WO2023239213A1 - 염증세포에서 특이적으로 작동하는 융합단백질 - Google Patents

염증세포에서 특이적으로 작동하는 융합단백질 Download PDF

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WO2023239213A1
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fusion protein
ubiquitin
inflammatory
present
cell
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오창규
박순익
박원진
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주식회사 쎌트로이
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    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the present invention relates to an inflammatory cell-specific drug delivery system that delivers drugs specifically to inflammatory cells but does not act on normal cells.
  • a drug delivery system refers to a series of technologies that control the delivery and release of pharmacologically active substances into cells, tissues, organs, and/or organs, minimizing the side effects of drugs and maximizing their efficacy and effectiveness. This refers to a technology that optimizes drug treatment by designing a dosage form to enable treatment.
  • inflammatory disease refers to a disease caused by hyperactivity of the inflammatory response due to genetic or environmental factors.
  • the inflammatory response is a defense mechanism of biological tissue against external stimuli such as infection or internal stimuli such as in vivo metabolites, and occurs when pro-inflammatory cytokines and nitric oxide (NO) are produced. do.
  • inflammatory cytokines such as IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , and IL-6 play a critical role in mediating the pathological progression of various infectious or inflammatory diseases.
  • These inflammatory cytokines are produced by various immune cells with activated inflammatory responses, and contribute to further intensifying inflammation by further recruiting immune cells to the site of inflammation.
  • IL-1 ⁇ and IL-18 are complex protein oligomers.
  • Activation of TLR by pathogen-associated molecular pattern molecules or damage-associated molecular pattern molecules induces the expression of pro-IL-1 ⁇ or pro-IL-18, It is processed by caspase-1, which is especially activated in inflammatory cells, and is converted into active IL-1 ⁇ or IL-18.
  • caspase-1 involves NLR (nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing) protein, ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) adapter protein, and caspase-1 precursor (pro-caspase-1). It is mediated by the inflammasome complex, and therefore is not activated in normal immune cells that have not undergone an inflammatory reaction, but is activated only in immune cells that have undergone an inflammatory reaction.
  • NLR nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing
  • ASC apoptosis-associated speck-like protein containing
  • anti-inflammatory drugs such as ibuprofen and benzydamine are used for anti-inflammatory purposes, but since these drugs do not specifically act on inflammation-causing substances or inflammatory cells, they may cause problems of suppressing immune function throughout the body. . Accordingly, natural product-based anti-inflammatory drugs that are relatively safe and can be consumed for a long period of time are used, but their efficacy is minimal and production costs and time efficiency are low.
  • the present invention was devised to solve the problems in the prior art as described above, and provides an inflammatory cell-specific drug delivery system that specifically acts only on inflammatory cells without being degraded by the proteasome in normal cells.
  • the main purpose is to
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent No. 10-2032945
  • Non-patent Document 1 Dinarello, C. A. Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory diseases. Blood 117, 3720-32 (2011).
  • Non-patent Document 2 Barton, G. M. A calculated response: control of inflammation by the innate immune system. J. Clin. Invest. 118, 413-20 (2008).
  • Non-patent Document 3 Sahoo, M., Ceballos-Olvera, I., del Barrio, L. & Re, F. Role of the inflammasome, IL-1 ⁇ and IL-18 in bacterial infections. Scientific World Journal. 11, 2037-50 (2011).
  • the present invention provides a fusion protein comprising a ubiquitin protein and a caspase-1 recognition sequence (CRS).
  • CRS caspase-1 recognition sequence
  • the ubiquitin may be wild-type ubiquitin or a variant thereof, but is not limited thereto.
  • the ubiquitin variant may satisfy one or more characteristics selected from the group consisting of the following, but is not limited thereto:
  • the ubiquitin variant has the 76th amino acid from the N terminus of wild-type ubiquitin: valine (V), arginine (R), proline (P), tryptophan (W), histidine (H), isoleucine (I), and lysine.
  • V valine
  • R proline
  • P proline
  • W histidine
  • I isoleucine
  • K glutamine
  • Q leucine
  • L aspartate
  • D asparagine
  • N tyrosine
  • T threonine
  • S serine
  • F phenylalanine
  • A substituted with cysteine
  • C cysteine
  • E glutamate
  • M methionine
  • the ubiquitin variant is one in which the 29th amino acid from the N terminus of wild-type ubiquitin is substituted with arginine (R);
  • the ubiquitin variant is one in which the 48th amino acid from the N terminus of wild-type ubiquitin is substituted with arginine (R).
  • the wild-type ubiquitin may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, but is not limited thereto.
  • the ubiquitin variant may simultaneously include one or more mutations, but is not limited thereto.
  • the ubiquitin protein may be one or more, but is not limited thereto.
  • the caspase-1 recognition sequence may be recognized and cleaved by activated caspase-1 protein, but is not limited to this.
  • the caspase-1 recognition sequence may include an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 21 to 25, but is not limited thereto.
  • the ubiquitin protein and the caspase-1 recognition sequence may be connected by a linker, but the present invention is not limited thereto.
  • the fusion protein may further include a cell-penetrating peptide, but is not limited thereto.
  • the cell-penetrating peptide may be bound to one or both ends of the fusion protein, but is not limited thereto.
  • the cell-penetrating peptide may include any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31 to 47, but is not limited thereto.
  • the present invention is a fusion protein comprising a ubiquitin protein, a caspase-1 recognition sequence, and a biologically active molecule, wherein the biologically active molecule is bound to the caspase-1 recognition sequence and is not directly bound to the ubiquitin protein.
  • a characterized fusion protein is provided.
  • the bond may be a chemical bond, a bond using a linker, or a peptide bond, but is not limited thereto.
  • the biologically active molecules include peptides, proteins, glycoproteins, nucleic acids, carbohydrates, lipids, glycolipids, compounds, natural products, semi-synthetic drugs, microparticles, nanoparticles, liposomes, and viruses. , quantum dots, and fluorochrome, but is not limited thereto.
  • the fusion protein may be linked in that order, but is not limited to a ubiquitin protein, a caspase-1 recognition sequence, and a biologically active molecule.
  • the fusion protein may further include a cell-penetrating peptide, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a recombinant vector containing a polynucleotide encoding the fusion protein.
  • the recombinant vector may further include a polynucleotide encoding a cell-penetrating peptide, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector may further include a polynucleotide encoding a biologically active molecule, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector includes a polynucleotide encoding a ubiquitin protein; A polynucleotide encoding a caspase-1 recognition sequence; and polynucleotides encoding biologically active molecules may be sequentially arranged, but are not limited thereto.
  • the present invention provides cells containing the above recombinant vector.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases, comprising the fusion protein as an active ingredient, wherein the biologically active molecule bound to the fusion protein is an anti-inflammatory agent.
  • the present invention provides a method for preventing or treating inflammatory diseases, comprising administering the fusion protein to an individual in need thereof.
  • the present invention provides the use of the fusion protein for the production of a drug for the treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention provides a use of the fusion protein for the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • the anti-inflammatory agent may be an anti-inflammatory protein or an anti-inflammatory peptide, but is not limited thereto, and may include IL-4, IL-6, IL-10, IL-11, and IL-13. , IL-19, IL-35, I ⁇ B ⁇ , p50, SV40, c-myc, NLS, NBD, NEMO, p65, Myd88, NF- ⁇ B, etc., antagonists (inhibitors, inhibitors, etc.) of pro-inflammatory proteins, and pro-inflammatory proteins It may be one or more selected from the group consisting of a targeting antibody or functional fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the anti-inflammatory agent may be an inhibitor of the expression or activity of NF- ⁇ B, but is not limited thereto.
  • the anti-inflammatory agent may be an inhibitor of the NF- ⁇ B signaling pathway, but is not limited thereto.
  • the biologically active molecule may be degraded by the proteasome in cells in which the inflammatory response is not activated, but the present invention is not limited thereto.
  • the fusion protein may further include a cell-penetrating peptide, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for delivering drugs specific to inflammatory cells or inflammatory tissues, comprising the fusion protein according to the present invention as an active ingredient. That is, the present invention provides an inflammatory cell- or inflammatory tissue-specific drug delivery system comprising the fusion protein according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a drug delivery method specific to inflammatory cells or inflammatory tissues, comprising the step of administering the fusion protein to an individual in need.
  • the present invention provides the use of the fusion protein for the production of an inflammatory cell or inflammatory tissue-specific drug delivery system.
  • the present invention provides the use of the fusion protein to deliver biologically active substances specifically to inflammatory cells or inflammatory tissues.
  • the inflammatory cell-specific drug delivery system (CDC fusion protein) according to the present invention is based on a ubiquitin protein and a caspase-1 recognition sequence fusion protein.
  • the entire drug delivery system, including the drug is decomposed by ubiquitin and does not function.
  • the caspase-1 recognition sequence is cleaved, allowing the drug to avoid proteasomal degradation and exert pharmacological activity.
  • the CDC fusion protein according to the present invention can be additionally combined with cell-penetrating peptides, etc., thereby significantly improving the efficiency of drug delivery to target cells. Therefore, the CDC fusion protein according to the present invention is capable of delivering drugs specific to inflammatory cells and can minimize the risk of side effects on normal cells, so it is expected to be useful as a drug delivery vehicle in various inflammatory diseases.
  • Figure 1a shows the nucleotide sequence of a CDC fusion protein-encoding nucleic acid according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1b shows the amino acid sequence of the CDC fusion protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1c shows the nucleotide sequence of a CDC fusion protein-encoding nucleic acid according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1d shows the amino acid sequence of the CDC fusion protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2a is a flowchart showing the activation of inflammatory cells and the processing of the CDC fusion protein to verify the operation of the CDC system according to the present invention.
  • Figure 2b shows that in order to verify the operation of the CDC system according to the present invention, human monocyte cells were treated with PMA to induce differentiation, and then inflammation was induced and Caspase-1 activity was measured depending on whether or not the CDC fusion protein of the present invention was treated. This is the confirmed result.
  • Figure 3 shows the DsRed fluorescence of the CDC fusion protein by treating immune cells with LPS to induce an inflammatory response and then treating them with the CDC fusion protein to confirm the mechanism of action of the CDC system according to the present invention on normal immune cells and inflammatory cells.
  • This is an image of the signal taken with a confocal microscope (Bortezomib, proteasome degradation inhibitor; Ac-YVAD-CHO, Caspase-1 inhibitor; same hereinafter).
  • Figure 4 shows the DsRed fluorescence signal of the CDC fusion protein by treating immune cells with LPS to induce an inflammatory response and then treating the CDC fusion protein to confirm the operating mechanism of normal immune cells and inflammatory cells in the CDC system according to the present invention. This is a result confirmed by flow cytometry.
  • Figure 5 shows the results of evaluating the efficacy of the fusion protein in inhibiting NF- ⁇ B activity after treating inflammatory cells with a fusion protein combining the CPP and NF- ⁇ B signaling pathway inhibitory peptide sequences (BAY 11-7082 , NF- ⁇ B inhibitory compound; NLS, NBD, NEMO-LZ, p65 phosphorylation, and Myd88, NF- ⁇ B signaling pathway inhibitory peptide).
  • Figure 6 shows the results of measuring intracellular fluorescence after treating macrophages with FITC-conjugated CPP candidates to search for cell-penetrating peptides that specifically penetrate macrophages.
  • Figure 7 shows that in order to confirm the efficacy of the CDC system according to the binding of a cell-penetrating peptide, TAT or a cell-penetrating peptide (C179) was bound to the CDC system bound to an NF- ⁇ B inhibitory peptide and then administered to inflammatory cells to increase NF in the cells. The results of measuring - ⁇ B activity are shown.
  • Figure 8 shows IL-1 ⁇ following treatment with the CDC system combined with cell-penetrating peptide (C179) after inducing an inflammatory response in colonic epithelial cells to evaluate the efficacy of the CDC system according to the present invention to suppress inflammation in colonic epithelial cells. It shows the result of measuring the level of.
  • Figure 9 shows IL-1 ⁇ following treatment with the CDC system combined with cell-penetrating peptide (C179) after inducing an inflammatory response in mouse macrophages to evaluate the efficacy of the CDC system according to the present invention to suppress inflammation in mouse macrophages. It shows the result of measuring the level of.
  • Figures 10a to 10d show the effect of improving colitis symptoms with the naked eye after treating an animal model in which colitis was induced with DSS with the CDC system according to an embodiment of the present invention to confirm the colitis treatment effect of the CDC system according to the present invention.
  • the results of the evaluation (FIG. 10a), the results of measuring the colon length (FIG. 10b), the results of histopathological evaluation (FIG. 10c), and the results of measuring the level of inflammatory cytokines in serum (FIG. 10d) are shown. .
  • Figure 11 is a diagram comparing the mechanism of action of the CDC system in normal cells and inflammatory cells according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention is a drug delivery system called “CDC (CPP-Degron), which allows the entire drug delivery system, including the drug, to decompose and fail to function in normal cells, but allows the drug to exert pharmacological activity without being decomposed in cells with an activated inflammatory response.
  • the main purpose is to provide “CDC fusion proteins” (Caspase-1 recognition sequence).
  • the CDC fusion protein according to the present invention is based on a fusion protein in which a ubiquitin protein and a caspase-1 recognition sequence (CRS) are fused, and in normal cells, polyubiquitination occurs in the ubiquitin protein.
  • CRS caspase-1 recognition sequence
  • the entire CDC fusion protein moves to the proteasome and is degraded (proteasome degradation), but in cells (preferably, immune cells) where the inflammatory response is activated and inflammasomes are formed, caspase-1 (Caspase-1) is activated to recognize and cleave CRS, so the drug released from the ubiquitin protein is not decomposed and maintains its normal structure and activity to exert pharmacological effects.
  • the CDC system according to the present invention can further increase delivery efficiency to target cells (inflammatory cells) by additionally including a cell-penetrating peptide, and as a result, the anti-inflammatory efficacy can be further improved.
  • the CDC fusion protein according to the present invention minimizes the possibility of non-specific drug delivery to normal cells and enables specific drug delivery to inflammatory cells, and is expected to be used as a drug delivery system for various inflammatory diseases.
  • the single letter (triple letter) of amino acids refers to the following amino acids according to standard abbreviation conventions in the field of biochemistry: A (Ala), alanine; C (Cys), cysteine; D (Asp), aspartic acid; E (Glu), glutamic acid; F (Phe), phenylalanine; G (Gly), glycine; H (His), histidine; I (IIe), isoleucine; K (Lys), lysine; L (Leu), leucine; M (Met), methionine; N (Asn), asparagine; O (Ply), pyrrolysine; P(Pro), proline; Q (Gln), glutamine; R (Arg), arginine; S (Ser), serine; T (Thr), threonine; U (Sec), selenocysteine; V (Val), valine; W (Trp), tryptophan; and Y (Ty (Ty
  • the purpose of the present invention is to provide a fusion protein comprising a ubiquitin protein and a caspase-1 recognition sequence (CRS).
  • the fusion protein may be referred to as “CDC fusion protein.”
  • the CDC fusion protein may also be referred to as CDC protein, CDC system, etc.
  • the fusion protein may be further bound to a biologically active molecule such as a drug.
  • the fusion protein may further be conjugated with a cell-penetrating peptide.
  • peptide or “protein” is a polymer of amino acids. Usually, a form in which a few amino acids are linked is called a peptide, and a form in which many amino acids are linked is called a protein.
  • the link between amino acids in a peptide or protein structure is made up of amide bonds or peptide bonds.
  • a peptide bond refers to a bond between a carboxyl group (-COOH) and an amino group (-NH 2 ) through which water (H 2 O) escapes and forms -CO-NH-.
  • fusion protein refers to a protein in which two or more proteins are artificially linked. At this time, the two or more proteins may be directly connected to each other, or may be connected through another mediator (eg, linker).
  • the fusion protein refers to a protein in which a ubiquitin protein and a caspase-1 recognition sequence are linked (bound, fused). The fusion proteins can be obtained by chemically synthesizing them after each fusion target is determined, or by expressing and purifying them using genetic recombination methods.
  • the fusion protein includes a polynucleotide sequence encoding a ubiquitin protein; A polynucleotide sequence encoding a caspase-1 recognition sequence; biologically active molecules; And/or a fusion gene linked to a cell-penetrating peptide can be inserted into any expression vector to prepare a recombinant vector, and then expressed in a cell expression system.
  • ubiquitin refers to a protein that binds to a substrate protein and induces proteasome degradation of the substrate protein.
  • the ubiquitin protein according to the present invention acts as a site where polyubiquitination occurs in E3 ligase, and the polyubiquitinated fusion protein, that is, the CDC fusion protein, is completely degraded by the proteasome.
  • the ubiquitin includes wild-type (i.e., natural or natural) ubiquitin as well as its variants, and may be included without limitation as long as it can cause proteasomal degradation of the bound protein.
  • the ubiquitin variant may include one or more mutations simultaneously, but is not limited thereto.
  • Ubiquitin is a known protein, and sequence information can be found in public protein databases such as Uniprot (reference numbers: P0CG47, P0CG48, P62979, and P62987, etc.). Additionally, ubiquitin variants in which some amino acid sequences have been modified are known. The ubiquitin variant can be applied to the present invention without limitation as long as it can perform the function of ubiquitin (inducing polyubiquitination and proteasome degradation). In one embodiment, the ubiquitin variant according to the present invention has the 76th amino acid from the N terminus of wild-type ubiquitin: valine (V), arginine (R), proline (P), tryptophan (W), histidine (H), and isoleucine.
  • V valine
  • R arginine
  • P proline
  • W tryptophan
  • H histidine
  • the ubiquitin variant according to the present invention may be one in which glycine (G), the 76th amino acid from the N terminus of wild-type ubiquitin, is substituted with one of the other amino acids above.
  • the ubiquitin variant has G76V, G76R, G76P, G76W, G76H, G76I, G76K, G76Q, G76L, G76D, G76N, G76Y, G76T, G76S, G76F, G76A, G76C, G76E, or G76M substitution in the wild-type ubiquitin sequence. It may contain mutations.
  • the ubiquitin variant according to the present invention may be one in which the 29th amino acid and/or the 48th amino acid from the N terminus of wild-type ubiquitin is substituted with arginine (R).
  • the ubiquitin variant according to the present invention may be one in which lysine (K), the 29th amino acid and/or lysine (K), the 48th amino acid from the N terminus of wild-type ubiquitin, is substituted with arginine (R). That is, the ubiquitin variant may include K29R and/or K48R substitution mutations in the wild-type ubiquitin sequence.
  • the wild-type ubiquitin sequence may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, but is not limited thereto.
  • the ubiquitin variant according to the present invention may simultaneously include one or more of the above-described mutations (mutations).
  • the ubiquitin variant having the G76V substitution mutation may further include a mutation in which the 29th amino acid from the N terminus is substituted with R.
  • the CDC fusion protein according to the present invention may include one or more ubiquitin proteins or variants thereof. That is, the ubiquitin protein or its variant may exist in a repeated form within one CDC fusion protein. At this time, the ubiquitin protein or its variant may exist in the same repeated form, and different types of ubiquitin proteins (i.e., ubiquitin proteins or variants thereof with different sequences) may exist together. Additionally, when the fusion protein includes a plurality of ubiquitin proteins, the ubiquitin proteins may be sequentially fused or connected to each other. In one embodiment of the present invention, the ubiquitin variant having the G76V substitution mutation may be included in the fusion protein in the form of two or three repeats. The plurality of ubiquitin proteins are 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 4, 2 to 3, or 2 ubiquitin proteins linked. However, it is not limited to this.
  • Ubiquitin variants may have different decomposition rates of target proteins depending on the type of mutation. Therefore, a person skilled in the art may select an appropriate ubiquitin variant by considering the type or characteristics of the biologically active molecule (drug, etc.) to be fused to the CDC fusion protein, the type of target disease, etc., based on the description in this specification and the technical knowledge in the art. By doing so, the delivery efficiency or activity of the biologically active molecule can be adjusted.
  • the ubiquitin protein according to the present invention may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 14, or more preferably, may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 14, but is not limited thereto.
  • Variants of amino acid sequences are included within the scope of the present invention. That is, the cell-penetrating peptide according to the present invention is a functional equivalent of the polypeptide constituting it, for example, some amino acid sequences of the polypeptide have been modified by deletion, substitution, or insertion. It is a concept that includes variants that can perform the same functional action as the polypeptide.
  • the ubiquitin protein according to the present invention has at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 14. It may contain an amino acid sequence having sequence homology. For example, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85. %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% sequence homology. It includes polypeptides having.
  • the “% sequence homology” for a polypeptide is determined by comparing a comparison region with two optimally aligned sequences, wherein a portion of the polypeptide's sequence in the comparison region is a reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (additional or may contain additions or deletions (i.e. gaps) compared to those that do not contain deletions.
  • Caspase-1 Recognition Sequence refers to the sequence that caspase-1 protein recognizes and cleaves.
  • Caspase is a core protease in the network involved in apoptosis and inflammation. Specific types include caspase-3, caspase-9, which is involved in apoptosis, and caspase, which is involved in inflammation. These include caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-12.
  • caspase-1 is not activated in normal cells, but in cells in which an inflammatory response is induced, it is activated by the inflammasome, a multi-white matter oligomer, causing the maturation of various inflammatory cytokines (IL-1 ⁇ , IL-18, etc.) . Since the caspase-1 recognition sequence according to the present invention is recognized and cleaved by activated caspase-1, biologically active molecules linked to ubiquitin through the caspase-1 recognition sequence are released from ubiquitin and degraded by proteasomes. can be avoided.
  • caspase-1 in normal cells, the activity of caspase-1 is low and it cannot perform its protease function, so the caspase-1 recognition sequence is maintained intact, and thus the biologically active molecule linked to ubiquitin through caspase-1 ultimately becomes a pro. Decomposed by theasome.
  • the caspase-1 recognition sequence according to the present invention is not limited to a specific sequence and may include any sequence that is recognized and cleaved by caspase-1, but is preferably WEHD (SEQ ID NO: 21), YVHD (SEQ ID NO: 22) ), YVAD (SEQ ID NO: 23), and FESD (SEQ ID NO: 24). More preferably, the caspase-1 recognition sequence according to the present invention may include or consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, and the amino acid sequence includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 and 70 It may include an amino acid sequence having sequence homology of at least %, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95%.
  • each component may be directly linked, or may be linked through another mediator (eg, linker).
  • the fusion protein according to the present invention may be a ubiquitin protein and a caspase-1 recognition sequence connected by a linker, and the biologically active molecule may also be connected to a caspase-1 recognition sequence by a linker, and a cell-penetrating peptide may also be connected by a linker. It can be linked to the ubiquitin sequence.
  • a “linker” refers to a fusion protein (preferably a peptide or protein) that connects a ubiquitin protein, a caspase-1 recognition sequence, and/or a biologically active molecule to produce a CDC fusion protein.
  • a linking mediator inserted between proteins to increase the structural flexibility of these proteins and thereby enhance the activity of each linked protein.
  • the linker may be a chemical linker.
  • the linker may be made of amino acids. There is no limit to the specific type or length of the linker as long as it can minimize the immune response.
  • the linker may be composed of 1 to 20 amino acids, 1 to 15 amino acids, 1 to 10 amino acids, 1 to 5 amino acids, or 1 to 3 amino acids.
  • the linker according to the present invention can be applied without limitation as long as it is a known linker.
  • the linker may be a GS linker.
  • the polynucleotide sequence encoding the GS sequence may be denoted as ggcagc.
  • the fusion protein according to the present invention contains a biologically active molecule, and the biologically active molecule is bound to a caspase-1 recognition sequence and is not directly bound to the ubiquitin protein. That is, the fusion protein is linked in that order to a ubiquitin protein, a caspase-1 recognition sequence (CRS), and a biologically active molecule (Ub-CRS-biologically active molecule), and the biologically active molecule passes through the caspase-1 recognition sequence. It is characterized by being linked to the ubiquitin protein.
  • CRS caspase-1 recognition sequence
  • Ub-CRS-biologically active molecule biologically active molecule
  • the caspase-1 recognition sequence is not cleaved, so biologically active molecules linked to ubiquitin through the caspase-1 recognition sequence are decomposed by the proteasome, but in cells where an inflammatory reaction has occurred, the biologically active molecule linked to ubiquitin is decomposed by the proteasome.
  • the caspase-1 recognition sequence is cleaved by caspase-1, biologically active molecules are released from ubiquitin and can avoid proteasomal degradation.
  • the fusion protein may further include a cell-penetrating peptide.
  • the fusion protein is linked in the following order: cell-penetrating peptide (CPP), ubiquitin protein (Ub), caspase-1 recognition sequence (CRS), and biologically active molecule (CPP) -Ub-CRS-biologically active molecule); Ubiquitin protein, caspase-1 recognition sequence, biologically active molecule, and cell-penetrating peptide linked in that order (Ub-CRS-biologically active molecule-CPP); It may be linked in the order of cell-penetrating peptide, ubiquitin protein, caspase-1 recognition sequence, biologically active molecule, and cell-penetrating peptide (CPP-Ub-CRS-biologically active molecule-CPP), but is not limited thereto.
  • inflammatory cells refer to cells with an activated inflammatory response, and the cells are not limited to specific types, but are preferably neutrophils; basophils; eosinophils; monocyte; macrophage; dendritic cell; plasma cells; histiocytes; It may be selected from lymphocytes such as CD8 + T cells, CD4 + T cells, and B cells.
  • lymphocytes such as CD8 + T cells, CD4 + T cells, and B cells.
  • the inflammatory cells according to the present invention refer to cells in which inflammasomes have been formed and activated, and more preferably, caspase-1 is activated.
  • biologically active molecules refers to substances that preferably have biological or pharmaceutical activity, which can penetrate into cells (into the cytoplasm or nucleus) and participate in the regulation of biological activity or exert pharmacological effects. It refers to a substance that has biological activity in various parts of the body, such as within cells, tissues, interstitial tissue, and blood, where it exists or must be transported and act. These biologically active molecules may be used interchangeably with the term “macromolecule”.
  • the biologically active molecules include peptides, proteins, glycoproteins, nucleic acids, carbohydrates, lipids, glycolipids, compounds, natural products, semi-synthetic drugs, microparticles, nanoparticles, liposomes, viruses, quantum dots, and fluorescence. It may be selected from the group consisting of pigments (fluorochromes) and complexes thereof.
  • the biologically active molecules according to the present invention are peptides, proteins, and glycoproteins that can be degraded by the proteasome, and are characterized in that they are degraded by the proteasome in normal cells and lose their biological activity. .
  • Non-limiting examples of such proteins include growth factors, enzymes, nucleases, transcription factors, antigenic peptides, antibodies (e.g., monoclonal, chimeric, humanized antibodies, etc.), antibody fragments, hormones, Transport proteins, immunoglobulins, structural proteins, motor function proteins, receptors, signaling proteins, storage proteins, membrane proteins, transmembrane proteins, internal proteins, external proteins, secretory proteins, viruses Included are proteins, protein complexes, chemically modified proteins, and prions.
  • the nucleases include CAS9 (CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CAS variants, Cfp1 (CxxCfinger protein-1), ZEN (Zinc-finger nucleases), and TALEN (Transcription activator-like effector nuclease). Included.
  • Non-limiting examples of the nucleic acids include DNA, RNA, antisense oligonucleotide (ASO), microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), aptamer, and locked nucleic acid (LNA). , PNA (peptide nucleic acid), and morpholino.
  • Non-limiting examples of such compounds include therapeutic drugs, toxic compounds, and chemical compounds.
  • drug is a broad concept that includes substances for alleviating, preventing, treating or diagnosing a disease, injury or specific symptom. That is, the fusion protein according to the present invention can be used as a drug carrier for preventing or treating diseases, especially inflammatory diseases.
  • the drug is a peptide or protein (i.e. a therapeutic peptide or therapeutic protein).
  • the biologically active molecules of the present invention include cholesterol, chemotherapy agents, vitamins, co-factors, 2,5-A chimeras, allozymes, and aptamers.
  • molecules that can modulate the pharmacokinetics and/or pharmacodynamics of polymers such as polyamines, polyamides, polyethylene glycol, and polyether may be included.
  • the fusion protein according to the present invention includes those formed by simply mixing a peptide and a substance, those formed by mixing a peptide and a substance, or those formed by linking or conjugating them by a chemical bond, etc. Additionally, the fusion protein may be linked by physical bond, chemical bond, covalent bond, non-covalent bond, peptide bond, or self-assembly, or can be linked in an integrated or fused form using a mediator (e.g., linker). Preferably, the fusion protein according to the present invention is characterized in that it is linked to a biologically active molecule by a peptide bond.
  • the chemical bond is selected from the group consisting of disulfide bond, diamine bond, sulfide-amine bond, carboxy-amine bond, ester bond, diselenide bond, maleimide bond, thioester bond, and thioether bond.
  • disulfide bond diamine bond
  • sulfide-amine bond carboxy-amine bond
  • ester bond ester bond
  • diselenide bond maleimide bond
  • thioester bond thioether bond
  • the fusion protein according to the present invention may further include a cell-penetrating peptide.
  • the cell-penetrating peptide may be bound to one or both ends of the fusion protein (i.e., linked to ubiquitin, caspase-1 recognition sequence, and/or biologically active molecule).
  • cell permeability means the ability or property of a substance to penetrate the cell (membrane) and into the inside of the cell.
  • cell membrane refers to a lipid-containing barrier that separates a cell or cell population from the extracellular space.
  • Cell membranes include, but are not limited to, plasma membranes, cell walls, and intracellular organelle membranes such as mitochondrial membranes and nuclear membranes.
  • cell penetrating peptide refers to a peptide that has cell-penetrating properties and has the ability to deliver cargo into cells in vitro and/or in vivo.
  • the cell-penetrating peptide may be a cell-penetrating peptide that has a particularly high penetrating ability for immune cells.
  • the cell-penetrating peptide may exhibit high cell-penetrating ability for macrophages.
  • “cargo” includes all substances that can move into cells by binding to cell-penetrating peptides, and may include all types of biologically active molecules.
  • the transport target includes, for example, all substances desired to increase cell penetration efficiency, specifically active substances in drugs, cosmetics or health foods, more specifically substances that are not easy to move into cells through general routes, and more specifically, substances that are not easy to move into cells through general routes. Examples include, but are not limited to, proteins, nucleic acids, peptides, minerals, sugars such as glucose, nanoparticles, biological agents, viruses, contrast agents, or other chemicals.
  • the delivery target is the fusion protein according to the present invention, that is, the CDC fusion protein.
  • the cell-penetrating peptide according to the present invention binds to the end of the fusion protein and further improves the delivery efficiency of the fusion protein to inflammatory cells. That is, the fusion protein to which a cell-penetrating peptide is additionally linked has a penetrating activity against inflammatory cells of at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% or more, for example, 5% or more, compared to the control group. %, 10%, 20%, 30%, 40%, or 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or higher, and/or 0.5 times, 1.1 times, 1.2 times, 1.4 times, 1.6 times It can increase by 2x, 1.8x or more.
  • the cell-penetrating peptide is composed of an amino acid sequence represented by the general formula I below, and may satisfy the following characteristics:
  • A' is absent or 1 to 8 amino acids are connected
  • B' does not exist or is comprised of 1 to 15 amino acids linked
  • the peptide consists of 7 to 25 amino acids.
  • the cell-penetrating peptide may be amphipathic. Additionally, all or part of the cell-penetrating peptide may have an alpha-helix structure.
  • the 1 to 8 amino acids constituting A' may each independently be lysine, alanine, isoleucine, or tyrosine
  • the 1 to 15 amino acids constituting B' may each independently be lysine or leucine. , or it may be isoleucine.
  • the cell-penetrating peptide consisting of the amino acid sequence represented by the general formula I may be composed of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31 to 47.
  • the cell-penetrating peptide is composed of an amino acid sequence represented by the following general formula II, and may satisfy the following characteristics:
  • R 14 is arginine (R), proline (P), lysine (K), or isoleucine (I);
  • R 1 to R 14 is proline (P);
  • arginine (R) is assigned 1 point and lysine (K) is assigned 0.5 points, and when added together, R 1 to R 14 as a whole scores 6.5 points or more;
  • the peptide contains one or more amino acids selected from the group consisting of valine (V), leucine (L), and isoleucine (I).
  • the cell-penetrating peptide may be cationic. Additionally, all or part of the cell-penetrating peptide may have an alpha-helix structure.
  • the cell-penetrating peptide consisting of the amino acid sequence represented by General Formula II may further satisfy one or more characteristics selected from the group consisting of:
  • R 5 -R 6 is any one consecutive amino acid selected from the group consisting of VI, KR, RL, KK, LR, RA, RK, and KQ;
  • R 9 and R 10 are each independently arginine (R), lysine (K), alanine (A), leucine (L), histidine (H), or W;
  • R 2 is proline (P), leucine (L), arginine (R), lysine (K), valine (V), or alanine (A);
  • R 4 is lysine (K), leucine (L), arginine (R), or isoleucine (I);
  • the peptide does not contain glutamic acid (E), glycine (G), and tyrosine (Y).
  • the cell-penetrating peptide according to the present invention may be a cell-penetrating peptide that has a particularly high penetrating ability in immune cells such as macrophages (i.e., an immune cell-specific cell-penetrating peptide).
  • immune cells include, but are not limited to, neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, monocytes, macrophages, dendritic cells, natural killer cells, and lymphocytes (B cells and T cells).
  • the cell-penetrating peptide consisting of the amino acid sequence represented by the general formula II includes any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 31 to 47, or any amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 31 to 47. It may consist of a single amino acid sequence. More preferably, the cell-penetrating peptide has excellent cell-penetrating ability, especially in immune cells, and contains any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 31 to 47, or any amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 31 to 47. It may consist of a single amino acid sequence. Most preferably, the cell-penetrating peptide according to the present invention may be Cat.16 (C16) or Cat.179 (C179), but is not limited thereto.
  • 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2 of the cell-penetrating peptides may be linked sequentially to bind to one or both ends of the biologically active molecule, and the bond may be chemically It may be a bond, a linker-based bond, or a peptide bond.
  • derivatives and analogs of the above cell-penetrating peptides.
  • “derivative” refers collectively to similar peptides obtained by changing part of the cell-penetrating peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the present invention, and preferably has one or more amino acids different from each other. It may be replaced with an amino acid, one or more amino acids added, one or more amino acids deleted, or fused with a compound that increases the half-life of the peptide (e.g., polyethylene glycol, etc.).
  • the derivative may maintain, increase, or decrease the function or characteristics (eg, cell permeability) of the cell-penetrating peptide according to the present invention.
  • the derivative may have one or more amino acid substitutions while maintaining the characteristics of the cell-penetrating peptide according to the present invention.
  • the amino acid substitutions may generally occur based on similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine with aliphatic side chains can be substituted for each other; Glycine and alanine, which have relatively short side chains, can be substituted for each other; Valine, leucine, and isoleucine, which have larger hydrophobic aliphatic side chains, can be substituted for each other; Phenylalanine, tyrosine, and tryptophan, which have aromatic side chains, may be substituted for each other; Lysine, arginine, and histidine, which have basic side chains, may be substituted for each other; Aspartate and glutamate, which have acidic side chains, can be substituted for each other; Cysteine and methionine, which have sulfur-containing side chains, can be substituted for each other.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the fusion protein according to the present invention, a recombinant vector containing the polynucleotide, and a cell transformed with the recombinant vector (i.e., a cell containing the recombinant vector). That is, the recombinant vector according to the present invention includes a polynucleotide encoding a ubiquitin protein; A polynucleotide encoding a caspase-1 recognition sequence; and/or polynucleotides encoding biologically active molecules. The recombinant vector may further include one or more linker sequences between each polynucleotide.
  • “recombinant vector” refers to a vector capable of expressing a peptide or protein encoded by a heterogeneous nucleic acid inserted into the vector, preferably the target protein (in the present invention, ubiquitin , a caspase-1 recognition sequence, and/or a fusion protein to which a biologically active molecule is linked (i.e., CDC fusion protein).
  • the “vector” refers to any medium for the introduction and/or transfer of bases into a host cell in vitro, in vivo, or in vivo, and is a replication unit that can bind other DNA fragments to result in replication of the combined fragment ( replicon), and “replication unit” refers to any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, chromosomes, viruses, etc.).
  • the vector according to the present invention may be linear DNA, plasmid DNA, or recombinant viral vector, but is not limited thereto.
  • Such vectors include, for example, viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, bacterial expression vectors, adenoviral vectors, lentiviral vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors.
  • the vector is a plasmid vector or bacterial expression vector.
  • the present inventors used the pET26b vector in specific examples.
  • the recombinant vector of the present invention preferably includes a promoter, which is a transcription initiation factor to which RNA polymerase binds, an optional operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and termination of transcription and translation. It may include a regulating sequence, a terminator, etc., and more preferably, a polyhistidine tag (an amino acid motif consisting of at least 5 histidine residues), a signal peptide gene, and an endoplasmic reticulum retention signal peptide. ), a cloning site, etc., and may additionally include a tag gene, a marker gene for selection such as an antibiotic resistance gene for selecting transformants, etc.
  • a promoter which is a transcription initiation factor to which RNA polymerase binds
  • an optional operator sequence for regulating transcription a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and termination of transcription and translation. It may include a regulating sequence,
  • the polynucleotide sequence of each gene is operably linked to a promoter.
  • operatively linked refers to a functional linkage between a nucleotide expression control sequence, such as a promoter sequence, and another nucleotide sequence, whereby the control sequence is responsible for the transcription of the other nucleotide sequence. and/or regulate detoxification.
  • the recombinant vector can be constructed using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter capable of advancing transcription e.g., pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • a transcription/translation termination sequence e.g., a strong promoter capable of advancing transcription (e.g., pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc. ), a ribosome binding site for initiation of translation, and a transcription/translation termination sequence.
  • the origin of replication at which the vector operates in the eukaryotic cell may include, but is limited to, the f1 origin of replication, the SV40 origin of replication, the pMB1 origin of replication, the adeno origin of replication, the AAV origin of replication, and the BBV origin of replication. It doesn't work.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothioneine promoter
  • promoters derived from mammalian viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV
  • adenovirus late promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • SV40 promoter SV40 promoter
  • the cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV can be used and typically have a polyadenylation sequence as the transcription termination sequence.
  • tags include Avi tag, Calmodulin tag, polyglutamate tag, E tag, FLAG tag, HA tag, His tag (polyhistidine tag), Myc tag, S tag, SBP tag, IgG-Fc tag, and CTB.
  • Tags Softag 1 tag, Softag 3 tag, Strep tag, TC tag, V5 tag, VSV tag, Xpress tag, etc. may be included.
  • the recombinant vector may further include a polynucleotide encoding a biologically active molecule. That is, in this case, the biologically active molecule is a peptide, protein, glycoprotein, etc., and it is preferable that it can be transcribed and expressed together when RNA polymerase initiates transcription of the recombinant vector.
  • the recombinant vector may further include a polynucleotide encoding a cell-penetrating peptide.
  • Each of the polynucleotides may be linked to each other through a linker or the like.
  • the polynucleotide encoding the ubiquitin may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or may be composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the caspase-1 recognition sequence may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, or may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the cell-penetrating peptide may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or may be composed of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector according to the present invention may include the base sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 10, or may be composed of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 10, but is not limited thereto.
  • a polynucleotide consisting of a base sequence indicated by a specific sequence number is not limited to the base sequence, and variants of the base sequence are included within the scope of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the base sequence of the present invention is a functional equivalent of the nucleic acid molecule constituting it, for example, a nucleic acid molecule in which a portion of the base sequence of the nucleic acid molecule has been modified by deletion, substitution, or insertion. It is a concept that includes variants that can perform the same functional function as the molecule.
  • the polynucleotide disclosed in the present invention has at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% of the base sequence represented by a specific sequence number. It may contain base sequences with homology. For example, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85. %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% sequence homology. It includes a polynucleotide having.
  • the “% sequence homology” for a polynucleotide is determined by comparing a comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (additions or deletions) for the optimal alignment of the two sequences. may contain additions or deletions (i.e. gaps) compared to those that do not contain .
  • the polynucleotide encoding the caspase-1 recognition sequence is arranged between the polynucleotide encoding the ubiquitin protein and the polynucleotide encoding the biologically active molecule. That is, in the recombinant vector, it is preferable that the polynucleotide encoding the biologically active molecule is not directly linked to the polynucleotide encoding the ubiquitin protein.
  • the recombinant vector is a polynucleotide encoding a ubiquitin protein; A polynucleotide encoding a caspase-1 recognition sequence; And polynucleotides encoding biologically active molecules may be sequentially arranged.
  • the polynucleotide encoding the cell-penetrating peptide may be located toward the 5' end of the polynucleotide encoding the ubiquitin protein and/or the 3' end of the polynucleotide encoding the biologically active molecule, but is limited thereto. It doesn't work.
  • the fusion protein expressed from this has a caspase-1 recognition sequence between the ubiquitin protein and the biologically active molecule, so the biologically active molecule is released as the caspase-1 recognition sequence is cleaved by caspase-1 in inflammatory cells.
  • proteasomal degradation can be avoided.
  • the biologically active molecule is linked by ubiquitin protein through the caspase-1 recognition sequence, so the entire fusion protein is degraded by the proteasome.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases, comprising the fusion protein according to the present invention as an active ingredient.
  • the biologically active molecule bound to the fusion protein is an anti-inflammatory agent, that is, a biologically active molecule with anti-inflammatory activity.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation, that is, an anti-inflammatory pharmaceutical composition, comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • an anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the biologically active molecule bound to the fusion protein is an anti-inflammatory agent.
  • inflammatory disease can include all known diseases related to inflammation, and is a concept that includes diseases in which symptoms can be improved or therapeutic effects can be achieved by suppressing inflammation. For example, it also includes diseases whose symptoms can be improved by reducing the levels of inflammatory cytokines.
  • the inflammatory diseases are not limited to specific types, but include gastritis, gastric ulcer, duodenal ulcer, inflammatory skin disease, allergic disease, gastroenteritis, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, and inflammatory bowel disease.
  • peritonitis osteomyelitis, cellulitis, meningitis, encephalitis, pancreatitis, trauma-induced shock, bronchial asthma, cystic fibrosis, stroke, acute bronchitis, chronic bronchitis, acute bronchiolitis, chronic bronchiolitis, osteoarthritis, gout, spondyloarthropathy, ankylosing spondylitis, lighter. syndrome, psoriatic arthropathy, enteropathy spondylitis, juvenile arthropathy, juvenile ankylosing spondylitis, reactive arthropathy, infectious arthritis, post-infectious arthritis, gonococcal arthritis, tuberculous arthritis, viral arthritis, fungal arthritis, syphilitic arthritis.
  • Lyme disease arthritis associated with 'vasculitis syndrome', polyarteritis nodosa, hypersensitivity vasculitis, Lou Gehrig's granulomatosis, polymyalgia rheumatica, articular cell arteritis, calcium crystal deposition arthropathy, pseudogout, non-articular rheumatism, bursitis, tenosynovitis, Epicondylitis (tennis elbow), neuropathic joint disease (charcoal and joint), hemorrhagic arthrosis (hemarthrosic), Henoch-Schönlein purpura, hypertrophic osteoarthropathy, multicentric reticulohistiocytoma, surcoilosis, hemochromatosis, Sickle cell disease and other hemochromatosis, hyperlipoproteinemia, hypogammaglobulinemia, familial Mediterranean fever, Behart's disease, systemic lupus erythematosus, relapsing fever, psori
  • the anti-inflammatory agent may be included without limitation as long as it is a substance that has anti-inflammatory activity.
  • the anti-inflammatory agent may be a substance that can be degraded by the proteasome, such as a protein, peptide, or antibody with anti-inflammatory activity. Therefore, the fusion protein containing the anti-inflammatory agent is degraded by the proteasome and cannot function in normal cells in which the inflammatory response is not activated.
  • the anti-inflammatory agent may include, without limitation, anti-inflammatory proteins, anti-inflammatory peptides, etc. known in the art.
  • the anti-inflammatory agents specifically include IL-4, IL-6, IL-10, IL-11, IL-13, IL-19, IL-35, I ⁇ B ⁇ , p50, SV40, c-myc, NLS, NBD, and NEMO. , p65, Myd88, NF- ⁇ B, etc., activity or expression inhibitors (inhibitors, antagonists, etc.) of pro-inflammatory proteins, or antibodies targeting the pro-inflammatory proteins or functional fragments thereof, but are limited to specific types. This does not mean that any peptide or protein with anti-inflammatory activity can be included without limitation.
  • the pro-inflammatory protein is a protein that promotes inflammation, and specifically, pro-inflammatory cytokines, IL-1 ⁇ , IL-6, TNF- ⁇ , IL-2, IL-12, IL-17, IL-18, INF- Examples include ⁇ , NLS, NBD, NEMO, p65, and Myd88.
  • the anti-inflammatory agent may be an expression or activity inhibitor of NF- ⁇ B.
  • the anti-inflammatory agent may be an inhibitor of the NF- ⁇ B signaling pathway.
  • the inhibitor of the NF- ⁇ B signaling pathway is not limited to a specific type, but may be selected from inhibitors of the expression or activity of NLS, NBD, NEMO, p65, and/or Myd88.
  • the present invention provides a composition for delivering drugs specific to inflammatory cells or inflammatory tissues, that is, a drug delivery system, containing the fusion protein according to the present invention as an active ingredient.
  • the biologically active molecule bound to the fusion protein is an anti-inflammatory agent, that is, a biologically active molecule with anti-inflammatory activity. That is, in the composition for drug delivery according to the present invention, the fusion protein, which is the active ingredient, is decomposed in normal cells, so the anti-inflammatory agent does not exert pharmacological activity, but in inflammatory cells or tissues, the fusion protein is not degraded by the proteasome. Because the activity of the drug is maintained, inflammatory cell-specific drug delivery is possible.
  • the specific description of inflammatory cells is as described above.
  • the content of the fusion protein, that is, the CDC fusion protein, in the composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the patient's condition, etc., for example, 0.0001 to 99.9% by weight based on the total weight of the composition, Alternatively, it may be 0.001 to 50% by weight, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount with the solvent removed.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of diluents, binders, disintegrants, lubricants, adsorbents, humectants, film-coating materials, and controlled-release additives.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared as powder, granules, sustained-release granules, enteric-coated granules, solutions, eye drops, ellipsis, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese according to conventional methods.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, and calcium. These include phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives to tablets, powders, granules, capsules, pills, and troches according to the present invention include corn starch, potato starch, wheat starch, lactose, white sugar, glucose, fructose, di-mannitol, precipitated calcium carbonate, synthetic aluminum silicate, and phosphoric acid.
  • Excipients such as cellulose (HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, propylene glycol, casein, calcium lactate, and Primogel; Gelatin, gum arabic, ethanol, agar powder, cellulose acetate phthalate, carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, glucose, purified water, sodium caseinate, glycerin, stearic acid, sodium carboxymethyl cellulose, sodium methyl cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, dextrin.
  • binders can be used, Hydroxypropyl methyl cellulose, corn starch, agar powder, methyl cellulose, bentonite, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethyl cellulose, sodium alginate, calcium carboxymethyl cellulose, calcium citrate, sodium lauryl sulfate, silicic acid anhydride, 1-hydroxy Propylcellulose, dextran, ion exchange resin, polyvinyl acetate, formaldehyde-treated casein and gelatin, alginic acid, amylose, guar gum, sodium bicarbonate, polyvinylpyrrolidone, calcium phosphate, gelled starch, gum arabic, Disintegrants such as amylopectin, pectin, sodium polyphosphate, ethyl
  • soybean oil (Lubri wax), aluminum stearate, zinc stearate, sodium lauryl sulfate, magnesium oxide, Macrogol, synthetic aluminum silicate, silicic anhydride, higher fatty acids, higher alcohol, silicone oil, paraffin oil, polyethylene glycol fatty acid ether, Lubricants such as starch, sodium chloride, sodium acetate, sodium oleate, dl-leucine, and light anhydrous silicic acid may be used.
  • Additives for the liquid according to the present invention include water, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, sucrose monostearate, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (twin esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, etc. can be used.
  • a solution of white sugar, other sugars, or sweeteners, etc. may be used in the syrup according to the present invention, and if necessary, flavoring agents, colorants, preservatives, stabilizers, suspending agents, emulsifiers, thickening agents, etc. may be used.
  • Purified water can be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. can be used as needed.
  • Suspensions according to the present invention include acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, etc. Topics may be used, and surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.
  • Injections according to the present invention include distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, IV solution, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated IV solution, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil - sesame oil.
  • solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristic acid, and benzene benzoate;
  • Solubilizers such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, Tween, nicotinic acid amide, hexamine, and dimethylacetamide;
  • Weak acids and their salts acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and buffering agents such as gums
  • Isotonic agents such as sodium chloride
  • Stabilizers such as sodium bisulfite (NaHSO 3 ) carbon dioxide gas, sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 5 ), sodium sulfite (Na 2 SO 3 ), nitrogen gas (N 2
  • Suppositories according to the present invention include cacao oil, lanolin, witepsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, Subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, lecithin, Lanet wax, glycerol monostearate, Tween or Span, Imhausen, monolene (propylene glycol monostearate), glycerin, Adeps solidus, Buytyrum Tego -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydrocote SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), Hydro Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Massaupol, Masupol-15, Neosupostal-
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include the extract with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, and sucrose. ) or prepared by mixing lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, drug activity, and It can be determined based on factors including sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used simultaneously, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to an individual through various routes. All modes of administration are contemplated, including oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal injection, vaginal injection. It can be administered by internal insertion, ocular administration, ear administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined depending on the type of drug as the active ingredient along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the patient's age, gender, weight, and severity of the disease.
  • “individual” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, cows, etc. refers to mammals of
  • “administration” means providing a given composition of the present invention to an individual by any appropriate method.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of the desired disease
  • treatment refers to the improvement or improvement of the desired disease and its associated metabolic abnormalities by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. It refers to all actions that are beneficially changed, and “improvement” refers to all actions that reduce parameters related to the target disease, such as the degree of symptoms, by administering the composition according to the present invention.
  • the CDC fusion protein (CDC system) of the present invention is characterized by linking a ubiquitin protein and a caspase-1 recognition sequence, and in addition, a cell-penetrating peptide sequence to increase cell delivery efficiency and a drug for pharmacological activity (e.g., therapeutic peptide) may be additionally combined.
  • nucleic acid sequence of the CDC fusion protein combining the cell-penetrating peptide Cat16 (C16) and the fluorescent protein Dsred is shown in SEQ ID NO: 8 and Figure 1A, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 19 and Figure 1B.
  • the entire nucleotide sequence of the expression vector for expressing this is shown in SEQ ID NO: 9.
  • nucleic acid sequence of the CDC fusion protein combining the cell-penetrating peptide Cat179 (C179) and the NF- ⁇ B inhibitory sequence (Myd88) is shown in SEQ ID NO: 10 and Figure 1c, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20 and Figure 1d. showed.
  • a cell-penetrating peptide Cat16 (C16) coding nucleic acid (SEQ ID NO: 1) containing restriction enzymes Nde I and Bsa I recognition sequences, and a ubiquitin variant containing restriction enzymes Bsa I and Nco I ( G76V)-CRS coding nucleic acid was synthesized.
  • the cell-penetrating peptide was used to further increase the cell delivery efficiency of the CDC system of the present invention.
  • the vector containing the synthesized gene and the pET-26b vector for expressing the CDC fusion protein containing DsRed were treated with the above restriction enzyme, the desired gene fragment was isolated, and a recombinant vector was constructed using T4 DNA ligase.
  • the constructed vector was transformed into E. coli (DH5 ⁇ ) and then cultured on LB agar medium containing kanamycin at a temperature of 37°C for 16 hours to isolate colonies. Isolated E. coli was cultured in LB liquid medium at 37°C, 200 rpm, and 16 hours, DNA was extracted from the culture medium, and recombinant vectors in the desired form were selected.
  • the selected CDC fusion protein expression vector was transformed into E.
  • coli BL21(DE3) for protein expression, and clones transformed with the recombinant vector were selected in the same manner as above.
  • the selected strains were cultured in LB liquid medium at 37°C and 200 rpm for 18 hours, then 1mM IPTG was added and cultured at 37°C or 25°C for 4 hours to induce protein expression.
  • the expressed protein was separated and purified by a conventional method using a Ni-NTA column.
  • the CDC system combined with C179 was produced in the same manner as described above.
  • human monocytes THP-1 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea) were cultured in RPMI-1640 medium under conditions of 37°C and 5% CO 2 . 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics (10,000 U/ml penicillin, 0.1 mg/mL streptomycin) were added to the medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotics 10,000 U/ml penicillin, 0.1 mg/mL streptomycin
  • differentiation is induced for 48 hours by adding PMA to THP-1 cells seeded at 6 ⁇ 10 4 cells/well in a 24-well plate, as described later, and CDC
  • the system was treated with LPS and ATP at a concentration of 1 ⁇ M in 400 ⁇ L media.
  • the subsequent process was carried out according to the kit's manual, and luminescence was measured and evaluated using a microplate reader.
  • the flow chart of the experiment is shown in Figure 2a.
  • THP-1 cells were distributed on cover glass in a 24-well plate at a density of 6 ⁇ 10 4 cells/well, and then differentiated for 48 hours by adding 100 ng/mL of Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). induced. After 48 hours, cells were washed with Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), and 100 nM Bortezomib (proteasome degradation inhibitor) and 100 ⁇ M caspase-1 inhibitor (Ac-YVAD-CHO) were added to 1% FBS RPMI-1640 medium.
  • DPBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • Ac-YVAD-CHO caspase-1 inhibitor
  • LPS an agonist of Toll-like receptor 4 activates differentiated THP-1 to induce transcription of Nuclear factor kappa B (NF- ⁇ B), a transcription factor, and increases inducers of inflammasome activation such as ATP. Induces the formation of NLRP3 inflammasomes and induces the activity of Caspase-1.
  • NF- ⁇ B Nuclear factor kappa B
  • ATP a transcription factor
  • inflammasome activation such as ATP.
  • NLRP3 inflammasomes induces the activity of Caspase-1.
  • a strong fluorescent signal of DsRed was detected in THP-1 cells activated with LPS, which means that as the inflammatory response of THP-1 is activated, Caspase-1 with increased activity becomes CDC. This means that the DsRed fluorescent protein expressed fluorescence without being degraded by the proteasome by cutting the Caspase-1 recognition sequence of the fusion protein. This is further supported by the result that DsRed fluorescence decreased when THP
  • the above results mean that the CDC fusion protein according to the present invention can deliver biologically active molecules specifically to inflammatory cells.
  • the CDC system of the present invention was evaluated using flow cytometry.
  • THP-1 cells were distributed in a 24-well plate at a density of 1 ⁇ 10 5 cells/well, and differentiation was induced for 48 hours by treatment with 100 ng/ml PMA. After 48 hours, cells were washed with DPBS, pretreated with 100 nM Bortezomib and 100 ⁇ M Ac-YVAD-CHO in 1% FBS RPMI-1640 medium for 1 hour each, and then treated with 1 ⁇ M CDC_red protein for 1 hour. . Afterwards, 1 ⁇ g/ml LPS was treated for 3 hours and then 5 mM ATP was treated for 30 minutes.
  • the cells were harvested, collected in a 1.5 ml tube, and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes. After removing the supernatant, the cells were resuspended in cell staining buffer, the supernatant was removed, and the cells were resuspended in DPBS and washed. This was repeated twice, the cells were resuspended again, samples were prepared, and flow cytometry was performed using FACS Diva (BD).
  • FACS Diva FACS Diva
  • Example 5 Evaluation of inhibition of NF- ⁇ B activity according to CPP binding of NF- ⁇ B signaling pathway inhibition sequence
  • a cell-penetrating peptide which can improve the efficiency of mass transfer to cells of the present invention, and an inhibitory peptide sequence of the NF- ⁇ B signaling pathway were combined, and the efficacy of inhibiting NF- ⁇ B activity was evaluated.
  • A549-Dual cells Human NF- ⁇ B-SEAP&IRF-Luc Reporter lung carcinoma
  • BAY 11-7082, an NF- ⁇ B inhibitor, and five types of peptide sequences that inhibit the NF- ⁇ B signaling pathway combined with CPP were pretreated at a concentration of 20 or 50 ⁇ M for 1 hour.
  • the sequences of the CPP and NF- ⁇ B signaling pathway inhibitory peptides used in this example are shown in Table 1 below.
  • each well was treated with TNF- ⁇ (1 ng/ml) for 24 hours. After 24 hours, the assay was performed according to the manual using Invivogen's QUANTI-BLUE Solution, and the absorbance was measured at 655 nm using a microreader.
  • THP-1 cells were distributed in a 24-well plate at 1.5 Cultured under 5% CO 2 conditions. Then, 4 ⁇ M each of FITC-conjugated TAT or FITC-conjugated CPP (C12-C402) was treated and incubated for 1 hour. After the culture was completed, the cells were separated using 0.25% trypsin, transferred to a sterile tube, and centrifuged to remove the medium. Afterwards, the medium was completely removed by washing twice with 200 ⁇ L of D-PBS, and finally, the cells were resuspended in 400 ⁇ L of D-PBS and intracellular fluorescence was measured using a flow cytometer (FACS, BD Canto II). .
  • FACS flow cytometer
  • FITC-conjugated C179 showed the highest cell penetration rate for macrophages among 60 CPP candidates. It showed a cell permeability that was about 4.5 times higher than that of FITC-conjugated TAT, a comparison group.
  • Example 7 Comparison of the efficacy of the CDC system depending on whether cell-penetrating peptide is combined or not
  • NF- ⁇ B inhibition efficacy of CDC-cargo according to CPP binding was compared.
  • A549-Dual cells which are Human NF- ⁇ B-SEAP&IRF-Luc Reporter lung carcinoma) cells, were used.
  • A549-dual cells were distributed in a 96-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells/well, and cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. .
  • NF- ⁇ B inhibitory peptides LZ and Myd88, which showed NF- ⁇ B inhibitory activity in Example 5, were used, and for the experiment, an NF- ⁇ B inhibitory peptide that was not bound to CPP (no-CPP-CDC-LZ/Myd88) ; CDC system combining TAT and NF- ⁇ B inhibitory peptide (TAT-CDC-LZ/Myd88); And a CDC system (C179-CDC-LZ/Myd88) combining C179 and NF- ⁇ B inhibitory peptide, which was confirmed to have the highest permeability in macrophages in Example 6, was prepared.
  • Cells were pretreated with the above substances at a concentration of 50 ⁇ M for 1 hour, and BAY 11-7082 at the same concentration was treated as a comparison group. After pretreatment for 1 hour, 1 ng/ml of TNF- ⁇ was treated and cultured for 24 hours. After 24 hours, the assay was performed according to the manual using Invivogen's QUANTI-BLUE Solution, and the absorbance was measured at 655 nm using a microreader.
  • Example 8 Evaluation of the CDC system's efficacy in inhibiting inflammation in colonic epithelial cells
  • the inflammation-inhibiting effect of the CDC system according to the present invention was evaluated by measuring IL-1 ⁇ , a pro-inflammatory cytokine.
  • Caco-2 cells which are colonic epithelial cells, were used.
  • Caco-2 cells were distributed in a 96-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells/well and cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. . After completion of incubation, cells were treated with BAY 11-7082 and C179-CDC-Myd88 at a concentration of 50 ⁇ M and incubated for another 1 hour. Then, each was treated with TNF- ⁇ (1 ng/ml) and cultured for 24 hours. After 24 hours, the level of IL-1 ⁇ in the cell culture medium was measured using the Human IL-1 ⁇ ELISA kit from R&D Systems.
  • the anti-inflammatory efficacy of the CDC system according to the present invention was verified using Raw 264.7 cells, which are mouse macrophages.
  • Raw 264.7 cells were distributed in a 96-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells/well, and cultured in RPMI medium supplemented with 10% fetal bovine serum at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. After completing the culture, BAY 11-7082 and C179-CDC-Myd88 were treated at a concentration of 50 ⁇ M and incubated for another hour. Then, each was treated with TNF- ⁇ (1 ng/ml) and cultured for 24 hours. After 24 hours, IL-1 ⁇ was measured in the cell culture medium using the Human IL-1 ⁇ ELISA kit from R&D Systems.
  • Example 10 Evaluation of the efficacy of the CDC system in a colitis mouse model
  • the anti-inflammatory efficacy of the CDC system according to the present invention was verified in a colitis mouse model.
  • a colitis model was created by inducing colitis in wild-type C57BL/6J mice using Dextran sulfate sodium (DSS).
  • mice 3% DSS was dissolved in the drinking water of the negative control group excluding the normal group and the test group and were ingested for 6 days.
  • the test group was administered the test substance intravenously at 75 mg/kg once a day, at a certain time every day for a total of 10 days.
  • the normal group and the negative control group were administered the same amount of vehicle intravenously for 10 days according to the test substance administration schedule.
  • the visual evaluation (DAI; Disease activity index) results are shown in Figure 10a.
  • DAI Disease activity index
  • weight loss, looseness of stool, degree of hematochezia, and presence of blood in the anus were checked daily to determine changes in DAI score.
  • the DSS group colitis group
  • DSS+CT group In the colitis group administered the CDC system, the DAI score significantly increased (p ⁇ 0.001), and on Days 5, 6, and 8, the DAI score of the DSS+CT group significantly decreased compared to the DSS group (p ⁇ 0.05). This shows that symptoms such as weight loss and bloody stool due to colitis were alleviated to a statistically significant level by administering the CDC system of the present invention.
  • the colon length measurement results are shown in Figure 10b.
  • Colon disease is not only measured by signs such as weight loss, bleeding, and diarrhea accompanied by mucus, but also because it induces shrinkage of the colon, the length of the colon is used as a key indicator to determine the colon protection effect.
  • the length of the large intestine in the NC, DSS, and DSS+CT groups was measured to be 8.85 ⁇ 1.07 cm, 7.32 ⁇ 0.39 cm, and 8.38 ⁇ 0.58 cm, respectively.
  • mice were laparotomized under ether anesthesia and blood was collected from the abdominal vena cava of each individual, and the collected blood was centrifuged at 3,000 rpm for 20 minutes at 4°C to obtain serum.
  • the IL-1 ⁇ in the serum of NC, DSS, and DSS+CT mice was found to be 51.8 ⁇ 5.7 pg/ml, 143.7 ⁇ 72.6 pg/ml, and 73.9 ⁇ 29.6 pg/ml, respectively. .
  • the IL-1 ⁇ level in serum was statistically significantly increased in the DSS group compared to the NC group, and the cytokine level was found to be statistically significantly decreased in the DSS+CT group compared to the DSS group.
  • the above results show that the CDC system of the present invention can effectively suppress the increase in inflammatory cytokines caused by colitis not only in vitro but also in vivo , thereby exerting an anti-inflammatory effect.
  • the entire protein is decomposed by proteasome degradation by ubiquitin in normal cells, and the bound biologically active ingredient does not function, but in inflammatory cells, activated Caspase-1 It was confirmed that the biologically active ingredient maintained its activity by avoiding proteasomal degradation through CRS recognition and cleavage.
  • the excellent effectiveness of the present invention has been clearly confirmed through in vitro as well as in vivo experiments.
  • the CDC system of the present invention improves various colitis symptoms in colitis animal models and prevents and improves colitis by suppressing the level of inflammatory factors. , and therapeutic effects can be achieved.
  • the CDC fusion protein according to the present invention can combine various therapeutic agents and can act specifically on inflammatory cells without affecting normal cells, so it is expected to be useful in the field of prevention and treatment of inflammation-related diseases. do. Furthermore, it was confirmed that when the CDC fusion protein according to the present invention is linked with an inflammatory cell-specific cell-penetrating peptide, the penetration efficiency into inflammatory cells increases and the inflammation suppressing effect is further increased. The CDC fusion protein of the present invention and A better anti-inflammatory effect can be achieved through a combination of cell-penetrating peptides.
  • Table 2 below shows sequence information related to the present invention.
  • the inflammatory cell-specific drug delivery system (CDC fusion protein) according to the present invention is based on a ubiquitin protein and a caspase-1 recognition sequence fusion protein.
  • the entire drug delivery system, including the drug is decomposed by ubiquitin and does not function.
  • the caspase-1 recognition sequence is cleaved, allowing the drug to avoid proteasomal degradation and exert pharmacological activity.
  • the CDC fusion protein according to the present invention can be additionally combined with cell-penetrating peptides, etc., thereby significantly improving the efficiency of drug delivery to target cells. Therefore, the CDC fusion protein according to the present invention is capable of delivering drugs specific to inflammatory cells and can minimize the risk of side effects on normal cells, so it is expected to be useful as a drug delivery vehicle in various inflammatory diseases.

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Abstract

본 발명에 따른 염증세포 특이적 약물전달 시스템 (CDC 융합단백질)은 유비퀴틴 단백질 및 카스파제-1 인식서열 융합단백질에 기반한 것으로서, 정상세포에서는 유비퀴틴에 의해 약물을 포함한 전체 약물 전달 시스템이 분해되어 기능하지 못하지만, 염증세포에서는 카스파제-1 인식서열이 절단됨에 따라 약물이 프로테아솜 분해를 회피하고 약리학적 활성을 발휘할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드 등이 추가로 결합될 수 있어, 타겟세포로의 약물 전달 효율을 더욱 현저하게 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 염증세포 특이적인 약물 전달이 가능하며, 정상세포에 대한 부작용 위험을 최소화할 수 있으므로, 다양한 염증성 질환에서 약물 전달체로서 유용히 활용될 것으로 기대된다.

Description

염증세포에서 특이적으로 작동하는 융합단백질
본 발명은 염증세포 특이적으로 약물을 전달하고, 정상세포에서는 작용하지 않는, 염증세포 특이적 약물 전달 시스템 등에 관한 것이다.
본 발명은 2022년 6월 10일에 출원된 한국특허출원 제 10-2022-0070965 호 및 2023년 6월 8일에 출원된 한국특허출원 제10-2023-0073836호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원들의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
약물 전달 시스템이란 약리학적 활성을 갖는 물질의 세포, 조직, 장기, 및/또는 기관으로의 전달 및 방출을 제어하는 일련의 기술을 의미하는 것으로서, 의약품의 부작용은 최소화하고, 효능 및 효과를 극대화할 수 있도록 제형을 설계하여 약물 치료를 최적화하는 기술을 의미한다. 약물 전달 시스템 개발을 위한 다양한 연구가 진행되고 있으나, 정상세포에 대한 비특이적인 약물 전달, 약물 전달 과정에서 발생하는 세포의 손상 문제, 타겟 세포로 전달된 약물의 활성 상실 등의 문제가 여전히 남아있다. 최근에는 효과적인 세포내 약물 전달을 위해 나노입자 (nanoparticles)와 같은 약물 전달체의 내포작용 (endocytosis)을 응용한 기술이 활용되어 왔지만, 독성, 면역계에서의 빠른 소실로 인한 전달 효율 저하 또는 세포와의 상호 작용으로 인한 입체 장애 (steric hindrance) 등의 문제로 여전히 많은 연구가 필요한 실정이다. 특히, 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서 염증반응이 활성화된 면역세포에만 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물 전달 시스템은 아직까지 개발이 미비하다.
한편, 염증성 질환은 유전적, 환경적 요인으로 인한 염증반응의 과활성으로 유발된 질환을 의미한다. 일반적으로　염증반응은 감염 등의 외부 자극이나 생체 내 대사산물과 같은 내부 자극에 대한 생체조직의 방어기전으로서 전염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine) 및 산화질소(nitric oxide, NO)가 생성되면서 발생한다. 특히 IL-1β, TNF-α, 및 IL-6과 같은 염증성 사이토카인은 다양한 전염성 또는 염증성 질환의 병리학적 진행을 매개하는데 중대한 역할을 한다. 이들 염증성 사이토카인들은 염증반응이 활성화된 다양한 면역세포에 의해 생성되며, 염증 부위로 면역세포를 더욱 모집하여 염증을 더욱 심화시키는데 기여한다. 이들 중 IL-1β및 IL-18의 생성은 복합 단백질 올리고머인 염증소체 (inflammasome)의 활성화에 의해 조절된다. 감염균-연관 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern) 분자 또는 손상-연관 분자 패턴(damage-associated molecular pattern) 분자 등에 의한 TLR의 활성화는 pro-IL-1β또는 pro-IL-18의 발현을 유도하며, 이는 특히 염증세포에서 활성화되는 카스파제-1 (caspase-1)에 의해 처리되어 활성 IL-1β또는 IL-18으로 전환된다. 카스파제-1의 활성화는 NLR (nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing) 단백질, ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) 어댑터 단백질 및 카스파제-1 전구체 (pro-caspase-1)로 구성된 인플라마좀 복합체에 의하여 매개되는데, 따라서 염증반응이 일어나지 않은 정상 면역세포에서는 활성화되지 않고, 염증반응이 일어난 면역세포에서만 활성화 된다.
항염 목적으로 이부프로펜 (ibuprofen), 벤지다민 (benzydamine) 등 다양한 항염제가 사용되고 있으나, 이들 약물은 염증 원인 물질 내지 염증세포에 특이적으로 작용하지 못하므로 전신에서 면역기능 억제를 초래하는 문제가 생기기도 한다. 이에 비교적 안전하고, 장기 섭취가 가능한 천연물 기반의 항염제가 사용되기도 하나, 이들의 효능이 미미하고 생산 비용 및 시간의 효율성이 떨어지는 문제가 있다.
따라서, 염증세포에 특이적으로 약물을 전달하고, 정상세포에서는 약물의 활성을 억제함으로써 비특이적인 약물 전달에 의한 부작용의 문제를 최소화할 수 있는 염증세포 특이적 약물 전달 시스템의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 정상세포에서는 프로테아솜에 의해 분해되어 작용되지 않으면서 염증세포에서만 특이적으로 작용하는 염증세포 특이적 약물 전달 시스템을 제공하는 것을 주요 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명과 관련된 선행기술 문헌은 아래와 같다.
(특허문헌 1) 대한민국 등록특허 제10-2032945호
(비특허문헌 1) Dinarello, C. A. Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory diseases. Blood 117, 3720-32 (2011).
(비특허문헌 2) Barton, G. M. A calculated response: control of inflammation by the innate immune system. J. Clin. Invest. 118, 413-20 (2008).
(비특허문헌 3) Sahoo, M., Ceballos-Olvera, I., del Barrio, L. & Re, F. Role of the inflammasome, IL-1β and IL-18 in bacterial infections. Scientific World Journal. 11, 2037-50 (2011).
본 발명은 유비퀴틴 단백질 및 카스파제-1 인식서열 (Caspase-1 Recognition Sequence, CRS)를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유비퀴틴은 야생형 유비퀴틴 또는 이의 변이체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 유비퀴틴 변이체는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 상기 유비퀴틴 변이체는 야생형 유비퀴틴의 N 말단으로부터 76번째 아미노산이 발린 (V), 아르지닌 (R), 프롤린 (P), 트립토판 (W), 히스티딘 (H), 아이소류신 (I), 리신 (K), 글루타민 (Q), 류신 (L), 아스파테이트 (D), 아스파라진 (N), 타이로신 (Y), 트레오닌 (T), 세린 (S), 페닐알라닌 (F), 알라닌 (A), 시스테인 (C), 글루타메이트 (E), 또는 메티오닌 (M)으로 치환된 것임;
(b) 상기 유비퀴틴 변이체는 야생형 유비퀴틴의 N 말단으로부터 29번째 아미노산이 아르지닌 (R)으로 치환된 것임; 및
(c) 상기 유비퀴틴 변이체는 야생형 유비퀴틴의 N 말단으로부터 48번째 아미노산이 아르지닌 (R)으로 치환된 것임.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 야생형 유비퀴틴은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 유비퀴틴 변이체는 한 개 이상의 변이를 동시에 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 유비퀴틴 단백질은 하나 또는 복수개일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 카스파제-1 인식서열은 활성화된 카스파제-1 단백질에 의해 인식되어 절단되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 카스파제-1 인식서열은 서열번호 21 내지 25 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 유비퀴틴 단백질 및 상기 카스파제-1 인식서열은 링커로 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 융합단백질의 일측 말단 또는 양측 말단에 결합될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 31 내지 47로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 유비퀴틴 단백질, 카스파제-1 인식서열, 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 융합단백질로서, 상기 생물학적 활성 분자는 카스파제-1 인식서열에 결합된 것이고, 유비퀴틴 단백질에는 직접 결합되지 않은 것을 특징으로 하는, 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 결합은 화학적 결합, 링커를 이용한 결합, 또는 펩타이드 결합일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 화합물, 천연물, 반합성 물질 (semi-synthetic drugs), 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 바이러스, 양자점 (quantum dots), 및 형광색소 (fluorochrome)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 융합단백질은 유비퀴틴 단백질, 카스파제-1 인식서열, 및 생물학적 활성 분자 순으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 생물학적 활성 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 카스파제-1 인식서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 생물학적 활성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 배열되어 있는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 융합단백질에 결합된 생물학적 활성 분자는 항염제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 염증성 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 상기 융합단백질의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질의 염증성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 항염제는 염증 억제성 단백질 또는 염증 억제성 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 이외에도 IL-4, IL-6, IL-10, IL-11, IL-13, IL-19, IL-35, IκBα, p50, SV40, c-myc, NLS, NBD, NEMO, p65, Myd88, NF-κB 등 전염증성 단백질의 길항제 (억제제, 저해제 등), 및 전염증성 단백질을 표적으로 하는 항체 또는 이의 기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 항염제는 NF-κB의 발현 또는 활성 억제제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항염제는 NF-κB 신호전달 경로의 억제제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 염증반응이 활성화되지 않은 세포에서는 프로테아솜에 의해 분해될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증세포 또는 염증조직 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다. 즉, 본 발명은 본 발명에 따른 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증세포 또는 염증조직 특이적 약물전달체를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합단백질을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증세포 또는 염증조직 특이적 약물전달 방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 염증세포 또는 염증조직 특이적 약물전달체의 제조를 위한 상기 융합단백질의 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 염증세포 또는 염증조직 특이적으로 생물학적 활성 물질을 전달하기 위한 상기 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 염증세포 특이적 약물전달 시스템 (CDC 융합단백질)은 유비퀴틴 단백질 및 카스파제-1 인식서열 융합단백질에 기반한 것으로서, 정상세포에서는 유비퀴틴에 의해 약물을 포함한 전체 약물 전달 시스템이 분해되어 기능하지 못하지만, 염증세포에서는 카스파제-1 인식서열이 절단됨에 따라 약물이 프로테아솜 분해를 회피하고 약리학적 활성을 발휘할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드 등이 추가로 결합될 수 있어, 타겟세포로의 약물 전달 효율을 더욱 현저하게 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 염증세포 특이적인 약물 전달이 가능하며, 정상세포에 대한 부작용 위험을 최소화할 수 있으므로, 다양한 염증성 질환에서 약물 전달체로서 유용히 활용될 것으로 기대된다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 CDC 융합단백질-코딩 핵산의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 CDC 융합단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 CDC 융합단백질-코딩 핵산의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따른 CDC 융합단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명에 따른 CDC 시스템의 작동을 검증하기 위해, 염증세포의 활성화 및 CDC 융합단백질의 처리 과정을 나타낸 흐름도이다.
도 2b는 본 발명에 따른 CDC 시스템의 작동을 검증하기 위해, 인간 단핵구 세포에 PMA를 처리하여 분화를 유도한 후, 염증을 유발하면서 본 발명의 CDC 융합단백질의 처리 여부에 따른 Caspase-1 활성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 CDC 시스템의 정상 면역세포 및 염증세포에서의 작용기작을 확인하기 위해, 면역세포에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도한 후 CDC 융합단백질을 처리하여 CDC 융합단백질의 DsRed 형광 신호를 공초점 현미경으로 촬영한 이미지이다 (Bortezomib, 프로테아솜 분해 저해제; Ac-YVAD-CHO, Caspase-1 저해제; 이하 동일).
도 4는 본 발명에 따른 CDC 시스템의 정상 면역세포 및 염증세포의 작동기작을 확인하기 위해, 면역세포에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도한 후 CDC 융합단백질을 처리하여 CDC 융합단백질의 DsRed 형광 신호를 유세포 분석법으로 확인한 결과이다.
도 5는 CPP 및 NF-κB 신호전달 경로의 저해 펩타이드 서열이 결합된 융합단백질을 염증세포에 처리한 후, 상기 융합단백질에 의한 NF-κB 활성 저해 효능을 평가한 결과를 나타낸다 (BAY 11-7082, NF-κB 저해 화합물; NLS, NBD, NEMO-LZ, p65 phosphorylation, 및 Myd88, NF-κB 신호전달 경로 저해 펩타이드).
도 6은 대식세포 특이적으로 투과되는 세포투과성 펩타이드를 탐색하기 위해, 대식세포에 FITC가 결합된 CPP 후보군들을 처리한 후 세포 내 형광을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 세포 투과성 펩타이드의 결합에 따른 CDC 시스템의 효능을 확인하기 위해, NF-κB 저해 펩타이드가 결합된 CDC 시스템에 TAT 또는 세포 투과성 펩타이드 (C179)를 결합시킨 후 염증세포에 투여하여 세포의 NF-κB 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 CDC 시스템의 대장 상피세포에서의 염증 억제 효능을 평가하기 위해, 대장 상피세포에 염증반응을 유도한 후 세포 투과성 펩타이드 (C179)가 결합된 CDC 시스템 처리에 따른 IL-1β의 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 CDC 시스템의 마우스 대식세포에서의 염증 억제 효능을 평가하기 위해, 마우스 대식세포에 염증반응을 유도한 후 세포 투과성 펩타이드 (C179)가 결합된 CDC 시스템 처리에 따른 IL-1β의 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10a 내지 10d는 본 발명에 따른 CDC 시스템의 대장염 치료 효과를 확인하기 위해 DSS로 대장염을 유도한 동물모델에 본 발명의 일 실시예에 따른 CDC 시스템을 처리한 후, 대장염 증상 개선 효과를 육안으로 평가한 결과 (도 10a), 대장 길이를 측정한 결과 (도 10b), 조직병리학적 평가를 수행한 결과 (도 10c), 그리고 혈청 내 염증성 사이토카인의 수준을 측정한 결과 (도 10d)를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 CDC 시스템의 정상세포 및 염증세포에서의 작용기작을 비교하여 나타낸 그림이다.
본 발명은 정상세포에서는 약물을 포함한 전체 약물 전달 시스템이 분해되어 작용하지 못하지만, 염증반응이 활성화된 세포에서는 약물이 분해되지 않고 약리학적 활성을 발휘할 수 있게 하는 약물 전달 시스템인 “CDC (CPP-Degron-Caspase-1 recognition sequence) 융합단백질 (CDC fusion proteins)”을 제공하는 것을 주요 목적으로 한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 유비퀴틴 단백질 및 카스파제-1 인식서열 (Caspase-1 Recognition Sequence, CRS)이 융합된 융합단백질에 기초한 것으로서, 정상세포에서는 유비퀴틴 단백질에서 폴리유비퀴틴화 (polyubiquitination)가 이루어짐에 따라 전체 CDC 융합단백질이 프로테아솜으로 이동하여 분해되지만 (프로테아솜 분해), 염증반응이 활성화되어 염증소체 (Iinflammasome)가 형성된 세포 (바람직하게는, 면역세포)에서는 카스파제-1 (Caspase-1)가 활성화되어 CRS를 인식 및 절단하므로, 유비퀴틴 단백질로부터 방출된 약물이 분해되지 않고 정상적인 구조 및 활성을 유지하여 약리효과를 발휘할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 CDC 시스템은 세포 투과성 펩타이드를 추가로 포함함으로써 타겟세포 (염증세포)로의 전달 효율이 더욱 증가할 수 있으며, 결과적으로 염증 억제 효능이 더욱 증진될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 정상세포에 대한 비특이적 약물 전달의 가능성은 최소화하고 염증세포 특이적인 약물 전달이 가능한 바, 다양한 염증성 질환의 약물 전달 시스템으로 활용될 것으로 기대된다.
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 서술한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자 (삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A (Ala), 알라닌; C (Cys), 시스테인; D (Asp), 아스파르트산; E (Glu), 글루탐산; F (Phe), 페닐알라닌; G (Gly), 글라이신; H (His), 히스티딘; I (IIe), 아이소류신; K (Lys), 라이신; L (Leu), 류신; M (Met), 메티오닌; N (Asn), 아스파라진; O (Ply), 피롤라이신; P (Pro), 프롤린; Q (Gln), 글루타민; R (Arg), 아르지닌; S (Ser), 세린; T (Thr), 트레오닌; U (Sec), 셀레노시스테인; V (Val), 발린; W (Trp), 트립토판; 및 Y (Tyr), 타이로신.
본 발명은 유비퀴틴 단백질 및 카스파제-1 인식서열 (Caspase-1 Recognition Sequence, CRS)를 포함하는 융합단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 명세서 전반에서, 상기 융합단백질은 “CDC 융합단백질 (CDC fusion protein)”으로 지칭될 수 있다. 상기 CDC 융합단백질은 CDC 단백질, CDC 시스템 등의 명칭으로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 일 구현에에서, 상기 융합단백질은 약물 등의 생물학적 활성 분자가 더 결합될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드가 더 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, “펩타이드 (peptide)”혹은 “단백질 (protein)”이란 아미노산의 중합체로서, 보통 소수의 아미노산이 연결된 형태를 펩타이드라 하며, 많은 아미노산이 연결되면 단백질이라 부른다. 펩타이드 또는 단백질 구조에서 아미노산 간의 연결은 아미드 (amide) 결합 또는 펩타이드 결합으로 이루어져 있다. 펩타이드 결합이란 카르복실기 (-COOH)와 아미노기(-NH2) 사이에 물(H2O)이 빠져나가고 -CO-NH- 형태를 이루는 결합을 지칭한다.
본 발명에 있어서, "융합단백질"은 2종 이상의 단백질이 인위적으로 연결된 형태의 단백질을 의미한다. 이 때 상기 2종 이상의 단백질은 서로 직접 연결될 수도 있고, 기타 매개체 (예를 들어, 링커)를 통해 연결될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 융합단백질은 유비퀴틴 단백질 및 카스파제-1 인식서열이 연결 (결합, 융합)된 형태의 단백질을 의미한다. 상기 융합단백질은 각각의 융합 대상이 결정된 후 화학적으로 합성하거나 또는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 융합단백질은 유비퀴틴 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 카스파제-1 인식서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 생물학적 활성 분자; 및/또는 세포 투과성 펩타이드를 연결한 융합 유전자를 임의의 발현 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한 후, 상기 재조합 벡터를 세포 발현 시스템에서 발현시켜 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서, “유비퀴틴 (ubiquitin)”은 기질 단백질에 결합하여 기질 단백질의 프로테아솜 분해 (proteasome degradation)를 유도하는 단백질을 지칭한다. 본 발명에 따른 유비퀴틴 단백질은 E3 라이게이즈 (ligase)에 폴리유비퀴틴화 (polyubiquitination)가 일어나는 부위로 작용하며, 폴리유비퀴틴화된 융합단백질, 즉 CDC 융합단백질은 프로테아솜에 의해 전체가 분해된다. 본 발명에 있어서, 상기 유비퀴틴은 야생형 (즉 자연형 또는 천연형)의 유비퀴틴은 물론 이의 변이체를 포함하는 것으로서, 결합된 단백질의 프로테아솜 분해를 일으킬 수 있는 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 유비퀴틴 변이체는 한 개 이상의 변이를 동시에 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 유비퀴틴은 공지된 단백질로서, Uniprot 등의 공공 단백질 데이터베이스에서 서열 정보 등을 확인할 수 있다 (참조번호: P0CG47, P0CG48, P62979, 및 P62987 등). 또한 일부 아미노산 서열이 변형된 유비퀴틴 변이체가 공지되어 있다. 상기 유비퀴틴 변이체는 유비퀴틴의 기능 (폴리유비퀴틴화 및 프로테아솜 분해 유도)을 수행할 수 있는 것이라면 제한 없이 본 발명에 적용 가능하다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 유비퀴틴 변이체는 야생형 유비퀴틴의 N 말단으로부터 76번째 아미노산이 발린 (V), 아르지닌 (R), 프롤린 (P), 트립토판 (W), 히스티딘 (H), 아이소류신 (I), 리신 (K), 글루타민 (Q), 류신 (L), 아스파테이트 (D), 아스파라진 (N), 타이로신 (Y), 트레오닌 (T), 세린 (S), 페닐알라닌 (F), 알라닌 (A), 시스테인 (C), 글루타메이트 (E), 또는 메티오닌 (M) 으로 치환된 것일 수 있다. 더욱 구체적으로는, 본 발명에 따른 유비퀴틴 변이체는 야생형 유비퀴틴의 N 말단으로부터 76번째 아미노산인 글라이신 (G)이 상기의 기타 아미노산 중 하나로 치환된 것일 수 있다. 즉, 상기 유비퀴틴 변이체는 야생형의 유비퀴틴 서열에서 G76V, G76R, G76P, G76W, G76H, G76I, G76K, G76Q, G76L, G76D, G76N, G76Y, G76T, G76S, G76F, G76A, G76C, G76E, 또는 G76M 치환 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 유비퀴틴 변이체는 야생형 유비퀴틴의 N 말단으로부터 29번째 아미노산 및/또는 48번째 아미노산이 아르지닌 (R)으로 치환된 것일 수 있다. 더욱 구체적으로는, 본 발명에 따른 유비퀴틴 변이체는 야생형 유비퀴틴의 N말단으로부터 29번째 아미노산인 리신 (K) 및/또는 48번째 아미노산인 리신 (K)이 아르지닌 (R)으로 치환된 것일 수 있다. 즉, 상기 유비퀴틴 변이체는 야생형의 유비퀴틴 서열에서 K29R 및/또는 K48R 치환 돌연변이를 포함할 수 있다. 유비퀴틴 변이체에 관한 정보는 참조문헌 [Nature Communications volume 10, Article number: 2013 (2019)] 및 참조문헌 [J Biol Chem. 1995 Jul 21;270(29):17442-56]에서 확인 가능하다. 한편, 상기 야생형 유비퀴틴 서열은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 유비퀴틴 변이체는 상술한 변이 (돌연변이) 중 하나 이상을 동시에 포함할 수 있다. 일 예로, G76V 치환 돌연변이를 갖는 유비퀴틴 변이체는 N 말단으로부터 29번째 아미노산이 R로 치환된 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 하나 이상의 유비퀴틴 단백질 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 즉, 유비퀴틴 단백질 또는 이의 변이체는 하나의 CDC 융합단백질 내에 반복된 형태로 존재할 수 있다. 이 때, 상기 유비퀴틴 단백질 또는 이의 변이체는 동일한 것이 반복된 형태로 존재할 수 있고, 서로 다른 종류의 유비퀴틴 단백질 (즉, 서로 다른 서열을 갖는 유비퀴틴 단백질 또는 이의 변이체)가 함께 존재할 수 있다. 또한, 융합단백질이 복수개의 유비퀴틴 단백질을 포함하는 경우, 상기 유비퀴틴 단백질들은 서로 연속적으로 융합 또는 연결된 것일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, G76V 치환 돌연변이를 갖는 유비퀴틴 변이체는 2개 또는 3개가 반복된 형태로 융합단백질에 포함될 수 있다. 상기 복수개의 유비퀴틴 단백질은 2개 내지 10개, 2개 내지 8개, 2개 내지 6개, 2개 내지 5개, 2개 내지 4개, 2개 내지 3개, 또는 2개의 유비퀴틴 단백질이 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
유비퀴틴 변이체는 돌연변이의 종류에 따라 타겟 단백질의 분해 속도 등이 달라질 수 있다. 따라서, 당업자는 본 명세서의 기재 및 당업계의 기술상식을 바탕으로, CDC 융합단백질에 융합하고자 하는 생물학적 활성분자 (약물 등)의 종류나 특성, 대상 질환의 종류 등을 고려하여 적절한 유비퀴틴 변이체를 선택함으로써 상기 생물학적 활성분자의 전달 효율 내지 활성도를 조절할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 유비퀴틴 단백질은 서열번호 13 또는 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 13 또는 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 아미노산 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 즉, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 이를 구성하는 폴리펩타이드의 작용성 등가물, 예를 들어, 폴리펩타이드의 일부 아미노산 서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 상기 폴리펩타이드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 유비퀴틴 단백질은 서열번호 13 또는 14로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리펩타이드의 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “카스파제-1 인식서열 (Caspase-1 Recognition Sequence, CRS)”은 카스파제-1 단백질이 인식하여 절단하는 서열을 의미한다. 카스파제 (Caspase)는 세포사멸 및 염증에 관여하는 네트워크의 핵심 프로테아제 (protease)로, 구체적인 종류로는 세포자멸사 (apoptosis)에 관여하는 카스파제-3, 카스파제-9, 및 염증에 관여하는 카스파제-1, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-12 등이 있다. 이중 카스파제-1은 정상세포에서는 활성화되지 않지만 염증반응이 유도된 세포에서는 다중백질 올리고머인 염증소체 (Inflammasome)에 의해 활성화되어 다양한 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-18 등)의 성숙을 일으킨다. 본 발명에 따른 카스파제-1 인식서열은 활성화된 카스파제-1에 의해 인식 및 절단되므로, 상기 카스파제-1 인식서열을 통해 유비퀴틴에 연결되어 있던 생물학적 활성 분자는 유비퀴틴으로부터 방출되어 프로테아솜 분해를 회피할 수 있다. 반면, 정상세포에서는 카스파제-1의 활성이 낮아 프로테아제 기능을 수행할 수 없으므로 카스파제-1 인식서열이 온전하게 유지되며, 따라서 카스파제-1을 통해 유비퀴틴에 연결되어 있는 생물학적 활성 분자는 결국 프로테아솜에 의해 분해된다.
본 발명에 따른 카스파제-1 인식서열은 구체적인 서열에 제한되지 않고, 카스파제-1에 의해 인식되어 절단되는 서열이라면 모두 포함될 수 있으나, 바람직하게는 WEHD (서열번호 21), YVHD (서열번호 22), YVAD (서열번호 23), 및 FESD (서열번호 24) 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 카스파제-1 인식서열은 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 카스파제-1의 타겟 서열은 당업계에 공지되어 있으며 (예를 들어, Cell Death and Differentiation (2017) 24, 1380-1389 참조), 공지된 카스파제-1 인식서열이 본 발명에 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 융합단백질, 즉, CDC 융합단백질은 각 구성이 직접 연결된 것일 수 있으며, 또는 기타 매개체 (예컨대, 링커)를 통해 연결된 것일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 융합단백질은 유비퀴틴 단백질 및 카스파제-1 인식서열이 링커로 연결된 것일 수 있으며, 생물학적 활성 분자 역시 카스파제-1 인식서열에 링커로 연결된 것일 수 있고, 세포 투과성 펩타이드 또한 링커를 통해 유비퀴틴 서열에 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, “링커 (linker)”는 유비퀴틴 단백질, 카스파제-1 인식서열, 및/또는 생물학적 활성 분자를 연결하여 융합단백질 (바람직하게는, 펩타이드 또는 단백질), 즉 CDC 융합단백질을 제조하는 경우에 이들 단백질의 구조적 유연성을 증가시켜 연결된 각 단백질의 활성이 증진될 수 있도록 단백질 및 단백질 사이에 삽입되는 연결 매개체를 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 링커는 화학적 링커일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 링커는 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 링커는 면역반응을 최소화할 수 있는 것이라면 구체적인 종류나 길이에 제한이 없다. 예를 들어, 상기 링커는 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 본 발명에 따른 링커는 공지된 링커라면 제한 없이 적용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 링커는 GS 링커일 수 있다. 상기 GS 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 ggcagc로 표시될 수 있다.
본 발명에 따른 융합단백질은 생물학적 활성 분자를 포함하는 것으로서, 상기 생물학적 활성 분자는 카스파제-1 인식서열에 결합된 것이고, 유비퀴틴 단백질에는 직접 결합되지 않은 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 융합단백질은 유비퀴틴 단백질, 카스파제-1 인식서열 (CRS), 및 생물학적 활성 분자 순으로 연결된 것으로서 (Ub-CRS-생물학적 활성 분자), 상기 생물학적 활성 분자는 카스파제-1 인식서열을 경유하여 유비퀴틴 단백질에 연결된 것을 특징으로 한다. 따라서, 염증반응이 일어나지 않은 정상세포에서는 카스파제-1 인식서열이 절단되지 않으므로, 카스파제-1 인식서열을 통해 유비퀴틴에 연결된 생물학적 활성 분자가 프로테아솜에 의해 분해되지만, 염증반응이 일어난 세포에서는 카스파제-1 인식서열이 카스파제-1에 의해 절단됨에 따라 생물학적 활성 분자가 유비퀴틴으로부터 방출되어 프로테아솜 분해를 회피할 수 있다.
또한, 상기 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 상기 융합단백질이 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 경우, 상기 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드 (CPP), 유비퀴틴 단백질 (Ub), 카스파제-1 인식서열 (CRS), 및 생물학적 활성 분자 순으로 연결된 것이거나 (CPP-Ub-CRS-생물학적 활성 분자); 유비퀴틴 단백질, 카스파제-1 인식서열, 생물학적 활성 분자, 및 세포 투과성 펩타이드 순으로 연결된 것이거나 (Ub-CRS-생물학적 활성 분자-CPP); 세포 투과성 펩타이드, 유비퀴틴 단백질, 카스파제-1 인식서열, 생물학적 활성 분자, 및 세포 투과성 펩타이드 순으로 연결된 것일 수 있으나 (CPP-Ub-CRS-생물학적 활성 분자-CPP), 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “염증세포”는 염증반응이 활성화된 세포를 의미하며, 상기 세포는 구체적인 종류에 제한되는 것은 아니나 바람직하게는 호중구 (neutrophils); 호염구(basophils); 호산구 (eosinophils); 단핵구 (monocyte); 대식세포 (macrophage); 수지상세포 (dendritic cell); 형질세포 (plasma cells); 조직구 (histiocytes); CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, B 세포 등의 림프구 등으로부터 선택될 수 있다. 상기 세포는 예시를 언급한 것에 불과하며, 염증 촉진 인자를 생성하여 염증을 일으킬 수 있는 세포라면 제한 없이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 염증세포는 염증소체 (inflmmasome)이 형성 및 활성화된 것으로서, 더욱 바람직하게는 카스파제-1이 활성화된 세포를 의미한다.
본 명세서에 있어서, “생물학적 활성 분자”란 바람직하게는 생물학적 또는 약학적 활성을 가지는 물질들을 총칭하며, 이는 세포 내 (세포질 또는 핵 내)로 투과되어 생리활성조절에 관여하거나 약리효과를 발현할 수 있는 것 또는 운반되어 작용해야 하는 세포 내, 조직 내, 세포간질, 혈액 등 다양한 생체 내 부위에서도 생물학적 활성을 갖는 물질을 의미한다. 이러한 생물학적 활성 분자는 용어 “거대분자”와 호환적으로 사용될 수 있다.
상기 생물학적 활성 분자는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 화합물, 천연물, 반합성 물질 (semi-synthetic drugs), 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 바이러스, 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome), 및 이들의 복합체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 생물학적 활성 분자는 프로테아솜에 의해 분해될 수 있는 펩타이드, 단백질, 및 당단백질 등으로서, 정상세포에서는 프로테아솜에 의해 분해되어 생물학적 활성을 상실하는 것을 특징으로 한다.
상기 단백질의 비-제한적인 예시에는 성장인자, 효소, 핵산분해효소, 전사인자, 항원성 펩타이드, 항체 (예컨대, 단일클론, 키메라 (chimeric), 인간화 (humanized) 항체 등), 항체 단편, 호르몬, 운반 단백질, 면역글로불린, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호 (signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단 (transmembrane) 단백질, 내부 (internal) 단백질, 외부 (external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질, 및 프리온 (prions) 등이 포함된다. 상기 핵산분해효소에는 CAS9 (CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CAS variants, Cfp1 (CxxCfinger protein-1), ZEN (Zinc-finger nucleases), 및 TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) 등이 포함된다.
상기 핵산의 비-제한적인 예시에는 DNA, RNA, ASO (Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA (microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA (small interfering RNA; siRNA), 앱타머 (aptamer), LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), 및 모폴리노 (morpholino) 등이 포함된다.
상기 화합물의 비-제한적인 예시에는 치료 약물, 독성 화합물, 및 화학적 화합물 등이 포함된다. 상기 "약물"은 질병, 상처 또는 특정 증상을 완화, 예방, 치료 또는 진단하기 위한 물질을 포함하는 광범위한 개념이다. 즉, 본 발명에 따른 융합단백질은 질병, 특히 염증성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 전달체로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 약물은 펩타이드 내지 단백질 (즉, 치료 펩타이드 또는 치료 단백질)이다.
이 밖에도, 본 발명의 생물학적 활성 분자에는 콜레스테롤, 화학요법제 (chemotherapeutics), 비타민, 보조인자 (co-factors), 2,5-A 키메라 (chimeras), 알로자임 (allozymes), 앱타머 (aptamers), 폴리아민 (polyamines), 폴리아미드 (polyamides), 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에테르와 같은 중합체의 약물동태학 (pharmacokinetics) 및/또는 약동학 (pharmacodynamics)을 조절할 수 있는 분자 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 융합단백질은 펩타이드와 물질이 단순히 혼합 (mixing)된 것, 펩타이드와 물질이 혼합되어 형성된 것, 또는 이들이 화학적 결합 등에 의해 연결되거나 컨쥬게이션되어 생성된 것을 모두 포함한다. 또한, 상기 융합단백질은 물리적 결합, 화학적 결합, 공유 결합, 비공유 결합, 펩타이드 결합, 또는 자기조립화로 연결되거나, 매개체 (예를 들어, 링커)를 이용하여 통합된 또는 융합된 형태로 연결될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 융합단백질은 생물학적 활성 분자와 펩타이드 결합으로 연결된 형태를 가지는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 화학적 결합은 이황화 결합, 디아민 결합, 황화-아민 결합, 카르복시-아민 결합, 에스테르 결합, 디셀레나이드 결합, 말레이미드 결합, 티오에스테르 결합, 및 티오에테르 결합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 융합단백질 (즉, 유비퀴틴, 카스파제-1 인식서열, 및/또는 생물학적 활성분자가 연결된 것)의 일측 말단 또는 양측 말단에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, “세포 투과성”이란, 물질이 세포 (막)를 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미한다. 본 명세서에 있어서, “세포막 (cell membrane)”이란 세포외 공간으로부터 세포 또는 세포 집단을 분리하는 지질-함유 장벽 (lipid-containing barrier)을 지칭한다. 세포막은 원형질막, 세포벽, 세포내 소기관 (organelle) 막, 예컨대 미토콘드리아막, 핵막 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “세포 투과성 펩타이드 (cell penetrating peptide, CPP)”란 세포 투과성을 갖는 펩타이드로서, in vitro 및/또는 in vivo 에서 운반 대상 (cargo)을 세포 내로 전달하는 능력을 가진 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 특히 면역세포에 대한 투과도가 높은 세포 투과성 펩타이드 일 수 있다. 예컨대, 상기 세포 투과성 펩타이드는 대식세포에 대해 높은 세포 투과능을 보이는 것일 수 있다.
본 명세서에서, "운반 대상 (cargo)"은 세포 투과성 펩타이드와 결합하여 세포 내로 이동할 수 있는 물질을 모두 포함하며, 모든 종류의 생물학적 활성 분자가 포함될 수 있다. 상기 운반 대상은, 예를 들어 세포 투과 효율을 높이길 원하는 모든 물질, 구체적으로 약물, 화장품 또는 건강 식품의 유효 물질, 더 구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않은 물질, 보다 더 구체적으로 단백질, 핵산, 펩타이드, 미네랄, 포도당을 예로 들 수 있는 당, 나노 입자, 생물학적 제제, 바이러스, 조영물질 또는 기타 화학 물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 운반 대상은 본 발명에 따른 융합단백질, 즉, CDC 융합단백질이다. 즉, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 융합단백질의 말단에 결합하여 융합단백질의 염증세포로의 전달 효율을 더욱 증진시킨다. 즉, 세포 투과성 펩타이드가 추가로 연결된 융합단백질은 대조군과 비교하여 염증세포에 대한 투과 활성이 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높은, 및/또는 0.5배, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배 또는 그 이상 증가할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 하기의 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것으로서, 다음의 특징을 만족하는 것일 수 있다:
[일반식 I]
A'-KIITILI-B'
상기 일반식에서, A'는 존재하지 않거나 1 내지 8개 아미노산이 연결된 것이고,
B'는 존재하지 않거나 1 내지 15개 아미노산이 연결된 것이며,
상기 펩타이드는 7 내지 25개 아미노산으로 이루어짐.
바람직하게는, 상기 세포 투과성 펩타이드는 양친매성 (amphipathic)일 수 있다. 또한, 상기 세포 투과성 펩타이드는 전부 또는 일부가 알파-헬릭스 구조를 갖는 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 A'를 구성하는 1 내지 8개의 아미노산은 각각 독립적으로 라이신, 알라닌, 아이소류신, 또는 타이로신일 수 있으며, 상기 B'를 구성하는 1 내지 15개의 아미노산은 각각 독립적으로 라이신, 류신, 또는 아이소류신일 수 있다.
가장 바람직하게는, 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 31 내지 47로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 하기의 일반식 II로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것으로서, 다음의 특징을 만족하는 것일 수 있다:
[일반식 II]
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9-R10-R11-R12-R13-R14
상기 일반식에서, R14는 아르기닌 (R), 프롤린 (P), 라이신 (K), 또는 아이소류신 (I)이고;
R1 내지 R14 중 하나 이상이 프롤린 (P)이며;
R1 내지 R14 중 아르기닌 (R)인 것은 1점, 라이신 (K)인 것은 0.5점으로 지정하여 합산하였을 때 R1 내지 R14는 전체로서 6.5점 이상이고;
상기 펩타이드는 발린 (V), 류신 (L), 및 아이소류신 (I)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함함.
바람직하게는, 상기 세포 투과성 펩타이드는 양이온성일 수 있다. 또한, 상기 세포 투과성 펩타이드는 그 전부 또는 일부가 알파-헬릭스 구조를 갖는 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 일반식 II로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 더 만족할 수 있다:
(a) 상기 일반식에서, R5-R6은 VI, KR, RL, KK, LR, RA, RK, 및 KQ로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 연속된 아미노산임;
(b) R9 및 R10은 각각 독립적으로 아르기닌 (R), 라이신 (K), 알라닌 (A), 류신 (L), 히스티딘 (H), 또는 W임;
(c) R2는 프롤린 (P), 류신 (L), 아르기닌 (R), 라이신 (K), 발린 (V), 또는 알라닌 (A)임;
(d) 상기 일반식에서, R4는 라이신 (K), 류신 (L), 아르기닌 (R), 또는 아이소류신 (I)임; 및
(e) 상기 펩타이드는 글루탐산 (E), 글라이신 (G), 및 타이로신 (Y)을 포함하지 않음.
바람직하게는, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 대식세포 등 면역세포에서 특히 투과능이 높은 세포 투과성 펩타이드일 수 있다 (즉, 면역세포 특이적 세포 투과성 펩타이드). 상기 면역세포는 호중구, 호산구, 호염구, 비만 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 림프구 (B 세포 및 T 세포) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
더욱 바람직하게는, 상기 일반식 II로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 31 내지 47로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 31 내지 47로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포 투과성 펩타이드는 특히 면역세포에서 세포 투과능이 우수한 것으로서, 서열번호 31 내지 47로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 31 내지 47로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 Cat.16 (C16) 또는 Cat.179 (C179)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포 투과성 펩타이드는 1 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 또는 1개 내지 2개가 연속적으로 연결되어 생물학적 활성 분자의 일측 또는 양측 말단에 결합할 수 있으며, 상기 결합은 화학적 결합, 링커를 이용한 결합, 또는 펩타이드 결합일 수 있다.
본 발명의 범위에는 상기 세포 투과성 펩타이드의 유도체 및 유사물 (mimetics, 또는 peptidomimetics)가 포함된다. 본 명세서에 있어서, “유도체 (derivative)”란, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 세포 투과성 펩타이드의 일부를 변화시켜 얻어지는 유사한 펩타이드를 총칭하며, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것, 하나 이상의 아미노산이 추가된 것, 하나 이상의 아미노산이 결실된 것, 또는 펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 등)을 융합시키는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 유도체는 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드의 기능 또는 특성 (예를 들어, 세포 투과성)이 유지되거나, 증가하거나, 또는 감소될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 유도체는 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드로서의 특성을 유지하면서 하나 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 상기 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 (amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 보전성 또는 반-보전성 치환으로서, 지방족 측쇄를 가지는 글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신이 서로에 대하여 치환될 수 있으며; 비교적 짧은 측쇄를 가지고 있는 글라이신 및 알라닌이 서로에 대하여 치환될 수 있으며; 소수성인 더 큰 지방족 측쇄를 가지고 있는 발린, 류신, 및 아이소류신이 서로에 대하여 치환될 수 있으며; 방향족 측쇄를 가지는 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판이 서로 치환될 수 있으며; 염기성 측쇄를 가지는 라이신, 아르지닌, 및 히스티딘이 서로 치환될 수 있으며; 산성 측쇄를 가지는 아스파테이트 및 글루타메이트가 서로 치환될 수 있으며; 황 함유 측쇄를 가지는 시스테인 및 메티오닌이 서로 치환될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다 (즉, 상기 재조합 벡터를 포함하는 세포). 즉, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 카스파제-1 인식서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및/또는 생물학적 활성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 상기 각 폴리뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 링커 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “재조합 벡터 (recombinant vector)”란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 목적 단백질 (본 발명에서는, 유비퀴틴, 카스파제-1 인식서열, 및/또는 생물학적 활성 분자가 연결된 융합단백질, 즉, CDC 융합단백질)을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 “벡터”는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있으며, “복제 단위”란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.
본 발명에 따른 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 박테리아 발현 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 플라스미드 벡터 또는 박테리아 발현 벡터이다. 본 발명자들은 구체적인 실시예에서 pET26b 벡터를 사용하였다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터 (promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리히스티딘 태그 (최소 5개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 신호 펩타이드 (signal peptide) 유전자, 소포체 잔류 신호 펩타이드 (endoplasmic reticulum retention signal peptide), 클로닝 사이트 (cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있고, 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터에서 상기 각 유전자들의 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된 (operatively linked)"은 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
상기 재조합 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우, 벡터가 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 태그용 유전자로는, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그 (폴리히스티딘 태그), Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터를 목적하는 세포 내로 도입시키기 위해, 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산 (DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 생물학적 활성 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 즉, 이 때 생물학적 활성 분자는 펩타이드, 단백질, 당단백질 등으로서, RNA 중합효소가 재조합 벡터의 전사를 개시할 때 함께 전사되어 발현될 수 있는 것이 바람직하다.
또한, 상기 재조합 벡터는 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
상기 유비퀴틴을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 카스파제-1 인식서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 생물학적 활성분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및/또는 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 벡터 내에서 서로 연결된 상태로 존재하여 각 유전자가 코딩하는 단백질이 서로 연결된 융합단백질의 형태로 발현될 수 있다. 상기 각 폴리뉴클레오티드는 링커 등을 통해 서로 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유비퀴틴을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하거나, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 카스파제-1 인식서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하거나, 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 염기서열을 포함하거나, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그러나 상기 유비퀴틴 또는 카스파제-1 인식서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 구체적인 서열이 공지되어 있으므로 당업자는 적절한 서열을 선택하여 본 발명에 따른 융합단백질을 제조할 수 있다. 또한, 본 명세서에 세포 투과성 펩타이드의 구체적인 아미노산 서열들이 공지되어 있으므로 당업자는 당업계의 기술상식 및 본 명세서의 기재를 기초로 상기 세포 투과성 펩타이드를 합성하기 위한 적절한 핵산 서열을 구현할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 8 내지 10으로 표시되는 염기서열을 포함하거나, 서열번호 8 내지 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 특정 서열번호로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 해당 염기서열에만 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 염기서열의 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 본 발명에 개시된 폴리뉴클레오티드는 특정 서열번호로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 재조합 벡터에서 카스파제-1 인식서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 생물학적 활성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 사이에 배열된다. 즉, 상기 재조합 벡터에서 생물학적 활성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 직접 연결되지 않는 것이 바람직하다.
가장 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 카스파제-1 인식서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 생물학적 활성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 배열된 것일 수 있다. 이 때, 세포 투과성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 방향 및/또는 상기 생물학적 활성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 방향에 위치할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이로부터 발현된 융합단백질은, 유비퀴틴 단백질 및 생물학적 활성 분자의 사이에 카스파제-1 인식서열이 존재하므로, 염증세포에서 카스파제-1에 의해 카스파제-1 인식서열이 절단됨에 따라 생물학적 활성 분자가 유비퀴틴 단백질로부터 분리됨으로써 프로테아솜 분해를 회피할 수 있다. 반면 정상세포에서는 상기 생물학적 활성 분자가 카스파제-1 인식서열을 통해 유비퀴틴 단백질에 의해 연결되므로 프로테아솜에 의해 전체 융합단백질이 분해된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 융합단백질에 결합된 생물학적 활성 분자는 항염제, 즉, 염증 억제 활성을 가진 생물학적 활성 분자이다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 즉, 항염용 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 융합단백질에 결합된 생물학적 활성 분자는 항염제이다.
본 발명에 있어서, “염증성 질환”은 염증과 관련된 공지된 질환이 모두 포함될 수 있으며, 염증을 억제함으로써 증상이 개선되거나 치료 효과가 나타날 수 있는 질환을 포함하는 개념이다. 예를 들어, 염증성 사이토카인의 수준을 감소시킴으로써 증상이 개선될 수 있는 질환도 포함된다. 상기 염증성 질환은 구체적인 종류에 제한되는 것은 아니나, 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 염증성 피부질환, 알레르기성 질환, 위장관염, 대장염, 크론씨 질환(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게릭 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염 (테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury), 및 기관지 폐 형성장애(Broncho-pulmonary dysplasia) 등으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항염제는 염증 억제 활성을 갖는 물질이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항염제는 염증 억제 활성을 갖는 단백질, 펩타이드, 항체 등 프로테아솜에 의해 분해될 수 있는 물질일 수 있다. 따라서, 상기 항염제를 포함하는 융합단백질은 염증반응이 활성화되지 않은 정상세포에서는 프로테아솜에 의해 분해되어 작용할 수 없다. 구체적으로, 상기 항염제는 당업계에 공지된 염증 억제성 단백질, 염증 억제성 펩타이드 등을 제한 없이 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 항염제는 구체적으로 IL-4, IL-6, IL-10, IL-11, IL-13, IL-19, IL-35, IκBα, p50, SV40, c-myc, NLS, NBD, NEMO, p65, Myd88, NF-κB 등 전염증성 단백질의 활성 또는 발현 억제제 (저해제, 길항제 등), 혹은 상기 전염증성 단백질을 표적으로 하는 항체 또는 이의 기능성 단편 등을 예로 들 수 있으나, 구체적인 종류로 한정되는 것은 아니며, 염증 억제 활성을 갖는 펩타이드 또는 단백질이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 전염증성 단백질은 염증을 촉진하는 단백질로서, 구체적으로는 전염증성 사이토카인, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-12, IL-17, IL-18, INF-γ, NLS, NBD, NEMO, p65, 및 Myd88 등을 예로 들 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 항염제는 NF-κB의 발현 또는 활성 억제제일 수 있다. 혹은, 상기 항염제는 NF-κB 신호전달 경로의 억제제일 수 있다. 상기 NF-κB 신호전달 경로의 억제제는 구체적인 종류로 한정되는 것은 아니나, NLS, NBD, NEMO, p65, 및/또는 Myd88의 발현 또는 활성 억제제로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증세포 또는 염증조직 특이적 약물 전달용 조성물, 즉 약물전달체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 융합단백질에 결합된 생물학적 활성 분자는 항염제, 즉, 염증 억제 활성을 가진 생물학적 활성 분자이다. 즉, 본 발명에 따른 약물 전달용 조성물은 그 유효성분인 융합단백질이 정상세포 내에서는 분해되어 항염제가 약리학적 활성을 발휘하지 못하지만, 염증세포 내지 염증조직에서는 융합단백질이 프로테아솜에 분해되지 않고 약물의 활성이 유되므로 염증세포 특이적인 약물 전달이 가능하다. 염증세포에 대한 구체적인 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 조성물 내의 상기 융합단백질, 즉, CDC 융합단백질의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. CDC 융합단백질 (CDC system)의 제조
본 발명의 CDC 융합단백질 (CDC 시스템)은 유비퀴틴 단백질 및 카스파제-1 인식서열이 연결된 것을 특징으로 하며, 추가로 세포 전달 효율을 높이기 위한 세포 투과성 펩타이드 서열 및 약리학적 활성을 위한 약물 (예컨대, 치료 펩타이드)이 추가로 결합될 수 있다.
일 예시로서, 세포투과성 펩타이드 Cat16 (C16) 및 형광단백질 Dsred가 결합된 CDC 융합단백질의 핵산 서열은 서열번호 8 및 도 1a로 나타냈으며, 아미노산 서열은 서열번호 19 및 도 1b에 나타냈다. 이를 발현시키기 위한 발현 벡터의 전체 뉴클레오티드 서열은 서열번호 9에 나타냈다.
다른 예시로서, 세포투과성 펩타이드 Cat179 (C179) 및 NF-κB 저해 서열 (Myd88)이 결합된 CDC 융합단백질의 핵산 서열은 서열번호 10 및 도 1c로 나타냈으며, 아미노산 서열은 서열번호 20 및 도 1d에 나타냈다.
CDC 융합단백질 발현 벡터를 제작하기 위해 제한효소 Nde I 및 Bsa I 인식서열을 포함하는 세포 투과성 펩타이드 Cat16 (C16) 코딩 핵산 (서열번호 1)과, 제한효소 Bsa I 및 Nco I을 포함하는 유비퀴틴 변이체 (G76V)-CRS 코딩 핵산을 합성하였다. 상기 세포 투과성 펩타이드는 본 발명의 CDC 시스템의 세포 전달 효율을 더욱 증가시키기 위해 사용되었다. 합성된 유전자를 포함하는 벡터와 DsRed를 포함하는 CDC 융합단백질 발현용 pET-26b 벡터에 상기 제한효소를 처리하고 원하는 유전자 절편을 분리한 뒤 T4 DNA ligase를 이용하여 재조합 벡터를 제작하였다. 제작된 벡터는 E.coli (DH5α)에 형질전환한 뒤 카나마이신을 포함하는 LB 한천배지에서 37℃의 온도로 16시간 배양하여 콜로니를 분리하였다. 분리된 E.coli를 LB 액체배지에서 37℃, 200 rpm, 및 16시간 조건으로 배양하고 배양액에서 DNA를 추출하여 원하는 형태로 재조합된 벡터를 선별하였다. 선별된 CDC 융합단백질 발현 벡터를 단백질 발현용 E.coli (BL21(DE3))에 형질전환하고 위와 동일한 방식으로 재조합 벡터가 형질전환된 클론을 선별하였다. 선별된 균주는 37℃및 200 rpm 조건으로 LB 액체배지에서 18시간 배양한 뒤 IPTG 1mM을 첨가하고 37℃또는 25℃에서 4시간 배양하여 단백질 발현을 유도시켰다. 발현된 단백질은 Ni-NTA 칼럼을 이용해 통상의 방법으로 분리정제하였다. C179가 결합된 CDC 시스템은 전술한 것과 동일한 방법으로 제작하였다.
실시예 2. CDC 시스템의 작동 검증
본 실시예에서는 본 발명에 따른 CDC 시스템의 작동 및 컨셉을 Caspase-Glo1 Inflammasome assay kit (Promega; G9951)를 사용하여 평가하였다.
구체적으로, 인간 단핵구 THP-1 (한국 세포주 은행, Seoul, Korea)는 RPMI-1640 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건을 유지하여 배양하였다. 배지에는 10% fetal bovine serum (FBS)와 항생제 (10,000 U/ml penicillin, 0.1 mg/mL streptomycin)를 첨가하였다. 염증세포에 CDC 시스템을 처리하는 경우, 후술하는 바와 같이 24-well plate에 6×104 cell/well로 씨딩 (seeding)된 THP-1 세포에 PMA를 첨가하여 48시간 동안 분화를 유도하고, CDC 시스템을 400 μL media에 1 μM 농도로 처리한 후 에 LPS 및 ATP를 처리했다. 이후 과정은 kit의 매뉴얼에 따라 진행하고, microplate reader를 사용하여 Luminescence를 측정하여 평가하였다. 실험의 흐름도는 도 2a에 나타냈다.
결과는 도 2b에 나타냈다. PMA로 분화 유도된 THP-1 cell에 LPS 및 ATP로 염증을 유발한 실험군에서는 Caspase-1의 activity가 약 50,000 (RLU)로 증가하여 염증이 유발되지 않은 대조군 대비 Caspase-1의 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. CDC 시스템 (C16-DsRed)의 처리는 Caspase-1 activity를 약 25,000 (RLU)로 감소시켰으며, 이는 Caspase-1의 inhibitor인 Ac-YVAD-CHO와 유사한 수치를 나타냈다.
실시예 3. 공초점 현미경을 이용한 CDC 융합단백질의 평가
본 실시예에서는 공초점 현미경 (Confocal microscope)을 이용하여 본 발명의 CDC 시스템이 정상적으로 작동하는지 확인하였다. THP-1 세포를 24-well plate에서 커버글라스에 6×104 cells/well의 밀도가 되도록 분주한 후, 100 ng/mL의 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)를 첨가하여 48시간 동안 분화를 유도했다. 48시간 후, Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)로 세포를 세척하고, 1% FBS RPMI-1640 배지에 100 nM의 Bortezomib (프로테아솜 분해 저해제) 및 100 μM의 caspase-1 저해제 (Ac-YVAD-CHO)를 각각 1시간 전처리한 후, CDC_Red 단백질 1 μM을 1시간 동안 처리하였다. 이후 1 μg/ml의 LPS 를 3시간 동안 처리하고, 5 mM의 ATP를 30분간 처리하였다. 이어서 DPBS로 세포를 세척하고, 4% Paraformaldehyde (PFA)로 10분간 상온에서 세포를 고정하였다. 고정이 완료된 세포는 DPBS로 세척한 다음 DAPI가 포함된 세포 및 커버글라스 고정 젤을 사용하여 슬라이드 글라스에 고정하고 건조시켰다. 건조된 실험 샘플을 공초점 현미경으로 관찰하여 평가하였다.
공초점 현미경를 통해 CDC 융합단백질을 평가한 결과는 도 3에 나타냈다. 정상 면역세포 (Normal; 즉, 염증반응이 활성화되지 않은 면역세포)의 경우 예상했던 바와 같이 유비퀴틴 (UbG76V)에 의해 CDC 융합단백질의 프로테아솜 분해가 유도됨에 따라 DsRed의 형광이 거의 검출되지 않았다 (도 3의 첫 번째 열). 이는 프로테아솜 분해 저해제인 Bortezomib 처리군에서 세포 내 DsRed 형광이 증가하는 결과를 통해 검증되었다 (도 3의 두 번째 열). Toll-like receptor 4의 작용제인 LPS는 분화된 THP-1를 활성화하여 전사인자인 Nuclear factor kappa B (NF-ĸB)의 전사를 유도하고 ATP와 같은 염증소체 활성화 (inflammasome activation)의 유도제의 증가 통해 NLRP3 염증소체의 형성을 유도하며, Caspase-1의 활성을 유도한다. 도 3의 세 번째 열에서 확인 가능한 바와 같이, LPS로 활성화된 THP-1 세포에서는 DsRed의 강력한 형광 신호가 검출되었는데, 이는 THP-1의 염증반응이 활성화됨에 따라, 활성이 증가한 Caspase-1이 CDC 융합단백질의 Caspase-1 인식서열을 절단하여 DsRed 형광 단백질이 프로테아솜 분해되지 않고 형광을 발현하였음을 의미한다. 이는 THP-1 세포에 LPS와 함께 Caspase-1 저해제인 Ac-YVAD-CHO를 처리하였을 때에는 DsRed 형광이 감소한 결과 (도 3의 네 번째 열)를 통해 더욱 뒷받침된다.
즉, 상기 결과는 본원발명에 따른 CDC 융합단백질이 염증세포 특이적으로 생물학적 활성 분자를 전달할 수 있음을 의미한다.
실시예 4. 유세포분석을 이용한 CDC 융합단백질의 기능 평가
본 실시예에서는 유세포분석을 이용하여 본 발명의 CDC 시스템을 평가하였다. THP-1 세포를 24-well plate에 1×105 cells/well의 밀도가 되도록 분주하고, 100 ng/ml의 PMA를 처리하여 48시간 동안 분화를 유도했다. 48시간 후 DPBS로 세포를 세척하고, 1% FBS RPMI-1640 배지에 100 nM의 Bortezomib 및 100 μM의 Ac-YVAD-CHO를 각각 1시간씩 전처리 한 후, CDC_red 단백질 1 μM을 1시간 동안 처리하였다. 이후 1 μg/ml의 LPS를 3시간 동안 처리한 후 5 mM의 ATP를 30분간 처리하였다. 이후 DPBS로 세포를 세척한 후 세포를 수확하여 1.5 ml tube에 모으고, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리를 수행했다. 이어서 상층액을 제거한 후, cell staining buffer에 세포를 재현탁하고 상층액을 제거한 뒤 DPBS에 세포를 재현탁하여 세포를 세척했다. 이를 2회 반복하고, 다시 세포를 재현탁하여 샘플을 준비하고 FACS Diva (BD)를 통해 유세포 분석을 수행했다.
유세포 분석을 통해 CDC 시스템을 평가한 결과는 도 4에 나타냈다. 정상 면역세포에서는 유비퀴틴에 의해 프로테아솜 분해가 유도되어 결과적으로 DsRed의 형광 값 (MFI)이 감소하였으나, 프로테아솜 분해 저해제인 Bortezomib을 처리하였을 때 형광 값이 두 배 이상 증가한 바, 정상 면역세포에서는 유비퀴틴에 의해 CDC system이 분해된다는 것을 다시 확인하였다. 반면, LPS를 처리하여 염증반응을 유도한 면역세포의 경우, 정상세포에 프로테아솜 분해 저해제를 처리한 그룹 이상의 높은 형광 값이 측정되었으며, 염증반응이 유도된 세포에 Caspase-1 저해제인 Ac-YVAD-CHO를 처리하였을 때에는 형광 값이 확연히 감소하는 것을 확인하였다. 이는 염증반응이 일어난 면역세포에서는 CDC 시스템이 프로테아솜 분회를 회피할 수 있으며, 이는 Caspase-1에 의한 CRS 절단에 의존한다는 것을 보여주는 것이다. 즉, 상기 결과는 본 발명에 따른 CDC 시스템이 염증세포 특이적으로 약물의 전달 및 작동을 유도할 수 있음을 증명한다.
실시예 5. NF-κB 신호전달경로 저해 서열의 CPP 결합에 따른 NF-κB 활성 (NF-κB activity) 저해 평가
본 실시예에서는 본 발명의 세포로의 물질 전달 효율을 증진시킬 수 있는 세포 투과성 펩타이드 (CPP), 및 NF-κB 신호전달 경로의 저해 펩타이드 서열을 결합하고, NF-κB 활성 저해 효능을 평가하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트에 A549-Dual cell (Human NF-κB-SEAP&IRF-Luc Reporter lung carcinoma)를 5×104 cells/well이 되도록 분주하고, 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 이어서 NF-κB 저해제인 BAY 11-7082, 그리고 CPP가 결합된 NF-κB 신호전달 경로의 저해 펩타이드 서열 5종을 20 또는 50 μM의 농도로 1시간 전처리하였다. 본 실시예에서 사용된 CPP 및 NF-κB 신호전달 경로 저해 펩타이드의 서열은 아래 표 1에 나타냈다.
명칭 서열 서열번호
CPP (C16) RPRRKKQIKRLCKR 11
NLS 억제제 VQRKRQKLMP 26
NBD 억제제 TALDWSWLQTE 27
NEMO-LZ 억제제 LKAQADIYKADFQAERHAREKLVEKKEYLQEQLEQLQREFNKL 28
p65 phosphorylation 억제제 QLRRPSDRELSE 29
Myd88 억제제 RDVLPGT 30
1시간 전처리 후, 각각의 웰에 TNF-α (1 ng/ml)를 24 시간 동안 처리하였다. 24시간 후 Invivogen사의 QUANTI-BLUE Solution을 사용하여 매뉴얼에 따라 assay를 진행하고 microreader를 사용하여 655 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 5에 나타냈다. A549-Dual cell에서 QUANTI-BLUE를 사용한 NF-κB 활성을 측정한 결과, 세포에 TNF-α를 처리하여 염증반응을 유발하였을 때 NF-κB 활성이 현저하게 증가하였으나, CPP 결합된 5가지 NF-κB 신호전달 경로 저해 펩타이드를 처리하였을 때 NF-κB 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, CPP 결합된 5가지 NF-κB 신호전달 경로 저해 펩타이드 서열 중 CPP-LZ는 50 μM에서 NF-κB 활성을 약 25%, CPP-Myd88은 50 μM에서 약 45%의 NF-κB 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 활성성분의 기능이 유지된다는 것을 보여준다.
실시예 6. 대식세포에 특이적인 CPP의 탐색
본 실시에에서는, CDC 시스템의 대식세포로의 전달효율을 높일 수 있는 CPP를 발굴하기 위해, 대식세포 특이적으로 투과되는 세포투과성 펩타이드를 탐색하였다.
구체적으로, 24-웰 플레이트에 THP-1 cell을 1.5×105 cells/well이 되도록 분주한 후 PMA를 처리하여 M0 대식세포로 분화시키고, 10 % 우태아 혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양하였다. 이어서 FITC가 결합된 TAT 또는 FITC가 결합된 CPP (C12-C402)를 각각 4 μM씩 처리하고 1 시간 동안 배양하였다. 배양이 종결된 후에는 0.25% trypsin을 이용하여 세포를 분리하여 멸균 튜브로 옮겨 담고, 원심 분리하여 배지를 제거하였다. 그 후 200 μL의 D-PBS로 2회 세척하여 배지를 완전히 제거하고, 최종적으로 400 μL의 D-PBS에 재부유시킨 후 유세포 분석기 (FACS, BD Canto II)를 이용하여 세포 내 형광을 측정하였다.
결과는 도 6에 나타냈다. THP-1-유래-대식세포에서 FITC가 결합된 CPP 후보물질들의 세포 투과능을 각각 측정한 결과 60종의 CPP 후보물질 중 FITC가 결합된 C179가 대식세포에 대해 가장 높은 세포 투과율을 나타냈으며, 비교군인 FITC 결합된 TAT보다 약 4.5배 높은 세포 투과도를 나타냈다.
실시예 7. 세포 투과성 펩타이드의 결합 여부에 따른 CDC 시스템의 효능 비교
본 실시예에서는 CPP 결합에 따른 CDC-cargo의 NF-κB 저해 효능을 비교하였다. 이를 위해, Human NF-κB-SEAP&IRF-Luc Reporter lung carcinoma) 세포인 A549-Dual 세포를 사용하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트에 A549-dual cell을 5×104 cells/well이 되도록 분주하고, 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배양하였다. NF-κB 저해 펩타이드로, 상기 실시예 5에서 NF-κB 저해 활성을 보였던 LZ와 Myd88을 사용하였으며, 실험을 위해 CPP에 결합되지 않은 NF-κB 저해 펩타이드 (no-CPP-CDC-LZ/Myd88); TAT 및 NF-κB 저해 펩타이드가 결합된 CDC 시스템 (TAT-CDC-LZ/Myd88); 그리고 상기 실시예 6에서 대식세포에서의 투과능이 가장 높은 것으로 확인된 C179 및 NF-κB 저해 펩타이드가 결합된 CDC 시스템 (C179-CDC-LZ/Myd88)을 준비하였다. 상기 물질들을 50 μM의 농도로 1시간 동안 세포에 전처리하였고, 비교군으로 동일한 농도의 BAY 11-7082를 처리하였다. 1시간 전처리 후 1 ng/ml의 TNF-α를 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, Invivogen사의 QUANTI-BLUE Solution을 사용하여 매뉴얼에 따라 assay를 진행하고 microreader를 사용하여 655 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 7에 나타냈다. A549-Dual 세포에 TNF-α만을 처리하였을 때에는 NF-κB 활성이 크게 증가하였으나, 50 μM 농도 C179-CDC-LZ 또는 C179-CDC-Myd88를 함께 처리하였을 때에는 NF-κB 활성이 약 35% 저해된 것으로 나타났다. 특히, 상기 CDC 시스템들의 NF-κB 활성 저해 효과는 동일 농도의 no-CPP-CDC-LZ/Myd88 (즉, CPP가 결합되지 않은 CDC 시스템) 또는 TAT-CDC-LZ/Myd88 (즉, C179 대신 TAT이 결합된 CDC 시스템)에 비해 더 높은 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명의 CDC 시스템은 염증세포에 특이적으로 높은 투과도를 나타내는 세포투과성 펩타이드와 결합되면 세포 내로의 이동 효율이 더욱 높아지며, 따라서 염증조건에서의 NF-κB의 활성 증가를 더욱 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
실시예 8. CDC 시스템의 대장 상피세포에서의 염증 저해 효능 평가
본 실시예에서는 본 발명에 따른 CDC 시스템의 염증 저해 효과를 전염증성 사이토카인인 IL-1β를 측정하여 평가하였다. 본 실험에서는 대장 상피세포인 Caco-2 세포를 사용하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트에 Caco-2 세포를 5×104 cells/well이 되도록 분주하고, 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 배양을 마친 후, BAY 11-7082 및 C179-CDC-Myd88을 50 μM의 농도로 세포에 처리하고 1시간 더 배양하였다. 이어서 TNF-α (1 ng/ml)를 각각 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, R&D systems사의 Human IL-1β ELISA kit를 사용하여 세포배양 배지에서 IL-1β의 수준을 측정하였다.
결과는 도 8에 나타냈다. 장 상피세포에 TNF-α를 단독 처리하였을 때 염증반응이 일어남에 따라 IL-1β의 수준이 크게 증가하였으나, 세포 투과성 펩타이드가 결합된 CDC 시스템 C179-CDC-Myd88를 처리하였을 때 IL-1β의 수준이 약 35% 감소하였으며, 이와 같은 IL-1β 저해 효과는 BAY 11-7082 (약 28% 감소)보다 더 높은 것으로 나타났다. 상기 결과는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 본 발명의 CDC 시스템이 장 상피세포를 특이적으로 투과하여 NF-κB의 신호전달 경로를 저해함으로써 염증성 인자들을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
실시예 9. CDC의 마우스 대식세포에서의 염증 저해 효능 평가
본 실시예에서는 마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포를 이용하여 본 발명에 따른 CDC 시스템의 염증 저해 효능을 검증하였다.
구체적으로 96-웰 플레이트에 Raw 264.7 세포를 5×104 cells/well이 되도록 분주하고, 10% 우태아혈청이 첨가된 RPMI 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 24시간 배양하였다. 배양을 마친 후, BAY 11-7082 및 C179-CDC-Myd88을 50 μM의 농도로 처리하고 1시간 더 배양하였다. 이어서 TNF-α (1 ng/ml)를 각각 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, R&D systems사의 Human IL-1β ELISA kit를 사용하여 세포배양 배지에서 IL-1β를 측정하였다.
결과는 도 9에 나타냈다. 마우스 대식세포에 TNF-α를 단독 처리하였을 때 염증반응이 일어남에 따라 IL-1β의 수준이 크게 증가하였으나, 세포 투과성 펩타이드가 결합된 CDC 시스템 C179-CDC-Myd88를 처리하였을 때 IL-1β의 수준이 약 64% 감소하였으며, 이와 같은 IL-1β 저해 효과는 BAY 11-7082 (약 52% 감소)보다 더 높은 것으로 나타났다. 상기 결과는 세포 투과성 펩타이드가 결합된 본 발명의 CDC 시스템이 마우스 대식세포를 특이적으로 투과하여 NF-κB의 신호전달 경로를 저해함으로써 염증성 인자들을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
실시예 10. 대장염 마우스 모델에서 CDC 시스템의 효능 평가
본 실시예에서는 본 발명에 따른 CDC 시스템의 항염 효능을 대장염 마우스 모델에서 검증하였다. 이를 위해, Wild-type의 C57BL/6J 마우스에 Dextran sulfate sodium (DSS)를 이용해 대장염을 유도하여 대장염 모델을 제작하였다.
구체적으로, 마우스에 급성 대장염을 유발하기 위해 정상군을 제외한 음성 대조군과 시험군의 음수에 3%의 DSS를 용해하여 6일간 섭취하도록 하였다. CDC 시스템 투여시 시험군은 시험물질을 75 mg/kg로 1일 1회, 총 10일간 매일 일정 시간대에 정맥투여 하였다. 정상군 및 음성 대조군에는 동량의 vehicle만을 시험물질 투여일정과 동일하게 10일간 정맥투여 하였다.
육안평가 (DAI; Disease activity index) 결과는 도 10a에 나타냈다. 시험기간 동안 체중 감소, 변의 묽기, 혈변 정도 및 항문의 혈액 유무를 매일 확인하여 DAI score의 변화를 확인한 결과, Day 3부터 Day 10까지 NC군에 비해 DSS군 (대장염 그룹)과 DSS+CT군 (CDC 시스템이 투여된 대장염 그룹)에서 DAI score가 유의적으로 증가하였는데 (p<0.001), Day 5, 6, 8에는 DSS군에 비해 DSS+CT군의 DAI score가 유의적으로 감소한 것으로 나타났다 (p<0.05). 이는 대장염에 의한 체중감소, 혈변 등의 증상들이 본 발명이 CDC 시스템 투여에 의해 통계적으로 유의한 수준으로 완화되었음을 보여준다.
대장 길이 (colon length) 측정 결과는 도 10b에 나타냈다. 대장질환은 체중 감소, 출혈과 점액을 동반하는 설사 등의 징후로 측정될 뿐만 아니라, 결장의 축소를 유도하기 때문에 대장의 길이가 대장 보호 효과 판정을 위한 주요 지표로 사용되고 있다. 부검일에 대장을 적출해 대장의 길이를 측정한 결과, NC, DSS, DSS+CT군의 대장 길이는 각각 8.85±1.07 cm, 7.32±0.39 cm, 8.38±0.58 cm으로 측정되었다. 즉, NC군에 비해 DSS군에서 대장 길이가 유의적으로 감소하여 대장염이 유발된 것을 확인할 수 있었으며, DSS+CT군에서 대장 길이가 다소 감소한 경향을 보였으나 통계적으로 유의적인 차이는 없었다. 또한, DSS군과 비교하였을 때, DSS+CT군에서 대장 길이가 유의적으로 증가한 것으로 나타난 바, 본 발명의 CDC 시스템 투여에 의한 대장염에 대한 대장 보호효과를 확인할 수 있었다.
조직병리학적 평가 결과는 도 10c에 나타냈다. 조직병리학적 평가를 위하여 각 마우스로부터 확보된 대장조직을 Hematocylin & Eosin으로 염색하여 광학현미경 관찰한 결과, NC군은 장상피의 점막층이 온전하게 구성되어 있음이 관찰되었다. 반면 DSS군의 경우 대장염이 유도됨에 따라 대장조직의 점막 및 점막하층에 경미한 부종과 염증 소견이 관찰되었고, 상피점막층 여러 부위가 파괴된 것을 확인할 수 있었다. DSS+CT군의 대장 조직 관찰 결과, 점막하층에 일부 염증 소견이 관찰되었으며 상피 점막층 파괴도 일부 관찰되기는 하였으나, DSS군에 비해 염증 소견이 적게 관찰되었고, 병변 부위 역시 적은 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명에 따른 CDC 시스템이 동물모델에서 대장염으로 인한 대장조직의 손상을 완화시키고 증상을 개선한다는 것을 보여준다.
마우스별 혈청 내 IL-1β level 수준은 도 10d에 나타냈다. 이를 위해, 마우스를 ether 마취하에 개복하여 각 개체의 복대정맥에서 혈액을 채취하였으며, 채취된 혈액을 4℃에서 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 확보했다. 혈청 내 IL-1β 수준을 분석한 결과 NC, DSS, 및 DSS+CT 마우스의 혈청 내 IL-1β는 각각 51.8±5.7 pg/ml, 143.7±72.6 pg/ml, 73.9±29.6 pg/ml로 확인됐다. 즉, NC군에 비해 DSS군에서 혈청 내 IL-1β level이 통계적으로 유의하게 증가하였으며, DSS군에 비해 DSS+CT군에서 상기 사이토카인 수준이 통계적으로 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명의 CDC 시스템이 in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서도 대장염으로 인한 염증성 사이토카인의 증가를 효과적으로 억제하여, 항염 효과를 발휘할 수 있음을 보여준다.
이상의 실시예를 통해, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 정상세포에서는 유비퀴틴에 의한 프로테아솜 분해에 의해 전체 단백질이 분해되어 결합된 생물학적 활성 성분이 기능하지 못하지만, 염증세포에서는 활성화된 Caspase-1의 CRS 인식 및 절단에 의해 프로테아솜 분해를 회피하여 생물학적 활성 성분이 활성을 유지하는 것이 확인되었다. 본 발명의 우수한 효과는 in vitro 실험뿐만 아니라 in vivo 실험을 통해 명확히 확인된 바, 본 발명의 CDC 시스템은 대장염 동물모델에서 다양한 대장염 증상을 개선하고, 염증성 인자의 수준을 억제하여 대장염의 예방, 개선, 및 치료 효과를 달성할 수 있다. 이처럼, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 다양한 치료제를 결합시킬 수 있고, 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서 염증세포 특이적으로 작용할 수 있는 바, 염증 관련 질환의 예방 및 치료 분야에서 유용히 활용될 것으로 기대된다. 나아가, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질을 염증세포 특이적 세포 투과성 펩타이드와 연결시키는 경우, 염증세포로의 투과 효율이 증가하여 염증 억제 효과가 더욱 증가하는 것이 확인된 바, 본 발명의 CDC 융합단백질 및 세포 투과성 펩타이드의 조합을 통해 더욱 우수한 항염 효과를 달성할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
아래 표 2는 본 발명과 관련된 서열 정보를 나타낸다.
명칭 서열 서열번호
CPP (C16) CCGTCCGCGTCGTAAGAAACAGATTAAACGTCTGTGCAAACGTGGT 1
CPP (C179) CTGGTTCCGCGTCGTCTGCGTCGTCGTGCACGTCGTCGCAAA 2
Ubiquitin variant (G76V) ATGCAGATTTTCGTGAAAACCCTGACCGGCAAAACCATTACCCTGGAAGTGGAACCGAGCGATACCATTGAAAACGTGAAAGCGAAAATTCAGGATAAAGAAGGCATTCCGCCGGATCAGCAGCGTCTGATTTTCGCGGGCAAACAGCTGGAAGATGGCCGTACCCTGAGCGATTATAACATTCAGAAAGAAAGCACCCTGCATCTGGTGCTGCGTCTGCGTGGCGTG 3
CRS_GWEHDGK GGCTGGGAACATGATGGCAAA 4
DsRed ATGCGTAGCAGCAAGAACGTGATTAAAGAATTCATGCGTTTCAAAGTGCGTATGGAAGGCACCGTGAACGGCCATGAATTCGAAATTGAAGGCGAAGGCGAAGGCCGTCCGTATGAAGGCCATAACACCGTGAAACTGAAAGTGACCAAAGGCGGCCCGCTGCCGTTCGCGTGGGATATTCTGAGCCCGCAGTTCCAGTATGGCAGCAAAGTGTATGTGAAACATCCGGCGGATATTCCGGATTATAAGAAACTG 5
Myd88 CGTGATGTTCTGCCTGGCACC 6
6xHis CACCACCACCACCACCAC 7
CDC system-coding sequence (C16-Ub-CRS-DsRed-6xHis) TCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA 8
CDC system-expressing vector (C16-Ub-CRS-DsRed-6xHis) CACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT 9
CDC system-expressing vector (C179-Ub-CRS-Myd88) ATGGGCCATCATCACCACCATCACCATCATGGTAGCAGcggtCTGGTTCCGCGTCGTCTGCGTCGTCGTGCACGTCGTCGCAAAGGTTCAATGCAGATTTTCGTGAAAACCCTGACCGGCAAAACCATTACCCTGGAAGTGGAACCGAGCGATACCATTGAAAACGTGAAAGCGAAAATTCAGGATAAAGAAGGCATTCCGCCGGATCAGCAGCGTCTGATTTTCGCGGGCAAACAGCTGGAAGATGGCCGTACCCTGAGCGATTATAACATTCAGAAAGAAAGCACCCTGCATCTGGTGCTGCGTCTGCGTGGCGTGGGCAGCGGCTGGGAACATGATGGCAAAGGTAGCAGCGGTGGTAGCagtggtCGTGATGTTCTGCCTGGCACCtga 10
CPP (C16) RPRRKKQIKRLCKR 11
CPP (C179) LVPRRLRRRARRRK 12
Ubiquitin variant (G76V) MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRG V 13
Ubiquitin (wild type) MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRG G 14
CRS_GWEHDGK GWEHDGK 15
DsRed MRSSKNVIKEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGCFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKPVQLPGYYYVDSKLDITSHNEDYTIVEQYERTEGRHHLFL 16
Myd88 RDVLPGT 17
6xHis HHHHHH 18
CDC system-coding sequence (C16-Ub-CRS-DsRed-6xHis) MQASRPRRKKQIKRLCKRGSMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVGSGWEHDGKGSMRSSKNVIKEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGCFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKPVQLPGYYYVDSKLDITSHNEDYTIVEQYERTEGRHHLFLCRDPNSSSVDKLAAALEHHHHHH 19
CDC system-coding sequence (C179-Ub-CRS-Myd88) MGHHHHHHHHGSSGLVPRRLRRRARRRKGSMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVGSGWEHDGKGSSGGSSGRDVLPGT 20
CRS_WEHD WEHD 21
CRS_YVHD YVHD 22
CRS_YVAD YVAD 23
CRS_FESD FESD 24
CRS_GWEHDGK GWEHDGK 25
NLS VQRKRQKLMP 26
NBD TALDWSWLQTE 27
NEMO-LZ LKAQADIYKADFQAERHAREKLVEKKEYLQEQLEQLQREFNKL 28
p65 phosphorylation QLRRPSDRELSE 29
Myd88 RDVLPGT 30
CPP_C12 KPRKKKKKRKNKKI 31
CPP_C14 ALVLLRRRRRDRK 32
CPP_C16 RPRRKKQIKRLCKR 33
CPP_C31 IRAKKKKRRRKKKP 34
CPP_C52 TKRRKRRLRRRLTP 35
CPP_C67 KKRKKRRKKRKVDP 36
CPP_C72 AARIRALRRRRRRP 37
CPP_C85 LMPSKIRRRKKRKK 38
CPP_C93 ARLRVILRRRNPKR 39
CPP_C95 ARLRVILRRRHPRR 40
CPP_C112 IPLRRLMRRARRHR 41
CPP_C113 WPRRRLRLRHRARR 42
CPP_C179 LVPRRLRRRARRRK 43
CPP_C185 SRRRLRRFLRRIAP 44
CPP_C201 MKRLLKVVRRRRRP 45
CPP_C226 RPLVRRRLRRAVRR 46
CPP_C283 YRPRRKKITKKLKR 47
본 발명에 따른 염증세포 특이적 약물전달 시스템 (CDC 융합단백질)은 유비퀴틴 단백질 및 카스파제-1 인식서열 융합단백질에 기반한 것으로서, 정상세포에서는 유비퀴틴에 의해 약물을 포함한 전체 약물 전달 시스템이 분해되어 기능하지 못하지만, 염증세포에서는 카스파제-1 인식서열이 절단됨에 따라 약물이 프로테아솜 분해를 회피하고 약리학적 활성을 발휘할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드 등이 추가로 결합될 수 있어, 타겟세포로의 약물 전달 효율을 더욱 현저하게 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 CDC 융합단백질은 염증세포 특이적인 약물 전달이 가능하며, 정상세포에 대한 부작용 위험을 최소화할 수 있으므로, 다양한 염증성 질환에서 약물 전달체로서 유용히 활용될 것으로 기대된다.

Claims (30)

  1. 유비퀴틴 단백질 및 카스파제-1 인식서열 (Caspase-1 Recognition Sequence, CRS)를 포함하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유비퀴틴은 야생형 유비퀴틴 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 유비퀴틴 변이체는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족하는 것인, 융합단백질:
    (a) 상기 유비퀴틴 변이체는 야생형 유비퀴틴의 N 말단으로부터 76번째 아미노산이 발린 (V), 아르지닌 (R), 프롤린 (P), 트립토판 (W), 히스티딘 (H), 아이소류신 (I), 리신 (K), 글루타민 (Q), 류신 (L), 아스파테이트 (D), 아스파라진 (N), 타이로신 (Y), 트레오닌 (T), 세린 (S), 페닐알라닌 (F), 알라닌 (A), 시스테인 (C), 글루타메이트 (E), 또는 메티오닌 (M)으로 치환된 것임;
    (b) 상기 유비퀴틴 변이체는 야생형 유비퀴틴의 N 말단으로부터 29번째 아미노산이 아르지닌 (R)으로 치환된 것임; 및
    (c) 상기 유비퀴틴 변이체는 야생형 유비퀴틴의 N 말단으로부터 48번째 아미노산이 아르지닌 (R)으로 치환된 것임.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 야생형 유비퀴틴은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 유비퀴틴 단백질은 하나 또는 복수개인 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 카스파제-1 인식서열은 활성화된 카스파제-1 단백질에 의해 인식되어 절단되는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 카스파제-1 인식서열은 서열번호 21 내지 25 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 유비퀴틴 단백질 및 상기 카스파제-1 인식서열은 링커로 연결된 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 융합단백질의 일측 말단 또는 양측 말단에 결합된 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 31 내지 47로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  12. 유비퀴틴 단백질, 카스파제-1 인식서열, 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 융합단백질로서, 상기 생물학적 활성 분자는 카스파제-1 인식서열에 결합된 것이고, 유비퀴틴 단백질에는 직접 결합되지 않은 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 결합은 화학적 결합, 링커를 이용한 결합, 또는 펩타이드 결합인 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 분자는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 화합물, 천연물, 반합성 물질 (semi-synthetic drugs), 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 바이러스, 양자점 (quantum dots), 및 형광색소 (fluorochrome)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 융합단백질은 유비퀴틴 단백질, 카스파제-1 인식서열, 및 생물학적 활성 분자 순으로 연결된 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  17. 제1항의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 벡터.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 세포 투과성 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인, 재조합 벡터.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 생물학적 활성 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인, 재조합 벡터.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 카스파제-1 인식서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 생물학적 활성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 배열되어 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 포함하는, 세포.
  22. 제12항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 융합단백질에 결합된 생물학적 활성 분자는 항염제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 항염제는 염증 억제성 단백질 또는 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 항염제는 NF-κB 신호전달 경로의 억제제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 분자는 염증반응이 활성화되지 않은 세포에서는 프로테아솜에 의해 분해되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  26. 제22항에 있어서,
    상기 융합단백질은 세포 투과성 펩타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  27. 제1항 또는 제12항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증세포 또는 염증조직 특이적 약물 전달용 조성물.
  28. 제12항의 융합단백질을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료방법으로서, 상기 융합단백질에 결합된 생물학적 활성 분자는 항염제인 것을 특징으로 하는, 방법.
  29. 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 제12항의 융합단백질의 용도로서, 상기 융합단백질에 결합된 생물학적 활성 분자는 항염제인 것을 특징으로 하는, 용도.
  30. 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 제12항의 융합단백질의 용도로서, 상기 융합단백질에 결합된 생물학적 활성 분자는 항염제인 것을 특징으로 하는, 용도.
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