WO2020046001A1 - 염증 및 대사성 질환의 바이오마커에 대한 결합능이 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

염증 및 대사성 질환의 바이오마커에 대한 결합능이 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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disease
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diseases
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박윤정
정종평
이주연
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주식회사 나이벡
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide capable of binding to biomarkers of inflammatory and metabolic diseases and their use, and more particularly to ATF3 binding capacity represented by any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-4.
  • the present invention relates to fusion peptides having peptides and peptides having cell permeability therein, and to the use of these peptides for the treatment of inflammatory diseases, metabolic diseases and / or autoimmune diseases.
  • Activating transcription factor 3 (ATF3) protein is a component of the transcriptional factor mammalian activation transcription factor / cAMP responsive element-binding (CREB) protein. It is known that expression is induced by a variety of signals represented by a variety of factors involved in development and is involved in the complex process of the intracellular stress response.
  • ATF3 protein acts as an activator or repressor of known target genes, with over 20 potential target genes of ATF3 known to date, including AdipoR1, AdipoR2, bNIP3, Cdc25A , CCL2, CCL4, Cyclin D1, FN-1, GLUT4, HIF-2 ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, IL-12b, IRS2, MMP1, MMP13, Noxa, p15PAF, Slug, Snail, STAT1, TNF- ⁇ , TWIST1, p53, p73, PDX-1, adiponectin and the like are known to be included.
  • NF- ⁇ B JNK in most cells including fibroblasts or epithelial cells, as well as immune cells such as macrophage, mast cells, T cells, dendritic cells, etc.
  • Various pathways such as, Erk, p38 and PKC induce ATF3, and induced ATF3 regulates transcription of various genes, resulting in apoptosis, cell proliferation, cell motility, DNA repair (DNA) It is known to be involved in repair and metabolism, among which NF- ⁇ B is also involved in inducing related inflammatory responses.
  • ATF3 protein is present in inflammatory diseases (Lai PF et al., Evid Based Complement Alternat Med. 2013; 2013: 716481.), obesity (Jang MK et al., Biochem Biophys Res Commun. 2013 Feb 15; 431 (3) Metabolism, autoimmune diseases such as diabetes (KR 10-1652957), cardiovascular disease (Zhou H. et al., Basic Res Cardiol. 2018 Aug 9; 113 (5): 37.) CK et al., Ann Rheum Dis 76 (2017) 602-611, Zheng S. et al., Mol Cell Biol, 33 (2013), 4857-4871).
  • a substance that modulates the expression or function of can inhibit the inflammatory response induced by ATF3, but until now, no effective inhibitor for ATF3 protein has been developed.
  • the present inventors have made efforts to solve the problems of the prior art, as a result of the development of a peptide that binds to ATF3, inhibits the expression of ATF3, and inhibits the signaling pathway by ATF3 and a pharmaceutical composition comprising the same, inducing inflammation.
  • the present invention has been completed by confirming that the production of inflammatory cytokine is reduced.
  • the present invention provides a peptide represented by any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 4, and having the ability to bind to ATF3 protein.
  • the present invention also provides a fusion peptide in which a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is additionally bound to the N or C terminus of the peptide.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating inflammatory disease, metabolic disease, autoimmune disease and / or fibrotic disease comprising the peptide or the fusion peptide as an active ingredient.
  • the invention also provides the use of the peptide, the fusion peptide or the composition for the treatment of inflammatory diseases, metabolic diseases, autoimmune diseases and / or fibrotic diseases.
  • the invention also provides the use of said peptide, said fusion peptide or said composition for the manufacture of a medicament for the treatment of inflammatory disease, metabolic disease, autoimmune disease and / or fibrotic disease.
  • the present invention also provides a method of treating an inflammatory disease, metabolic disease, autoimmune disease, and / or fibrotic disease, comprising administering the peptide, the fusion peptide, or the composition to an individual in need thereof. And / or methods of preventing and / or treating fibrotic diseases.
  • Figure 2 is the result of confirming the amount of ATF3 protein according to the peptide treatment of SEQ ID NOS: 1 to 4 by Western blot.
  • Figure 3 is a confocal micrograph observing the degree of cell permeation of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 peptide.
  • Figure 5a shows the inflammation and fat reduction in liver tissue according to the treatment of SEQ ID NO: 1 peptide in non-alcoholic steatohepatitis animal model. The result was confirmed by staining.
  • Figure 5b is a result confirmed by sirius red staining effect of reducing the fibrosis in liver tissue according to the SEQ ID NO: 1 peptide treatment in the non-alcoholic steatohepatitis animal model.
  • Figure 5c is a result confirmed by Masson trichrome staining effect of reducing the fibrosis in liver tissue according to the SEQ ID NO: 1 peptide treatment in the non-alcoholic steatohepatitis animal model.
  • Figure 5d is a NAS score results for each group according to the administration of SEQ ID NO: 1 peptide in the non-alcoholic steatohepatitis animal model.
  • Figure 6 shows the results of H & E staining of the colon intestinal villi after treatment with the SEQ ID NO: 1 peptide in animal models of inflammatory bowel disease.
  • the phage display method was used to find peptide sequences having ATF3 binding ability, which is a biomarker for inflammatory and metabolic diseases, and confirmed that they showed ATF3 binding ability in a concentration-dependent manner.
  • the present invention relates to a peptide capable of binding to ATF3 protein in one aspect.
  • the peptide may be represented by any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • SEQ ID NO: 1 (ABP1): AESPLTNRGWNP
  • SEQ ID NO: 3 (ABP3): TLGLRPVPVATT
  • SEQ ID NO: 4 (ABP4): VLNIPEHFTAQN
  • the peptide having the ability to bind to the ATF protein is not only represented by any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4, but has 60% or more homology thereto or 70% or more homology thereto.
  • the peptide affects a desired structure or function.
  • the cell permeability of the peptides of SEQ ID NOS: 1 to 4 is not great, but the cell permeability is improved in the peptides of SEQ ID NOs: 6 to 9 bound to the peptide of SEQ ID NO: 5 having cell permeability. It was.
  • the present invention relates to a fusion peptide which, in another aspect, has ATF 3 binding ability and further has cell permeability.
  • the fusion peptide may be characterized in that a peptide having cell permeability is coupled to the peptide of SEQ ID NO: 1 to 4, the peptide having a cell permeability is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 11 It may be characterized in that the peptide represented by.
  • the peptide having cell permeability is not only represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 11, but has a homology of 60% or more, 70% or more of homology thereto, At least 80% homology, at least 90% homology, or at least 95% homology, for example, in the amino acid sequence of the peptide of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO:
  • the substitution of some amino acids e.g., 1 to 5 amino acids
  • other amino acids or addition or deletion of some (e.g., 1 to 5 amino acids) of amino acids to the desired structure or function If there is no effect, or if it exhibits a favorable effect on the stability of the peptide, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11
  • the amino acid sequence of may be appropriately substituted to achieve the object of the present invention.
  • the fusion peptide may be characterized in that represented by any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6 to 9.
  • SEQ ID NO: 5 (hBD-3-3): GKCSTRGRKCCRRKK
  • SEQ ID NO: 6 (ABP1-hBD3-3): AESPLTNRGWNPGKCSTRGRKCCRRKK
  • SEQ ID NO: 7 (ABP2-hBD3-3): MLDTNIQSRPNLGKCSTRGRKCCRRKK
  • SEQ ID NO: 8 (ABP3-hBD3-3): TLGLRPVPVATTGKCSTRGRKCCRRKK
  • SEQ ID NO: 9 (ABP4-hBD3-3): VLNIPEHFTAQNGKCSTRGRKCCRRKK
  • SEQ ID NO: 10 (LMWP): VSRRRRRRGGRRRR
  • the fusion peptide may be synthesized by linking the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 to the C terminal of the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4, SEQ ID NO: 1 to The peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 may be synthesized by linking the N terminal of the peptide represented by the amino acid sequence of 4.
  • the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 may be linked by a linker with the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11.
  • the linker may be used as a linker as long as it can provide space for each peptide to form a functional structure, for example, the linker may be a peptidic linker of natural and / or synthetic origin.
  • Peptide linkers of natural and / or synthetic origin may consist of an amino acid chain consisting of 1 to 50 amino acids and may comprise a repeating amino acid sequence of a naturally occurring polypeptide, such as a polypeptide having a hinge function.
  • the peptidic linker amino acid sequence may be a synthetic linker amino acid sequence designated to be rich in glycine, glutamine, and / or serine residues. These residues may, for example, be arranged in small repeat units of up to 5 amino acids and the small repeat units may be repeated to form a multimer unit. At the amino- and / or carboxy terminus of the multimer unit, up to six additional optional naturally occurring amino acids may be added. Other synthetic peptidic linkers may be a single amino acid construct repeated 10-20 times and may be up to six additional optional naturally occurring amino acids at the amino- and / or carboxy-terminus.
  • the linker may be a chemically modified form of amino acids, for example, Fmoc-6-aminohexanoic acid (Fmoc- ⁇ -Acp-OH) in which Fmoc- (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) is bound as a blocking group. It may be used in the form of, but is not limited thereto.
  • the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 4 may be cell permeable, but the cell permeability was not high. However, since the ATF3 protein is present in the cell, when linking the peptide of SEQ ID NO: 5 with cell permeability, the cell permeability of the peptide of SEQ ID NO: 1 to 4 is increased, so that it can bind more to the ATF3 protein in the cell, Thus, the effect on ATF3 can be enhanced.
  • ATF3 is known to be an important factor in inflammatory diseases, metabolic diseases, autoimmune diseases and fibrotic diseases.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating an inflammatory disease comprising the peptide or the fusion peptide as an active ingredient in another aspect.
  • the inflammatory disease may be at least one selected from the group consisting of arthritis, periodontitis, atopy, thyroiditis, uveitis, Hashimoto's thyroiditis, gastritis, fatty liver, hepatitis and enteritis, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating metabolic disease comprising the peptide or the fusion peptide as an active ingredient in another aspect.
  • the metabolic disease is obesity, weight loss, diabetes, atherosclerosis, arteriosclerosis, cardiovascular disease, neurological disease, Alzheimer's disease, cognitive disorders, oxidative stress, skin disease, skin aging, damage by UV irradiation, hypertension , Hypercholesterolemia, hyperlipidemia, immune deficiency, cancer and metabolic syndrome may be characterized in that at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the hypercholesterolemia refers to a disease of a symptom in which the concentration of LDL, HDL, and / or VLDL in the blood is higher than a normal value, and hyperlipidemia is a high concentration of triglycerides compared to a normal value. Means a disease of symptoms.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating autoimmune disease comprising the peptide or the fusion peptide as an active ingredient in another aspect.
  • the autoimmune disease is insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, autoimmune encephalomyelitis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, myasthenia gravis, thyroiditis, uveitis, Hashimoto thyroiditis, thyroidism, pernicious anemia, autoimmune atrophy gastritis, autoimmune atrophy Immune hemolytic anemia, idiopathic leukocyte reduction, primary cholangiovascular sclerosis, alcoholic / nonalcoholic steatohepatitis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ulcerative bowel disease, psoriasis, Sjogren's syndrome, scleroderma, Wegener's granulomatosis, polymyositis, dermatitis, discoid LE and systemic lupus erythematosus may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating fibrotic disease, comprising the peptide or the fusion peptide as an active ingredient in another aspect.
  • the fibrotic disease may be characterized in that at least one selected from the group consisting of keloids caused by liver cirrhosis, pulmonary fibrosis, obstructive pulmonary disease, heart failure, arteriosclerosis, chronic kidney failure, diabetes mellitus and postoperative sequelae due to fibrosis, It is not limited to this.
  • the present invention relates to the use of the peptide, the fusion peptide or the composition for the treatment of inflammatory disease.
  • the present invention relates to the use of said peptide, said fusion peptide or said composition for the treatment of metabolic disease.
  • the present invention relates to the use of the peptide, the fusion peptide or the composition for the treatment of autoimmune disease.
  • the present invention relates to the use of the peptide, the fusion peptide or the composition for the treatment of fibrotic disease.
  • the present invention relates to the use of said peptide, said fusion peptide or said composition for the manufacture of a medicament for the treatment of an inflammatory disease.
  • the present invention relates to the use of said peptide, said fusion peptide or said composition for the manufacture of a medicament for the treatment of metabolic diseases.
  • the present invention relates to the use of said peptide, said fusion peptide or said composition for the manufacture of a medicament for the treatment of autoimmune disease.
  • the present invention relates to the use of said peptide, said fusion peptide or said composition for the manufacture of a medicament for the treatment of fibrotic disease.
  • the present invention relates to a method for preventing and treating an inflammatory disease comprising administering the peptide, the fusion peptide, or the composition to a subject in need thereof.
  • the present invention relates to a method for preventing and treating metabolic diseases comprising administering the peptide, the fusion peptide, or the composition to a subject in need thereof.
  • the present invention relates to a method for preventing and treating autoimmune disease, comprising administering the peptide, the fusion peptide, or the composition to a subject in need thereof.
  • the present invention relates to a method for preventing and treating fibrotic disease, comprising administering the peptide, the fusion peptide, or the composition to a subject in need thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the peptide.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, as antioxidants, buffers And other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • composition of the present invention is formulated into any one formulation selected from the group consisting of injections, oral formulations, patches, solutions, capsules, granules, tablets, powders, sprays, ointments, gels, mucosal administrations and suppositories. It may be, but is not limited thereto. These formulations may be prepared by conventional methods used in the art for formulation or by methods disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA and formulated into various formulations depending on the individual disease or component. Can be.
  • the therapeutic pharmaceutical composition may be formulated to further contain a pharmaceutically acceptable adjuvant, wherein the pharmaceutically acceptable adjuvant is an excipient, diluent, buffer, antimicrobial preservative, surfactant, antioxidant, thickener and viscosity modifier.
  • a pharmaceutically acceptable adjuvant is an excipient, diluent, buffer, antimicrobial preservative, surfactant, antioxidant, thickener and viscosity modifier.
  • the pharmaceutically acceptable adjuvant is an excipient, diluent, buffer, antimicrobial preservative, surfactant, antioxidant, thickener and viscosity modifier.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is based on the weight, age, sex and health of the patient. The range varies depending on the diet, the time of administration, the method of administration, the rate of excretion and the severity of the disease.
  • the daily dosage of the peptides is about 1 to 100 mg / kg, preferably 5 to 50 mg / kg and may be administered once a day or divided into 2-3 times a week, but is not limited thereto.
  • the dosage regimen and dosage will vary depending on the age, weight and response of the individual patient. Appropriate dosage regimens and dosages can be readily selected by those of ordinary skill in the art that naturally consider such factors.
  • Example 1-1 Peptide Sequence Discovery with ATF3 Ability Using Phage Display
  • Phage display was used to discover specific peptide sequences that bind to ATF3. After attaching M13 phages labeled with a highly diverse and complex random peptide library to a polystyrene plate well coated with ATF3 protein, unbound phages were washed and bound. However, the recovery was repeated several times. Subsequent panning was applied to the finally labeled phage-labeled peptides to sequence DNAs encoding them to find peptide sequences with ATF3 binding ability. Subtractive panning is a new phage display technique that can be used to discover sequences that bind to certain substances but not other substances.
  • Phage display kit was purchased by using Ph.D.-12 Phage Display Kit of New England Biolabs (USA), and the final 17 excavated using labeled phages with random peptide library consisting of 12 amino acids provided in the kit. Dog clones were sequenced by requesting Cosmojintech Co., Ltd. in the form of E. coli culture.
  • SEQ ID NO: 1 (ABP1, AESPLTNRGWNP), SEQ ID NO: 2 (ABP2 (MLDTNIQSRPNL), SEQ ID NO: 3 (ABP3, TLGLRPVPVATT), SEQ ID NO: 4 (ABP3, VLNIPEHFTAQN).
  • the peptide sequence is likely to be a specific sequence that binds to ATF3, and therefore, specific to bind to ATF3.
  • the peptide sequence was selected as a candidate for the peptide sequence.
  • Peptides of SEQ ID NOS: 1 to 4 in sequence from the N terminus were synthesized by F-moc solid phase peptide synthesis.
  • the synthesized peptide sequences were cleaved from the resin, washed, lyophilized and separated and purified by liquid chromatography. Purified peptides were checked for molecular weight using MALDI-TOF analysis.
  • Biotin was labeled on the peptides of Examples 1-2 to confirm binding affinity with the ATF3 protein.
  • Each peptide was biotinylated using EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce Biotechnology, USA) according to the manufacturer's test method, and bound through ultrafiltration, a membrane separation method using pressure difference as a driving force. By-products were removed. Then, the molecular weight of the synthesis result was confirmed by measuring the molecular weight by mass spectrometry. Analysis and purification were performed using analytical reverse phase liquid chromatography.
  • the binding affinity of the peptide having ATF3 binding ability to the ATF3 protein was measured by an Avidin-Biotin Complex binding assay.
  • Each well of a 96-well polystyrene plate was coated with ATF3 protein at a concentration of 0.02 ⁇ g / ⁇ l for 16 hours, followed by blocking solution (0.1 M NaHCO 3 (pH 8.6), 5 mg / ml BSA, 0.02 After blocking for at least 1 hour with% NaN 3 (optional), filter sterilize), the blocking solution was discarded and washed 6 times with washing solution (TBS + 0.1% [v / v] Tween-20).
  • the solution was washed 6 times or more with appropriate washing solution, and then 150 ⁇ l of substrate solution (2,2'-AZINO-BIS, Cat. # A3219, Sigma-Aldrich, USA) was added to the well. Dispensing was carried out for 20 minutes at room temperature. After 20 minutes, 50 ⁇ l of 1% SDS solution was treated to stop the reaction and the absorbance was measured at 405 nm.
  • substrate solution (2,2'-AZINO-BIS, Cat. # A3219, Sigma-Aldrich, USA
  • Peptides of SEQ ID NO: 6-9 were synthesized by F-moc solid phase peptide synthesis by linking the peptide of SEQ ID NO: 5 to the C terminus of the peptides of SEQ ID NOS: 1-4 having the ability to bind to ATF3 protein.
  • the synthesized peptide sequences were cleaved from the resin, washed, lyophilized and separated and purified by liquid chromatography. Purified peptides were checked for molecular weight using MALDI-TOF analysis.
  • Methionine-Choline Deficient (MCD) feeds were fed to C57BL / 6J mice for 8 weeks to induce a non-alcoholic fatty liver model.
  • Drinking water in which 5% DSS was dissolved in ICR mice was used to confirm the therapeutic effect by simultaneously administering peptides while inducing inflammatory bowel disease for 10 days.
  • Proteins were lysed using RIPA lysis buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS) containing protease and phosphatase inhibitors. Proteins were quantified by BCA protein assay and the expression levels of ATF3 and tubulin proteins were confirmed by western blot. In the case of Western blot, the sample was loaded in an 8% SDS PAGE gel with the size marker in the same amount and electrophoresed for about 2 hours, and then transferred to the nitrocellulose membrane. The transferred membrane was blocked with 5% skim milk for 1 hour and reacted with 1st antibody overnight at 1: 1000 ratio. Thereafter, the membrane was washed with TBST containing 0.1% tween-20, and reacted with HRP-attached 2nd antibody for 1 hour, and then chemiluminescence was confirmed by ECL substrate.
  • RIPA lysis buffer 25 mM Tris-HCl pH 7.6,
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 was found to be partially transmitted because the weak red fluorescence was observed in the cell
  • the peptide of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 is SEQ ID NO: More fluorescence was observed in the cells than in the peptide of 1 to confirm that the cell permeability was high.
  • HepG2 cells were plated at 70% density on a 6-well plate, followed by cell starvation for 2 hours with DMEM medium containing 0.5% FBS after 16 hours. After treatment with a medium containing 200 ⁇ M each of the peptides of SEQ ID NOs 1 to 2 for 2 hours, palmitic acid was treated with 200 ⁇ M to induce an inflammatory response for 24 hours. Each medium was collected and the expression level of the inflammatory cytokine IL-6 was confirmed by ELISA kit (R & D, Minneapolis, MN, USA).
  • MCD mouse model was used to determine whether the peptide is effective in treating hepatitis at the animal level according to the present invention.
  • Male C57BL / 6J mice were used, and a normal diet, MCD diet, SEQ ID No. 1 peptide low dose (20 mg / kg) and high dose (80 mg / kg) were injected.
  • peptides were administered in parallel, once daily, and 12 times at 3 day intervals.
  • Body weights for all animals were measured immediately prior to initiation of administration and measured twice weekly throughout the entire trial. After the end of the last administration, the subjects underwent respiratory anesthesia with isoflurane to collect blood from the posterior jugular vein, followed by euthanasia.
  • NAS Score is a measure of ballooning degeneration, lobular inflammation, and steatosis. NAS score was also reduced by more than 50% in the peptide-treated group was confirmed that the non-alcoholic fatty liver was improved (Fig. 5d).
  • the DSS-induced group was observed a lot of inflammatory cells, the villi were damaged a lot.
  • the inflammatory cells were reduced and the villi were preserved without damage.
  • the present invention provides a novel peptide having ATF3 binding ability, a protein that acts as an important factor in the development of various inflammatory diseases, metabolic diseases, autoimmune diseases and / or fibrotic diseases, thereby controlling intracellular concentration of ATF3, It can be used for the treatment of diseases, metabolic diseases, autoimmune diseases and / or fibrotic diseases, and by further fusion of the peptides having intracellular permeability and inflammation inhibitory function to the peptides can enhance the disease treatment effect.

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 4로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 ATF3 결합능을 가지고 있는 펩타이드 및 이에 세포투과능이 있는 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드 및 이들 펩타이드의 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환의 치료 용도에 관한 것이다. 본 발명에서는, 다양한 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환의 발병에 중요한 요인 및 바이오마커로 작용하는 단백질인 ATF3 결합능을 가지는 신규한 펩타이드를 제공함으로써, ATF3의 세포내 농도를 조절하여, 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환의 치료 용도로 활용할 수 있으며, 상기 펩타이드에 세포 내 투과능과 염증 억제 기능을 갖는 펩타이드를 추가로 융합시킴으로써 질환 치료 효과를 상승시킬 수 있다.

Description

염증 및 대사성 질환의 바이오마커에 대한 결합능이 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도
본 발명은 염증 및 대사성 질환의 바이오마커에 결합능이 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 서열번호 1 내지 4로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 ATF3 결합능을 가지고 있는 펩타이드와 이에 세포 투과능이 있는 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드 및 이들 펩타이드의 염증성 질환, 대사성 질환 및/또는 자가면역 질환의 치료 용도에 관한 것이다.
ATF3(Activating transcription factor 3) 단백질은 전사인자의 포유동물 활성전사조절인자/cAMP 반응요소-결합 단백질(mammalian activation transcription factor/cAMP responsive element-binding(CREB)protein)의 구성성분으로, ATF3 유전자는 암 발생에 관여하는 여러 요인들에 의해 나타나는 다양한 신호들에 의해 발현이 유도되며, 세포내 스트레스 반응의 복잡한 과정에 연관되어 있는 것으로 알려져 왔다.
ATF3 단백질은 알려진 표적 유전자들의 활성인자(activator) 또는 억제제(repressor)로서 역할을 하고, 현재까지 문헌적으로 알려져 있는 ATF3의 잠재적 표적 유전자들은 20여 개가 넘으며, 여기에는 AdipoR1, AdipoR2, bNIP3, Cdc25A, CCL2, CCL4, Cyclin D1, FN-1, GLUT4, HIF-2α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-12b, IRS2, MMP1, MMP13, Noxa, p15PAF, Slug, Snail, STAT1, TNF-α, TWIST1, p53, p73, PDX-1, 아디포넥틴(adiponectin) 등이 포함되는 것으로 알려져 있다.
또한, 대식세포(macrophage), 비만세포(mast cell), T 세포(T cell), 수지상 세포(dendritic cell) 등의 면역세포에서뿐만 아니라 섬유아세포나 상피세포를 비롯한 대부분의 세포에서 NF-κB, JNK, Erk, p38, PKC 등 다양한 경로가 ATF3를 유도하고, 유도된 ATF3는 다양한 유전자들의 전사를 조절하여 세포사멸(apoptosis), 세포성장(cell proliferation), 세포이동(cell motility), DNA 수선(DNA repair), 대사(metabolism)에 관여하며, 그 중에 NF-κB가 관계된 염증반응 유도에도 연관성이 있다고 알려져 있다.
현재 ATF3 단백질의 발현은 염증성 질환(Lai PF et al., Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:716481.), 비만(Jang MK et al., Biochem Biophys Res Commun. 2013 Feb 15;431(3):421-7.), 당뇨병(KR 10-1652957) 심혈관 질환(Zhou H. et al., Basic Res Cardiol. 2018 Aug 9;113(5):37.)과 같은 대사질환, 자가면역질환(Smith CK et al., Ann Rheum Dis 76 (2017) 602-611, Zheng S. et al., Mol Cell Biol, 33 (2013), 4857-4871)과의 연관성에 대한 많은 연구가 진행되고 있고, ATF3 단백질의 발현 또는 기능을 조절하는 물질에 의해, ATF3에 의해 유도되는 염증반응을 억제할 수 있을 것이나, 현재까지는 ATF3 단백질에 대한 효과적인 저해제가 개발되지는 않고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, ATF3에 결합하여 ATF3의 발현을 억제하고, ATF3에 의한 신호전달 경로를 저해하는 펩타이드와 이를 포함하는 약제학적 조성물을 개발하여 염증유발 사이토카인 (inflammatory cytokine)의 생성을 감소시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 염증 및 대사성 질환의 바이오마커인 ATF3 단백질에 결합할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이들의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되고, ATF3 단백질에 결합능이 있는 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드가 추가로 결합되어 있는 융합 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물의 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환 치료를 위한 약물의 제조를 위한 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물을 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환 치료가 필요한 객체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환의 예방 및/또는 치료방법을 제공한다.
도 1은 서열번호 1 내지 4의 펩타이드가 ATF3 단백질에 농도 의존적으로 결합함을 확인한 결과이다.
도 2는 서열번호 1 내지 4의 펩타이드 처리에 따른 ATF3 단백질 양을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 3은 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 6 펩타이드의 세포투과 정도를 관찰한 공초첨 현미경 사진이다.
도 4는 서열번호 1 내지 6의 펩타이드 처리에 따른 IL-6의 발현량을 ELISA로 로 확인한 결과이다.
도 5a는 비알콜성 지방간염 동물모델에서 서열번호 1 펩타이드 처리에 따른 간조직내 염증과 지방 감소를 H.E. 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 5b는 비알콜성 지방간염 동물모델에서 서열번호 1 펩타이드 처리에 따른 간조직내 섬유화 감소 효과를 Sirius red 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 5c는 비알콜성 지방간염 동물모델에서 서열번호 1 펩타이드 처리에 따른 간조직내 섬유화 감소효과를 Masson trichrome 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 5d는 비알콜성 지방간염 동물모델에서 서열번호 1 펩타이드 투여에 따른 군 별 NAS score 결과이다.
도 6는 염증성 장질환 동물모델에서 서열번호 1 펩타이드 처리 후, 대장내 융모를 H&E 염색하여 확인한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 파지 디스플레이 방법을 이용하여 염증 및 대사성 질환의 바이오마커인 ATF3 결합능을 가지는 펩타이드 서열을 발굴하고, 이들이 농도 의존적으로 ATF3 결합능을 보이는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 ATF3 단백질에 결합능이 있는 펩타이드에 관한 것이다.
상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
서열번호 1 (ABP1): AESPLTNRGWNP
서열번호 2 (ABP2: MLDTNIQSRPNL
서열번호 3 (ABP3): TLGLRPVPVATT
서열번호 4 (ABP4): VLNIPEHFTAQN
본 발명에서 ATF 단백질에 결합능이 있는 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 경우 뿐만 아니라, 이와 60% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 70% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 80% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 90% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 95% 이상의 상동성을 가지고 있을 수 있으며, 예를 들어 서열번호 1 내지 4의 펩타이드의 아미노산 서열 중 일부 아미노산(예를 들어, 1 내지 5개의 아미노산)을 다른 아미노산으로 치환하거나, 아미노산을 일부(예를 들어, 1 내지 5개의 아미노산을) 추가 또는 결손시킨 경우로, 이로 인하여 상기 펩타이드가 목적하는 구조 또는 기능에 영향이 없는 경우 내지는 상기 펩타이드의 안정성 등에 유리한 효과를 발휘하는 경우라면 서열번호 1 내지 4로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 적절히 대체하여 본 발명의 목적을 달성하기 위해 사용할 수 있음은 당업자가에 자명하다.
본 발명에서는 또한, 상기 서열번호 1 내지 4의 펩타이드의 세포 투과성이 크지 않으나, 이에 세포투과능을 가지고 있는 서열번호 5의 펩타이드를 결합시킨 서열번호 6 내지 9의 펩타이드에서 세포 투과성이 향상되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 ATF 3 결합능을 가지며 세포 투과능도 추가로 가지고 있는 융합 펩타이드에 관한 것이다.
상기 융합 펩타이드는 서열번호 1 내지 4의 펩타이드에 세포투과능이 있는 펩타이드가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 세포투과능이 있는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 10, 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 세포 투과능이 있는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 10, 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경우 뿐만 아니라, 이와 60% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 70% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 80% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 90% 이상의 상동성을 가지고 있거나, 95% 이상의 상동성을 가지고 있을 수 있으며, 예를 들어 서열번호 5, 서열번호 10, 또는 서열번호 11의 펩타이드의 아미노산 서열 중 일부 아미노산(예를 들어, 1 내지 5개의 아미노산)을 다른 아미노산으로 치환하거나, 아미노산을 일부((예를 들어, 1 내지 5개의 아미노산을) 추가 또는 결손하여도 상기 펩타이드가 목적하는 구조 또는 기능에 영향이 없는 경우 내지는 상기 펩타이드의 안정성 등에 유리한 효과를 발휘하는 경우라면 서열번호 5, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 적절히 대체하여 본 발명의 목적을 달성하기 위해 사용할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
한편, 상기 융합 펩타이드는 서열번호 6 내지 9로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
서열번호 5 (hBD-3-3): GKCSTRGRKCCRRKK
서열번호 6 (ABP1-hBD3-3): AESPLTNRGWNPGKCSTRGRKCCRRKK
서열번호 7 (ABP2-hBD3-3): MLDTNIQSRPNLGKCSTRGRKCCRRKK
서열번호 8 (ABP3-hBD3-3): TLGLRPVPVATTGKCSTRGRKCCRRKK
서열번호 9 (ABP4-hBD3-3): VLNIPEHFTAQNGKCSTRGRKCCRRKK
서열번호 10 (LMWP): VSRRRRRRGGRRRR
서열번호 11 (H4): HRRCNKNNKKR
상기 융합 펩타이드는 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드의 C 말단에 서열번호 5, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 연결하여 합성할 수 있으며, 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드의 N 말단에 서열번호 5, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 연결하여 합성할 수도 있다.
또한, 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드와 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 링커는 각 펩타이드가 기능적 구조를 형성할 수 있도록 공간을 부여할 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 링커로 활용할 수 있으며, 예를 들어, 상기 링커는 천연 및/또는 합성 기원의 펩타이드성 링커일 수 있다. 천연 및 또는 합성 기원의 펩타이드성 링커는 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 사슬로 이루어질 수 있고, 경첩 기능을 갖는 폴리펩타이드와 같이 천연 발생 폴리펩타이드의 반복적인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 펩타이드성 링커 아미노산 서열은 글리신, 글루타민, 및/또는 세린 잔기가 풍부하도록 지정된 합성 링커 아미노산 서열일 수 있다. 이들 잔기는 예를 들어 5개 이하의 아미노산의 작은 반복 단위로 배열될 수 있고 상기 작은 반복 단위는 멀티머 단위를 형성하도록 반복되어 배열 될 수 있다. 멀티머 단위의 아미노- 및/또는 카르복시 말단에서, 6개 이하의 추가의 임의의 천연 발생 아미노산이 첨가될 수 있다. 기타 합성 펩타이드성 링커는 10 내지 20회 반복되는 단일 아미노산 구성일 수 있고, 아미노- 및/또는 카르복시-말단에 6개 이하의 추가 임의의 천연 발생 아미노산일 수 있다. 한편, 상기 링커는 아미노산이 화학적으로 변형된 형태일 수 있으며, 예컨데, 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Fmoc-6-aminohexanoic acid (Fmoc-ε-Acp-OH)의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 1 내지 4의 펩타이드의 경우, 그 일부가 세포투과될 수 있으나 세포 투과능이 많이 높지는 않은 것으로 나타났다. 그러나, ATF3 단백질은 세포 내에 존재하기 때문에, 세포투과능이 있는 서열번호 5의 펩타이드를 연결하는 경우, 서열번호 1 내지 4의 펩타이드의 세포투과능이 증가하여 세포 내의 ATF3 단백질에 더 많이 결합할 수 있고, 따라서 ATF3에 작용하는 효과를 상승시킬 수 있다.
ATF3는 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환, 섬유화 질환에 중요한 인자로 알려져 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 염증성 질환은 관절염, 치주염, 아토피, 갑상선염, 포도막염, 하시모토 갑상선염, 위염, 지방간염, 간염 및 장염으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 대사성 질환은 비만, 체중 감소, 당뇨병, 죽상경화증, 동맥경화증, 심혈관 질환, 신경 질환, 알츠하이머 질환, 인지 장애, 산화적 스트레스, 피부 질환, 피부 노화, UV 조사에 의한 손상, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 면역 결핍, 암 및 대사성 증후군으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 상기 고콜레스테롤혈증은 혈중 LDL, HDL 및/또는 VLDL의 농도가 정상치에 비해 높은 농도로 포함되어 있는 증상의 질환을 의미하고, 고지혈증은 트리글리세라이드의 농도가 정상치에 비해 높은 농도로 포함되어 있는 증상의 질환을 의미한다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 자가면역 질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 중증 근무력증, 갑상선 염, 포도막염, 하시모토 갑상선염, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 알코올성/비알코올성 지방간염, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 장질환, 건선, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염, 피부근육염, 원판상 LE 및 전신 홍반 루푸스로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 섬유화 질환은 섬유화에 의한 간경화, 폐섬유증, 폐쇄성 폐질환, 심부전, 동맥경화, 만성신부전, 당뇨병 및 수술후 후유증으로 발생하는 켈로이드로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물의 염증성 질환 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물의 대사성 질환 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물의 자가면역 질환 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물의 섬유화 질환 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 염증성 질환 치료를 위한 약물의 제조를 위한 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 대사성 질환 치료를 위한 약물의 제조를 위한 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 자가면역 질환 치료를 위한 약물의 제조를 위한 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 섬유화 질환 치료를 위한 약물의 제조를 위한 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물을 염증성 질환의 치료가 필요한 객체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물을 대사성 질환의 치료가 필요한 객체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 및 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물을 자가면역 질환의 치료가 필요한 객체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 질환의 예방 및 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드, 상기 융합 펩타이드 또는 상기 조성물을 섬유화 질환의 치료가 필요한 객체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유화 질환의 예방 및 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 펩타이드 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 1 종 이상 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 주사제, 경구투여용 제제, 패치제, 액제, 캡슐, 과립, 정제, 산제, 분무제, 연고제, 겔제, 점막투여제제 및 좌제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이들 제제는 당분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다.
상기 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 보조제를 추가로 함유하도록 제제화 될 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용가능한 보조제는 부형제, 희석제, 완충제, 항균성 보존제, 계면활성제, 산화방지제, 증점제 및 점도개질제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 서열번호 1 내지 9의 펩타이드를 염증성 질환, 대사성 질환 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환의 치료 용도로 사용할 때, 상기 펩타이드의 일일 투여량은 약 1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 5 내지 50 ㎎/㎏ 이며, 일일 일회 또는 주 2-3회에 나누어 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이 경우, 투여 용법 및 투여 용량은 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 다양할 것이다. 적합한 투여 용법 및 투여 용량은 이러한 인자를 당연히 고려하는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 쉽게 선택될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: ATF3 단백질의 결합능을 가진 펩타이드의 발굴
실시예 1-1: 파지 디스플레이를 이용한 ATF3 결합능을 가진 펩타이드 서열 발굴
ATF3에 결합하는 특정한 펩타이드 서열을 발굴하기 위하여 파지 디스플레이 방법 (Phage display)을 이용하였다. 다양성과 복잡성이 높은 랜덤 펩타이드 라이브러리 (Random peptide library)가 표지된 M13 파지들을 ATF3 단백질로 코팅(coating)된 폴리스티렌 플레이트 (polystrene plate) 웰 (well)에 붙인 뒤, 결합하지 않은 파지는 씻어내고 결합한 파지만을 회수하는 것을 여러 번 반복하였고, Subtractive panning을 적용하여 최종적으로 얻은 파지에 표지된 펩타이드에 대하여 이를 코딩하는 DNA를 서열 분석하여 ATF3 결합능이 있는 펩타이드 서열을 발굴하였다. Subtractive panning은 특정 물질에는 결합하면서 그 외 다른 물질에는 결합하지 않는 서열을 발굴하고자 할 때 사용 가능한 새로운 파지 디스플레이 기법이다.
파지 디스플레이 키트는 New England Biolabs (USA)의 Ph.D.-12 Phage Display Kit를 구입하여 사용하였으며, 상기 키트에서 제공하는 12 개 아미노산으로 구성된 랜덤 펩타이드 라이브러리가 표지된 파지들을 이용하여 발굴한 최종 17 개 클론을 대장균 배양액 상태로 (주)코스모진텍에 의뢰하여 서열 분석하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 2 개의 클론이 동일한 DNA 서열을 나타내는 4개의 서열을 확인하였고 이를 번역하여 12 개 아미노산으로 구성된 최종 펩타이드의 서열로 서열번호 1 (ABP1, AESPLTNRGWNP), 서열번호 2 (ABP2 (MLDTNIQSRPNL), 서열번호 3 (ABP3, TLGLRPVPVATT), 서열번호 4 (ABP3, VLNIPEHFTAQN)를 얻을 수 있었다. 상기 펩타이드 서열은 ATF3에 결합하는 특이적 서열일 가능성이 높으므로, ATF3에 결합하는 특이적인 펩타이드 서열의 후보로 상기 펩타이드 서열을 선택하였다.
Figure PCTKR2019011036-appb-T000001
실시예 1-2: ATF3 결합능을 가진 펩타이드의 합성
N 말단으로부터 순서대로 서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 F-moc 고체상 화학합성방법(Solid phase peptide synthesis)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척하고, 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하였다. 정제된 펩타이드는 MALDI-TOF 분석을 이용하여 분자량을 확인하였다.
실시예 1-3: ATF3 결합능을 펩타이드의 ATF3 단백질과의 결합 친화성 (Binding affinity) 확인
ATF3 단백질과의 결합 친화성을 확인하기 위하여 실시예 1-2의 펩타이드에 비오틴을 표지하였다. 각각의 펩타이드에 제조사의 실험법에 따라 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce Biotechnology, USA)을 사용하여 비오틴화(Biotinylation) 하였으며, 압력차를 추진력으로 이용하는 막분리법인 한외여과(Ultrafiltration)를 통해 결합되지 않은 부산물을 제거하였다. 이후, Mass spectrometry로 분자량을 측정함으로써 합성 결과물의 분자량을 확인하였다. 분석과 정제는 분석용 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (reverse phase liquid chromatography)를 이용하였다. 직경 4.6mm의 C18 컬럼을 이용하여 유속 1ml/min으로 0.1% TFA/H2O 와 0.092% TFA/아세토 나이트릴 (acetonitrile)를 0~60%의 변화를 주면서 30분간 흘려주는 방법으로 분석하였으며, 이때 자외선 검출기의 파장은 220nm로 하였다. 정제는 직경 2.2cm의 컬럼을 이용하여 유속 20ml/min으로 용매와 검출파장을 같은 조건으로 실시하였다. 비오틴이 결합된 펩타이드만을 일부 취하여 진공 증발 농축기(rotary evaporator)를 이용하여 용매를 제거한 후 동결 건조하였다.
ATF3 결합능이 있는 펩타이드의 ATF3 단백질과의 결합 친화성을 아비딘-비오틴 복합체 (Avidin-Biotin Complex) 결합 어세이 (Binding assay)를 통해 측정하였다. 96-웰 (well) 폴리스티렌 플레이트 (polystyrene plate)의 각 well에 ATF3 단백질을 0.02 ㎍/㎕ 농도로 16시간 동안 코팅한 다음, 블로킹 용액 (0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3 (optional), filter sterilize)으로 최소 1 시간 이상 블록 (block) 한 뒤, 블로킹 용액을 버리고 워싱 용액 (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20) 으로 6회 이상 강하게 세척하였다. 이후 ATF3 단백질이 코팅된 웰 표면에 비오틴을 표지하여 합성, 분리, 정제한 ATF3 결합능이 있는 펩타이드인 서열번호 1 내지 4의 펩타이드(ABP1-4)를 10 uM 에서 100 uM 까지 농도별로 150 ㎕씩 분주하였다. 상온에서 2 시간 동안 반응시킨 뒤 각각에 알맞은 워싱 용액으로 6 회 이상 강하게 세척하고 ExtrAvidin-Peroxidase (Cat. #E2886, Sigma-Aldrich, USA) 를 블로킹 용액에 1 : 500 으로 희석하여 웰에 150 ㎕씩 분주하였다. 이를 상온에서 1 시간 반응시킨 뒤 각각에 적절한 워싱 용액으로 6 회 이상 강하게 세척한 뒤, 기질 용액 (2,2'-AZINO-BIS, Cat. #A3219, Sigma-Aldrich, USA) 을 웰에 150 ㎕ 분주하고 상온에서 20분 발색 반응하였다. 20분 뒤, 반응을 멈추기 위해 1 % SDS 용액을 50 ㎕씩 처리하고 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1-2의 ATF3 결합능이 있는 펩타이드를 처리하였을 때 농도 의존적으로 ATF3 단백질에 결합하는 경향을 확인하였다.
실시예 2: 세포투과능 및 ATF3 결합능이 있는 펩타이드
ATF3 단백질에 결합능이 있는 서열번호 1 내지 4의 펩타이드의 C말단에 서열번호 5의 펩타이드를 연결하여 서열번호 6-9의 펩타이드를 F-moc 고체상 화학합성방법(Solid phase peptide synthesis)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척하고, 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하였다. 정제된 펩타이드는 MALDI-TOF 분석을 이용하여 분자량을 확인하였다.
실시예 3: 비알콜성 지방간염 동물모델에서 펩타이드 효과 확인
C57BL/6J 마우스에 Methionine-Choline Deficient (MCD) 사료를 8주간 공급하여 비알콜성 지방간 모델을 유도시킨 후 서열번호 1 펩타이드를 용량별로 6주간 투여하여 나타나는 효력을 평가하였다.
실시예 4: 염증성 장질환 동물모델에서 펩타이드 효과 확인
ICR 마우스에 5% DSS를 녹인 식용수를 사용하여 10일동안 염증성 장질환 유도하면서 펩타이드를 동시에 투여하여 치료효과를 확인하였다.
실험예 1: ATF3 결합 펩타이드에 의한 간질환 마커인 ATF3 단백질의 발현 감소 효과 확인
웨스턴블럿을 실시하여 서열번호 1 내지 4의 펩타이드에 의한 ATF3 단백질의 발현의 변화를 확인하였다. 6-well plate 에 70%의 density로 HepG2 세포를 plating한 후 16시간 뒤에 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 2시간 동안 cell starvation 하였다. 서열번호 1 내지 4의 펩타이드 각각을 200μM 농도로 포함한 배지를 2시간 동안 처리한 후, 팔미트산(palmitic acid)을 200μM 농도로 처리하여 24시간 동안 염증 반응을 유도하였다. Protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를 포함한 RIPA lysis buffer (25 mM Tris·HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 사용하여 단백질을 lysis하였다. BCA protein assay를 통해 단백질을 정량하고, western blot 으로 ATF3, tubulin 단백질의 발현량을 확인하였다. Western blot의 경우, 8% SDS PAGE gel 에 size marker와 함께 sample을 동량 loading하여 약 2시간 전기영동한 후, nitrocellulose membrane에 transfer하였다. Transfer 한 membrane은 5% skim milk로 1시간 blocking하고, 1st antibody를 1:1000 비율로 하룻밤 동안 반응시켰다. 이 후 membrane을 0.1% tween-20을 포함한 TBST로 세척 하고 HRP가 부착된 2nd antibody로 1시간 반응시킨 후, ECL substrate로 화학발광을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 팔미트산을 단독으로 처리한 경우에는 간질환 마커인 ATF3 단백질의 발현이 증가하였으나, 서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 동시에 처리하였을 때, ATF3 단백질의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통해, 서열번호 1 내지 4의 펩타이드가 간질환 마커인 ATF3 단백질 발현을 억제하는 효과를 확인한 바, 서열번호 1 내지 4의 펩타이드가 간질환을 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 서열번호 5에 의한 ATF3 단백질의 결합력이 있는 펩타이드의 세포투과능 증가 확인
6웰(well)에 RAW 264.7 세포를 웰(well)당 2X104개씩 이식한 후, 24시간 뒤에 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 교체한다. 형광 (rhodamine)이 표지된 서열번호 1, 5, 6의 펩타이드를 각각 50μM 처리하고, 20분 후에 세포를 고정시킨 후, 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 서열번호 1의 펩타이드는 세포 내에서 약하게 붉은 색의 형광이 관찰된 것으로 보아 일부가 투과된 것을 알 수 있었고, 서열번호 5와 서열번호 6의 펩타이드는 서열 번호 1의 펩타이드보다 형광이 세포내에서 많이 관찰되어 세포 투과성이 높음을 확인할 수 있었다.
이는, 세포투과성이 낮은 서열번호 1의 펩타이드에 세포투과성이 높은 서열번호 5의 펩타이드를 결합시킴으로써 (즉, 서열번호 6) ATF3 단백질에 결합력이 있는 펩타이드의 세포내 투과능을 더 증가시켜 세포 안에서 그 효과를 증가시킬 수 있음을 의미한다.
실험예 3: ATF3 결합 펩타이드에 의한 IL-6의 발현 감소 효과 확인
6-well plate 에 70%의 density로 HepG2 세포를 plating한 후 16시간 뒤 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 2시간 동안 cell starvation 하였다. 서열번호 1 내지 6의 펩타이드 각각을 200μM 농도로 포함한 배지를 2시간 동안 처리한 후, 팔미트산(palmitic acid)을 200μM 농도로 처리하여 24시간 동안 염증 반응을 유도하였다. 각각의 배지를 수거하여 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현정도를 ELISA kit (R&D, Minneapolis, MN, USA)으로 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 팔미트산에 의해 증가된 IL-6의 발현량이 ATF3 결합 펩타이드에 의해 감소되었음을 확인할 수 있었다. 이는 ATF3 결합 펩타이드가 염증 유발 사이토카인의 생성을 감소시킴으로써 간질환 치료효과가 있다는 것을 증명하는 것이다. 또한, 서열번호 6은 IL-6의 발현량이 가장 감소한 것으로 보아, 서열번호 5의 세포투과능에 의해서 사이토카인의 발현억제 효과가 더욱 증가하였음을 알 수 있었다.
실험예 4: 비알콜성 지방간염 동물모델에서 펩타이드 효과 확인
본 발명에 따른 동물수준에서 펩타이드의 지방간염 치료 효과 있는지 확인하기 위하여, MCD 마우스 모델을 이용하였다. 수컷 C57BL/6J 마우스를 이용하였고, Normal diet, MCD diet, 서열번호 1 펩타이드 저용량(20mg/kg), 고용량(80mg/kg)을 주입하였다. 8주간 MCD 사료를 자율급이 한 후 펩타이드를 병행투여하였고, 1일 1회투여, 3일 간격으로 총 12회 투여하였다. 모든 동물에 대하여 체중은 투여 개시 직전에 측정하며, 전 시험에 걸쳐 매주 2회 측정하였다. 마지막 투여 종료 후 개체는 isoflurane으로 호흡마취 하에 후대정맥으로 혈액을 채취한 후, 방혈시켜 안락사를 수행하였다. 안락사 후, 외관의 육안적 관찰 및 복강, 흉강 내 장기의 육안적 특징을 관찰하였다. 부검을 실시한 모든 동물에 대하여 중성 완충 포르말린 용액에 조직을 고정하고, 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하고 박절하였다. 박절한 조직 절편에 HE staining (도 5a)과 Sirius red(도 5b), Masson trichrome(도 5c) 염색을 진행하여 간 조직 내 지방 축적 및 섬유화 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5a에서 관찰했을 때, MCD 다이어트를 유도한 군에서는 염증과 지방 입자의 수와 크기가 증가하였으나, 서열번호 1 펩타이드를 주입한 군에서는 염증 및 지방 입자의 수와 크기가 감소하였다. 도 5b와 도 5c에 나타난 바와 같이, MCD 다이어트를 유도한 군에서 섬유화(도 5b는 붉은색, 도 5c는 푸른색)가 크게 진행 되었고, 서열번호 1 펩타이드를 주입한 군에서는 섬유화가 크게 감소된 것을 확인할 수 있었다.
NAS Score는 Ballooning degeneration, Lobular inflammation, Steatosis의 합계를 측정한 것이다. NAS Score에서도 펩타이드를 처리한 군에서 50% 이상 감소하였기 때문에 비알콜성 지방간이 개선된 것을 확인할 수 있었다.(도 5d)
실험예 5: 염증성 장질환 동물모델에서 펩타이드 효과 확인
본 발명에 따른 동물수준의 염증성 장질환 모델에서 펩타이드에 의한 치료효과가 있는지 확인하였다. ICR 마우스를 사용하였고, 10일동안 5% DSS를 식용수로 사용하면서 염증 유발을 하는 동시에 펩타이드를 IP injection 통해 주입하였다. Normal, Defect, 양성대조군(SAHA), 면역조절대조군(anti-TNF-a antibody), 서열번호 1 펩타이드를 10일동안 매일 처리하였다. 10일 후, CO2 과호흡에 의한 희생 후, Colon 및 spleen 확보하여 Colon 길이 및 파라핀 제작을 통한 H&E 염색으로 장내 융모 손상여부 확인하였다 (도 6)
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, DSS 유도한 군은 염증세포가 많이 관찰되었고, 융모가 많이 손상되었다. 서열번호 1 펩타이드 처리군에서는 염증세포가 줄어들고 융모가 손상되지 않고 보존되어 있는 것을 확인 할 수 있었다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명은 종래 다양한 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환의 발병에 중요한 요인으로 작용하는 단백질인 ATF3 결합능을 가지는 신규한 펩타이드를 제공함으로써, ATF3의 세포내 농도를 조절하여, 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환 및/또는 섬유화 질환의 치료 용도로 활용할 수 있으며, 상기 펩타이드에 세포 내 투과능과 염증 억제 기능을 갖는 펩타이드를 추가로 융합시킴으로써 질환 치료 효과를 상승시킬 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (16)

  1. 서열번호 1 내지 4로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되고, ATF3 단백질에 결합능이 있는 펩타이드.
  2. 제1항의 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 세포투과능이 있는 펩타이드가 추가로 결합되어 있는 융합 펩타이드.
  3. 제2항 있어서, 상기 세포투과능이 있는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 10, 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 서열번호 6 내지 9로 구성된 군 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 염증성 질환은 관절염, 치주염, 아토피, 갑상선염, 포도막염, 하시모토 갑상선염, 위염, 지방간염, 간염 및 장염으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 대사성 질환은 비만, 체중 감소, 당뇨병, 죽상경화증, 동맥경화증, 심혈관 질환, 신경 질환, 알츠하이머 질환, 인지 장애, 산화적 스트레스, 피부 질환, 피부 노화, UV 조사에 의한 손상, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 면역 결핍, 암 및 대사성 증후군으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 치료용 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 중증 근무력증, 갑상선 염, 포도막염, 하시모토 갑상선염, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 알코올성/비알코올성 지방간염, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 장질환, 건선, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염, 피부근육염, 원판상 LE 및 전신 홍반 루푸스로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 치료용 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 섬유화 질환은 섬유화에 의한 간경화, 폐섬유증, 폐쇄성 폐질환, 심부전, 동맥경화, 만성신부전, 당뇨병, 수술후 후유증으로 생기는 켈로이드로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 섬유화 질환 치료용 약학적 조성물.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사제, 경구투여용 제제, 패치제, 액제, 캡슐, 과립, 정제, 산제, 분무제, 연고제, 겔제, 점막투여제제 및 좌제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 보조제는 부형제, 희석제, 완충제, 항균성 보존제, 계면활성제, 산화방지제, 증점제 및 점도개질제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 보조제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 일일 투여량은 1 내지 100 ㎎/㎏ 이며, 일일 일회 또는 주 2-3회 투여하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
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