KR20220140176A - 혈관신생 촉진용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관신생 의존성 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명자들은 TGFBI를 결손시킨 마우스의 지방 조직에서 증가된 혈관 밀도를 나타내며, CD31의 발현이 증가함에 따라, TGFBI의 결손에 의하여 지방 혈관의 신생이 촉진됨을 확인하였으며, TGFBI의 결손이 MAPK 신호 전달 경로에 따른 모세혈관의 발아를 증가시킴을 확인하였는 바, TGFBI 억제제를 혈관신생 의존성 질환을 치료하는 데 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

혈관신생 촉진용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for promoting angiogenic activity}

본 발명은 혈관신생 촉진용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아 발생(embryonic development), 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다.

발생 및 상처 치유, 기관 형성에 중요한 과정인 혈관 생성이 제대로 일어나지 않을 경우 심각한 질환이 발생하게 된다. 예를 들어, 발생단계에서 혈관 형성이 되지 않을 경우 태반의 미발달을 초래하여 유산의 원인이 될 수 있으며, 조직의 궤양 및 허혈의 발생이 기관의 기능 이상을 유발시키고 더 나아가 사망에 이르게 한다. 최근 식생활의 변화, 영양 상태의 개선과 노년 인구의 증가에 따라 동맥경화, 심근경색 및 협심증, 뇌경색, 급성사지허혈과 같은 다양한 심혈관계 질환이 성인 사망률의 수위를 차지하는 심각한 질환으로 대두되고 있으나 뚜렷한 치료법이 정립되지 않은 상태이며, 이러한 허혈성 질환을 치료하기 위해 신생혈관형성을 유도하는 방법 또는 촉진하는 새로운 치료법 및 인자의 개발이 주목을 받고 있다(김덕경 et al, 대한내분비학회, 16(3), 328-338, 2001).

혈관신생을 이용한 생체 질환의 치료를 혈관신생 치료라 하며, 혈관내피 성장인자(VEGF)와 같은 혈관신생 촉진 인자가 중증의 국소 빈혈을 위한 치료제로 사용되고 있으나, 상기 인자들의 분리·정제가 어려우며, 고가이므로 임상 적용에 어려움이 있으며, 혈관성 조직 복구에 의해 증상이 개선될 수 있는 질환의 치료를 위해 보다 효과적이고 새로운 인자들의 발굴이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.

대한민국공개특허공보 제10-2016-0015462호

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 TGFBI(Transforming growth factor, beta-induced) 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것으로서, 본 발명자들은 TGFBI 결손 마우스에서 혈관 형성이 촉진됨을 확인함으로써, TGFBI 억제제를 이용하여 혈관신생 의존성 질환을 치료할 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 TGFBI 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 TGFBI 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 TGFBI 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TGFBI 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TGFBI 억제제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 의존성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 혈관신생 의존성 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 TGFBI 억제제의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 TGFBI 억제제를 포함하는 조성물의 혈관신생 의존성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 억제제는 TGFBI 활성 억제제 또는 발현 억제제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 활성 억제제는 TGFBI 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 발현 억제제는 TGFBI 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, RNAi, siRNA, miRNA, shRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 혈관신생 의존성 질환은 허혈, 불임, 당뇨성 족부궤양, 허혈성 뇌졸중, 궤양, 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 허혈성 심부전, 욕창, 탈모, 급성 후방지 국소빈혈 및 뇌혈관성 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 TGFBI 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 피부판 재생, 상처 및 화상치료, 인공피부이식 및 이식용 혈관 제조로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 TGFBI 억제제는 Src 또는 ERK의 활성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 혈관신생을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 TGFBI를 결손시킨 마우스의 지방 조직에서 증가된 혈관 밀도를 나타내며, CD31의 발현이 증가함에 따라, TGFBI의 결손에 의하여 지방 혈관의 신생이 촉진됨을 확인하였으며, TGFBI의 결손이 MAPK 신호 전달 경로에 따른 모세혈관의 발아를 증가시킴을 확인하였는 바, TGFBI 억제제를 혈관신생 의존성 질환을 치료하는 데 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 WT 및 TGFBI KO 마우스의 유전자형 분석을 위한 PCR 수행 결과를 나타내며, TGFBI 유전자의 엑손 3을 표적으로 수행하였다.
도 1b는 20주령 WT 및 TGFBI KO 마우스의 혈장 TGFBI 농도를 나타낸 것이다(n=3/그룹).
도 1c는 20주령 WT 및 TGFBI KO 마우스에서 iWAT(inguinal white adipose tissue) 섹션의 H&E 염색 대표 이미지를 나타낸 것이다(n=5/그룹). 빨간색 화살표는 큰 혈관(직경≥10μm)을 나타낸다. 스케일 바=200μm.
도 1d는 마우스의 섹션 상 혈관 평균 수를 나타낸 것이다(n=3/그룹).
도 1e는 20주령 WT 및 TGFBI KO 마우스에서 iWAT 섹션의 CD31 면역 조직 형광 염색의 대표 이미지를 나타낸 것이다(n=5/그룹). 스케일 바=50μm.
도 1f는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 CD31 염색의 면적 백분율을 정량화한 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 평균±S.E.M으로 표시하였다. * p <0.05 vs WT.
도 2a는 iWAT에서 나오는 모세혈관 발아를 최대 9일 동안 모니터링한 결과로, 발아된 모세혈관의 대표적인 이미지를 표시된 날짜에 표시하였다.
도 2b는 모세혈관 발아 거리를 Image J 소프트웨어로 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 포매 후 9일차에 모세혈관 가지로부터 분리된 세포로부터 추출한 총 단백질 내 p-Src, Src, p-ERK, ERK의 발현 수준을 나타낸 것이다(n=3/그룹).
도 2d는 도 2c에서 확인한 단백질의 상대적 발현량을 나타낸 것이다. 데이터는 평균±S.E.M으로 표시하였다. *p < 0.05, **p < 0.01 vs WT.
도 3a는 지방 세포 조건 배지(Ad-CM)로 처리된 WT 및 TGFBI KO 마우스에서 마트리겔 플러그 분석의 개략도를 나타낸 것이다.
도 3b는 WT 및 KO 마우스에서 마트리겔의 대표적인 H&E 염색 이미지를 나타낸 것이다(n=3/그룹). 스케일 바=100μm.
도 3c는 침윤된 혈관을 마트리겔 H&E 염색 섹션 3개에서 계수하고 평균 수로 표시한 결과를 나타낸 것이다.
도 3d는 마트리겔 플러그의 상대적 헤모글로빈 함량을 나타낸 것이다. 삽입된 이미지는 각 그룹의 마트리겔을 나타낸다. 데이터는 평균±S.E.M으로 표시하였다. **p < 0.01 vs WT.

본 발명자들은 실시예를 통하여, TGFBI를 결손시킨 마우스의 지방 조직에서 증가된 혈관 밀도를 나타내며, CD31의 발현이 증가함에 따라, TGFBI의 결손에 의하여 지방 혈관의 신생이 촉진됨을 확인하였으며, TGFBI의 결손이 MAPK(Mitogen-activated protein kinase) 신호 전달 경로에 따른 모세혈관의 발아를 증가시킴을 확인하였는 바, 본 발명을 완성하였다(본 발명의 실시예 참조).

따라서, 본 발명은 TGFBI 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈관신생 촉진용 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서, 용어 "단백질"은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 명세서에서, "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥의 형태로 된 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 "상보적(complementary)'이라고 한다.

한편, 'mRNA(messenger RNA 또는 전령 RNA)'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 리보솜(ribosome)으로 전달하여 폴리펩티드 합성(단백질 번역, translation)의 청사진 역할을 하는 RNA이다. 유전자를 주형(template)으로 하여 단일 가닥의 mRNA가 전사(transcription) 과정을 통하여 합성된다.

본 명세서에서, "TGFBI(Transforming growth factor, beta-induced)"은 BIGH3, BIG-H3으로도 불리우며, 인간에서 TGFBI 유전자의 유전자좌 5q31에 의해 암호화되는 단백질이다. TGFBI는 타입 I, II, 및 IV 콜라겐에 결합하는 RGD 함유 단백질을 암호화한다. 또한, TGFBI는 세포-콜라겐 상호 작용에서 역할을 하며, 연골에서 연골 내골 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에서, TGFBI 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명에서의 TGFBI 단백질은 서열번호 1로 표시되는 인간의 TGFBI(NP_033395.1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다(괄호 안은 NCBI Genbank accession number).

상기 TGFBI mRNA는 바람직하게는 서열번호 2으로 표시되는 인간 TGFBI mRNA(NM_009369.4)로 표시되는 염기서열을 포함하는 것이다(괄호 안은 NCBI Genbankaccession number). 상기한 인간의 TGFBI mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genbank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 구체적으로는 생리학적 조건 하(세포 내)에서 핵산 분자 내 타겟팅 모이어티가 타겟(예컨대, TGFBI 유전자)에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 보다 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 명세서에서, 상기 억제제는 TGFBI 활성 억제제 또는 발현 억제제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 활성 억제제는 TGFBI 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 발현 억제제는 TGFBI 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, RNAi, siRNA, miRNA, shRNA 및 리보자임으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "siRNA"는 센스 가닥(예를 들어, TGFBI 유전자 mRNA 서열에 상응하는 (corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(예를 들어, TGFBI 유전자 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명에서 이용될 수 있는 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 구체적으로는, 전체 길이는 10 내지 100 염기, 보다 구체적으로는 15 내지 80 염기, 그리고 보다 더 구체적으로는 20 내지 70 염기이다. 본 발명에서 상기 siRNA는 구체적으로 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 타겟으로 하는 것일 수 있다. 본 발명에서, 상기 siRNA는 abm사의 cat.no 4659409 제품일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 사일런스시키는 데 이용될 수 있다. shRNA는 진핵세포에서 기능할 수 있는 프로모터라면 어떤 것이든 사용하여 세포에 도입될 수 있다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다.

본 명세서에서, 용어 "miRNA(마이크로RNA, microRNA)"는 21-25개의 뉴클레오타이드의 단일가닥 RNA 분자로서 mRNA(messengerRNA)의 3'-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 물질을 나타낸다(BartelDP, et al., Cell, 23;116(2): 281-297(2004)). miRNA의 생성은 Drosha(RNaseIII type 효소)에 의해 스템-루프 구조의 전구체 miRNA(pre-miRNA)로 만들어지고, 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 성숙한 miRNA로 만들어진다.

본 명세서에서, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 예를 들어, 본 발명의 안티센스 서열은 TGFBI에 상보적이고 TGFBI mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, TGFBI mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 구체적으로는 8 내지 60 염기이고, 보다 구체적으로는 10 내지 40 염기이다.

본 명세서에서, 용어 "리보자임(ribozyme)"은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체 적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA이다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "앱타머(aptamer)"는 특정 타겟에 결합하는 올리고뉴클레오타이드(일반적으로, RNA 분자)를 의미한다.구체적으로는, 본 명세서에서의 "앱타머"는 올리고뉴클레오타이드 앱타머(예컨대, RNA aptamer)를 의미한다.

본 명세서에서, siRNA 또는 shRNA는 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성 향상, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반응 감소를 위한 다양한 변형(modification)을 가한 것일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 OH기가 -CH₃(메틸), -OCH₃(methoxy), -NH₂, -F, -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다.

본 발명에서 용어, “혈관신생(angiogenesis)”은 새로 혈관이 생기는 현상으로서 혈관이 새로 생성되는 모든 현상을 지칭할 수 있으며, 그 예로 기존의 혈관을 구성하는 세포가 증식 및 이주하여 새로 혈관을 만드는 현상을 지칭할 수 있고, 혈관을 만드는 전구세포에 의하여 혈관이 새로 생성되는 현상까지 포함할 수 있다. 본 발명의 혈관은 CD31 양성 혈관일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, “혈관신생 촉진”은 상기와 같은 혈관신생을 촉진하여 모세혈관 등의 혈관의 생성이 보다 빠른 시간 내에 및/또는 보다 많은 혈관의 생성이 이루어질 수 있도록 하는 것을 의미한다. 태아의 발생 및 성장, 장기의 형성, 상처의 치유 등에는 혈관의 형성과 혈액의 순환이 필수적인바, 혈관신생이 촉진됨으로써 태아의 발생 및 성장, 장기의 형성, 상처의 치유 등이 보다 효율적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 혈관신생 촉진은 CD31 양성 혈관의 신생을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 혈관신생 의존성 질환은 다양한 원인에 의한 혈관 이상으로 인해 혈액이나 산소가 제대로 공급되지 못하여 발생하거나 악화되는 질병을 말하는 것으로, 구체적으로는 혈관신생이 필요한 질환을 말하나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 허혈, 불임, 당뇨성 족부궤양, 허혈성 뇌졸중, 궤양, 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 허혈성 심부전, 욕창, 탈모, 급성 후방지 국소빈혈 및 뇌혈관성 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

허혈, 허혈성 뇌졸중, 동맥경화증, 심근경색, 협심증 등은 혈관이 막히거나 좁아지는 것이 원인이 되어 혈관 내 혈액을 통해 산소와 영양이 적절히 공급되지 못하면 신체 조직 및 장기 기능 장애가 발생하게 됨으로써 발병하게 된다. 이러한 혈관 기능 장애가 심장 근육에서 발생하면 심장이 멈추어 심근경색, 협심증 등이 발생하게 되고, 손이나 발 끝 부분에서 발생하면 허혈성 지체질환이 되며, 뇌에서 발생하게 되면 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매 등이 발생할 수 있다.

허혈성 심부전 및 급성 후방지 국소빈혈 역시 관이 막히거나 좁아지는 것이 원인으로 혈액을 충분히 공급받지 못하여 산소가 부족하여 발생할 수 있다.

당뇨성 족부궤양은 당뇨병의 가장 흔한 합병증으로 당뇨병 환자의 혈관에 존재하는 고농도의 혈당에 의해 세포 내 일부 기능이 손상되면서 다리 부위의 미세혈관과 신경세포가 죽게되어 발생하게 된다.

소화관 궤양, 피부 궤양 등의 궤양, 화상, 상처 등은 조직 손상에 의한 것으로서 통상적인 치료방법은 처치 후 손상부위가 자연회복력에 의해 치유되는 것을 기다리는 것이나, 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 상기와 같은 질환의 치유는 세포 증식에 의한 새로운 결합 조직 및 상피 조직의 형성에 의해 좌우되는바, 세포의 증식, 분화를 촉진하거나 자극하는 것이 효과적이다.

또한, 욕창은 압박궤양으로도 불리며, 몸의 어느 부위든 지속적인 또는 반복적인 압박이 가해지면서 혈액순환이 잘 되지 않아 조직이 죽어 발생한 궤양으로서 혈관의 신생을 촉진함으로써 혈액순환이 잘 이루어지도록 유도하여 치료할 수 있다.

또한, 불임의 경우 자궁 내의 혈액순환과 모세혈관의 혈류순환이 저하되어 수정란의 착상이 잘 이루어지지 않음으로써 발생할 수 있으며, 혈관의 신생을 촉진하여 자궁 내 혈액 순환이 잘 이루어지도록 하여 불임을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 탈모는 비정상적으로 모발이 탈락되는 수가 많아지는 것을 말하며, 혈액에 의한 영양공급이 충분하지 못할 경우 발생할 수 있다. 탈모의 치료방법 중 하나로 모세혈관의 확장을 통해 혈액순환을 촉진하는 방법이 있으며, 본 발명의 TGFBI 억제제를 이용하여 혈관신생을 촉진함으로써 탈모를 예방 또는 치료하거나 육모를 촉진할 수 있다.

상기 질병들은 혈관을 이식하거나 우회혈관을 신생시키는 등의 방법으로 증상을 완화 또는 개선시킬 수 있으며, 본 발명의 TGFBI 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 통하여 혈관을 신생시키거나 이식용 혈관을 생성하여 이러한 질병들을 개선하거나 치료할 수 있다.

본 발명에서, 상기 TGFBI 단백질은 Src 또는 ERK(extracellular-signal-regulated kinase)의 활성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 조성물은 지방세포 배양 상청액을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 지방세포 배양 상청액은 FBS 및 인슐린을 함유할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 시약 조성물의 형태로 제공되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, TGFBI 억제제의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 본 발명에서 용어, “식품학적으로 허용 가능한 염”이란 식품학적으로 허용되는 유기산, 무기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 본 발명에서 용어, "수의학적으로 허용 가능한 염"이란 수의학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.

적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물 내의 상기 TGFBI 억제제의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃)이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 "개체"의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 척추동물이라면 제한되지 아니하나, 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개, 고양이, 어류 및 파충류에 적용될 수 있다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, TGFBI 억제제를 포함하는 조성물은 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명에 있어서 식품은 기능성 식품 및 건강기능성 식품을 포함한다.

본 발명의 TGFBI 억제제를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 TGFBI 억제제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 TGFBI 억제제는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실험방법

시약

둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 소 태아 혈청(FBS) 및 신생 송아지 혈청(NBCS)은 Gibco Life Technologies(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 인슐린, 인도메타신, 덱사메타손 및 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX)은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 혈장 및 세포 상청액 TGFBI 함량은 마우스 베타 IG H3 ELISA 키트(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 사용하여 결정하였다. 트랜스웰 챔버 인서트(폴리카보네이트 멤브레인, 8μm 기공 크기) 및 마트리겔은 각각 Costar(MA, USA) 및 Corning(NY, USA)에서 구입하였다.

실험동물

이형접합 TGFBI^+/- 마우스를 사육하여 TGFBI^-/-(KO) 및 TGFBI^+/+(WT) 한배 새끼를 생성하였다. FLP(flippase) 재조합 효소 표적 서열이 측면에 있는 PGK-네오마이신을 포함하는 표적화 벡터를 C57BL/6 배반포에 미세주입한 다음, FLP 재조합 효소 표적 측면에 있는 PGK(phosphoglycerate kinase I)-네오마이신 카세트를 Flp 매개 재조합에 따라 제거하였다. TGFBI 유전자의 엑손 3을 삭제하기 위해, floxed-TGFBI 마우스를 프로타민 I-Cre(PrmI-Cre) 형질 전환 마우스와 교배하여 TGFBI^+/- 마우스를 생성하였다. 유전자형은 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 꼬리 생검으로 결정하였다. 사용된 프라이머는 센스(5'-CCATACTCTGACTTCCAGGTTATTA-3', 서열번호 4) 및 안티센스(5'-TGGCAGACTAGCAAGGGTTT-3', 서열번호 5)였다. 마우스는 습도 10~20%, 온도 24℃±1℃, 명암주기 12시간의 환경에서 유지되었다. 마우스에는 10% 지방이 보충된 표준사료를 식이를 하였다. 모든 동물 실험은 경북대학교 동물 실험위원회(승인번호 : KNU 2016-0070)의 승인을 받았다. 연구는 ARRIVE 지침에 따라 수행되었다. 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.

3T3-L1 지방 세포의 배양 및 조건 배지의 준비

SVEC4-10 내피세포 및 3T3-L1 지방전구세포는 각각 10% FBS 또는 10% 신생아 송아지 혈청(NBCS)이 보충된 DMEM에서 유지되었고, 가습된 5% CO₂ 조건의 37℃에서 배양하였다. 지방 세포 분화를 위해 3T3-L1 지방전구세포를 10% FBS, 0.5mM IBMX, 1.72nM 인슐린, 1μM 덱사메타손 및 100μM 인도메타신이 포함된 DMEM으로 구성된 분화 배지(MDI, differentiation medium)에 48시간 동안 노출시켰다. 그 후, 10% FBS 및 1.72nM 인슐린이 보충된 배지에서 2일마다 배지의 절반을 교체하여 6일 동안 추가로 자극된 세포를 유지하였다. 분화 유도 8일 후, 성숙한 3T3-L1 지방 세포의 배양 배지를 수집하고 500 xg에서 10분 동안 4℃에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거하였다. 생성된 상청액은 지방 세포 조건 배지(Ad-CM)가 필요한 실험에 사용하였다.

지방 조직의 생체 외(Ex vivo) 혈관신생 분석

사타구니 백색 지방 조직(iWAT)을 WT 및 TGFBI KO 마우스(8주령 마우스)로부터 수득하였다. 각 iWAT를 1mm³ 조각으로 자르고, 96 웰 플레이트 상 마트리겔에 포매하고, EBM-2 배지(Lonza, Walkersville, MD, USA) 상에서 37℃에서 9일 동안 배양하였다. 배지를 2일마다 교체하고 지정된 시간에 현미경으로 발아 혈관 신생을 관찰하였다. 지방 조직에서 발아 거리는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

웨스턴 블롯팅에 의한 추가 분석을 위해 모세관 가지를 포함하는 세포의 분리를 수행하였다. 포매 9일 후, EBM-2 배양 배지를 제거하고 인산염완충식염수(PBS)로 세척하고 디스파제(cat. no. 354235; BD Biosciences, San Jose, CA)를 첨가하여 37℃에서 2 시간 동안 마트리겔을 분해하였다. 이후 분리된 세포와 부유 세포를 현미경으로 확인하고, 소화된 마트리겔을 상온에서 10분간 200×g에서 원심분리하여 제거하였다. 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 세포 용해 완충액에 재현탁하여 웨스턴 블롯 분석을 위한 샘플을 준비하였다.

실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)

제조업체의 지침에 따라 RNeasy Lipid Tissue Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 WT 마우스의 iWAT 및 간에서 총 RNA를 추출하였다. 역전사 및 cDNA 합성은 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트(Toyobo, Osaka, Japan)를 사용하여 수행되었다. RT-PCR은 SYBR Green(Toyobo, Japan)을 사용하여 iCycler iQ Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories, USA)으로 수행되었다. 모든 프라이머는 마크로젠(Seoul, Korea)에서 합성하였으며 프라이머 서열은 표 1과 같다.

Gene	Forward Primer	Reverse Primer
TGFBI	GGAAGCTTCACCATCTTTGC (서열번호 6)	ATGTTGACGTTGCTCACCAG (서열번호 7)
β-actin	CGTGCGTGACATCAAAGAGAA (서열번호 8)	GCTCGTTGCCAATAGTGATGA (서열번호 9)

웨스턴 블롯 분석

먼저, 세포 및 조직을 수확하고 RIPA 완충액에서 용해시켰다. 단백질 함량은 Bradford 분석을 사용하여 측정되었다. 동등한 양의 단백질을 7.5%-10% SDS-PAGE에 적용하고 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 5% 무지방 탈지유로 막을 차단하고 p-Src, Src, p-ERK, ERK(Cell Signaling Technology, Beverly, USA) 및 β-actin(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)에 대한 1차 항체와 함께 배양하였다. 이어서, 막을 실온에서 1시간 동안 HRP-접합된 항-마우스 또는 항-토끼 이차 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 배양하였다. 그런 다음 막을 트리스완충식염수와 Tween 20(10 mmol/l Tris, pH 8.0, 150 mmol/l NaCl, 및 0.05% Tween 20) 용액으로 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence)을 사용하여 진행되었다.

마트리겔 플러그 분석

25%(v/v) Ad-CM 및 10유닛 헤파린을 함유한 마트리겔(0.3ml)을 WT 및 KO 마우스(10주령 수컷)에 피하주사하였다. 3주 후, 마트리겔 플러그를 제거하고 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 새로운 미세혈관의 형성을 관찰하였다. 혈관 밀도를 정량화하기 위해 모든 섹션을 현미경으로 이미지화하였다. 섹션의 침윤된 혈관을 관찰하고 계수하였다.

제거된 마트리겔 플러그의 헤모글로빈 함량은 Drabkin의 방법을 사용하여 측정되었다. 마트리겔 플러그를 0.2% 헤파린을 함유하는 증류수에서 밤새 4℃에서 균질화하였다. 용해물을 5000 xg에서 20분 동안 원심분리하고 상청액을 Drabkin 시약(Sigma, MO)과 함께 배양하였다. 흡광도는 540nm에서 분광 광도계(Tecan, Austria GmbH, USA)를 사용하여 측정하였다.

면역 조직 형광 (IHF)

iWAT는 WT 및 KO 마우스에서 수확하고 4% 파라포름알데히드로 고정하고 파라핀에 포매시켰다. 포매된 조직을 5μm 두께의 섹션으로 자르고 H&E로 염색하였다. 혈관 밀도를 정량화하기 위해 모든 섹션을 현미경으로 촬영하였다. 혈관은 크기에 따라 큰 혈관과 모세 혈관으로 분류하였다. 큰 혈관과 모세관 밀도는 촬영된 이미지 당 개수로 표시하였다.

지방 조직에서 CD31의 존재와 발현을 확인하기 위해 4μm의 표본을 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 블록에서 잘라내었다. 슬라이드를 60℃의 건조 오븐에서 1시간 이상 가열한 다음 Leica Bond Rx Automated Stainer(Leica Biosystems, Newcastle, UK)로 다중 면역 형광 염색을 수행하였다. 이후, 슬라이드를 30분 동안 베이킹하고 Leica Bond Dewax 용액(# AR9222, Leica Biosystems)으로 탈왁스 처리한 다음, pH 9.0 용액에서 30분 동안 Bond Epitope Retrieval 2(#AR9640, Leica Biosystems)를 사용하여 항원 검색을 수행하였다. CD31에 대한 1차 항체(ab124432, Abcam, 희석 1:500)를 실온의 가습 챔버에서 30분 동안 배양한 후, Polymer HRP Ms+Rb(ARH1001EA, AKOYA Biosciences)를 사용하여 10분 동안 검출을 수행하였다. CD31의 시각화는 10분 동안 Opal 690 TSA(희석 1:150)를 사용하여 수행되었으며, 그 후 슬라이드를 20분 동안 Bond Epitope Retrieval 1(# AR9961, Leica Biosystems)로 처리하여 시퀀싱 단계 전에 결합된 항체를 제거하였다. 이후 핵을 DAPI로 시각화하고, 조직 섹션을 ProLong Gold 안티페이드 시약(P36934, Invitrogen)을 사용하여 커버 슬립하였다. CD31 염색 영역을 정량화하기 위해 실험 그룹 당 3마리 마우스의 섹션을 선택하였다. CD31의 면역 염색 영역은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 빨간색 채널은 파란색으로부터 분리되어 회색조로 변환되고 배경을 제거하였다. 단색 면역 형광 스택의 값을 측정하고 면적 백분율로 표현하였다.

통계 분석

데이터는 평균±SEM으로 표현되었으며, 통계 분석은 SPSS 23 소프트웨어 (SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행되었다. 그룹 평균 간의 차이는 짝을 이루지 않은 Student's t-test 또는 단방향 분산 분석으로 분석하였다. p <0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 모든 시험관 내 및 생체 내 동물 실험은 3회 반복하였다.

실시예 1. TGFBI가 지방 조직의 혈관 분포에 미치는 영향 확인

지방 혈관에서 TGFBI의 역할을 결정하기 위해, 야생형(WT) 및 TGFBI 녹아웃(KO) C57BL/6 마우스를 사용하였다. 유전자형은 꼬리 생검 샘플을 사용하여 PCR로 확인하였다.

도 1a에 나타난 바와 같이, WT 마우스 유전자는 TGFBI에 대해 1099bp에서 밴드를 보인 반면, TGFBI KO 마우스는 376bp에서 밴드를 나타내었다.

또한, 도 1b에 나타난 바와 같이, ELISA 결과 TGFBI KO 마우스 혈장 내 TGFBI의 발현은 검출되지 않았다.

또한, 도 1c 및 도 1d에 나타난 바와 같이, WT 마우스와 비교하여 TGFBI KO 마우스는 iWAT에서 상당히 증가된 큰 혈관 밀도를 나타내었다. 상기 결과는 TGFBI가 지방 혈관 신생 조절에 기여함을 시사한다.

이에 더하여, 혈관 신생은 내피 세포에 의해 제어되기 때문에, TGFBI가 iWAT에서 내피세포의 증착(deposition) 및 군집화(population)에 영향을 미치는지 조사하였다. 면역 조직 화학은 WT 및 KO 마우스 모두에서 발현되는 내피 세포에서 고정 저항성 에피토프를 인식하는 항-CD31 항체를 사용하여 수행되었다.

도 1e 및 도 1f에 나타난 바와 같이, CD31의 발현은 WT 마우스의 iWAT보다 KO 마우스의 iWAT에서 더 강한 것으로 나타났다. 이는 TGFBI 결실이 CD31 염색에 의해 평가된 바와 같이 내피 세포의 군집화를 조절함으로써 지방 혈관 신생을 촉진했음을 나타낸다.

실시예 2. TGFBI의 결손의 모세혈관 발아 촉진 및 MAPK 활성화 단백질 키나아제 활성화 효과 확인

TGFBI KO 마우스에서 증가된 혈관 밀도를 바탕으로, TGFBI의 결손이 생체 외 조직 배양 시스템에서 발아하는 혈관의 활성화를 촉진할 수 있다고 추측하였다. 마트리겔에 지방 조직을 삽입하고 6 일 후, KO 마우스의 iWAT 외식편에서 발아된 모세 혈관은 WT 마우스와 비슷하였다.

도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 포매 6일 및 9일 차에 WT와 KO 마우스 모두의 iWAT에서 모세혈관이 나타났으나, 동기간 내 KO 마우스에서의 발아 길이가 현저히 증가하였다.

또한, TGFBI 결손이 iWAT에서 모세혈관 발아를 촉진하는 메커니즘을 확인하기 위해, 발아된 모세혈관에서 세포를 분리하고 MAPK 신호 전달 경로의 활성을 분석하였다.

도 2c 및 도 2d에 나타난 바와 같이, 인산화된 Src 및 Erk의 발현은 WT 마우스의 발현과 비교하여, TGFBI KO 마우스로부터 분리된 세포에서 각각 약 1.5배 및 1.2배 상향 조절되었다.

상기 결과는 TGFBI 결실이 MAPK 신호 전달 경로의 활성화에 의해 조절될 수 있는 지방 조직에서 모세 혈관 발아 능력을 향상시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 3. TGFBI 결손의 Ad-CM 함유 마트리겔로의 혈관 침윤 조절 효과 확인

TGFBI가 지방 혈관 신생을 조절하는지 확인하기 위해, Ad-CM을 사용하여 마트리겔로의 혈관 침윤에 대한 TGFBI의 효과를 조사하였다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 마트리겔을 일반 배지(CON, DMEM-고글루코스, 10% FBS, 및 1% 항생제 함유) 또는 Ad-CM과 혼합하고 혼합물을 마우스에 피하 주사하였다.

도 3b 내지 도 3d에 나타난 바와 같이, Ad-CM의 추가는 주변 지방 조직에서 마트리겔로 혈관 침윤을 촉진하였다. 또한, TGFBI KO 마우스에 주입된 Ad-CM을 포함하는 마트리겔이 WT 마우스에 비해 더 높은 혈관 밀도와 헤모글로빈 함량을 나타냄을 관찰하였다. 대조적으로, 정상 배지를 포함하는 마트리겔을 주사한 WT와 KO 마우스 사이에는 유의한 차이를 보이지 않았다.

이러한 결과는 Ad-CM이 혈관 신생을 촉진하고 TGFBI의 결실이 혈관 신생에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for promoting angiogenic activity <130> MP21-037 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 683 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 precursor <400> 1 Met Ala Leu Leu Met Arg Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Leu Ser Val 1 5 10 15 Gly Pro Ala Gly Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu 20 25 30 Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val 35 40 45 Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Lys Lys Tyr Phe Thr Asn 50 55 60 Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly 85 90 95 Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Met Gly Val 100 105 110 Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu 115 120 125 Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser 130 135 140 Asn Glu Ala Trp Ser Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val 145 150 155 160 Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val 165 170 175 Asp Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr 180 185 190 Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly 195 200 205 Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala 210 215 220 Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr 225 230 235 240 Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu 245 250 255 Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Val Leu Glu Gly Asp 260 265 270 Gly Gln Phe Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile 275 280 285 Pro Ala Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg 290 295 300 Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala 305 310 315 320 Ile Val Ala Gly Met Ser Met Glu Thr Leu Gly Gly Thr Thr Leu Glu 325 330 335 Val Gly Cys Ser Gly Asp Lys Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Val Ile 340 345 350 Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Phe Ile Asp 355 360 365 Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Leu Glu Leu Ala Gly 370 375 380 Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Ile Leu Lys Gln Ala Gly Leu 385 390 395 400 Asp Thr His Leu Ser Gly Lys Glu Gln Leu Thr Phe Leu Ala Pro Leu 405 410 415 Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Val Pro Arg Ile Asp Ala Gln Met Lys 420 425 430 Thr Leu Leu Leu Asn His Met Val Lys Glu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr 435 440 445 Leu Tyr Ser Gly Gln Thr Leu Asp Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg 450 455 460 Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala 465 470 475 480 Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Phe Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg 485 490 495 Met Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp 500 505 510 Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Met 515 520 525 Glu Ile Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn 530 535 540 Glu Ala Phe Gln Ala Met Pro Pro Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu Ala 545 550 555 560 Asn Ala Lys Glu Leu Thr Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu 565 570 575 Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu 580 585 590 Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Ser Lys Asn Asn Val Val Ser Val 595 600 605 Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Thr Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val 610 615 620 Val Tyr Ala Ile Asn Thr Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln 625 630 635 640 Glu Arg Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln 645 650 655 Ala Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Ala Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro 660 665 670 Val Tyr Gln Arg Leu Leu Glu Arg Met Lys His 675 680 <210> 2 <211> 2678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mus musculus transforming growth factor, beta induced (Tgfbi), mRNA <400> 2 gcccgcgcct gctttcatcg tgggtccgcg cgtgctccag ctccatggcg ctcctcatgc 60 gactgctgac cctcgctctg gcactgtctg tgggccccgc tgggaccctt gcaggtcccg 120 ccaagtcacc ctaccagctg gtgctgcagc atagccggct ccggggtcgc cagcacggcc 180 ccaatgtatg tgctgtgcag aaggtcattg gcaccaacaa gaaatacttc 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Claims (9)

1. TGFBI 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 억제제는 TGFBI 활성 억제제 또는 발현 억제제인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 활성 억제제는 TGFBI 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 발현 억제제는 TGFBI 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, RNAi, siRNA, miRNA, shRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 혈관신생 의존성 질환은 허혈, 불임, 당뇨성 족부궤양, 허혈성 뇌졸중, 궤양, 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 허혈성 심부전, 욕창, 탈모, 급성 후방지 국소빈혈 및 뇌혈관성 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 TGFBI 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. TGFBI 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 조성물은 피부판 재생, 상처 및 화상치료, 인공피부이식 및 이식용 혈관 제조로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용도인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진용 조성물.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 TGFBI 억제제는 Src 또는 ERK의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진용 조성물.
   

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