KR20150128044A - ATF3 유전자 발현을 억제하는 신규 siRNA 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ATF3 siRNA 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병을 포함하는 대사성 질환용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 ATF3 siRNA은 기존의 ATF3 siRNA 보다 ATF3 유전자 발현을 더욱 억제하고 ATF3와 관련된 iNOS의 단백질 발현, NO 생성 및 ROS의 생성을 포함하는 산화적 스트레스, CHOP을 포함하는 ER 스트레스, 췌장베타세포기능 저하 및 혈장 인슐린 양 등을 개선함으로써 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ATF3 유전자 발현을 억제하는 신규 siRNA 및 이의 용도{Novel siRNA suppressing ATF3 gene expression and use thereof}

본 발명의 목적은 ATF3(Activating transcription factor 3) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 센스 RNA 및 안티센스 RNA로 구성된 siRNA(small interacting RNA) 또는 이를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

대사성 질환(metabolic disease)은 만성적인 대사 장애로 인하여 발생하는 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 비만, 관상 또는 동맥경화증과 같은 여러 가지 질환이 동시에 발생하는 질환을 일컫는 것으로서 1988년 Reaven(Reaven GM, Diabetes, 1988, 37:1595-1607)에 의해 처음으로 규명되었다. 대사성 질환은 인슐린저항성과 고혈압, 이상지질혈증을 특징으로 하고 있으며, 대부분 과체중이나 비만을 동반하고 있다. 대사성 질환은 또한 심혈관질환의 위험 인자이며, 여러 원인으로 인한 사망과 연관되어 있다고 보고되었다. 제2형 당뇨병 환자의 경우 제1형 당뇨병과 달리 대사성 질환의 유병률이 높다고 보고되고 있으며, 제2형 당뇨병 환자가 대사성 질환을 동반할 때 사망률이 증가한다고 알려져 있다(Bonora E, et al. Diabet Med., 2004, 21:52-8; Ford ES, Diabetes Care., 2005, 28:1769-78; Alexander CM, et al. Diabetes, 2003, 52:1210-1214). 또한, 제2형 당뇨병은 대혈관 및 미세혈관 질환과 고혈압, 이상지질혈증 등의 합병증 발생의 주요 원인 질환으로 알려져 있다(Mykkanen L, et al. Diabetologia., 1993, 36:553-559; Haffner SM, et al. Diabetes, 1992, 41:715-722).

당뇨병은 가장 대표적인 만성 성인병 중의 하나이다. 우리나라의 당뇨병 환자는 2011년 기준으로 30세 이상 인구의 12.4%에 해당하는 약 400 만 명에 이르는 것으로 보고된 바 있다(2013년 대한 당뇨병학회). 당뇨병(Diabetes)은 혈중에 있는 당분이 췌장에서의 인슐린 생성 또는 분비 능력의 감소나 근육, 간, 또는 지방조직 등에서의 인슐린의 작용, 당 흡수 또는 분해 능력이 감소함으로 인해 에너지로 사용되지 못하고 혈액에 그대로 남아 있게 됨으로 혈액에서의 당 성분이 증가함으로 나타나는 질병이다. 당뇨병의 원인으로는 대표적으로 식생활의 서구화, 비만증, 운동부족, 스트레스 등이 잘 알려져 있다. 현재 미국, 유럽 및 일본과 같은 선진국에서는 비만 및 당뇨병의 증가로 인한 사회 경제적인 폐해가 심화되고 있고, 한국의 경우도 경제 성장에 따른 식생활습관의 서구화로 인해 당뇨병 환자가 급속도로 증가하여 2050년이 되면 지금보다 약 190%가 증가한 6백만명에 이를 것으로 전망하고 있다(대한당뇨병 학회 당뇨병 실태보고서 2013). 2004년 와일드(Wild) 등이 보고한 바에 따르면 2000년 당시 전 세계 당뇨병 환자가 약 1억 7,100만명에서 2030년에는 약 3억 6,600만명으로 증가할 것으로 추정하였지만 2013년 현재 전 세계 당뇨병 환자가 이미 3억 4,600만명에 이르는 것으로 보고되었다(WHO Health 보고서, 2013). 이러한 추세라면 2030년 세계 당뇨병 환자는 그 예상치를 훨씬 넘어 설 것으로 예상된다. 특히, 국민건강보험공단에서 발표한 자료에 따르면 당뇨병 진료인원은 2006년 인구 10만 명당 3,305명에서 2010년 3,985명 연평균 4.8% 증가하였으며, 당뇨병으로 인한 총 진료비는 2006년 8,101억 원에서 2010년 1조 2,935억 원으로 연평균 12.4%가 증가하여 당뇨병 환자의 폭발적 증가와 함께 의료비 지출도 급격하게 증가하고 있어 국가적인 차원의 대책 마련이 시급한 현안으로 대두되고 있다. 그러나 앞에서도 언급한 바와 같이 당뇨병은 모든 만성질환의 주요 원인질환으로 여러 합병증으로 인한 의료비용과 사망에 따른 손실비용을 추산하게 되면 국가적인 대응을 해야만 하는 주요 질환으로 여겨지고 있다.

당뇨병은 크게 인슐린 의존성인 제1형 당뇨병과 비의존성 제2형 당뇨병으로 나눌 수 있다. 제1형 당뇨병 환자는 유전적 원인 또는 바이러스 감염 등에 의하여 어렸을 때부터 췌장베타세포의 사멸로 인하여 인슐린을 거의 분비하지 못하여 발생하는 것으로 알려져 있지만, 제2형 당뇨병 환자는 인슐린 분비 능력은 거의 정상으로 가지고 있었지만 성장을 하면서 노출되는 여러 생활습관적 또는 환경적 요인들에 의해 대부분 발생하는 것으로 알려져 있다. 많은 경우 비만을 동반하는 제2형 당뇨병은 혈중 내 지방산의 증가로 인하여 인슐린 저항성이 유도되어 포도당 대사에 이상이 발생하여 결국 혈중 내 혈당이 높아지는 질환이며, 아울러, 췌장소도의 기능 부전 및 이로 인한 인슐린 분비의 이상과 신호 전달 이상이 제2형 당뇨병의 원인으로 또한 생각된다. 인슐린 저항성은 제2형 당뇨병 환자의 90%이상에서 나타나는 주요 병인 요소로서, 고혈당이 나타나기 수년 전부터 선행되는 것으로 알려져 있다(Haffner S M, et al. JAMA, 1990, 263:2893-2898). 인슐린 저항성과 이에 따른 대사 이상 및 혈관계 이상들의 집합체를 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome) 또는 대사 증후군(metabolic syndrome)이라 한다. 인슐린 저항성과 대사증후군은 심혈관계 질환, 특히 관상동맥 질환의 위험도 증가와 연관성이 매우 높으며(Isomaa B, et al. Diabetes Care, 2001, 24:683-9), 관상동맥 질환의 위험도와 사망률을 3배 정도 증가시키는 것으로 보고되고 있다(Lakka H, et al. JAMA, 2002, 288:2709-2716).

최근 연구에 의하면, ATF3(Activating Transcription factor)은 당뇨, 비만 등 대사이상질환에 있어서 췌장 베타세포의 기능 저하 및 세포사멸을 유도하고 특히, ATF3가 과발현되면 췌장베타세포에서 당분해 효소인 글루코키나제(Glucokinase; GCK)와 이의 전사조절인자인 PDX-1 등의 발현 저하에 직접적으로 관여하여 인슐린 생성기능 저하 및 세포사멸을 증가시킴이 보고되었다(Kim et al., JBC. 2010, 285: 37251-37262; Kim et al., BBRC, 2011, 414: 681-687)

ATF3(Activating transcription factor 3) 단백질은 전사인자의 포유동물 활성전사조절인자/cAMP 반응요소-결합 단백질(mammalian activation transcription factor/cAMP responsive element-binding(CREB)protein)의 구성성분으로 두 개의 다른 동형단백질(isoforms)을 암호화하는 다수의 전사변이(transcript variants)가 이 유전자에서 발견되었다. 긴 변이는 ATF 결합 요소를 갖는 프로모터로부터 전사 활성화를 억제하고, ATF3 유전자는 암 발생에 관여하는 여러 요인들에 의해 나타나는 다양한 신호들에 의해 유도되며, 세포내 스트레스 반응의 복잡한 과정에 연관되어 있는 것으로 알려져 왔다. 그러나 최근에는 ATF3의 동형단백질 또는 이형단백질간의 복합체 형성 여부에 따라 표적 유전자들의 발현을 억제 또는 증가시키는 것으로 알려져 있다.

ATF3는 알려진 표적 유전자들의 활성인자(activator) 또는 억제제(repressor)로서 역할을 하고, 현재까지 문헌적으로 알려져 있는 ATF3의 잠재적 표적 유전자들은 20여 개가 넘으며, 여기에는 AdipoR1, AdipoR2, bNIP3, Cdc25A, CCL2, CCL4, Cyclin D1, FN-1, GLUT4, HIF-2α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-12b, IRS2, MMP1, MMP13, Noxa, p15PAF, Slug, Snail, STAT1, TNFα, TWIST1, p53, p73, PDX-1, 아디포넥틴(adiponectin) 등이 포함되는 것으로 알려져 있다.

대식세포(macrophage), 비만세포(mast cell), T 세포(T cell), 수지상 세포(dendritic cell) 등의 면역세포에서뿐만 아니라 섬유아세포나 상피세포를 비롯한 대부분의 세포에서 NFκB, JNK, Erk, p38, PKC 등 다양한 경로가 ATF3를 유도하고, 유도된 ATF3는 다양한 유전자들의 전사를 조절하여 세포사멸(apoptosis), 세포성장(cell proliferation), 세포이동(cell motility), DNA수선(DNA repair), 대사(metabolism)에 관여하며, 데이타베이스들도 상당수의 중요 전사인자들(AP1, CHOP, NFκB, p53 등)과의 연관성을 예시하고 있어 중심 신호분자로서의 역할 규명이 매우 중요한 것으로 알려져 있다. 특히 ATF3는 비만이나 당뇨병 발생에 의해서 증가하는 여러 유리 지방산이나 산화적 스트레스 물질들에 의해 발현이 크게 증가되는 것으로 확인되고 있다.

최근 연구에 따르면 19-21개 정도의 핵산으로 구성된 짧은 이중가닥(double strand) 간섭 RNA인 에스아이알엔에이(siRNA)가 세포 내에서 RISC(RNA-induced silencing complex)와 결합하여 세포 내 상보적인 염기 서열을 가진 mRNA에 특이적으로 작용하여 표적 mRNA를 분해하는 RNA 간섭 작용을 하는 것으로 매우 잘 알려져 있다.

상기 siRNA는 안티센스 올리고 뉴클레오티드에 비해 4-10배 정도 적은 양으로도 유전자 발현을 저해할 수 있어 세포 독성이 적고 유전자의 선택적 발현 저해가 뛰어나 이를 이용하여 암이나 유전적 질병을 유도하는 유전자가 단백질로 되는 것을 저해하면 질병의 원인을 없앨 수 있게 됨으로써 새로운 효과적인 질병치료제로 많은 관심을 받고 있다.

이에, 본 발명자들은 신규한 siRNA를 이용하여 대사성 질환 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 시험관 내 및 생체 내에 전달된 ATF3 유전자 발현을 억제하는 ATF3 siRNA가 췌장베타세포의 대사기능 저하 및 세포사멸을 억제시키고, 더불어 비만, 당뇨병 발생을 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 ATF3(Activating transcription factor 3) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ATF3(Activating transcription factor 3) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA를 제공한다.

또한, 본 발명은 ATF3 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 신규한 ATF3 siRNA가 기존 상업적으로 시판되고 있는 ATF3 siRNA를 처리한 경우에 비해 ATF3 유전자 발현을 더욱 크게 억제시키고 스트레스로 인해 생성되는 iNOS의 단백질 발현, NO 생성 및 ROS의 생성을 포함하는 산화적 스트레스, CHOP를 포함하는 ER 스트레스, 췌장베타세포기능 저하 및 혈장 인슐린 양 등을 더욱 크게 개선함으로써, 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 각각의 ATF3 siRNA를 세포 및 랫드(rat)의 생체 내로 전달시킨 후 ATF3 발현억제 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 ATF3 mRNA(A) 및 단백질(B) 발현 억제에 대한 기존의 ATF3 siRNA와 본 발명의 ATF3 siRNA의 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 ATF3 단백질 발현 억제에 대한 기존의 ATF3 siRNA와 본 발명의 ATF3 siRNA의 농도 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 ATF3 siRNA를 주사한 랫드(rat)에서 혈당, 트리글리세리드, 당분해, 지방간 및 인슐린민감도 등을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서 췌장베타세포의 세포사멸 억제 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서 활성산소(iNOS, 니트리트, ROS) 발현 억제 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 에탄올로 유도된 GCK, PDX-1, 인슐린 및 세포사멸의 발현저해가 ATF3 siRNA에 의해 개선되는 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 제작한 ATF3 siRNA를 이용하여 비만성당뇨쥐 모델에서 나타나는 췌장 베타세포의 기능 저하 및 내당능저하를 개선함으로써 당뇨병 발생을 예방할 수 있음을 나타내는 전체 모식도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 ATF3(Activating transcription factor 3) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 센스 RNA 및 안티센스 RNA로 구성된 siRNA(small interacting RNA)를 제공한다.

상기 ATF3는 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 siRNA는 상기 표적서열에 상동인 독립적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하거나 상기 센스 RNA 가닥 및 안티센스 RNA 가닥이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있다. 상기 센스 RNA 가닥은 서열번호 1 및 3인 것이 바람직하고 안티센스 RNA는 서열번호 2 및 4로 기재되는 안티센스 RNA인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데, 이를 특히 shRNA(short hairpin RNA)라 지칭한다. 한편, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다. 종래에 siRNA의 루프 영역으로 많이 사용되어온 예들은 다음과 같다: AUG(Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(8):5515-5520, 2002), CCC, CCACC 또는 CCACACC(Paul et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002), UUCG(Lee et al., Nature Biotechnology 20:500-505), CTCGAG, AAGCUU(Editors of Nature Cell Biology Whither RNAi, Nat Cell Biol. 5:489-490, 2003), UUCAAGAGA(Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002) 및 TTGATATCCG(www.genscript.com의 default spacer). siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조(protruding structure)와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

더불어, 본 발명에 따른 siRNA에서, 센스 RNA 가닥 및/또는 안티센스 RNA가닥은 이의 당 부분, 뉴클레오베이스 부분 또는 인터뉴클레오타이드 구조 내에 최소한 1개의 화학적 변형을 포함하는 것이 가능하다. 이러한 변형은 생체 내에서 뉴클레아제에 의해 siRNA의 파괴를 저해하는 것을 가능하게 할 수 있다. 본 발명에 따른 siRNA의 안정성과 생적합성을 생체 내에서 향상시킬 수 있는 모든 화학적 변형이 본 발명의 범위에 포함된다. 당 부분에 대한 바람직한 변형 중에서, 언급될 수 있는 것은 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-티오, 또는 2'-O-알킬과 같은 리보오스의 포지션 2', 그리고 바람직하게는 리보뉴클레오타이드 상의 정상 2'-OH 그룹을 대체하는 2'-O-메틸 또는 LNA의 포지션 2' 및 4' 사이에 있는 메틸렌 브릿지의 존재에서 일어나는 변형이다. 뉴클레오베이스의 경우, 5-브로모-유리딘, 5-이오도-유리딘, N3-메틸-유리딘, 2,6-디아미노퓨린(DAP, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시-유리딘(pdU), 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시시티딘(pdC)과 같은 변형된 염기 또는 콜레스테롤과 결합한 염기를 이용하는 것이 가능하다. 마지막으로, 인터뉴클레오타이드 골격의 바람직한 변형은 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 메틸포스포네이트, 포스포로디아미데이트 그룹에 의한 골격에 있는 포스포디에스터 그룹을 치환하는 것을 포함하거나, 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신(PNA, 펩타이드 핵산)으로 구성되는 골격을 이용한다. 다양한 변형(염기, 당, 골격)은 몰포리노(morpholino) 타입의 변형된 핵산(몰포린 링에 고정되고 포스포로디아미데이트 그룹에 의해 연결된 염기) 또는 PNA(펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위에 고정된 염기)에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 siRNA는 "분리된 것"이며, 이는 자연 상태에 있지 않은 것을 의미하지만 인간의 개입과 관련된 모든 수단에 의해 얻어질 수 있는 것을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 siRNA는 화학적 합성, 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제함으로써 얻어질 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 ATF3 siRNA를 제작하여 가장 효율적으로 ATF3를 억제하는 siRNA를 선별하였고(도 1A 참조), 상기 siRNA는 비만성 당뇨병이 발생한 ZDF 랫드의 생체내에서도 ATF3 mRNA 및 단백질의 발현을 억제하였으며(도 1B 및 1C 참조), 본 발명의 ATF3 siRNA가 기존에 판매되는 ATF3 siRNA보다 현저한 ATF3 억제 효과를 나타내는 것을 확인함으로써(도 2A, 2B 및 3 참조), 본 발명의 ATF3 siRNA는 기존의 ATF3 siRNA보다 우수한 ATF3 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명은 ATF3 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 센스 RNA 및 안티센스 RNA로 구성된 siRNA를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 ATF3는 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 siRNA는 상기 표적서열에 상동인 독립적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하거나 상기 센스 RNA 가닥 및 안티센스 RNA 가닥이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있다. 상기 센스 RNA 가닥은 서열번호 1 및 3인 것이 바람직하고 안티센스 RNA는 서열번호 2 및 4로 기재되는 안티센스 RNA인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 조성물은 공복혈당 및 트리글리세리드(triglyceride)양을 감소시키고, 당분해 능력을 증가시키는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 대사성 질환은 비만, 체중 감소, 당뇨병, 죽상경화증, 동맥경화증, 심혈관 질환, 신경 질환, 알츠하이머 질환, 인지 장애, 산화적 스트레스, 피부 질환, 피부 노화, UV 조사에 의한 손상, 고혈압, 고콜레스테롤혈증(LDL, HDL, VLDL), 고지혈증(트리글리세라이드), 면역 결핍, 암, 제2형 당뇨, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알코올성 지방간(fatty liver), 대사성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 조성물의 총 중량에 대하여 본 발명의 ATF3 siRNA를 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 ATF3 siRNA를 포함하는 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 siRNA의 생적합성과 전달성을 향상시키는 것을 가능하게 하는 당업자에게 잘 알려진 모든 운반체를 추가로 포함할 수 있다. 특히, siRNA와 함께 사용될 수 있는 운반체는 세포막을 투과할 수 있는 리포좀 및 펩타이드("세포-투과성 펩타이드")를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate), 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 흉부내 또는 뇌혈관내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.

일일 투여량은 siRNA의 양을 기준으로 0.6 내지 1.2 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.7 내지 1.1 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 1.1 ㎎/㎏이며, 하루 1회 투여되고 이때 여러 부위에 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, ATF3 유전자에 대한 억제가 비만성 당뇨병에 대해 개선효과가 있는지를 ZDF 당뇨 랫드에서 조사한 결과, ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서 공복혈당 및 혈장의 트리글리세라이드가 크게 감소함을 확인하였고(도 4A 및 도 4B 참조), 당분해 능력이 크게 향상됨을 확인하였으며(도 4C 참조), 인슐린에 의한 당 분해 능력이 회복됨을 확인하였다(도 4D 참조). 또한, 19주령 ZDF 랫드에 ATF3 siRNA를 주사하였을 때, 혈장 인슐린 양이 크게 증가되었고(도 4E 및 4F 참조), 췌장 베타세포의 세포사멸이 크게 감소하였으며(도 5A 참조), 이와 동일하게 ER 스트레스 관련 단백질인 CHOP, GRP78이 감소하고 당분해 효소 단백질인 글루코카이나아제 (GCK)의 감소가 회복됨을 보였고(도 5B 참조), 산화적 스트레스 마커인 iNOS 단백질 발현과 함께 NO 및 ROS 생성이 크게 감소함을 확인하였다(도 6A 및 6B 참조).

알코올을 섭취한 랫드에서 ATF3 siRNA의 생체 내 주입에 따른 ATF3 발현 억제를 통한 췌장베타세포의 기능 개선효과를 확인한 결과, ATF3 유전자를 직접 췌장베타세포인 INS-1 세포에 과발현 한 경우 GCK의 발현이 감소함을 확인하였다. 이와 동일하게 에탄올을 처리한 세포에서도 GCK, PDX-1 발현의 감소와 함께 인슐린 발현이 크게 감소됨을 알 수 있었다. 그러나 ATF3 siRNA를 과발현시킨 세포에 에탄올을 처리한 경우 이들 유전자들의 발현 저하를 현저히 억제함을 확인하였다(도 7A 및 7B 참조).

또한, ATF3 siRNA를 주사한 랫드의 경우에 ATF3와 PDX-1/HDAC1/2의 결합이 저해됨으로써 PDX-1과 p300의 결합이 증가하면서 히스톤 단백질에 아세틸화가 증가되어 GCK 유전자 발현이 증가함을 확인하였다(도 7C 참조). 에탄올 섭취한 랫드는 당분해 능력이 크게 감소되고 세포사멸이 증가한 반면에, ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서는 알코올에 의한 당분해 능력 감소가 크게 개선되었고 증가하였던 세포사멸이 크게 억제됨으로써(도 7D 및 7E 참조), 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 센스 RNA는 서열번호 1 및 3으로 기재되는 센스 RNA인 것이 바람직하다.

상기 안티센스 RNA는 서열번호 2 및 4로 기재되는 안티센스 RNA인 것이 바람직하다.

상기 조성물은 공복혈당 및 트리글리세리드(triglyceride)양을 감소시키고, 당분해 능력을 증가시키는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 대사성 질환은 비만, 체중 감소, 당뇨병, 죽상경화증, 동맥경화증, 심혈관 질환, 신경 질환, 알츠하이머 질환, 인지 장애, 산화적 스트레스, 피부 질환, 피부 노화, UV 조사에 의한 손상, 고혈압, 고콜레스테롤혈증(LDL, HDL, VLDL), 고지혈증(트리글리세라이드), 면역 결핍, 암, 제2형 당뇨, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알코올성 지방간(fatty liver), 대사성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 비교예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예, 실험예 및 비교예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 비교예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> ATF3 siRNA 의 제작

랫드 ATF3 siRNA를 제작하기 위해 랫드 ATF3 유전자(NM_012912) 염기서열을 바탕으로 다마콘(Dharmacon) siRNA제작 프로그램을 이용하여 일차적으로 후보군 올리고 뉴클레오티드를 선정하였고, 이를 다시 ㈜코스모진텍에 의뢰를 하여 생체 내 siRNA 전달시스템에 가장 효율적으로 반응할 수 있는 서열을 상기 회사의 알고리즘에 적용하여 재분석하여 최종 4개의 후보 염기서열대로 합성하였다. siRNA의 합성은 진파마사(GenePharma co.(중국))의 주문형 합성 siRNA(custome siRNA) 서비스를 이용하였다.

그 결과, 랫드(rat) siRNA 275 및 319의 올리고(oligo) 서열을 하기의 표 1에 나타냈다.

ATF3-RAT-319
Sense(서열번호 1)	5'-CACCUUUGCCAUCGGAUGUTT-3'
Antisense(서열번호 2)	5'-ACAUCCGAUGGCAAAGGUGTT-3'
ATF3-RAT-275
Sense(서열번호 3)	5'-CACCUUUUGUCAAGGAAGATT-3'
Antisense(서열번호 4)	5'-UCUUCCUUGACAAAAGGUGTT-3'
ATF3-RAT-520
Sense(서열번호 5)	5'-GGAGAGUGUGAAUGCCGAATT-3'
Antisense(서열번호 6)	5'-UUCGGCAUUCACACUCUCCTT-3'
ATF3-RAT-651
Sense(서열번호 7)	5'-GGAAGACGAGAGGAACCUUTT-3'
Antisense(서열번호 8)	5'-AAGGUUCCUCUCGUCUUCCTT-3'
랫드 ATF3 mRNA (서열번호 9)	AAGTGTCTACCTTGACAGGTGGGGTGGGACCACGTCCTCCACTGCGGCTGACAACATCCCTCCTAGGGAAGATGGAGTGAGAACATTCATCATTGAAGTTGTCCAATGGCCAGGGTATGCTTTCTAGAAACTATGCTGTTCTGTCCTAGACTGACTGTGCATAGGGCATTCATTTCTGAGCCTGGTGTTGTGCTATTTAGATGTTTGTCTTGCACAACATTGGCGTGATTTTTTTCCGGGAGTTTCATCAGACCTGATTTCCGAGAGTTTGGGGGTCTGCCACTGTGGACAATATCCCCCAAAAGTGTTTGGGTGGCCATGTAAACTGGCTGATGACCAGCTGTGCTACTCTGTGCTGACCGAGGACTGATGCCTCCTTCCCCTGTACCCACTGCTGAGGAAGAACCCGGGCACAGCAGCTGTCCTTGGCTACAAACTGTTACAATGTCACAGAACGAAGGCACAAAGTCCCGCTTTCAAAGGGCGTAGGACTCCACACTCAGTGACAGGGCAGGAAGAGCCAAGGATTCTCCGTTTTCCCTTCCTTCCCACCAAAAACCACAGCCCGTGGAGACTGGTATTTGAAGCCAGGAGTGGGGCAAGGAAGGTGTCTGCACTGTGGGATGTTAACTGCGCTTTTGTCTTGAAGCTATTTTGAGATGCGGTCCAGAGTATTTCAGCTGGGAGGTCCCTCCCACTGGCCACCAGGGCTCTGGCTACTGTTAAAATTCTGATGTTTCTGTGAAATCCTCAGTGTTCAATCCGACTCAGTAGTATATTACAGTTTTCTGTAAGAGAGAACGTTACTTATTTATCCCAGTATTCCTAGCCTGTCAACGTAATAAAATATCAGAATGAGACCTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'

< 실시예 2> ATF3 siRNA 선별

<2-1> 세포주의 형질감염

상기 실시예 1에서 제조된 ATF3 siRNA가 췌장 베타세포(pancreatic β-cells), 간세포(hepatocytes), 섬유아세포(fibrobalst), 신장세포(kidney mesangial cells) 등에서 ATF3 단백질을 효과적으로 억제하는지를 확인하기 위하여 이를 상기 세포에 형질감염시켰다.

siRNA를 준비하는 단계로서 각 바이알(vial)을 스핀다운(spin down)하고 ATF3 siRNA 275 및 319를 125 ㎕의 RNAse가 없는 물(RNAse free water)에 녹여 20 μM이 되도록 한다. 음성대조군 siRNA(negative control siRNA)를 62.5 ㎕의 RNAse가 없는 물에 녹여 20 μM이 되도록 한다.

siRNA를 일시적으로 형질감염시키기 위하여, MIN6N8, INS-1, HepG2, 3T3L1 및 MES-13 세포에 리포펙타민 RNAiMAX(lipofectamine)(Invitrogen)를 사용하였다. 구체적으로, siRNA 형질감염 시키기 하루 전에 항생제가 없는 배지로 60 mm 세포 배양 플레이트에 30-50% 세포 밀도가 되도록 깔고 세포배양기(37℃, 5% CO₂)에서 배양한다. 형질감염시키는 당일에, 각각의 혈청(serum)없는 500 ㎕의 OPTI-MEM 배지에 6.25 ㎕의 본 발명의 siRNA duplex를 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 손가락으로 툭툭 치면서(tapping) 섞는다.

볼텍스(voltex)로 섞어준 리포펙타민 RNAiMAX에서 5 ㎕를 취하여 상기 각각의 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 섞은 후(tapping) 상온에서 15분간 반응시킨다. 따라서, 최종 siRNA 농도는 50 nM이 되고, siRNA duplex-lipofectamine RNAiMax 복합체를 준비된 세포에 넣고 잘 섞는다. 37℃에서 48시간 동안 배양 후, 세포를 회수하여 RNA 및 단백질을 추출하여 RT-PCR 또는 웨스턴블랏을 실행하였다. 특히, ATF3는 정상세포에서 거의 발현을 하지 않으므로 siRNA로 형질감염시킨 후 24시간째에 TNF-α(20 ng/ml)를 처리하여 발현을 유도하였다.

<2-2> ATF3 siRNA 에 의한 ATF3 발현 확인

상기 실시예 <2-1>에서 형질감염시킨 ATF3 siRNA(siRNA 275, siRNA 319, siRNA 520 및 siRNA 651)가 ATF3를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여, 세포를 배양용기에 하루밤 동안 키운 다음 리포펙타민 RNAiMAX 키트(Invitrogen, USA)을 이용하여 사용자설명서에 따라 ATF3 siRNA를 형질감염시킨 후 24시간 동안 37℃ 이산화탄소배양기에서 배양 후 세포를 모아 단백질을 분리하였다. 폴리아크릴 아마이드 단백질 분리 겔을 제작한 다음 여기에 단백질(30 μg 씩)을 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후 겔 상에서 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막으로 이동을 시킨 다음 5% 스킴 밀크 (Skim Milk)를 함유한 PBS에서 안정화를 시킨 후 ATF3 또는 튜블린(tublin; Santacruz, USA) 항체를 상기 용액에 1:1,000의 농도로 희석하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음으로 0.1% Tween PBS 용액으로 10분씩 3 회 세척한 후 HRP-conjugated anti-mouse IgG 또는 항-래빗 IgG 항체를 1:5,000으로 PBS에 있는 5% 탈지분유(Skim Milk)에 희석하여 상온에서 한 시간 배양하였다. 다음으로 0.1% Tween PBS 용액으로 10분씩 3회 세척한 후 ECL 용액(Santacruz, USA)에 반응 후 형광의 세기를 X-ray 필름(Kodak, USA)상에 현상하였다.

그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이, 상기 모든 세포에서 ATF3 단백질 발현이 가장 효율적으로 억제된 것은 랫드(rat) siRNA 275 및 319임이 확인되었다(도 1A).

< 실시예 3> ATF3 siRNA 생체 내 ATF3 유전자 발현 억제 확인

<3-1> ZDF 랫드에서 ATF3 siRNA 의 생체 내 전달

상기 실시예 2에서 선별한 siRNA가 생체 내에서 동일한 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, ZDF 랫드에 생체 내 jetPEI^TM를 사용하여 ATF3 siRNA를 랫드에 주사하였다. ZDF 랫드는 비만을 동반한 당뇨발생 랫드로서 6주령이면 당뇨 전단계인 고혈당, 고인슐린 현상이 나타나고 10주령 이후에는 당뇨로 진입을 하게 되고 19주 후부터는 당뇨 이후 단계에 해당 되어 대사기능이 심하게 감소 되는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 상기 랫드가 주령에 따라 췌장에서 인슐린의 합성 및 생산능력의 감소와 더불어 이에 대한 신호경로의 변화에 따른 당뇨병 발생의 주원인이 될 수 있는 ATF3 단백질의 기능제어를 통하여 당뇨병 발생을 제어할 수 있는지에 대한 가능성을 확인하고자 하였다.

폴리플러스 트랜스펙션 TM(Polyplus transfection TM)의 생체내 jetPEI^TM siRNA 운반 시약(in vivo-jetPEI^TM siRNA delivery reagent)를 사용하였다. 생체내 jetPEI^TM은 생체내에 핵산(DNA, shRNA, siRNA 및 onucleotides 등)들을 효율적으로 전달하는데 사용되는 선형의 폴리에틸레이민(linear polyethylenimine, PEI)으로서 독성이 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 생체내 jetPEI^TM 은 핵산을 정맥주사(intravenous, i.v.), 복강내주사(intraperitoneal, i.p.), 심장내주사(intracardiac), 종양내 화학요법(intratumoral), 피하주사(sub-cutaneous) 등의 다양한 방법으로 조작으로 전달할 수 있는 효율적인 방법이다.

폴리에틸레이민(PEI)은 폴리-L-라이신(Poly-L-Lysine)의 개발 이후에 개발된 두 번째 중합과발현 전달물질이다. PEI는 DNA를 양성전극을 가진 입자로 응축을 하여 음성전극을 가진 세포 표면 잔기에 쉽게 결합을 하여 세포흡수작용(Endocytosis)을 통해 세포 안으로 전달하게 한다.

구체적으로, 합성된 ATF3 siRNA(#275 및 #319)는 21 bp로 이루어져 있고 1 OD는 약 33.2 ㎍에 해당되므로, 1 OD 기준으로 125 ㎕의 DEPC가 처리된 물에 siRNA를 녹이면 약 20 μM의 최종 농도가 된다. 랫드 한 마리당 150 ㎍의 siRNA를 3일 간격으로 1회씩 총 6번의 정맥 주사한 후 1 내지 2주 동안 유지하였다.

ATF3 siRNA 주사방법으로서, 하기의 단계에 따라 수행하였다.

1) 250 ㎕의 멸균된 물로 150 ㎍의 siRNA를 녹이고 250 ㎕의 10% 글루코오스 용액을 첨가하여 최종 500 ㎕ (5% 글루코오스)가 되도록 섞어준 후 스핀다운(spin down)한다.

2) 226 ㎕의 멸균된 물에 24 ㎕의 생체내-jetPEI 시약을 넣고 여기에 250 ㎕의 10% 글루코오스 용액을 첨가하여 최종 500 ㎕(5% 글루코오스)가 되도록 섞어준 후 스핀다운(spin down)한다.

3) 상기 1)과 2)가 완성이 되면 양쪽을 잘 섞고 스핀다운(spin down)한 후 상온에서 15분간 반응시킨다.

4) 반응이 끝난 후, 즉시 각각의 랫드 1마리당 1 ㎖씩 정맥주사(반복 주사도 가능함)를 한다.

5) 3일 간격으로 하루에 한 번씩 6회 주사한 후, 각 장기(간, 췌장, 신장 등)에서 ATF3 발현의 저하를 확인한다.

<3-2> ATF3 siRNA 처리된 랫드에서 ATF3 mRNA 발현 억제 확인

상기 실시예 <3-1>의 방법으로 ZDF 랫드의 생체 내로 전달된 ATF3 siRNA가 ATF3 유전자 발현을 억제하는지 확인하였다. mRNA는 랫드의 폐, 간, 췌장 조직 및 쥐의 췌장에서 분리한 소도세포로부터 분리를 한 후 이를 역전사 효소(Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA로 전환을 시킨 후 상기 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 랫드 ATF3 (NM_012912)에 대한 프라이머 (primer)의 염기서열은 Forward: 5'-CTCTAGCCGCTCTCTGGACC-3’(서열번호 10)와 Reverse: 5'-CGGCATTCACACTCTCCAGT-3’(서열번호 11)을 사용하였다. PCR은 조건은 (94℃-55℃-72℃)로 30 사이클(Cycle)로 수행하였다. 수행한 후 1% agarose 겔에 전기영동한 후 UV상에서 밴드를 확인하고 이에 대한 밴드 세기를 정량화하여 그래프화 하였다.

그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이 당뇨병 랫드의 폐(Lung) 및 간(Liver)에서 각각 ATF3의 mRNA 및 단백질의 발현이 현저히 저해되고(도 1B), 도 1C에 나타낸 바와 같이, 췌장조직(Pancreas tissues) 및 분리한 소도세포(islet cells)에서도 각각 ATF3의 mRNA 및 단백질의 발현이 현저히 저해됨을 확인할 수 있었다(도 1C).

< 비교예 1> 기존에 판매되는 ATF3 siRNA 와 본 발명의 ATF3 siRNA 비교

<1-1> ATF3 mRNA 발현억제 효과 비교

상기 실시예 1에서 선별된 본 발명의 ATF3 siRNA와 기존에 시판되는 산타크루즈사(Santacruz Biotech; sc-72029)의 제품 및 퀴아젠사(QIAGEN)에서 주문 합성한 센스(sense) 5'-AGUCAGUUACCGUCAACAA-3' (서열번호 12) 및 안티센스(antisense) 5'-UUGUUGACGGUAACUGACU-3' (서열번호 13) ATF3 siRNA를 이용하여 ATF3 유전자 발현 억제 효과를 비교하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 구체적으로, 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA는 각 바이알(vial)을 스핀다운(spin down)하고 ATF3 siRNA를 330 ㎕의 RNAse가 없는 물(RNAse free water)에 녹여 10 μM이 되도록 한다. 대조군 siRNA(control siRNA)를 66 ㎕의 RNAse가 없는 물에 녹여 10 μM이 되도록 준비하여 상기 실시예 <2-1>의 방법으로 형질감염을 수행하였고, 이때 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA는 12.5 ㎕를 사용한 후, 상기 실시예 <3-2>의 방법을 사용하여 확인하였다. 세포나 조직으로부터 추출한 2 ㎍ RNA에 DNA분해효소를 넣어 DNA를 완전히 제거한 후 EDTA 용액을 넣어 반응을 종결시켰다. RNA의 순수도를 확인하기 위해 아가로우즈 겔에 반응샘플 3 ㎕를 전기영동하여 확인하고 스펙트로 포토미터기기를 이용하여 OD₂₆₀에서 RNA 정량을 하였다. 정량한 RNA 1-2 ㎍에 DEPC가 든 물을 15 ㎕가 되게 채우고 이에 0.5 ㎕의 10 μM 프라이머를 넣고 70℃에서 10분간 가열한 후 얼음위에서 식히고 간단히 원심분리하였다. 역전사반응 용액(5 x RT 버퍼, 0.1 M DTT, 10 mM dNTP 믹스, RNAsin, Superscript II)을 제조하여 0.2 ㎖ PCR 튜브에 든 RNA 샘플에 9.5 ㎕씩 분주를 하여 PCR 기계에 넣고 18℃ 5분, 42℃ 90분, 50℃ 10분, 70℃ 10분 반응을 시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 2 ㎕에 10 x PCR 버퍼, 25 mM MgCl_{2 ,} 10 mM dNTPs, 10 μM 프라이머 1/2, Taq DNA 중합효소, 증류수를 넣어 총 50 ㎕로 만들어 94℃ 2분 x 1회, 94℃ 30초 - 55℃ 30초 - 72℃ 2분 x 30회, 72℃ 5분 x 1회로 PCR 반응을 시키고 4℃로 식힌다. PCR 반응물 25 ㎕를 1% 아가로우즈 겔에서 전기영동을 하여 UV 램프 상에서 확인하였다. 사용한 랫드 ATF3에 대한 프라이머는 Forward: 5'-CTCTAGCCGCTCTCTGGACC-3’(서열번호 10)와 Reverse: 5'-CGGCATTCACACTCTCCAGT-3’(서열번호 11)을 사용하였다.

그 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이, 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA와 비교하여 본 발명의 siRNA 275 및 319가 ATF3 mRNA를 더욱 현저히 억제하는 것을 확인하였다(도 2A 참조).

<1-2> ATF3 단백질 발현억제 효과 비교

상기 비교예 <1-1>과 동일한 방법으로 각각 본 발명의 siRNA, 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA를 INS-1 세포에 형질감염시키고 24시간 후, 20 ng/㎖의 TNF-α을 24시간 동안 처리하고 RNA 또는 단백질을 분리하여 웨스턴블랏을 수행하였다.

그 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA와 비교하여 본 발명의 siRNA 275 및 319가 ATF3 단백질을 더욱 현저히 억제하는 것을 확인하였다. 따라서, 이들의 억제효과는 기존의 상업적으로 시판되는 siRNA보다 더 높은 것으로 확인되었다(도 2 ).

<1-3> siRNA 농도에 따른 발현억제 효과 비교

선택한 랫드 siRNA 275 및 319의 특이적 발현 저하 효과를 더욱 확인하기 위하여, 각 제품들을 농도별로 형질감염시킨 후 상기 비교예 <1-2>와 동일한 방법으로 효과를 비교하였다. 이때, 효과의 민감도를 보기 위하여, 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA는 25, 50 nM로, 본 발명의 랫드 siRNA 275 및 319는 기존 제품들보다 농도를 반으로 줄여 12.5, 25 nM를 형질감염시켰다. 24시간 후 20 ng/㎖의 TNF-α을 24시간 동안 처리한 후 단백질을 분리하여 웨스턴블랏을 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, TNF-α에 의해 증가한 ATF3의 단백질 발현을 산타크루즈사 및 퀴아젠사와 비교한 결과, 본 발명의 ATF3 siRNA 275 및 319에 의한 ATF3 단백질 발현 저하가 더 큰 것으로 확인되었다(도 3).

< 실험예 1> ATF3 siRNA 처리된 당뇨 랫드 모델에서 대사기능 저해

<1-1> 혈당변화 확인

ATF3 유전자에 대한 억제가 비만성 당뇨병에 대해 개선효과가 있는지를 조사하기 위하여, 랫드의 혈당 내 글루코오스 양을 조사하였다.

상기 실시예 <3-1>과 동일하게 ATF3 siRNA-319를 ZDF 랫드 꼬리 정맥에 주사를 하였다. 상기 ATF3 siRNA-319를 1회(single) 주사(급성)를 한 경우와 6회 주사(만성)한 랫드에서 공복혈당에 미치는 효과를 비교확인하기 위해서, ATF3 siRNA-319를 주사한 후 19주까지 랫드에게 먹이를 유지시키고, 희생되기 하루 전에 먹이를 중단시킨 후(16시간) 다음날 아침에 포도당 측정기(glucometer DEX(Bayer))를 사용하여 혈당을 측정하였다.

그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, ATF3 siRNA-319를 6회 주사한 랫드에서 공복혈당이 크게 감소됨을 확인하였다(도 4A).

<1-2> 트리글리세리드 양의 변화 확인

랫드 혈장(plasma) 내 트리글리세리드(plasma triglyceride) 양을 조사하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>과 동일하게 ATF3 siRNA-319를 ZDF 랫드 꼬리 정맥에 주사를 하였다.

상기 실험예 <1-1>과 동일하게 실험하되, 랫드를 희생시키고 얻은 혈장에서 간지방축적의 마커로서 활용되는 트리글리세라이드(triglyceride(Tg))의 양을 트리글리세라이드 시약 키트(Infinity Triglyceride reagent kit(Thermo Scientific))를 사용하여 제조사의 프로토콜과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, ATF3 siRNA-319를 6회 주사를 한 랫드에서 혈장의 트리글리세라이드가 크게 감소됨을 나타냈다(도 4B).

<1-3> 내당능 및 당분해 변화 확인

랫드의 내당능 및 당분해능을 조사하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>의 동일한 방법으로 ATF3 siRNA-319를 ZDF 랫드 꼬리 정맥에 주사를 하였다.

상기 실험예 <1-1>과 동일하게 실험하되, 랫드를 희생시키기 전에 먹이를 제한한 후 내당능 검사를 하기 위하여, 랫드 1kg당 1.5 g의 글루코오스(glucose)를 각각의 랫드 복강에 주사를 한 후 30분, 60분 및 120분에 혈당을 측정하였고(GTT 측정), 당분해 능력을 확인하기 위하여 랫드 1kg당 2 IU의 인슐린을 복강에 주사한 후 30분, 60분 및 120분에 혈당을 측정하였다(ITT(인슐린 민감도)측정).

그 결과, 도 4C에 나타낸 바와 같이, ZDF 당뇨 랫드에서 크게 감소되었던 당분해 능력이 ATF3 siRNA-319를 주사한 랫드에서 크게 향상되었고(도 4C), 도 4D에 나타낸 바와 같이, ZDF 당뇨 랫드에서 인슐린에 의한 당 분해 능력이 감소되었지만, ATF3 siRNA를 주사한 ZDF 당뇨 랫드에서는 인슐린에 의한 당 분해 능력이 회복됨을 확인하였다(도 4D).

<1-4> 인슐린 민감도 및 인슐린 양 변화 확인

ZDF 랫드는 6주(당뇨 전단계)를 거쳐 10주(당뇨)를 거치면서 고혈당, 고인슐린 증상이 나타나고 인슐린 저항증이 오게됨으로써 당분해 능력이 떨어지는 것으로 알려져 있다. 그러나 ZDF 랫드 19주령의 경우에 고혈당 현상은 더욱 심화되어 있지만 췌장베타세포에서의 기능저하와 세포사멸에 의해 인슐린 합성이 적어지고 분비량이 적어지면 혈장의 인슐린 양이 적어지는 것으로 알려져 있다.

이에 ATF3 siRNA를 주사한 후 췌장베타세포의 인슐린 합성 및 분비 기능이 개선되는지를 확인하기 위하여, 19주령 ZDF 당뇨 랫드에서 상기 실험예 <1-1>에서 실시한 동일한 방법으로 혈장 내 인슐린 양을 측정하였다.

그 결과, 도 4E 및 4F에 나타낸 바와 같이, 19주령 ZDF 당뇨 랫드에서 혈장 인슐린 양이 크게 감소하였으나 ATF3 siRNA를 6회 주사한 19주령 ZDF 당뇨 랫드에서 혈장 인슐린 양이 크게 증가됨을 확인하였다(도 4E 및 4F).

결론적으로, 본 발명의 ATF3 siRNA에 의한 ATF3 유전자 발현 감소를 통하여 비만성 당뇨병 발생 시 증가되었던 인슐린 저항증을 통한 당 분해 능력 감소를 크게 개선시켰고, 췌장베타세포에서의 인슐린생성 및 ATP 생성 감소와 같은 기능저하가 크게 개선됨을 확인하였다.

< 실험예 2> ATF3 siRNA 에 처리한 당뇨랫드 모델에서 췌장베타세포의 세포사멸 억제 효과 확인

ATF3 siRNA를 주사를 한 랫드에서 췌장베타세포의 세포사멸을 확인하기 위하여, 랫드의 소도세포에서 세포사멸을 관찰하였다.

ATF3 siRNA-319를 ZDF 랫드 꼬리 정맥에 주사한 후, 췌장으로부터 소도세포를 분리한 후 곧바로 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-medaited dUTP nick end labeling, Promega, Madison, USA) 분석을 수행하였다. 여기서 사용한 DeadEndtM Colorimetric TUNEL 시스템은 기존 TUNEL 분석방법을 변형시킨 방법으로 세포사멸이 일어나는 세포의 핵에서 DNA가 쪼개지게 되는데 이 쪼개진 DNA의 작은 조작들의 3‘-OH 끝에 바이오틴이 붙어있는 뉴클레오티드를 말단 탈하이드록시기 전이 재조합(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase recombinant, rTdT)효소를 이용하여 붙이는 방법이다. 상기 반응이 끝난 후, Horseradish peroxidase가 붙어있는 스트렙타비딘 (Streptavidin)을 첨가하여 반응을 시키면 바이오틴이 붙어있는 뉴클레오티드에 결합이 되고 여기에 산화효소 기질인 과산화수소, 크로모겐(Chromogen), 디아미노베지딘 (Diaminobenzidine, DAB)을 넣어 반응을 시켜 세포사멸이 일어난 세포의 핵이 어두운 갈색으로 염색이 된다.

그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, ATF3 siRNA를 주사를 한 랫드에서 췌장 베타세포의 세포사멸이 크게 감소함을 나타냈다(도 5A). 도 5A의 그래프는 도 5A에서 TUNEL-양성 세포를 무작위로 50개씩 세어서 수치화하여 나타낸 그래프이다.

< 실험예 3> ATF3 siRNA 처리한 당뇨 랫드 모델에서 ER 스트레스 억제 효과 확인

<3-1> ER 스트레스 마커의 단백질 발현 변화 확인

19주령 ZDF 랫드의 췌장조직에서 ER 스트레스 마커인 CHOP, GRP78와 세포사멸마커인 Bax, Caspase 3 cleavage, 췌장베타세포 당대사관련 글루코카이나제(GCK), 인슐린 및 지방축적에 관한 마커인 FAS SREBP1c 들의 단백질 발현에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>에서 사용한 동일한 방법으로 랫드에 ATF3 siRNA를 주사하여, 상기 서술한 바와 같이 웨스턴블랏을 수행하였다.

그 결과, ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서 ER 스트레스(CHOP 및 GRP78)와 세포사멸을 유도하는 Caspase-3의 절단을 저해하는 것으로 나타났다. 그러나, 당대사효소인 GCK 발현은 크게 증가를 하였고 인슐린의 발현도 증가를 하였다. 반면 지질 축적에 관련된 FAS 및 mSREBP1c의 발현은 크게 감소를 하였다(도 5B).

<3-2> 소도세포에서 ER 스트레스 마커 단백질 발현 확인

랫드의 소도세포에서 ER 스트레스 마커인 CHOP의 단백질 발현 여부를 조사하기 위하여, 하기의 실험방법을 수행하였다.

ATF3 siRNA 주사를 한 랫드의 췌장조직을 파라핀(Paraffin)으로 고정하고 절단한 후, ATF3, 인슐린 및 CHOP 항체로 염색을 하여 소도세포에서의 이들 단백질들의 발현을 조사하였다. 또한, 이들 조직에서 헤마톡실린/에오신(hematoxylin & eosin)염색을 하여 조직의 생리학적 행태를 조사분석하였다.

그 결과, 도 5C에 나타낸 바와 같이, ZDF 당뇨 랫드에서 크게 증가한 ATF3 및 CHOP의 발현이 ATF3 siRNA에 의해 크게 감소되었고 인슐린 발현은 크게 증가함을 나타냈다(도 5C). 도 5D는 항체를 이용하여 염색한 단백질 발현 세포 및 염색 강도를 측정한 후 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다(도 5D).

상기 결과로부터 대조군 siRNA를 주사한 랫드의 경우, 19주령의 ZDF 랫드에서 볼 수 있는 소도세포의 크기가 작아져 있고, ATF3 siRNA를 주사한 랫드의 경우는 대조군에서 작아진 소도세포의 크기를 회복되는 것으로 나타났다.

< 실험예 4> ATF3 siRNA 처리한 당뇨 랫드 모델에서 산화적 스트레스 억제 효과 확인

<4-1> iNOS 단백질 발현 확인

세포사멸시 관련되어있는 것으로 알려진 산화적 스트레스가 ATF3와 연관되어 있는지를 조사하기 위하여, 상기 서술한 바와 같이, 웨스턴블랏 분석 및 면역항체 염색법을 사용하여 산화적 스트레스의 마커인 iNOS 단백질의 발현을 조사하였다.

그 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, ZDF 랫드에서 증가한 iNOS의 단백질 발현이 ATF3 siRNA를 주사를 한 랫드에서 크게 감소함을 확인하였다(도 6A). 상기 결과는 췌장 조직의 소도세포에서도 동일하게 나타났다.

<4-2> 산화질소( nitrix oxide ) 발현 확인

산화적 스트레스가 증가하면 iNOS의 발현과 함께 산화질소(nitric oxide)의 증가가 함께 나타나는 것으로 알려져 있다. ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서 산화질소의 측정을 위하여, 그리에스(Griess) 측정방법을 이용하였다. 산화질소(Nitric Oxide, NO)는 많은 생물학적 시스템에서 중요한 생리적전달자 및 조절자로서 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 다양한 시스템에서의 역할 때문에 생물학적 시스템에서 NO의 양을 측정하는 것은 매우 중요하다고 할 수 있다. NO형성을 측정하는 방법으로는 주로 NO의 분해될 때 나오는 산물들 중 가장 안정된 니트리트(nitrite(NO₂ ^-))를 측정함으로 확인을 하게 된다. 이 측정 방법은 1879년에 Griess에 의해 만들어진 디아조화 (diazotization) 반응에 근거해서 고안된 방법으로서, 설파닐아미드(sufanilamide)와 NED(N-1-napthylethylenediamine dihydrochliride)를 사용하여 산성화(Phophoric acid)조건에서 일어나는 화학반응을 근거로 한다. 설파닐아미드가 니트리트 (NO₂ ^-)를 만나게 되면 물 한분자가 만들어져 나가게 되고 이는 다시 NED를 만나게 되면 아조 화합물이 형성된다. 이때 형성된 아조 화합물이 색깔을 띄게 되면서 NO의 양을 간접적으로 측정하는 원리로서, 먼저 4℃에 보관되어 있던 설파닐아미드와 NED를 상온에 15-30 분간 미리 꺼낸 후, 각 실험 샘플 50 ㎕씩을 각 플레이트 웰에 넣고 다채널 파이펫으로 50 ㎕의 설파닐아미드 용액을 모든 실험 샘플에 넣어 상온에서 5-10 분간 반응을 시켰다. 이때 빛을 차단하고 반응이 끝이 난 후 50 ㎕의 NED 용액을 모든 샘플에 넣어주고 다시 상온에서 5-10분간 반응을 시켰다. 반응을 시키는 것과 동시에 보라색/자홍색이 나타나고 30분 안에 520 nm ~ 550 nM 사이의 필터를 가지고 있는 플레이트 리더기에서 흡광도를 측정하였다. 이때 보라/자홍색이 나타남으로써 이들이 반응을 통해 azo (아조)가 형성이 되었음을 나타낸다.

그 결과, 도 6B에 나타낸 바와 같이, ZDF 당뇨 랫드에서 크게 증가한 NO 생성 및 ROS의 생성이 ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서는 크게 감소됨을 확인하였다(도 6B).

< 실험예 5> ATF3 siRNA 에 의한 췌장베타세포의 기능 개선 효과 확인

<5-1> 췌장베타세포에서 ATF3 과발현에 의한 GSK mRNA 발현 변화 확인

산화적 스트레스를 유발하는 알코올을 섭취하게 한 랫드에서 증가하는 ATF3는 당분해효소인 글루코카이나제(GCK) 유전자의 전사조절인자인 PDX-1 단백질과 직접결합을 하여 유전자발현 조절에 필요한 히스톤(histone) 단백질에 아세틸기를 전달해주는 효소인 p300 (acetyltransferase)과 PDX-1과의 결합을 억제하고 히스톤디아세틸화 효소인 HDAC1/2 (Histone deacetylase 1, 2)를 끌어당김으로써 GCK 유전자 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다.

췌장베타세포인 INS-1세포와 만성적 알코올 섭취를 하게 한 랫드에서 ATF3 siRNA에 의한 ATF3 발현 억제를 통한 췌장베타세포의 기능 개선효과 확인하기 위하여, 췌장 베타세포인 INS-1세포에 ATF3 cDNA를 과발현시킨 후 당분해 효소인 글루코카이나제(GCK) mRNA 발현을 RT-PCR로 확인하였다.

그 결과, 도 7A에 나타낸 바와 같이, ATF3가 과발현된 세포에서 GCK mRNA 크게 감소함을 확인하였다(도 7A).

<5-2> ATF3 siRNA 처리에 의한 단백질 발현 변화 확인

에탄올 처리한 세포에서 ATF3 siRNA에 의한 GCK, ATF3, PDX-1 및 인슐린 단백질의 발현 변화를 확인하기 위하여, 상기 실험예 <3-2>에 서술된 바와 같이 면역항체 염색법을 수행하였고, 이때 GCK, ATF3, PDX-1 및 인슐린 항체를 사용하였다.

INS-1세포에 ATF3 siRNA를 형질감염시킨 세포와 시키지 않은 세포에 각각 100 mM 에탄올을 24 시간 동안 처리한 후 GCK, ATF3, PDX-1 및 인슐린 항체로 세포에 염색을 하여 발현정도를 형광 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 7B에 나타낸 바와 같이, 에탄올을 처리한 군에서 GCK, PDX-1 및 인슐린의 발현이 감소하였으나 ATF3 siRNA를 이용하여 ATF3의 발현을 억제시킨 세포에서는 감소되었던 GCK, PDX-1 및 인슐린의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다(도 7B).

<5-3> ATF3 siRNA 처리에 의한 단백질 결합 확인

ATF3의 발현억제에 따른 단백질의 상호작용을 확인하기 위하여 면역침전을 수행하였다. 면역침전법은 세포를 깬 용해물과 특정단백질에 대한 항체를 반응시켜 이 항체만을 정제하여 사용하는 방법으로 특정 단백질들에 결합하는 단백질들을 확인하는데 유용하게 사용되는 방법이다. 실험방법은 실험 군 세포나 조직을 용해시킨 다음 약 500 ~ 1,000 ㎍ 단백질과 1-2 ㎍ 항체를 4℃에서 16시간 동안 회전을 시키면서 반응을 시킨 후 반응 특이성을 높이기 위해 항체만을 정제를 하게 되는 이때 항체에 반응을 하는 단백질 G 또는 A 아가로즈(Protein G/A agarose)에 붙어있는 비드(bead)를 사용하여 반응을 시켰다. 반응이 끝닌 후 간단 원심분리와 간단 세정(Washing)과정 반복을 통하여 비드에 결합된 단백질만을 분리하였다. 이들에 결합된 단백질들을 확인하기 위해 얻어진 샘플 적당량 (20 ㎕)을 5분간 100℃에서 끓인 후 폴리아크릴 아마이드 겔에서 전기영동을 하고 PVDF 막으로 흡착을 시켜 항체반응을 통해 원하는 항체를 사용하여 상기 방법과 동일하게 웨스턴블랏을 수행하였다.

INS-1세포에 ATF3 siRNA를 이용하여 결핍시킨 세포와 시키지 않은 세포에 각각 에탄올을 처리한 후 세포를 용해시키고 PDX-1 항체로 면역침전(immunoprecipitation)을 시킨 후 결합하는 단백질들의 변화를 관찰하였다. 여기서 사용한 생체 내 결합분석은 INS-1세포에 직접 ATF3의 발현을 저해하는 siRNA를 제작하여 과발현을 시킨 후 100 mM 에탄올을 24 시간동안 처리한 후 세포를 모아 용해를 시킨 다음 1,000 ㎍의 단백질과 PDX-1 항체를 16시간 동안 반응시켜 단백질 G/A-agarose와 반응을 시킨 다음 분리 정제하여 전기영동을 하여 각각의 항체를 사용하여 웨스턴블랏을 수행하여 PDX-1 단백질과 특이적으로 결합을 하는 단백질들의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 7C에 나타낸 바와 같이, 에탄올 처리한 군에서 PDX-1과 에탄올에 의해 증가한 ATF3가 서로 강하게 결합을 하고 있고, 반면에 PDX-1과 결합을 하는 것으로 알려진 아세틸화축매효소(acetyltransfecrase)인 p300과의 결합은 오히려 크게 감소를 하였다. 이와는 반대로 히스톤 탈아세틸화촉매효소(histone deacetylase, HDAC)인 HDAC1 또는 HDAC2와 PDX-1의 결합은 오히려 ATF3가 증가한 것과 동일하게 증가함을 나타냈다. 이와 함께 베타세포에서의 당분해효소인 GCK 발현은 알코올에 의해 총 용해물에서 감소함을 확인하였다. 또한, ATF3 siRNA를 주사한 랫드의 경우에 ATF3와 PDX-1/HDAC1/2의 결합이 저해됨으로써 PDX-1과 p300의 결합이 증가하면서 히스톤 단백질에 아세틸화가 증가되어 GCK 유전자 발현이 증가하였다(도 7C).

<5-4> ATF3 siRNA 에 의한 당분해능 증가 확인

알코올을 섭취한 랫드에서 ATF3 siRNA에 의한 당분해능을 확인하기 위해, 에탄올을 6주 동안 섭취한 랫드에 ATF3 siRNA를 정맥주사를 통해 전달을 하게 한 후 10주에서 랫드를 희생시키기 전에 먹이를 중단시킨 후 내당능 검사를 실시하였다. 내당능 검사는 실험예 2에서와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 7D에 나타낸 바와 같이, 에탄올 섭취를 한 랫드의 경우에 당분해 능력이 크게 감소되어 있는 반면에 ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서는 당분해 능력이 크게 향상됨을 확인하였다(도 7D).

<5-5> ATF3 siRNA 에 의한 췌장베타세포의 세포사멸 억제 효과 확인

알코올을 섭취한 랫드에서 ATF3 siRNA에 의한 췌장베타세포의 세포사멸을 확인하기 위하여, 에탄올을 6주 동안 섭취한 랫드에 ATF3 siRNA를 정맥주사를 통해 전달을 하게 한 후 10주에서 랫드를 희생시키기 전에 먹이를 중단시키고 상기 실험예 2와 동일동일한 방법으로 TUNEL 분석을 이용하여 췌장베타세포의 세포사멸을 조사하였다.

그 결과, 도 7E에 나타낸 바와 같이, 에탄올 섭취에 의해 증가되는 랫드의 췌장베타세포의 세포사멸은 ATF3 siRNA에 의해 억제됨을 확인하였다(도 7E).

<110> Korea Centers for Disease Control and Prevention <120> Novel siRNA suppressing ATF3 gene expression and use thereof <130> 14p-01-64 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-319-Sense <400> 1 caccuuugcc aucggaugut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-319-Antisense <400> 2 acauccgaug gcaaaggugt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-275-Sense <400> 3 caccuuuugu caaggaagat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-275-Antisense <400> 4 ucuuccuuga caaaaggugt t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-520-Sense <400> 5 ggagagugug aaugccgaat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-520-Antisense <400> 6 uucggcauuc acacucucct t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-651-Sense <400> 7 ggaagacgag aggaaccuut t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-651-Antisense <400> 8 aagguuccuc ucgucuucct t 21 <210> 9 <211> 1928 <212> RNA <213> rat <400> 9 ctcagcgaga cgcgcggtgc acggtgcttc cccggcggag ccgaccgacc aacccgcgct 60 ccggcagagt ccttggcgct cgcctgccgg cgggacagac agcccgcctc tagccgctct 120 ctggaccctg gccgccccga gcgaagactg gagcaaaatg atgcttcaac atccaggcca 180 ggtctctgcc tcagaagtca gcgcgaccgc catcgtcccc tgcctctcac ctcctgggtc 240 actggtgttt gaggattttg ctaacctgac accttttgtc aaggaagagc tgagattcgc 300 catccagaac aagcaccttt gccatcggat gtcctctgcg ctggagtcag tcaccatcaa 360 caacagacct ctggagatgt cagtcaccaa gtctgaggtg gcccctgaag aagatgagag 420 aaaaaggagg cggcgggaaa gaaacaaaat tgctgctgcc aagtgtcgaa acaagaaaaa 480 agagaagaca gagtgcctgc agaaggagtc agagaaactg gagagtgtga atgccgaact 540 gaaggcccag atcgaggagc tgaagaatga gaagcagcat ctgatttaca tgctcaacct 600 gcaccggccc acgtgtatcg tccgggctca gaacgggcgg acgccggaag acgagaggaa 660 cctttttatc caacagataa aagaaggaac attgcagagc taagcagagg tggcatgggg 720 gcaattgggg agtccttact gaatcctcct tttccacccc aaaccctgaa gccattggaa 780 aactggcttc ctgtgcactt ctagaatctc agcagccacg agctgttggg tcaggagggc 840 ctgcggtgac tactgcgttg tcccactctg tccccgagtg aaccgtggag caggcaggag 900 catcctttgt ctcaccggct ccaggattta ggccttacca tcccggccat tctcagatga 960 cctagctggc cccaggctgg ggtcccatgc aaagcaggat cgcactaatg ggatgcaggc 1020 agaagtgtct accttgacag gtggggtggg accacgtcct ccactgcggc tgacaacatc 1080 cctcctaggg aagatggagt gagaacattc atcattgaag ttgtccaatg gccagggtat 1140 gctttctaga aactatgctg ttctgtccta gactgactgt gcatagggca ttcatttctg 1200 agcctggtgt tgtgctattt agatgtttgt cttgcacaac attggcgtga tttttttccg 1260 ggagtttcat cagacctgat ttccgagagt ttgggggtct gccactgtgg acaatatccc 1320 ccaaaagtgt ttgggtggcc atgtaaactg gctgatgacc agctgtgcta ctctgtgctg 1380 accgaggact gatgcctcct tcccctgtac ccactgctga ggaagaaccc gggcacagca 1440 gctgtccttg gctacaaact gttacaatgt cacagaacga aggcacaaag tcccgctttc 1500 aaagggcgta ggactccaca ctcagtgaca gggcaggaag agccaaggat tctccgtttt 1560 cccttccttc ccaccaaaaa ccacagcccg tggagactgg tatttgaagc caggagtggg 1620 gcaaggaagg tgtctgcact gtgggatgtt aactgcgctt ttgtcttgaa gctattttga 1680 gatgcggtcc agagtatttc agctgggagg tccctcccac tggccaccag ggctctggct 1740 actgttaaaa ttctgatgtt tctgtgaaat cctcagtgtt caatccgact cagtagtata 1800 ttacagtttt ctgtaagaga gaacgttact tatttatccc agtattccta gcctgtcaac 1860 gtaataaaat atcagaatga gacctggtaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaa 1928 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-primer-F <400> 10 ctctagccgc tctctggacc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-primer-R <400> 11 cggcattcac actctccagt 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QIAGEN ATF3 siRNA-sense <400> 12 agucaguuac cgucaacaa 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QIAGEN ATF3 siRNA-antisense <400> 13 uuguugacgg uaacugacu 19

Claims (9)

1. ATF3(Activating transcription factor 3) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 센스 RNA 및 안티센스 RNA로 구성된 siRNA(small interacting RNA).
   
2. 제1항에 있어서, 상기 ATF3는 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 siRNA.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 센스 RNA는 서열번호 1 및 3으로 기재되는 센스 RNA인 것을 특징으로 하는 siRNA.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 RNA는 서열번호 2 및 4로 기재되는 안티센스 RNA인 것을 특징으로 하는 siRNA.
   
5. ATF3 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 센스 RNA 및 안티센스 RNA로 구성된 siRNA를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 센스 RNA는 서열번호 1 및 3으로 기재되는 센스 RNA인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 안티센스 RNA는 서열번호 2 및 4로 기재되는 안티센스 RNA인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 공복혈당 및 트리글리세리드(triglyceride)양을 감소시키고, 당분해 능력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 대사성 질환은 비만, 체중 감소, 당뇨병, 죽상경화증, 동맥경화증, 심혈관 질환, 신경 질환, 알츠하이머 질환, 인지 장애, 산화적 스트레스, 피부 질환, 피부 노화, UV 조사에 의한 손상, 고혈압, 고콜레스테롤혈증(LDL, HDL, VLDL), 고지혈증(트리글리세라이드), 면역 결핍, 암, 대사성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.

Images