KR102580041B1 - 오스테오폰틴 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경계질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오스테오폰틴(osteopontin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 오스테오폰틴의 발현 또는 활성을 억제함으로써 아밀로이드 베타(Aβ)에 의한 신경세포의 사멸을 억제하는 효과가 있다. 또한, 오스테오폰틴의 발현 또는 활성 억제제는 전염증성 단백질의 수준을 감소시키고, 반대로 항염증성 단백질의 수준은 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명은 알츠하이머병을 비롯한 다양한 퇴행성 신경계질환의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

오스테오폰틴 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경계질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing, improving or treating neurodegenerative disease comprising osteopontin inhibitor as an active ingredient}

본 발명은 오스테오폰틴(osteopontin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경계질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

퇴행성 신경계질환(neurodegenerative disease)이란 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서 뇌(brain) 또는 척수(Spinal cord)에서 발생하는 질환을 말하며, 현재까지 알려지지 않은 원인 또는 유전적 결함이나 환경적 요인에 의해 뇌와 척수의 특정 뇌세포군의 점진적 구조의 손실 및 기능의 손실에 의해 나타나는 질환을 말한다. 상기 퇴행성 신경계질환으로 인해 야기된 신경세포 사멸 또는 손상은 뇌신경계의 정보 전달에 가장 중요한 뇌신경세포와 뇌신경세포 사이의 정보를 전달하는 시냅스의 형성이나 기능상의 문제, 뇌신경의 전기적 활동성의 이상적 증가나 감소를 야기하는 것으로 알려져 있다. 뇌와 척수의 신경세포들은 위치에 따라 매우 다양한 기능을 하고 있어 특정 부위의 신경세포 손상에 의해 특징적인 기능장애를 유발하며, 또 이러한 기능장애가 어떤 형태로 진행되는가에 따라 매우 다양한 임상 양상을 보인다. 이러한 퇴행성 신경계 질환에는 알츠하이머병(Alzheimer's disease: AD), 파킨슨병(Parkinson's disease: PD), 헌팅턴병(Huntington's disease: HD), 다발성 경화증(Multiple sclerosis: MS), 루게릭병으로 알려진 근위축성측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS) 등이 있다. 알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 신경계질환은 주로 아밀로이드 베타(Amyloid beta: Aβ의 축적으로 인한 것으로 알려져 왔으며, 이들 단백질이 응집되어 형성된 플라크(plaque)를 제거하기 위한 연구에 집중되어 왔다.

한편, 오스테오폰틴(Osteopontin)은 고유한 아르기닌-글라이신-아스파르트산(Arg-Gly-Asp; RGD) 세포부착 서열(cell-binding sequence)을 포함하고 있는 인단백질(phosphoprotein)로, 흰쥐의 배양된 뼈세포(rat osteosarcoma ROS 17/2.8)에서 처음 분리되었다. OPN은 뼈모세포와 뼈파괴세포에서 분비되어 일종의 가교(bridge, Latin pons) 역할을 하며 세포들을 기질에 부착시키는 역할을 한다. 그러나 많은 연구자들은 오스테오폰틴이 뼈 외에도 콩팥을 비롯한 속귀, 동맥의 평활근육, 소화관상피, 신경세포체 및 축삭 양자 등의 다양한 조직에서 발현되는 것을 확인하였으며, 그 기능 또한 발현 부위별로 매우 다를 것이라는 의견을 제시하고 있다.

신경계와 관련하여 오스테오폰틴은 지주막하 출혈, 뇌졸중, 다발성 경화증, 파킨슨병 등 여러 종류의 질환에서 신경보호효과 및 항염증효과가 보고되어 있으며, 반대로 오스테오폰틴의 RGD 모티프를 포함하는 6개 아미노산으로 구성된 펩타이드가 신경보호효과가 없거나 오스테오폰틴의 경쟁적 저해제로 작용한다는 보고도 존재한다. 이처럼 오스테오폰틴은 일반적인 퇴행성 신경계질환에서 일부 상황에서는 신경 독성 및 사망을 유발하고, 다른 환경에서는 신경 보호제 역할을 하는 등 상반된 효과를 나타내는 것으로 보인다. 본 발명자들은 알츠하이머병 모델에서 줄기세포 치료제의 작용 기작을 연구하던 중 오스테오폰틴의 발현이 감소되는 현상을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2091567 B1

이에 본 발명자들은 오스테오폰틴(osteopontin; OPN)의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 알츠하이머병을 포함한 퇴행성 신경계질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 오스테오폰틴 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제제를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 퇴행성 신경계질환의 예방, 개선 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오스테오폰틴(osteopontin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 오스테오폰틴 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 조성물의 퇴행성 신경계질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 상기 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 오스테오폰틴은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 오스테오폰틴 유전자의 발현을 억제하는 제제는 오스테오폰틴 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 오스테오폰틴 단백질의 활성을 억제하는 제제는 오스테오폰틴 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체, 앱타머 및 화합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 퇴행성 신경계질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근위축성측삭경화증 및 치매로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타(Amyloid beta)에 의한 신경세포 사멸을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 면역염증세포의 수 또는 전염증성 단백질의 수준을 감소시키거나, 항염증성 단백질의 수준을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 전염증성 단백질은 인터류킨-6(IL-6)이고, 상기 항염증성 단백질은 인터류킨-10(IL-10)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 (a) 분리된 세포 또는 조직에 후보물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포 또는 조직에서 오스테오폰틴 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 후보물질과 접촉된 세포 또는 조직에서 오스테오폰틴 단백질의 발현 수준이 후보물질 접촉 전의 수준과 비교하여 감소되는 경우, 상기 후보물질을 퇴행성 신경계질환의 예방, 개선 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경계질환의 예방, 개선 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분리된 세포 또는 조직은 신경세포 또는 신경조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 오스테오폰틴의 발현 또는 활성을 억제함으로써 아밀로이드 베타(Aβ)에 의한 신경세포의 사멸을 억제하는 효과가 있으며, 전염증성 단백질의 수준을 감소시키고, 반대로 항염증성 단백질의 수준은 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명은 알츠하이머병을 비롯한 다양한 퇴행성 신경계질환의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a 및 도 1b는 3차원 뇌 오가노이드에 대조군으로서 아밀로이드 베타 올리고머 또는 DMSO를 단독으로 처리하거나, 아밀로이드 베타 올리고머와 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포를 공동으로 처리한 후 뇌 오가노이드 배양액에서 사이토카인 어레이(도 1a) 및 오스테오폰틴 단백질 발현량을 정량 분석(도 1b)한 결과이다(Aβ, 아밀로이드 베타; hNTSCs 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포; OPN, 오스테오폰틴).
도 2는 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 알츠하이머병 모델에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포를 처리한 후 네스틴(nestin), 베타-튜불린 III(class III β-tubulin), GFAP 및 오스테오폰틴 발현과 관련된 염증세포 마커인 Iba-1의 발현을 면역형광염색법으로 확인한 도이다.
도 3a 및 도 3b는 알츠하이머병 동물 모델에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포를 이식한 후 동물의 뇌에서 오스테오폰틴의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과(도 3a) 및 정량화한 그래프(도 3b)이다.
도 4a 내지 도 4d는 알츠하이머병 동물 모델에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포를 이식한 후 동물의 뇌에서 염증세포 마커 Iba-1의 발현 수준을 면역형광염색법으로 확인한 결과(도 4a 및 도 4b) 및 항염증 단백질 IL-10과 IL-6의 발현 수준을 ELISA로 확인하여 정량화한 그래프(도 4c 및 도 4d)이다.
도 5는 오스테오폰틴 특이적 antagonist 및 siRNA 처리에 따른 베타아밀로이드 독성 수준을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 오스테오폰틴(osteopontin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "오스테오폰틴(osteopontin; OPN)"은 고유한 아르기닌-글라이신-아스파르트산(Arg-Gly-Asp; RGD) 세포부착 서열을 포함하고 있는 인테그린과 칼슘 결합 인단백질을(phosphoprotein)을 의미하는 것으로서, 석회화되는 조직, 다양한 상피세포, 활성화된 면역계의 세포 등에서 생산되며, 신장, 췌장, 비뇨ㆍ생식기계, 폐, 타액선, 내이, 신경계, 태반, 뇨 등에서 발견된다고 알려져 있다. 이러한 오스테오폰틴은 CD44계와 인테그린계 수용체를 가지며, 이들과 상호작용하여 세포 접착, 세포 이동, 신호 전달 및 염증 과정 등 다양한 생리작용에 관여한다.

본 발명에 있어서, 상기 오스테오폰틴은 인간 유래 오스테오폰틴일 수 있으며, 예를 들면, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 오스테오폰틴 유전자의 발현을 억제하는 제제는 오스테오폰틴 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "miRNA, siRNA 및 shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개하기 위하여 주로 목적 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여, 상기 mRNA의 해독을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 상기 miRNA, siRNA 및 shRNA는 표적 유전자의 발현을 해독 수준에서 억제할 수 있기 때문에, 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법에 사용될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "siRNA"는 센스 가닥(예를 들어, 오스테오폰틴 유전자 mRNA 서열에 상응하는 (corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(예를 들어, 오스테오폰틴 유전자 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명에서 이용될 수 있는 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 구체적으로는, 전체 길이는 10 내지 100 염기, 보다 구체적으로는 15 내지 80 염기, 그리고 보다 더 구체적으로는 20 내지 70 염기이다.

본 명세서에서, 용어 "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 사일런스시키는 데 이용될 수 있다. shRNA는 진핵세포에서 기능할 수 있는 프로모터라면 어떤 것이든 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다.

본 명세서에서, 용어 "miRNA(마이크로RNA, microRNA)"는 21-25개의 뉴클레오타이드의 단일가닥 RNA 분자로서 mRNA(messengerRNA)의 3"-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 물질을 나타낸다(BartelDP, et al., Cell, 23;116(2): 281-297(2004)). miRNA의 생성은 Drosha(RNaseIII type 효소)에 의해 스템-루프 구조의 전구체 miRNA(pre-miRNA)로 만들어지고, 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 성숙한 miRNA로 만들어진다.

본 명세서에서 사용된 용어, "리보자임(ribozyme)"은 리보자임의 서열에 대해서 완전히 또는 부분적으로 상동성인 서열을 갖는 핵산 분자를 분해할 수 있는 촉매적 RNA 분자이다. 표적 RNA와 특이적으로 짝을 이루고, 특정의 위치에서 포스포다이에스터 골격을 분해시킴으로써 표적 RNA를 기능적으로 불활성화시키는 RNA 리보자임을 암호화한 리보자임 이식유전자를 디자인할 수 있다. 이러한 분해를 수행함에 있어서, 리보자임은 그 자체가 변화되지 않으며, 따라서 재순환하여 다른 분자를 분해시킬 수 있다. 상기 리보자임은 리보자임 서열을 통합시킨 RNA 올리고뉴클레오티드의 형태로 세포에 대해 직접 표적화될 수 있거나, 원하는 리보자임 RNA를 코드화한 발현 벡터로서 세포 내에 도입될 수 있다. 리보자임은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대해서 기술된 것과 대체로 동일한 방식으로 사용 및 적용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "DNAzyme"은 단일 가닥 RNA를 절단하는 촉매 DNA 분자로, 표적 RNA 서열에 대하여 매우 선택적이고 이로써 전령 RNA를 표적으로 하여 특정 유전자를 하향 조절하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991), "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thyminesubstituted polyamide", Science 254(5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하는데, 오스테오폰틴 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 오스테오폰틴 단백질의 활성을 억제하는 제제는 오스테오폰틴 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체, 앱타머 및 화합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체"란 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미한다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"란 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기를 갖는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상기 앱타머는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드, 화합물, 중합체 등의 다양한 물질을 표적분자로서 사용할 수 있고, 단백질보다 안정성이 우수하며, 구조가 간단하면서도 핵산으로 구성되어 합성이 용이하기 때문에, 다양한 표적분자를 검출하는 방법에 이용되고 있다. 상기 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.

본 발명에서, 상기 화합물은 당업계에 오스테오폰틴 억제제로 알려진 것이라면 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 레보세티리진(Levocetirizine)일 수 있다. 상기 레보세티리진은 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 1]

또한, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "퇴행성 신경계질환"이란, 신경 세포가 세포 사멸로 상실되어 인지 기능의 악화 또는 신경학적, 신경 퇴행성, 생체적, 정신적, 또는 행동적 일탈로 특징될 수 있는 손상, 기능이상, 또는 합병증을 초래하는 상태 또는 장애를 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 적합한 퇴행성 신경계질환은, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근위축성측삭경화증 및 치매를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타(Amyloid beta)에 의한 신경세포 사멸을 억제할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "아밀로이드 베타(Amyloid beta)"는 "Abeta", 또는 "Aβ"로 바꿔 쓸 수 있고, 알츠하이머병을 비롯한 다양한 퇴행성 신경계질환 환자의 뇌, 척수 등에서 발견되는 주요 화학적 성분 계열을 의미한다. 아밀로이드 베타는 다양한 수의 아미노산, 통상 38-43 아미노산을 포함하는 베타-아밀로이드 전구 단백질(APP)의 절편이다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 면역염증세포의 수를 감소시키는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 조성물은 전염증성 단백질의 수준을 감소시키거나, 항염증성 단백질의 수준을 증가시키는 효과가 있다. 여기서 상기 전염증성 단백질은 인터류킨-6(IL-6)이고, 상기 항염증성 단백질은 인터류킨-10(IL-10)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 아밀로이드 베타 및 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 in vitro 알츠하이머병 모델에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포를 공동 배양한 경우 오스테오폰틴의 발현이 유의하게 감소하였으며, 이는 오스테오폰틴을 생산하는 염증세포의 수가 현저하게 감소한 것에 기인하는 것이라는 사실을 확인하였다(실시예 1 및 2 참조).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 아밀로이드 베타를 과발현하는 알츠하이머병 동물 모델에 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포를 이식한 경우, 오스테오폰틴 단백질의 발현이 크게 억제되고, 오스테오폰틴을 생산하는 염증세포의 수가 크게 감소하였으며, 항염증성 단백질인 인터류킨-10의 발현 수준이 증가하고, 전염증성 단백질인 인터류킨-6의 발현은 반대로 크게 감소하는 것을 확인하였다(실시예 3 및 4 참조).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 신경줄기세포에 베타아밀로이드와 함께 Levocetirizine 또는 OPN siRNA를 함께 처리한 경우 베타아밀로이드에 의한 세포사멸이 크게 감소하는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).

한편, 본 발명의 조성물 내의 상기 유효성분의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 또는 0.001 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 "투여"란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 "예방"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 오스테오폰틴 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 제제를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 제제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 상기 제제는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20 g, 또는 약 0.04-0.10 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 분리된 세포 또는 조직에 후보물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포 또는 조직에서 오스테오폰틴 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 후보물질과 접촉된 세포 또는 조직에서 오스테오폰틴 단백질의 발현 수준이 후보물질 접촉 전의 수준과 비교하여 감소되는 경우, 상기 후보물질을 퇴행성 신경계질환의 예방, 개선 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경계질환의 예방, 개선 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 분리된 세포 또는 조직은 신경세포 또는 신경조직일 수 있다.

상기 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(FACS) 및 단백질 칩(protein chip)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 아밀로이드 베타 및 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 알츠하이머병 모델에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포에 의한 오스테오폰틴의 발현 변화 확인

본 발명자들은 in vitro 알츠하이머병 모델에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포(hNTSCs)에 의한 사이토카인, 단백질 등의 발현 변화를 확인하였다.

구체적으로, 인간의 혈액에서 유도한 역분화 줄기세포 9 × 10³개 또는 1 × 10⁴개를 mTeSR™ 배지와 섞어준 후 U-bottom 96-well 플에이트에 각각 분주하고 37℃, 5% CO₂ 환경 하의 배양기에서 약 7일 동안 배양하여 스페로이드(spheroid)를 유도하였다. 다음으로, 형성된 스페로이드를 N2 보충제가 포함된 분화배지를 이용하여 약 5-7일 동안 분화를 유도하였다. 완전한 성숙체가 될 때까지 배지를 약 3-4일 주기로 교환해 주면서, 배양기 내의 셰이커(shaker)에서 70 rpm의 속도로 37℃, 5% CO₂ 환경 하에서 약 30-40일 동안 배양하여 3차원 뇌 오가노이드를 제작하였다. 오가노이드가 배양된 플레이트에 10 μM의 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid β oligomers)를 처리한 뒤, Transwell　 시스템에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포가 플레이팅(plating)되어 있는 상부 챔버(upper chamber)는 실험군으로, 배지만 넣은 상부 챔버는 대조군으로 하여 각각 3일 동안 공동배양(co-culture)하였다. 그 후 배양액(상층액)을 모아서 사이토카인 어레이(cytokine array) 및 단백질의 발현량을 정량하여 분석하였다.

그 결과 도 1a 및 1b에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 아밀로이드 베타(Aβ) 올리고머를 단독으로 처리한 뇌 오가노이드에서는 오스테오폰틴(OPN)의 발현 수준이 현저하게 증가한 반면, 아밀로이드 베타 올리고머 처리 후 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포(hNTSCs)를 공동배양한 군에서는 오스테오폰틴의 발현 수준이 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 알츠하이머병 모델에서 줄기세포에 의한 치료 효과는 오스테오폰틴의 발현을 감소시킴으로서 나타나는 것일 가능성을 시사하는 것이다.

실시예 2. 아밀로이드 베타 및 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 알츠하이머병 모델에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포에 의한 신경세포 및 면역염증세포 발현 변화 확인

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제작된 3차원 뇌 오가노이드에 10 μM의 아밀로이드 베타 올리고머를 처리한 뒤, Transwell　 시스템에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포가 플레이팅되어 있는 상부 챔버는 실험군으로, 배지만 넣은 상부 챔버는 대조군으로 하여 각각 3일 동안 공동배양(co-culture)하였다. 상기 배양이 끝난 후 뇌 오가노이드를 1X PBS(Phosphate-buffered saline)로 한 차례 세척하고, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 24시간 동안 고정한 후, 15% 및 30% 수크로스(sucrose) 용액을 처리하였다. 이후 OCT(Optimal cutting temperature) 컴파운드를 이용하여 블록을 만들고, 동결 절편(frozen slide)을 제작하였다. 상기 절편을 PBS로 세척한 다음 0.1% Triton X-100을 처리하여 투과화(permeabilization) 하였다. 이를 다시 PBS로 세척하고, 1% NGS(normal goat serum)를 상온에서 1시간 동안 처리하여 비특이적 결합(non-specific binding)을 블록킹(blocking) 한 후 신경세포 관련 단백질에 대한 1차 항체(네스틴, 베타-튜불린 III, GFAP 또는 Iba-1)를 처리하여 4 ℃에서 24 시간 동안 반응시켰다. 그 후 PBS로 세척하고, 1차 항체에 대한 형광이 붙은 2차 항체(Alexa Fluor 594-conjugates)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 PBS로 세척하고, 마운팅(mounting) 용액으로 마운팅 한 후 공초점현미경(confocal microscopy)을 사용하여 신경세포 관련 단백질의 발현 여부를 면역형광염색법으로 분석하였다. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)는 대비염색(counterstaining)용으로 사용되었다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 아밀로이드 베타(Aβ) 올리고머를 단독으로 처리한 뇌 오가노이드에서는 염증세포 마커인 Iba-1을 발현하는 세포의 수가 현저하게 증가한 반면, 아밀로이드 베타 올리고머 처리 후 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포(hNTSCs)를 공동배양한 군에서는 Iba-1 발현 세포 수가 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 오스테오폰틴을 발현하는 염증세포의 수가 감소하였음을 확인한 것이며, 줄기세포에 의한 알츠하이머병 치료 효과에 있어서 오스테오폰틴의 발현 감소는 염증세포 수의 감소에 따른 것이라는 사실을 보여주는 것이다.

실시예 3. 아밀로이드 베타를 과발현하는 알츠하이머병 동물 모델에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포 이식에 따른 오스테오폰틴의 발현 변화 확인

본 발명자들은 상기 실시예 1 및 2의 in vitro 알츠하이머병 모델에서 확인한 줄기세포에 의한 치료 효과의 양상이 in vivo에서도 동일하게 나타나는지 확인하기 위하여, 알츠하이머 동물 모델에 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포를 이식하여 치료 효과 및 오스테오폰틴의 발현 수준을 확인하였다.

그 결과 도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포를 처리한 군에서 오스테오폰틴 단백질의 발현이 크게 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 실시예 1 및 2를 통해 확인한 줄기세포의 치료 효과에 따른 오스테오폰틴의 발현 감소 결과와 일치하는 것이다.

실시예 4. 아밀로이드 베타를 과발현하는 알츠하이머병 동물 모델에서 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포 이식에 따른 면역염증세포 및 염증 단백질의 발현 변화 확인

이어서, 본 발명자들은 알츠하이머병 동물 모델을 이용하여 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포 처리에 따른 면역염증세포의 발현, 전염증성(pro-inflammatory) 단백질의 수준 및 항염증성(anti-inflammatory) 단백질 수준을 확인하였다.

그 결과 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이, 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포를 처리한 동물 모델에서 면역염증세포의 마커인 Iba-1 발현이 크게 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 도 4c 및 4d에서 나타난 바와 같이, 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포를 처리한 군에서는 항염증성 단백질인 IL-10(인터류킨-10)의 발현 수준이 증가하였고, 전염증성 단백질인 IL-6(인터류킨-6)의 발현은 반대로 크게 감소하는 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 줄기세포의 이식 효과에 따른 오스테오폰틴의 발현 감소에 의해 면역염증세포 및 전염증성 단백질의 수준이 감소하는 것으로서, 본 발명에 따른 오스테오폰틴 발현 감소가 줄기세포의 치료 효과를 증명하는 중요한 요소임을 증명하는 것이다.

실시예 5. 오스테오폰틴의 발현 억제에 따른 알츠하이머병의 치료 효과 확인

본 발명자들은 상기 실시예 1 내지 4를 통해 줄기세포의 오스테오폰틴 감소에 의한 알츠하이머병 치료 효과를 확인하였으며, 직접 오스테오폰틴의 수준을 감소시키는 경우도 동일하게 알츠하이머병의 치료 효과가 나타나는지 여부를 확인하였다. 오스테오폰틴을 코딩하는 유전자 또는 이로부터 전사된 mRNA를 표적화하여 오스테오폰틴 단백질의 발현을 억제하거나, 오스테오폰틴 단백질의 활성을 직접 억제하는 경우 알츠하이머병의 치료 효과가 나타남을 확인하였다.

실시예 6. 신경세포에서 OPN 발현 억제에 따른 베타아밀로이드 신경독성 변화 확인

이어서, 본 발명자들은 베타아밀로이드 신경독성에 대한 OPN 단백질의 기능을 확인하기 위하여 신경세포를 이용하여 OPN antagonist, OPN siRNA 처리에 따른 베타아밀로이드 독성 수준을 확인하였다.

구체적으로 24 well plate에 신경줄기세포를 5 x 10⁴개 정도를 분주하고 37 ℃ CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 세포가 있는 plate를 항생제가 없는 0.1% 혈청이 포함된 배지로 바꿔주고 나서 0.5 μM Levocetirizine (Sigma-Aldrich, L7795, OPN antagonist)를 처리한 뒤, 6-7 시간 후에 3 μM 베타아밀로이드를 추가로 처리하고 48시간 배양 후에 MTT assay를 통해 세포 생존률을 확인하였다.

또한, siRNA 실험의 경우, 6 well 배양 플레이트에서 FBS가 포함된 항생제가 없는 정상 성장 배지에 웰당 2 x 10⁵ 개 세포를 분주하고 37 ℃ CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. Transfection reagent를 이용해 OPN siRNA (SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY, sc-36129) mixture를 세포에 처리하고 약 6-7시간 정도 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양이 끝나면 정상 배양 배지 1 ml를 추가로 넣어주고 약 24시간 정도를 추가 배양하였다. 배양이 끝나면 plate를 항생제가 없는 o,1% 혈청 배지로 교체하고 3 μM 베타아밀로이드를 처리, 약 24시간 배양한 후에 MTT assay를 통해 세포 생존률을 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 신경줄기세포에 3 μM 베타아밀로이드를 처리한 경우 세포 생존률이 60% 정도였으나. 베타아밀로이드에 0.5 μM Levocetirizine 또는 80 pmol OPN siRNA를 함께 처리한 경우 베타아밀로이드에 의한 세포사멸이 크게 감소하는 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과는 오스테오폰틴의 발현 감소 또는 억제에 의해 면역염증세포 및 전염증성 단백질의 수준이 감소함을 나타내는 것으로서, 본 발명에 따른 오스테오폰틴의 억제가 퇴행성 신경계질환의 치료 타겟이 될 수 있음을 증명하는 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing, improving or treating neurodegenerative disease comprising osteopontin inhibitor as an active ingredient <130> MP20-071P1 <150> KR 10-2020-0066649 <151> 2020-06-02 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 300 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala 1 5 10 15 Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu 20 25 30 Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro 35 40 45 Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Thr Leu Pro Ser Lys Ser 50 55 60 Asn Glu Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp 65 70 75 80 Asp His Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp 85 90 95 Val Asp Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser 100 105 110 Asp Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala 115 120 125 Thr Glu Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly 130 135 140 Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe 145 150 155 160 Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr 165 170 175 Ser His Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro 180 185 190 Val Ala Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys 195 200 205 Asp Ser Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His 210 215 220 Ser His Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser 225 230 235 240 Asn Glu His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser 245 250 255 Arg Glu Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val 260 265 270 Val Asp Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile 275 280 285 Ser His Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn 290 295 300

Claims (11)

1. 오스테오폰틴(osteopontin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 오스테오폰틴 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제는 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 오스테오폰틴은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 아밀로이드 베타(Amyloid beta)에 의한 신경세포 사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 면역염증세포의 수 또는 전염증성 단백질의 수준을 감소시키거나, 항염증성 단백질의 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 전염증성 단백질은 인터류킨-6(IL-6)이고, 상기 항염증성 단백질은 인터류킨-10(IL-10)인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
9. 오스테오폰틴 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
   상기 오스테오폰틴 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제는 인간 코 하비갑개 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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