CN116261461A - 刺激细胞增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了治疗和预防纤维化相关疾病的方法，以及用于此类方法的药剂。所述方法包括抑制ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一种。在一个实施方案中，所述疾病为肝脏疾病或病症。还公开了促进细胞(例如肝细胞)再生的方法。
Description
本申请要求2020年7月30日提交的SG 10202007297P的优先权，其内容和要素出于所有目的通过引用并入本文。
发明领域
本公开总体上涉及再生疗法领域。具体地，本说明书教导了一种刺激或增加对象体内细胞增殖和/或再生的方法，包括向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂以在所述受试者体内刺激或增加细胞增殖。
背景
急性和慢性肝功能衰竭的发病率不断上升，每年导致全球超过130万人死亡(世界卫生组织，2018年)，这是一个重大的全球健康问题。终末期肝病的主要根本原因是肝炎病毒感染(尤其是乙型和丙型肝炎)、药物和酒精引起的肝损伤以及非酒精性脂肪性肝病(NAFLD；与肥胖相关并进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH))。亚洲的肝炎病毒感染负担特别高(WHO)，并且NAFLD的发病率增加。尽管在预防和治疗病毒性肝炎(乙型肝炎疫苗接种和丙型肝炎联合疗法)方面取得了进展，但预计患有终末期肝病的人数将会增加，这主要是由于肥胖流行和老龄化社会造成的。
目前，治疗终末期肝病的唯一方法是肝移植。然而，供体器官有限，终末期肝病患者也可能出现并发症，无法进行大手术。因此，正在寻求延缓或逆转终末期肝病的替代策略。这些策略包括细胞移植、人工肝装置和增强器官的内源性再生能力。
肝脏是唯一具有非凡再生能力的内脏器官。众所周知，只要有25％的原始肝脏质量就可以再生回其完整大小。成年肝细胞寿命长，通常不进行细胞分裂(G0)。然而，在肝损伤后，它们具有进入细胞周期并增殖的能力。一旦细胞增殖完成，新分裂的细胞就会进行重建，以及其他与再生相关的过程，如血管生成和细胞外基质的重建，以完成再生过程。
尽管有这种惊人的能力，但肝脏的再生能力似乎有限，尤其是在慢性损伤条件下。肝脏的再生能力是肝脏稳态的核心。由于肝脏是药物解毒的主要场所，它接触到体内许多可能导致细胞死亡和损伤的化学物质。此外，通过肠肝循环，它暴露于微生物群相关的代谢物。肝脏可以迅速再生受损组织，从而防止功能衰竭。对于因肿瘤切除或活体供体移植而部分切除肝脏的患者，肝再生也很重要。
在过去的三十年里，科学家们对肝脏再生过程有了更好的了解。例如，细胞因子IL6和TNFα启动肝细胞进入细胞周期，而HGF和EGF等有丝分裂原对于驱动增殖很重要。然而，促进再生过程的过程还不是很清楚。重要的是，不仅肝脏内在信号参与再生反应，而且来自远端器官的信号也参与其中。
改造再生反应，涉及许多不同的过程，包括营养素、氧气水平等。重要的是，复杂的肝脏结构，尤其是与其他器官的相互作用，无法在体外完美模拟，因此体内实验必不可少。体内模型的缺点在于它们在高通量药物发现管道(尤其是化合物筛选)方面的潜力有限。
因此，需要克服或至少缓解上述的一个或多个问题。
发明内容
本发明涉及通过抑制被鉴定为在促纤维化过程中上调的基因和/或蛋白质来治疗和/或预防疾病。抑制此类基因/蛋白质具有保护和再生作用。
本公开提供了一种治疗或预防纤维化相关疾病的方法，包括抑制ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一种。
还提供了治疗或预防纤维化相关疾病的方法，包括施用治疗或预防有效量的ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一种到受试者。
还提供了ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中至少一种的抑制剂，用于治疗或预防纤维化相关疾病的方法。
还提供了ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中至少一种的抑制剂在制备用于治疗或预防与纤维化有关疾病的方法的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述疾病是肝脏疾病或病症。
在一些实施方案中，所述疾病或病症选自：急性肝病、慢性肝病、代谢性肝病、脂肪变性、肝纤维化、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝硬化、轻度肝纤维化、晚期肝纤维化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝病(ALFD)、酒精相关性肝病(ARLD)、肝缺血再灌注损伤、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、肝炎、肝损坏、肝损伤、肝功能衰竭、代谢综合征、肥胖、糖尿病、终末期肝病、肝脏炎症、小叶炎症、和/或肝细胞癌(HCC)。
在一些实施方案中，抑制剂选自核酸、肽、抗体、抗原结合分子或小分子抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂能够结合根据SEQ ID NO：7156至7178中任一项或多项的多肽，或结合根据SEQ ID NO：7179至7195中任一项的mRNA。
在一些实施方案中，抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7179至7195中的任一项或其一部分，具有至少75％的序列同一性，或与SEQID NO：7179至7195中的任一项的反向互补序列或其一部分，具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1至7155中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：1至7155中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：6、7、457至1482、7095、7096、7109至7114、7130至7140、7144、7145、7149、7150、7154和/或7155中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：6、7、457至1482、7095、7096、7109至7114、7130至7140、7144、7145、7149、7150、7154和/或7155中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低ITFG1的基因和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、14至347、7092、7093、7097至7102、7115至7120、7141、7142、7146、7147、7151和/或7152中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：1、2、14至347、7092、7093、7097至7102、7115至7120、7141、7142、7146、7147、7151和/或7152中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低MFAP4的基因和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：3至5、348至456、7094、7103至7108、7121至7129、7143、7148和/或7153中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：3至5、348至456、7094、7103至7108、7121至7129、7143、7148和/或7153中的任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低GRHPR的基因和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1483至2208中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：1483至2208中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够减少ABCC4的基因和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：2209至5060中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：2209至5060中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够减少PAK3的基因和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5061至5389中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：5061至5389中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够减少TRNP1的基因和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5390至5966中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：5390至5966中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够减少APLN的基因和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5967至6974中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：5967至6974中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够减少KIF20A的基因和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：6975至7091中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：6975至7091中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够减少LTB的基因和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包括：(i)包含SEQ ID NO：1至7096或7146至7150之一的核苷酸序列、或与SEQ ID NO：1至7096或7146至7150之一具有至少75％的序列同一性的核苷酸序列的核酸；和(ii)包含具有(i)所述核苷酸序列的反向互补序列的核苷酸序列、或与(i)所述核苷酸序列的反向互补序列具有至少75％的序列同一性的核苷酸序列的核酸。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含一种或多种修饰的核苷酸，其选自：2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸、2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸、2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-硫代磷酸酯，2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯，2'-氟尿苷-3'-磷酸，2'-氟腺苷-3'-磷酸，2'-氟鸟苷-3'-磷酸，2'-氟胞苷-3'-磷酸、2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯和2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7146至7150之一所示的核苷酸序列(包括对其的修饰)的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7151至7155之一所示核苷酸序列(包括对其的修饰)的核酸。
在一些实施方案中，所述抑制剂包含促进肝细胞摄取抑制性核酸的部分。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是反义核酸、siRNA、或shRNA。
在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用所述抑制剂，在所述受试者体内MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A、和/或LTB中的一种或多种的表达和/或活性被上调。
还提供了用于降低ITFG1的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7182或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7182或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：6、7、457至1482、7095、7096、7109至7114、7130至7140、7144、7145、7149、7150、7154和/或7155中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：6、7、457至1482、7095、7096、7109至7114、7130至7140、7144、7145、7149、7150、7154和/或7155中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
提供了用于降低MFAP4的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7179或7180或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7179或7180或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、14至347、7092、7093、7097至7102、7115至7120、7141、7142、7146、7147、7151和/或7152中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：1、2、14至347、7092、7093、7097至7102、7115至7120、7141、7142、7146、7147、7151和/或7152中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
提供了用于降低GRHPR的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7181或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7181或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，抑制性核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：3至5、348至456、7094、7103至7108、7121至7129、7143、7148和/或7153中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：3至5、348至456、7094、7103至7108、7121至7129、7143、7148和/或7153中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
提供了用于降低ABCC4的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7183至7186中的任一项或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7183至7186中的任一项或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1483至2208中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：1483至2208中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
提供了用于降低PAK3的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7187至7190中的任一项或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7187至7190中的任一项或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：2209至5060中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：2209至5060中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
提供了用于降低TRNP1的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7191或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7191或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5061至5389中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：5061至5389中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
提供了用于降低APLN的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7192或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7192或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5390至5966中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：5390至5966中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
提供了用于降低KIF20A的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7193或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7193或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5967至6974中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：5967至6974中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
提供了用于降低LTB基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7194或7195或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7194或7195或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：6975至7091中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：6975至7091中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
还提供了一种抑制性核酸，包含(i)包含SEQ ID NO：7092至7096之一所示核苷酸序列的核酸；和(ii)包含SEQ ID NO：7141至7145之一所示核苷酸序列的核酸。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含一种或多种修饰的核苷酸，其选自：2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸、2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸、2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-硫代磷酸酯，2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯，2'-氟尿苷-3'-磷酸，2'-氟腺苷-3'-磷酸，2'-氟鸟苷-3'-磷酸，2'-氟胞苷-3'-磷酸、2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯、和2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯。
还提供了一种抑制性核酸，包含(i)包含SEQ ID NO：7146至7150之一所示核苷酸序列(包括对其的修饰)的核酸；和(ii)包含SEQ ID NO：7151至7155之一所示核苷酸序列(包括对其的修饰)的核酸。
在一些实施方案中，所述抑制性核酸还包含促进肝细胞摄取抑制性核酸的部分。在一些实施方案中，所述抑制性核酸是反义核酸、siRNA或shRNA。
本公开还提供了一种核酸，可以是分离的，其编码根据本公开的抑制性核酸。
本公开还提供了一种表达载体，其包含根据本公开的核酸。
本公开还提供了一种组合物，其包含根据本公开的抑制性核酸、核酸或表达载体，以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。
本公开还提供了包含根据本公开的抑制性核酸、核酸、或表达载体的细胞。
本公开还提供了根据本公开的治疗或预防疾病的方法，包括将治疗或预防有效量的根据本公开的的抑制剂、抑制性核酸、核酸、表达载体、组合物或细胞施用于受试者。
本公开还提供了根据本公开的抑制剂、抑制性核酸、核酸、表达载体、组合物或细胞在治疗中的应用。在一些实施方案中，所述抑制剂、抑制性核酸、核酸、表达载体、组合物或细胞被提供用于治疗或预防疾病(例如根据本公开的疾病)的方法中。
本公开还提供了根据本公开的抑制剂、抑制性核酸、核酸、表达载体、组合物或细胞在制备用于治疗或预防疾病(例如根据本公开的疾病)的方法的药物中的用途。
还公开了一种用于降低细胞中ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的基因和/或蛋白质表达的体外或体内方法，包括将根据本公开的抑制性核酸、核酸、或表达载体导入细胞中。
还公开了一种体外或体内再生肝组织的方法，该方法包括抑制组织细胞中的ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一种。
还公开了一种体外或体内增殖/扩增肝细胞的方法，该方法包括抑制肝细胞中的ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一种。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括将根据本公开的抑制性核酸、核酸或表达载体引入细胞，例如组织中的细胞或肝细胞。
本文公开了一种刺激或增加受试者体内细胞增殖和/或再生的方法，该方法包括在刺激或增加受试者体内细胞的增殖和/或再生的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
本文公开了一种增强受试者细胞功能的方法，该方法包括在增强所述受试者细胞功能的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
本文公开了一种增强受试者细胞活力的方法，该方法包括在增强所述对象的细胞活力的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
本文公开了一种治疗受试者肝脏病症或疾病的方法，该方法包括在治疗所述受试者的肝脏病症或疾病的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
本文公开了一种保护受试者免受肝损伤的方法，该方法包括在保护所述对象免受肝损伤的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
本文公开了一种检测受试者肝脏病症或疾病的方法，该方法包括检测样品中与器官再生相关的一种或多种生物标志物的水平，其中与参照相比一种或多种生物标志物水平的变化表明所述受试者患有肝脏病症或疾病。
本文公开了一种与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂，用于预防或治疗所述受试者的肝脏病症或疾病。
本文公开了与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂在制备用于预防或治疗所述受试者的肝脏病症或疾病的药物中的用途。
本文公开的方法可以使用任何合适的抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是根据本发明的抑制剂。
本文公开了一种核酸抑制剂，其包含或编码与表1-14中任一项所列的RNA序列具有至少70％、80％、90％或95％序列同一性的RNAi试剂，或在严格条件下与表1-14中任一项所列RNA序列的互补序列杂交的RNAi试剂，或由其组成。
本文公开了一种筛选与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂的方法：a)将所述基因或相应基因产物与化合物文库接触，和b)鉴定所述文库中与所述基因或相应基因产物结合以抑制所述基因或相应基因产物的表达或功能的化合物。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这样的组合明显不允许或明确避免。
具体实施方式
本发明涉及鉴定参与肝脏疾病发展和/或对损伤后肝再生有害的蛋白质，以及靶向这些蛋白质以治疗肝脏疾病。
不受理论的束缚，发明人使用无偏好的体内功能遗传筛选来鉴定在肝脏疾病和与纤维化相关的病症中上调的新治疗靶标。靶标shRNA的富集表明，这些靶标的敲低/抑制为慢性肝损伤条件下的肝细胞提供了生存优势。由于富集表明之于对照的相对扩增，已鉴定基因的敲低或抑制支持肝细胞扩增、增殖和稳健性。这对于肝脏疾病拦截、加速肝再生、防止肝损伤、促进细胞增殖、阻止和逆转肝纤维化、以及提高存活率在治疗上是有益的。
靶标
本公开涉及抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的基因和/或蛋白质表达。这些基因中的任何一种或组合(即任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部九种)可以在本文提供的方法中被抑制。这些基因中的任何一个或组合在本文中可称为靶基因、靶mRNA或靶蛋白。MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种在本文中可描述为“与器官再生相关的基因或相应基因产物”。
MFAP4、GRHPR和ITFG1在肝细胞癌的复发性扩增中被发现(Nat Med.2014年10月；20(10)：1138–1146)。本发明人发现ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和LTB在患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的当地患者队列中均失调。
微纤维相关糖蛋白4(MFAP4)是属于纤维蛋白原相关结构域(FReD)超家族的细胞外基质蛋白。人MFAP4由UniProtKB P55083标识。
MFAP4结构和功能在例如Pilecki B.等，生物化学杂志，291：1103-1114(2016)中描述，其全部内容通过引用并入本文。
MFAP4是一种存在于弹性纤维中的细胞外糖蛋白，是弹性纤维正常组织所必需的。它特异性结合弹性蛋白原和纤维蛋白原-1和-2，以及弹性蛋白交联氨基酸锁链素，并在体内与纤维蛋白原-1阳性纤维共定位。人MFAP4定位于各种弹性组织中的弹性纤维，包括主动脉、皮肤和肺。
MFAP4与重塑相关疾病密切相关，包括肝纤维化、动脉粥样硬化、动脉损伤刺激重塑和哮喘(Wang HB等，美国心脏协会杂志；9(17)：e015307)。Pan Z等，FASEB J.2020，34(11)：14250-14263报道，MFAP4缺乏通过抑制NF-κB和TGF-β/Smad信号通路的激活并下调纤维化相关蛋白的表达来减轻肾纤维化。MFAP4由活化的肌成纤维细胞产生，并且可以作为肝纤维化严重程度的预测生物标志物(Madsen BS等，Liver Int.2020；40(7)：1701–1712；
SG等，PLoS One，2015；10(10)：e0140418)。本申请的实施例2表明已知参与肝再生的基因，例如Ptgs2、Areg、Dhrs9、Hmox1和Nqo1在Mfap4敲低后上调。
由人MFAP4基因转录的mRNA的选择性剪接产生两种同种型：同种型1(UniProtKB：P55083-1，v2；SEQ ID NO：7156)和同种型2(UniProtKB：P55083-2；SEQ ID NO：7157)其中对应于SEQ ID NO：7156的第1至2位的氨基酸序列被替换为序列'MGELSPLQRPLATEGTMKAQGVLLKL'。
人MFP4同种型1的255个氨基酸序列包含位于SEQ ID NO：7156的第1-21位的N末端信号肽和位于SEQ ID NO：7156的第22-255位的成熟蛋白质区域。SEQ ID NO：7156的第26-28位构成细胞附着位点，SEQ ID NO：7156的第32-255位构成纤维蛋白原C末端结构域。
在本说明书中，提及“MFAP4”包括：人MFAP4、人MFAP4的同种型、人MFAP4的同系物(即由非人动物的基因组编码)及其变体。在一些实施方案中，根据本公开的MFAP4包含或由与SEQ ID NO：7156的氨基酸序列具有至少70％或更高的氨基酸序列同一性，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)是一种NADPH/NADH依赖性酶，具有羟基丙酮酸还原酶、乙醛酸还原酶和D-甘油酸脱氢酶酶活性。它将有毒的中间体乙醛酸盐还原为易于排泄的乙醇酸盐，并将羟基丙酮酸盐还原为用于葡萄糖合成的D-甘油酸盐。GRHPR缺乏是原发性高草酸尿症2型(PH2)的根本原因，并导致尿草酸盐水平升高、肾结石形成和肾功能衰竭(Cregeen DP等人，Hum Mol Genet.1999；8(11)：2063-9)。人GRHPR由UniProtKBQ9UBQ7标识。
GRHPR结构和功能描述于例如Rumsby G.和Cregeen D.P.，生物化学与生物物理学报，1446：383-388(1999)，和Booth等，J Mol Biol，2006；360(1)：178-89，其全部内容通过引用并入本文。
由人GRHPR基因转录的mRNA的选择性剪接产生两种同种型：同种型1(UniProtKB：Q9UBQ7-1，v1；SEQ ID NO：7158)和同种型2(UniProtKB：Q9UBQ7-2；SEQ ID NO：7159)其中对应于SEQ ID NO：7158的第1-21位的氨基酸序列被替换为序列'MLGGVPTLCGTGNETWTLLAL'，SEQ ID NO：7158的22-164位缺失，SEQ ID NO：7158的246-328位替换为序列“YPRATLPSKPGEEPSPLLPSGDFLPRGLLVRPQAELAGFHKPNNQLRNSWEYTRPPYREEEPSEWAWPVCFSAVAPTRRGLAHSSVASGSVPREPLQAHYPPPQRAGLEDLKGPLEAASHTAEPGFVWLWFSDTLNLMLLGGQTLKLTWS”。
人GRHPR同种型1的328个氨基酸序列包含SEQ ID NO：7158的第217、243、162-164、185-188和295位的NADP结合位点，以及SEQ ID NO：7158的第83-84、245、269和293-296位的底物(乙醛酸/羟基丙酮酸)结合位点。
在本说明书中，提及“GRHPR”包括：人GRHPR、人GRHPR的同种型、人GRHPR的同系物(即由非人类动物的基因组编码)及其变体。在一些实施方案中，根据本公开的GRHPR包含或由与SEQ ID NO：7158的氨基酸序列具有70％或更高氨基酸序列同一性，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
T细胞免疫调节蛋白(ITFG1；也称为蛋白TIP、整合素-αFG-GAP重复蛋白1或Linkin/LNKN-1)是T细胞功能的调节剂。人ITFG1由UniProtKB Q8TB96标识。
ITFG1结构和功能描述于例如Fiscella M.，等，Nat.Biotechnol.21：302-307(2003)，其全部内容通过引用并入本文。在体外用ITFG1处理原代人和鼠T细胞导致IFN-γ、TNF-α和IL-10的分泌，而据报道，体内ITFG1在小鼠急性移植物抗宿主病(GVHD)模型中具有保护作用。据报道，ITFG1和ATPase RUVBL1之间的相互作用是乳腺癌细胞侵袭和进展所必需的(Fan W.等，Biochim Biophys Acta Gen Subj.2017；1861(7)：1788-1800)。
人ITFG1的612个氨基酸序列如SEQ ID NO：7160(UniprotKB：Q8TB96-1，v1)所示。该序列包含：SEQ ID NO：7160的第1-33位的N末端信号肽，SEQ ID NO：7160的第258-293位的FG-GAP重复，以及SEQ ID NO：7160的第567-587位的跨膜结构域。
在本说明书中，提及“ITFG1”包括：人ITFG1、人ITFG1的同种型、人ITFG1的同系物(即由非人动物的基因组编码)及其变体。在一些实施方案中，根据本公开的ITFG1包含或由与SEQ ID NO：7160的氨基酸序列具有至少70％或更高的氨基酸序列同一性，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4；也称为多药耐药蛋白4(MRP4))是ATP结合盒(ABC)家族的ATP依赖性转运蛋白，可主动从细胞中排出生理化合物和异生素。它转运一系列在细胞通讯和信号传导中起关键作用的内源性分子，包括环核苷酸，例如环AMP(cAMP)和环GMP(cGMP)、胆汁酸、类固醇结合物、尿酸盐和前列腺素。它在多种组织中表达，包括肝细胞，在肾脏和脉络丛中表达最高(Maher JM，等，Drug Metab.Dispos.33(2005)，pp.947-955)。人ABCC4由UniProtKB O15439标识。
ABCC4结构和功能描述于例如Russel等，药理学趋势，2008，29(4)：200-7，其全部内容通过引用并入本文。ABCC4是人类和啮齿类动物接触有毒对乙酰氨基酚后肝脏中的一种诱导基因。在小鼠中，ABCC4缺乏与肝损伤风险增加、肠道上皮功能改变和药物处置改变有关，尽管据报道在患有脂肪变性、酒精性肝硬化和糖尿病性肝硬化的人类肝脏中蛋白质表达增加(More VR等，Drug Metab.Dispos.2013；41(5)：1148–1155)。
由人ABCC4基因转录的mRNA的可变剪接产生四种同种型：同种型1(UniProtKB：O15439-1，v3；SEQ ID NO：7161)，同种型2(O15439-2，SEQ ID NO：7162)，其中对应于SEQ IDNO：7161的第679-725位的氨基酸序列缺失，同种型3(O15439-3，SEQ ID NO：7163)，其中对应于SEQ ID NO：7161的第846-859位的氨基酸序列被替换为序列‘RWDLAVLSWLVSNS’和SEQID NO：7161的第860-1325位缺失，以及同种型4(O15439-4，SEQ ID NO：7164)，其中对应于SEQ ID NO：7161的第103-177位的氨基酸序列缺失，对应于SEQ ID NO：7161的第846-859位的氨基酸序列被替换为序列‘RWDLAVLSWLVSNS’，对应于SEQ ID NO：7161的第860-1325位的氨基酸序列缺失。
人ABCC4同种型1的1325个氨基酸序列包含：SEQ ID NO：7161的第92-377位的ABC跨膜1型1结构域，第410-633位的ABC转运蛋白1结构域，第714-1005位的ABC跨膜1型2结构域，第1041-1274位的ABC转运蛋白2结构域，以及第445-452位和第1075-1082位ATP结合区。
在本说明书中，提及“ABCC4”包括：人ABCC4、人ABCC4的同种型、人ABCC4的同系物(即由非人动物的基因组编码)及其变体。在一些实施方案中，根据本公开的ABCC4包含或由与SEQ ID NO：7161的氨基酸序列具有至少70％或更高的氨基酸序列同一性，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
p21激活激酶3(PAK3；也称为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PAK3、β-PAK或Oligophrenin-3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在多种不同的信号通路中发挥作用，包括细胞骨架调节、细胞迁移或细胞周期调节。通过活性CDC42和RAC1的结合激活导致构象变化和随后在几个丝氨酸和/或苏氨酸残基上的自磷酸化。它磷酸化MAPK4和MAPK6并激活下游靶标MAPKAPK5，MAPKAPK5是F-肌动蛋白聚合和细胞迁移的调节剂。PAK3还是整合素β-1信号转导的核心介质(HSC激活和纤维化疾病进展的关键介质)。人PAK3由UniProtKB O75914标识。
PAK3结构和功能描述于例如Deleris P.等，生物化学杂志.286：6470-6478(2011)和Chong C.等人，生物化学杂志.276：17347-17353(2001)，它们均通过引用整体并入本文。
由人PAK3基因转录的mRNA的可变剪接产生四种同种型：同种型1(UniProtKB：O75914-1，v2；SEQ ID NO：7165)，同种型2(O75914-2，SEQ ID NO：7166)，其中对应于SEQ IDNO：7165的第93-107位的氨基酸序列缺失，同种型3(O75914-3，SEQ ID NO：7167)，其中SEQID NO：7165的第92位的氨基酸被序列'TNSPFQTSRPVTVASSQSEGKM'替代，和同种型4(O75914-4，SEQ ID NO：7168)，其中对应于SEQ ID NO：7165的第92-107位的氨基酸序列被序列'TNSPFQTSRPVTVASSQSEGKM'替代。
人PAK3同种型1的559个氨基酸序列包含：位于SEQ ID NO：7165的第70-83位的CRIB结构域和第283-534位的蛋白激酶结构域。
在本说明书中，提及“PAK3”包括：人PAK3、人PAK3的同种型、人PAK3的同系物(即由非人动物的基因组编码)及其变体。在一些实施方案中，根据本公开的PAK3包含或由与SEQID NO：7165的氨基酸序列具有至少70％或更高的氨基酸序列同一性，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
TMF调节的核蛋白1(TRNP1)是一种DNA结合因子，可调节基因子集的表达，并在大脑新皮层的切向、径向和横向扩张中发挥关键作用。人TRNP1由UniProtKB Q6NT89标识。
TRNP1结构和功能描述于例如Stahl R.等，细胞，153：535-549(2013)，其全部内容通过引用并入本文。
人TRNP1的227个氨基酸序列如SEQ ID NO：7169(UniprotKB：Q6NT89-1，v2)所示。
在本说明书中，提及‘TRNP1’包括：人TRNP1、人TRNP1的同种型、人TRNP1的同系物(即由非人动物的基因组编码)及其变体。在一些实施方案中，根据本公开内容的TRNP1包含或由与SEQ ID NO：7169的氨基酸序列有70％或更高的氨基酸序列同一性，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
Apelin(APLN)是G蛋白偶联的Apelin受体(APLNR)的肽配体。APLN系统在许多器官的生理学和病理生理学中起着重要和多种作用，包括调节血压、心肌收缩力、血管生成、代谢平衡以及细胞增殖、细胞凋亡或炎症。Apelin在心脏、内皮、血管平滑肌细胞(VSMCs)、脑、肾、睾丸、卵巢、肝和脂肪组织中均有表达，其中肺和乳腺表达水平最高。人APLN由UniProtKB Q9ULZ1标识。
APLN结构和功能描述于例如Tatemoto K.等，生化和生物物理研究通讯，251：471-476(1998)，和Lee D.K.等人，神经化学杂志74：34-41(2000)，它们均通过引用整体并入本文。
人APLN的77个氨基酸序列如SEQ ID NO：7170(UniprotKB：Q9ULZ1-1，v1)所示。SEQID NO：7170包含第1-22位的信号肽和第23-41位的前肽。SEQ ID NO：7170通过蛋白水解加工被切割成一种或多种活性肽：Apelin-36(SEQ ID NO：7171)位于SEQ ID NO：7170的第42-77位，Apelin-31(SEQ ID NO：7172)位于SEQ ID NO：7170的第47-77位，Apelin-28(SEQ IDNO：7173)位于SEQ ID NO：7170的第50-77位，或Apelin-13(SEQ ID NO：7174)位于SEQ IDNO：7170的第65-77位。
在本说明书中，提及‘APLN’包括：人APLN、人APLN的同种型、人APLN的同系物(即由非人动物的基因组编码)、源自人APLN的蛋白水解肽及其变体。在一些实施方案中，根据本公开的APLN包含或由与SEQ ID NO：7170的氨基酸序列具有至少70％或更高的氨基酸序列同一性，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
驱动蛋白样蛋白KIF20A(也称为GG10_2、有丝分裂驱动蛋白样蛋白2(MKlp2)、Rab6相互作用驱动蛋白样蛋白(RAB6KIFL)、Rabkinesin-6)是染色体乘客复合体(CPC)介导的胞质分裂所需的有丝分裂驱动蛋白。KIF20A是polo样激酶1(Plk1)的靶标，磷酸化的KIF20A与Plk1的polo盒结构域结合。Plk1对KIF20A的磷酸化是Plk1在后期和末期空间限制到中央纺锤体所必需的，并且这两种蛋白质的复合物是胞质分裂所必需的。人KIF20A由UniProtKBO95235标识。
KIF20A结构和功能描述于例如Neef R.等，细胞生物学杂志.2003；162(5)：863-75，其全部内容通过引用并入本文。
由人KIF20A基因转录的mRNA的可变剪接产生两种同种型：同种型1(UniProtKB：O95235-1，v1；SEQ ID NO：7175)和同种型2(UniProtKB：O95235-2；SEQ ID NO：7176)，其中对应于SEQ ID NO：7175的65-82位的氨基酸序列缺失。
人KIF20A同种型1的890个氨基酸序列包含：SEQ ID NO：7175的第64-507位的驱动蛋白运动结构域和第611-762位的卷曲螺旋结构域。
在本说明书中，提及的“KIF20A”包括：人KIF20A、人KIF20A的同种型、人KIF20A的同系物(即由非人动物的基因组编码)及其变体。在一些实施方案中，根据本公开的KIF20A包含或由与SEQ ID NO：7175的氨基酸序列具有70％或更高的氨基酸序列同一性，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
淋巴毒素-β(LTB，也称为肿瘤坏死因子C(TNF-C)，肿瘤坏死因子配体超家族成员3)是一种促炎细胞因子，属于TNF家族，与受体LTBR/TNFRSF3结合。它参与免疫和炎症反应的调节，并与其他LT相关细胞因子如LT-α、TNFα和LIGHT(TNFSF14)及其受体一起，在次级淋巴器官的发育和稳态中发挥作用。人LTB由UniProtKB Q06643标识。
LTB结构和功能描述于例如Sudhamsu J.，等，美国国家科学院院刊，110：19896-19901(2013)；Browning J.L.等，细胞，72：847-856(1993)，Neville M.J.&Campbell R.D.，免疫学杂志，162：4745-4754(1999)；Crowe P.D.等，科学.1994；264(5159)：707-10；和Bjordahl R.L.等人，免疫学的最新观点，2013，25(2)：222–229，其全部内容通过引用并入本文。
由人类LTB基因转录的mRNA的可变剪接产生两种同种型：同种型1(UniProtKB：Q06643-1，v1；SEQ ID NO：7177)和同种型2(UniProtKB：Q06643-2；SEQ ID NO：7178)，其中对应于SEQ ID NO：7177的第53-77位的氨基酸序列被替换为序列‘GLGFRSCQRRSQKQISAPGSQLPTS’，并且SEQ ID NO：7177的第78-244位缺失。
人LTB同种型1的244个氨基酸序列包含：SEQ ID NO：7177的第1-18位的细胞质结构域、第19-48位的跨膜结构域和第49-244位的细胞外结构域。
在本说明书中，提及“LTB”包括：人LTB、人LTB的同种型、人LTB的同系物(即由非人类动物的基因组编码)及其变体。在一些实施方案中，根据本公开内容的LTB包含或由与SEQID NO：7177的氨基酸序列具有至少70％或更高的氨基酸序列同一性，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
如本文所用，蛋白质的“片段”、“变体”或“同系物”可任选地表征为与参照蛋白(例如参照同种型)的氨基酸序列具有至少60％、优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，参照蛋白的片段、变体、同种型和同系物可以被表征为执行由参照蛋白执行的功能的能力。
“片段”通常是指参照蛋白质的一部分。“变体”通常是指一种蛋白质，其氨基酸序列包含一个或多个相对于参照蛋白质的氨基酸序列的氨基酸取代、插入、缺失或其他修饰，但保留与参照蛋白的氨基酸序列相当程度的序列同一性(例如，至少60％)。“同种型”通常是指由与参照蛋白的物种相同的物种表达的参照蛋白的变体。“同系物”通常是指与参照蛋白质的物种相比由不同物种产生的参照蛋白质的变体。同系物包括直系同源物。
“片段”可以是任何长度(按氨基酸的数量)，尽管可以任选地是参照蛋白质(即片段所来源的蛋白质)长度的至少20％，并且可以具有参照蛋白长度的50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％之一的最大长度。
在一些实施方案中，靶基因/蛋白质(即MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB)是来自哺乳动物(哺乳动物(Mammalia)纲中的任何物种，例如灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人类灵长类动物或人类)和/或啮齿动物(例如大鼠或小鼠))的靶基因/蛋白质。
MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的同种型、片段、变体或同系物可任选地表征为与来自给定物种，例如人类的未成熟或成熟的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
本文所述的人类基因的同系物可以来自任何动物。在一些实施方案中，本文所述的人类基因的同系物可来自哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人类哺乳动物，例如灵长类动物(例如非人类灵长类动物，例如猕猴(Macaca)属动物(例如食蟹猴(Macaca fascicularis)、猕猴(Macaca mulatta))，例如非人类原始人(例如泛穴居人(Pantroglodytes)))。在一些实施方案中，哺乳动物可以是兔、豚鼠、大鼠、小鼠或啮齿(Rodentia)目动物、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(Bos)目动物(例如牛)、马(Equidae)科动物(例如马)或驴。
本文所述的人类蛋白质的同系物可任选地表征为与SEQ ID NO：7156至7178的氨基酸序列具有70％或更高的氨基酸序列同一性，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。本文所述的人蛋白质的变体可任选地表征为与SEQ ID NO：7156至7178的氨基酸序列具有70％或更高的氨基酸序列同一性，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同系物可以任选地是功能同种型、片段、变体或同系物，例如具有参照MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的功能特性/活性，其通过功能特性/活性的合适测定分析所确定。
对靶标的抑制
本发明涉及MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB(即本文所述的靶基因/蛋白质)的抑制。也就是说，本发明涉及抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的表达和/或活性及其下游功能结果。
MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制包括，相对于在没有抑制的情况下观察到的表达/活性水平，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任何一种或多种的表达(基因和/或蛋白质表达)的减少/降低，和/或MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中任何一种或多种的活性减少/降低。“抑制”在本文中也可称为“拮抗”。在根据本公开的方法中可以抑制所述基因/蛋白质中的任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种。
在一些实施方案中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制可以被表征为以下一项或多项(相对于未抑制状态)：
·降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的表达(例如基因和/或蛋白质表达)；
·降低编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA水平；
·减少/阻止编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的核酸转录；
·增加编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA(例如mRNA)的降解；
·降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白的水平；
·减少/防止编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA的转录后加工(例如剪接、翻译、翻译后加工)；
·促进/增加MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白的降解；
·降低/阻止MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB功能的水平；和/或
·减少/防止MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB，与MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的相互作用伴侣之间的相互作用。
基因表达可以通过本领域技术人员熟知的方式来确定。编码一种或多种靶蛋白的RNA水平可以通过例如RT-qPCR、northern印迹等技术来确定。举例来说，qRT-PCR可用于确定编码靶蛋白的RNA水平。
编码靶蛋白的RNA水平的降低可以是例如编码靶蛋白的核酸转录减少或编码靶蛋白的RNA降解增加的结果。
编码靶蛋白的核酸转录减少可以是抑制编码靶蛋白的DNA转录所需因子的组装和/或活性的结果。编码靶蛋白的RNA降解增加可以是编码靶蛋白的RNA酶促降解增加的结果，例如作为RNA干扰(RNAi)的结果，和/或编码目标蛋白的RNA稳定性降低。
蛋白质表达可以通过本领域技术人员熟知的方式来确定。编码靶蛋白的蛋白质水平可以通过例如基于抗体的方法，包括蛋白质印迹、免疫组织/细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT，或通过基于报告子的方法来确定。
靶蛋白水平的降低可以是例如编码靶蛋白的RNA水平降低、编码靶蛋白的RNA转录后加工减少、或靶蛋白降解增加的结果。
靶蛋白的转录后加工减少可以是例如编码靶蛋白的前体mRNA到编码靶蛋白的成熟mRNA的剪接减少、编码靶蛋白的mRNA的翻译减少、或靶蛋白的翻译后加工减少。
编码靶蛋白的前体mRNA到编码靶蛋白的成熟mRNA的剪接减少可以是剪接所需因子的组装和/或活性受到抑制的结果。编码靶蛋白的mRNA的翻译减少可以是抑制翻译所需因子的组装和/或活性的结果。靶蛋白翻译后加工(例如酶促加工、折叠)减少可以是抑制组装和/或靶蛋白翻译后加工所需因子活性的结果。靶蛋白降解增加可以是靶蛋白酶促(例如蛋白酶介导的)降解增加的结果。
在一些实施方案中，靶基因/蛋白质的抑制可以表征为靶蛋白质的功能水平降低。靶蛋白的功能可以是靶蛋白的任何功能特性。
相互作用伴侣可以是任何核酸或蛋白质，其与MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种相互作用，或共同促成共享功能。
在一些实施方案中，MFAP4的相互作用伴侣是整联蛋白αvβ3、弹性蛋白原、纤维蛋白原-1、纤维蛋白原-2、锁链蛋白、LOX、MFAP2、FBLN1、FBLN2、MFAP5、EFEMP2、EFEMP1、SFTPD或弹性蛋白。
在一些实施方案中，GRHPR的相互作用伴侣是乙醛酸盐、羟基丙酮酸盐、D-甘油酸盐、AGXT、HYI、GLYCTK、PGP、GLO1、HAO1、HAO2、DAO、NADPH或NADH。
在一些实施方案中，ITFG1的相互作用伴侣是RUVBL1、RUVBL2、α-微管蛋白、TIPIN、ATP9A、ASCC2、RFX7或TM7SF3。
在一些实施例中，ABCC4的相互作用伴侣是ATP、ABCG4、SNX27、ABCA3、ABCE1、MRPS7、SLC22A8、SLCO1B1、NR1H4或SLC22A6。
在一些实施例中，PAK3的相互作用伴侣是PAK1、CDC42、NCK1、MAPK14、RAC1、PXN、GIT1、GIT2、ARHGEF7、或ARHGEF6。
在一些实施例中，TRNP1的相互作用伴侣是TMF1、FAM18A、CNIH3、SMARCC2、FAM19A3、TBC1D3A、TBC1D3D、ARHGAP11B或GPR56。
在一些实施例中，APLN的相互作用伴侣是APLNR、AGTR1、AGT、CXCR4、CCR5、KNG1、NPY、PDYN、NMU或POMC。
在一些实施方案中，KIF20A的相互作用伴侣是MAD2L1、AURKB、RACGAP1、KIF11、PLK1、CDCA8、KIF4A、CENPE、PRC1或INCENP。
在一些实施方案中，LTB的相互作用伴侣是LTBR、LTA、TNF、TNFSF14、TNFRSF1B、TNFSF13B、TNFRSF11A、CD40LG、MAP3K14、TNFSF11。
MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的功能特性可以使用适当的测定法，例如体外试验进行分析。
在一些实施方案中，MFAP4抑制增加Ptgs2、Areg、Dhrs9、Hmox1、Nqo1、P70S6k、p38、mTOR和/或ERK2中的一种或多种的表达和/或活化。在一些实施方案中，MFAP4抑制剂激活mTOR、p70S6K、ERK和p38信号通路。
靶蛋白与靶蛋白的相互作用伴侣之间的相互作用的抑制可以例如通过检测靶蛋白和相互作用伴侣之间的相互作用水平相对于对照、未抑制条件的降低来测定。蛋白质相互作用的能力可以通过本领域技术人员熟知的方法来分析，例如免疫共沉淀和共振能量转移(RET)测定。
还可以通过分析一种或多种靶蛋白功能相关物来评估靶蛋白功能的抑制。也就是说，可以通过分析靶蛋白功能的下游功能结果来评估靶蛋白功能。例如，靶蛋白功能的抑制可以通过检测一种或多种蛋白的表达(基因和/或蛋白表达)和/或活性的降低来测定，所述蛋白的表达由于靶蛋白功能而直接/间接上调。靶蛋白功能的抑制也可以通过检测一种或多种蛋白的表达(基因和/或蛋白表达)和/或活性的增加来测定，这些蛋白的表达由于靶蛋白功能而直接/间接下调。
抑制剂
本文提供靶向选自下组的一种或多种基因/蛋白质的抑制剂：MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和LTB。
“MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制剂”是指能够抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的表达和/或功能的任何药剂。此类药剂可以是抑制(即可以直接或间接引起)MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中任一种或多种的效应物，如上文所述。
能够抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的药剂在本文中可称为MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB抑制剂。MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB抑制剂在本文中也可称为MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的拮抗剂，或MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB拮抗剂。
MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的“抑制剂”可以指能够抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB的任何药剂。此外，“MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制剂”可以指能够抑制选自下组的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、或九种靶基因/蛋白质的两种或多种药剂：MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和LTB。多种抑制剂可用于本公开的方法中以靶向两种或更多种靶基因/蛋白质。
在一些实施方案中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB(即靶蛋白)的抑制剂可以：
·减少/阻止MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的表达(例如基因和/或蛋白质表达)；
·降低编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA水平；
·减少/阻止编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的核酸转录；
·增加编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA(例如mRNA)的降解；
·降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白的水平；
·减少/阻止编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA的转录后加工(例如剪接、翻译、翻译后加工)；
·促进/增加MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白的降解；
·降低/阻止MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB功能的水平；和/或
·减少/阻止MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB，与MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的相互作用伴侣之间的相互作用。
应当理解，给定的抑制剂可以显示多于一种的在前一段中列举的性质。可以使用合适的测定法评估给定抑制剂在前一段中所述的特性。测定可以是例如体外测定，可选择基于细胞的测定或无细胞测定。测定可以是例如体内测定，即在非人类动物中进行。
当测定是基于细胞的测定时，它们可以包括用抑制剂(例如核酸)处理细胞以确定抑制剂是否显示一种或多种所述特性。测定可以使用标记有可检测实体的种类以促进它们的检测。测定可包括在用一定范围的量/浓度的给定抑制剂(例如稀释系列)分别处理细胞后评估所述特性。应当理解，细胞优选是表达待抑制的靶蛋白的细胞，例如肝细胞(例如HepG2细胞或HuH7细胞)。
此类测定结果的分析可包括确定达到相关活性最大水平的50％时的浓度。达到相关活性最大水平的50％时的核酸浓度可称为抑制剂相对于相关活性的“半数最大有效浓度”，也可称为'EC50'。举例来说，用于增加编码靶蛋白的RNA降解的给定抑制剂(例如抑制性核酸)的EC50可以是达到编码靶蛋白的RNA降解的最大水平的50％时的浓度。
根据特性，EC50也可称为“半数最大抑制浓度”或“IC50”，这是观察到给定特性最大抑制水平的50％时的抑制剂浓度。举例来说，用于降低编码靶蛋白的基因表达的给定抑制剂(例如抑制性核酸)的IC50可以是达到基因表达抑制最大水平的50％时的浓度。
能够减少/阻止MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的任一种或多种的基因表达的药剂(例如降低编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA的水平；减少/阻止编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的核酸转录；和/或增加编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA的降解)可以使用包括检测编码靶蛋白的RNA水平的方法来鉴定，例如通过RT-qPCR(本领域技术人员熟知的技术)。该方法可以使用引物和/或探针来检测和/或定量编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA。
此类测定法可包括向在体外培养物中表达靶蛋白的细胞中引入(例如通过转染)(i)推定的抑制剂(例如抑制性核酸)，或(ii)对照剂(例如对照核酸，例如已知不影响编码靶蛋白的RNA水平的核酸)，随后(例如在适当的时间段后，即足以观察到靶蛋白的基因表达/编码所述靶蛋白的核酸的转录水平/编码靶蛋白的RNA水平降低，或编码靶蛋白的RNA降解水平增加的时间段)测量根据(i)和(ii)的细胞中编码靶蛋白的RNA水平和，(iii)比较检测到的编码靶蛋白的RNA水平以确定推定的抑制剂是否减少/阻止靶蛋白的基因表达，减少/阻止编码靶蛋白的核酸的转录，降低编码靶蛋白的RNA水平，和/或增加编码靶蛋白的RNA的降解。
能够降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的任一种或多种的蛋白质表达的药剂(例如降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白的水平，增加MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白的降解)可以使用包括检测靶蛋白水平的方法来鉴定，例如使用基于抗体/报告子的方法(蛋白质印迹、ELISA、免疫组织/细胞化学等)。此类测定可包括用药剂处理细胞/组织，随后将此类细胞/组织中的靶蛋白水平与适当对照条件(例如未处理/溶媒处理的细胞/组织)的细胞/组织中的靶蛋白水平进行比较。
该方法可以使用对靶蛋白特异的抗体。此类测定可包括向在体外培养物中的表达靶蛋白的细胞引入(例如通过转染)(i)推定的抑制剂(例如抑制性核酸)，或(ii)对照剂(例如已知不影响靶蛋白的水平的核酸)，随后(例如在适当的时间段后，即足以观察到靶蛋白水平降低的时间段)测量根据(i)和(ii)的细胞中靶蛋白的水平，以及(iii)比较检测到的靶蛋白的水平以确定推定的抑制剂是否降低靶蛋白的水平和/或减少/阻止编码靶蛋白的mRNA的翻译。
能够降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的任一种或多种的功能水平(例如，如本文所述的靶蛋白的功能)的药剂可以使用包括检测相关功能水平的方法来鉴定。此类测定法可包括向在体外培养物中的表达靶蛋白的细胞引入(例如通过转染)(i)推定的抑制剂(例如抑制性核酸)，或(ii)对照剂(例如已知不影响靶蛋白功能的核酸)，随后(例如在适当的时间段后，即足以观察到靶蛋白功能水平降低的时间段)测量在根据(i)和(ii)的细胞中靶蛋白的功能水平，和(iii)比较检测到的靶蛋白的功能水平以确定推定的抑制剂是否降低靶蛋白的功能水平。
本文提及“靶蛋白的功能”可以指MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白的任何功能特性和/或介导的活性。
能够降低/阻止编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的任一种或多种的前体mRNA(pre-mRNA)正常剪接的药剂可以使用包括检测和/或量化编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的一种或多种亚型的RNA(例如成熟mRNA)水平来鉴定。此类测定可包括通过RT-qPCR定量编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的一种或多种同种型的RNA(例如成熟mRNA)。该方法可以使用引物和/或探针来检测和/或定量由编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的基因转录的前体mRNA的经典剪接产生的成熟mRNA，和/或使用引物和/或探针来检测和/或定量由编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的基因转录的前体mRNA的可变剪接产生的成熟mRNA。
通过经典剪接从编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A、和/或LTB的基因转录的前体mRNA产生的成熟mRNA，可以是编码主要同种型的成熟mRNA，其通过表达编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A、和/或LTB的基因产生。主要同种型可以是最常产生/检测到的同种型。例如，由人MFAP4转录的前体mRNA的经典剪接产生的成熟mRNA可以是编码人MFAP4同种型1(即具有SEQ ID NO：7156所示的氨基酸序列)的成熟mRNA。通过可变剪接从编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的基因转录的前体mRNA产生的成熟mRNA可以是编码主要同种型之外的同种型的成熟mRNA，其通过所述基因的表达产生。例如，通过可变剪接从人MFAP4转录的前体mRNA产生的成熟mRNA可以是编码除同种型1之外的人MFAP4同种型的成熟mRNA(即具有不同于SEQID NO：7156的氨基酸序列)；例如编码人MFAP4同种型2的成熟mRNA(即具有SEQ ID NO：7157所示的氨基酸序列)。
此类测定法可包括，在体外培养中，将(i)推定的抑制剂(例如抑制性核酸)，或(ii)对照药剂(例如，已知不影响编码靶基因的前体mRNA剪接的核酸)，引入(例如通过转染)表达MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的细胞中，随后(例如，在适当的时间段后，即足以观察到对编码靶基因的前体mRNA的剪接产生影响的时间段)，测量根据(i)和(ii)的细胞中编码靶基因的一种或多种同种型的成熟mRNA的水平，和(iii)比较编码同种型的成熟mRNA的水平以确定推定的抑制剂是否减少/阻止编码靶基因的前体mRNA的正常剪接。
能够减少本文所述的靶蛋白与所述靶蛋白的相互作用伴侣之间的相互作用的药剂可以使用包括检测靶蛋白与其相互作用伴侣之间的相互作用水平的方法(例如使用基于抗体/报告子的方法)来鉴定。可以例如使用共振能量转移技术(例如FRET、BRET)，或分析目标蛋白与其相互作用伴侣之间相互作用相关性的方法，来分析靶蛋白与其相互作用伴侣之间的相互作用水平。所述方法可包括，用药剂处理细胞/组织，随后，将靶蛋白与其相互作用伴侣在此类细胞/组织中的相互作用水平，与靶蛋白与其相互作用伴侣在合适的对照条件(例如未经处理/溶媒处理的细胞/组织)的细胞/组织中的相互作用水平进行比较。还可以例如使用ELISA、表面等离子体共振或生物层干涉测量分析等技术分析靶蛋白与其相互作用伙伴之间的相互作用水平。所述方法可包括，将存在药剂时靶蛋白与其相互作用伴侣之间的相互作用水平，与合适的对照条件下(例如不存在药剂)靶蛋白与其相互作用伴侣之间的相互作用水平进行比较。
在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的基因的表达降低至在不存在抑制剂，或存在已知不抑制相关基因表达的相同数量的对照试剂时观察到的表达水平1倍以下，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍之一。在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的基因的表达降低至在不存在抑制剂，或存在已知不抑制相关基因表达的相同数量的对照试剂时观察到的表达水平的100％以下，例如≤99％、≤95％、≤90％、≤85％、≤80％、≤75％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％、≤35％、≤30％、≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤5％、或≤1％之一。
在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的RNA水平降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA水平的相同数量的对照试剂时观察到的水平的1倍以下，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍之一。在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的RNA水平降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的RNA水平的相同数量的对照试剂时观察到的水平的100％以下，例如≤99％、≤95％、≤90％、≤85％、≤80％、≤75％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％、≤35％、≤30％、≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤5％、或≤1％之一。
在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的核酸转录水平降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的核酸转录的相同数量的对照试剂时观察到的水平的1倍以下，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍之一。在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的核酸转录水平降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的核酸转录的相同数量的对照试剂时观察到的水平的100％以下，例如≤99％、≤95％、≤90％、≤85％、≤80％、≤75％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％、≤35％、≤30％、≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤5％、或≤1％之一。
在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白中的任一种或多种的水平降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白水平的相同数量的对照试剂时观察到的水平的1倍以下，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍之一。在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白中的任一种或多种的水平降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白水平的相同数量的对照试剂时观察到的水平的100％以下，例如≤99％、≤95％、≤90％、≤85％、≤80％、≤75％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％、≤35％、≤30％、≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤5％、或≤1％之一。
在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的功能水平降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB功能水平的相同数量的对照试剂时观察到的水平的1倍以下，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍之一。在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的功能水平降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB功能水平的相同数量的对照试剂时观察到的水平100％以下，例如≤99％、≤95％、≤90％、≤85％、≤80％、≤75％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％、≤35％、≤30％、≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤5％、或≤1％之一。
在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种与相互作用伴侣的结合水平降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低所述结合水平的相同数量的对照试剂时观察到的水平的1倍以下，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍之一。在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种与相互作用伴侣的结合水平降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低所述相关结合水平的相同数量的对照试剂时观察到的水平的100％以下，例如≤99％、≤95％、≤90％、≤85％、≤80％、≤75％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％、≤35％、≤30％、≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤5％、或≤1％之一。
在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的前体mRNA的正常剪接降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低编码所述相关靶蛋白的前体mRNA的正常剪接的相同数量的对照试剂时观察到的水平的1倍以下，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍之一。在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的前体mRNA的正常剪接降低至在不存在抑制剂，或存在已知不降低编码所述相关靶蛋白的前体mRNA的正常剪接的相同数量的对照试剂时观察到的水平的100％以下，例如≤99％、≤95％、≤90％、≤85％、≤80％、≤75％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％、≤35％、≤30％、≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤5％、或≤1％之一。
在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的mRNA的翻译降低至在不存在所述抑制剂，或存在已知不降低编码所述相关靶蛋白的mRNA的翻译的相同数量的对照试剂时观察到的水平的1倍以下，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍之一。在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的mRNA的翻译降低至在不存在所述抑制剂，或存在已知不降低编码所述相关靶蛋白的mRNA的翻译的相同数量的对照试剂时观察到的水平的100％以下，例如≤99％、≤95％、≤90％、≤85％、≤80％、≤75％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％、≤35％、≤30％、≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤5％、或≤1％之一。
依照前述八段的优选降低水平为降低至小于0.5倍/≤50％，例如小于0.4倍/≤40％、小于0.3倍/≤30％、小于0.2倍/≤20％、小于0.15倍/≤15％、或小于0.1倍/≤10％之一。
在一些实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂可以将编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的RNA的降解增加至在不存在所述抑制剂，或存在已知不会增加编码所述相关靶蛋白的RNA降解的相同数量的对照试剂时观察到的水平1倍以上，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍之一。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制剂阻止或沉默编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，根据本公开的抑制剂在蛋白质水平上阻止或沉默MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的表达。如本文所用，给定基因/蛋白质的表达可被认为是“被阻止的”或“沉默的”，其中，表达水平降低至在不存在所述抑制剂，或存在已知不是所述相关靶蛋白的表达的抑制剂的相同数量的对照试剂时观察到的水平的小于0.1倍/≤10％。
在优选的实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂(例如抑制性核酸，例如siRNA或shRNA)抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的基因和/或蛋白表达是在不存在所述抑制剂，或存在已知不抑制所述相关靶基因/蛋白的表达的相同数量的对照试剂时观察到的水平的大于50％，例如≥60％、≥61％、≥62％、≥63％、≥64％、≥65％、≥66％、≥67％、≥68％、≥69％、≥70％、≥71％、≥72％、≥73％、≥74％、≥75％、≥76％、≥77％、≥78％、≥79％、≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％之一。
在优选的实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂(例如抑制性核酸，例如siRNA或shRNA)抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的基因表达(例如，通过qRT-PCR测定)是在不存在所述抑制剂，或存在已知不抑制所述相关靶基因/蛋白的表达的相同数量的对照试剂时观察到的水平的大于50％，例如≥60％、≥61％、≥62％、≥63％、≥64％、≥65％、≥66％、≥67％、≥68％、≥69％、≥70％、≥71％、≥72％、≥73％、≥74％、≥75％、≥76％、≥77％、≥78％、≥79％、≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％之一。
在优选的实施方案中，在给定的测定中，根据本公开的抑制剂(例如抑制性核酸，例如siRNA或shRNA)，抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的蛋白表达(例如，通过ELISA测定)是在不存在所述抑制剂，或存在已知不抑制所述相关靶基因/蛋白的表达的相同数量的对照试剂时观察到的水平的大于50％，例如≥60％、≥61％、≥62％、≥63％、≥64％、≥65％、≥66％、≥67％、≥68％、≥69％、≥70％、≥71％、≥72％、≥73％、≥74％、≥75％、≥76％、≥77％、≥78％、≥79％、≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％之一。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制剂(例如抑制性核酸，例如siRNA或shRNA)可以以≤1μM，例如≤500nM、≤100nM、≤75nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤15nM、≤12.5nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤900pM、≤800pM、≤700pM、≤600pM、≤500pM、≤400pM、≤300pM、≤200pM、≤100pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤10pM或≤1pM之一的IC50抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种或多种的基因和/或蛋白质表达。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制剂可以以≤1nM、≤900pM、≤800pM、≤700pM、≤600pM、≤500pM、≤400pM、≤300pM、≤200pM、≤100pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤10pM或≤1pM的IC50抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A、和/或LTB中的任一种或多种的基因表达(例如，通过qRT-PCR测定)。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制剂可以以≤1nM、≤900pM、≤800pM、≤700pM、≤600pM、≤500pM、≤400pM、≤300pM、≤200pM、≤100pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤10pM或≤1pM的IC50抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A、和/或LTB中的任一种或多种的蛋白质表达(例如，通过ELISA测定)。
抑制剂的种类
根据本公开的抑制剂可以是具有适当抑制活性的任何种类的试剂。
本文所用的术语“抑制剂”是指降低或抑制靶分子的至少一种功能或生物活性的试剂，例如本文所述的那些。
根据本公开的抑制剂可以是能够结合MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB mRNA或蛋白质中的任一种或多种的分子，能够结合MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A、和/或LTB中的一种或多种的相互作用伴侣的分子，或能够降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达的分子。
在一些实施方案中，抑制剂能够结合根据SEQ ID NO：7156至7178中任一项或多项的多肽，或根据SEQ ID NO：7179至7195中任一项的mRNA。
在一些实施方案中，抑制剂靶向例如能够结合至SEQ ID NO：7156至7178的任一个或多个的功能结构域或区域。在一些实施方案中，抑制剂靶向包含SEQ ID NO：7156的第22-255、26-28或32-255位的区域。在一些实施方案中，抑制剂靶向包含SEQ ID NO：7158的第83-84、162-164、185-188、217、243、245、269和293-296位中的一个或多个位置的区域。在一些实施方案中，抑制剂靶向包含SEQ ID NO：7160第258-293位的区域。在一些实施方案中，抑制剂靶向包含SEQ ID NO：7161的第92-377、410-633、714-1005、1041-1274、445-452或1075-1082位的区域。在一些实施方案中，抑制剂靶向包含SEQ ID NO：7165的第70-83或283-534位的区域。在一些实施方案中，抑制剂靶向包含SEQ ID NO：7175的第64-507或611-762位的区域。在一些实施方案中，抑制剂靶向包含SEQ ID NO：7177的第1-18、19-48、或49-244位的区域。
在一些实施方案中，抑制剂能够结合MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的相互作用伴侣，例如上文所述的那些。
可以使用任何合适的方法检测分子与相关因子(即本文所述的靶基因/蛋白质，或所述蛋白质的相互作用伴侣)的结合来鉴定此类结合分子。这样的方法可以包括检测相关因子和分子之间复合物的形成。
在一些实施方案中，抑制剂是核酸、肽、抗体、抗原结合分子或小分子抑制剂。
可通过筛选小分子文库来鉴定结合本文所述的靶mRNA/蛋白质或其结合伴侣的小分子抑制剂。如本文所用，“小分子”是指低分子量(<1000道尔顿，通常在～300-700道尔顿之间)的有机化合物。可以通过例如使用Horswill AR等，PNAS，2004，101(44)15591-15596中描述的方法来鉴定结合本文所述的靶mRNA/蛋白质的小分子抑制剂，其全部内容通过引用并入本文。
GRHPR的抑制剂可以是4-羟基-2-酮戊二酸。
ABCC4的抑制剂可以是甲氨蝶呤、巯基嘌呤、齐多夫定、双嘧达莫、丙磺舒、磺吡酮、氟尿嘧啶、卢卡帕尼(Rucaparib)、阿德福韦酯、头孢唑啉、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478、丹曲林、格拉芬宁、萘啶酸或哌唑嗪。
PAK3的抑制剂可以是FRAX597。
APLN的抑制剂可以是ML221，一种爱帕琳肽受体(APJ)拮抗剂。
KIF20A的抑制剂可以是BKS0349或Paprotrain。
本文提供的抑制剂包括肽/多肽，例如肽适体、硫氧还蛋白、单体、anticalin、Kunitz结构域、高亲和性多聚体(avimers)、胱氨酸结(knottins)、fynomers、atrimers、DARPins、亲合体(affibodies)、纳米抗体(即单域抗体(sdAbs))、affilins、犰狳重复蛋白(ArmRPs)、OBodies和纤连蛋白——综述于Reverdatto等，Curr Top Med Chem.2015；15(12)：1082-1101，其全部内容通过引用并入本文(另参见例如Boersma等，J Bioi Chem(2011)286：41273-85和Emanuel等，Mabs(2011)3：38-48)。抑制剂包括可以通过筛选相关肽/多肽库来鉴定的肽/多肽。肽/多肽抑制剂可称为抑制肽/多肽。
抑制肽/多肽还可以包括，例如，感兴趣的目标基因/mRNA/蛋白质(即MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB)的肽/多肽相互作用伴侣。
肽/多肽相互作用伴侣可以基于感兴趣的靶基因/mRNA/蛋白质的相互作用伴侣，并且可以例如包含所述靶标的相互作用伴侣的片段。肽/多肽相互作用伙伴可以基于MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种，并且可以例如包含与所述mRNA/蛋白质的相互作用伴侣结合的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的片段。此类试剂可充当“诱饵”分子，并且优选地显示竞争性抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB与MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的相应相互作用伴侣之间的相互作用。
MFAP4的抑制剂可以是例如能阻断MFAP4与整联蛋白受体、整联蛋白αvβ3、弹性蛋白原、纤维蛋白原-1、纤维蛋白原-2、锁链素、LOX、MFAP2、FBLN1、FBLN2、MFAP5、EFEMP2、EFEMP1、SFTPD或弹性蛋白之间相互作用的肽/多肽。
GRHPR的抑制剂可以是例如能够阻断GRHPR与乙醛酸、羟基丙酮酸、D-甘油酸、AGXT、HYI、GLYCTK、PGP、GLO1、HAO1、HAO2、DAO、NADPH或NADH之间相互作用的肽/多肽。
ITFG1的抑制剂可以是例如能够阻断ITFG1和RUVBL1、RUVBL2、α-微管蛋白、TIPIN、ATP9A、ASCC2、RFX7或TM7SF3之间相互作用的肽/多肽。
ABCC4的抑制剂可以是例如能够阻断ABCC4和ATP、ABCG4、SNX27、ABCA3、ABCE1、MRPS7、SLC22A8、SLCO1B1、NR1H4或SLC22A6之间相互作用的肽/多肽。
PAK3抑制剂可以是例如能够阻断PAK3和PAK1、CDC42、NCK1、MAPK14、RAC1、PXN、GIT1、GIT2、ARHGEF7或ARHGEF6之间相互作用的肽/多肽。
TRNP1抑制剂可以是例如能够阻断TRNP1和TMF1、FAM18A、CNIH3、SMARCC2、FAM19A3、TBC1D3A、TBC1D3D、ARHGAP11B或GPR56之间相互作用的肽/多肽。
APLN抑制剂可以是例如能够阻断APLN和APLNR、AGTR1、AGT、CXCR4、CCR5、KNG1、NPY、PDYN、NMU或POMC之间相互作用的肽/多肽。
KIF20A抑制剂可以是例如能够阻断KIF20A和MAD2L1、AURKB、RACGAP1、KIF11、PLK1、CDCA8、KIF4A、CENPE、PRC1或INCENP之间相互作用的肽/多肽。
LTB抑制剂可以是例如能够阻断LTB与LTBR、LTA、TNF、TNFSF14、TNFRSF1B、TNFSF13B、TNFRSF11A、CD40LG、MAP3K14、TNFSF11之间相互作用的肽/多肽。
在一些实施方案中，抑制肽/多肽可包含或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的一种或多种的相互作用伴侣的氨基酸序列，或其片段的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％之一的序列同一性。
在一些实施方案中，抑制肽/多肽可包含或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的一种或多种的氨基酸序列，或其片段的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％之一的序列同一性。在这样的实施方案中，应当理解，与蛋白质的野生型形式相比，抑制性肽/多肽将缺乏正常活性和/或具有降低的活性。例如，在一些实施方案中，抑制肽/多肽可以是MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的变体(例如突变体)版本，其相对于野生型MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB具有降低的功能。
抑制性肽/多肽包括适体。核酸适体已综述于例如Zhou和Rossi，Nat Rev DrugDiscov.2017 16(3)：181-202，并且可以通过指数富集的配体系统进化(SELEX)方法或通过开发SOMAmers(慢解离率修饰的适体)来鉴定和/或生产(Gold L等.(2010)PLoS ONE 5(12)：e15004)。适体和SELEX在Tuerk和Gold，科学(1990)249(4968)：505-10和WO91/19813中有所描述。核酸适体可包含DNA和/或RNA，可以是单链或双链的。它们可以包含经化学修饰的核酸，例如其中糖和/或磷酸盐和/或碱基被化学修饰。这种修饰可以提高适体的稳定性或使适体更耐降解，并且可以包括核糖2’位的修饰。核酸适体可以化学合成，例如在固相上。固相合成可以使用亚磷酰胺化学。简而言之，将固相支持的核苷酸去三苯甲基化，然后与适当活化的核苷亚磷酰胺偶联以形成亚磷酸酯三酯键。然后可封端，然后用氧化剂(通常是碘)氧化亚磷酸三酯。之后可以重复该循环以组装适体(例如，参见Sinha，N.D.；Biernat，J.；McManus，J.；
H.核酸研究.1984，12，4539；和Beaucage，S.L.；Lyer，R.P.(1992).四面体48(12)：2223)。Reverdatto等，Curr Top Med Chern.(2015)15(12)：1082-101，对肽适体及其生成和鉴定方法进行了综述，其全部内容通过引用并入本文。
抑制性肽/多肽还包括抗体(免疫球蛋白)，例如单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其片段和衍生物(例如Fv、scFv、Fab、scFab、F(ab')2、Fab2、双抗体、三抗体、scFv-Fc、微型抗体、单域抗体(如VhH)等)。
在一些实施方案中，本文所述的抑制剂是能够结合MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的抗体。
MFAP4抑制剂可以是目录号为PA5-42013(ThermoFisher)或ab169757(abcam)的抗体。GRHPR抑制剂可以是目录号为PA5-54652(赛默飞世尔)或ab155604(艾博抗)的抗体。ITFG1抑制剂可以是目录号为PA5-54067(赛默飞世尔)或TA339563(傲锐基因)的抗体。ABCC4抑制剂可以是目录号为PA5-82019(赛默飞世尔)或ab15602(艾博抗)的抗体。PAK3抑制剂可以是目录号为PA5-79781(赛默飞世尔)或ab40808(艾博抗)的抗体。TRNP1抑制剂可以是目录号为PA5-71277(赛默飞世尔)或ab174303(艾博抗)的抗体。APLN抑制剂可以是APLN阻断抗体。APLN抑制剂可以是目录号为PA5-114860(赛默飞世尔)或ab125213(艾博抗)的抗体。KIF20A的抑制剂可以是目录号为PA5-38648(赛默飞世尔)的抗体。LTB抑制剂可以是抗体(例如重组小鼠抗LTA和LTB抗体(CBL543))。
与MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种结合的抑制剂/抑制分子，或与其相互作用伴侣结合的抑制剂/抑制分子，可显示出与相关因子(即相关的mRNA/蛋白质，或所述mRNA/蛋白质的相互作用伴侣)的特异性结合。如本文所用，“特异性结合”是指选择性结合，其可区别于对非靶分子的非特异性结合。
特异性结合MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中任一项的抑制剂或结合分子优选地与结合其他非目标分子相比，以更高的亲和力和/或更长的持续时间结合MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB。此类结合分子可被描述为“特异于”MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种。特异性结合MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中任一种的相互作用伴侣的抑制剂或结合分子优选地与结合其他非目标分子相比，以更高的亲和力和/或更长的持续时间结合MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB；此类结合分子可被描述为“特异于”MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中任一种的相互作用伴侣。
在一些实施方案中，本文所述的抑制剂/结合分子抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中任一种结合其相应的相互作用伴侣(即，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB各自的相互作用伴侣)。在一些实施方案中，抑制剂/结合分子表现为MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任一种与其相应的相互作用伴侣之间相互作用的竞争性抑制剂。结合分子可占据或以其他方式减少接近结合相应的相互作用伴侣所需的蛋白质区域，或可占据或以其他方式减少接近结合相应蛋白质所需的相互作用伴侣区域。
抑制剂(例如结合分子)抑制感兴趣的蛋白质和相应的相互作用伴侣之间的相互作用的能力可以例如通过在抑制剂的存在下，或在一种或两种相互作用伴侣与抑制剂孵育后分析相互作用来评估。确定给定的结合剂是否能够抑制感兴趣的蛋白质和相应的相互作用伴侣之间的相互作用的合适方法的例子是竞争性ELISA。
本文所述的抑制剂可以是能够降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中任一种的表达的分子。“能够降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中任一种的表达的分子”是指能够降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的任意一个的基因、mRNA和/或蛋白质表达的分子。在一些实施方案中，该分子降低或阻止根据SEQ ID NO：7156至7178的多肽的表达。在一些实施方案中，该分子降低或阻止来自根据SEQ ID NO：7179至7195的序列的多肽的表达。
抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB或其同种型的表达将优选地导致由细胞/组织/器官/器官系统/受试者表达的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB的量降低。例如，在给定细胞中，通过施用合适的核酸抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB将导致相对于未处理细胞的表达水平降低。抑制可能是局部的。优选的抑制程度是至少50％，更优选地，至少60％、70％、80％、85％、或90％之一。90％到100％之间的抑制水平被认为是表达或功能的“沉默”。基因和蛋白质表达可如本文所述或通过本领域技术人员熟知的方法来确定。
在一些实施方案中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制可以包括修饰细胞以降低或阻止MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达。在一些实施方案中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制包括修饰编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的核酸。与未修饰的细胞相比，修饰导致细胞具有降低水平的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的基因和/或蛋白质表达。
在一些实施方案中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制可以包括修饰编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的基因。
在一些实施方案中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制包括向编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的核酸序列中引入插入、取代或缺失。
在一些实施方案中，抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB包括引入减少或阻止来自修饰的核酸序列的根据SEQ ID NO：7156至7178中任一项的多肽表达的修饰。在一些实施方案中，抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB包括修饰细胞以包含不编码根据SEQ ID NO：7156至7178中任一项的氨基酸序列的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的等位基因。在一些实施方案中，抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB包括修饰细胞以缺乏编码根据SEQ ID NO：7156至7178中任一项的多肽的核酸。
在一些实施方案中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制包括修饰相关基因以在从所述基因转录的序列中引入提前终止密码子。在一些实施方案中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制包括修饰相关基因以编码截短的和/或非功能性多肽。在一些实施方案中，抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB包括修饰相关基因以编码错误折叠和/或降解的多肽。
修饰编码感兴趣的蛋白质的核酸的方法，和实现该方法的试剂，是本领域众所周知的，并且包括例如包括通过同源重组修饰靶核酸，以及使用位点特异性核酸酶(SSN)编辑靶核酸。
合适的方法可以采用同源重组靶向，综述于，例如Mortensen，Curr ProtocNeurosci.(2007)第4章：4.29节和Vasquez等，PNAS 2001，98(15)：8403-8410，两者均通过引用整体并入本文。同源重组靶向涉及通过同源序列引导的交叉事件交换核酸序列。
在一些实施方案中，该方法采用使用SSN的靶核酸编辑。使用SSN进行基因编辑综述于例如Eid和Mahfouz，Exp Mol Med.2016年10月；48(10)：e265，其全部内容通过引用并入本文。可以设计能够产生位点特异性双链断裂(DSB)的酶，以将DSB引入感兴趣的目标核酸序列。DSB可以通过容易出错的非同源末端连接(NHEJ)修复，其中，断裂的两端重新连接，通常伴有核苷酸的插入或删除。或者，DSB可以通过高度同源性定向修复(HDR)进行修复，其中，提供末端与断裂位点同源的DNA模板并将其引入DSB位点。
能够被设计为产生目标核酸序列特异性DSB的SSN包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和成簇的规则间隔回文重复序列/CRISPR相关9(CRISPR/Cas9)系统。
ZFN系统综述于例如Umov等，Nat Rev Genet.(2010)11(9)：636-46，其全部内容通过引用并入本文。ZFN包含可编程的锌指DNA结合结构域和DNA切割结构域(例如FokI核酸内切酶结构域)。可以通过筛选能够结合靶核酸序列的锌指阵列来鉴定DNA结合结构域。
TALEN系统综述于例如在Mahfouz等，植物生物技术杂志(2014)12(8)：1006-14中，其全部内容通过引用并入本文。TALEN包含可编程的DNA结合TALE结构域和DNA切割结构域(例如FokI核酸内切酶结构域)。TALE包含由33-39个氨基酸的重复组成的重复结构域，除了每个重复的第12和13位的两个残基是重复可变双残基(RVD)之外，它们是相同的。每个RVD根据以下关系确定所述重复与靶DNA序列中核苷酸的结合：“HD”与C结合，“NI”与A结合，“NG”与T结合，“NN”或“NK”与G结合(Moscou和Bogdanove，科学(2009)326(5959)：1501.)。
CRISPR/Cas9和相关系统，例如CRISPR/Cpf1、CRISPR/C2c1、CRISPR/C2c2和CRISPR/C2c3，综述于例如Nakade等人，Bioengineered(2017)8(3)：265-273中，其全部内容通过引用并入本文。这些系统包含核酸内切酶(例如Cas9、Cpf1等)和单向导RNA(sgRNA)分子。可以对sgRNA工程改造，以将核酸内切酶活性靶向感兴趣的核酸序列。
在一些实施方案中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的抑制采用靶向相关核酸序列的位点特异性核酸酶(SSN)系统。因此，在一些实施方案中，抑制剂包含或由靶向编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种核酸的SSN系统组成。在一些实施方案中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的抑制采用编码靶向相关核酸序列的SSN系统的核酸。
在一些实施方案中，SSN系统靶向，蛋白质功能所需的编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白质结构域的核酸区域，例如，如本文所述的结构域。
在一些实施方案中，SSN系统是ZFN系统、TALEN系统、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/C2c1系统、CRISPR/C2c2系统或CRISPR/C2c3系统。
在一些实施方案中，SSN系统是CRISPR/Cas9系统。在这样的实施方案中，抑制可以使用编码CRISPR RNA(crRNA)的核酸，其靶向编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的一种或多种的核酸，和用于将crRNA加工成其成熟形式的反式激活crRNA(tracrRNA)。
核酸抑制剂
在一些实施方案中，抑制剂是核酸抑制剂。核酸抑制剂在本文中也可以描述为抑制性核酸。
根据本公开的核酸抑制剂可以包含DNA和/或RNA或由其组成。核酸抑制剂可以是单链的(例如在反义寡核苷酸(例如gapmers)的情况下)。核酸抑制剂可以是双链的或可以包含双链区域(例如在siRNA、shRNA等的情况下)。抑制性核酸可包含双链和单链区域(例如，在shRNA和pre-miRNA分子的情况下，它们在发夹结构的茎区是双链的，而在发夹结构的环区是单链的)。
在一些实施方案中，根据本公开的核酸抑制剂可以是如本文所述的反义核酸。在一些实施方案中，核酸抑制剂可包含如本文所述的反义核酸。在一些实施方案中，核酸抑制剂可以编码如本文所述的反义核酸。
如本文所用，“反义核酸”是指与靶核苷酸序列(例如编码本文所述靶基因的RNA)的至少一部分互补的核酸(例如DNA或RNA)。根据本公开的反义核酸优选是单链核酸，并且通过互补的沃森-克里克碱基配对结合到靶核苷酸序列。互补碱基配对可能涉及互补碱基对之间的氢键。反义核酸可以作为单链分子提供，例如在反义寡核苷酸的情况下，或者可以包含在双链分子种类中，例如在siRNA、shRNA和pre-miRNA分子的情况下。
反义核酸与其靶核苷酸序列之间的互补碱基配对可以是完整的。在此类实施方案中，所述反义核酸包含或由其靶核苷酸序列的反向互补序列组成，互补碱基配对发生在所述靶核苷酸序列的每个核苷酸与所述反义核酸中的互补核苷酸之间。或者，所述反义核酸与其靶核苷酸序列之间的互补碱基配对可以是不完整的/部分的。在此类实施方案中，互补碱基配对发生在所述靶核苷酸序列与所述反义核酸中的互补核苷酸的一些而非全部核苷酸之间。
核酸之间通过互补碱基配对的这种结合可称为“杂交”。通过与其靶核苷酸序列结合，反义核酸可以形成包含(i)反义核酸和(ii)包含靶核苷酸序列的靶核酸的核酸复合物。
反义核酸的核苷酸序列与其靶核苷酸序列充分互补，使得它与靶核苷酸序列结合或杂交。应当理解，反义核酸优选与其靶核苷酸序列的反向互补序列具有高度序列同一性。在一些实施方案中，反义核酸包含或由与其目标核苷酸序列的反向互补序列具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性之一)的核苷酸序列组成。
在一些实施方案中，根据本公开的反义核酸包含：与其靶核苷酸序列反向互补的核苷酸序列，或包含相对于其靶核苷酸序列的反向互补的1至10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个中的一个)取代的核苷酸序列。
在一些实施方案中，根据本公开的反义核酸的靶核苷酸序列包含或由5至100个核苷酸，例如10到80、12到50、或15到30个(例如20到27，例如～21到23)核苷酸之一组成。在一些实施方案中，根据本公开的反义核酸的靶核苷酸序列包含或由DNA和/或RNA组成。在一些实施方案中，根据本公开的反义核酸的靶核苷酸序列包含或由RNA组成。
在一些实施方案中，反义核酸减少/阻止包含其靶核苷酸序列的核酸的转录。在一些实施方案中，反义核酸减少/阻止正常转录所需的因子(例如增强子、RNA聚合酶)与包含其靶核苷酸序列的核酸的结合。
在一些实施方案中，所述反义核酸增加/加强包含其靶核苷酸序列的核酸的降解，例如通过RNA干扰。在一些实施方案中，所述反义核酸减少/阻止包含其靶核苷酸序列的核酸的翻译，例如通过RNA干扰或通过RNase H进行反义降解。
RNA干扰描述于例如Agrawal等，Microbial.Mol.Bio.Rev.(2003)67(4)：657–685和Hu等，Sig.Transduc.Tar.Ther.(2020)5(101)，两者均通过引用整体并入本文。简而言之，双链RNA分子被RNA诱导的沉默复合物(RISC)的argonaute成分识别。双链RNA被RISC加载复合体(RLC)分离成单链并整合到活性RISC中。RISC整合链通过互补碱基配对与其目标RNA结合，根据RISC整合RNA的识别和与目标RNA的互补程度，RISC切割目标RNA导致其降解，或者以其他方式阻断核糖体的进入，从而阻止其翻译。基于RNAi的疗法已被批准用于多种适应症(Kim，Chonnam Med J.(2020)56(2)：87–93)。
在一些实施方案中，所述反义核酸减少/阻止包含其靶核苷酸序列的核酸的正常转录后加工(例如剪接和/或翻译)。在一些实施方案中，所述反义核酸减少或改变包含其靶核苷酸序列的前体mRNA与成熟mRNA的剪接。在一些实施方案中，所述反义核酸减少包含其靶核苷酸序列的mRNA翻译为蛋白质。
在一些实施方案中，所述反义核酸减少/防止正常转录后加工所需的因子(例如剪接体的组分)与包含其靶核苷酸序列的核酸的关联。在此类情况下，所述反义核酸可称为“剪接转换”核酸。
剪接转换核酸综述于例如Haves和Hastings，核酸研究(2016)44(14)：6549–6563，其全部内容通过引用并入本文。剪接转换核酸包括例如剪接转换寡核苷酸(SSO)。它们通过阻断发生在剪接机制的组件和pre-mRNA之间RNA：RNA碱基配对和/或蛋白质：RNA结合相互作用，来破坏目标RNA转录本的正常剪接。剪接转换核酸可用于改变编码本文所述蛋白质的成熟mRNA转录物的数量/比例。可以设计剪接转换核酸以靶向靶转录物的特定区域，例如影响感兴趣的外显子的跳跃，例如编码感兴趣的结构域/区域的外显子。SSO通常包含对寡核苷酸糖-磷酸主链的改变，以减少/防止RNAse H降解，例如硫代磷酸酯键、二氨基磷酸酯键例如二氨基磷酸酯吗啉代(PMO)，并且可以包括例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、甲氧基乙基核苷酸修饰，例如2'O-甲基(2'OMe)和2'-O-甲氧基乙基(MOE)核糖修饰和/或5'-甲基胞嘧啶修饰。
在一些实施方案中，所述反义核酸抑制/减少包含其靶核苷酸序列的核酸的翻译。在一些实施方案中，所述反义核酸减少/阻止翻译所需的因子(例如核糖体)与包含其靶核苷酸序列的核酸的结合。
如本文所用，“靶序列”是指在基因(例如与器官再生相关的基因)转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
应当理解，反义核酸结合的靶核苷酸序列，是编码希望抑制其表达的蛋白质的核苷酸序列。因此，在本公开的方面和实施方案中，反义核酸的靶核苷酸序列是编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一个或多个的基因的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是由编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB中任一项的基因编码的RNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB中任一种的RNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列包含编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB中任一项的RNA外显子的一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是编码MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB中任一项的RNA外显子的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述靶标核苷酸序列是表14中提供的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_001198695.2(GI：1677501926，版本2)的核苷酸序列，它是人MFAP4转录本变体1mRNA(SEQ ID NO：7179)或其部分的NCBI参考序列。在一些实施方案中，所述靶标核苷酸序列是NM_002404.3(GI：1677501522，版本3)的核苷酸序列，它是人MFAP4转录本变体2mRNA(SEQ ID NO：7180)或一部分的NCBI参考序列。
在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_012203.2(GI：1519473711，版本2)的核苷酸序列，它是人GRHPR转录本变体1mRNA(SEQ ID NO：7181)或其部分的NCBI参考序列。
在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_030790.5(GI：1653961895，版本5)的核苷酸序列，它是人ITFG1转录本变体1mRNA(SEQ ID NO：7182)或其部分的NCBI参考序列。
在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_005845.5(GI：1813751621，版本5)的核苷酸序列，它是人ABCC4转录本变体1mRNA(SEQ ID NO：7183)或其部分的NCBI参考序列。在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_001105515.3(GI：1677498821，版本3)的核苷酸序列，它是人ABCC4转录本变体2mRNA(SEQ ID NO：7184)或其部分的NCBI参考序列。在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_001301829.2(GI：1677530022，版本2)的核苷酸序列，它是人ABCC4转录物变体3mRNA(SEQ ID NO：7185)或其部分的NCBI参考序列。在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_001301830.2(GI：1677498275，版本2)的核苷酸序列，它是人ABCC4转录本变体4mRNA(SEQ ID NO：7186)或其部分的NCBI参考序列。
在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_001128166.3(GI：1889680926，版本3)的核苷酸序列，它是人PAK3转录本变体1mRNA(SEQ ID NO：7187)或其部分的NCBI参考序列。在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_002578.5(GI：1519316149，版本5)的核苷酸序列，它是人PAK3转录本变体2mRNA(SEQ ID NO：7188)或其部分的NCBI参考序列。在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_001128167.3(GI：1890283404，版本3)的核苷酸序列，它是人PAK3转录本变体3mRNA(SEQ ID NO：7189)或其部分的NCBI参考序列。在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_001128168.3(GI：1676441496，版本3)的核苷酸序列，它是人PAK3转录本变体4mRNA(SEQ ID NO：7190)或其部分的NCBI参考序列。
在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_001013642.3(GI：1519242294，版本3)的核苷酸序列，它是人TRNP1 mRNA(SEQ ID NO：7191)或其部分的NCBI参考序列。
在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_017413.5(GI：1519315208，版本5)的核苷酸序列，它是人APLN mRNA(SEQ ID NO：7192)或其部分的NCBI参考序列。
在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_005733.3(GI：1519313609，版本3)的核苷酸序列，它是人KIF20A转录本变体1mRNA(SEQ ID NO：7193)或其部分的NCBI参考序列。
在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_002341.2(GI：1720810086，版本2)的核苷酸序列，它是人LTB转录本变体1mRNA(SEQ ID NO：7194)或其部分的NCBI参考序列。在一些实施方案中，所述的靶标核苷酸序列是NM_009588.1(GI：6996015，版本1)的核苷酸序列，它是人LTB转录本变体2mRNA(SEQ ID NO：7195)或其部分的NCBI参考序列。
在一些实施方案中，所述反义核酸包含或由与SEQ ID NO：7179至7195中任一个或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在所述反义核酸的长度或参考序列部分的长度上计算。
在一些实施方案中，所述反义核酸包含或由与SEQ ID NO：7179至7195中任一个或其部分具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在所述反义核酸的长度或参考序列部分的长度上计算。
在一些实施方案中，所述反义核酸和/或参考序列的部分的长度为5至50、5至40、8至30、8至25、10至25、15至25、或19至22个核苷酸。本文所述的反义核酸可包含胸腺嘧啶或尿嘧啶残基。当本文描述的反义核酸，通过参考与参考序列的序列同一性来定义时，核酸可以包含尿嘧啶残基代替参考序列中的任何胸腺嘧啶残基，反之亦然。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与表1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、和/或13的序列或其反向互补序列具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在所述反义核酸的长度或在来自表格中的参考序列的长度上计算。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：1至7155中的任意一个或多个，或SEQ ID NO：1至7155中的任意一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：14至7114或7141至7155中的任意一个或多个，或与SEQ ID NO：14至7114或7141至7155中的任意一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：1至13中的任一个，或与SEQ ID NO：1至13中任一个的反向互补序列具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NOs：7115至7140中的任一个，或与SEQ ID NOs：7115至7140中任一个的反向互补序列具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：14至347中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：14至347中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低MFAP4的基因和/或蛋白质表达，例如人MFAP4。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：1、2、15、19或25，和/或与SEQ ID NO：1、2、15、19或25的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低MFAP4的基因和/或蛋白质表达，例如人MFAP4。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：7092、7093、7141、7142、7146、7147、7151、7152和/或7097至7102，和/或与SEQ ID NO：7092、7093、7141、7142、7146、7147、7151、7152和/或7097至7102的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低MFAP4的基因和/或蛋白质表达，例如人MFAP4。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NOs：7097或7100，和/或与SEQ ID NOs：7097或7100的反向互补序列具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低MFAP4的基因和/或蛋白质表达，例如人MFAP4。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：7115至7120中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：7115至7120中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低MFAP4的基因和/或蛋白质表达，例如小鼠MFAP4。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：348至456中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：348至456中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低GRHPR的基因和/或蛋白质表达，例如人GRHPR。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：3、4、5、349、350和/或351中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：3、4、5、349、350和/或351中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低GRHPR的基因和/或蛋白质表达，例如人GRHPR。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：7094、7143、7148、7153和/或7103至7108中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：7094、7143、7148、7153和/或7103至7108中的任一个或多个的反向互补，具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低GRHPR的基因和/或蛋白质表达，例如人GRHPR。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：7121至7129中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：7121至7129中的任一个或多个的反向互补，具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低GRHPR的基因和/或蛋白质表达，例如小鼠GRHPR。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：457至1482中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：457至1482中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低ITFG1的基因和/或蛋白质表达，例如人ITFG1。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：6、7、457、465、468、470和/或473中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：6、7、457、465、468、470和/或473中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低ITFG1的基因和/或蛋白质表达，例如人ITFG1。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：7095、7096、7144、7145、7149、7150、7154、7155和/或7109至7114中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：7095、7096、7144、7145、7149、7150、7154、7155和/或7109至7114任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低ITFG1的基因和/或蛋白质表达，例如人ITFG1。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：7130至7140中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：7130至7140中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低ITFG1的基因和/或蛋白质表达，例如小鼠ITFG1。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：1483至2208中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：1483至2208中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低ABCC4的基因和/或蛋白质表达，例如人ABCC4。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：1483、1485、1486、1488、1489和/或1490中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：1483、1485、1486、1488、1489和/或1490中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低ABCC4的基因和/或蛋白质表达，例如人ABCC4。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：2209至5060中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：2209至5060中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低PAK3的基因和/或蛋白质表达，例如人PAK3。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：2209、2225和/或2234中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：2209、2225和/或2234中的任一个或多个的反向互补具有至少75％序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低PAK3的基因和/或蛋白质表达，例如人PAK3。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：5061至5389中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：5061至5389中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低TRNP1的基因和/或蛋白质表达，例如人TRNP1。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：5061和/或5062中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：5061和/或5062中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低TRNP1的基因和/或蛋白质表达，例如人TRNP1。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：5390至5966中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：5390至5966中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成。例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够减少APLN的基因和/或蛋白质表达，例如人APLN。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：5390、5391、5392和/或5393中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：5390、5391、5392和/或5393的任一个或多个的反向互补序列具有至少75％序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够减少APLN的基因和/或蛋白质表达，例如人APLN。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：5967至6974中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：5967至6974中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低KIF20A的基因和/或蛋白质表达，例如人KIF20A。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：5967、5970和/或5971中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：5967、5970和/或5971中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低KIF20A的基因和/或蛋白质表达，例如人KIF20A。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：6975至7091中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：6975至7091中的任一个或多个的反向互补具有至少75％序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低LTB的基因和/或蛋白质表达，例如人LTB。
在一些实施方案中，所述的反义核酸包含或由与SEQ ID NO：6977、6978和/或6993中的任一个或多个，和/或与SEQ ID NO：6977、6978和/或6993中的任一个或多个的反向互补具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的序列组成，例如在反义核酸的长度或参考序列的长度上计算。反义核酸可以能够降低LTB的基因和/或蛋白质表达，例如人LTB。
反义核酸可包含或由与表1至14的任一个所列序列杂交的序列，或与表1至14的任一个所列序列的互补序列杂交的序列组成。
在一些实施方案中，核酸抑制剂是反义寡核苷酸(ASO)。ASO是单链核酸分子，包含或由靶标核苷酸序列的反义核酸组成。根据本公开的反义寡核苷酸可包含或由如本文所述的反义核酸组成。
ASO可以通过改变剪接或募集RNase H来降解包含靶标核苷酸序列的RNA来修饰包含其靶标核苷酸序列的RNA分子的表达。当ASO与包含其靶标核苷酸序列的RNA结合时，RNase H识别形成的核酸复合分子。根据本公开的ASO，可以包含或由根据本公开的反义核酸组成。ASO可包含10至40个(例如17至30、20至27、21至23个)核苷酸的长度。许多ASO被设计为嵌合体，包含具有不同化学性质的碱基的混合物，或设计为间隔体(gapmer)，包含被修饰核苷酸“翼”包围的中心DNA部分。ASO描述于例如Scoles等，神经遗传学2019年4月；5(2)：e323。ASO有时包含对糖-磷酸主链的改变，以增加它们的稳定性和/或减少/阻止RNAse H降解，例如硫代磷酸酯键、二氨基磷酸酯键例如二氨基磷酸酯吗啉代(PMO)，并且可以包括例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、甲氧基乙基核苷酸修饰，例如2'O-甲基(2'OMe)和2'-O-甲氧基乙基(MOE)核糖修饰和/或5'-甲基胞嘧啶修饰。
在一些实施方案中，核酸抑制剂选自：siRNA、dsiRNA、miRNA、shRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、saRNA、snoRNA或反义寡核苷酸(例如gapmer)，或编码它们的核酸。在一些实施方案中，核酸抑制剂选自：siRNA、dsiRNA、miRNA、shRNA。在一些实施方案中，核酸抑制剂是siRNA。在一些实施方案中，核酸抑制剂是shRNA。
核酸抑制剂可以是RNAi试剂(例如用于CRISR/CAS9敲除的siRNA、shRNA或基于miRNA的shRNA或gRNA)或编码减少基因/mRNA(例如MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种)表达的RNAi试剂的核酸。
在一些实施方案中，抑制性核酸可包含本文所述的反义核酸，例如作为更大核酸种类的一部分。例如，在一些实施方案中，抑制性核酸可以是包含本文所述的反义核酸的siRNA、dsiRNA、miRNA、shRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、saRNA或snoRNA。
在一些实施方案中，抑制性核酸是小干扰RNA(siRNA)。如本文所用，“siRNA”是指长度为17至30个(例如20至27个，例如～21至23个)碱基对的双链RNA分子，其能够参与RNA干扰(RNAi)通路以用于靶标RNA的靶向降解。双链siRNA分子可以形成具有高度互补性的RNA链的核酸复合物。与靶核苷酸序列(即反义核酸)具有互补性的双链siRNA分子链可称为“引导”链，而另一条链可称为“乘客”链。siRNA的结构和功能描述于例如Kim和Rossi，生物技术2008年4月；44(5)：613-616。
RNAi试剂可以在一条或两条链的3'端、5'端或两端包含一个或多个悬垂区域和/或加帽基团，例如包含一个或两个或三个核苷酸(例如‘UU’3’悬垂、‘TT’3’悬垂或‘CCA’5’悬垂)。悬垂的长度可以是1-6个核苷酸，例如长度为2-6个核苷酸、长度为1-5个核苷酸、长度为2-5个核苷酸、长度为1-4个核苷酸、长度为2-4个核苷酸、长度为1-3个核苷酸、长度为2-3个核苷酸、或长度为1-2个核苷酸。悬垂可以是一条链比另一条链长的结果，或者是两条相同长度的链交错的结果。悬垂可以与靶标mRNA形成错配，或者它可以与靶标基因序列互补，或者可以是另一个序列。第一链和第二链也可以连接，例如，通过额外的碱基形成发夹，或通过其他非碱基接头连接。
在一些实施方案中，根据本公开的siRNA的乘客链可以在5’端包含“CCA”修饰，即添加核苷酸“CCA”。在一些实施方案中，根据本公开的siRNA的乘客链可以在3’端包含‘TT’修饰，例如替换3'的两个核苷酸。
在一些实施方案中，根据本公开的siRNA的引导链可包含或由根据本文描述的反义核酸的实施方案的反义核酸组成。
在一些实施方案中，根据本公开的siRNA(例如在表1-11中)可以包含在经历加工以形成siRNA的更长的shRNA序列(例如在表12和13中)中。
如本文可互换使用的术语“RNAi试剂”或“RNAi”，是指包含如本文所定义的该术语的RNA，且其经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路介导RNA转录本的靶向切割的试剂。RNAi试剂通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。RNAi试剂调节例如抑制细胞(例如受试者体内的细胞，所述受试者例如哺乳动物)中与器官再生相关的基因的表达。术语“RNAi试剂”包括shRNA(例如在表12或13中)或由RISC加工成siRNA的前体RNA(例如在表1至11中)，以及抑制内源性基因表达的siRNA本身。
本发明提供了能够在体内抑制靶基因表达的双链RNAi试剂。RNAi试剂可包含有义链和反义链。RNAi试剂的每条链长度范围为12-30个核苷酸。例如，每条链可介于14-30个核苷酸的长度、17-30个核苷酸的长度、25-30个核苷酸的长度、27-30个核苷酸的长度、17-23个核苷酸的长度、17-21个核苷酸的长度、17-19个核苷酸的长度、19-25个核苷酸的长度、19-23个核苷酸的长度、19-21个核苷酸的长度、21-25个核苷酸的长度或21-23个核苷酸的长度。
有义链和反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”)。RNAi试剂的双链体区长度可以是12-30个核苷酸对。例如，所述双链体区可介于14-30个核苷酸对的长度、17-30个核苷酸对的长度、27-30个核苷酸对的长度、17-23个核苷酸对的长度、17-21个核苷酸对的长度、17-19个核苷酸对的长度、19-25个核苷酸对的长度、19-23个核苷酸对的长度、19-21个核苷酸对的长度、21-25个核苷酸对的长度或21-23个核苷酸对的长度。在另一个实施例中，所述双链体区的长度选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27个核苷酸。
在一些实施方案中，抑制性核酸是dicer小干扰RNA(dsiRNA)。如本文所用，“dsiRNA”是指长度为～27个碱基对的双链RNA分子，它被Dicer加工成siRNA，用于RNAi介导的靶标RNA降解。DsiRNA描述于例如Raja等，亚洲药学杂志(2019)14(5)：497-510，其全部内容通过引用并入本文。DsiRNA针对Dicer加工进行了优化，与21-mer siRNA相比可能具有更高的效力(参见例如Kim等人，自然生物技术(2005)23(2)：222–226)，这可能与Dicer介导的核酸酶活性和RISC装载之间的联系有关。
在一些实施方案中，抑制性核酸是微小RNA(miRNA)或其前体(例如pri-miRNA或pre-miRNA)。miRNA分子具有与siRNA分子相似的结构，但是是内源编码的，并且来源于短发夹RNA分子的加工。它们最初表达为长初级转录本(pri-miRNA)，在细胞核内被加工成60至70个核苷酸的发夹(pre-miRNA)，这些发夹在细胞质中进一步加工成与RISC和靶标mRNA相互作用的更小的种类。miRNA包含对结合靶标mRNA必不可少的“种子序列”。种子序列通常包含6个核苷酸，位于miRNA 5'端的第2至7位。
在一些实施方案中，抑制性核酸是短发夹RNA(shRNA)，例如如表12和13中提供的(显示了有义-环-反义序列)。shRNA分子包含具有高度互补性的核苷酸序列，它们通过互补碱基配对彼此结合以形成发夹的茎区。具有高度互补性的核苷酸序列可以通过形成发夹环区域的一个或多个核苷酸连接。shRNA分子可以被加工(例如通过DICER的催化裂解)以形成siRNA或miRNA分子。shRNA分子的长度可介于35至100个(例如40至70个)核苷酸之间。发夹的茎区的长度可以介于17到30个(例如20到27个，例如～21-23个)碱基对之间。茎区可包含G-U配对以稳定发夹结构。本文所述的shRNA序列可包含随后将被加工成更短的siRNA链的序列，例如表1-11中呈现的引导/乘客链。
可以根据原则和/或使用本领域技术人员熟知的工具来鉴定/设计用于靶向抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB中的一个或多个的基因和/或蛋白质表达的siRNA、dsiRNA、miRNA和shRNA。用于设计siRNA和shRNA分子的参数和工具描述于例如Fakhr等，癌症基因治疗(2016)23：73-82(在此通过引用整体并入)。技术人员可使用的用于设计此类分子的软件总结于Fakhr等，癌症基因治疗(2016)23：73-82的表1中，并且包括例如siRNA Wizard(InvivoGen)。制造此类分子的详细信息可在Ambion、Dharmacon、GenScript、Invitrogen、和OligoEngine等商业供应商的网站上找到。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：1至7091中任一项或多项的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1至7091之一具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸；(ii)包含与(i)的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列，或与(i)的核苷酸序列的反向互补序列具有至少75％序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸。SEQ IDNO：1至7091显示在本文提供的表1至10中。根据本公开内容的核酸可以能够降低根据显示了SEQ ID NO的表格的标题的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB中任一项的基因和/或蛋白质表达。例如，表2中显示的SEQ ID NO可以能够降低MFAP4的基因和/或蛋白质表达。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7092至7096中的任一个或多个核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7092至7096之一具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸；(ii)包含与(i)的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列，或与(i)的核苷酸序列的反向互补序列具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7092的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7092具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7141的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7141具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7093的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7093具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7142的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7142具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％，82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7094的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7094具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7143的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7143具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7095的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7095具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7144的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7144具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7096的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7096具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7145的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7145具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列的核酸。
在根据前述七段的一些实施方案中，(i)的核苷酸序列和(ii)的核苷酸序列可以在不同的核酸上提供(即，分开的寡核苷酸)。因此，(i)和(ii)的核酸可以是不同的核酸。在这样的实施方案中，所述抑制性核酸可包含或由核酸双链体组成，该核酸双链体通过包含(i)和(ii)的核苷酸序列的不同核酸之间的互补碱基配对形成。
或者，在一些实施方案中，(i)的核苷酸序列和(ii)的核苷酸序列可以提供在同一核酸上(即单个寡核苷酸)。即，(i)和(ii)的核酸可以是相同的核酸。在这样的实施方案中，(i)的核苷酸序列和(ii)的核苷酸序列可以通过一个或多个接头核苷酸连接。所述抑制性核酸可包含由(i)和(ii)的核苷酸序列之间的互补碱基配对形成的核酸双链体区，并且接头区可形成单链环区。
本文公开了一种核酸抑制剂，其包含或编码或由与表1至13中任一个(或表的任何组合)中列出的RNA序列具有至少70％、80％、90％或95％序列同一性的RNAi试剂，或在严格条件下与表1至13(或表的任何组合)中所列RNA序列的互补序列杂交的RNAi试剂组成。
本文公开了一种核酸抑制剂，其包含或编码或由与表2-12中任一个(或表的任何组合)中列出的RNA序列具有至少70％、80％、90％或95％序列同一性的RNAi试剂，或在严格条件下与表2-12(或其表的任何组合)中列出的RNA序列的互补序列杂交的RNAi试剂组成。
本文公开了一种核酸抑制剂，其包含或编码或由与表1或13中列出的RNA序列具有至少70％、80％、90％或95％序列同一性的RNAi试剂，或在严格条件下与表1或13中列出的RNA序列的互补序列杂交的RNAi试剂组成。
在本文中可互换使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，不论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，这些术语包括但不限于，单链、双链、或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的、或衍生的核苷酸碱基的聚合物。这些术语进一步包括但不限于，包含内含子序列的mRNA或cDNA。所述多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(通常可见于RNA或DNA中)，或修饰的或取代的糖或磷酸基团。或者，所述多核苷酸的主链可以包含合成亚基的聚合物，例如亚磷酰胺，因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团，例如氟核糖和硫代酸酯、和核苷酸分支。核苷酸序列可以被非核苷酸成分打断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该定义中包括的其他类型的修饰是加帽、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及引入用于将多核苷酸连接至蛋白质、金属离子、标记成分、其他多核苷酸、或固体支持物的手段。术语“多核苷酸”还包括肽核酸、PNA和LNA。多核苷酸还可进一步包含基因组DNA、cDNA、或DNA-RNA杂交体。
术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”是指核糖核苷酸的聚合物。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。DNA和RNA可以天然合成(例如，分别通过DNA复制或DNA转录)。RNA可以进行转录后修饰。DNA和RNA也可以化学合成。DNA和RNA可以是单链的(即，分别为ssRNA和ssDNA)或多链的(例如，双链，即，分别为dsRNA和dsDNA)。“mRNA”或“信使RNA”是指定一条或多条多肽链的氨基酸序列的单链RNA。当核糖体与mRNA结合时，其信息在蛋白质合成过程中被翻译。
“严格条件”是指核酸可以与其靶标多核苷酸序列，而非其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的(例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交)。通常，严格条件选为比特定序列在确定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是温度(在规定的离子强度、pH和多核苷酸浓度下)，在该温度下，50％的与靶标序列互补的探针与处于平衡状态的靶标序列杂交。通常，严格条件将是对于较短的探针(例如，10到50个核苷酸)，其中盐浓度为至少约0.01至约1.0M钠离子浓度(或其他盐)在约pH 7.0至约pH 8.3且温度为至少约30℃的条件。
如本文所用，术语“互补”在指代核酸序列时，是指由碱基配对指示的核酸序列的互补序列，但方向相反，以便在折叠成发夹结构时产生互补性。该术语包括部分互补性，其中只有一些碱基根据碱基配对规则和两个核酸序列之间的完全互补性匹配。
修饰
根据本公开的核酸抑制剂/抑制性核酸可包含化学修饰的核苷酸，例如核苷酸中磷酸和/或核糖和/或碱基被化学修饰。此类修饰可能影响核酸的活性、特异性和/或稳定性。核酸抑制剂的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30之一或全部)核苷酸可包含此类化学修饰。
根据本公开的核酸抑制剂考虑的修饰包括那些描述于Hu等，信号转导和靶向治疗(2020)5(101)(通过引用并入上文)的修饰，特别是那些示于Hu等，信号转导和靶向治疗(2020)5(101)的图2里的修饰。根据本公开的核酸抑制剂考虑的进一步修饰包括那些描述于Selvam等，化学生物学与药物设计(2017)90(5)：665-678的修饰，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含一个或多个包含磷酸修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述磷酸修饰可以选自：硫代磷酸酯(例如Rp异构体、Sp异构体)、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、甲氧基丙基磷酸酯、5'-(E)-乙烯基磷酸酯、5'-甲基磷酸酯、(S)-5'-C-甲基磷酸酯、5'-硫代磷酸酯和肽核酸。在一些实施方案中，核酸抑制剂包含一个或多个包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含一个或多个包含核糖修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述核糖修饰可选自：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基、2'-氟、2'-脱氧-2'-氟、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-脱氧、2'-羟基、2'-阿拉伯-氟、2'-O-苄基、2'-O-甲基-4-吡啶、锁核酸、(S)-cEt-BNA、三环-DNA、PMO、解锁核酸、己糖醇核酸和乙二醇核酸。在一些实施方案中，抑制性核酸包含一个或多个包含2'-O-甲基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，抑制性核酸包含一个或多个包含2'-氟修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含一个或多个包含碱基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述碱基修饰可选自：假尿苷、2'-硫尿苷、N6'-甲基腺苷、5'-甲基胞苷、5'-氟-2'-脱氧尿苷、N-乙基哌啶7'-EAA三唑-修饰的腺嘌呤、N-乙基哌啶6'-三唑修饰的腺嘌呤、6'-苯基吡咯并胞嘧啶、2',4'-二氟甲苯核糖核苷和5'-硝基吲哚。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：一个或多个包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸、一个或多个包含2'-O-甲基修饰的核苷酸，和一个或多个包含2'-氟修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含一种或多种修饰的核苷酸，其选自：2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸、2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸、2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟尿苷-3'-磷酸、2'-氟腺苷-3'-磷酸、2'-氟鸟苷-3'-磷酸、2'-氟胞苷-3'-磷酸、2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯、和2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，根据本发明的抑制性核酸包含：包含3至10个(例如3、4、5、6、7、8、9或10之一)包含2'-氟修饰的核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：包含4至15个(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15之一)包含2'-氟修饰的核苷酸。在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：包含2至6个(例如2、3、4、5或6个之一)包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：包含5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20之一)包含2'-O-甲基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：包含2至6个(例如2、3、4、5或6之一)包含2'-O-甲基和硫代磷酸酯修饰的核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：包含1至4个(例如1、2、3或4之一)包含2'-氟和硫代磷酸酯修饰的核苷酸的核苷酸序列。
在其中核酸抑制剂/抑制性核酸包含如本文所述的包含化学修饰的核苷酸的实施方案中，仍然为了根据本公开的序列比较的目的评估核苷酸序列，如同替代地存在等效的未修饰的核苷酸一样。
为了核苷酸序列比较的目的，评估包含含有修饰的磷酸基团的核苷酸的核酸，如同包含修饰的磷酸基团的核苷酸代替包含等效的未修饰的磷酸基团一样。为了核苷酸序列比较的目的，评估包含含有修饰的核糖基团的核苷酸的核酸，如同包含修饰的核糖基团的核苷酸替代包含等效的未修饰核糖基团一样。为了核苷酸序列比较的目的，评估包含含有修饰碱基的核苷酸的核酸，如同包含修饰碱基的核苷酸替代包含等效的未修饰碱基一样。
举例来说，为了核苷酸序列比较的目的，对包含含有假尿苷、2-硫尿苷和/或5’-氟-2’-脱氧尿苷的核苷酸的核酸进行评估，如同包含尿苷的核苷酸被替代存在于它们各自的位置上一样。举例来说，为了核苷酸序列比较的目的，对包含含有N6'-甲基腺苷、N-乙基哌啶7'-EAA三唑-修饰的腺嘌呤和/或N-乙基哌啶6'-三唑-修饰的腺嘌呤的核苷酸的核酸进行评估，如同包含腺嘌呤的核苷酸被替代存在于它们各自的位置一样。举例来说，为了核苷酸序列比较的目的，对包含含有5'-甲基胞苷和/或6'-苯基吡咯并胞嘧啶的核苷酸的核酸进行评估，如同包含胞嘧啶的核苷酸被替代存在于它们各自的位置上一样。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含含有表11中所示的核苷酸序列(包括对其的修饰)的核酸。
在一些实施方案中，抑制性核酸包含含有表11的SEQ ID NO：7146至7155中的任一个或多个所示的核苷酸序列(包括对其的修饰)的核酸。以下六段是指在表11中展示的SEQID NO。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7146至7150中任一个的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQ ID NO：7146至7150之一具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7151至7155中任一个的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQ ID NO：7151至7155之一具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7146的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQ ID NO：7146具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7151的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQID NO：7151具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7147的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQ ID NO：7147具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7152的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQID NO：7152具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7148的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQ ID NO：7148具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7153的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQID NO：7153具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7149的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQ ID NO：7149具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7154的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQID NO：7154具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7150的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQ ID NO：7150具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7155的核苷酸序列(包括其修饰)，或与SEQID NO：7155具有至少75％的序列同一性(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核苷酸序列(包括其修饰)的核酸。
通常，dsRNA分子的每条链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如本文详细描述的，每条或两条链还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。此外，“RNAi试剂”可包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi试剂可在多个核苷酸处包含实质性修饰。此类修饰可包括本文公开的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求的目的，任何此类修饰，如在siRNA型分子中使用的，都包含在“RNAi试剂”中。
在一个实施方案中，有义链和反义链的每个残基独立地用LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-脱氧、2'-羟基、或2'-氟修饰。所述链可以包含不止一种修饰。
根据本公开内容的抑制性核酸可以根据本领域技术人员熟知的技术来生产。
例如，抑制性核酸可通过编码抑制性核酸的核酸序列的转录重组产生。编码根据本公开的抑制性核酸的核酸可以例如是包含在用于表达抑制性核酸的表达载体中。
转录可以在无细胞转录反应中进行，使用重组酶(例如RNA聚合酶)来转录抑制性核酸。或者，根据本公开的抑制性核酸的产生可以在包含编码抑制性核酸的核酸的细胞中进行，并且可以使用细胞酶(例如RNA聚合酶)进行转录。通过在细胞内表达产生根据本公开的抑制性核酸可包括从载体转录。可以以本领域已知的任何方式(例如转染、转导、电穿孔等)进行核酸/载体的引入，以产生根据本公开的抑制性核酸。可以使用细胞特异性启动子(例如肝细胞特异性启动子)来调节抑制性核酸的表达。
例如，根据本公开的shRNA分子可以通过从编码shRNA的载体转录而在细胞内产生。shRNA可以通过在RNA聚合酶启动子的控制下，用编码shRNA序列的载体转染细胞而在细胞内产生。
根据本公开的siRNA分子可以通过从编码shRNA的载体转录而在细胞内产生，所述shRNA编码/包含所述siRNA，随后通过细胞DICER加工shRNA分子以形成siRNA分子。根据本公开的shRNA分子(例如表12或13中的序列)可以嵌入并使用基于miR-30的系统表达，例如描述于Fellmann C等，细胞报导2013；5(6)：1704-13，和Rio DC等人，冷泉港实验方案；2013；doi：10.1101/pdb.prot075853，其全部内容通过引用并入本文。
也可以使用本领域熟知的标准固相或液相合成技术合成抑制性核酸。固相合成可以使用亚磷酰胺化学法。简而言之，固体支持的核苷酸可以去三苯甲基，然后与适当活化的核苷亚磷酰胺偶联以形成亚磷酸酯三酯键。然后可封端，然后用氧化剂(通常是碘)氧化亚磷酸三酯。之后可以重复该循环以产生多核苷酸。
本公开提供了包含或编码根据本公开的抑制性核酸的核酸。在一些实施方案中，包含或编码抑制性核酸的核酸包含或由DNA和/或RNA组成。
本公开还提供了包含核酸的载体，所述核酸包含或编码根据本公开的抑制性核酸。
根据本公开的核酸和载体可以以纯化或分离的形式提供，即来自其他核酸、或天然存在的生物材料。
包含或编码根据本公开的抑制性核酸的核酸的核苷酸序列可以包含在载体中，例如表达载体。如本文所用，“载体”是用作将外源核酸转移到细胞中的运载体的核酸分子。载体可以是用于在细胞中表达核酸的载体。这样的载体可以包括可操作地连接到编码待表达序列的核苷酸序列的启动子序列。载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于从根据本公开的载体表达核酸。
术语“可操作地连接”可以包括，选定的核酸序列和调控核酸序列(例如启动子和/或增强子)共价连接以将核酸序列的表达置于调节序列影响或控制之下(从而形成表达盒)的方式的情况。因此，如果调节序列能够影响核酸序列的转录，则该调节序列可操作地连接至所选核酸序列。
合适的载体包括质粒、双元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒(MLV)衍生载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、牛痘病毒载体和疱疹病毒载体)、基于转座子的载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)。
在一些实施方案中，所述载体可以是真核载体，例如包含在真核细胞中从该载体表达核酸所必需的元件的载体。在一些实施方案中，所述载体可以是哺乳动物载体，例如包含巨细胞病毒(CMV)或SV40启动子以驱动表达。在一些实施方案中，所述载体包含细胞或组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述载体包含肝细胞特异性启动子。
本公开还提供了多种根据本公开的抑制性核酸。本公开还提供包含或编码根据本公开的多种抑制性核酸的核酸和载体。
根据本公开的多个抑制性核酸中的单个抑制性核酸可以是相同的或不相同的。类似地，在包含或编码根据本公开的抑制性核酸的核酸/载体包含/编码多于一种根据本公开的抑制性核酸的实施方案中，由核酸/载体包含/编码的抑制性核酸可以相同或不相同。
在一些实施方案中，核酸/载体可编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个之一根据本公开的抑制性核酸。在一些实施方案中，核酸/载体可以编码根据本公开的给定抑制性核酸的多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等)拷贝。
在一些实施方案中，根据本公开的多个抑制性核酸可以是多个不相同的抑制性核酸。在一些实施方案中，多个抑制性核酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个之一不同的抑制性核酸。在一些实施方案中，核酸/载体可包含/编码多个根据本公开的不相同的抑制性核酸。
根据本公开的多个抑制性核酸的实施方案，以及根据包含/编码多个不同的抑制性核酸的核酸/载体的实施方案，以下两段进一步定义了根据本公开的多个不同的抑制性核酸。
在一些实施方案中，不相同的抑制性核酸包含或编码不相同的反义核酸。在这样的实施方案中，不相同的反义核酸可以各自独立地符合上文描述的反义核酸的任何实施方案。
在一些实施方案中，不相同的抑制性核酸可包含或编码靶向不相同的靶核苷酸序列的反义核酸。在此类实施方案中，不相同的靶核苷酸序列可各自独立地符合上文所述的反义核酸的靶标核苷酸序列的任何实施方案。
本公开还提供了一种细胞，其包含或表达(i)根据本公开的抑制性核酸，(ii)包含或编码根据本公开的抑制性核酸的核酸，和/或(iii)包含含有或编码根据本公开的抑制性核酸的核酸的载体。
所述细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。所述哺乳动物可以是灵长动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长动物或人)或非人哺乳动物(例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括啮齿目动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括奶牛，例如乳牛或牛目中的任何动物)、马(包括马目动物中的任何动物)、驴、和非人灵长类动物)。在优选的实施方案中，所述细胞可以是人类细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以是肝细胞。
本公开还提供了一种用于产生包含根据本公开的核酸或载体的细胞的方法，包括将根据本公开的核酸或载体引入细胞中。在一些实施方案中，将根据本公开的核酸或载体引入细胞包括转化、转染、电穿孔或转导(例如逆转录病毒转导)。
本公开还提供了一种用于产生根据本公开的抑制性核酸或包含或编码根据本公开的抑制性核酸的核酸的方法，包括在适合细胞表达核酸或载体的条件下培养包含核酸的细胞，所述核酸包含或编码根据本公开的抑制性核酸或根据本公开的载体。在一些实施例中，该方法在体外进行。
本公开还提供了包含根据本公开的核酸(包括抑制性核酸、包含/编码抑制性核酸的核酸、包含/编码此类核酸的表达载体)或细胞的组合物。
在治疗和预防应用中，本发明的抑制剂和组合物，优选配制成药物或药物组合物(适合临床使用)。此类组合物可包含抑制剂或细胞以及本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上可接受的成分。此类成分包括但不限于药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂、和甜味剂。
本文提供了包含本文定义的抑制剂，和药学上可接受的载体的药物组合物。
根据本公开的组合物可以通过药学领域众所周知的任何方法来制备。这些方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过将活性化合物与载体(例如，液体载体、细碎的固体载体等)均匀且紧密地结合，然后将产品成型(如果需要)来制备制剂。
所述组合物可以制备成用于局部、肠胃外、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、眼内、玻璃体内、结膜内、视网膜下、脉络膜上、皮下、真皮内、鞘内、口服、鼻腔或经皮给药途径，其可以包括注射或输液。合适的制剂可包含在无菌或等渗介质中的所选试剂。可以根据待施用的药剂和待治疗/预防的疾病来选择制剂和施用方式。
本发明的药物组合物可以以多种方式给药，这取决于需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。给药可以是局部的(包括鼻内或肺内)、口服或肠胃外。肠胃外给药包括静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射。
本公开的组合物可以配制成流体形式，包括凝胶形式。可以配制流体制剂用于通过注射或输注(例如通过导管)施用至人体或动物体的选定器官或区域。本公开的另一方面涉及配制或生产根据本公开的药物或药物组合物的方法，该方法包括通过将试剂与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合来配制药物组合物或药物。
抑制剂的递送
根据本公开的抑制剂(包括例如小分子、抗体和核酸(包括抑制性核酸、表达载体))、细胞和组合物可以被修饰和/或配制以促进递送至和/或被感兴趣的细胞/组织(例如肝细胞(肝细胞)或肝组织)摄取。
此类物种的靶向递送策略综述于例如Li等，Int.J.Mol.Sci.(2015)16：19518-19536和Fu等，Bioconjug Chem.(2014)25(9)：1602-1608，其全部内容通过引用并入本文。特别地，根据本公开内容的核酸可以使用Hu等，信号转导和靶向治疗(2020)5(101)(通过引用并入上文)、或Tatiparti等，“siRNA传递策略：对近期发展的全面回顾”，纳米材料7.4(2017)：77(由Thomas Nann编辑)、和Lehto T等，Adv Drug De/iv Rev.2016，106(Pt A)：172-182所述的递送平台，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开的制品可以被封装在纳米颗粒或脂质体中。在一些实施方案中，本公开的制品可以(共价或非共价地)与细胞穿透肽(例如蛋白质转导结构域、特洛伊肽、富含精氨酸的肽、vectocell肽)、阳离子聚合物、阳离子脂质或病毒载体连接。
纳米颗粒可以是有机的，例如胶束、脂质体、蛋白质、固体脂质颗粒、固体聚合物颗粒、树枝状聚合物、和聚合物治疗剂。纳米颗粒可以是无机的，例如，诸如纳米管或金属颗粒，可选地添加有机分子。在一些实施方案中，纳米颗粒是如Chen等，Mol Ther MethodsClin Dev.(2016)3：16023里所述的纳米粒子，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，纳米颗粒是PLGA、多肽、聚(β-氨基酯)、DOPE、含β-环糊精的聚阳离子、线性PEI、PAMAM树枝状聚合物、支链PEI、壳聚糖或聚磷酸酯纳米颗粒。
递送核酸抑制剂(例如RNAi试剂)到细胞(例如受试者如人类受试者体内的细胞)可以通过许多不同的方式实现。例如，可以通过在体外或体内将细胞与本发明的核酸接触来进行递送。还可以通过向受试者施用包含核酸抑制剂例如siRNA、shRNA、dsRNA的组合物来直接进行体内递送。或者，可通过施用一种或多种编码并指导核酸抑制剂表达的载体(例如一种或多种DNA载体)间接进行体内递送。在一个实施方案中，使用基于病毒或基于转座子的核酸构建体递送核酸抑制剂。在一个实施方案中，核酸抑制剂被封装在脂质体中。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制剂(例如小分子、肽、抗体、抑制性核酸、包含/编码抑制性核酸的核酸、或表达载体)包含修饰以掺入一个或更多个促进递送至和/或被感兴趣的细胞类型或组织摄取的部分。在一些实施方案中，根据本公开的抑制剂连接(例如化学缀合)至一个或多个促进递送至和/或被感兴趣的细胞类型或组织摄取的部分。
抑制剂的修饰和配制以促进靶向递送至感兴趣的细胞类型和/或组织描述于例如Lorenzer等，控制释放杂志(2015)203：1-15中，其全部内容通过引用并入本文。促进递送至和/或被感兴趣的细胞类型或组织摄取的部分，可以选择性地结合感兴趣的靶细胞类型/组织。该部分可以促进靶标细胞类型的细胞膜和/或靶标组织的细胞的穿透。该部分可以结合在感兴趣的靶标细胞类型/组织的细胞表面表达的分子。该部分可以促进核酸被感兴趣的靶标细胞类型/组织内化(例如通过胞吞作用)。
促进递送至感兴趣的细胞类型或组织和/或被其摄取的部分描述于例如Benizri等，Bioconjug Chem.(2019)30(2)：366-383，其全部内容通过引用并入本文。这样的部分包括例如N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、α-生育酚、细胞穿透肽、核酸适体、抗体及其抗原结合片段/衍生物、胆固醇、角鲨烯、聚乙二醇(PEG)、脂肪酸(例如棕榈酸)和核脂部分。
在一些实施方案中，该部分可以例如是结合感兴趣的靶标细胞类型/组织的肽/多肽(例如抗体、其片段或衍生物、肽适体或细胞穿透肽)或核酸(例如核酸适体)，例如通过与在感兴趣的靶标细胞类型/组织的细胞表面表达的分子相互作用。
在一些实施方案中，根据本公开的核酸包含促进递送至和/或被肝脏细胞(例如肝细胞)和/或肝组织摄取的部分。在这样的实施方案中，该部分可以促进肝细胞细胞膜的穿透。该部分可以结合在肝细胞的细胞表面表达的分子。在一些实施方案中，在肝细胞的细胞表面表达的分子是脱唾液酸糖蛋白受体，例如ASGR1或ASGR2。该部分可促进核酸被肝细胞内化(例如通过胞吞作用)。
在一些实施方案中，该部分可以例如是与肝细胞和/或肝组织结合的肽/多肽(例如抗体、其片段或衍生物、肽适体或细胞穿透肽)或核酸(例如核酸适体)，例如通过与肝细胞细胞表面表达的分子相互作用(例如脱唾液酸糖蛋白受体，例如ASGR1或ASGR2)。
在一些实施方案中，该部分是或包含GalNAc。在一些实施方案中，抑制剂(例如核酸)与GalNAc缀合。GalNAc与肝细胞表达的去唾液酸糖蛋白受体相互作用。在GalNAc与ASGPR结合后，与GalNAc结合的核酸通过受体介导的内吞作用被肝细胞有效内化(参见例如Nair等，美国化学学会杂志(2014)136(49)：16958–16961)。在一些实施方案中，抑制剂(例如核酸)与一个或多个(例如1、2、3、4或更多)GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，一个或多个GalNAc部分可以与一条或多条核酸链的5'或3'端共价结合。在一些实施方案中，核酸与三天线GalNAc碳水化合物部分缀合(此类部分描述于例如Nair等，同上)。
在一些实施方案中，根据本公开的抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：1至7155之一的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1至7155之一具有至少75％的序列同一性的核苷酸序列(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％之一或更高的序列同一性)的核酸；(ii)三天线GalNAc碳水化合物部分。
在一些实施方案中，该部分是或包含α-生育酚(即维生素E)。在一些实施方案中，核酸与α-生育酚缀合。核酸-α-生育酚缀合物已用于将核酸靶向递送至肝脏(参见例如Nishina等，分子疗法(2008)16(4)：734-740)。在一些实施方案中，核酸缀合至一个或多个(例如，1、2、3、4或更多)α-生育酚部分。在一些实施方案中，一个或多个α-生育酚部分可以共价连接至一条或多条核酸链的5'或3'端。
生物分子的缀合物可以利用“点击化学”来产生，如描述于例如Nwe和Brechbiel，癌症生物治疗和放射性药物(2009)24(3)：289-302中和Astakhova等，分子药理学(2018)15(8)：2892-2899，其全部内容均通过引用并入本文。在一些实施方案中，缀合可采用炔-叠氮化物或硫代-马来酰亚胺方法。在一些实施方案中，抑制剂(例如核酸)可以缀合到促进递送到和/或被感兴趣的细胞类型或组织摄取的部分，例如，在一条或多条核酸链的3'和/或5'端。
抑制剂可以与一个或多个部分缀合，以促进通过接头递送至和/或被感兴趣的细胞类型或组织摄取。在一些实施方案中，接头可以是或包含核苷酸序列。接头的核苷酸序列可包含一个或多个如本文所述的经修饰的核苷酸。
疾病的治疗/预防
本文所述的抑制剂、核酸、表达载体、细胞和组合物可用于治疗和预防方法。
本发明提供了通过抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB来治疗和/或预防疾病的方法和物品(药剂和组合物)。通过抑制例如细胞、组织/器官/器官系统/受试者的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB来实现疾病的治疗/预防。
本发明涉及治疗和/或预防由MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB(和/或相关下游因子)的一个或多个的表达/活性增加而引起和/或加剧的疾病，或由一个或多个被MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一个或多个下调的相关下游因子的表达/活性降低，而引起和/或加剧的疾病。
在本文所述的任何方法中，可以使用任何合适的抑制剂实现对MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB(基因、mRNA和/或蛋白质)中的一个或多个的抑制。在一些实施方案中，抑制剂是核酸、肽、抗体、抗原结合分子或小分子抑制剂，例如如本文所述。多种抑制剂可用于靶向任何两个或多个基因/蛋白质。
在本文提供的任何方法中，抑制剂可以是本文所述的核酸，例如抑制性核酸。
本发明的用途扩展到治疗/预防任何将从MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的一个或更多个的表达和/或活性的降低获得治疗/预防益处的疾病。
在一些实施方案中，待治疗/预防的疾病的特征可以是，例如与正常器官/组织/受试者相比(即在没有疾病的情况下)，在受疾病影响的器官/组织/受试者中，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB(或其相关物)中的一种或多种的表达/活性增加。
治疗/预防可以是，在出现疾病症状的细胞/组织/器官中，与MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB(或其相关物)中的一种或多种的表达/活性上调相关的疾病。
实验实例表明，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和LTB的表达在纤维炎症性疾病中上调，例如肝脏疾病、炎症性肝病、脂肪变性、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD))、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
因此，本公开确立了对MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A或LTB的抑制可用于治疗/预防，例如肝脏或其他组织的，例如NAFLD、NASH、纤维化和/或炎症为特征的疾病。
本发明的方面涉及肝脏疾病或病症的治疗/预防。
因此，一方面，本发明提供了一种治疗或预防肝病或病症的方法，包括抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一种。如上文所述，抑制可指抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的表达和/或活性及其下游功能的结果，并涵盖减少/降低基因和/或蛋白质表达或减少/降低任一所述基因/蛋白质的活性。
还提供了治疗或预防肝病或病症的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A、和/或LTB中至少一种的抑制剂。该方法可包括施用两种或更多种(即2、3、4、5、6、7、8或9种)靶向MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的两个或更多个(即2、3、4、5、6、7、8或9)的抑制剂。
还提供了MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中至少一种的抑制剂，用于治疗或预防肝病或病症的方法。
还提供了MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中至少一种的抑制剂，在制备用于治疗或预防肝病或病症的药物中的用途。
抑制剂可以是MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中至少一种的任何合适的抑制剂，例如本文所述的任何药剂，例如核酸、肽、抗体、抗原结合分子或小分子抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是抑制性核酸，例如本文所述的那些。
在一些实施方案中，所述待治疗/预防的肝脏疾病或病症选自下组：急性肝病、慢性肝病、代谢性肝病、脂肪变性、肝纤维化、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝硬化、轻度肝病纤维化、晚期肝纤维化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝病(ALFD)、酒精相关性肝病(ARLD)、肝缺血再灌注损伤、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、肝炎、肝损伤、肝损伤、肝功能衰竭、代谢综合征、肥胖、糖尿病、终末期肝病、肝脏炎症、小叶炎症和/或肝细胞癌(HCC)。
在一些实施方案中，所述肝纤维化是病毒诱导的肝纤维化。在一些实施方案中，所述肝炎是酒精诱发的肝炎。在一些实施方案中，所述肝损伤是药物或病毒引起的肝损伤。
本公开的实验实施例将MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和LTB鉴定为纤维炎症过程的调节剂，而且它们在不同组织类型之间是保守的。
本发明的方面涉及治疗/预防在病理学上涉及促纤维化过程的疾病。因此，在一些实施方案中，所述疾病是纤维化，或以纤维化为特征的疾病。
如本文所用，“纤维化”是指由于细胞外基质成分例如胶原的过度沉积而形成过量纤维结缔组织。纤维结缔组织的特点是具有高胶原含量的细胞外基质(ECM)。所述胶原可以以股线或纤维的形式提供，它们可以不规则地排列或对齐。纤维结缔组织的ECM也可能包括糖胺聚糖。
如本文所用，“过量纤维结缔组织”是指在给定位置(例如，给定组织或器官，或给定组织或器官的一部分)的结缔组织的量大于该位置没有纤维化存在(例如在正常、非病理条件下)的结缔组织的量。如本文所用，“ECM组分的过度沉积”是指一种或多种ECM组分的沉积水平高于不存在纤维化时(例如，在正常、非病理条件下)的沉积水平。
纤维化的细胞和分子机制描述于Wynn，病理学杂志(2008)214(2)：199-210，以及Wynn和Ramalingam，自然药物(2012)18：1028-1040，其全部内容通过引用并入本文。
组织损伤可能由各种刺激引起，包括感染、自身免疫反应、毒素、辐射和机械损伤。修复通常涉及用相同类型的细胞替换受损细胞，以及用结缔组织替换正常的实质组织。当修复过程没有得到适当控制时，它们就会变得致病，导致ECM成分大量沉积，其中正常组织被永久性疤痕组织取代。在特发性肺纤维化、肝硬化、心血管纤维化、系统性硬化症和肾炎等疾病中，广泛的组织重塑和纤维化最终会导致器官衰竭和死亡。
纤维化的主要细胞效应物是肌成纤维细胞，它会产生富含胶原蛋白的ECM。响应组织损伤，受损细胞和白细胞产生促纤维化因子，如TGFβ、IL-13和PDGF，这些因子将成纤维细胞激活为表达αSMA的肌成纤维细胞，并将肌成纤维细胞募集到损伤部位。肌成纤维细胞产生大量ECM，并且是帮助挛缩和闭合伤口的重要介质。然而，在持续感染或慢性炎症期间，肌成纤维细胞可能会过度激活和募集，从而导致ECM成分过度产生，从而导致形成过多的纤维结缔组织。
炎症反应在引发许多不同器官系统的纤维化方面起着重要作用。炎症可导致受影响组织中ECM成分的过度沉积。低度但持续的炎症也被认为促进心血管疾病和高血压的纤维化进展。在许多纤维化疾病中，持续的炎症触发对于上调生长因子、蛋白水解酶、血管生成因子和纤维化细胞因子的产生至关重要，它们会刺激结缔组织成分的沉积，从而逐渐重塑和破坏正常组织结构。
在一些实施方案中，纤维化可由病理状况触发，例如导致产生促纤维化因子，例如TGFβ1的病症、感染或疾病状态。在一些实施方案中，纤维化可能由物理损伤/刺激、化学损伤/刺激或环境损伤/刺激引起。手术过程中可能会发生物理损伤/刺激，例如医源性原因。化学损伤/刺激可能包括药物诱导的纤维化，例如在长期s施用博来霉素、环磷酰胺、胺碘酮、普鲁卡因胺、青霉胺、金和呋喃妥因等药物后(Daba等，Saudi Med J 2004年6月；25(6)：700-6)。环境伤害/刺激可能包括接触石棉纤维或二氧化硅。
纤维化可以是身体的任何组织/器官的。在一些实施方案中，纤维化是心脏、肾脏、肝脏、肺、骨骼肌、血管、眼睛、皮肤、胰腺、肠、小肠、大肠、结肠、脑或骨髓的纤维化。在一些实施方案中，纤维化是肝脏的纤维化。在一些实施方案中，纤维化是心脏、肺或肾脏的纤维化。纤维化也可能同时发生在多个组织/器官中。
因此，本发明提供了通过抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB来治疗和/或预防以纤维化为特征的疾病的方法和制品(药剂和组合物)。
因此，一方面，本发明提供了一种治疗或预防以纤维化为特征的疾病的方法，包括抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一个。
还提供了治疗或预防以纤维化为特征的疾病的方法，包括向对象施用治疗或预防有效量的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的至少一种的抑制剂。该方法可包括施用两种或更多种(即2、3、4、5、6、7、8或9种)靶向MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的两种或更多种(即2、3、4、5、6、7、8或9)的抑制剂。
还提供了MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中至少一种的抑制剂，用于治疗或预防以纤维化为特征的疾病的方法。
还提供了MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中至少一种的抑制剂在制备用于治疗或预防以纤维化为特征的疾病的方法的药物中的用途。
“以纤维化为特征的疾病”是指在病理上涉及纤维化和/或促纤维化过程的疾病。“以纤维化为特征的疾病”可以是纤维化，例如任何细胞、组织或器官的纤维化。
以纤维化为特征的疾病包括但不限于：呼吸系统疾病，例如肺纤维化、囊性纤维化、特发性肺纤维化、进行性大块纤维化、硬皮病、闭塞性细支气管炎、海-普(Hermansky-Pudlak)综合征、石棉肺、矽肺、慢性肺动脉高压、艾滋病相关肺动脉高压高血压、结节病、肺病中的肿瘤间质和哮喘；慢性肝病、肝硬化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、血吸虫性肝病，肥厚性心肌病(HCM)、扩张型心肌病(DCM)等心血管疾病，心房纤维化、心房颤动、心室纤维化、心室颤动、心肌纤维化、布鲁加达(Brugada)综合征、心肌炎、心内膜心肌纤维化、心肌梗死、纤维化血管病、高血压性心脏病、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、小管间质和肾小球纤维化、动脉粥样硬化、静脉曲张、脑梗塞；神经系统疾病，如神经胶质增生和阿尔茨海默病；肌营养不良症，例如杜氏肌营养不良症(DMD)或贝克氏(Becker’s)肌营养不良症(BMD)；胃肠道疾病，如克罗恩病、显微镜下结肠炎和原发性硬化性胆管炎(PSC)；皮肤病，如硬皮病、肾源性系统性纤维化和皮肤瘢痕疙瘩；关节纤维化；Dupuytren挛缩；纵隔纤维化；腹膜后纤维化；骨髓纤维化；佩罗尼氏(Peyronie’s)病；粘连性囊炎；肾脏疾病(例如，肾纤维化、肾炎综合征、Alport综合征、HIV相关肾病、多囊肾病、法布里(Fabry’s)病、糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎、与系统性狼疮相关的肾炎)；进行性系统性硬化症(PSS)；慢性移植物抗宿主病；眼睛疾病，如格雷夫氏(Grave’s)眼病、视网膜前纤维化、视网膜纤维化、视网膜下纤维化(例如与黄斑变性相关(例如湿性年龄相关性黄斑变性(AMD))、糖尿病性视网膜病、青光眼、角膜纤维化、术后纤维化(例如白内障手术后的后囊膜，或青光眼小梁切除术后的大泡)、结膜纤维化、结膜下纤维化；关节炎；纤维化肿瘤前期和纤维化肿瘤疾病；化学或环境损害(例如癌症化学疗法、杀虫剂、辐射/癌症放疗)引起的纤维化。
应当理解，前段中列举的许多疾病/病症是相互关联的。例如，心室纤维化可能发生在心肌梗塞后，并与扩张型心肌病、肥厚型心肌病和心肌炎有关。
纤维化可直接或间接导致和/或增加疾病发展的易感性。例如，超过80％的肝细胞癌(HCC)发生在纤维化或肝硬化的肝脏中(Affo人，2016年，病理学年度回顾)，表明肝纤维化在肝脏的癌前环境(PME)中发挥着重要作用。
因此，本发明也可用于治疗和预防与纤维化相关的疾病和/或纤维化是其危险因素的疾病的方法。在一些实施方案中，纤维化相关或纤维化是其危险因素的疾病是癌症，例如肝癌(例如肝细胞癌)。
在一些实施方式中，根据本发明要治疗/预防的纤维化可以是与MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB表达和/或活动上调有关的纤维化，例如在发生或可能发生纤维化的细胞/组织/器官中。
该疗法可有效抑制纤维化的发展(延迟/预防)或纤维化的进展(例如恶化)。在一些实施方案中，治疗可导致疾病的改善，例如纤维化症状的减少。纤维化的预防可指预防病症恶化或纤维化发展的预防，例如防止早期纤维化(例如炎症、脂肪变性、NAFLD)发展到后期(例如纤维化、肝硬化、HCC)。
本发明的方面涉及治疗/预防在病理上涉及促炎过程疾病。炎症综述于例如Chen等，肿瘤靶标(2018)9(6)：7204–7218，其全部内容通过引用并入本文。炎症是指身体对细胞/组织损伤的反应，其特征是局部免疫、血管和炎症细胞对感染或损伤的反应导致水肿、红斑(发红)、发热、疼痛和功能丧失(僵硬和不动)。损伤可能是由于例如物理(例如机械)或化学损伤、外伤、感染、癌症或过度活跃/异常的免疫反应(例如自身免疫性疾病)。炎症形成先天免疫反应的一部分，在伤口愈合和感染控制中发挥重要的生理作用，并有助于恢复组织稳态。
然而，许多疾病与过度活跃的炎症反应(即过度炎症和/或异常激活的炎症)和/或慢性(长期)炎症有关。在本文中，过度和/或慢性炎症可称为“病理性炎症”。病理性炎症可指牵涉(即积极促成)疾病的病理学的炎症。
在一些实施方式中，根据本发明要治疗/预防的疾病是以慢性炎症为特征的疾病。在一些实施方案中，待治疗/预防的疾病是以过度活跃的炎症反应为特征的疾病。
在一些实施方案中，考虑了与慢性感染、癌症、自身免疫性疾病、退行性疾病或变应性疾病相关的慢性炎症或过度活跃的炎症免疫反应的治疗/预防。
与给定疾病(例如慢性感染、癌症、自身免疫性疾病、退行性疾病或过敏性疾病)“相关”的病理性炎症，可指由该疾病引起、引发和/或作为其结果的病理性炎症。与给定疾病相关的病理性炎症可能与该疾病并发。
慢性炎症通常是指持续较长时间的炎症，例如从几个月到几年。慢性炎症可导致例如由于未能正确控制/消除引起炎症(即慢性感染)的传染源、长期/反复接触物理/化学损伤、长期/反复接触过敏原(过敏)、和自身免疫性疾病。
所述慢性炎症、过度活跃的炎症免疫反应、慢性感染、癌症、自身免疫性疾病、退行性疾病或过敏性疾病，可影响身体的任何组织/器官，例如，心脏、肾脏、肝脏、肺、骨骼肌、血管、眼睛、皮肤、胰腺、肠、小肠、大肠、结肠、大脑或骨髓或同时影响多个组织/器官。
过度活跃的炎症免疫反应通常是指，过度的和/或被不当激活的炎症免疫反应(即异常的炎症免疫反应)。过度的炎症免疫反应是指，炎症免疫反应大于组织损伤(例如，由于物理或化学损伤或感染)后恢复组织稳态所需的反应。异常的炎症免疫反应包括由自身免疫和变态反应引起的炎症免疫反应。
慢性感染包括由任何感染源引起的持续/未解决的感染，例如慢性病毒、细菌、真菌和原虫感染。慢性病毒感染可由例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)、麻疹病毒(MV)、巨细胞病毒(CMV)、人类T细胞白血病病毒(HTLVs)、人类疱疹病毒(HHVs)、单纯疱疹病毒(HSVs)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人类乳头瘤病毒(例如JC病毒、BK病毒)、腺病毒(AdVs)、细小病毒或人类乳头瘤病毒(HPVs)的感染引起。慢性细菌感染可由例如结核分枝杆菌、幽门螺杆菌、伤寒沙门氏菌、梅毒螺旋体、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌或麻风分枝杆菌的感染引起。慢性真菌感染可由念珠菌属或曲霉菌感染引起。慢性原虫感染可由例如疟原虫属、巴贝斯虫属、贾第鞭毛虫属、利什曼原虫属、锥虫属或弓形虫属感染引起。
癌症可以是任何癌症。如本文所用，癌症包括任何不需要的细胞增殖(或任何通过不需要的细胞增殖表现出来的疾病)、赘生物或肿瘤。所述癌症可以是良性或恶性的，可以是原发性或继发性(转移性)的。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。所述癌症可以是来源于组织/细胞例如肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、大脑、乳房、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括大脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾脏、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、成淋巴细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、大网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、子宫、外阴和/或白细胞。
自身免疫性疾病可选自：I型糖尿病、II型糖尿病、乳糜泻、格雷夫斯病、炎性肠病(例如克罗恩病)、多发性硬化症、牛皮癣、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
退行性疾病的特征是细胞/组织/器官状况或功能随时间恶化。促炎和促纤维化过程与许多退行性疾病的病理有关。
退行性疾病包括例如阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、癌症、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth病)、慢性创伤性脑病、囊性纤维化、Leigh退行性综合征、埃勒斯-当洛(Ehlers-Danlos)综合征、进行性骨化性纤维发育不良、弗里德赖希(Friedreich’s)共济失调、额颞痴呆、心血管疾病(例如动脉粥样硬化性心血管疾病(例如冠状动脉疾病、主动脉瓣狭窄)、心肌梗塞、肺动脉高压)、亨廷顿病、婴儿神经轴索营养不良、圆锥角膜、球角膜、脑白质营养不良、黄斑变性、马凡氏综合征、线粒体肌病、线粒体DNA耗竭综合征、多发性硬化症、多系统萎缩症、肌肉萎缩症、神经元蜡样脂褐质沉着症、尼曼匹克(Niemann-Pick)病、骨关节炎、骨质疏松症、帕金森病、肺动脉高压、所有朊病毒病(克雅氏病、致死性家族性失眠症等)、进行性核上性麻痹、色素性视网膜炎、类风湿性关节炎、Sandhoff病、脊髓性肌萎缩症、亚急性硬化性全脑炎、Tay-Sachs病和血管性痴呆。
过敏性疾病可以选自过敏性哮喘、过敏性鼻炎、食物过敏和特应性皮炎。
在一些实施方案中，所述慢性炎症、过度活跃的炎症免疫反应、慢性感染、癌症、自身免疫性疾病或过敏性疾病可以是：心血管系统的器官，例如心脏或血管；胃肠系统的器官，例如肝脏、肠、小肠、大肠、结肠或胰腺；呼吸系统的器官，例如肺；皮肤；神经系统的器官，例如大脑；泌尿系统的器官，例如肾；或肌肉骨骼系统的器官，例如肌肉组织。
病理性炎症通常会导致纤维化——参见例如Mack，基质生物学(2018)68-69：106-121和Suthahar等，Curr Heart Fail Rep.(2017)14(4)：235-250，这两篇文章均通过引用整体并入本文。
本发明还发现用于治疗和预防与病理性炎症相关和/或病理性炎症是其危险因素的疾病的方法的用途。在一些实施方案中，与病理性炎症相关或病理性炎症是其危险因素的疾病是纤维化或以纤维化为特征的疾病。
在一些实施方案中，根据本发明要治疗/预防的病理性炎症可以是与MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达和/或活性上调相关的病理性炎症，例如在发生或可能发生病理性炎症的细胞/组织/器官中。
该疗法可有效抑制病理性炎症的发生(延迟/预防)或病理性炎症的进展(例如恶化)。在一些实施方案中，治疗可导致疾病的改善，例如减少病理性炎症的症状。预防病理性炎症可指预防病症恶化或预防病理性炎症的发展，例如防止早期病理性炎症发展到后期。
根据本发明的治疗性/预防性干预可以在相关疾病的额外治疗的情况下使用。也就是说，MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达/活性可以在受试者中被抑制(例如通过用合适的抑制剂治疗，如本文所述的那些)，所述受试者也接受/已经接受/将接受进一步的治疗/预防干预以治疗/预防所述疾病。
实验实施例表明，可以通过抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种来实现肝和肺细胞/组织的增殖、扩增和再生。
根据本发明的各个方面，根据本发明的治疗和/或预防疾病的方法可以包括以下一种或多种：
降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的基因/蛋白质表达水平；
降低MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的活性水平；
降低纤维化相关物的水平(例如胶原蛋白、αSMA、骨膜蛋白、纤连蛋白、CTGF、波形蛋白或基膜聚糖蛋白(lumican))；
减少促纤维化因子(例如胶原蛋白、αSMA、骨膜蛋白、纤连蛋白、CTGF、波形蛋白或基膜聚糖蛋白(lumican))的基因/蛋白质表达；
减少肌成纤维细胞的数量/比例；
降低病理性炎症的相关水平；
减少促炎因子的基因/蛋白质表达；
减少肌成纤维细胞的数量/比例；
增加受疾病影响的器官/组织的功能；
刺激/增加受疾病影响的细胞的增殖；
刺激/增加受疾病影响的细胞的扩张；
刺激/增加受疾病影响的细胞的再生；
刺激/增加成肌细胞的增殖；
刺激/增加成肌细胞的扩张；
刺激/增加成肌细胞的再生；
增加健康成肌细胞的数量/比例；
刺激/增加受疾病影响的器官/组织的再生；
刺激/增加受疾病影响的器官/组织中细胞的增殖和/或扩张；
刺激/增加肝细胞(例如受疾病影响的或在受疾病影响的器官/组织中)的增殖和/或扩增；
刺激/增加肝组织的再生；
刺激/增加肺组织的再生；
刺激/增加肝脏再生；
刺激/增加肺的再生；
增加受疾病影响的器官/组织的功能；
增加肝功能；
增加肺功能；
增加受疾病影响的器官/组织的伤口愈合；
增加肝组织的伤口愈合；
增加肺组织的伤口愈合；
保护受疾病影响的器官/组织；
保护受疾病影响的肝脏/肝脏组织；
保护受疾病影响的肺/肺组织；
提高患有疾病的对象的存活率；
减少受疾病影响的器官/组织中巨噬细胞的数量/比例；和/或
减少受疾病影响的器官/组织中单核细胞的数量/比例；
本文提供了治疗受试者的方法。
本公开内容教导了一种治疗受试者的病症或疾病的方法，该方法包括在治疗所述受试者的病症或疾病的条件下，向受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
本公开内容教导了一种治疗受试者的肝脏病症或疾病的方法，该方法包括在治疗所述受试者的肝脏的病症或疾病的条件下，向受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
如本文所用的“与器官再生相关的基因”可以指MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB基因中的一个或多个。如本文所用，“与器官再生相关的相应基因产物”可指由上述一种或多种基因编码的mRNA，或MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB蛋白。
在一个实施方案中，本文的受试者患有如本文所述的肝脏病症或疾病。本文所述的方法可包括预防或治疗肝脏病症或疾病。
在一个实施方案中，本文的受试者患有肺部病症或疾病。所述肺部病症或疾病可以是香烟或病毒引起的肺部病症或疾病。所述肺病症或疾病可以是肺损伤或纤维化。该方法可包括预防或治疗所述肺部病症或疾病。
本文公开了一种保护受试者免受肝损伤或与纤维化相关的疾病的方法，该方法包括在保护受试者免受肝损伤的条件下，向受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够的时间。所述抑制剂可以是本文所述的一种。与器官再生相关的基因/相应基因产物可以是MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种。
本文公开了一种与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂，用于预防或治疗受试者的肝脏病症或疾病。在一个实施方案中，该抑制剂能够刺激或增加受试者中肝细胞的增殖。
本文公开了与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂在制备用于预防或治疗所述受试者的肝脏病症或疾病的药物中的用途。
本文公开了一种增强受试者细胞功能的方法，该方法包括在增强所述受试者的细胞功能的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂。“增强细胞功能”是指提高细胞的内源性活性，例如信号传导、增殖、扩张。细胞的功能可以从健康状态开始或从患病/受损状态开始得到增强。
该方法可以包括提高细胞在患病条件下的稳健性。术语稳健性是指能够在患病条件下生存。
本文公开了一种增强受试者细胞活力的方法，该方法包括在增强所述受试者的细胞活力的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够的时间，例如，在本文中所述的抑制剂。
本公开内容教导了一种在受试者中刺激或增加细胞增殖和/或再生的方法，该方法包括在刺激或增加所述受试者中细胞增殖的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够的时间。
在一个实施方案中，该方法进一步增加了细胞在所述对象患病条件下的稳健性。
在一个实施方案中，与器官再生相关的基因是通过敲除动物模型肝细胞中的基因，并检测所述动物模型中肝细胞的增殖和/或再生来鉴定的。
与器官再生相关的基因选自下组：微原纤维相关蛋白4(Mfap4)、乙醛酸和羟基丙酮酸还原酶(Grhpr)、整合素αFG-GAP重复内含物1(Itfg1)、ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)、p21(RAC1)激活激酶3(PAK3)、TMF1调节核蛋白1(TRNP1)、Apelin(APLN)、Kindesin家族成员20A(KIF20A)和淋巴毒素β(LTB)。
“基因产物”是由基因表达或产生的生物聚合产物。基因产物可以是例如未剪接的RNA、mRNA、剪接变体mRNA、多肽、翻译后修饰的多肽、剪接变体多肽等。该术语还包括使用RNA基因产物作为模板(即RNA的cDNA)制备的生物多聚产物。基因产物可以通过酶促、重组、化学或在基因天然存在的细胞内产生。在许多实施方案中，如果基因产物是蛋白质的，则它表现出生物活性。在许多实施方案中，如果基因产物是核酸，它可以被翻译成表现出生物活性的蛋白质基因产物。
本文公开了一种用于降低细胞中MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的基因和/或蛋白质表达的体外或体内方法，包括引入本文所述的抑制剂进入所述细胞。在一些实施方案中，所述抑制剂是本文所述的抑制性核酸。
本文公开了一种体外或体内再生肝组织的方法，该方法包括抑制组织细胞中的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一种，例如使用本文所述的抑制剂。
本文公开了一种用于预防肝细胞再生能力随年龄下降的方法，该方法包括抑制细胞中的MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一种组织，例如使用本文所述的抑制剂。
本文所用的术语“治疗”可指(1)预防或延迟一种或多种病症症状的出现；(2)抑制病症或病症的一种或多种症状的发展；(3)缓解病症，即引起病症或病症的至少一种或多种症状消退；和/或(4)引起病症一种或多种症状的严重程度降低。术语“治疗”可指有问题的组织/器官的再生，或防止疾病/病症发展到以后更严重的阶段。
术语“施用”是指将本文所指的抑制剂接触、施用、注射、输注或提供给受试者。
在整个说明书中使用的术语“受试者”应理解为是指人或可以是家养动物或伴侣动物。虽然特别考虑本发明的方法用于治疗人类，但它们也适用于兽医治疗，包括治疗伴侣动物如狗和猫，以及家养动物如马、牛和绵羊，或动物园动物例如灵长类动物、猫科动物、犬科动物、牛科动物、和有蹄类动物。“受试者”可以包括人、患者或个体，并且可以是任何年龄或性别。
所述患者可患有本文所述的疾病。受试者可已经被诊断为患有需要治疗的疾病，可被怀疑患有这种疾病，或者可有患上疾病的风险。
在根据本发明的实施方案中，所述对象优选是人类对象。在根据本发明的实施方案中，可以根据基于对本文描述的疾病的某些标志物的表征的方法来选择受试者用于治疗。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括将根据本公开的抑制剂施用到受试者、器官、组织或细胞中。所述器官、组织或细胞可以是在体内或体外。本文所述的任何方法都可以在体内或体外进行。
本发明的方面和实施方案涉及检测MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达(基因和/或蛋白质表达)和/或受试者的细胞/组织/器官中的活性，例如通过分析受试者的细胞/组织/器官确定的，例如在从所述对象获得的样本中(例如体外细胞/组织/器官/样本)。
本文公开了一种检测受试者肝脏病症或疾病的方法，该方法包括检测样品中与肝再生相关的一种或多种生物标志物的水平，其中与参照相比，一种或多种生物标志物水平的变化表明对象患有肝脏病症或疾病。所述一种或多种生物标志物可以是MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种。
MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达和/或活性上调，可将受试者鉴定为待用至少一种这些基因/蛋白质的根据本发明的抑制剂治疗。
MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达/活性上调，是指表达/活性水平高于给定类型的细胞/组织的预期水平。可以如本文所述分析基因或蛋白质表达和活性。
可以通过测量细胞/组织中MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达/活性水平来确定上调。可以在来自受试者的细胞或组织样品中的表达/活性水平，与参考表达/活性水平之间进行比较，例如表示相同或相应细胞/组织类型的正常表达/活性水平的值/值的范围。在一些实施方案中，参考水平可通过检测对照样品中MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达/活性来确定，例如在来自健康受试者的相应细胞或组织，或来自同一受试者的健康组织。在一些实施方案中，参考水平可以从标准曲线或数据集中获得。
从受试者获得的样品可以是任何种类的。生物样品可以取自任何组织或体液，例如血液样本、血液来源样本、血清样本、淋巴样本、精液样本、唾液样本、滑液样本。血液来源样本可以是患者血液的选定部分，例如选定的含细胞部分或血浆或血清部分。样品可包括组织样品或组织活检；或从受试者分离的细胞。样品可以通过已知技术收集，例如活检或针吸。可以储存和/或处理样品用于随后测定MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达/活性水平。
在一些优选的实施方案中，样本可以是组织样本，例如取自受本文所述疾病影响的组织/器官的活检。样本可以包含细胞。
可基于确定对象具有MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种表达/活性的上调水平来选择受试者用于根据本发明的治疗/预防。所述基因/蛋白质的上调的表达/活性可用作适合根据本发明治疗的疾病的标志物。
选择后，可以治疗受试者以抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达和/或活性，例如通过施用MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中至少一种的抑制剂(例如具有上调的表达/活性水平)。
检测MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达/活性的上调也可用于诊断本文所述疾病的方法，鉴定受试者处于发展为本文所述疾病的风险，以及预测受试者对抑制MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的反应的方法(例如，通过用抑制剂治疗针对一种或多种所述基因/蛋白质)。
在一些实施方案中，受试者可能被怀疑患有或受害于疾病，例如基于指示受试者身体或受试者身体的选定细胞/组织中疾病的其他症状的存在，或被认为有发生疾病的风险，例如由于遗传易感性或暴露于已知是该疾病的危险因素的环境条件。确定MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种表达/活性的上调可以确认诊断或疑似诊断，或者可以确认所述对象处于发展这种疾病的风险。该测定还可诊断适合用MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的抑制剂治疗的疾病或倾向。
因此，可以提供为患有或疑似患有疾病的受试者提供预后的方法，该方法包括确定MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达/活性是否在获自受试者的样品中上调，并且基于该测定，提供用MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种抑制剂治疗受试者的预后。
该方法还可以包括以下步骤：选择受试者以用MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的抑制剂治疗，和/或向所述受试者施用MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的一种或多种的抑制剂，从而为所述受试者提供本文所述疾病的治疗或预防本文所述疾病的发展或进展。
诊断或预后的方法可以在从受试者获得的样品上在体外进行，或者在对从受试者获得的样品进行处理之后进行。一旦收集了所述样本，不需要所述患者在场，即可进行体外诊断或预后方法，因此该方法可以是一种不在人体或动物体上实施的方法。如上文所述，从受试者获得的样品可以是任何种类的。
其他诊断或预后测试可与此处描述的那些结合使用，以提高诊断或预后的准确性，或确认使用此处描述的测试获得的结果。
术语“治疗有效量”和“有效量”可互换使用，是指当给药于需要这种治疗的患者(例如人)时足以实现如下定义的治疗的化合物的量一剂或多剂。治疗有效量将根据患者、正在治疗的疾病、患者的体重和/或年龄、疾病的严重程度、药剂的性质、或由合格的处方者或护理人员确定的给药方式。上述技术和方案的例子可以在《雷明顿药学》，第20版，2000，利平科特，威廉姆斯和威尔金斯出版社找到。
可以提供多剂量的所述试剂。一个或多个或每个剂量可伴有另一种治疗剂的同时或顺序给药。
多个剂量可以由预定的时间间隔分开，该时间间隔可以选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天之一，或1、2、3、4、5或6个月。例如，可以每7、14、21或28天(正负3、2、或1天)给药一次。
在治疗应用中，如本文所述使用的抑制剂，优选地与一种或多种本领域技术人员熟知的其他药学上可接受的成分一起配制为药剂或药物，所述其他药学上可接受的成分包括但不限于，药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括，对所公开的化合物或其用途无害的赋形剂或试剂，例如溶剂、稀释剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。使用此类载体和试剂制备药物活性物质的组合物，是本领域众所周知的(参见，例如，《雷明顿药学》，Mace出版公司，宾夕法尼亚州费城，第17版(1985)；和，《现代药学》，MarcelDekker有限公司，第3版(G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑)。每种载体、佐剂、赋形剂等在与配方的其他成分相容的意义上也必须是“可接受的”。
合适的载体、佐剂、赋形剂等可以在标准药物教科书中找到，例如，《雷明顿药学》，第18版，Mack出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，1990；和，《药用辅料手册》，第2版，1994。
可以通过药学领域熟知的任何方法制备制剂。这些方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过将活性化合物与载体(例如，液体载体、细碎的固体载体等)均匀且紧密地结合，如有需要，然后将产品成型来制备制剂。
制剂可制备用于局部、肠胃外、全身、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、皮下、口服或透皮施用途径，其可包括注射。可注射制剂可包含在无菌或等渗介质中的所选药剂。可以根据要治疗/预防的药剂和疾病来选择制剂和给药方式。
本文公开了一种筛选与器官再生相关的基因或相应基因产物抑制剂的方法：a)将所述基因或相应基因产物与化合物文库接触，和b)鉴定文库中与所述基因或相应基因产物结合，以抑制所述基因或相应基因产物的表达或功能的化合物。
本文还提供了报告细胞系，用于筛选与细胞再生相关的基因或相应基因产物的小化合物抑制剂。
编号段落
1.一种刺激或增加受试者细胞增殖和/或再生的方法，所述方法包括，在刺激或增加所述受试者体内细胞增殖的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂。
2.如段落1所述的方法，其中所述方法增加了所述细胞在所述受试者患病条件下的稳健性。
3.如段落1所述的方法，其中与器官再生相关的基因是通过敲除动物模型肝细胞中的所述基因，并检测动物模型中肝细胞的增殖和/或再生来鉴定的。
4.如段落2所述的方法，其中与器官再生相关的基因选自下组：微纤维相关蛋白4(Mfap4)、乙醛酸和羟基丙酮酸还原酶(Grhpr)、整合素αFG-GAP重复内含物1(Itfg1)，ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)、p21(RAC1)激活激酶3(PAK3)、TMF1调节核蛋白1(TRNP1)、Apelin(APLN)、Kindesin家族成员20A(KIF20A)和淋巴毒素β(LTB)。
5.如段落1所述的方法，其中所述抑制剂是核酸、肽、抗体或小分子抑制剂。
6.如段落5所述的方法，其中所述抑制剂是核酸抑制剂，其包含或编码与表1-14中任一项所列的RNA序列具有至少70％、80％、90％或95％序列同一性的RNAi试剂，或在严格条件下与表1-14中任一项所列RNA序列的互补序列杂交的RNAi试剂。
7.如段落1所述的方法，其中所述对象患有肝脏病症或疾病。
8.如段落7所述的方法，其中所述肝脏病症或疾病选自下组：急性肝病、慢性肝病、代谢性肝病、脂肪变性、肝纤维化、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝硬化、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝缺血再灌注损伤、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、肝炎和肝损伤。
9.如段落7所述的方法，其中所述方法包括预防或治疗所述肝脏病症或疾病。
10.一种增强受试者细胞功能的方法，所述方法包括，在增强所述受试者细胞功能的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
11.如段落10所述的方法，其中所述方法包括提高所述细胞在患病条件下的稳健性。
12.一种增强受试者细胞活力的方法，所述方法包括在提高所述受试者细胞活力的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
13.一种治疗受试者肝脏病症或疾病的方法，所述方法包括，在治疗所述受试者的所述肝脏病症或疾病的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
14.一种保护受试者免于肝损伤的方法，所述方法包括，在保护所述受试者免于肝损伤的条件下，向所述受试者施用与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂足够长的时间。
15.一种检测受试者肝脏病症或疾病的方法，所述方法包括，检测样品中与肝再生相关的一种或多种生物标志物的水平，其中，与参照相比，一种或多种生物标志物水平的变化表明所述受试者患有肝脏病症或疾病。
16.一种与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂，用于预防或治疗所述对象的肝脏病症或疾病。
17.如段落16所述的抑制剂，其中所述肝脏病症或疾病选自下组：急性肝病、慢性肝病、代谢性肝病、脂肪变性、肝纤维化、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝硬化、肝纤维化，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝缺血再灌注损伤、原发性胆汁性肝硬化(PBC)肝炎或肝损伤。
18.如段落17所述的抑制剂，其中所述抑制剂能够刺激或增加所述受试者中肝细胞的增殖。
19.与器官再生相关的基因或相应基因产物的抑制剂，在制备用于预防或治疗所述受试者的肝脏病症或疾病的药物中的用途。
20.如段落19所述的用途，其中所述肝脏病症或疾病选自下组：急性肝病、慢性肝病、代谢性肝病、脂肪变性、肝纤维化、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝硬化、肝纤维化，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝缺血再灌注损伤、原发性胆汁性肝硬化(PBC)肝炎或肝损伤。
21.如段落19所述的用途，其中所述抑制剂能够刺激或增加所述受试者肝细胞的增殖。
22.一种核酸抑制剂，其包含或编码与表1-14中任一项所列的RNA序列具有至少70％、80％、90％或95％序列同一性的RNAi试剂，或在严格条件下，与表1-14中任一项所列RNA序列的互补序列杂交的RNAi试剂，或由其组成。
23.一种筛选与器官再生相关的基因或相应基因产物抑制剂的方法：a)将所述基因或相应基因产物与化合物文库接触，和b)鉴定所述文库中与所述基因或相应基因产物结合，以抑制所述基因或相应基因产物的表达或功能的化合物。
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在前面的描述中或在所附权利要求中或在附图中公开的特征，以其特定形式或以执行所公开功能的方式或获得所公开结果的方法或过程的形式表达，视情况而定，可以单独地或以这些特征的任何组合，用于以其各种形式实现本发明。
本领域的技术人员将理解，除了具体描述的之外，这里描述的本发明易于进行变化和修改。应当理解，本发明包括落入精神和范围内的所有此类变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
为避免任何疑问，本文提供的任何理论解释都是为了提高读者的理解。发明人不希望受任何这些理论解释的约束。
此处使用的任何章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。
如本申请中所用，单数形式“一个”、“一种”和“这个”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种试剂”包括多种试剂，包括它们的混合物。范围在本文中可以表示为从“大约”一个特定值，和/或到“大约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解特定值形成另一个实施例。与数值相关的术语“约”是可选的，例如表示+/-10％。
贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及诸如“含有”和“包括”的变体将被理解为暗示包括规定的整数或步骤或整数组或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。
本说明书中对任何先前出版物(或从中得出的信息)或任何已知事项的引用不是，也不应被视为承认或认可或任何形式的暗示该先前出版物(或信息从中派生)或已知物质构成本说明书相关领域的公知常识的一部分。
本发明的某些实施方案现在将参考以下附图和实施例进行描述，这些附图和实施例仅用于说明的目的并且不旨在限制上文描述的总体的范围。进一步的方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
对于标准分子生物学技术，请参见Sambrook，J.、Russel，D.W.，分子克隆，实验室手册，第3版，2001，纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社，其全部内容通过引用并入本文。
附图简述
现在将参考附图仅通过非限制性示例的方式讨论说明本发明原理的实施方案和实验，其中：
图1.肝再生调节剂的功能遗传体内RNAi筛选A)筛选概要。通过基于转座子的构建体(上图)联合睡美人13(SB13)编码质粒的流体动力学尾静脉注射(5只独立小鼠)，将靶向89个基因的250个shRNA文库递送至肝脏。在大约5％到10％的肝细胞中稳定整合后，硫代乙酰胺(TAA)处理(每周3次，持续8周)诱导与晚期肝纤维化相关的慢性肝损伤。通过深度测序检测shRNA丰度的变化。B)展示了每个shRNA的倍数变化。大多数shRNA已耗尽，但少数明显富集。C)ROMAampl库(250shRNA)分布。显示了潜在候选物的富集。每只动物的富集(深灰色)或消耗(浅灰色)的基于热图的表示。上图显示所有shRNA(每行代表一只动物)。下图代表高度显著富集、耗尽和中性shRNA的更高放大倍数(每列代表一只动物)。D)功能遗传筛选鉴定高置信度候选物(显示图B)的放大图)。至少有两个独立的shRNA以Mfap4、Grhpr和Itfg1为靶点被富集。此外，非靶向对照(shNC)shRNA(Renilla.713和Luciferase.1309)未显示显著富集或耗尽，并且已知重要的肝再生基因已耗尽，而靶向c-Met(肝再生的必要受体)的shRNA已耗尽。这些结果使筛选方法具有可信度。
图2：靶向Mfap4增强再生的体外验证——shRNA介导的Mfap4敲低加速了胚胎肝细胞系的增殖率A)靶向Mfap4的得分最高的shRNA的敲低效率测试。上图，用于产生稳定细胞系的逆转录病毒骨架。下图，蛋白质印迹显示我们的shRNA对Mfap4的有效敲低(对照：aTub＝α-微管蛋白)。B)基于稳定细胞系的测定的示意图。C)TIB73(BNLCL.2)细胞系中的伤口愈合试验。稳定的细胞系生长至完全汇合，然后去除硅垫片，留下限定的无细胞区域。监测这个“伤口”间隙的填充。在左图中显示了每组的代表性图像。进行了三个技术重复。右图显示了不同时间点的量化(数据通过ImageJ软件和GraphPad Prism软件的双向方差分析进行了分析)。shMfap4.1356(SEQ ID NO：1)、shMfap4.760(SEQ ID NO：2)和shNC之间的显著差异由‘*’显示。D)EdU掺入测定。通过EdU测定评估用shMfap4.1356(SEQ ID NO：2)和shNC转染的TIB73细胞(BNLCL.2)的DNA合成。量化显示实验和对照之间存在显著差异。进行了三个技术重复。E)细胞倍增。显示了倍增时间测定结果。以相同的接种密度接种细胞。倍增时间是根据生长曲线的指数期计算的。进行了三个技术重复。F)使用Guava Muse细胞分析仪通过流式细胞术进行细胞周期分析。显示的是指定细胞周期阶段的细胞百分比。与对照NC相比，在实验的情况下(通过shMfap4.1356和shMfap4.760稳定敲低Mfap4的细胞)表明G2期的细胞数量更多。G)使用成年肝小鼠细胞系AML12进行的伤口愈合试验。左图，观察到与图2C)相同的效果。右图，(A)的量化显示在14小时时间点时伤口闭合速度显著加快。
图3：Mfap4敲低加速肝脏再增殖A)基于FAH基因敲除小鼠的肝脏再增殖试验。上图显示了用于表达酶FAH、标志物GFP和感兴趣的shRNA的基于转座子的载体的概要。下图显示了试验的概要和合理性。如果某种shRNA的敲低能够增强再生并加速肝细胞增殖，那么我们应该能够看到与从稳定整合的肝细胞开始的对照shRNA相比，克隆扩增更快。B)GFP成像器图像。外植小鼠肝脏的GFP成像显示稳定表达shMfap4.1356(SEQ ID NO：1)的肝细胞与表达shNC的肝细胞相比，克隆扩增(再增殖)增强(HDTV注射25μg所示质粒后第18天)。显示了每组的代表性照片(shMfap4.1356组中n＝8，shMfap4.760组中n＝6，shNC组中n＝6)。浅色白点代表GFP阳性宏观可见克隆扩增。C)组织切片上的原生GFP。显示的是在体内递送表达shMfap4或对应于B)的对照shRNA的转座子构建体18天后，FAH-/-小鼠肝切片(200x)的代表性GFP荧光照片。D)稳定表达shMfap4.1356(SEQ ID NO：1)、shMfap4.760(SEQ ID NO：2)和shNC的小鼠肝脏的GFP阳性细胞的组织学分析(针对GFP的免疫染色)(显示的是代表性照片，shMfap4.1356组中n＝8，shMfap4.760组中n＝6，shNC组中n＝6)。HDTV注射1.25μg所示质粒后第18天(放大200倍)。对于shMfap4可以看到增加的克隆扩增。E)GFP阳性细胞的定量(对应于图D)显示，与对照相比，在Mfap4敲低的情况下，GFP阳性肝细胞显著增加。每个点代表一只动物。F)注射了1：30(0.83μg质粒和0.17mgSB13)稀释的p/T-FAHIG-shMfap4.1356(n＝5)或p/T-FAHIG-shNC(n＝5)和SB13的FAH-/-小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(p<0.05)。NTBCoff表示NTBC药物去除的时间，诱导选择过程(注射后1天)。
图4：“西方饮食”(WD)小鼠脂肪肝模型A)WD+果糖饮食事实。使用的饮食富含脂肪和碳水化合物。45％的能量来自脂肪，主要是饱和脂肪，含有0.2％的胆固醇。此外，动物获得60％果糖/水(重量/体积)。B)病理学评估。由经过认证的病理学家评估和评分暴露于“西方饮食”或正常食物指定时间的C56Bl6小鼠肝组织的组织学载玻片。显示的是脂肪变性和纤维化的评分结果。每个点代表一种动物。C)接受“西方饮食”的小鼠体重逐渐增加，与性别无关。D)WD模型显示与人类患者相似的进行性纤维化(参见图E))。E)基于人类患者和疾病阶段的纤维化进行性增加，类似于小鼠模型(图D和B)。F).晚期肝纤维化在24周的WD后已经可以肉眼检测到(代表性图像)。G)在WD24周后小鼠肝脏显示出高水平的脂肪变性(H&E染色的肝组织，代表性图像)。H)胶原纤维的天狼星红染色表明在WD暴露24周后出现了晚期纤维化。
图5：Mfap4敲低减弱NASH相关肝纤维化A)实验大纲。FAH-/-小鼠被注射了我们的构建体，然后，小鼠被饲养3个月以进行完全增殖，以使得肝脏中的每个肝细胞表达感兴趣的shRNA构建体。在达到完全再繁殖后，小鼠被暴露于“西方饮食”(高脂肪饮食和60％果糖)24周。肝脏被收获、处理和分析。B)显示了肝脏的代表性宏观照片。组间的宏观差异已经可见。C)对指定的再增殖小鼠的肝脏切片的天狼猩红染色(纤维化疤痕组织染色)和苏木精-伊红染色(每个实验组n＝5，每个对照组n＝7；显示代表性切片，放大50倍)。D)显示了每只动物的纤维化评分。评分由一位经过认证的病理学家给出，该病理学家对实验组不知情。与对照组相比，实验组的纤维化评分明显较低。E)显示了卵圆细胞增生的评分。评分由一位经过认证的病理学家给出，该病理学家对实验组不知情。与对照组相比，实验组的得分显著降低(＝0)。如果通过肝细胞的再生不再充分，卵圆细胞增生被认为是一种代偿机制。F)显示了肝脏的代表性GFP扫描仪宏观照片。肝脏表面的强GFP信号表明完全再增殖。
图6：Mfap4敲低减轻与慢性肝损伤相关的肝纤维化A)实验大纲。FAH-/-小鼠被注射了我们的构建体，然后，小鼠被饲养3个月以进行完全再增殖。之后，重复剂量的硫代乙酰胺每周3次腹膜内给药，持续8周，从而诱发慢性肝损伤。肝脏被收获、处理和分析。B)显示了肝脏的代表性宏观照片。组间的宏观差异已经可见。C)对指定的再增殖小鼠的肝脏切片的天狼猩红染色(纤维化疤痕组织染色)和苏木精-伊红染色(每个实验组n＝6，每个对照组n＝7；显示代表性切片，放大50倍)。D)显示了每只动物的纤维化评分。评分由一位经过认证的、对实验组不知情的病理学家给出。与对照组相比，实验组的纤维化评分明显较低。
图7：Mfap4敲除加速部分肝切除术(PH)后的肝再生A)实验大纲。FRGN被注射了我们的构建体，然后，小鼠被饲养3个月以完全再增殖。FRGN小鼠在NOD背景下为FAH-/-、Rag2-/-、Il2rg-/-且免疫受损。在小鼠肝脏完全再增殖后，通过手术切除了2/3的肝脏。剩余的再生肝脏在手术后48小时收获。B)显示肝切除术后48小时Ki67免疫荧光染色(顶行)和DABKi67染色(底行)肝切片的代表性照片(放大200倍，每个实验/对照组n＝5)。C)DAB染色肝切片的Ki67阳性细胞的量化(对应于图B))显示与shNC肝脏相比，表达shMfap4的肝脏在部分肝切除术后肝细胞增殖增加(各个点代表个体动物，数据显示平均值±SEM；每组n＝5个)。D)细胞周期蛋白A的蛋白质印迹分析(在指定时间点从再增殖的小鼠肝脏中提取的核提取物)表明表达shMfap4的小鼠肝脏(n＝2)的细胞周期进入更早，细胞周期进展更快。E)实验大纲。向具有免疫能力的FAH-/-小鼠注射我们的构建体，然后将小鼠饲养3个月以进行完全再增殖。之后，通过手术切除了2/3的肝脏。手术后42小时和48小时收获剩余的再生肝脏。F)显示了肝切除术后42小时(每个实验组n＝5，每个对照组n＝6)和48小时(每个实验组n＝5，每个对照组n＝10)的DAB Ki67染色肝切片的代表性照片(200x放大)。G)DAB染色肝切片的Ki67阳性细胞的定量(对应于图B))显示与shNC肝脏相比，表达shMfap4的肝脏在部分肝切除后肝细胞增殖增加和肝再生加速(各个点代表个体动物，数据显示平均值±SEM)。H)细胞周期蛋白E的蛋白质印迹分析(在指定时间点从再增殖的小鼠肝脏中提取的核提取物)表明表达shMfap4的小鼠肝脏(n＝2)的细胞周期进入较早且细胞周期进展较快。I)在手术部分切除2/3的肝脏后，对应于PHx不同时间点，完全再增殖的FAH-/-肝脏(HDTV注射后3个月)的GFP成像。肝脏表面的强GFP信号表明完全再增殖。J)DAB GFP染色的代表性图片显示FAH肝脏的完全再增殖约为90-95％。深棕色区域代表再增殖的肝细胞，浅棕色区域未再增殖。
图8：Mfap4的体内敲低影响mTOR和p38信号转导A)实验示意图。从再增殖的小鼠肝脏中分离出全细胞蛋白质提取物，并通过蛋白质阵列进行分析。B)热图显示了磷酸化抗体MAPK通路蛋白阵列的结果。分析了稳定表达shMfap4或shNC的再增殖的小鼠肝脏的全细胞蛋白提取物(显示的是相对斑点强度)。C)根据STRING数据库，所有指示的蛋白质都在相互作用并与细胞生长和增殖有关。D)在进行广泛的蛋白质阵列聚焦后，进行了蛋白质印迹实验。此处显示了蛋白质印迹的结果。从完全再增殖的肝脏中分离出蛋白质。与对照相比，P-P70S6k、p-p38、p-mTOR、p-ERK2在Mfap4敲低的情况下表达更高，因此，与对照相比，在Mfap4敲低的情况下显示更强的激活。实验组中有3个生物学重复，对照中有3个生物学重复。E)mTOR介导调节的示意图。特定的mTOR磷酸化位于p70S6k激活的上游，并导致强制翻译。F双重敲低条件下的伤口愈合。基于通路分析，进行了双敲除实验。扩增我们的稳定细胞系，用相应的siRNA处理细胞，并去除了硅垫圈。监测伤口愈合。在双重敲低Mfap4和p70S6k以及Mfap4和p38的情况下，观察到生长和迁移速度较慢。G)从图F中的细胞中分离蛋白质的蛋白质印迹。有趣的是，p38敲低也会影响p70S6k。H)用Mfap4敲低制备用于转录组分析的稳定细胞系的示意图。I)显示了AML12-shMfap4.1356、AML12-shMfap4.760、AML12-shNC、(Rb88-RMA050和Ren_RMA061)和AML12(AML_RMA052)的主成分分析。我们观察到实验组和对照之间的集群分离。J)显示了以下样本的热图。与对照相比，Ptgs2、Areg、Dhrs9、Hmox1、Nqo1在实验样本中上调，并且根据文献已知这些基因参与肝再生。K)STRING数据库显示根据图D和J上调的蛋白质之间的联系。
图9：Mfap4效应在人类细胞中是保守的A)shRNAs被鉴定为有效靶向人类Mfap4。使用全细胞裂解物通过蛋白质印迹分析敲低试验。通过逆转录病毒感染和选择产生稳定表达靶向人Mfap4的指定shRNA的HepG2细胞。微管蛋白用作上样对照。B)EdU掺入测定。通过EdU测定法评估用hushMfap4和shNC转染的HepG2细胞的DNA合成。量化显示实验组和对照之间存在显著差异。C)对约150名患者肝脏样本的转录组学分析显示，伴有肝硬化和纤维化的NAFLD患者Mfap4表达增加4分(表：方框表示疾病阶段有显著变化，但变化小于log2 2倍；灰色标记表示至少log2 2倍的显著性上调；*p<0.05，**p<0.01，***p，0.005)。D)对来自健康和肝硬化肝脏的人体组织样本进行Mfap4蛋白染色(Mfap4特异性抗体和DAB染色)。在左侧，健康肝组织在没有一抗的情况下被染色作为对照。在中间，健康肝脏的染色表明肝细胞对Mfap4呈轻微阳性。有趣的是，我们还看到了一些核染色。右图显示了肝硬化人肝脏的染色。人肝细胞在细胞质和核染色中表现出强染色。左侧肝硬化可见纤维化瘢痕组织，Mfap4呈高度阳性。E)人MFAP4 siRNA库的敲低测试。对用si huMFAP4或siNC处理的永生化人肝细胞(Creative Bioarray CSC-I9016L)的蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析。α-微管蛋白用作上样对照(n＝3)。F)EdU掺入测定显示与对照相比，实验组中的EdU阳性细胞数量更多。G)EdU掺入测定(3个技术重复)。显示的是％EdU阳性细胞的值±SEM。永生化人肝细胞用靶向人MFAP4的siRNA处理，或用siNC处理作为对照(*p<0.05)。H)用于产生稳定细胞系的逆转录病毒骨架方案。I)稳定整合针对人Mfap4的shRNA的永生化人肝细胞(Creative BioarrayCSC-I9016L)的代表性GFP图片。J)qPCR分析显示与非靶向对照相比，两种shRNA——hushMfap4.1812(SEQ ID NO：7100)和hu shMfap4.1602(7097)对huMfap4的有效敲低。K)蛋白质印迹显示两个独立的shRNA在永生化人肝细胞-SV40中有效敲低人Mfap4。L)人类永生化肝细胞中的Mfap4敲低加速了伤口愈合。使用分别稳定表达shhuMFAP4.1602或shNC的永生化人肝细胞进行伤口愈合试验。细胞生长至完全汇合，然后去除硅垫片留下限定的无细胞区域(0h)。监测该“伤口”缺口的填充情况(48小时；每种情况下n＝3)。M)L)的量化，伤口愈合区域(n＝3；*p<0.05，ns＝不显著)。
图10：体外验证靶向Grhpr以增强再生A)用于生成稳定细胞系的逆转录病毒骨架的大纲。B)靶向Grhpr的得分最高的shRNA的敲低效率测试。蛋白质印迹显示我们的shRNA(α-微管蛋白(αTub)作为上样对照)有效抑制Grhpr。C)伤口愈合试验。稳定细胞系生长至完全汇合，然后去除硅垫片留下限定的无细胞区域。监测这个“伤口”间隙的填充。显示了每组的代表性图像。D)显示了伤口愈合测定的不同时间点的量化(数据通过ImageJ软件和GraphPadPrism软件的双向方差分析进行了分析。shGrhpr361(SEQ ID NO：3)和shNC之间的显著差异由'*'显示)。
图11：Grhpr敲低加速肝脏再增殖A)大纲显示了用于表达酶FAH、标志物GFP和感兴趣的shRNA的转座子载体。B)基于FAH敲除小鼠的肝脏再增殖试验。大纲显示了试验的合理性。如果某种shRNA的敲低能够增强再生并加速肝细胞增殖，那么我们应该能够看到与从稳定整合的肝细胞开始的对照shRNA相比，更快的克隆扩增。C)GFP成像器图像。外植小鼠肝脏的GFP成像显示，与表达shNC的肝细胞相比，稳定表达shGrhpr.361(SEQ ID NO：3)的肝细胞的克隆扩增(再增殖)增强(HDTV注射25μg所示质粒后第18天)。显示了每组的代表性照片(n＝5)。浅色白点代表GFP阳性宏观可见克隆扩增。D)组织切片上的原生GFP。显示的是在体内递送表达对应于C)的shGrhpr或对照shRNA的转座子构建体18天后FAH-/-小鼠肝切片(200x)的代表性GFP荧光照片。E)稳定表达shGrhpr.361(SEQ ID NO：3)和shNC的小鼠肝脏的GFP阳性细胞的组织学分析(针对GFP的免疫染色)(显示的是代表性照片，shGrhpr.361组中n＝5，shNC组中n＝5)。HDTV注射1.25μg所示质粒后第18天(放大200倍)。对于shMfap4可以看到增加的克隆扩增。F)GFP阳性细胞的定量(对应于E))显示与对照相比，在Mfap4敲低的情况下，GFP阳性肝细胞显著增加。每个点代表一只动物。G)构建体稀释(1：30)为0.83μg质粒和0.17mg SB13时的存活曲线。所有具有shGrhpr构建体的实验小鼠(n＝5)都存活而对照小鼠死亡(n＝5)。
图12：Grhpr敲低加速部分肝切除术后的肝再生A)实验大纲。FAH-/-小鼠被注射了我们的构建体，然后，小鼠被饲养3个月以进行完全再增殖。之后，通过手术切除了2/3的肝脏。在手术后的不同时间点收获剩余的再生肝脏。B)在部分肝切除术后的24小时(每组n＝5)、38小时(每组n＝6)、48小时(每组n＝9)的时间点的Ki67 DAB染色肝切片(放大200倍)的代表性照片。与shNC肝脏相比，在表达shGrhpr的肝脏中可以看到部分肝切除术后更早和增加的肝细胞增殖。C)与shNC肝脏相比，表达shGrhpr的肝脏在部分肝切除后，DAB染色的肝切片的Ki67阳性细胞的定量(对应于B))显示更早和增加的肝细胞增殖(各个点代表个体动物，数据显示平均值±SEM)。D)与对照shNC相比，在Grhpr敲低的情况下有丝分裂周期的峰值移动的示意图(对应于C))。
图13：Grhpr敲低减轻与慢性肝损伤相关的肝纤维化A)实验大纲。FAH-/-小鼠被注射了我们的构建体，然后，小鼠被饲养3个月以进行完全再增殖。之后，重复剂量的硫代乙酰胺每周3次腹膜内给药，持续8周，从而诱发慢性肝损伤。肝脏被收获、处理和分析。B)显示了肝脏的代表性宏观照片。组间的宏观差异已经可见。C)对指定的再增殖的小鼠肝脏切片的天狼猩红染色(纤维化疤痕组织染色)和苏木精-伊红染色(每组n＝5，放大50倍)。D)显示了每只动物的纤维化评分。评分由一位经过认证的对实验组不知情的病理学家给出。
图14：Grhpr敲低不能防止NASH相关肝纤维化A)实验大纲。FAH-/-小鼠被注射了我们的构建体，然后，小鼠被饲养3个月以进行完全再增殖。在达到完全再增殖后，小鼠暴露于“西方饮食”(高脂肪饮食和60％果糖)24周。肝脏被收获、处理和分析。B)显示了肝脏的代表性宏观照片。C)对指定的再增殖的小鼠肝脏切片的天狼猩红染色(纤维化疤痕组织染色)和苏木精伊红染色(每个实验组n＝6，每个对照组n＝7；显示代表性切片，放大50倍)。D)显示了每只动物的纤维化评分。评分由一位经过认证的病理学家给出，该病理学家对实验组不知情。
图15：人类NAFLD中的Grhpr表达变化A)对约150名患者的肝脏样本进行的转录组学分析显示，在患有晚期纤维化和肝硬化的NASH患者中，Grhpr表达轻微但显著地降低。与此一致，我们检测到纤维化3和4评分患者显著减少(*p<0.05，**p<0.01，***p，0.005)。
图16：Itfg1敲低加速伤口愈合和肝脏再增殖A)用于生成稳定细胞系的逆转录病毒骨架的概述。B)靶向Itfg1的得分最高的shRNA的敲低效率测试。qPCR分析和蛋白质印迹分析显示我们的shRNA可有效敲低Itfg1。C)Itfg1敲低加速体外伤口愈合。稳定细胞系生长至完全汇合，然后去除硅垫片留下限定的无细胞区域。监测这个“伤口”间隙的填充。代表性图像显示在上半部分。显示了伤口愈合测定的不同时间点的量化(下半部分，数据通过ImageJ软件和GraphPrizm软件的双向方差分析进行分析。shItfg1.698(SEQ ID NO：6)、shItfg1.680(SEQ ID NO：7)和shNC之间存在的显著差异显示为'*')。D)大纲显示了用于表达酶FAH、标志物GFP和感兴趣的shRNA的基于转座子的载体(上图)。下图显示了基于FAH敲除小鼠的肝脏再增殖试验。大纲显示了试验的合理性。如果某种shRNA的敲低能够增强再生并加速肝细胞增殖，那么我们应该能够看到与从稳定整合的肝细胞开始的对照shRNA相比，更快的克隆扩增。E)GFP成像器图像。外植小鼠肝脏的GFP成像显示，与表达shNC的肝细胞相比，稳定表达shItfg1的肝细胞的克隆扩增(再增殖)增强(在HDTV注射1.25μg指定质粒后第18天；显示了代表性照片；每个敲低shItfg1.698的实验组n＝8，，每个敲低shItfg1.680的实验组n＝6，每个对照组n＝6)。浅色白点代表GFP阳性宏观可见克隆扩增。F)稳定表达shItfg1.698、shItfg1.680和shNC的小鼠肝脏GFP阳性细胞的组织学分析(针对GFP的免疫染色)(显示的是代表性照片)。HDTV注射1.25μg所示质粒后第18天(放大200倍)。对于shItfg1可以看到增加的克隆扩增。G)GFP阳性细胞的定量(对应于F))显示，与对照相比，在Itfg1敲低的情况下，GFP阳性肝细胞显著增加。每个点代表一只动物。H)再增殖存活测定。右图显示了实验的概要。我们进一步稀释了递送到肝脏的质粒量。在一定的稀释度下，具有稳定整合的肝细胞数量将不足以扩展和补偿FAH-/-肝细胞的损失。然而，如果我们的候选物的敲低加速了再增殖，它可能足以补偿并使其生存。左图显示1：30稀释后的生存曲线。所有注射了我们表达对照shRNA的构建体的动物都死亡了，而所有注射了我们表达shItfg1的构建体的小鼠都存活了下来。实验组与对照之间具有统计学意义。使用对数秩检验(每组n＝5)计算统计显著性。
图17：Itfg1敲低减轻与慢性肝损伤相关的肝纤维化A)实验概要。FAH-/-小鼠被注射了我们的构建体，然后，小鼠被饲养3个月以进行完全再增殖。之后，重复剂量的硫代乙酰胺每周3次腹膜内给药，持续8周，从而诱发慢性肝损伤。肝脏被收获、处理和分析。B)显示了肝脏的代表性宏观照片。组间的宏观差异已经可见。C)对指定的再增殖小鼠肝脏切片的天狼猩红染色(纤维化疤痕组织染色)和苏木精-伊红染色(shItfg1.698为n＝6，对照组为n＝7，放大50倍)。D)显示了每只动物的纤维化评分。评分由一位经过认证的对实验组不知情的病理学家给出。E)显示了具有GFP成像系统的肝脏的代表性宏观照片。肝脏都是绿色的，因此完全再增殖。
图18：ITFG1在人肝组织中的表达；敲低防止NASH相关纤维化(也参见图35)。A)暴露于西方饮食的小鼠的宏观图片。shItfg1表示肝脏被再增殖，从而每个肝细胞都表达靶向Itfg1的shRNA，而shNC表示再增殖，从而每个肝细胞都表达非靶向对照shRNA。从宏观上看，Itfg1敲低的肝脏显示纤维化减少。B)来自约150名患者的肝脏样本的转录组学分析显示Itfg1没有显著的表达变化。C)ITFG1在健康肝组织和NASH肝硬化中表达。D)显示了ITFG1在人体组织中的表达。数据取自人类蛋白质图谱。E)ITFG1的低表达与肝癌患者的较长生存期相关。数据取自人类蛋白质图谱。F)用于产生稳定细胞系的逆转录病毒骨架的方案。G)鉴定了有效靶向人ITFG1的shRNA。使用全细胞裂解物通过蛋白质印迹分析进行敲低测试。稳定表达感兴趣的shRNA的HepG2细胞是通过逆转录病毒感染和选择产生的。GAPDH作为上样对照。
图19：乳液+500体内功能遗传筛选A)筛选示意图。建立了一个针对467个基因的混合shRNA文库筛选，这些基因在人类NAFLD患者中失调。使用两种基于饮食的NAFLD模型在两种性别的小鼠中进行筛选。B)每种RNA的倍数变化，通过暴露于胆碱缺乏型L-氨基酸定义的高脂肪饮食8周的雄性小鼠的p值为0.1表示。大多数shRNA已耗尽，但少数明显富集。C)基于归一化shRNA丰度水平的主成分分析。我们可以看到基于饮食暴露的明显分离。D)基于热图每只动物的高富集和耗尽的shRNA的富集/耗尽。根据我们的分析，我们确定了6个高置信度靶标。
图20：CDHFD小鼠脂肪肝模型A)胆碱缺乏型L-氨基酸定义的高脂肪饮食(CDHFD)导致小鼠快速和进行性脂肪肝疾病。在8周的饮食暴露后，小鼠已经显示出伴有晚期纤维化的NASH。B)病理学评估。经认证的病理学家对暴露于指定时间的CDHFD或正常食物的C56Bl6小鼠肝组织的组织学载玻片进行评估和评分。显示的是脂肪变性和纤维化的评分结果。每个点代表一种动物。
图21：Abcc4是NAFLD的潜在治疗靶点A)显示的是针对每只动物靶向Abcc4的shRNA表达盒的相对读数(NC＝正常食物，CD＝CDHFD)。B)靶向Abcc4的shRNA表达盒的筛选结果总结。显示的是每组的平均相对读数、倍数变化和log2倍数变化，比较CDHFD小鼠和NC小鼠。C)来自约150名患者的肝脏样本的转录组学分析显示，在NASH晚期纤维化和肝硬化阶段，Abcc4基因表达显著增加。此外，可以根据气球样变和纤维化阶段检测表达增加(表：灰色标记表示显著上调至少log2 2倍；*p<0.05，**p<0.01，***p，0.005)。
图22：Pak3是NAFLD的潜在治疗靶点A)显示的是每只动物靶向Pak3的shRNA表达盒的相对读数(NC＝正常食物，CD＝CDHFD)。B)靶向Pak3的shRNA表达盒的筛选结果总结。显示的是每组的平均相对读数、倍数变化和log2倍数变化，比较CDHFD小鼠和NC小鼠。C)来自约150名患者的肝脏样本的转录组学分析显示，在NASH肝硬化阶段，Pak3基因表达显著增加。此外，可以根据纤维化阶段检测表达增加(表：灰色标记表示显著上调至少log2 2倍；*p<0.05，**p<0.01，***p，0.005)。
图23：Trnp1是NAFLD的潜在治疗靶点A)显示的是针对每只动物靶向Trnp1的shRNA表达盒的相对读数(NC＝正常食物，CD＝CDHFD)。B)靶向Trnp1的shRNA表达盒的筛选结果总结。显示的是每组的平均相对读数、倍数变化和log2倍数变化，比较CDHFD小鼠和NC小鼠。C)来自约150名患者肝脏样本的转录组学分析显示，在NASH肝硬化阶段，Trnp1基因表达显著增加。有趣的是，随着脂肪变性和炎症表达的增加，其表达似乎被下调(表：灰色标记表示至少log2 2倍的显著上调；带框的灰色标记表示至少log2 2倍的显著下调；*p<0.05，**p<0.01，***p，0.005)。
图24：Apln是NAFLD的潜在治疗靶标A)显示的是针对每只动物的靶向Apln的shRNA表达盒的相对读数(NC＝正常食物，CD＝CDHFD)。B)靶向Apln的shRNA表达盒的筛选结果总结。显示的是每组的平均相对读数、倍数变化和log2倍数变化，比较CDHFD小鼠和NC小鼠。C)来自约150名患者的肝脏样本的转录组学分析显示，在NASH肝硬化阶段，Apln基因表达显著增加。有趣的是，随着炎症表达的增加，其表达似乎被下调(表：灰色标记表示至少log2 2倍的显著上调；带框的灰色标记表示至少log2 2倍的显著下调；*p<0.05，**p<0.01，***p，0.005)。
图25：Kif20a是NAFLD的潜在治疗靶标A)显示的是针对每只动物的靶向Kif20a的shRNA表达盒的相对读数(NC＝正常食物，CD＝CDHFD)。B)靶向Kif20a的shRNA表达盒的筛选结果总结。显示的是每组的平均相对读数、倍数变化和log2倍数变化，比较CDHFD小鼠和NC小鼠。C)来自约150名患者肝脏样本的转录组学分析显示Kif20a基因表达逐渐增加直至NASH晚期纤维化阶段(表：灰色标记表示显著上调至少log2 2倍；*p<0.05，**p<0.01，***p，0.005)。
图26：Ltb是NAFLD的潜在治疗靶标A)显示的是针对每只动物的靶向Ltb的shRNA表达盒的相对读数(NC＝正常食物，CD＝CDHFD)。B)靶向Ltb的shRNA表达盒的筛选结果总结。显示的是每组的平均相对读数、倍数变化和log2倍数变化，比较CDHFD小鼠和NC小鼠。C)来自约150名患者的肝脏样本的转录组学分析显示Ltb基因表达逐渐增加直至NASH晚期纤维化阶段(表：灰色标记表示显著上调至少log2 2倍；*p<0.05，**p<0.01，***p，0.005)。
图27：NASH疾病拦截体内功能遗传筛选的布局A)用于疾病拦截的全基因组体内功能遗传筛选。筛选了分成32个子池的近80000个shRNA。ShRNA表达是可诱导的，并且仅在肝脏显示脂肪变性之后但在NASH进展之前被激活。
图28：Mfap4敲低1年不会导致肝癌A)实验示意图。FAH-/-小鼠通过HDTV注射p/T-FAHIG-shRNA&SB13表达构建体；然后，将小鼠饲养1年以观察任何肿瘤形成或肝脏组织学异常。B)明场。显示了代表性图片(肝脏的两个表面)(每个实验组n＝5只小鼠，每个对照组n＝5只小鼠)。C)GFP成像。显示了代表性图片(肝脏的两个表面)。未观察到GFP阳性肿瘤。肝脏完全再增殖(强GFP阳性信号)。D)苏木精-伊红染色。显示了代表性图片。实验组和对照组均未见恶性病变。病理学评估由经过认证的病理学家进行。病理学家没有发现肝脏有恶性病变。E)GFP(DAB)染色。显示了代表性图片。大约95％的肝细胞呈GFP阳性，这意味着肝脏已完全再增殖。
图29：GalNAC与针对Mfap4的siRNA缀合(BNLCL.2细胞系；转染后72小时)A)研究中使用的GalNAC-siRNA缀合物的结构。确切的主链修饰可以在序列附录中找到(SEQ ID NO：7092和7093)。siRNA的目标序列基于shRNA指导序列。B)浓度为6μM的蛋白质印迹分析显示，与对照相比，两种不同缀合物GalNAC-si Mfap4.1356(SEQ ID NO：7092)和GalNAC-siMfap4.760(SEQ ID NO：7093)对Mfap4的有效敲低。C)浓度为11μM的蛋白质印迹分析显示，与对照相比，两种不同的缀合物GalNAC-si Mfap4.1356和GalNAC-si Mfap4.760有效敲低Mfap4。
图30：Grhpr敲低1年不会导致肝癌A)实验示意图。FAH-/-小鼠通过HDTV注射p/T-FAHIG-shRNA&SB13表达构建体；然后，将小鼠饲养1年以观察任何肿瘤形成或肝脏组织学异常。注射后1年收获肝脏。B)明场。显示了代表性图片(肝脏的两个表面)(每个实验组n＝3只小鼠，每个对照组n＝5只小鼠)。C)GFP成像。显示了代表性图片(肝脏的两个表面)。未观察到GFP阳性肿瘤。肝脏完全再增殖(强GFP阳性信号)。
图31：人类肝细胞(HpG2细胞系)中的Grhpr表达A)用于产生稳定细胞系的逆转录病毒骨架示意图。B)鉴定了有效靶向人类Grhpr的shRNA。使用全细胞裂解物通过qPCR进行敲低测试。HepG2细胞与pMSCV载体共转染。C)使用全细胞裂解物通过蛋白质印迹进行敲低测试。通过逆转录病毒感染和选择产生稳定表达指定shRNA的HepG2细胞。微管蛋白用作上样对照。
图32：GalNAC与针对Grhpr的siRNA缀合(BNLCL.2细胞系；转染后72小时)A)研究中使用的GalNAC-siRNA缀合物的结构。确切的主链修饰可以在序列附录(SEQ ID NO：7094)中找到。siRNA的目标序列基于shRNA指导序列。B)浓度为6μM的蛋白质印迹分析显示，与乱序对照相比，缀合物GalNAC-si Grhpr.361(SEQ ID NO：7094)对Grhpr有效敲低。浓度为11μM的蛋白质印迹分析显示，与乱序对照相比，偶联物GalNAC-si Grhpr.361有效敲低Grhpr。
图33：Itfg1敲低加速部分肝切除术(PH)后的肝再生A)实验大纲。FAH-/-小鼠被注射了我们的构建体，然后，小鼠被饲养3个月以进行完全再增殖。之后，通过手术切除了2/3的肝脏。在手术后42小时和48小时收获剩余的再生肝脏。B)肝切除术后42小时(每个实验组n＝4，每个对照组n＝6)和48小时(每个实验组n＝5，每个对照组n＝10)的DABKi67染色肝切片的代表性照片(200x放大)。C)与shNC肝脏相比，DAB染色肝切片(对应于B)的Ki67阳性细胞的定量显示表达shItfg1的肝脏在部分肝切除后肝细胞增殖增加(各个点代表个体动物，数据显示平均值±SEM)。
图34：Itfg1敲低1年不会导致肝癌A)实验示意图。FAH-/-小鼠通过HDTV注射p/T-FAHIG-shRNA&SB13表达构建体；然后，将小鼠饲养1年以观察任何肿瘤形成或肝脏组织学异常。注射后1年收获肝脏。B)明场。显示了代表性图片(肝脏的两个表面)。没有观察到肿瘤(每个实验组n＝5只小鼠，每个对照组n＝5只小鼠)。C)GFP成像。显示了代表性图片(肝脏的两个表面)。未观察到GFP阳性肿瘤。肝脏完全再繁殖(GFP阳性)。D)苏木精-伊红染色。显示了代表性图片。实验组和对照组均未见恶性病变。病理学评估由经过认证的病理学家进行。E)GFP(DAB)染色。显示了代表性图片。大约95％的肝细胞呈GFP阳性，这意味着肝脏已完全重新增殖。
图35：Itfg1敲低减轻NASH模型中与慢性肝损伤相关的肝纤维化A)实验概要。FAH-/-小鼠被注射了我们的构建体，然后，小鼠被饲养3个月以进行完全再增殖。在达到完全再增殖后，小鼠被暴露于“西方饮食”(高脂肪饮食和60％果糖)24周。肝脏被收获、处理和分析。B)显示了肝脏的代表性宏观照片。组间的宏观差异已经可见。C)对指定的再增殖小鼠肝脏切片的天狼猩红染色(纤维化疤痕组织染色)和苏木精-伊红染色(显示代表性图像；shItfg1.698为n＝6，对照组为n＝7，放大50倍)。D)显示了每只动物的纤维化评分。评分由一位经过认证的、对实验组不知情的病理学家给出。E)HistoIndex对脂肪变性进行的基于AI的客观分析。显示了代表性图片。F)定量分析显示，与对照组(每组n＝7只小鼠)相比，实验组(每组n＝7只小鼠)的脂肪变性评分显著降低。
图36：Itfg1的敲低影响MKK6、JNK和RPS6信号转导A)从完全再增殖的肝脏中分离蛋白质以进行进一步广泛蛋白质阵列分析的示意图。B)在进行广泛的蛋白质阵列聚焦后，进行了蛋白质印迹实验。此处显示了蛋白质印迹的结果。从完全再增殖的肝脏中分离出蛋白质。与对照相比，尤其是P-MKK6/P-MKK3在Itfg1敲低的情况下被激活得更多。实验组中有3个生物学重复，对照中有3个生物学重复。C)根据STRING数据库，所有指示的蛋白质都在相互作用并与细胞生长和增殖有关。
图37：GalNAC与针对Itfg1的siRNA缀合(BNL CL.2细胞系；转染后72小时)A)研究中使用的GalNAC-siRNA缀合物的结构。确切的主链修饰可以在序列附录中找到(SEQ IDNO：7095和7096)。siRNA的目标序列基于shRNA指导序列。B)浓度为6μM的蛋白质印迹分析显示，与对照相比，两种不同的缀合物GalNAC-si Itfg1.698(SEQ ID NO：7095)和GalNAC-siItfg1.680(SEQ ID NO：7096)对Itfg1有效敲低。浓度为11μM的蛋白质印迹分析显示，与对照相比，两种不同的缀合物GalNAC-si Itfg1.698和GalNAC-si Itfg1.680可有效敲低Itfg1。
图38：Mfap4和Itfg1敲低增强了肝脏以外的增殖和再生A)伤口愈合测定的概要。产生表达各shRNA的稳定细胞系。B)Mfap4的敲低以及Itfg1的敲低加速了小鼠肺细胞(细胞系CCL206)的伤口愈合。C)Mfap4的敲低以及Itfg1的敲低加速了小鼠成肌细胞(成肌细胞系CRL1772)的伤口愈合。
图39：Pak3敲低加速体外伤口愈合AML12成体肝细胞系中Pak3的稳定敲低加速伤口愈合(显示代表性图像)。
实施例
实施例1体内功能遗传RNAi筛选
进行了体内功能遗传筛选，以确定新的肝再生调节剂作为治疗靶点，以增加内源性再生和抗肝病。这种方法最初是利用FAH-/-小鼠开创的。在此基础上，进一步修改和改进了筛选设置，因此它可以应用于任何独立于遗传背景和修饰的小鼠(图1A)。通过水动力尾静脉注射，递送了一个重点shRNA文库到肝脏，其中包含250个针对89个基因的shRNA。通过与编码睡美人13转座酶的质粒结合，在大约5％到10％的肝细胞中获得稳定整合。因此，生成了嵌合小鼠肝脏，其中表达shRNA的肝细胞被“野生(wt)”肝细胞包围。为了模拟慢性肝损伤，发明人用硫代乙酰胺(TAA)(一种诱导肝损伤的化学物质)治疗小鼠，每周3次，持续8周(图1A)。肝损伤和代偿性再生的循环会引发竞争环境。如果某种shRNA的敲低对肝细胞有利，则细胞会扩增，并且可以检测到shRNA的富集。相反，如果shRNA的表达是有害的，则该shRNA应该耗尽。与起始池相比，没有变化表明在此环境中没有影响。shRNA的丰度可以通过基于Illumina的深度测序来确定。为了测序，从肝脏中分离出基因组DNA，用包括Illumina接头序列的引物扩增shRNA表达盒，并直接对产物进行测序。
此外，大多数shRNA在此筛选中被耗尽，子集在所有生物复制(5只独立小鼠)中始终被富集(图1B-C)。重要并给予筛选置信度的是，两个独立的非靶向对照shRNA(也称为shNC或shCTRL；一种靶向光素酶，一种靶向荧光素酶，两者均未在小鼠中表达)未被富集或耗尽。此外，三个独立的靶向c-Met肝细胞生长因子受体和肝再生所必需的shRNA被耗尽(图1D)。为了避免shRNA的脱靶效应，本发明人关注于至少两种独立的shRNA被富集的靶标(图1D)。四个独立的shRNA被发现富集靶向Mfap4，两个独立的shRNAs各自靶向Grhpr和Itfg1。
实施例2鉴定的治疗靶标的验证
Mfap4–微纤维相关蛋白4
为了验证，首先测试了的两个最高-富集的靶向Mfap4的shRNA的体外敲低效率(图2A)。两种shRNA都显示出有效的敲低。对于稳定表达每个shRNA的细胞系(图2B)，以及表达非靶向对照shRNA的细胞系都制备了，并且测试了shRNA在伤口愈合测定中的作用。Mfap4的敲低(两个独立的shRNA测试)增加了TIB73(BNLCL.2)细胞和AML12细胞的伤口闭合，表明增殖增加(图2C和G)。此外，使用稳定细胞系，本发明人检查了通过EdU整合增强的细胞复制并确定细胞倍增时间(图2D-E)。清楚地检测到加速增殖。使用Guava Muse细胞分析仪通过流式细胞术进行的细胞周期分析显示，与非靶向对照(shNC)相比，对于通过shMfap4.1356(SEQ ID NO：1)和shMfap4.760(SEQ ID NO：2)稳定敲低Mfap4的细胞，在细胞周期的G2期细胞数量更多(以细胞数量的％显示)，同样表明增殖增加(图2F)。
本发明人随后利用了FAH(延胡索酰乙酰乙酸酯)敲除小鼠。酪氨酸代谢的缺陷导致肝细胞中毒副产物的积累，导致肝功能衰竭。通过水动力尾静脉注射向大约5-10％的肝细胞递送一种构建体，用于表达缺失的酶FAH和shRNA，测试再增殖效率。如果靶向Mfap4的shRNA的敲低增强了再生和增殖，则应该看到更快的克隆扩增(图3A)。正如预期的那样，Mfap4的敲低增强了再增殖，其通过全肝GFP成像的(图3B)、肝脏冷冻切片的原始GFP荧光(图3C)和石蜡切片中GFP的抗体染色(图3D-E)检测到。进一步稀释注射质粒的数量可以减少稳定表达FAH、GFP和感兴趣的shRNA的肝细胞数量，因此表达FAH的肝细胞不能足够快地扩张和补偿FAH-/-肝细胞损失。然而，依赖于shRNA的再生加速可能能允许存活。在1：30稀释时，所有shMfap4.1356(SEQ ID NO：1)注射小鼠仍然存活，而所有注射对照shNC小鼠死亡(图3F)。这进一步支持了Mfap4敲低介导的加速，因为仅在Mfap4的情况下，肝细胞扩张得足够快以补偿肝细胞损失。
“西方饮食”诱发进行性NAFLD，导致NASH和纤维化(图4)。发明人重新构建了FAH-/-小鼠肝脏，以便所有肝细胞表达靶向Mfap4的shRNA或非靶向对照shRNA。充分再增殖后，小鼠暴露于“西方饮食”(图5A)。Mfap4的敲低明显减弱了疾病进展，反映在减少的纤维化上(图5B-F)。
还应用了慢性TAA暴露于shMfapp4和shCTRL再增殖的FAH小鼠(图6A)。与筛选结果一致，Mfap4敲低可防止TAA引起的肝损伤和纤维化(图6B-D)。作为急性损伤模型，对再增殖的小鼠(图7A和E)进行了2/3部分肝切除术(PH)。增强的Ki67染色(图7B-C和7F-G)以及细胞周期蛋白A(图7D)和细胞周期蛋白E(图7H)在PH后的早期激活分别表明再生更快。在2/3手术部分切除肝脏后，FAH-/-肝脏的GFP成像(图7I)和DAB GFP染色(图7J)表明小鼠已完全再增殖。
在用shMfap4或非靶向对照shRNA完全再增殖后，发明人还通过蛋白质阵列(protein arrays)和蛋白质印迹检查了途径激活的差异。收集肝脏并分离用于蛋白质阵列和蛋白质印迹的蛋白质以及用于转录组学的RNA(图8A-H)。与增强的再生能力一致，Mfap4敲低诱导mTOR、p70S6K、ERK和p38的激活(图8B和D)。基于STRING分析(string-db.org)，已识别的途径全部相关联(图8C、E和K)并影响细胞生长和增殖。P70S6K是mTOR的主要底物(图8E)，有助于肝再生。此外，p70S6K和ERK信号传导的损伤与肝脏再生能力的年龄依赖性下降有关。使用体外伤口愈合试验，进行了稳定表达shMfap4或shCTRL细胞系与靶向p70s6k或p38的siRNA相结合的双敲除实验(图8F-G)。在这种情况下检测到伤口愈合减慢。这使得Mfap4的敲低与增强肝脏再生和恢复活力一致。AML12-shMfap4.1356、AML12-shMfap4.760和AML12-shNC的主要成分分析显示实验(shMfap4)和对照(shNC)之间的聚类分离。Mfap4和对照的热图比较表明，根据文献，已知参与肝再生的基因，如Ptgs2、Areg、Dhrs9、Hmox1和Nqo1，与对照相比在Mfap4敲低后上调(图8H-J)。此外，STRING分析表明，来自细胞系的转录组学途径以及来自重新填充的肝脏的蛋白质组学鉴定途径是相关联的(图8K)。
本发明人随后鉴定了2个独立的靶向人Mfap4的shRNA：huMfap4.1812(SEQ ID NO：7100)和huMfap4.1602(SEQ ID NO：7097)。观察到人肝癌细胞系HepG2(图9A)中的有效敲低。此外，通过永生化人肝细胞-SV40中的qPCR分析(图9J)和(图9H-I)蛋白质印迹(图9K)确定，与非靶向对照相比，两种shRNA都显示出huMfap4的强靶向敲低。Edu掺入测定表明小鼠和人之间存在一种保守机制，因为在Mfap4敲低时，在人HepG2细胞中观测到更高的EdU掺入(图9B)，永生化人肝细胞中siRNA对Mfap4的瞬时敲低显示了更高的EdU掺入(图9F-G)，并且在永生化人肝细胞中Mfap4的稳定敲低可增强伤口愈合(图9L-M)。
重要的是，根据当地患者队列，肝硬化NAFLD患者肝脏中Mfap4的表达增加(图9C)。这与之前的研究一致，表明肝和肺纤维化中Mfap4增加。有趣的是，Mfap4被建议作为无创评估丙型肝炎患者肝纤维化的潜在生物标志物。发明人对来自健康和肝硬化肝脏的人肝组织进行的Mfap4染色也显示在患病肝脏中的检出增加。有趣的是，除了纤维化疤痕区域的强染色外，还在肝细胞的细胞质和细胞核中检测到Mfap4(图9D)。Mfap4被认为是一种细胞外基质蛋白，但对其在肝细胞中的作用知之甚少。因此，它代表了具有新生物学特性的肝病治疗的新靶点。
本发明人还研究了经Mfap4处理的小鼠中肝癌的发展。shMfap4构建体通过HDTV传递给FAH-/-小鼠。饲养小鼠1年后，收获肝脏以确定肝脏中的任何肿瘤形成(图28A)。没有观察到GFP阳性肿瘤，肝脏完全再增殖，如强GFP阳性信号所示(图28B-C和E)。大约95％的肝细胞呈GFP阳性。此外，在shMfap4和shNC治疗组中，苏木精和伊红染色均未显示任何恶性疾病。由经过认证的病理学家进行评估，未在肝脏中发现恶性病变(图28D)。实验表明，Mfap4敲低1年不会导致小鼠肝癌。
产生了靶向Mfap4的修饰的siRNA-GalNAC缀合物(图29A；表11；SEQ ID NO：7092和7093)。人类永生化肝细胞用siRNA处理72小时，然后暴露于EdU4小时，然后固定和分析。蛋白质印迹分析显示，与乱序对照相比，两种不同的缀合物GalNAC-si Mfap4.1356和GalNAC-si Mfap4.760有效敲低Mfap4。
Grhpr–乙醛酸和羟基丙酮酸还原酶
第二个确定的靶标是具有羟基丙酮酸还原酶、乙醛酸还原酶和D-甘油酸脱氢酶活性的酶。两个以Grhpr为靶标的shRNAs在筛选中被大量富集(图1)。验证遵循与Mfap4所述相同的方式。首先，生成稳定的细胞系并确定shRNA的敲低效率(图10A-B)。两种shRNA都表现出很强的靶向敲低能力。伤口愈合试验支持在Grhpr敲低条件下更快的愈合和更快的增殖(图10C-D)。同样，利用FAH-/-小鼠，比较了Grhpr靶向和对照shRNA之间的再增殖。在这些条件下，Grhpr敲低加速了肝脏的再增殖，所有注射shGrhpr的小鼠在1：30稀释后仍然存活，而所有对照注射shNC小鼠均死亡(图11)。接下来，肝脏被完全再增殖，以便每个肝细胞表达shGrhpr或非靶向对照shRNA(图12A)。在2/3部分肝切除术的急性肝损伤模型中，Grhpr敲低加速了Ki67阳性细胞早期峰值所指示的再生(图12B-D)。此外，将慢性TAA治疗应用于表达shGrhpr的再增殖的FAH-/-小鼠肝脏，显示与对照相比肝损伤减少和纤维化减少(图13)。然而，在西方饮食小鼠模型中，Grhpr敲低似乎无法防止NAFLD相关疾病进展和纤维化发展(图14)。
有趣的是，NAFLD患者队列显示在NASH晚期纤维化和肝硬化阶段，肝脏中Grhpr表达显著降低，但不是非常明显(图15A)。
类似于靶向Mfap4的实验设置，在Grhpr敲低条件下研究了肝癌的发展(图30A)。FAH-/-小鼠注射了p/T-FAHIG-shGrhpr和SB13质粒的组合，用于肝脏再增殖。最初5％到10％的肝细胞会稳定整合。注射后NTBC停药后，肝脏将再增殖，因此几乎每个肝细胞都会表达靶向Grhpr的shRNA。注射后1年收获肝脏并评估肝肿瘤的发展。在FAH-/-小鼠中未观察到GFP阳性肿瘤，肝脏完全重新增殖(图30B-C)，表明肝脏中Grhpr的长期敲低不会诱发肝癌并且是安全的
此外，具有稳定表达shRNA的HepG2细胞是通过逆转录病毒转染和选择产生的(图31A)。通过qPCR和蛋白质印迹使用RNA或全细胞裂解物(微管蛋白用作上样对照)确定Grhpr敲低。鉴定了几种靶向人Grhpr的独立shRNA(图31B)，它们导致人肝癌细胞系HepG2中有效的Grhpr敲低(图31C)。
按照与靶向Mfap4所述相同的方式生成靶向Grhpr的修饰的siRNA-GalNAC缀合物(图32A，表11；SEQ ID NO：7094)。BNLCL.2细胞系；转染后72小时。分别使用6μM和11μM进行蛋白质印迹分析表明，与乱序对照相比，缀合物GalNAC-si Grhpr.361可有效抑制Grhpr。
Itfg1–包含整合素alphaFG-GAP重复蛋白1
首先测试了顶部富集的shRNA和额外的独立shRNA的靶向敲低效率。通过qPCR和蛋白质印迹(图16A-B)，两种shRNA都显示出良好的靶向敲低。利用稳定的细胞系，Itfg1敲低在体外强烈加速伤口愈合(图16C)。发明人随后利用FAH-/-小鼠并进行了再增殖测定(图16D)。与筛选结果一致，两种Itfg1敲低都会加速再增殖(图16E-G)。有趣的是，如果输入质粒被进一步稀释，在某些时候，具有稳定整合的肝细胞数量应该不足以补偿NTBC停用后的肝细胞损失(图16H右图)。在1：30稀释时，所有注射shItfg1的小鼠仍然存活，而所有注射shCTRL的小鼠死亡(图16H左图)。这进一步支持Itfg1敲低介导的加速，因为只有在shItfg1的情况下，肝细胞扩张得足够快以补偿肝细胞损失。与此一致，在肝完全再增殖后，观察到Itfg1敲低对慢性TAA诱导的肝损伤和纤维化的保护作用(图17)。
在小鼠西方饮食NAFLD模型(图35A)中，Itfg1的敲低减弱了纤维化的发展(图35B-F)，这已经可以在宏观上看到(图18A)。表达非靶向对照shRNA的小鼠肝脏表面粗糙提示存在晚期纤维化。相反，表达shItfg1的肝脏表面提示纤维化明显减少。此外，使用HistoIndex专有AI病理学系统进行的客观分析进一步表明，通过Itfg1敲低可显著减少脂肪变性(图35E-F)。来自我们的NAFLD患者队列的表达数据表明，在疾病进展期间肝脏中没有主要的表达变化(图18B)，表明存在转录后调节。Itfg1在健康肝组织和NASH、肝硬化和肝细胞癌中表达(图18C-D)。来自人类蛋白质图谱的数据显示，Itfg1的低表达与肝癌患者的存活率增加有关(图18F)。有趣的是，到目前为止，对Itfg1知之甚少，因此它代表了一个有趣的肝病新靶点。生成稳定的人HepG2细胞系并确定不同Itfg1 shRNA的敲低效率显示出对人Itfg1的强靶向敲低(图18F-G)。
同样，利用FAH-/-小鼠，肝脏完全再增殖3个月，以便每个肝细胞表达shItfg1或非靶向对照shRNA(shNC)。之后，移除2/3的肝脏并监测肝脏再生(图33A)。在2/3部分肝切除术的急性肝损伤模型中，更早的峰值和更高数量的Ki67阳性细胞提示，部分肝切除术后Itfg1敲低加速再生(图33B-C)。在小鼠中Itfg1敲低1年后未观察到恶性疾病和GFP阳性肿瘤(图34)。约95％GFP阳性肝细胞提示shItfg1组和对照组的肝脏都完全再增殖。
为了研究在用shItfg1或非靶向对照shRNA完全再增殖后通路激活的差异，分离来自完全再增殖的肝脏的蛋白质用于进一步的广泛蛋白质阵列分析(图36A)。在进行广泛的蛋白质阵列后，进行了聚焦蛋白质印迹实验。据观察，ITFG1的敲低会影响MKK6、JNK和RPS6信号。特别地，与对照相比，P-MKK6/P-MKK3在Itfg1敲低的情况下被激活得更多(图36B)。根据STRING数据库，所有提示的蛋白质都在相互作用并与细胞生长和增殖相关(图36C)。
产生了修饰的siRNA-GalNAC缀合物以靶向Itfg1(图37A，表11；SEQ ID NO：7095和7096)。6μM和11μM的蛋白质印迹分析分别显示，与对照相比，两种不同的缀合物GalNAC-siItfg1.698和GalNAC-siItfg1.680可有效敲低Itfg1(图37B)。
小鼠肺细胞系和小鼠成肌细胞系中的Mfap4或Itfg1敲低
使用小鼠肺细胞系CCL206和小鼠成肌细胞系CRL1722生成稳定细胞系，各自表达shRNA-shMfap4、shItfg1或对照shNC(图38A)。Mfap4的敲低以及Itfg1的敲低加速了小鼠肺细胞和小鼠成肌细胞的伤口愈合。这些结果表明，Mfap4和Itfg1的敲低不仅增强了肝脏的增殖和再生，还增强了肺和成肌细胞的增殖和再生。
实施例3–EMULSION+500筛选和靶标验证
独立于TAA慢性损伤诱导筛选，还使用包含1780个靶向467个基因的shRNA的聚焦shRNA文库进行功能遗传筛选。这467个基因是，对应于我们的NAFLD患者队列中发现的差异上调基因的小鼠同源基因(图19A)。该筛选是在两种基于饮食的NAFLD小鼠模型中进行的，即“西方饮食”(WD)模型(图4)和胆碱缺乏型L-氨基酸定义的高脂肪饮食(CDHFD)模型(图20)。CDHFD是一种非常有侵略性且快速的模型，可在8周内导致NASH和晚期纤维化。相比之下，WD大约需要半年时间才能达到这个阶段。与TAA筛选类似，shRNA文库通过水动力尾静脉注射(HDTV)输送到肝脏。结合转座子的构建体与表达睡美人13转座酶的质粒，可在约5％至10％的肝细胞中实现稳定整合。注射后，开始相应的饮食暴露，直到达到具有晚期纤维化的NASH。收获肝脏后，分离基因组DNA，扩增部分shRNA表达盒，并通过NGS对丰度进行测序。鉴定出富集的shRNA，这表明这些shRNA在脂肪肝疾病的背景下具有优势。
在CDHFD模型中，大多数shRNA被耗尽(图19B)。有趣的是，基于归一化的shRNA丰度水平的主成分分析，可以看到我们的CDHFD与正常饮食暴露组小鼠之间的明显分离(图19C)。然后进行深入差异丰度shRNA分析。六个用于验证的shRNA/靶标(图19D)是基于大多数动物的可靠富集而确定的。重要的是，由于该库是根据相关的人类患者数据设计的，并且这是一个功能性基因筛选，因此筛选中的评分已经可以看作是第一个验证步骤。
ABCC4——ATP结合盒亚家族C成员4(MRP4)
此靶标是介导胆汁成分流入到血液中的转运蛋白。有趣的是，在所有对照饮食暴露的小鼠中，仅检测到少量相对读数，而在5只CDHFD小鼠中有3只可见明显富集(图21A-B)。此外，该基因的表达在人类患者队列的疾病进展过程中增加(图21C)。与炎症、纤维化和气球样变评分相关的表达也显著增加。
PAK3——p21(RAC1)激活激酶3
该靶标是丝氨酸-苏氨酸激酶。在5只小鼠中的4只中观察到靶向PAK3的shRNA富集(图22A-B；SEQ ID NO：9)。PAK3的表达在肝硬化和纤维化评分为4的NAFLD患者中显著上调(图22C)。由于肝脏和胰腺在发育过程中均来源于前肠内胚层，因此有趣的是，Pak3被描述为β细胞分化的调节剂。在这种情况下，Pak3促进细胞周期退出，因此具有抗增殖功能。因此，这也是肝病和再生的一个非常有趣的靶标，正如AML12成体肝细胞系中Pak3的稳定敲低所证实的那样，它加速了伤口愈合(图39)。
TRNP1——TMF1调节的核蛋白1
该靶标是一种DNA结合因子，在大脑发育和加速细胞周期进程中起着至关重要的作用。到目前为止，没有描述与肝脏相关的功能。在对照喂养的小鼠中，检测到靶向shTrnp1表达细胞(低相对读数)的一致选择。然而，CDHFD的5只小鼠中有4只显示shTrnp1富集(图23A-B；SEQ ID NO：13)。我们的人类NAFLD患者队列显示肝脏中Trnp1的复杂基因表达模式。在早期疾病阶段，我们观测到下调，但在肝硬化阶段上调(图23C)。与脂肪变性期间的情况一致，我们观测到进行性下调。
APLN——爱帕琳肽(Apelin)
该靶标编码一种肽，该肽可作为G蛋白偶联的爱帕琳肽受体的内源性配体。在5只CDHFD小鼠的3只中，观察到与对照相比靶向Apln的shRNA的强烈富集(图24A-B；SEQ ID NO：11)。基于NAFLD患者队列，观察到肝硬化阶段的显著上调并且与纤维化评分4分一致(图24C)。已有文献表明Apln通过ERK信号促进肝纤维化。此外，Apln被描述为在NAFLD患者和脂肪肝大鼠中有所不同，并建议作为诊断标志物。重要的是，编码的蛋白质被加工成活性肽片段，使其难以被经典药物方法靶向，并且是基于RNAi的治疗的理想选择。
KIF20A——驱动蛋白家族成员20A
该靶标编码胞质分裂所需的有丝分裂驱动蛋白。在5只CDHFD小鼠中的3只中，观察到与对照相比靶向Kif20a的shRNA的强烈富集(图25A-B；SEQ ID NO：12)。基于NAFLD患者队列数据，Kif20a的表达在疾病进展期间增加(图25C)。此外，Kif20a的高表达与HCC患者的生存率低有关。有趣的是，Kif20a敲低会影响胞质分裂，从而导致更高的多倍性。在许多慢性肝病中也可以看到更高的多倍体。
LTB——淋巴毒素β
该靶标编码TNF家族的II型膜蛋白。与对照相比，在5只CDHFD小鼠中的4只中可见靶向LTB的shRNA的强烈富集(图26A-B；SEQ ID NO：10)。基于NAFLD患者队列数据，除肝硬化阶段外，LTB的表达在疾病进展期间持续增加(图26C)。还观察到基于脂肪变性、炎症、气球样变和纤维化评分的显著表达增加。有趣的是，LTB被发现可以调节肝脏再生，与肥胖有关，并且缺乏淋巴毒素途径的动物被证明可以抵抗饮食引起的肥胖。
此外，一项基于NAFLD患者队列，靶向自上而下的调基因(top down-regulated)的功能性基因筛选也正在进行中。此外，功能基因组筛选也即将结束。在此设置中，本发明人在达到脂肪变性后进展为NASH之前仅通过诱导shRNA表达，为了特异性用于NAFLD疾病进展的调节剂筛选全基因组(小鼠中32个shRNA库，约2500至3000shRNA)(图27)。
siRNA引导链列表：
siRNA引导链与有义-环-反义RNA结构的反义链相同。该序列等于mRNA中靶向序列的反向互补序列。该列表显示了21bp的siRNA引导链。SEQ ID NO：15和19用于实施例中。浅灰色标记、粗体和下划线是具有最高-DSIR预测分数并通过全基因组传感器预测算法预测的siRNA引导链(SEQ ID NO：349-351、457、465、468、470、473、1483、1485、1486、1488-1490、2209、2225、2234、5061、5062、5390-5993、5967、5970、5971、6977、6978和6993)。
序列同一性
为了确定两个或多个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比，可以以本领域技术人员已知的各种方式实现成对和多重序列比对，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如ClustalOmega(
J.2005，生物信息学21，951-960)，T-coffee(Noredame等2000，J.Mol.Biol.(2000)302，205-217)，Kalign(Lassmann和Sonnhammer 2005，BMC生物信息学，6(298))和MAFFT(Katoh和Standley 2013，分子生物学与进化，30(4)772–780)软件。使用此类软件时，例如对于空位罚分和扩展罚分，优选使用默认参数。
表格
表1:小鼠(mus musculus):
人(homo sapiens):
表2.MFAP4的结果.分数阈值:70.设计:siRNA 21 nt.
表3.GRHPR的结果.分数阈值:70.设计:siRNA
21 nt.
表4.ITFG1的结果.分数阈值:70.设计:siRNA 21 nt.
表5.ABCC4的结果.分数阈值:70.设计:siRNA 21 nt.
表6.PAK3的结果.分数阈值:70.设计:siRNA 21 nt.
表7.TRNP1的结果.分数阈值:70.设计:siRNA 21 nt.
表8.APLN的结果.分数阈值:70.设计:siRNA
21 nt.
表9.KIF20A的结果.分数阈值:70.设计:siRNA 21 nt.
表10.LTB的结果.分数阈值:70.设计:siRNA 21 nt.
表11.GalNAC-siRNA缀合物.
表12.人shRNA序列(有义环反义序列)
表13.小鼠shRNA序列(有义环反义序列)
表14:靶标序列.
Claims (57)
1.一种治疗或预防纤维化相关疾病的方法，包括抑制ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一种。
2.一种治疗或预防纤维化相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的至少一种的抑制剂。
3.ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中至少一种的抑制剂，用于治疗或预防纤维化相关疾病的方法。
4.ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中至少一种的抑制剂在制备用于治疗或预防纤维化相关疾病的方法中的药物中的用途。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述疾病是肝脏疾病或病症。
6.根据权利要求5所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述肝脏疾病或病症选自：急性肝病、慢性肝病、代谢性肝病、脂肪变性、肝纤维化、原发性硬化性胆管炎(PSC)，肝硬化、轻度肝纤维化、晚期肝纤维化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝病(ALFD)、酒精相关性肝病(ARLD)、肝缺血再灌注损伤、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、肝炎、肝损伤、肝损伤、肝功能衰竭、代谢综合征、肥胖、糖尿病、终末期肝病、肝脏炎症、小叶炎症和/或肝细胞癌(HCC)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂选自核酸、肽、抗体、抗原结合分子或小分子抑制剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂能够结合根据SEQ ID NO：7156至7178中任一项或多项的多肽，或结合根据SEQ ID NO：7179至7195中的任一项的mRNA。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7179至7195中的任一项或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7179至7195中的任一项的反向互补序列或其部分具有至少75％的序列同一性。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1至7155中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：1至7155中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：6、7、457至1482、7095、7096、7109至7114、7130至7140、7144、7145、7149、7150、7154和/或7155中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：6、7、457至1482、7095、7096、7109至7114、7130至7140、7144、7145、7149、7150、7154和/或7155中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低ITFG1的基因和/或蛋白表达。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、14至347、7092、7093、7097至7102、7115至7120、7141、7142、7146、7147、7151和/或7152中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：1、2、14至347、7092、7093、7097至7102、7115至7120、7141、7142、7146、7147、7151和/或7152中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低MFAP4的基因和/或蛋白表达。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：3至5、348至456、7094、7103至7108、7121至7129、7143、7148和/或7153中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：3至5、348至456、7094、7103至7108、7121至7129、7143、7148和/或7153中的任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低GRHPR的基因和/或蛋白表达。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1483至2208中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ IDNO：1483至2208中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低ABCC4的基因和/或蛋白表达。
15.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：2209至5060中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ IDNO：2209至5060中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中反义核酸能够降低PAK3的基因和/或蛋白表达。
16.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5061至5389中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ IDNO：5061至5389中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低TRNP1的基因和/或蛋白表达。
17.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5390至5966中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ IDNO：5390至5966中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低APLN的基因和/或蛋白表达。
18.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5967至6974中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ IDNO：5967至6974中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低KIF20A的基因和/或蛋白表达。
19.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂是包含或编码反义核酸的抑制性核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：6975至7091中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ IDNO：6975至7091中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性，可选地，其中所述反义核酸能够降低LTB的基因和/或蛋白表达。
20.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制性核酸包括：(i)包含SEQ ID NO：1至7096或7146至7150之一的核苷酸序列、或与SEQ ID NO：1至7096或7146至7150之一具有至少75％的序列同一性的核苷酸序列的核酸；和(ii)包含具有(i)所述核苷酸序列的反向互补序列、或与(i)所述核苷酸序列的反向互补序列具有至少75％的序列同一性的核苷酸序列的核酸。
21.根据权利要求9至20中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制性核酸包含一种或多种选自以下的修饰核苷酸：2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸盐、2'-O-甲基腺苷3'-磷酸盐、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸盐、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸盐、2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基腺苷3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟尿苷-3'-磷酸盐、2'-氟腺苷-3'-磷酸盐、2'-氟鸟苷-3'-磷酸盐、2'-氟胞苷-3'-磷酸盐、2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯、和2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯。
22.根据权利要求8或权利要求9所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制性核酸包含：(i)包含SEQ ID NO：7146至7150之一中所示的核苷酸序列(包括对其的修饰)的核酸；(ii)包含SEQ ID NO：7151至7155之一所示核苷酸序列(包括对其的修饰)的核酸。
23.根据权利要求7至22中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述抑制剂包含促进肝细胞摄取抑制性核酸的部分。
24.根据任一项权利要求中所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述核酸抑制剂是反义核酸、siRNA、或shRNA。
25.根据权利要求2至24中任一项所述的方法、使用的抑制剂、或用途，其中所述方法包括向受试者施用所述抑制剂，在所述受试者体内MFAP4、GRHPR、ITFG1、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的表达和/或活性被上调。
26.一种用于降低ITFG1的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7182或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7182或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
27.根据权利要求26所述的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：6、7、457至1482、7095、7096、7109至7114、7130至7140、7144、7145、7149、7150、7154和/或7155中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：6、7、457至1482、7095、7096、7109至7114、7130至7140、7144、7145、7149、7150、7154和/或7155中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
28.一种用于降低MFAP4的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7179或7180或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7179或7180或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
29.根据权利要求28所述的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、14至347、7092、7093、7097至7102、7115至7120、7141、7142、7146、7147、7151和/或7152中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：1、2、14至347、7092、7093、7097至7102、7115至7120、7141、7142、7146、7147、7151和/或7152中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
30.一种用于降低GRHPR的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7181或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7181或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
31.根据权利要求30所述的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：3至5、348至456、7094、7103至7108、7121至7129、7143、7148和/或7153中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：3至5、348至456、7094、7103至7108、7121至7129、7143、7148和/或7153中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
32.一种用于降低ABCC4的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7183至7186中的任一项或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7183至7186中的任一项或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
33.根据权利要求32所述的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1483至2208中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：1483至2208中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
34.一种用于降低PAK3的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7187至7190中的任一项或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7187至7190中的任一项或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
35.根据权利要求34所述的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：2209至5060中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：2209至5060中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
36.一种用于降低TRNP1的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7191或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7191或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
37.根据权利要求36所述的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5061至5389中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：5061至5389中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
38.一种用于降低APLN的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7192或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7192或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
39.根据权利要求38所述的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5390至5966中的任一个具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：5390至5966中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
40.一种用于降低KIF20A的基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7193或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7193或其部分的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
41.根据权利要求40所述的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5967至6974中任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：5967至6974中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
42.一种用于降低LTB基因和/或蛋白质表达的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸与SEQ ID NO：7194或7195或其部分具有至少75％的序列同一性，或与SEQ ID NO：7194或7195或其一部分的反向互补序列具有至少有75％的序列同一性。
43.根据权利要求42所述的抑制性核酸，其中所述核酸包含或编码反义核酸，所述反义核酸包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：6975至7091中的任一项具有至少75％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO：6975至7091中任一项的反向互补序列具有至少75％的序列同一性。
44.一种抑制性核酸，包含(i)包含SEQ ID NO：7092至7096之一所示核苷酸序列的核酸；和(ii)包含SEQ ID NO：7141至7145之一所示核苷酸序列的核酸。
45.根据权利要求26至44中任一项所述的抑制性核酸，其中所述抑制性核酸包含一种或多种选自以下的修饰核苷酸：2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸、2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸、2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-硫代磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟尿苷-3'-磷酸、2'-氟腺苷-3'-磷酸、2'-氟鸟苷-3'-磷酸、2'-氟胞苷-3'-磷酸、2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-硫代磷酸酯、2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯、和2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯。
46.一种抑制性核酸，包含(i)包含SEQ ID NO：7146至7150之一所示核苷酸序列(包括对其的修饰)的核酸；和(ii)包含SEQ ID NO：7151至7155之一所示核苷酸序列(包括对其的修饰)的核酸。
47.根据权利要求26至46中任一项所述的抑制性核酸，其中所述核酸还包含促进肝细胞摄取所述抑制性核酸的部分。
48.根据权利要求26至47中任一项所述的抑制性核酸，其中所述抑制性核酸是反义核酸、siRNA或shRNA。
49.一种核酸，可以是分离的，所述核酸编码根据权利要求26至48中任一项所述的抑制性核酸。
50.一种表达载体，包含根据权利要求49所述的核酸。
51.一种组合物，其包含根据权利要求26至48中任一项所述的抑制性核酸、根据权利要求49所述的核酸、或根据权利要求50所述的表达载体、以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。
52.一种细胞，其包含根据权利要求26至48中任一项所述的抑制性核酸、根据权利要求49所述的核酸、或根据权利要求50所述的表达载体。
53.根据权利要求26至48中任一项所述的抑制性核酸、根据权利要求49所述的核酸、根据权利要求50所述的表达载体、根据权利要求51所述的组合物、或根据权利要求52所述的细胞在治疗中的应用。
54.一种用于降低细胞中ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB中的一种或多种的基因和/或蛋白质表达的体外或体内方法，包括将权利要求26至48中任一项所述的抑制性核酸、权利要求49所述的核酸或权利要求50所述的表达载体导入细胞中。
55.一种体外或体内再生肝组织的方法，所述方法包括抑制组织细胞中的ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的至少一种。
56.一种体外或体内增殖/扩增肝细胞的方法，所述方法包括抑制肝细胞中的ITFG1、MFAP4、GRHPR、ABCC4、PAK3、TRNP1、APLN、KIF20A和/或LTB的至少一种。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其包括将根据权利要求26至48中任一项所述的抑制性核酸、根据权利要求49所述的核酸、或根据权利要求50所述的表达载体引入所述组织的细胞中或所述肝细胞中。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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