CN103102393B - 一种多肽及其在制备抑郁症治疗药物中的应用 - Google Patents

一种多肽及其在制备抑郁症治疗药物中的应用 Download PDF

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本发明公开了一种多肽及其在制备抑郁症治疗药物中的应用。所述多肽为序列表序列1或2所示的肽段。实验证明，单次皮下注射给药序列表序列1或序列2所示多肽100μg/只，在大鼠强迫游泳实验中，与溶媒对照组和文拉法辛组相比，可明显缩短大鼠在强迫游泳中的不动时间；在慢性不可预见性应激实验中，可逆转慢性不可预见性应激所致的糖水偏爱值下降。本发明所提供的多肽，单次给药即可见效，作用持续时间长，对于给药后第36天测试的抑郁样行为仍然有治疗效果。本发明为预防和/或治疗抑郁症提供了一种新的药物及治疗方法，具有十分广阔的应用前景。

Description

一种多肽及其在制备抑郁症治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种多肽及其在制备抑郁症治疗药物中的应用。
背景技术
抑郁症（Depression）是一种高发的情感障碍性精神疾病，严重威胁着人类的健康和社会发展。抑郁症由一系列基因和环境的交互作用所引起，主要表现为情绪低落、兴趣低下、快感缺失、绝望、无助、有罪恶感等，并伴有严重的焦虑情绪和自杀倾向。目前，抑郁症的治疗药物主要基于单胺类物质假说，临床上常用的治疗方法包括靶向单胺类递质的药物治疗和电休克疗法等。但遗憾的是，这些药物都需要数周乃至数月才能发挥作用，并且有三分之一的患者对任何治疗方法都不反应。因此，研究新型有效的用于抑郁症治疗和预防的药物是治疗抑郁症的关键。
碱性髓鞘蛋白（MBP）是维持髓鞘完整性的蛋白，其中87-99多肽片段（MBP87-99）能引起多发性硬化，但一些突变多肽如[A91]MBP87-99、cyclo(87-99)[A91,A96]MBP87-99等却能产生抵抗多发性硬化的作用（Katsara,et al.J Med Chem.2009;Tselios,et al.J Med Chem.2002;美国专利号US2004/0214775）。
大鼠强迫游泳实验（Forced Swim Test,FST）和慢性不可预见性应激模型（Unpredictable ChronicMild Stress,UCMS）是最常用的抑郁症模型，大鼠FST中的不动时间和UCMS模型中的糖水偏爱值可以用于评价抗抑郁药物的活性（SolbergLC,et al.Behav Pharmacology.2002）。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种多肽，该多肽可用于制备抑郁症治疗药物。
所述多肽为碱性髓鞘蛋白在自N端第91位和第96位发生突变的第87—99位的肽段；所述多肽的氨基酸序列为如下1）或2）的序列：
1）序列表序列1所示的氨基酸序列；
2）序列表序列2所示的氨基酸序列。
本发明保护所述多肽在制备治疗和/或预防抑郁症产品（或药物）中的应用。
本发明保护所述多肽在制备具有抗抑郁活性的产品（或药物）中的应用。
本发明还提供一种治疗和/或预防抑郁症产品（或药物），其活性成分为所述多肽。
本发明还提供一种具有抗抑郁活性的产品（或药物），其活性成分为所述多肽。
上述产品（或药物）是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将所述多肽用混合物X进行乳化；所述混合物X为弗氏完全佐剂与PBS缓冲液等体积混合得到的。
上述产品（或药物）中，所述乳化后所述多肽在所述混合物X中的浓度具体可为200μg/ml。
实验证明，单次皮下注射给药序列表序列1或序列2所示多肽100μg/只，在大鼠强迫游泳实验中，与溶媒对照组和文拉法辛组相比，可明显缩短大鼠在强迫游泳中的不动时间；在慢性不可预见性应激实验中，可逆转慢性不可预见性应激所致的糖水偏爱值下降。本发明所提供的多肽，单次给药即可见效，作用持续时间长，对于给药后第36天测试的抑郁样行为仍然有治疗效果。本发明为预防和/或治疗抑郁症提供了一种新的药物及治疗方法，具有十分广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中强迫游泳实验流程图。
图2为大鼠强迫游泳测试中不动时间的统计结果。其中，1—4分别代表溶媒对照组、多肽A91A96组、多肽R91A96组和文拉法辛组；*表示与溶媒对照组结果比较在p<0.05差异显著。
图3为大鼠旷场实验中爬格数的统计结果。其中，1—4分别代表溶媒对照组、多肽A91A96组、多肽R91A96组和文拉法辛组。
图4为实施例2中慢性不可预见性应激模型实验流程图。
图5为本发明多肽显著逆转慢性不可预见性应激所致大鼠糖水偏爱值的下降。其中，从左至右的柱形图依次代表溶媒对照组、溶媒对照+UCMS组、多肽A91A96+UCMS组、多肽R91A96+UCMS组和文拉法辛+UCMS组的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所述多肽A91A96的序列如序列表序列1所示；所述多肽R91A96的序列如序列表序列2所示，均由上海科泰生物有限公司合成。上述多肽在使用时采用等体积的弗氏完全佐剂（购自Sigma-Aldrich公司，产品目录编号为F5881）与磷酸盐缓冲液（PBS,0.1M,PH7.4）的混合物作为溶媒，形成多肽A91A96浓度为200μg/ml的乳剂A和多肽R91A96浓度为200μg/ml的乳剂B，经皮下注射给药。
下述实施例中所述文拉法辛购自Sigma-Aldrich公司，为阳性对照药物，使用时溶解于磷酸盐缓冲液（PBS,0.1M,PH7.4）中，得到文拉法辛浓度为40mg/ml的溶液CK，经皮下注射给药。
实施例1、本发明多肽显著降低大鼠强迫游泳实验中的不动时间
一、实验方法
选取体重为220-240g的Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），于温度22±2℃、湿度50%±10%、12h/12h昼夜节律控制的动物房中，进行自由摄食饮水适应饲养4天后，将大鼠随机分为4组（分别记为溶媒对照组、多肽A91A96组、多肽R91A96组和文拉法辛组，每组10只大鼠），开始给药（记为图1中的第0天），第8天进行5min旷场实验并记录爬格数，第9天进行5min强迫游泳测试并记录不动时间，实验流程如图1所示，实验重复三次，结果用平均值表示。
本实施例所述给药的方式为单次皮下注射，各组间单次皮下注射的药物不同，具体如下：
1）溶媒对照组：每只大鼠注射药物溶媒（即等体积的PBS（0.1M,PH7.4）和弗氏完全佐剂（购自Sigma-Aldrich公司）的混合物0.5mL；
2）多肽A91A96组：每只大鼠注射乳剂A0.5mL（即每只100μg多肽A91A96）；
3）多肽R91A96组；每只大鼠注射乳剂B0.5mL（即每只100μg多肽R91A96）；
4）文拉法辛组：每只大鼠按每千克体重注射溶液CK1.0mL（即注射文拉法辛40mg/kg）
本实施例所述旷场实验的具体方法如下：实验环境为长×宽×高=75cm×75cm×45cm的旷场，底部划分为25个面积相等的大方格。测试时将大鼠轻轻放入旷场实验区进行自由活动，进行5min自发活动的测定，记录大鼠的水平探索行为（即爬格数）。
本实施例所述强迫游泳测试的具体方法如下：强迫游泳装置由透明有机玻璃制成（高24cm，直径15cm，水深17cm，水温24±2℃）。测试前一天，大鼠置于强迫游泳装置中适应15min；测试时，大鼠置于强迫游泳装置中，记录5min内大鼠漂浮不动时间。漂浮不动时间定义为大鼠微蜷躯体、呈漂浮状态的时间。强迫游泳实验为经典抗抑郁药物筛选模型，大多数抗抑郁药物可以有效降低大鼠在强迫游泳中的不动时间。
二、实验结果
采用SPSS软件进行数据分析，实验数据均采用平均值±标准差（Mean±SEM）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），Post hoc分析采用LSD检验，P<0.05时认为差异有统计学意义。
强迫游泳实验结果如图2所示，与溶媒对照组（71.75±16.59s）相比，多肽A91A96组（29.5±8.98s）大鼠强迫游泳不动时间显著降低（p<0.05），多肽R91A96组（22±4.49s）大鼠强迫游泳不动时间也显著降低（p<0.05），而文拉法辛组（65.11±6.36s）大鼠强迫游泳的不动时间没有降低（p>0.05）。结果表明，多肽A91A96和多肽R91A96分别单次给药即可在抑郁症的治疗和/或预防中产生作用，且效果优于传统抗抑郁药物文拉法辛。
旷场实验结果如图3所示，溶媒对照组（124.1±6.06）、多肽A91A96组（112±7.81）、多肽R91A96组（100.56±9.7）和文拉法辛组（121.7±5.11）大鼠在旷场中的爬格数差异不显著，即多肽A91A96和多肽R91A96不影响大鼠的自发活动性。
实施例2、本发明多肽显著逆转慢性不可预见性应激所致大鼠糖水偏爱的下降
一、实验方法
实验流程如图4所示。选取体重为220—240g的Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），于温度22±2℃、湿度50%±10%、12h/12h昼夜节律控制的动物房中进行自由摄食饮水适应饲养4天后，将大鼠随机分为5组（每组10只大鼠）进行如下处理：
a）溶媒对照组：于图4所示第0天进行单次皮下注射给药，每只大鼠注射药物溶媒（即等体积的PBS（0.1M,PH7.4）和弗氏完全佐剂（购自Sigma-Aldrich公司）的混合物）0.5mL；
b）溶媒对照+UCMS组：于图4所示第0天进行单次皮下注射给药，每只大鼠注射药物溶媒（即等体积的PBS（0.1M,PH7.4）和弗氏完全佐剂（购自Sigma-Aldrich公司）的混合物）0.5mL；给药7天后，进行UCMS；
c）多肽A91A96+UCMS组：于图4所示第0天进行单次皮下注射给药，每只大鼠注射乳剂A0.5mL（即每只100μg多肽A91A96）；给药7天后，进行UCMS；
d）多肽R91A96+UCMS组：于图4所示第0天进行单次皮下注射给药，每只大鼠注射乳剂B0.5mL（即每只100μg多肽R91A96）；给药7天后，进行UCMS；
e）文拉法辛+UCMS组：于图4所示第7天进行UCMS，进行UCMS21天后，开始给药，连续给药7天，每天进行一次皮下注射给药，每次每只大鼠按每千克体重注射溶液CK1.0mL（即注射文拉法辛40mg/kg）；
所述UCMS是指建立慢性不可预见性应激模型：应激阶段遵循随机、不可预见性原则，每天在不固定的时间点给予两种不同应激，持续28天。应激方案安排如表1所述。
表1.慢性不可预见性应激（UCMS）方案
天 应激方式 天 应激方式
1 束缚(1h)+禁食(24h) 15 游泳(0℃,5min)+空笼(24h)
2 振荡(140转/min,1h)+禁水(24h) 16 夹尾(1min)+禁食(24h)
3 空笼(24h)+倾斜(24h) 17 束缚(1h)+倾斜(24h)
4 游泳(0℃,5min)+潮湿垫料(24h) 18 禁水(24h)+昼夜颠倒(24h)
5 禁食(24h)+昼夜颠倒(24h) 19 振荡(140转/min,1h)+潮湿垫料(24h)
6 倾斜(24h)+禁水(24h) 20 倾斜(24h)+空笼(24h)
7 振荡(140转/min,1h)+拥挤(24h) 21 游泳(0℃,5min)+频闪(8h)
8 禁食(24h)+昼夜颠倒(24h) 22 夹尾(1min)+潮湿垫料(24h)
9 倾斜(24h)+禁水(24h) 23 空笼(24h)+禁食(24h)
10 振荡(140转/min,1h)+拥挤(24h) 24 震荡(1h)+拥挤(24h)
11 禁食(24h)+空笼(24h) 25 倾斜(24h)+频闪(8h)
12 夹尾(1min)+倾斜(24h) 26 游泳(0℃,5min)+昼夜颠倒(24h)
13 束缚(1h)+潮湿垫料(24h) 27 夹尾(1min)+潮湿垫料(24h)
14 震荡(1h)+拥挤(24h) 28 束缚(1h)+禁水(24h)
UCMS结束后，进行糖水偏爱测试，统计糖水偏爱值，实验重复三次，结果用平均值表示。
本实施例中所述糖水偏爱测试方法具体如下：糖水偏爱测试期间大鼠单笼饲养，主要包括两个阶段：1）糖水适应阶段，大鼠进行双瓶1%糖水适应48小时之后大鼠禁水禁食24小时；2）糖水偏爱测试阶段：禁水禁食结束后，给大鼠放置称重后的1%糖水和纯水各一瓶，大鼠自由选择摄入糖水或纯水，于第6小时交换两瓶的位置，第12小时结束测试，称重两个水瓶，计算12小时内大鼠糖水和纯水的摄入量。评价指标：糖水偏爱值=糖水摄入量/（糖水摄入量+纯水摄入量）×100％。
二、实验结果
采用SPSS软件进行数据分析，实验数据均采用平均值±标准差（Mean±SEM）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），Post hoc分析采用LSD检验，P<0.05时认为差异有统计学意义。
结果如图5所示，与不经历UCMS的溶媒对照组的糖水偏爱值（88.49%±3.39%）相比，溶媒对照+UCMS组的糖水偏爱值（68.74%±10.46%）显著降低（p<0.05）（用*标记）；与溶媒对照+UCMS组的糖水偏爱值相比，多肽A91A96+UCMS组（88.7%±4.58%,p<0.05）、多肽R91A96+UCMS组（90.66%±1.33%,p<0.05）和文拉法辛+UCMS组（90.47%±2.43%,p<0.05）的糖水偏爱值显著升高（p<0.05）（用#标记）。结果表明，所述多肽的单次给药即可以产生抗抑郁作用，该作用可以至少对第36天的测试依然有效，且该作用与连续7天文拉法辛给药效果相当。
上述实验表明，本发明所述多肽单次给药对抑郁症的预防和/或治疗产生作用，并且该作用可以维持很长时间，在给药后第36天的测试中仍然显示出抗抑郁作用。

Claims (3)

1.一种多肽在制备具有抗抑郁活性的产品中的应用；所述多肽，其氨基酸序列为如下1)或2)的序列：
1)序列表序列1所示的氨基酸序列；
2)序列表序列2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将权利要求1所述多肽用混合物X进行乳化；所述混合物X为弗氏完全佐剂与PBS缓冲液等体积混合得到的。
3.权利要求1所述多肽在制备治疗和/或预防抑郁症产品中的应用。
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