又は皮下又は静脈内に注射した。
骨髄由来の培養DCに、MBPペプチド87−99、MBP由来改変ペプチドA91又は卵アルブミン(20μg/ml)を2時間パルスし、得られたDCをPBSで洗浄し、注射直前に適当な数と体積に調整した。(e)に上述したようにNYUインパクターを用いてSPDラット又はLewisラットの脊髄にT9レベルで挫傷を負わせた。対照群のラットにはPBS5μlを注射するかパルスされていないDCを注射した。SCIの直後に、処理群には損傷部位の局所に、又は頚部の隣接する2部位の皮下に、又は尾静脈内に、PBSに懸濁した(d)に記録した濃度のDCを注射した。対照ラットには処理ラットと同体積のPBSをそれぞれ局所又は皮下又は静脈内に注射した。
遅延処理の効果を調べるために、ラットをSCIの12又は28日後に麻酔し、椎弓切除領域を露出させ、損傷した脊髄を覆う治癒組織を注意深く分離することによって脊髄をさらに露出させた。上記のようにDC又はPBSを次に脊髄に注射した。
(g)脊髄挫傷からの回復の評価
後肢の移動行動から機能的回復を測定した。尺度0(完全麻痺)から21(正常な運動性)までの尺度のBasso、Beattie及びBresnahanのオープンフィールド移動評価尺度(BBB)を用いてこれを評点した(Bassoら、1996;Haubenら、2001;Haubenら、2000;Jakemanら、2000;Maら、2001;Young、1996)。評点を盲検化して、観察者が各ラットの受けた処理を認知できないことを確実にした。ほぼ1週間に1回、平坦な滑らない床面をもつ成形プラスチックでできた円形の囲い(直径90cm、壁の高さ7cm)の中心に動物を4分間置くことによってオープンフィールドにおける体幹、尾及び後肢の移動活動性を評価した。それぞれの評価の前に、ラットに会陰感染、後肢の創傷、並びに尾及び足の自食症がないか注意深く観察した。
後肢の移動行動から機能的回復を測定した。尺度0(完全麻痺)から21(正常な運動性)までの尺度のBasso、Beattie及びBresnahanのオープンフィールド移動評価尺度(BBB)を用いてこれを評点した(Bassoら、1996;Haubenら、2001;Haubenら、2000;Jakemanら、2000;Maら、2001;Young、1996)。評点を盲検化して、観察者が各ラットの受けた処理を認知できないことを確実にした。ほぼ1週間に1回、平坦な滑らない床面をもつ成形プラスチックでできた円形の囲い(直径90cm、壁の高さ7cm)の中心に動物を4分間置くことによってオープンフィールドにおける体幹、尾及び後肢の移動活動性を評価した。それぞれの評価の前に、ラットに会陰感染、後肢の創傷、並びに尾及び足の自食症がないか注意深く観察した。
(h)動物の飼育
脊髄損傷ラットでは、自動性排泄が回復する第2週の終わりまで1日に2回(損傷後の初めの48時間では1日3回)、膀胱の圧搾を手で援助した。尿路感染の証拠又は全身疾患の何か他の兆候がないかラットを注意深く監視した。挫傷後第1週に、さらにその期間の後に血尿が生じた場合、ツベルクリン用シリンジ(1日に溶液0.3ml)で経口投与することで、1クールのスルファメトキサゾール(400mg/ml)及びトリメトプリム(8mg/ml)(Resprim、Teva Laboratories、イスラエル)をラットに服用させた。日常視診には、椎弓切除部位に感染の証拠がないか観察すること、及び後肢に自食症又は圧迫の兆候がないか評価することを含めた。
脊髄損傷ラットでは、自動性排泄が回復する第2週の終わりまで1日に2回(損傷後の初めの48時間では1日3回)、膀胱の圧搾を手で援助した。尿路感染の証拠又は全身疾患の何か他の兆候がないかラットを注意深く監視した。挫傷後第1週に、さらにその期間の後に血尿が生じた場合、ツベルクリン用シリンジ(1日に溶液0.3ml)で経口投与することで、1クールのスルファメトキサゾール(400mg/ml)及びトリメトプリム(8mg/ml)(Resprim、Teva Laboratories、イスラエル)をラットに服用させた。日常視診には、椎弓切除部位に感染の証拠がないか観察すること、及び後肢に自食症又は圧迫の兆候がないか評価することを含めた。
(i)組織学
表示した時点でラットに0.1Mの冷PBS(pH7.4)100mlを4℃で心臓内に潅流してから、4%パラホルムアルデヒド200ml(グルコースを5%含む0.1MのPBS、pH7.4に調製)を潅流した。脊髄を取り出し、10%リン酸緩衝ホルムアルデヒドで一晩、後固定し、エタノールで一晩脱水し、パラフィンブロックに包埋した。各ブロックから調製した連続切片(4μm)をヘマトキシリン及びエオジン、又はルクソールファストブルーで染色した。
表示した時点でラットに0.1Mの冷PBS(pH7.4)100mlを4℃で心臓内に潅流してから、4%パラホルムアルデヒド200ml(グルコースを5%含む0.1MのPBS、pH7.4に調製)を潅流した。脊髄を取り出し、10%リン酸緩衝ホルムアルデヒドで一晩、後固定し、エタノールで一晩脱水し、パラフィンブロックに包埋した。各ブロックから調製した連続切片(4μm)をヘマトキシリン及びエオジン、又はルクソールファストブルーで染色した。
(j)増殖アッセイ
各群ラット3匹を損傷後12日に安楽死させ、脾臓を切除し、圧迫して微小ワイヤメッシュに通した。ACK溶解緩衝液(BioSource、米国)で赤血球を溶解後、脾臓細胞をPBSで洗浄し、L−グルタミン(2mM)、β−メルカプトエタノール(5×10−5M)、ピルビン酸ナトリウム(1mM)、ペニシリン(100IU/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、非必須アミノ酸及びラット自己血清1%(vol/vol)を補充したDMEMを含む増殖用培地に再懸濁した。コンカナバリンA(Con A、1.25μg/ml)若しくはMBP81−99(10μg/ml)若しくはMBP68−82(10μg/ml)若しくはMBP−A91(10μg/ml)若しくはMOG35−55(10μg/ml)を加えてあるか、又は抗原を加えない培地100μlで平底マイクロタイターウェルで1試料あたり4穴を使って、脾臓細胞を37℃で72時間、相対湿度90%及び7%CO2で培養した(細胞3×106個/ml)。72時間の培養の最終16時間に各穴に添加された3[H]チミジン(1μCi/穴)の取込みを測定することによって増殖応答を決定した。
各群ラット3匹を損傷後12日に安楽死させ、脾臓を切除し、圧迫して微小ワイヤメッシュに通した。ACK溶解緩衝液(BioSource、米国)で赤血球を溶解後、脾臓細胞をPBSで洗浄し、L−グルタミン(2mM)、β−メルカプトエタノール(5×10−5M)、ピルビン酸ナトリウム(1mM)、ペニシリン(100IU/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、非必須アミノ酸及びラット自己血清1%(vol/vol)を補充したDMEMを含む増殖用培地に再懸濁した。コンカナバリンA(Con A、1.25μg/ml)若しくはMBP81−99(10μg/ml)若しくはMBP68−82(10μg/ml)若しくはMBP−A91(10μg/ml)若しくはMOG35−55(10μg/ml)を加えてあるか、又は抗原を加えない培地100μlで平底マイクロタイターウェルで1試料あたり4穴を使って、脾臓細胞を37℃で72時間、相対湿度90%及び7%CO2で培養した(細胞3×106個/ml)。72時間の培養の最終16時間に各穴に添加された3[H]チミジン(1μCi/穴)の取込みを測定することによって増殖応答を決定した。
(k)拡散異方性磁気共鳴画像法
ラットを安楽死させ、脊髄を摘出し、磁気共鳴画像法(MRI)で観察した。Bruker DMX400大口径スペクトロメーターで5mmのヘルムホルツコイルとアクティブ型シールド傾斜磁場を備えた顕微鏡プローブを用いて、拡散異方性を測定した。ラットの同一性は観察者には分からないようにした。軸位断で9個のマルチスライスエコー撮像を行い、中央のスライスが脊髄損傷の中心に位置するようにした。TE31ms、TR2000ms、拡散時間15ms、拡散傾斜持続時間3ms、視野0.6cm、マトリックスサイズ128×128ピクセル、スライス厚0.5mm及びスライス間1.18mmで画像を得た。左から右への画像は頭から足への軸位断を表す。4つの拡散傾斜値(0、28、49及び71g/cm)をリード方向(横拡散)又はスライス方向(縦拡散)に沿って適用した。各ピクセルについての重み付き最小二乗法による直線回帰を用いて、横(T)及び縦(L)方向のみかけの拡散係数のマップを得て、そのマップから異方性比率のマトリックスを導出した。各スライスにおいて蓄積した異方性を積分した。各ラットについてスライスの異方性の積分値が最小となったところを損傷部位と定義した。
ラットを安楽死させ、脊髄を摘出し、磁気共鳴画像法(MRI)で観察した。Bruker DMX400大口径スペクトロメーターで5mmのヘルムホルツコイルとアクティブ型シールド傾斜磁場を備えた顕微鏡プローブを用いて、拡散異方性を測定した。ラットの同一性は観察者には分からないようにした。軸位断で9個のマルチスライスエコー撮像を行い、中央のスライスが脊髄損傷の中心に位置するようにした。TE31ms、TR2000ms、拡散時間15ms、拡散傾斜持続時間3ms、視野0.6cm、マトリックスサイズ128×128ピクセル、スライス厚0.5mm及びスライス間1.18mmで画像を得た。左から右への画像は頭から足への軸位断を表す。4つの拡散傾斜値(0、28、49及び71g/cm)をリード方向(横拡散)又はスライス方向(縦拡散)に沿って適用した。各ピクセルについての重み付き最小二乗法による直線回帰を用いて、横(T)及び縦(L)方向のみかけの拡散係数のマップを得て、そのマップから異方性比率のマトリックスを導出した。各スライスにおいて蓄積した異方性を積分した。各ラットについてスライスの異方性の積分値が最小となったところを損傷部位と定義した。
(l)嚢胞面積の測定
脊髄の縦方向の切片を作製する前に、(i)に記述したように各ラットを心臓内潅流した。脊髄を取り出し、(グルコース5%を含む0.1MのPBS、pH7.4で調製した)4%パラホルムアルデヒドで一晩、後固定し、PBSで短時間洗浄し、30%ショ糖溶液に移し、少なくとも3日間凍結保存した。全ての操作を4℃で行った。中央に損傷部位を有する脊髄の20mmのブロックを摘出し、Tissue−Tek(Miles、インディアナ州)に包埋し、液体窒素に入れた。クリオスタットを使って凍結した脊髄のブロックから縦方向の切片(厚さ20μm)を作製し、ゼラチンをコートしたスライドガラスに載せ、室温で乾燥させた。切片を70%エタノールを溶媒とする0.3%スダンブラックB溶液(メルク、ダルムシュタット、ドイツ)で1分間処理した。染色しすぎた場合は、満足な染色となるまで、その切片を新鮮70%エタノールに浸した。さらに分析するまで、そのスライドガラスを防湿庫に入れ4℃で保存した。各脊髄(各群についてn=4)からの50枚の切片を検査した。そのうち目的の両側と正中矢状領域に相当する5番目、25番目、45番目の切片を選択し、さらなる定量分析に供した。嚢胞の大きさを半自動画像解析で決定した。脊髄切片の境界を手動で規定することによって、ブランクのピクセル(すなわち組織が存在しないピクセル)の数を自動的に測定し(Image−Pro Plusプログラム)、嚢胞の累積サイズを得た(各ピクセルは1.8×1.8μm2)。
脊髄の縦方向の切片を作製する前に、(i)に記述したように各ラットを心臓内潅流した。脊髄を取り出し、(グルコース5%を含む0.1MのPBS、pH7.4で調製した)4%パラホルムアルデヒドで一晩、後固定し、PBSで短時間洗浄し、30%ショ糖溶液に移し、少なくとも3日間凍結保存した。全ての操作を4℃で行った。中央に損傷部位を有する脊髄の20mmのブロックを摘出し、Tissue−Tek(Miles、インディアナ州)に包埋し、液体窒素に入れた。クリオスタットを使って凍結した脊髄のブロックから縦方向の切片(厚さ20μm)を作製し、ゼラチンをコートしたスライドガラスに載せ、室温で乾燥させた。切片を70%エタノールを溶媒とする0.3%スダンブラックB溶液(メルク、ダルムシュタット、ドイツ)で1分間処理した。染色しすぎた場合は、満足な染色となるまで、その切片を新鮮70%エタノールに浸した。さらに分析するまで、そのスライドガラスを防湿庫に入れ4℃で保存した。各脊髄(各群についてn=4)からの50枚の切片を検査した。そのうち目的の両側と正中矢状領域に相当する5番目、25番目、45番目の切片を選択し、さらなる定量分析に供した。嚢胞の大きさを半自動画像解析で決定した。脊髄切片の境界を手動で規定することによって、ブランクのピクセル(すなわち組織が存在しないピクセル)の数を自動的に測定し(Image−Pro Plusプログラム)、嚢胞の累積サイズを得た(各ピクセルは1.8×1.8μm2)。
(m)FACS分析
骨髄由来培養DC(5×105個)をCD86−FITC(抗B7.2、マウスIgG1k、Pharmingen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)、OX6(抗MHC−IIマウスIgG1k、Pharmingen)、ED−1(Serotec、オックスフォード、イギリス)、CD45RA(Pharmingen)、及びそれらの対照抗体で染色した。正常マウス血清(2%)及び希釈した特異的抗体を含有するPBS100μl中に細胞を4℃で30分間放置した。細胞をPBS4mlで洗浄し、0.1%PFA溶液400μlに再懸濁した。試料をFACScan(Becton−Dickinson、ハイデルベルグ、ドイツ)で分析した。Leucoperm試薬(Serotec、オックスフォード、イギリス)を用いて製造業者の指示に従ってED−1を染色した。
骨髄由来培養DC(5×105個)をCD86−FITC(抗B7.2、マウスIgG1k、Pharmingen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)、OX6(抗MHC−IIマウスIgG1k、Pharmingen)、ED−1(Serotec、オックスフォード、イギリス)、CD45RA(Pharmingen)、及びそれらの対照抗体で染色した。正常マウス血清(2%)及び希釈した特異的抗体を含有するPBS100μl中に細胞を4℃で30分間放置した。細胞をPBS4mlで洗浄し、0.1%PFA溶液400μlに再懸濁した。試料をFACScan(Becton−Dickinson、ハイデルベルグ、ドイツ)で分析した。Leucoperm試薬(Serotec、オックスフォード、イギリス)を用いて製造業者の指示に従ってED−1を染色した。
(n)統計解析
行動及び形態データをStudentの両側t検定で解析した。オープンフィールド運動スコアを損傷後の種々の時点で測定したことから、反復のある2因子ANOVAでもデータを解析した。
行動及び形態データをStudentの両側t検定で解析した。オープンフィールド運動スコアを損傷後の種々の時点で測定したことから、反復のある2因子ANOVAでもデータを解析した。
実施例1:骨髄由来DCのキャラクタリゼーション
まずDC調製物の純度並びに細胞の成熟度を調べた。骨髄由来DCの表面の補助刺激B7.2(CD86)及びMHC−II分子の発現をフローサイトメトリーで分析した。図1Aに示すように、注射用に回収する時点(第7日)で、大部分の細胞(94%)はB7.2及びMHC−IIを発現したが、培養を開始した日(第0日)では、細胞の1.6%だけがこれらのDCマーカーを発現していた。
まずDC調製物の純度並びに細胞の成熟度を調べた。骨髄由来DCの表面の補助刺激B7.2(CD86)及びMHC−II分子の発現をフローサイトメトリーで分析した。図1Aに示すように、注射用に回収する時点(第7日)で、大部分の細胞(94%)はB7.2及びMHC−IIを発現したが、培養を開始した日(第0日)では、細胞の1.6%だけがこれらのDCマーカーを発現していた。
高レベルのB7.2及びMHC−IIを発現する可能性のある他の種類の細胞にはマクロファージとB細胞がある。したがって、我々はフローサイトメトリーで第7日の培養物を分析し、マクロファージのマーカーであるED−1及びB細胞のマーカーであるCD45RAの発現を調べた。図1Bのヒストグラムは、細胞はこれらのマーカーの両方に関して陰性であったことを示している。
我々はDCの成熟度について、及び抗原の曝露によってその成熟度が影響を受けるかについても検討した。DCにMBP−A91をパルスする前後に、細胞からRNAを抽出し、RT−PCRを行ってサイトカインであるTNFα、IL−12及びIL−6の発現を検出した。成熟DCはこれら全てのサイトカインを発現するが、半成熟DC又は未熟DCはそれらを発現しないことが知られている(LutzとSchuler、2002)。図1Cに示すように、MBP−A91をパルスされたDCはこれらのサイトカインの3つ全てを発現したため、成熟していると特徴付けられた。パルスされていないDCも同様のサイトカインを発現した。よって、本実施例で使用したDCは成熟していて、その成熟度は抗原をパルスしたことには依存しなかったとみられる。
実施例2:SCIを負ったラットに及ぼす、MBP87−99又はその類似体MBP−A91をパルスされた樹状細胞の作用:ミエリンペプチドに曝露された骨髄由来DCの局所移植はSCIからの機能的回復を促進する
(e)の方法の項に述べたように、雄性SPDラットに重症の挫傷を負わせた。MBPペプチド87−99又は変更した(よって、もはや脳炎を誘発しない)ペプチドMBP−A91を、(2時間培養することによって)パルスされた骨髄由来DCを損傷直後のラットに、方法の項で述べたように局所注射した。対照群にはビヒクル(PBS)を局所注射した。BBB移動評価尺度の0〜21の尺度(Bassoら、1996)で機能的回復を評価した。ここで0は運動性なし、21は完全な運動性を示す。盲検化して評点することで、ラットの同一性を確実に隠した。
(e)の方法の項に述べたように、雄性SPDラットに重症の挫傷を負わせた。MBPペプチド87−99又は変更した(よって、もはや脳炎を誘発しない)ペプチドMBP−A91を、(2時間培養することによって)パルスされた骨髄由来DCを損傷直後のラットに、方法の項で述べたように局所注射した。対照群にはビヒクル(PBS)を局所注射した。BBB移動評価尺度の0〜21の尺度(Bassoら、1996)で機能的回復を評価した。ここで0は運動性なし、21は完全な運動性を示す。盲検化して評点することで、ラットの同一性を確実に隠した。
重症の挫傷とPBSの局所注射後に、ラットは初発ショックからの極めて限られた回復を示した(図2)。しかし、MBP87−99(図2A)又はMBP−A91(図2B)をパルスされたDCを使って処理された損傷ラットは、有意な回復の改善を示し、その改善は挫傷性SCIの11日後に検出できた(図2A、2B)。処理を受けたラットの70%から80%で回復が明らかで、一部のラットでは移動スコア9に達し(図2C)、後肢の関節3か所全てで広範囲の運動が現れ(BBBスコア7)、足底を着け(BBB=8)、静止して体重を支えた(BBB=9)。処理ラットにおける平均BBBスコア±SEMは6.4±0.9であった(図2B、2C)。対照ラットでは、本実験セットで得られた最高のBBBスコアは、後肢の関節のわずかな運動に現れた4で、平均スコアは2.3±0.6であった。
局所注射されたDCが脊髄の回復を促進する能力に、抗原特異性が役割を果たすかどうかを検討するために、我々はパルスされていないDC及び卵アルブミンのような関連性のない抗原をパルスされたDCの効果を2組の別々の実験で試験した。結果は、パルスされていないDCで処理された動物の回復は、PBSで処理された対照と有意差がないことを示した(図3A)。独立した付加的な4実験で同様の結果を得た。卵アルブミンをパルスされたDCも回復にいかなる影響も及ぼさなかった(図3B)。
重症の脊髄挫傷及び、MBPペプチド87−99をパルスされたDCの局所注射又はPBS注射を行った3.5か月後に摘出したラット脊髄の組織分析は、空洞形成が少なく損傷部位が小さいことから明らかなように、対照(n=4)よりもDC処理ラット(n=4)で組織の保存が有意に良好であることを示した(図4A対4B)。処理ラットの病変部位は対照よりも有意に(1/2〜1/3に)縮小していた。各脊髄についておよそ50枚のスライスを検査し、その全てが同様のパターンを示した。DC処理された脊髄の嚢胞面積は未処理脊髄における面積よりも縮小していた。各脊髄からの3切断面を表す異なる3つのスライスで嚢胞の定量を行い、その3切断面と同じ平面が全ての脊髄を代表するようにした。異なる4匹の動物での3枚のスライスの平均値を図4Cに示す。嚢胞面積の比較から有意差が示され、MBPペプチドをパルスされたDCを用いた処理で脊髄空洞(脊髄中心の空洞形成)の量が減少することを示唆した。
自己免疫性疾患の誘導に感受性を有するラットの系統と抵抗性を有するラットの系統の間で(Haubenら、2001;Kipnisら、2001)、さらに雄性と雌性のマウス又はラットの間で(Haubenら、2002)、SCIからの自然回復に差があることが報告されている。したがって、EAE感受性系統である雌性Lewisラットを、MBP由来ペプチドをパルスされたDCで処理することの効果を検討することは興味深かった。図5は、MBP−A91をパルスされたDCを外傷後に局所注射することが脊髄損傷した雌性Lewisラット6匹の機能的回復に及ぼす有意な効果をPBSを注射された雌性同腹仔と比較して表したものである(反復のある2因子ANOVA、P≦0.01、df=1、F検定=8.701)。PBSを注射された対照のBBBスコアの最高値は5.2±0.2(平均±SEM)であったが、MBP−A91をパルスされたDCを注射されたラットでは最大平均スコア7.2±0.4(P≦0.005、Studentの両側t検定)に達した(図5A)。SCIの6か月後に各群のラット2匹の脊髄を摘出し、組織分析用に加工した。各脊髄からおよそ20枚の切片(4μm)を検査した。各群からの代表的な切片を図5B及び5Cに示す。MBP−A91をパルスされたDCで処理されたラットの脊髄はニューロン組織の保存性が高く、空洞形成が少ないことを示した。
実施例3:脊髄損傷からのDC誘導性の回復の根拠となる免疫学的メカニズムへの洞察
観察された、DC処理による神経保護作用がT細胞依存性であるかどうかを決定するために、出生時に胸腺切除を行って成熟T細胞を欠く成雄性SPDラットを脊髄損傷させ、MBP−A91をパルスされたDCを局所注射した。正常なT細胞の機能が存在しないとき、MBP−A91をパルスされたDCは機能的回復に有意な効果を及ぼさなかった(図6)。示した結果は、胸腺摘出されたSPDラットを用いて施行された3つの実験のうち代表的な1つの実験のものである。雄と雌で同様の結果を得た。1つの実験と別の実験で動物の体重が変動したため、常に同じ実験の群間でBBBスコアを比較したことに注意すべきである。よって、胸腺摘出された動物の対照群でBBBスコアが比較的高いことを、これらの動物でDCが回復を促進しなかったという論拠としてとらえるべきではない。胸腺摘出されたラットでT細胞介在性応答が欠如していることを、アジュバントに入れたウシ血清アルブミンをラットに注射し、ワクチン接種に応答した脾臓細胞のエクスビボ増殖応答を評価することで確認した(データは表示せず)。
観察された、DC処理による神経保護作用がT細胞依存性であるかどうかを決定するために、出生時に胸腺切除を行って成熟T細胞を欠く成雄性SPDラットを脊髄損傷させ、MBP−A91をパルスされたDCを局所注射した。正常なT細胞の機能が存在しないとき、MBP−A91をパルスされたDCは機能的回復に有意な効果を及ぼさなかった(図6)。示した結果は、胸腺摘出されたSPDラットを用いて施行された3つの実験のうち代表的な1つの実験のものである。雄と雌で同様の結果を得た。1つの実験と別の実験で動物の体重が変動したため、常に同じ実験の群間でBBBスコアを比較したことに注意すべきである。よって、胸腺摘出された動物の対照群でBBBスコアが比較的高いことを、これらの動物でDCが回復を促進しなかったという論拠としてとらえるべきではない。胸腺摘出されたラットでT細胞介在性応答が欠如していることを、アジュバントに入れたウシ血清アルブミンをラットに注射し、ワクチン接種に応答した脾臓細胞のエクスビボ増殖応答を評価することで確認した(データは表示せず)。
我々は、グラム陰性菌の細胞壁糖脂質成分であり、感染に関連した炎症に役割を果たす(GalanosとFreudenberg、1993;UlevitchとTobias、1994)リポ多糖(LPS)によって活性化されたDCが、さらに強い免疫応答を誘導することによって機能的回復を促進するかどうかについても検討した。結果は、LPSと共にDCを培養しても有意な有益効果を誘導しないことを示した。さらに、LPSとMBP−A91の両方をパルスされたDCはMBP−A91のみをパルスされたDCと同じ効果を示した(データは表示せず)。これらの結果は、脊髄の回復に必要な局所免疫応答が抗原特異性であることを示唆している。
実施例4:MBP−A91をパルスされた樹状細胞の全身投与は機能的回復を促進する
DCが成熟していてそれらの作用機序がT細胞依存性であることが分かったことから、回復に及ぼす有益効果が全身投与によって再現できるかを確認することが興味深かった。我々は、パルスされたDCの全身注射がパルスする抗原に特異的な全身T細胞応答を誘発できるかどうかをまず検討した。脊髄損傷した雄性SPDにMBP−A91をパルスされた1×106個のDC又はPBSをi.v.注射した(図7)。その10日後に各群のラット3匹を安楽死させ、脾臓を取り出し、脾臓細胞の増殖を種々のミエリンペプチドの存在下で試験した。図7Aは、対照であるミエリン由来ペプチドMOG35−55の存在下での脾臓細胞の増殖に対する試験したペプチドそれぞれ(MBP−A91、MBP81−99及びMBP68−82)の存在下での脾臓細胞の増殖を示す。PBSを注射されたラットではなく、MBP−A91をパルスされたDCをi.v.注射されたラットの脾臓細胞は、MOGペプチドよりもMBPペプチドに対して有意に強力なT細胞応答を表出した。これらの結果は、MBP−A91をパルスされた1×106個のDCを全身投与すると、直接関連するMBPペプチドであるA91に対する、及びMBP81−99のような他のMBP由来ペプチドに対する、並びに恐らくエピトープ拡散のメカニズムを介してMBP68−82にも対するT細胞応答を誘発することを示唆している(Wildbaumら、2002)。
DCが成熟していてそれらの作用機序がT細胞依存性であることが分かったことから、回復に及ぼす有益効果が全身投与によって再現できるかを確認することが興味深かった。我々は、パルスされたDCの全身注射がパルスする抗原に特異的な全身T細胞応答を誘発できるかどうかをまず検討した。脊髄損傷した雄性SPDにMBP−A91をパルスされた1×106個のDC又はPBSをi.v.注射した(図7)。その10日後に各群のラット3匹を安楽死させ、脾臓を取り出し、脾臓細胞の増殖を種々のミエリンペプチドの存在下で試験した。図7Aは、対照であるミエリン由来ペプチドMOG35−55の存在下での脾臓細胞の増殖に対する試験したペプチドそれぞれ(MBP−A91、MBP81−99及びMBP68−82)の存在下での脾臓細胞の増殖を示す。PBSを注射されたラットではなく、MBP−A91をパルスされたDCをi.v.注射されたラットの脾臓細胞は、MOGペプチドよりもMBPペプチドに対して有意に強力なT細胞応答を表出した。これらの結果は、MBP−A91をパルスされた1×106個のDCを全身投与すると、直接関連するMBPペプチドであるA91に対する、及びMBP81−99のような他のMBP由来ペプチドに対する、並びに恐らくエピトープ拡散のメカニズムを介してMBP68−82にも対するT細胞応答を誘発することを示唆している(Wildbaumら、2002)。
これらの発見に励まされ、我々は脊髄損傷ラットの機能的回復にこの全身投与経路が及ぼす効果を検討した。雄性SPDラットにSCIを負わせ、その直後に、MBP−A91をパルスされたDCをi.v.注射によって投与した。損傷の15日後から、試験した全ての時点で回復に及ぼす有意な効果を観察した(図7B、7C)。ラットで達成された最高スコアは9.5で、他の経路で注射されたラットのスコアよりも有意に高いとはいえなかったが、i.v.注射後に回復したラットの数は他の経路で処理後に観察された数よりも大きかった。興味深いことに、脊髄損傷したSPDラットでは、MBP−A91をパルスされたDC(2×106個の細胞/ラット)をs.c.注射によって投与しても、PBSを注射された対応のある対照で得られたよりも有意に良好な回復が生じた(反復のある2因子ANOVA、P≦0.01、df=1、F検定=12.353)(図8)。本実験に使用したSPDラットは雌で、よって自然回復は雄よりも良好であったことに注意(図8)。
実施例5:脊髄挫傷後に樹状細胞ワクチン接種を行える時間の猶予(therapeutic window)
MBP−A91をパルスされたDCを遅延局所注射する効果を検討するために、雄性SPDラット20匹に重症の脊髄挫傷を負わせ、損傷後10日間のそれらのラットのBBB移動スコアを監視した。第11日に、BBBスコアが最も低いラット12匹をランダムに2群に分けた。両群の平均BBBスコア±SEMは同様であった(第1群で1.0±0.4、第2群で0.9±0.25、Studentの両側t検定でP≦0.87)。翌日(SCIの12日後)、一方の群のラットの病変部位に、MBP−A91をパルスされた5×105個のDCを注射し、もう一方の群にパルスされていないDCを注射した。損傷後第29日から、その2群のラットにおける移動(BBB)スコアに有意差を認めた(P≦0.05、Studentの両側t検定;図9A、9B)。MBP−A91をパルスされたDCを用いた遅延処理が機能的回復に及ぼす全般的な効果は、統計的に有意であった(反復のある2因子ANOVA、P≦0.05、df=1、F検定=6.206)。MBP−A91をパルスされたDCの局所投与を損傷後28日目に実施することでこの典型的な実験を繰り返したときには、DCは移動の回復に有意な効果を示さなかった(図9C、9D)。
MBP−A91をパルスされたDCを遅延局所注射する効果を検討するために、雄性SPDラット20匹に重症の脊髄挫傷を負わせ、損傷後10日間のそれらのラットのBBB移動スコアを監視した。第11日に、BBBスコアが最も低いラット12匹をランダムに2群に分けた。両群の平均BBBスコア±SEMは同様であった(第1群で1.0±0.4、第2群で0.9±0.25、Studentの両側t検定でP≦0.87)。翌日(SCIの12日後)、一方の群のラットの病変部位に、MBP−A91をパルスされた5×105個のDCを注射し、もう一方の群にパルスされていないDCを注射した。損傷後第29日から、その2群のラットにおける移動(BBB)スコアに有意差を認めた(P≦0.05、Studentの両側t検定;図9A、9B)。MBP−A91をパルスされたDCを用いた遅延処理が機能的回復に及ぼす全般的な効果は、統計的に有意であった(反復のある2因子ANOVA、P≦0.05、df=1、F検定=6.206)。MBP−A91をパルスされたDCの局所投与を損傷後28日目に実施することでこの典型的な実験を繰り返したときには、DCは移動の回復に有意な効果を示さなかった(図9C、9D)。
実施例6:MBPペプチドをパルスされた樹状細胞をワクチン接種後に神経組織の保存性が改善することの形態学的証拠
挫傷性SCIの直後に、MBP−A91をパルスされたDC又はPBSを損傷部位に局所注射した9か月後に、各群の安楽死させた雄性SPDラット2匹から脊髄部(中央に損傷部位を有する約3cm)を摘出し、拡散強調MRI(DW−MRI)でスキャンした。1.18mm間隔で0.5mmの仮想スライスを分析した。得られた軸位の画像を解析してみかけの拡散係数、及び白質の完全性のマーカーである組織の異方性の値を得た(Nevoら、2001)。DW−MRI画像から得られた軸位の異方性のマップは、摘出された脊髄に沿った拡散異方性の連続面積を表す。MBP−A91をパルスされたDCで処理された群のマップでは、異方性の面積はPBS処理された対照群よりも大きい(図10A)。処理ラットにみられる連続的な縦方向の構造と対照的に、PBSを注射された対照から得たスライスは、構築された構造が病変部位の中心で消失し、病変部位から離れたスライスでも拡散異方性の面積が比較的小さい(図10A)。さらに、異方性値の積分を表す異方性和(SAI)は、走査した部分の全長にわたって対照よりもMBP−A91をパルスされたDCで処理されたラットで高かった(図10B)。行動の転帰はMRIの結果とよく相関した。すなわち行動スコアが高いほど病変部位でみられた拡散異方性の面積が大きかった(Haubenら、2000)。
挫傷性SCIの直後に、MBP−A91をパルスされたDC又はPBSを損傷部位に局所注射した9か月後に、各群の安楽死させた雄性SPDラット2匹から脊髄部(中央に損傷部位を有する約3cm)を摘出し、拡散強調MRI(DW−MRI)でスキャンした。1.18mm間隔で0.5mmの仮想スライスを分析した。得られた軸位の画像を解析してみかけの拡散係数、及び白質の完全性のマーカーである組織の異方性の値を得た(Nevoら、2001)。DW−MRI画像から得られた軸位の異方性のマップは、摘出された脊髄に沿った拡散異方性の連続面積を表す。MBP−A91をパルスされたDCで処理された群のマップでは、異方性の面積はPBS処理された対照群よりも大きい(図10A)。処理ラットにみられる連続的な縦方向の構造と対照的に、PBSを注射された対照から得たスライスは、構築された構造が病変部位の中心で消失し、病変部位から離れたスライスでも拡散異方性の面積が比較的小さい(図10A)。さらに、異方性値の積分を表す異方性和(SAI)は、走査した部分の全長にわたって対照よりもMBP−A91をパルスされたDCで処理されたラットで高かった(図10B)。行動の転帰はMRIの結果とよく相関した。すなわち行動スコアが高いほど病変部位でみられた拡散異方性の面積が大きかった(Haubenら、2000)。
考察
上に表した結果は、インビトロでMBP由来ペプチド又は関連ペプチドをパルスされた骨髄由来DCの局所又は全身注射によって処理されたラットでは、挫傷性SCI後の移動機能が有意に改善したことを示している。その処理の有益効果は形態学的にも明らかで、組織観察でみられる神経組織のより良好な保護とMRIで観察された処理ラットの脊髄における空洞のサイズの減少を伴った。
上に表した結果は、インビトロでMBP由来ペプチド又は関連ペプチドをパルスされた骨髄由来DCの局所又は全身注射によって処理されたラットでは、挫傷性SCI後の移動機能が有意に改善したことを示している。その処理の有益効果は形態学的にも明らかで、組織観察でみられる神経組織のより良好な保護とMRIで観察された処理ラットの脊髄における空洞のサイズの減少を伴った。
一般の仮説とは逆に、DCは髄膜及び脈絡叢を含めたCNSの特異的領域に分布することが分かった(McMenamin、1999)。このことから、DCがCNS環境を「採取」し、リンパ節でCNS抗原を提示することが恐らく可能となるであろう。他の器官と組織では、DCは生理条件でMHCに関連して自己抗原を提示するがそれらにたいして応答を開始する補助刺激能を欠いている。これはCNS抗原にも十分正しくあてはまる可能性があり、CNS関連自己抗原に対する末梢性免疫寛容の維持におそらく寄与するであろう。例えば細胞に対する損傷後のような病理状態では、DCは成熟過程を経て、高度に効果的で刺激的な方法でTリンパ球に組織由来抗原を提示できるようになる。成ラットのCNSの虚血性損傷後にDCは病変部位に蓄積し(Kostulasら、2002)、ラットでの挫傷性SCIにはDCの化学誘引物質の発現の上向き調節が続く(McTigueら、1998)。本発明人らは、損傷後のCNS自己抗原に対する適応免疫応答の刺激は、身体そのものの治癒メカニズムの正常な一部であること(Yolesら、2001)、及び「防御自己免疫」という新しく提唱された概念の主要な特徴を示した(Moalemら、1999;Schwartzら、1999)。
内因性自己免疫応答は、見たところ日々の維持には十分である(Nevoら、2003;SchwartzとKipnis、2002)が、CNSの外傷に伴う二次変性を阻止するには不十分なようである。しかし、自然免疫及び適応免疫の操作によって内因性自己免疫応答を増強することができる(Fisherら、2001;Haubenら、2000;Moalemら、1999)。DCは特異的免疫応答を開始することが示された。そのような操作は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発するために利用され、現在、癌療法のための臨床試験の途中である(Lauら、2001)。
多数の研究が、DCは免疫寛容を誘導できEAEの発生を阻止できると示した。それらの研究の全てで使用されたDCは、恐らく未熟又は半成熟であった(LutzとSchuler、2002)。表面マーカーと特異的サイトカインを使用することによって、我々は本出願で使用されたDCが成熟していることを示した。さらに、MBP関連ペプチドをパルスされたDCで処理されたラットから得た脾臓細胞のエックスビボでの増殖がMBPペプチドに応答して増強したという観察から、我々のDCが寛容を誘導することは除外された。この結論は、もしラットが新生仔のときにミエリン関連抗原に対して寛容となっていたなら、又はそれらの動物が免疫応答の発現能を抑制する制御性CD4+CD25+T細胞の投与を受けていたならば、それらのラットにおけるDNS損傷の転帰は悪化することを実証した我々の研究室の最近の実験結果と合致している(Kipnisら、2002;SchwartzとKipnis、2002)。
DCが効果的な免疫応答を刺激する能力を有するにもかかわらず、特異的脳炎誘発自己抗原をパルスされたDCによる、正常ラット又はマウスにおける免疫活性化が、我々の知るところでは、EAEを誘導すると示されたことは全くない。ある研究では、放射線照射されたマウスにおいてEAEがDCの投与により誘導されたが、それは同時にMBPという脳炎誘発ペプチドに特異的なCD4+T細胞が投与された場合だけであった(Dittelら、1999)。抗原をパルスされたDCは本研究でSCIからの回復を改善したが、我々の研究所ではそれらのDCをナイーブラットの局所(脊髄内)、皮下、又は静脈内に注射した後に、EAEの兆候は観察されなかった(データは表示しない)。よって、このような方法でDCで処理することは、破壊的な自己免疫を避ける一方で、望ましい免疫応答を誘発する限りにおいて安全であると思われる。
本出願における実験は、EAEに対する抵抗性とCNS外傷に耐える能力が異なるSPDとLewisという2系統のラットで実施された(Kipnisら、2001)。両系統において抗原をパルスされたDCを用いた処理は有効であった。Lewis系統で我々は、(BBBスコアで測定した)自然回復が明らかに雄性ラットよりも優れている雌性ラットを使用した(Haubenら、2002;Stein、2001)。それでもなお、DC処理は雌において依然有効であった。このことは雌の内因性応答は、損傷が誘導する変性の全てではなく一部を妨げることを示唆している。
たとえDC注射を損傷後12日間まで遅らせても、SCIからの回復が改善することを我々はここで示した。その実験で使用したラットの移動活性を処理前に評価し、BBBスコアが2以下のラットのみを使用した。ラットの均一な群をランダムに2群に分け、その一方をDCで処理し、もう一方を対照とした。この手法で、同一群内で、並びに処理群と非処理群との間で挫傷を受けたラット同士の傷害の重症度の変動を最小にした。興味深いことに、対照群ではわずかな改善だけを認めたが、処理ラットでの転帰は、損傷直後に処理された場合とほぼ同様に良好であった。この知見はDC処理ラットにおける機能的回復の根拠となるメカニズムが神経保護と新芽形成の両方を必要とすることを示唆している可能性もあろう。神経保護は軸索がまだ変性していない時期にだけ作動するという制限があるが、新芽形成はその後に大きく貢献する可能性がある。治療を行える時間の猶予が比較的広いことは、SCIの患者を治療する上で臨床的に重要であろう。ラットの横断した脊髄にマクロファージを移植することにより誘導された再生と機能的回復に関する以前の発見(Rapalinoら、1998)、並びにミエリンペプチドの受動又は能動免疫がマクロファージと小膠細胞の局所活性化を引き起こすという事実(Butovskyら、2001)を心に留めると同時に、DCの注射は未損傷の軸索に神経保護作用を示すこと加えて、新芽形成と損傷した軸索の再生を引き起こすという可能性が残る。
パルスされていないDC又は関連性のないタンパク質である卵アルブミンをパルスされたDCを用いた処理は、損傷した脊髄に効果を有さなかった。MBPペプチド又は改変MBPペプチドA91をパルスされたDCは有益で、成熟DCは抗原提示細胞として挙動し、よって脊髄損傷したラットに投与されるときは関連性のあるCNS抗原を伴う場合にのみ活性であり得ることを示した。
本発明の好ましい実施形態では、改変MBPペプチドA91をMBPの天然ペプチドの代わりに使用した。それは、改変ペプチドはSCI用のワクチンとしてMBPと同様に有効であるが脳炎誘発性ではないからである(Haubenら、2001b)。パルスされたDCとパルスされていないDCの間に表現型の差はなかった。それは両DCでサイトカインの発現が同等であることで示された。パルスされたDCと対照のパルスされていないDCの両方が富血清培地(10%ウシ胎仔血清)で培養中に、並びに特異的ペプチドが添加されたパルスの最終の2、3時間に、他の多くの無関係なタンパク質に曝露されていることを心に留めておくべきである。これらの事実は、その処理が抗原特異的であるという主張にさらにいっそう支持を添えるものである。さらに、強力な前炎症性化合物であるLPSによるDCの刺激は、抗原特異的なパルスの必要性を代替しなかった。
本出願でのいくつかの発見は、損傷した脊髄に及ぼすDCの効果に全身免疫メカニズムが介在することを示唆している。第一に、局所、皮下又は静脈内に投与されたDCの脊髄に対する効果に有意差はなかった。第二に、処理されたラットの脾臓細胞を種々の抗原でエックスビボで刺激すると、未処理ラットの脾臓細胞よりもミエリンペプチドに対して強い増殖応答を示した。これは、挫傷ラットに投与されたDCがミエリンペプチドに対して全身免疫応答を誘発したことを明らかに示している。その実験で投与されたDCは改変ミエリンペプチドA91(行動実験でDCにパルスするために使用されたペプチド)をパルスされたもので、そのDCは抗原の類似性とエピトープの拡散が原因でエックスビボで試験された優占的ミエリンペプチドに対する応答をおそらく誘発した。第三に、出生時に胸腺摘出されたラットに注射するとき、DCは挫傷性SCIからの回復に効果を及ぼさなかった。出生時に胸腺摘出されたラットが(新生仔の胸腺で通常発生する)成熟Tリンパ球を欠いていたことは、脊髄回復に及ぼすDCの有益効果は少なくとも部分的にT細胞に依存することを示している。このように注射されたDCは全身性の抗原特異的なT細胞依存性免疫応答を誘発する。
上に指摘したように、種々のDC投与経路は達成された最大の回復に有意には影響しなかったが静脈内投与で処理を行ったときにより多くのラットで高いBBBスコアを達成した。これはDCの皮下又は局所投与に比べて静脈内処理の均一性を反映しているのかもしれない。静脈内投与されたDCは脾臓及び他のリンパ器官に達すると想定することが妥当である。静脈内注射された成熟DCは注射後1日以内に脾臓に到達して脾臓のT細胞領域に選択的に局在することが示された(Saiら、2002)。DCの静脈内投与経路は免疫寛容の誘導(Mengesら、2002)と免疫活性化の誘導(Fongら、2001;Lauら、2001;Saiら、2002)の両方に有効であることが公知である。
本明細書における結果は特異的抗原をパルスされたDCが、SCIからのラットの回復に有益効果を及ぼすことを明らかに示している。我々は、DCの効果は全身性でT細胞依存性であること、及びミエリンペプチドのワクチン接種と同様にDCがMBPペプチドに対する適応免疫応答を誘発すると結論する。よって、我々の処理は、DCワクチン接種としてみなすことができ、アジュバントに入れたペプチドを用いたワクチン接種のように、局所自然応答を助長し、身体そのものの自己修復メカニズム、すなわち病変部位に存在する抗原に対する適応全身免疫応答を促進することによって、ストレスの大きな損傷誘導状態と対抗する手段である。
Claims (39)
- 抗原提示細胞及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物であって、前記抗原提示細胞が、
(a)神経系(NS)特異的抗原又はその類似体、
(b)NS特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
(c)コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド若しくはポリペプチド、及びポリGlu50Tyr50から成る群から選択されるコポリマー、並びに
(d)非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされたものである医薬組成物。 - 前記抗原提示細胞がヒト抗原提示細胞である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗原提示細胞が単球、マクロファージ、樹状細胞及びB細胞から成る群から選択される、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記抗原提示細胞がヒト樹状細胞である、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記ヒト樹状細胞が個体の皮膚、脾臓、胸腺、骨髄、リンパ節又は末梢血から得られた、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記抗原提示細胞が、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)、βインターフェロン(IFN−β)、IFN−γ、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターロイキン2(IL−2)、IL−3、IL−4、IL−6、IL−10、単球遊走活性化因子(MCAF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、コロニー刺激因子1(CSF−1)、神経栄養因子3(NT−3)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、リピドA、トリペプチドfMet−Leu−Phe(Fmlp)、ムラミルジペプチド(MDP)、イオノホアA23187、ビタミンD3結合タンパク質、CD40リガンド及びリポ多糖(LPS)から成る群から選択される少なくとも1つの生物学的に活性な刺激性作用物質を含有する培地で培養された、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記抗原提示細胞がIL−4、GM−CSF、又はIL−4及びGM−CSFの両方を含有する培地で培養された、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記抗原提示細胞がIL−4及びGM−CSFの両方を含有する培地で培養されたヒト樹状細胞である、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記抗原提示細胞がNS特異的抗原又はその類似体をパルスされたものである、請求項1から7までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記NS特異的抗原がミエリン塩基性タンパク質(MBP)、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)、S−100、βアミロイド、Thy−1、P0、ミエリン抗原P2、神経伝達物質受容体、Nogo−A、Nogo−B、Nogo−C、及びNogo受容体(NgR)から成る群から選択される、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記抗原提示細胞がNS特異的抗原に、又はその類似体に由来するペプチドをパルスされたものである、請求項1から7までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記ペプチドがMBP由来ペプチドである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記MBPペプチドがMBP87−99ペプチド(配列番号2)である、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記抗原提示細胞がNS特異的抗原由来のペプチドの類似体をパルスされたものである、請求項1から7までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記ペプチドがMBPペプチドの類似体である、請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記類似体がMBP−G91(配列番号3)、MBP−A91(配列番号4)、及びMBP−A96(配列番号5)から成るペプチドの群から選択される、請求項15に記載の医薬組成物。
- 前記抗原提示細胞がコポリマー1をパルスされたものである、請求項1から7までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記抗原提示細胞がポリGlu50Tyr50をパルスされたものである、請求項1から7までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 中枢神経系(CNS)又は末梢神経系(PNS)におけるニューロンの変性を防止若しくは阻害するための、又は神経の再生を促進するための、請求項1に記載の医薬組成物。
- CNS又はPNSの損傷、障害又は疾患を治療するための、請求項19に記載の医薬組成物。
- CNSにおける前記損傷が脊髄損傷、鈍性外傷、穿通外傷、脳の直撃若しくは対側衝撃、出血性卒中、又は虚血性卒中である、請求項20に記載の医薬組成物。
- 前記障害又は疾患が、糖尿病性神経障害、老人性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経(ベル)麻痺、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ビタミン欠乏症、てんかん、健忘症、不安、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、オピエート耐性及び依存症、緑内障、視神経障害、年齢関連黄斑変性、又は網膜変性である、請求項20に記載の医薬組成物。
- 中枢神経系(CNS)又は末梢神経系(PNS)におけるニューロンの変性を防止若しくは阻害するための、又は神経の再生を促進するための方法であって、それを必要とする個体に、
(a)神経系(NS)特異的抗原又はその類似体、
(b)NS特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
(c)コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド又はポリペプチド、及びポリGlu50Tyr50から成る群から選択されるコポリマー、並びに
(d)非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされた有効量の抗原提示細胞を投与することを含む方法。 - 前記抗原提示細胞がヒト抗原提示細胞である、請求項23に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が単球、マクロファージ、樹状細胞及びB細胞から成る群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、必要とする前記個体から得られた自己樹状細胞である、請求項25に記載の方法。
- 前記樹状細胞が前記個体の皮膚、脾臓、胸腺、骨髄、リンパ節又は末梢血から得られた、請求項26に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)、βインターフェロン(IFN−β)、IFN−γ、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターロイキン2(IL−2)、IL−3、IL−4、IL−6、IL−10、単球遊走活性化因子(MCAF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、コロニー刺激因子1(CSF−1)、神経栄養因子3(NT−3)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、リピドA、トリペプチドfMet−Leu−Phe(Fmlp)、ムラミルジペプチド(MDP)、イオノホアA23187、ビタミンD3結合タンパク質、CD40リガンド及びリポ多糖(LPS)から成る群から選択される少なくとも1つの生物学的に活性な刺激性作用物質を含有する培地で培養された、請求項23に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞がIL−4、GM−CSF、又はIL−4及びGM−CSFの両方を含有する培地で培養された、請求項28に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞がIL−4及びGM−CSFの両方を含有する培地で培養されたヒト樹状細胞である、請求項29に記載の方法。
- CNS又はPNSの損傷、障害又は疾患の治療方法であって、それを必要とする個体に、
(a)神経系(NS)特異的抗原又はその類似体、
(b)NS特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
(c)コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド又はポリペプチド、及びポリGlu50Tyr50から成る群から選択されるコポリマー、並びに
(d)非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされた有効量の抗原提示細胞を投与することを含む方法。 - CNSにおける前記損傷が脊髄損傷、鈍性外傷、穿通外傷、脳の直撃若しくは対側衝撃、出血性卒中、又は虚血性卒中である、請求項31に記載の方法。
- 前記障害又は疾患が糖尿病性神経障害、老人性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経(ベル)麻痺、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ビタミン欠乏症、てんかん、健忘症、不安、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、オピエート耐性及び依存症、緑内障、視神経障害、年齢関連黄斑変性、又は網膜変性である、請求項31に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が損傷部位に、又はその近辺に局所投与される、請求項31に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が全身投与される、請求項31に記載の方法。
- 脊髄損傷の治療方法であって、それを必要とする個体に、
(a)神経系(NS)特異的抗原又はその類似体、
(b)NS特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
(c)コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド又はポリペプチド、及びポリGlu50Tyr50から成る群から選択されるコポリマー、並びに
(d)非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされた有効量の自己樹状細胞を投与することを含む方法。 - 前記自己樹状細胞がGM−CSF及びIL−4を含む培地で培養後に配列番号4のペプチドをパルスされたものである、請求項36に記載の方法。
- CNS又はPNSの損傷の治療方法であって、それを必要とする個体に非自己抗原を免疫すること、及び前記非自己抗原をパルスされた有効量の抗原提示細胞を、前記個体の損傷部位にその後に投与することを含む治療方法。
- CNS又はPNSの損傷の治療方法であって、非自己抗原をパルスされた有効量の抗原提示細胞を、必要とする個体の損傷部位に投与することを含み、前記個体が前記非自己抗原に予め曝露された個体である治療方法。
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