KR20220041896A - Klf 유도 심근생성 - Google Patents

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KR20220041896A
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klf1
klf
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cardiac
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KR1020227006904A
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카즈 키쿠치
마사히토 오가와
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빅터 창 카디악 리서치 인스티튜트
고쿠리츠켄큐카이하츠호진 고쿠리츠쥰칸키뵤 겐큐센터
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Abstract

본 기술은 치료적 유효량의 KLF1 및 KLF2b 중 하나 또는 둘 다를 투여하여 심근세포에서 KLF1 및/또는 KLF2b의 수준을 증가시켜 심근생성을 유도하는 것을 포함하는 심근생성의 유도 방법에 관한 것이다.

Description

KLF 유도 심근생성
본원 기술은 KLF1 또는 KLF2b 중 적어도 하나 또는 KLF1 또는 KLF2b 핵산 중 적어도 하나를 심근세포에 투여하여 심근생성(즉, 세포 분열에 따른 새로운 심근세포 형성)을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 기술은 추가로 KLF1 또는 KLF2b 단백질 또는 핵산 중 적어도 하나를 개체에게 투여함으로써 개체에서 심근생성을 촉진하는 것에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 그 전체가 참고로 포함되는 호주 가특허 출원번호 2019902703에 대한 우선권을 주장한다.
배경기술
성체 포유동물 심장의 심근세포는 세포 주기에서 빠져나온 제한된 증식 능력을 갖는 말단 분화 세포이다. 결과적으로, 병리학적 심장 상태에서 성숙 심근세포의 사멸은 높은 사망률과 병적 상태로 이어진다. 예를 들어, 심근경색과 관련된 높은 사망률 및 병적 상태는 대부분 인간의 심장이 새로운 심근세포의 재생(심근생성)을 통한 복구 능력이 극히 제한적이라는 사실에 기인한다. 결과적으로, 경색된 심장 근육은 접촉할 수 없는 섬유성 흉터 조직으로 대체되어 심장 펌프 활동 감소, 심부전 및/또는 부정맥으로 인한 급사를 초래한다.
포유 동물과 대조적으로, 경골 제브라피쉬를 포함하는 특정 척추동물은 심근경색증 후에도 심장이 완전한 상태로 흉터 없이 재생된다. 페이트 매핑(fate mapping) 연구를 통해, 줄기 세포가 아닌 심근 세포가 제브라피쉬 심장 재생에 있어 새로운 심장 근육의 주요 공급원이라는 것이 알려져 있다. 중요하게도, 유사한 재생 능력이 신생(neonatal) 마우스에서 발견되었다. 그러나, 포유류 심근세포의 자가 재생 능력은 출생 후 빠르게 감소한다.
심혈관 장애는 수십억 개의 심근세포(cardiomyocytes; CM) 손실의 결과로 수축성 심장 근육 조직의 중증 진행성 손실을 유발할 수 있다. 포유류 심장의 재생 능력이 낮기 때문에 이는 궁극적으로, 손실된 CM을 강력하게 복원할 수 있는 현재 사용가능한 치료 옵션이 없는 심부전으로 이어질 수 있다.
Kr
Figure pct00001
ppel-유사 전사인자 중 하나의 요소인 KLF1은 적혈구 발달에 중요한 역할을 하며, KLF1 유전자의 돌연변이는 선천성 빈혈을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 심근생성에서 KLF1의 이전에 알려지지 않은 역할을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 성체 심근세포에서 KLF1을 과발현시키면 성체 포유동물 심장에서 심근생성을 유도할 수 있고 심장 재생을 유도할 수 있음을 입증하였다.
요약
첫 번째 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 KLF를 심근세포에 투여하거나, 심근세포에서 KLF의 발현을 유도하여, 예를 들어 심근세포에서 KLF1 및/또는 KLF2b의 수준을 증가시켜 심근생성을 유도하는 것을 포함하는 심근신생 유도 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태에서, 심근세포 집단은 유아, 어린이 또는 성인 심근세포이다. 심근세포 집단은 개체로부터 분리되거나 개체에 존재할 수 있다.
일 실시양태에서, 심근생성은 개체에서 심장 재생을 촉진한다. 심장 재생은 박출률(ejection fraction)의 증가, 분획 단축률(fractional shortening) 또는 이 둘 다를 특징으로 할 수 있다.
심장 재생은 혈관 내피세포, 심외막 세포 또는 둘 모두의 증가를 특징으로 할 수 있다.
KLF는 심근세포의 역분화를 유도하여 증식성 심근세포를 생성할 수 있으며, 바람직하게는 증식성 심근세포는 유사분열한다.
본 방법은 증식성 심근세포가 KLF의 존재 하에 증식하여 증식성 심근세포 집단을 생성하도록 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
증식성 심근세포는 5탄당 인산 경로, 세린 합성 경로 또는 이 둘 다를 사용하여 포도당을 우선적으로 대사한다.
본 방법은 증식성 심근세포 집단의 분화를 허용하여 심근세포 집단을 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 분화는 KLF가 실질적으로 없을 때 또는 KLF 유도가 중단된 후에 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, KLF는 탈분화를 촉진하기 위해 염색질 리모델링을 유도한다.
KLF 유도된 염색질 리모델링은 MEF2C, GATA4, MEF2A 및 NKX2.5 중 하나 또는 임의의 조합의 결합 부위에 대한 접근성을 감소시킬 수 있다.
KLF는 KLF1, KLF2b 또는 둘 다, KLF1 및/또는 KLF2b 핵산, 또는 상기 핵산 중 적어도 하나를 포함하는 벡터일 수 있다. 이 벡터는 프로모터에 작동가능하게 커플링된 핵산을 포함할 수 있다. 프로모터는 심장 특이적 프로모터일 수 있다. 심근세포 집단이 개체에 존재하는 실시양태에서, KLF가 개체에게 투여된다. 예를 들어, KLF는 개체의 심장에 투여될 수 있다.
KLF1 단백질은 서열번호 1, 11, 또는 서열번호 1 또는 11과 적어도 80% 동일한 단백질일 수 있다. KLF1 핵산은 서열번호 2, 3, 4, 5, 9, 10, 또는 서열번호 2, 3, 4, 5, 9 또는 10 중 어느 하나와 80% 이상 동일한 핵산 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
KLF2b 단백질은 서열번호 6, 또는 서열번호 6과 적어도 80% 동일한 단백질일 수 있다. KLF2b 핵산은 서열번호 7 또는 8, 또는 서열번호 7 또는 8 중 어느 하나와 80% 이상 동일한 핵산을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
상기 프로모터는 α-미오신 중쇄(α-MHC) 프로모터, 미오신 경쇄 2(MLC-2) 프로모터, 심장 트로포닌 C(cTnC) 프로모터, NCX1 프로모터 또는 TNNT2 프로모터일 수 있다. 프로모터는 KLF1 또는 KLF2b를 인코딩하는 벡터의 CM 발현을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
프로모터는 유도성 프로모터, 예를 들어 테트라사이클린 유도성 프로모터, 스테로이드 호르몬(예: 프로게스테론 또는 엑디손) 유도성 프로모터, 저산소증 유도성 프로모터, 심장 손상 부위 근처 영역에 특이적인 프로모터, 또는 허혈 및 재관류로 인한 스트레스에 반응하는 프로모터일 수 있다.
증식성 심근세포는 심근세포 전구체 세포, 미성숙 심근세포, 배아 표현형을 갖는 심근세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 심근생성은 심근세포의 세포 계통을 재프로그래밍하는 것을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 증식성 심근세포는 세포 주기에 재진입한다.
일부 실시양태에서, 증식성 심근세포는 심근세포와 비교하여, 5탄당 포스페이트 경로(PPP), 세린 합성 경로, 또는 이 둘 모두에 대한 증가된 의존성을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 심근생성은 심외막 세포 및 내피 세포의 확장을 포함한다.
일부 실시양태에서, 심근생성은 심외막 세포, 혈관 내피 세포 또는 이 둘 모두의 증가된 수를 특징으로 한다.
개체는 심근경색, 허혈성 심근병증, 확장성 심근병증 또는 심부전과 같은 심근세포 손실을 특징으로 하는 심장 상태를 가질 수 있다.
본 발명의 제2 측면에서, 제1 측면의 방법에 의해 생산된 심근세포 또는 증식성 심근세포 집단이 제공된다.
본 발명의 제3 측면에서, 제1 측면의 방법에 의해 생성된 심근세포 또는 증식성 심근세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 제4 측면에서, 제2 측면의 심근세포 또는 증식성 심근세포 집단, 또는 제3 측면의 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 심장 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제5 측면에서, 심장 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제2 측면의 심근세포 또는 증식성 심근세포 집단, 또는 제3 측면의 조성물의 용도가 제공된다.
정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 문맥상 명백하게 달리 요구하지 않는 한, 용어 'KLF'는 KLF1 및 KLF2b 중 어느 하나 또는 둘 모두를 지칭한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 명백하게 달리 요구하지 않는 한, 단어 '포함하다', 또는 '포함하다' 또는 '포함하는'과 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 그룹의 요소, 정수 또는 단계를 포함하지만 다른 요소, 정수 또는 단계 또는 다른 그룹의 요소, 정수 또는 단계를 제외하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐 '~로 이루어지는'이라는 용어는 단지 그 요소만 이루어지는 것을 의미한다.
명세서에 포함된 문서, 행위, 자료, 장치, 물품 등에 대한 모든 논의는 오로지 본 기술에 대한 맥락을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이러한 사항 중 일부 또는 전부는 선행 기술 기반의 일부를 형성하거나 본 명세서의 각 청구항의 우선일 이전에 존재했던 본 기술과 관련된 분야의 일반적인 일반 지식이었다는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
문맥상 달리 요구하거나, 반대로 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 단수 정수, 단계 또는 요소로서 인용된 기술의 정수, 단계 또는 요소는 인용된 정수, 단계 또는 요소의 단수 및 복수 형태 모두를 명확하게 포함한다.
본 명세서의 맥락에서, 용어 'a' 및 'an'은 관사의 문법적 목적 중 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 'an 요소'에 대한 참조는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본 명세서의 맥락에서, 용어 '약'은 수치 또는 값에 대한 참조가 절대 수치(figure) 또는 수치(value)로 간주되어서는 안 되며, 그에 따른 수치 또는 수치 위 또는 아래의 변동 여백을 포함함을 의미하며, 이는 통상적인 오차 또는 기기 한계 내를 포함하여, 통상의 기술자가 본 기술 분야에 따라 이해할 수 있는 것과 일치하는 수치 또는 값의 위 또는 아래의 변동 한계를 포함한다. 다시 말해서, 용어 '약'의 사용은 통상의 기술자가 동일한 기능 또는 결과를 달성하는 맥락에서 인용된 값과 동등하다고 간주할 범위 또는 근사치를 지칭하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '치료', '치료하는' 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 그 효과는 질병 또는 그 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/있거나 질병 및/또는 그 질병에 기인할 수 있는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에 사용된 '치료'는 포유동물, 특히 인간의 질병의 모든 치료를 포함하며, 다음을 포함한다: (a) 질병에 걸리기 쉬우나 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 개체에서 질병이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질병을 억제하는 것, 즉 질병의 발달을 정체시키는 것; 및 (c) 질병을 경감시키는 것, 즉 질병의 퇴행을 유발하는 것.
용어 '개인', '개체' 및 '환자'는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 비제한적으로 피쉬(예: 제브라피쉬), 설치류(쥐, 마우스), 인간 영장류, 인간, 개과, 고양이과 및 유제류(예: 말, 소, 양, 돼지, 염소)를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 개체는 인간이다.
'치료학적 유효량' 또는 '유효량'은 포유동물 또는 다른 개체에 투여될 때 질환에 대한 이러한 치료에 영향을 미치기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. '치료적 유효량'은 화합물 또는 세포, 질병 및 그의 중증도 및 치료될 개체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
통상의 기술자는 본원에 설명된 기술이 구체적으로 설명된 것 이외의 변형 및 수정이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 기술은 이러한 모든 변형 및 수정을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본 기술은 또한 개별적으로 또는 집합적으로 본 명세서에 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징 및 화합물과 상기 단계, 특징 및 화합물 중 2개 이상의 임의의 모든 조합을 포함한다.
도 1: 제브라피쉬에서 심장 재생 중 Klf1 발현. (A) 손상되지 않은(손상 없음) 및 손상된(7dpi) 심실의 qPCR 분석. (B) Semi-qPCR. 심근세포(CM), 심내막 세포(End) 및 심외막 세포(Epi)를 Tg ( cmlc2:EGFP ), Tg ( fli1a:EGFP ) 및 TgBAC(tcf21:DsRed2) 피쉬 각각의 손상되지 않은 심실 및 손상 후 7일(dpi)에 심실에서 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 사용하여 정제했다. (C) RNAScope 분석. 화살촉, 심근의 klf1 mRNA. 화살표, 혈액 세포 전구 유사 세포의 klf1 mRNA. ***p < 0.005.
도 2: 제브라피쉬 심장 재생에서 Klf1 기능. (A) 대조군(KlfDN-OFF) 또는 우성-음성 Klf1(KlfDN-ON)을 발현하는 형질전환 제브라피쉬로부터 심실의 Picro-Mallory 염색. 점선, 절제 평면. dpi, 손상 후 일수. KlfDN을 발현하는 이식유전 계통의 세부사항은 도 11A에 도시되어 있다. (B) 근세포 핵 마커, 근세포 인핸서 인자 2(Mef2) 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)의 면역형광에 의해 검출된 증식성 CM의 정량화. *P < 0.05.
도 3: 제브라피쉬 심장 재생에서 klf1의 발현 및 기능 분석. (A) 손상된 심실에서 klf1의 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR) 분석 (평균 ± SEM, n = 5-6). 유전자 발현은 0dpi(손상 후 일)로 표시되는 손상되지 않은 대조군의 수준과 관련하여 표시된다. (B) 정제된 심장 세포에서 klf1의 RT-qPCR 분석 (평균 ± SEM). 심근세포(CM), 심내막 세포(End) 및 심외막 세포(Epi)를 Tg ( cmlc2:EGFP ), Tg ( fli1a:EGFP ) 및 TgBAC ( tcf21:DsRed2 ) 피쉬 각각의 손상되지 않은 7dpi 심실에서 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 정제했다. 유전자 발현은 손상되지 않은 심근세포의 수준에 상대적으로 표시된다. 재생하는 심장(표시되지 않음)에서 RNAscope를 사용한 klf1 mRNA의 인시츄 혼성화 및 TnC에 대한 면역형광은 klf1 mRNA가 조혈 세포 및 심장 근육에서 검출되었음을 나타낸다. (C) 비-돌연변이성 배향에서 klf1 ct 의 돌연변이성 배향으로의 Cre-의존적 전환 . klf1 ct 의 구조 및 특성화에 대한 자세한 내용은 도 9를 참조하라. (D) 대조군( klf1 -CT) 및 klf1 -고갈 심장(klf1-MT)에서 심실 섹션의 Picro-Mallory 염색을 수행하고 재생 정량화(n = 20-22)를 수행했다. (E, F) 평활근 단백질 22α (Sm22) 또는 Alcam 중 하나와 함께 미오신 중쇄(MHC) 또는 심장 트로포닌 C(TnC)의 면역형광 및 Sm22+ MHC+ (E) 또는 Alcam+ TnC+ 영역 (F)의 정량화를 보여주기 위해 준비된 박스 플롯(n = 5-6). (G) 근세포 핵 마커, 근세포 인핸서 인자 2(Mef2) 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)의 면역형광. 박스 플롯은 Mef2+ PCNA+ 세포의 정량화를 보여주기 위해 준비되었다(n = 7-9). *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.001 비쌍(unpaired) t-테스트(E, F, G ).
도 4: 제브라피쉬 Klf1-유도된 CM 역분화. Klf1 과발현으로 역분화 마커(runx1; A)의 발현 유도 및 분화된 근육 마커(vmhc , actc1a , myom2a; B)의 억제. Klf1 과발현(ON) 후 7일에 Klf1-ON 및 OFF 심실의 qPCR 분석. Klf1 과발현에 사용된 트랜스제닉 라인의 세부사항은 도 12A에 설명되어 있다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005.
도 5: CM 증식에서 제브라피쉬 Klf1 기능. (A) EdU는 ON 후 9일에서 11일 사이에 매일 한 번 주입되었고 S-상 CM은 ON 후 12일째에 EdU+ CM으로 정량화되었다. (B) 유사분열 CM은 ON 후 12일에 포스포-히스톤 H3(pHH3)+ CM으로 정량화되었다. (C) 세포 증식 마커의 qPCR 분석. Klf1 과발현에 사용된 트랜스제닉 라인의 세부사항은 도 12A에 설명되어 있다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P<0.005; ****P<0.001. ND, 감지불가.
도 6: 마우스 Klf1 기능. (A) Semi-qPCR 분석. 신생아 마우스 심장은 출생 후 3일째에 손상되었고 6일째에 수집되었다. (B) CM 증식은 심장 트로포닌 T(TnT)와 Ki67의 공동 표지에 의해 평가되었고 대조군(GFP) 또는 KLF1 아데노바이러스(KLF1)이 주사된 손상되지 않은 성체 마우스 심장에서 정량화되었다. xz 및 yz 평면에서 공동 라벨링이 확인되었다. (C) S상 CM의 분석. EdU+ 핵은 WGA에 포함되어 정량화되었다. *P < 0.05; **P < 0.01. dpt, 형질감염 후 일수; LV, 좌심실.
도 7: 심근 복구에서 마우스 Klf1 기능. (A) CM 증식은 TnT와 Ki67의 공동 표지에 의해 평가되었고 심근경색증(MI) 후 14일째에 정량화되었다. (B) CM 유사분열은 TnT와 pHH3의 공동 표지에 의해 평가되었고 MI 후 14일에 정량화되었다. (C) MI 후 28일에 Gomori-trichrome 염색에 의한 대조군(Ad-GFP) 또는 KLF1 아데노바이러스(Ad-Klf1)로 처리된 심장의 분석. (D) Ad-GFP 또는 Ad-Klf1로 처리된 심장의 에코 분석.
도 8: (A) Zwitch2 유전자 트랩 카세트. (B) klf1 유전자의 Cre-매개 불활성화의 개략도. (C) klf1 유전자 발현의 심장 근육 특이적 비활성화. (D) klf1 유전자 발현의 심장 근육 특이적 비활성화에 의한 CM 증식의 감쇠. (E, F) klf1 유전자 발현의 심장 근육 특이적 비활성화에 의한 CM 역분화 메이커의 감소.
도 9: 제브라피쉬 klf1 조건부 대립 유전자의 생성 및 특성화. Zwitch2는 스플라이스 수용체 부위와 삼중항 폴리-A 서열(3xBGHpA) 및 플립파제 인식 표적(FRT)-측면, 제거가능한 카세트(LG-태그)로 구성되며, 여기서 렌즈 특이적 α A-크리스탈린(cryaa) 프로모터의 제어 하에 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 발현이 스크리닝에 사용된다. 스플라이스 수용체 부위, P2A 펩타이드 서열, 및 3xBGHpA 를 포함하는 세그먼트는 각 말단에서 반대 방향으로 탠덤 loxP 및 lox5171 부위 옆에 있다. Cre 표적 부위의 이러한 배열에 대한 Cre-매개 재조합은 카세트를 영구적으로 반전시키고 스플라이스 수용체는 정상적인 스플라이싱 패턴을 방해한다. (A) 제브라피쉬 klf1 야생형 (+) 대립유전자, 인트론 1에서 DNA 이중 가닥 절단을 유도하는 데 사용되는 전사 활성화제-유사 효과제 뉴클레아제(TALEN) 및 결과 조건부 klf1 ct 대립유전자의 개략도. 엑손은 숫자로 채워진 박스로 표시된다. TALEN 쌍에 대한 결합 부위는 파란색으로 강조 표시되고, TALEN 표적 부위는 점선 화살표로 표시된다. (B) Zwitch2의 올바른 삽입에 대한 게놈 PCR 분석은 (A)에 표시된 프라이머를 사용하여 수행되었다. LA 내의 프라이머를 대조군으로 사용했다. (C) Zwitch2-변형 klf1 대립유전자의 서던 블롯 분석. HpaI 인식 부위는 (A)에 표시되어 있다. (D) Zwitch2가 올바르게 삽입된 배아의 대표적인 이미지로, 렌즈에서 EGFP 발현을 보여준다(화살표). (E) 배아에서 Zwitch2 역전의 게놈 PCR 분석. klf1 ct /+ 피쉬를 Tg(ubb:Cre-GFP) 와 교배하고, 각 유전자형의 4-7 dpf 배아에서 얻은 게놈 DNA를 (A)에 표시된 프라이머로 PCR을 사용하여 분석했다. 대조군 프라이머는 (B)에서 사용한 것과 동일하였다. Cre-GFP를 확인하기 위해 Cre-F 및 Cre-R 프라이머를 사용했다. (F) 각 유전자형의 7 dpf 배아의 RT-qPCR 분석 (평균 ± SEM, n = 3-4). 샘플당 단일 배아를 RT-qPCR 분석에 사용했다. (G) 성체 심장에서 4-하이드로타목시펜(4-HT)-의존적 Zwitch2 역전의 게놈 PCR 분석. klf1 -CT 및 klf1 -MT는 각각 klf1 ct/ct 및 cmlc2:CreER ; klf1 ct /ct 이식유전자가 있는 제브라피쉬를 나타낸다. (B)와 동일한 대조군 프라이머를 사용하였다. (H) klf1 -CT 및 klf1 -MT 피쉬의 4-HT 처리된, 손상되지 않은 및 7 dpi의 심실의 RT-qPCR 분석 (평균 ± SEM, n = 4). BGHp(A), 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호; cryaa, α A-크리스탈린; dpf, 수정 후 일수; dpi, 손상 후 일수; klf1 +/+, 클러치-메이트 제어; LA, 왼팔; NS, 중요하지 않음; RA, 오른팔. *p < 0.05, 비쌍(unpaired) t-테스트.
도 10: 제브라피쉬 발달 동안의 Klf1 기능. (A) ubb:Cre - GFP에서 심각한 심장 부종이 관찰되었다. 7dpf에서 klf1 ct /ct 배아, 그러나 ubb:Cre - GFP에서는 그렇지 않음; klf1 +/+ 배아(클러치 메이트 대조군). n = 3(+/+), 4(ct/+) 또는 4(ct/ct). (B) ubb:Cre - GFP에서 심각한 심장 부종이 관찰되었다; 7 dpf에서 actb2 -BS- dn -klf1 배아(화살촉), 그러나 ubb:Cre - GFP 배아(클러치 메이트 대조군)에서는 그렇지 않음. (n = 7). actb2 -BS- dn - klf1의 세부 사항은 도 11A에 설명되어 있다. (C) klf1-CT 및 klf1 -MT 배아의 심실 절편을 사용한 근세포 인핸서 인자 2(Mef2) 및 미오신 중쇄(MHC)의 면역형광. 배아를 4-하이드록시타목시펜(4-HT)으로 1~3dpf로 처리하고 7dpf에서 분석했다. 단일 광학 평면에서 Mef2+ 핵의 정량화(평균 ± SEM, n = 7-9). (D) actb2:BS - dn - klf1 (클러치-메이트 대조군) 및 cmlc2:CreER ; actb2:BS -dn-klf1 배아의 심실 섹션을 사용한 Mef2 및 MHC의 면역형광. 배아를 1~3dpf의 4-HT로 처리하고 7dpf에서 분석했다. 단일 광학 평면에서 Mef2+ 핵의 정량화(평균 ± SEM, n = 6-8). (E) klf1 ct /ct (클러치-메이트 대조군) 및 ubb:Cre - GFP; 4dpf에서 klf1 ct/ct 배아의 심실 섹션을 사용한 Mef2 및 MHC의 면역형광. 단일 광학 평면에서 Mef2+ 핵의 정량화(평균 ± SEM, n = 5-7). (F) actb2:BS - dn - klf1 (클러치-메이트 대조군) 및 ubb:Cre - GFP; actb2:BS - dn - klf1 배아(4dpf)의 심실 섹션을 사용한 Mef2 및 MHC의 면역형광. 단일 광학 평면에서 Mef2+ 핵의 정량화(평균 ± SEM, n = 8-9). 심장 부종은 5dpf 이후부터 분명했지만, 4dpf에서는 나타나지 않았다. dpf, 수정 후 일. * p < 0.05, ****p < 0.001 엑스2 테스트(A), Fisher의 정확한 테스트(B) 또는 비쌍 t-테스트(CF).
도 11: 제브라피쉬에서 우성-음성 Klf1의 발현으로 손상된 심장 재생. (A) Tg(actb2:loxP-TagBFP-STOP-loxP-dn-klf1) vcc22 제브라피쉬 계통(이하 actb2:BS - dn -klf1)을 확립하였고 4-하이드록시타목시펜(4-HT) 처리와 함께 dn-Klf1의 심근세포 특이적 발현을 위해 cmlc2:CreER와 교배하였다. EnR, engrailed repressor domain. (B) Picro-Mallory 염색을 수행하고 재생을 정량화했다(n = 5-7). (C) 평활근 단백질 22α (Sm22) 및 미오신 중쇄(MHC)의 면역형광을 수행하였고 (n = 4-5)에서 Sm22+ MHC+ 영역의 정량화를 표시하기 위해 박스 플롯을 준비했다. (D) 근핵 마커 Mef2 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)의 면역형광을 수행하였고 Mef2+ PCNA+ 세포의 정량화를 나타내기 위해 박스 플롯을 준비했다(n = 9-10). ***p < 0.005, ****p < 0.001(Fisher's exact test(B) 또는 비쌍 t-test(C, D)). 스케일 바, 50μm.
도 12: 제브라피쉬 심근 Klf1의 기능-이득(Gain-of-function) 분석. (A) Tg(actb2:loxP-TagBFP-STOP-loxP-3xHA-klf1) vcc29 피쉬를 cmlc2:CreER 피쉬와 교배하였고 이중 형질전환 피쉬와 Cre-음성 클러치 메이트를 각각 klf1 -ON 및 klf1 -OFF 로 지칭하였다. (B) klf1 -OFF 및 klf1 -ON 피쉬에 사용된 4-하이드록시타목시펜(4-HT) 처리 요법. 미오신 중쇄(MHC) 및 평활근 단백질 22α (Sm22), 트로포닌 C(TnC) 또는 Alcam의 면역형광을 수행하였다. 근절 분해(Sarcomere disassembly)는 Actinin 및 TEM의 면역형광에 의해 7일째부터 검출되었다. (C) 근세포 핵 마커 근세포 인핸서 인자 2(Mef2) 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)의 면역형광을 수행하였고 정량화했다(평균 ± SEM, n = 7). (D) EdU 통합 분석. 확대되고 경계가 지정된 영역의 xz 및 yz 평면에서 이미지를 수집하고 정량화했다(평균 ± SEM, n = 8). EdU+ 심근세포는 EdU+ 핵이 z 평면에서 cmlc2:GFP+ 심근인 경우에만 계수되었다. (E) phospho-histone H3(pHH3)의 면역형광을 수행하고 정량화했다(평균 ± SEM, n = 6). pHH3+ 심근세포는 pHH3+ 핵이 z 평면에서 cmlc2:GFP+ 심근에 있을 때만 계수되었다. (F) Tg ( cmlc2:3xHA - klf1 -ER; cryaa:TagBFP ) vcc32 (이하, klf1 -ER), 심근세포에서 Klf1의 일시적인 핵 전위를 허용하는 형질전환 시스템. (G) klf1 -ER 피쉬에 사용된 4-HT 처리 요법. klf1 -ER 피쉬는 비히클 또는 4-HT O/N으로 7일 동안 처리한 후 정상적인 수족관 조건에서 30일 동안 회복 기간을 가졌다. (H) 비히클 또는 4-HT로 7일 처리 후 30일에 분석된 klf1 -ER 심장의 총 형태. (I) (H)의 심장 섹션의 Picro-Mallory 염색. (J) (I)의 정량화. (K, L) 세포 크기 정량화 (K) [n = 332(비히클), 326(4-HT)], (H)의 해리된 CMs의 계산된 세포 수(L) (평균 ± SEM, n = 3). 두 개의 독립적인 분석의 대표적인 데이터가 (K) 및 (L)에 표시된다. at, atrium; ba, 동맥 구근; DAPI, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; dpt, 처리 후 일수; EdU, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘; O/N, 오버나이트; TEM, 투과 전자 현미경; Veh, 비히클; vt, 심실. *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.001 Mann-Whitney U 검정에 의함(C, D, E) 또는 비쌍 t-검정에 의함(K, L). 스케일 바 500μm (H, I).
도 13: Klf1 -관련 패밀리 구성원의 기능 분석 및 Klf1발현의 비-심근 효과. 혈관계(A)(평균 ± SEM, n = 4) 및 심외막 세포 영역(B)(평균 ± SEM, n = 3-4)의 정량화를 klf1 -ON 또는 klf1 -OFF의 심장 조직 섹션을 사용하여 수행하였다. (C) Klf1, Klf2a, Klf2b 및 Klf4를 발현하는 심장 섹션에서 pHH3+ 액티닌+ 심근세포의 정량화(평균 ± SEM, n = 4). Klf2a, Klf2b 및 Klf4는 klf1 -ON에 대해 기술된 바와 같이 유도 가능한 방식으로 심근세포에서 발현되었다(도 12A). z 평면에서 Actinin+ 심근 내의 pHH3+ 핵은 유사분열 심근세포로 계수되었다. pHH3, 포스포-히스톤 H3. *p < 0.05, ****p < 0.001 비쌍 t-테스트.
도 14: klf1 -ON 제브라피쉬의 심장 기능 장애. (A) 12dpt에서 klf1 -ON 피쉬에서 융기된 비늘(괄호), 혈액 울혈(화살표) 및 복부 부종(화살촉)과 같은 심부전 유사 표현형. (B) klf1 -ON 피쉬에서 생존의 유의한 감소를 보여주는 Kaplan-Meier 생존 곡선 (n = 10, p < 0.0001, 로그 순위 테스트).
도 15: 제브라피쉬에서 Klf1 -유도 심장 재성장의 후성유전학적 분석. (A, B) 7 dpt에서 klf1 -OFF 및 ON 심실에서 3xHA-Klf1 ChIP-seq 판독 밀도의 히트맵을 생성하였고(A) Klf1 피크 정상의 ± 100bp 내에서 모티프가 강화되었다(B). (C) GREAT를 사용한 Klf1 피크의 기능적 주석. (D) 7 dpt에서 klf1 -OFF 및 ON 심실의 Klf1 ChIP-seq 피크에서 H3K27ac, H3K4me1 또는 H3K4me3에 대한 5-메틸시토신(5mC) 수준 및 정규화된 ChIP-seq 판독 밀도의 정렬된 히트맵. Klf1 ChIP-seq 피크는 H3K27ac/H3K4me1(인핸서) 및 H3K4me3 프로필(프로모터)에 따라 두 가지 범주로 나뉘며 그에 따라 히트맵이 표시된다. (E) 7 dpt에서 klf1 -OFF 및 ON 심실에서 얻은 ATAC-seq 판독의 히트맵. (F) (E)에서 차등적으로 농축된 ATAC-seq 피크를 중심으로 한 H3K27ac ChIP-seq 피크의 히트맵. (G) (E)의 klf1 -ON 심장에서 감소된 ATAC-seq 피크에 가장 가까운 유전자 및 모든 유전자의 mRNA 발현을 보여주는 박스 플롯. (H) GREAT를 사용하여 klf1 -ON 심장에서 감소된 ATAC-seq 피크의 기능적 주석. (I) 7 dpt(FDR < 1.0 × 10- 6)에서 klf1 -OFF 및 ON 심장의 RNA-seq 데이터에서 심장 근육 수축 전사체의 KEGG 유전자 세트의 농축 점수를 보여주는 GSEA 플롯. bp, 염기쌍; ChIP, 염색질 면역침전; dpt, 치료 후 일; FC, 폴드-체인지; FDR, 잘못된 발견 비율; GREAT, 주석 도구의 게놈 영역 강화; GSEA, 유전자 세트 농축 분석; KEGG, 유전자 및 게놈에 관한 교토 백과사전.
도 16: 제브라피쉬에서 Klf1 -유도 심장 재성장의 전사체 및 대사체 분석. (A, B) GO 생물학적 과정 (A) 및 KEGG 경로 (B)에서 상향조절 및 하향 조절된 유전자 세트를 나타내는 7 dpt에서의 klf1 -OFF 및 ON 심장의 RNA-seq 데이터 농축 분석. (C-E) GSEA는 7 dpt에서 klf1 -OFF 및 ON 심장의 RNA-seq 데이터 분석으로부터의 플롯으로 세포 분열(C), DNA 복제(D) 및 전구체 대사 산물 및 에너지 생성(E)과 같은 유전자 서명의 농축 점수를 보여준다. (F) 7 dpt에서 klf1 -OFF 및 ON 심실 심근에서 TEM으로 미토콘드리아의 미세 구조를 분석하였고, 크리스타 수를 정량화했다(평균 ± SEM, n = 30-32). (G) qPCR을 사용하여 7dpt에서 klf1 -OFF 및 ON 심실의 미토콘드리아 DNA 함량(mtDNA) 정량화 (평균 ± SEM, n = 3). mtDNA의 발현 (mt-co1, mt- nd1 )을 핵 DNA(nDNA; actb2 ) 발현으로 정규화하였고 klf1 -OFF 대조군의 수준과 관련하여 표시하였다. (H-K) 7 dpt에서 klf1 -OFF 및 ON 심실의 NADH(H), NAD+ (I), NADH/NAD+ 비율(J) 및 ATP(K)의 정량화 (평균 ± SEM, n = 3 -4). (L) 7 dpt에서 klf1 -OFF 및 ON 심실의 RNA-seq 데이터에서 얻은 미토콘드리아 생합성 및 기능을 조절하는 유전자의 발현 값(FPKM) (평균 ± SEM, n = 4). (M-P) 7 dpt에서 klf1-OFF 및 ON 심실에서 글루코스 6-인산(M), 리보스 5-인산(N), 세도헵툴로스 7-인산(O) 및 세린(P)의 질량 분석 기반 정량화(평균 ± SEM, n = 5). 정량화된 값은 klf1-OFF 대조군 레벨에 상대적으로 표시된다. (Q-S) 7 dpt에서 klf1 -OFF 및 ON 심실에서 NADPH(Q), NADP+ (R) 및 NADPH/NADP+ 비율(S)의 정량화(평균 ± SEM, n = 3). FDR, 잘못된 발견 비율; FPKM, 매핑된 판독치 백만 개당 엑손의 킬로베이스당 단편; GO, 유전자 온톨로지; GSEA, 유전자 세트 농축 분석; KEGG, 교토 유전자 및 게놈 백과사전. *p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.005, 및 ****p < 0.001(unpaired t-test).
도 17: 마우스 심장에서 Klf1 기능의 광범위한 분석. (A) 심근 경색 후 신생 및 성체 마우스 심장에서 마우스 Klf1(mKlf1) 발현의 시간 경과 qRT-PCR 분석(평균 ± SEM, n = 3-4). 유전자 발현은 손상되지 않은 대조군(0dpi)의 수준에 상대적으로 표시된다. MI는 출생 후 2일째에 성체 마우스와 신생 마우스에서 좌전하행(LAD) 관상 동맥의 영구 결찰에 의해 유도되었다. (B) 연구에 사용된 아데노바이러스 벡터. (C) 연구에서 수행된 실험 및 분석. Echo, 심장초음파. (D) Ad-mKlf1로부터의 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 리포터 발현의 면역조직화학. 점선은 경색 영역을 설명한다. (E-G) Ad-GFP(대조군) 및 Ad-mKlf1 주입된 심장의 시간 경과 심초음파(평균 ± SEM, n = 7-11). 박출률(E) 및 분획 단축률(F), 대표적 B-모드 및 M-모드 이미지(G)가 표시된다. 기준 심장 기능은 MI 이전에 측정되었으며 0dpi(E, F)로 표시되었다. (H) Ad-GFP 처리 또는 Ad-mKlf1 처리 심장에서 조직 절편의 고모리 트리크롬 염색(Gomori-trichrome staining). 각 치료 그룹에 대해 두 개의 독립적인 심장이 표시된다. (I, J) (H)에서 심장 복구(I) 및 흉터 조직 크기(J)의 정량화 (평균 ± SEM, n = 8). (K) 횡단면 평면에서 손상 경계 구역 심근에서 TnT 및 WGA의 면역형광을 수행하고 정량화했다(평균 ± SEM, n = 5). (L -- N) Ad-GFP(대조군) 및 Ad-mKlf1 주입 심장에서의 Ki67+ TnT+ 심근세포(L; 평균 ± SEM, n = 5), EdU+ TnT+ 심근세포(M; 평균 ± SEM, n = 3-4), pHH3+ TnT+ 심근세포(N; 평균 ± SEM, n = 5)의 정량화. dpi, 손상 후 일수; EdU, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘; pHH3, 포스포-히스톤 H3; WGA, 밀 배아 응집소. *p < 0.05, *** p < 0.005 X2 test로 분석한 ( I)를 제외한 모든 패널에서 비쌍 t- test에 의함.
도 18: 마우스의 생존 및 비-심근 조직에서 mKlf1 과발현의 효과. (A) Ad-GFP 또는 Ad-mKlf1을 정맥내 주사한 마우스의 간 조직 절편에서 Ki67의 면역형광을 수행하였고 검증 mKlf1 발현을 위한 EGFP의 면역염색을 나타내었다. Ki67+ 간세포는 자가형광에 의해 시각화되었고 이미지에서 형태학적으로 식별되고 정량화되었다(평균 ± SEM, n = 10). (B) Ad-GFP 및 Ad-mKlf1이 주입된 post-MI 마우스의 심실 섹션에서 CD31의 면역형광을 수행하였고 모세관을 정량화했다(평균 ± SEM, n = 5). Ad-GFP, 녹색 형광 단백질 구조물을 함유하는 아데노바이러스 벡터(대조군); Ad-mKlf1, mKlf1 구조물을 함유하는 아데노바이러스 벡터; ***p < 0.005 비쌍 t-테스트 (A, B).
도 19: Klf1 -유도된 심근생성에서 Hippo 및 ErbB 신호전달 경로의 역할. (A, B) GSEA 플롯은 7 dpt에서 klf1 -OFF 및 ON 심장의 RNA-seq 데이터에서 Hippo 신호 전달(A) 및 ErbB 신호 전달(B) 경로와 관련된 KEGG 유전자 세트의 농축 점수를 보여준다. (C, D) YAP 또는 ErbB의 약리학적 억제와 함께 7 dpt에서 klf1 -ON 심장에서 근세포 인핸서 인자 2(Mef2) 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)의 면역형광은 Mef2 및 PCNA로 공동표지된 증식성 심근세포를 나타낸다. Mef2+ PCNA+ 세포는 YAP(C; 평균 ± SEM, n = 4) 또는 ErbB(D; 평균 ± SEM, n = 4)의 억제로 심장에서 정량화되었다. dpt, 치료 후 일; FDR, 잘못된 발견 비율; GSEA, 유전자 세트 농축 분석; KEGG, 교토 유전자 및 게놈 백과사전; YAP, yes-관련 단백질.
성체 심근세포는 제한된 증식 능력을 갖는 말단 분화 세포이기 때문에 대체되지 않는 심근세포의 손실을 수반한다. 본원에서 입증된 바와 같이, KLF 또는 KLF 핵산의 투여는 심근생성을 촉진하는 데 유용하다. 본원에서 입증된 바와 같이, 각각의 KLF1 및 KLF2b는 심근 생성을 촉진하는 데 유용하다. 이 과정은 성체 심근세포의 탈분화를 포함하며, 이는 이후 증식하여 심근세포로 분화된다. 즉, 적어도 하나의 KLF의 투여는 성인 심장에서 심근생성을 촉진하거나 유도하는데 유용하다.
일 실시양태에서, KLF 유도 심근생성은 세포 계통을 재프로그래밍함으로써가 아니라 성체 심근세포의 상태를 증식성 상태로 재프로그래밍함으로써 발생한다. 이는 이웃 조직의 성장을 촉진하는 재프로그래밍된 심근세포를 동반할 수 있다.
일부 실시양태에서, 심근생성은 심외막 세포 및 내피 세포의 확장을 포함한다.
방법
예를 들어, 심장 조직에 적어도 하나의 KLF 핵산을 투여함으로써 KLF의 수준 또는 활성을 증가시키는 것은 시험관내 또는 생체내에서 심근생성을 촉진하거나 유도하는데 유용하다. 따라서, 적어도 하나의 KLF, 또는 적어도 하나의 KLF 핵산, 또는 KLF 핵산을 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 심근생성을 촉진하거나 유도하는 방법이 제공된다. 일 실시양태에서, 심근생성은 심근세포 역분화, 예를 들어 성인 심근세포의 역분화와 연관된다.
개체는 심장 질환을 갖는 개체(예를 들어, 인간과 같은 포유동물 개체; 비인간 영장류; 마우스, 래트 등과 같은 실험적 비인간 포유류 개체)를 포함한다. 심장 상태는 허혈성 심장 조직, 예를 들어 개인의 관상 동맥 질환 등을 유발할 수 있다. 적합한 개체는 심부전, 또는 가족성 심근병증, 확장성 심근병증, 비후성 심근병증, 제한성 심근병증, 또는 결과적 허혈성 심근병증을 갖는 관상 동맥 질환과 같은 퇴행성 심장 질환을 갖는 개체를 포함한다.
개체는 유아, 어린이 또는 성인일 수 있다.
일 실시양태에서, KLF, KLF 핵산, 또는 KLF 핵산을 포함하는 발현 벡터를 개체의 심근세포 또는 심장 조직에 투여하는 것을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 본 방법은 개체의 심근세포에서 KLF의 발현을 유도하는 것을 포함할 수 있다. 심근세포에서 활성 KLF의 추가 또는 발현은 심근세포를 탈분화시킨다. 생성된 세포(증식성 심근세포)는, 예를 들어 허혈성 사건으로 인해 손실된 심근세포의 적어도 일부를 대체하기 위해 증식할 수 있다. 증식 후 역분화 세포는 기능성 심근세포로 재분화된다.
일 실시양태에서, KLF, KLF 핵산, 또는 KLF 핵산을 포함하는 발현 벡터는 심근세포 또는 심장 조직에 투여된다. 심근세포 및/또는 심장 조직에 대한 투여는 시험관내 또는 생체내에서 발생할 수 있다. KLF, KLF 핵산, 또는 KLF 핵산을 포함하는 발현 벡터는 세포와 직접 접촉될 수 있고, 즉 세포에 직접 적용될 수 있거나, 대안적으로 예를 들어 KLF, KLF 핵산, 또는 발현 벡터를 개체의 혈류로 주입하여 그 후 그 분자가 세포로 운반됨으로써 간접적으로 세포와 조합될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, KLF, KLF 핵산, 또는 KLF 핵산을 포함하는 발현 벡터는, 예를 들어 심근 내로의 주사에 의해 심장에 직접 투여될 수 있다.
이들 방법에서, 치료적 유효량의 KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터가 개체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여는 KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터를 심장 조직으로 또는 심근세포에 직접 전달하는 것을 포함한다.
KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터의 투여는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포와 KLF 또는 KLF 핵산의 접촉은 시험 관내 또는 생체내에서 발생한다. KLF 또는 KLF 핵산은 세포와 직접 접촉될 수 있고, 즉 심근세포에 직접 적용될 수 있거나, 대안적으로 예를 들어, KLF1 또는 KLF1 핵산을 개체의 심장 조직 내로 주사함으로써 간접적으로 세포와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터를 투여하는 것은 내인성 KLF 수준과 비교하여, 심근세포 또는 심장 조직에서 KLF의 수준을 증가시킨다. 이 맥락에서 사용되는 용어 '내인성'은 KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터의 투여 전에 KLF의 발현의 '자연 발생' 수준 및/또는 활성을 지칭한다.
심근생성
심근생성은 심장의 근육 조직(심근)을 형성하는 심근세포(CM)가 분열하여 새로운 세포를 만드는 복잡한 과정이다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, KLF-유도 심근생성은 CM 재프로그래밍 및 이들 세포의 확장(증식)에 이어 성숙한 수축성 CM으로의 재분화를 통해 매개된다.
KLF는 심근세포의 역분화를 유도하여 증식성 심근세포를 생성한다. 즉, 심근세포는 정상적인 성인 개체에서 분화하여 다른 세포 유형을 형성하거나 재생할 수 없는 말단 분화 세포이다. 일반적으로 출생 후 심근 세포는 이핵 형성 및 중심체(centrosome) 분해를 특징으로 하는 말단 분화를 거쳐 심장이 재생되지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나, 여기에서 입증된 바와 같이 KLF 투여는 CM이 증식성 CM으로 역분화되도록 유도한다. 일부 실시양태에서, 증식성 CM은 유사분열이다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 증식성 심근세포가 KLF의 존재하에 증식하도록 하는 것을 포함한다. 이는 적절한 세포 또는 조직 배양 조건에서 시험관 내에서 발생하거나 생체 내에서 발생할 수 있다. 증식의 결과는 각 CM이 증식성 심근세포 집단을 생성한다는 것이다.
일단 KLF가 제거되거나, 또는 일단 KLF가 대사되면, 증식성 심근세포의 집단이 저하되고 자발적으로 분화되어 심근세포의 집단을 생성한다. 이러한 방식으로 KLF는 시험관내 또는 생체내에서 심근 세포 수를 증가시키는 데 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, KLF는 탈분화를 촉진하기 위해 염색질 리모델링을 유도한다.
일부 실시양태에서, KLF를 발현하는 CM은 측분비 효과를 갖는다. 예를 들어, 본원에 예시된 바와 같이, KLF의 발현은 심외막 세포 및 혈관 내피 세포의 수를 증가시킨다.
일 실시양태에서, 미오신 중쇄(MHC) 프로모터의 제어 하에 CM에서 KLF의 발현은 심외막 및 내피 세포에 대한 마커인 Raldh2(레틴알데히드 탈수소효소 2; Aldh1a2로도 알려짐)의 발현으로 이어지지 않는다. 따라서 CM에서 KLF의 발현은 세포 계통을 변경하지는 않는다. 세포 계통은 또한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일 동안 증식 후에도 변하지 않는다. 일부 실시양태에서, MHC 프로모터에 의한 KLF의 발현은 정상 CM과 비교하여 감소된 수준이다.
즉, 성인 심장에서 KLF 유도 심근생성은 세포 계통을 재프로그래밍하는 것을 포함하지 않는다. 오히려, KLF 유도 심근생성은 성체 CM의 상태를 인접 조직의 성장을 촉진하는 능력과 함께, 극도로 증식하는 상태로 재프로그래밍하는 것을 특징으로 한다.
KLF 유도 심근생성은 산화적 인산화(OXPHOS)에서 5탄당 포스페이트 경로(PPP) 및/또는 세린 합성 경로(SPP)로의 전환 형태 에너지 생산을 특징으로 한다.
KLF1
본원에 사용된 '크뤼펠-유사 인자('Kr
Figure pct00002
ppel-like factor)' 또는 'KLF'는 임의의 종(예를 들어, 마우스, 인간, 비인간 영장류)으로부터의 KLF1 또는 KLF2b의 임의의 단백질 변이체 뿐만 아니라 KLF 활동을 유지하는 이의 임의의 돌연변이체 및 단편을 지칭한다. 유사하게, "KLF 핵산"은 예를 들어, 임의의 종, 예를 들어, 마우스, 인간 또는 비인간 영장류로부터의 KLF를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 인간 KLF1 아미노산 서열은 서열번호 1에, 인간 KLF1의 염기서열은 서열번호 2에, 그 코딩 서열은 서열번호 3에 제시되어 있다. 마우스 KLF1의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4에 제시되어 있고, 그 코딩 서열은 서열번호 5에 제시되어 있다. KLF1은 Erythroid Kr
Figure pct00003
ppel-like transcription factor (EKLF), Kr
Figure pct00004
ppel-like factor 1, INLU, 또는 HBFQTL6으로도 알려져 있다. 제브라피쉬 KLF2b 아미노산 서열은 서열번호 6에, 제브라피쉬 KLF2b의 염기서열은 서열번호 7에, 코딩 서열은 서열번호 8에 제시되어 있다. 또한 제브라피쉬 KLF1 아미노산 서열은 서열번호: 11에, 제브라피쉬 KLF1의 염기서열은 서열번호: 9에, 및 그 코딩 서열은 서열번호: 10에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, KLF는 비-인간 또는 비-포유류 종으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, KLF는 제브라피쉬, 또는 도롱뇽 또는 뱀과 같은 재생 종에서 유래할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, KLF 또는 KLF를 코딩하는 핵산(KLF 핵산)은 시험관내 또는 생체내에서 심근생성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, KLF 및 KLF 핵산은 심근경색증(MI) 후의 허혈성 손상, 예를 들어, 심장독성 약물(예: 독소루비신과 같은 안트라사이클린 항생제), 코카인, 메스암페타민, 순환 항우울제, 칼슘 채널 차단제, 베타 차단제 및 디곡신) 또는 외상(수술의 결과로 우발적이든 의도적이든)으로 인한 심장 손상 후; 심부전; 또는 노화와 관련된 심장 용량 감소 등과 같이, 심근세포 역분화, 증식 또는 이 둘 모두가 바람직한 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법은 심장 재생을 위해 사용될 수 있다. 본 문맥에서, '심장 재생'은 손상된 심장의 구조적 및/또는 기능적 재생 또는 개선을 의미한다. 예를 들어, 구조적 개선은 KLF 투여 후 심장의 심근세포의 양 또는 수의 증가일 수 있다. 기능적 개선의 예는 KLF 투여 후 심장의 수축성 또는 박출률의 증가이다.
예를 들어, 박출률(ejection fraction), 분획 단축률(fractional shortening), 또는 둘 모두는 FLK 투여 전 박출률 또는 분획 단축률에 비하여, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% 또는 그 이상만큼 증가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 심장 재생은 KLF 투여 후 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28일에 발생한다.
KLF 변이체 또는 KLF 기능적 단편을 이용할 수 있다. 변이체 또는 기능적 단편은 야생형 KLF와 동일한 특이성으로 DNA에 결합할 수 있고 야생형 KLF의 적어도 하나의 기능을 보유한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 변이체 또는 기능적 단편은 DNA 결합 활성을 유지하는 KLF의 임의의 변이체이다.
일부 실시양태에서, KLF는 접합체 또는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, KLF 융합 단백질은 펩티드 결합을 통해, 다른 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 핵 국소화 서열 또는 추가의 KLF 또는 그 도메인, 예를 들어 전사활성화 도메인의 적어도 일부에 연결된 KLF의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, KLF는 다른 단백질, 예를 들어, 전사활성화제 도메인 p53 또는 VP16으로부터의 전사활성화 도메인에 융합될 수 있다. 융합 단백질은 또한 마커 단백질(예: GFP와 같은 형광 단백질), 또는 분리 및/또는 정제를 돕는 단백질(예: FLAG 또는 His 태그)을 포함할 수 있다. 비-KLF 서열은 KLF 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단일 수 있다.
일부 실시양태에서, KLF는 하나 이상의 핵 국소화 서열과 융합된다.
일부 실시양태에서, KLF 핵산은 KLF 융합 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 성숙한 KLF 아미노산 서열을 포함하는 KLF를 투여하는 것을 필요로 한다. 대안적으로, KLF는 성숙한 KLF 아미노산 서열과 적어도 80% 동일할 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법에 유용한 KLF는 야생형 KLF 아미노산 서열에 적어도 80% 동일하고, 예를 들어 야생형 KLF 아미노산 서열에 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 유용한 KFL 단백질은 일상적인 실험을 통해 동정할 수 있다. 일반적으로 KLF 단백질은 야생형 KLF로 기능한다.
본 방법은 성숙한 KLF 코딩 서열을 포함하는 KLF 핵산을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, KLF 핵산은 성숙한 KLF 코딩 서열과 적어도 80% 동일할 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법에 유용한 KLF 핵산은 야생형 KLF 핵산과 적어도 80% 동일할 수 있고, 예를 들어 야생형 핵산과 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 유용한 핵산은 일상적인 실험을 통해 확인할 수 있다. 일반적으로 핵산은 야생형 KLF로 기능하는 단백질을 암호화해야 한다.
일부 실시양태에서, KLF 핵산은 ssRNA, dsRNA, dsDNA, 또는 발현 벡터, 예를 들어, KLF 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터의 바이러스 발현 벡터일 수 있다. KLF 핵산은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, KLF핵산은 당의 2' 위치에서 변형된 적어도 하나의 뉴클레오티드, 예를 들어 2'-O-알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, RNA 변형은 RNA의 3' 말단에서 피리미딘의 리보스, 염기성 잔기 또는 역염기에 대한 2'-플루오로, 2'-아미노 및 2' O-메틸 변형을 포함한다.
다수의 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 변형은 이들이 혼입되는 핵산을 뉴클레아제 소화에 대해 더 내성이 있게 만든다. 변형된 KLF 핵산의 특정 예는 변형된 백본, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결 또는 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 당간 연결을 포함하는 변형된 백본을 포함하는 것들이다. 일부 실시양태에서, KLF 핵산의 변형은 포스포로티오에이트 백본 또는 헤테로원자 백본, 특히 CH2-NH-O-CH2, CH, -N(CH3)-O-CH2 (메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 알려져 있음), CH2-ON(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 또는 ON(CH3)-CH2-CH2 백본 (여기서 천연 포스포디에스테르 백본은 OPO-CH로 표시됨); 아미드 백본; 모르폴리노 백본 구조; 펩티드 핵산(PNA) 백본(여기서 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 백본은 폴리아미드 백본으로 대체되고, 뉴클레오티드는 폴리아미드 백본의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합됨)이다. 인-함유 연결에는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노포스포아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 또는 보라노포스페이트를 포함하나, 이에 제한되지 아니한다.
내부에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 핵산 백본은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 연결, 혼합된 헤테로원자와 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드간 연결에 의해 형성된 ck백본을 갖는다. 이들은 모르폴리노 결합(뉴클레오사이드의 당 부분에서 부분적으로 형성됨); 실록산 백본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH 2 구성 부분을 포함하는 기타를 포함한다.
하나 이상의 치환된 당 모이어티는, 또한 예를 들어 2' 위치에 다음 중 하나가 포함될 수 있다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3 , OCH3O(CH2)n CH3, O(CH2)nNH2 또는 O(CH2)nCH3 (여기서 n은 1 내지 약 10임); C1 내지 C10 저급 알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아르알킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3 ; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2; CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; 핵산의 약동학적 특성을 개선하기 위한 그룹; 또는 핵산 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환체의 약력학적 특성을 개선하기 위한 그룹. 또 다른 예로서, 핵산 서열은 2'-변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP)), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA))을 포함할 수 있다.
다른 예로서, KLF 핵산 서열은 적어도 하나의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 일부 실시양태에서, 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸)로도 알려짐]이다. 다른 변형에는 2'-메톡시(2'-O-CH3), 2'-프로폭시(2'-OCH2CH2CH3) 또는 2'-플루오로(2'-F)가 포함된다. 핵산 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 유사한 변형이 또한 이루어질 수 있다. 핵산은 또한 펜토푸라노실 그룹 대신에 사이클로부틸과 같은 당 모방체를 가질 수 있다.
KLF 핵산은 또한 추가로 또는 대안적으로 염기 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "비변형된" 또는 "천연" 핵염기는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 천연 핵산에서 드물게 또는 일시적으로 발견되는 핵염기, 예를 들어, 하이포크산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신(5-메틸-2' 데옥시시토신으로도 지칭되고, 당업계에서 종종 5-Me-C로 지칭됨), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC 또는 젠토비오실 HMC, 뿐만 아니라 합성 핵염기, 예를 들어 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸릴알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 기타 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오우라실 티오티민, 5-브로모우라실, 5-히드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌 또는 2,6-디아미노퓨린도 포함한다. 이노신도 포함될 수 있다. 다른 변형에는 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도-우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 또는 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 또는 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함할 수 있다.
주어진 핵산의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 전술한 변형 중 하나 이상은 단일 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 내의 단일 뉴클레오시드 내에 삽입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체에 화학적으로 연결된다. 이러한 모이어티는 지질 모이어티, 예를 들어 콜레스테롤 모이어티, 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올, 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-t 옥시콜레스테롤 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, KLF 핵산은 프로모터 서열에 작동가능하게 커플링된다. 프로모터 서열은 구성적으로 활성이거나 조성적으로 활성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 심장 특이적이며, 예를 들어 심장 특이적 프로모터 서열은 α-미오신 중쇄(α-MHC) 프로모터, 미오신 경쇄 2(MLC-2) 프로모터, 심장 트로포닌 C(cTnC) 프로모터, NCX1 프로모터, 또는 TNNT2 프로모터일 수 있다.
일부 실시양태에서, KLF 핵산은 유도성 프로모터, 예를 들어 테트라사이클린 유도성 프로모터, 스테로이드 호르몬(예를 들어, 프로게스테론 또는 엑디손) 유도성 프로모터, 또는 저산소증 반응성 프로모터에 작동적으로 커플링된다.
일부 실시양태에서, KLF 핵산은 손상된 영역에 인접한 심장의 영역에서 활성 또는 선택적으로 활성인 프로모터에 작동가능하게 커플링된다. 이러한 프로모터는 예를 들어 GATA-4 프로모터를 포함한다.
다른 실시양태에서, KLF 핵산은 허혈 및 재관류로 인한 스트레스에 반응하여 심장 조직에서 과발현되는 유전자의 프로모터에 작동가능하게 커플링된다. 이러한 유전자에는 아미노아디페이트-세미알데하이드 합성효소, 아포지단백질 E, 모노옥시게나아제 2를 함유하는 플라빈, NADPH 산화효소 4, 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 합성효소 2, 재조합 활성화 유전자 2, 스테아로일-코엔자임 A 불포화효소 1 또는 용질 운반체 패밀리 38(구성원 1)이 포함된다.
KLF 투여
본원에 기술된 방법에서, KLF 또는 KLF 핵산은 개체에게 투여된다. 특히, KLF 또는 KLF 핵산은 표적 세포, 조직 또는 기관에 투여된다. 일부 실시양태에서, KLF 또는 KLF 핵산은 표적 세포, 조직 또는 기관에 투여되거나, KLF 핵산을 코딩하는 발현 벡터는 KLF 핵산이 발현되는 표적 세포, 조직 또는 기관에 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여는 전신이고 발현 벡터는 표적 세포, 조직 또는 기관으로 흡수된다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 비-표적 세포, 조직 또는 기관에 의해 흡수될 수 있지만, 바람직하게는 이러한 세포 또는 조직, 또는 개체 전체에 대해 유의미한 부정적인 영향을 갖지 않는다.
핵산 및 발현 작제물을 표적 세포에 투여하거나 전달하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 하기에 간략하게 설명된 방법을 포함한다. 표적 세포는, 예를 들어 심근세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 생체내에서 표적 세포, 조직 또는 기관으로 전달된다. 일부 실시양태에서, KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 생체외에서 표적 세포에 투여된다. 일부 실시양태에서, KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 시험관내에서 표적 세포에 전달된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 심근세포이다. 심근세포는 개체에 존재할 수 있거나 개체 외부에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 심장 또는 심장 조직에 투여된다.
다른 실시양태에서, 표적 세포는 증식성 심근세포이다. 즉, KLF-유도성 역분화를 이미 겪은 심근세포에 KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터를 투여할 수 있다.
일부 실시양태에서, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 개체의 세포 내로 생체외에서 형질감염되거나 형질도입될 수 있다. KLF를 발현할 수 있는 형질감염 또는 형질도입된 세포는 이어서 확장되어 개체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 개체의 자가 조직이다. 적합한 세포는 성체 조혈 줄기/전구 세포와 같은 혈액 또는 골수로부터 분리된 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 정맥내 주사와 같이 전신으로 전달된다. 추가 투여 경로는 예를 들어 경구, 국소, 심장내 및 근육내를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 생체외에서 개체로부터 수확된 세포에 전달될 수 있고, 이어서 KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터를 함유하는 세포가 개체에 재도입된다.
일부 실시양태에서, KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 심장 도관법을 통해 투여된다.
핵산(예: KLF 핵산)의 전달을 위한 다수의 방법이 당업계에 공지되어 있다. 여기에는 아데노-연관 바이러스(AAV) 또는 렌티바이러스 매개 전달, 나노입자 매개 전달, 젤 폼-매개 심장막내 전달; 및 핵산을 심장으로 직접 근육내 투여를 포함한다.
KLF 핵산을 투여하는 바람직한 방법은 아데노-연관 바이러스(AAV)를 사용하는 것이다. 일부 실시양태에서, KLF 핵산은 연속적으로 또는 조건부로 발현될 수 있다. 추가적으로, 심장박동성(cardiotropic) AAV 혈청형 또는 돌연변이체의 사용은 조직 특이성을 향상시킨다. 따라서, 예를 들어, 본 방법은 심장박동성 AAV에서 KLF 핵산을 전달하는 것을 포함한다. 적합한 AAV는 Pacak and Byrne, Mol Ther, 2011, 19(9), pp1582-1590에 기재된 것과 같은 심장 특이적 AAV를 포함한다.
예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, HSV 또는 아데노바이러스와 같은 기타 바이러스가 또한, 사용될 수 있다.
발현을 위한 심장 조직 특이적 프로모터(예: NCX1, TNNT2)의 사용은 AAV 혈청형 외에 추가 특이성을 허용한다.
일부 실시양태에서, KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 형질감염제 또는 전달 비히클을 사용한 형질감염에 의해 투여된다. 본원에 사용된 용어 "전달 비히클"은 KLF 핵산의 세포 내로의 진입을 향상시키는 화합물 또는 화합물들을 지칭한다. 전달 비히클의 예로는 단백질 및 폴리머 복합체(폴리플렉스), 폴리머와 지질의 조합(리포폴리플렉스), 다층 및 재충전된 입자, 지질 및 리포솜(리포플렉스, 예를 들어 양이온성 리포솜 및 지질), 폴리아민, 인산칼슘 침전물, 폴리양이온, 히스톤 단백질, 폴리에틸렌이민, 폴리리신 및 폴리암포라이트 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달 비히클은 형질감염제를 포함한다. 형질감염제는 핵산을 응축시키는 데 사용될 수 있다. 형질감염제는 또한 작용기를 폴리뉴클레오타이드와 연관시키기 위해 사용될 수 있다. 작용기의 비제한적 예에는 세포 표적화 모이어티, 세포 수용체 리간드, 핵 국소화 신호, 엔도솜 또는 기타 세포내 소포(vesicles)로부터 내용물의 방출을 향상시키는 화합물(예: 막 활성 화합물) 및 이들이 부착된 화합물 또는 복합체의 거동 또는 상호작용을 변경시키는 기타 화합물(상호작용 변형자)을 포함한다. 생체내 전달을 위해 양이온성 형질감염제의 준중화량으로 만든 복합체를 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 엑소좀 또는 엑소좀-유사 소포를 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, KLF 핵산은 엑소좀 생성 세포 내로 도입될 수 있고 KLF 핵산을 함유하는 엑소좀은 이들 세포로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, 엑소좀은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 및 엑소좀 내로 도입된 KLF 핵산에 따라 단리되거나 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 리포폴리머, 리포솜, 젤라틴 복합체, 폴록사민 나노스피어, 또는 리포단백질을 사용하여 전달될 수 있다.
KLF 핵산 또는 발현 벡터의 심장 특이적 전달을 달성하기 위한 대안적인 기술은 초음파 표적 미세기포 파괴(ultrasound targeted microbubble destruction; UTMD)이다. 이 기술은 초음파로 초음파처리할 때 진동하여 파괴되는 가스가 채워진 미세 기포인 초음파 조영제의 물리적 특성을 기반으로 한다. 미세기포(Microbubbles)에는 KLF 핵산 또는 발현 벡터가 탑재되어 정맥 내로 주입되고 초음파로 심장에서 파괴되어 심장을 형질 감염시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 전신적으로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 하나 이상의 제약상 허용되는 담체와 조합하여 전달될 수 있다. KLF 핵산 또는 발현 벡터의 전달을 위한 폴리머 시약은 그 유용성을 증가시키는 화합물을 포함할 수 있다. 이들 그룹은 중합체 형성 전에 단량체에 혼입되거나 형성 후에 중합체에 부착될 수 있다. 벡터 전달 강화 모이어티는 핵산 복합체를 수정하고 이를 배양물 또는 전체 유기체에서 세포 위치(예: 조직 세포) 또는 세포 내 위치(예: 핵)로 지시할 수 있는 분자이다. 복합체의 세포 또는 조직 위치를 변형함으로써, KLF 핵산 또는 발현 벡터의 원하는 국소화 및 활성이 향상될 수 있다. 전달 강화 모이어티는, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 지질, 스테로이드, 당, 탄수화물, 핵산, 세포 수용체 리간드, 또는 합성 화합물일 수 있다. 전달 강화 모이어티는 일부 실시양태에서, 수용체에 대한 세포 결합, 핵으로의 세포질 수송 및 엔도솜 또는 다른 세포내 소포로부터의 핵 진입 또는 방출을 향상시킬 수 있다.
핵 국소화 신호(NLS)는 또한 mir-1 핵산 또는 발현 벡터의 핵 근접 및/또는 핵으로의 진입으로의 표적화를 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 핵 수송 신호는 단백질 또는 SV40 대형 태그 NLS 또는 뉴클레오플라스민 NLS와 같은 펩티드일 수 있다. 이러한 핵 국소화 신호는 NLS 수용체(카리오페린α)와 같은 다양한 핵 수송 인자와 상호작용한 다음 카리오페린 베타와 상호작용한다. 일부 구체예에서는, 핵 수송 단백질 자체가 또한 핵공 및 핵을 표적으로 하기 때문에 NLS로서 기능할 수 있다.
통상의 기술자는 KLF 핵산 또는 발현 벡터를 심장 또는 심장 조직 또는 심근세포 또는 기타 표적 세포에 전달하기 위한 적절한 시스템을 과도한 실험없이, 생 체내 , 생체외 , 또는 시험관내에서 선택하고 사용할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, KLF 핵산 또는 발현 벡터의 국소 전달이 바람직하다. 특히, 심장으로의 KLF 핵산 또는 발현 벡터의 전달이 바람직하다.
KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터의 심장으로의 국소 전달을 가능하게 하는 많은 전략이 있다. 예를 들어, Alzet® 삼투 펌프와 같은 삼투 미니 펌프는 지속 가능한 치료 농도에서 KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터의 효과적인 국소 전달에 사용될 수 있다. 저장소가 있는 펌프는 일반적으로 피하 조직에 이식되고 KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터를 실리콘 튜브 또는 캐뉼러를 통해 대상 조직에 전달한다. 삼투 미니 펌프는 정상 상태의 약물 전달을 위해 삼투압에 의존하며 이미 임상적으로 적용되어 왔다.
KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터의 국소 전달은 세포 이식에 의해도 달성될 수 있다. 세포 대체 요법 외에도 KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터를 함유하는 세포를 심장 근육에 이식할 수도 있다.
KLF 투여량
KLF, KLF 핵산, 또는 발현 벡터의 유효 투여량 수준은 다음을 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다: 치료되는 상태의 유형 및 상태의 단계; 사용되는 KLF, KLF 핵산, 또는 발현 벡터의 활성 및 성질; 사용되는 조성물; 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단; 투여 시간; 투여 경로; 치료 기간; 의학에서 잘 알려진 다른 관련 요인과 함께 치료와 함께 또는 동시에 사용되는 약물.
통상의 기술자는 일상적인 실험을 통해 적용 가능한 상태를 치료하는 데 필요한 효과적인 무독성 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 이는 대부분 사례별로 결정된다.
일반적으로, 유효 투여량은 24시간 당 체중 1kg 당 약 0.0001mg 내지 약 1000mg의 범위일 것으로 예상되며; 전형적으로, 24시간 당 체중 1kg당 약 0.001mg 내지 약 750mg; 24시간당 체중 1kg당 약 0.01mg 내지 약 500mg; 24시간당 체중 1kg당 약 0.1mg 내지 약 500mg; 24시간당 체중 1kg당 약 0.1mg 내지 약 250mg; 또는 24시간당 체중 kg당 약 1.0mg 내지 약 250mg이다. 보다 전형적으로, 유효 용량 범위는 24시간당 체중 1kg당 약 10mg 내지 약 200mg의 범위일 것으로 예상된다.
대안적으로, 유효 투여량은 최대 약 5000mg/m2일 수 있다. 일반적으로, 유효 투여량은 약 10 내지 약 5000mg/m2, 전형적으로 약 10 내지 약 2500mg/m2, 약 25 내지 약 2000mg/m2, 약 50 내지 약 1500mg/m2, 약 50 내지 약 1000mg/m2, 또는 약 75 내지 약 600mg/m2의 범위일 것으로 예상된다.
추가로, 개별 투여량의 최적의 양 및 간격은 치료될 상태의 성질 및 정도, 투여 형태, 경로 및 부위, 및 치료를 받는 특정 개체의 성질에 의해 결정될 것이다. 또한, 이러한 최적 조건은 종래 기술에 의해 결정될 수 있다.
정해진 수일 동안 하루에 제공된 조성물의 투여 횟수와 같은 최적의 치료 과정이 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있음이 또한 치료 결정 테스트의 전통적인 과정을 사용하는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
치료의 효과는 KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터로 치료된 개체로부터의 샘플에서 KLF의 발현 수준을 결정함으로써 평가될 수 있다. 일정 기간 후 개체로부터의 추가 샘플에서 KLF 핵산의 발현 수준이 결정되고, KLF 핵산 발현 수준의 변화로 치료 요법의 효능을 나타낼 수 있다. 샘플은 혈장 또는 혈청을 포함할 수 있다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 치료의 효과는, 예를 들어 KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터로 치료된 개체로부터의 샘플에서 증식성 심근세포의 수준을 결정함으로써 평가될 수 있다.
심근세포 개체군/심장 전구 세포 개체군
KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터의 투여는 증식성 심근세포 집단을 생성한다. 증식성 심근세포는 미성숙 심근세포 집단, 배아 표현형을 갖는 심근 세포 집단, 또는 심장 전구 세포 집단, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 이러한 증식성 심근세포 집단은 개체에 투여하기 위한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서 증식성 심근세포의 집단은 약제학적 조성물에 혼입되기 전에 심근세포로 분화되도록 허용될 수 있다.
KLF, KLF 핵산 또는 발현 벡터는 심근생성을 유도하기 위해 개체(또는 다른 곳에서)로부터 채취한 성체 심근세포에 투여될 수 있다. 생성된 세포는 심근세포 집단이든 증식성 심장 전구 세포 집단이든 상관없이 생리학적으로 허용되는 담체(즉, 심근세포의 활동을 방해하지 않는 무독성 물질)를 추가로 포함하는 약제학적 조성물, 예를 들어 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 제조될 수 있다. 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 담체가 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 담체의 선택은 부분적으로 투여되는 물질(즉, 세포 또는 화합물)의 특성에 따라 달라진다.
적합한 담체에는 생리 식염수 용액, 젤라틴, 물, 알코올, 천연 또는 합성 오일, 당류 용액, 글리콜, 에틸 올레에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르 또는 이러한 물질의 조합이 포함된다. 약제학적 조성물은 방부제 및/또는 다른 첨가제, 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및/또는 불활성 기체, 및/또는 기타 활성 성분을 추가로 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 심근세포 집단 또는 심장 전구체 집단은 공지된 캡슐화 기술에 따라 캡슐화된다.
일부 실시양태에서, 심근세포 집단 또는 심장 전구체 집단은 매트릭스에 존재한다.
심근세포 집단 또는 심장 전구체 집단의 단위 투여 형태는 약 103 세포 내지 약 109 세포, 예를 들어, 약 103 세포 내지 약 104 세포, 약 104 세포 내지 약 105 세포, 약 105 세포 내지 약 106 세포, 약 106 세포 내지 약 107 세포, 약 107 세포 내지 약 108 세포, 또는 약 108 세포 내지 약 109 세포를 함유할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 시험관내에서 심근세포 집단에서 심근생성을 유도하고 심근세포 집단을 개체의 심장에 이식하는 방법이 제공된다. 심근세포 집단은 이를 필요로 하는 개체로의 동종 또는 자가 이식을 위해 사용될 수 있다.
병용 요법
하나 이상의 다른 약제와 함께 KLF, KLF핵산 또는 벡터의 사용을 정의할 때 '병용 요법' 또는 '보조 요법'이라는 용어는 약물 조합의 유익한 효과를 제공하는 요법에서 순차적 방식으로 각 약제의 투여를 포함하도록 의도되며, 고정된 비율의 이러한 활성제를 갖는 단일 제제 또는 각 제제의 다중 개별 제형과 같이 실질적으로 동시적인 방식으로 이들 제제의 공동 투여를 포함하도록 의도된다.
본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 하나 이상의 KLF, KLF 핵산, 또는 벡터는 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 제형화되거나 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다양한 구체예에 따르면, KLF, KLF 핵산, 또는 벡터 중 적어도 하나는 수술 및/또는 다른 공지된 치료 또는 치료제, 및/또는 보조제 또는 예방제와의 조합 치료 요법에 포함될 수 있다.
다수의 제제가 상업적 용도, 임상 평가 및 전임상 개발에서 이용가능하며, 이는 조합 약물 요법의 일부로서 상기 열거된 질환 및 상태의 치료를 위해 선택될 수 있다. 조합 요법에 사용될 수 있는 적합한 제제는 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 적합한 제제는, 예를 들어 Merck Index, An Encyclopaedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, 12th Ed., 1996, 및 후속 판에 나열되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
조합 요법은 활성제가 함께, 순차적으로, 또는 각각의 경우에 적절한 간격으로 투여되는 것을 포함할 수 있다. KLF, KLF 핵산 또는 벡터 중 적어도 하나를 포함하는 활성제의 조합은 상승적 효과를 낼 수 있다.
KLF, KLF 핵산 또는 벡터 중 적어도 하나와 추가 제제의 동시 투여는 제제가 다른 활성제와 동일한 단위 용량으로 존재함으로써 수행될 수 있거나, 또는 하나 이상의 다른 활성제(들)가 투여 요법 또는 일정에 따라 동일하거나 유사한 시간에 또는 상이한 시간에 투여되는 개별 및 개별 단위 용량으로 존재할 수 있다. 순차 투여는 필요에 따라 임의의 순서로 이루어질 수 있고, 특히 누적 또는 상승 효과가 필요한 경우 제2 또는 이후 화합물이 투여될 때 현재의 제1 또는 초기 화합물의 지속적인 생리학적 효과를 요구할 수 있다.
실시예에 도시된 바와 같이, 광범위하게 기술된 본 발명의 정신 또는 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 다양한 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있다는 것이 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 따라서, 본 실시예는 모든 면에서 예시적인 것으로 간주되어야 하며 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 기술이 보다 명확하게 이해될 수 있도록, 이하의 도면 및 실시예를 참조하여 바람직한 실시예를 설명한다.
실시예
실시예 1: 손상은 제브라피쉬에서 심장 재생 동안 klf1 의 심근 발현을 유도한다.
제브라피쉬에서 심장 재생을 위한 분자 메커니즘을 조사하는 동안, 본 발명자들은 징크 핑거 전사 인자 KLF1/EKLF의 제브라피쉬 오르토로그를 코딩하는 유전자인 kr
Figure pct00005
ppel-like factor 1(klf1)의 손상-유도된 심근 발현을 확인했다(도 1A). 포유류에서, KLF1은 조혈 조직에서 발현되고 적혈구 발달에 필수적이지만, 이 연구 이전에 비-조혈 기관에서 KLF1의 역할은 불분명했다.
이 분석에 따르면, 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 사용하여 klf1 발현이 손상 후 7일(dpi)에 일시적으로 정점에 이르렀고(도 1B), 이는 심근세포의 재생 증식의 최대 반응에 해당했다(CM). 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 세포 유형 특이적 리포터 라인의 7dpi 심실에서 얻은 정제된 심장 세포로 RT-qPCR을 수행한 경우, klf1 전사체는 CM에서 검출되었지만 심외막 및 심내막 세포에서는 검출되지 않았다(도 1B). klf1 발현은 또한 4-하이드록시타목시펜(4-HT) 치료가 출혈을 일으키지 않고 심장 근육을 특이적으로 손상시킬 수 있는, 유전적 CM 절제 모델을 사용하여 평가되었다. CM이 고갈된 심장의 섹션을 사용하여, 본 발명자들은 세포질 근육 마커인 트로포닌 C(TnC)에 대해 매우 민감한 인시츄 혼성화 및 면역형광을 수행하였고, 재생성 심근에서 TnC와 klf1 mRNA 신호의 공동-국소화를 검출했다(도 1C, 화살표). 이러한 데이터는 손상이 제브라피쉬에서 심장 재생 동안 klf1의 심근 발현을 유도함을 나타낸다.
실시예 2: Klf1은 제브라피쉬의 심장 재생에 필수적이다.
심장 재생에서 Klf1의 기능을 조사하기 위해, 본 발명자들은 제브라피쉬 계통 Tg (actb2:loxP-TagBFP-STOP-loxP-dn-klf1) vcc22(이하 actb2:BS-dn-klf1)를 확립했으며, 여기서, 우성-음성 형태의 Klf1(dn-Klf1)은 심장 근육 특이적 Cre 드라이버 라인, Tg(cmlc2:CreER)(이하 cmlc2:CreER)과 조합된 CM에서 유도된다. 우리는 cmlc2:CreER; actb2:BS - dn - klf1 (KlfDN-ON) 및 대조군 actb2:BS - dn - klf1 피쉬(KlfDN-OFF)를 4-HT로 처리하고 30dpi에서 재생을 분석했다. 놀랍게도, 모든 KlfDN-ON 심장은 상처 부위에서 극도로 심한 흉터를 보였지만(7 중 7, 도 2A), 이러한 표현형은 대조군 KlfDN-OFF 심장에서는 관찰되지 않았다(7 중 0, 도 2A). dn-Klf1의 심근 발현은 CM 증식을 유의하게 감소시켰는데, 이는 PCNA와 함께 근핵 마커 Mef2의 감소된 공동-표지화에 의해 검출된 바와 같다(도 2B). 이러한 데이터는 Klf1이 제브라피쉬의 심장 재생에 필수적인 전사 인자임을 나타낸다.
정량적 전사 분석을 사용하여, klf1 발현이 심근세포에서 최대 재생-유도 증식 기간과 동시에, 손상 후 7일(dpi)에 최고조에 달하는 것으로 관찰되었다(도 3A). 이 일시적인 klf1 발현은 정제된 심근세포에 제한되었고, 심외막(Epi) 또는 심내막 세포(End)에서는 검출되지 않았다(도 3B). 심장 출혈을 일으키지 않고 심장 근육을 손상시키는, 조건적 4-하이드록시타목시펜(4-HT) 유도성 심근세포 절제 모델을 사용하여, 세포질 근육 마커 트로포닌 C와 klf1 mRNA의 공동 국소화를 관찰하였다. 이는 재생성 심근 세포가 제브라피쉬에서 심장 재생 중에 Klf1을 발현함을 나타낸다.
실시예 3: Klf1 발현은 제브라피쉬 심장에서 CM 역분화를 유도한다.
트랜스제닉 제브라피쉬 계통 Tg ( actb2:loxP - TagBFP -STOP- loxP - 3xHA - klf1 ) vcc29 는 cmlc2:CreER을 갖는 CM에서 3xHA-태그된 Klf1을 과발현하도록 확립되었다. 이중 형질전환 피쉬와 Cre -음성 클러치 메이트를 각각 klf1 -ON 및 klf1 - OFF 로 명명했다. klf1 -ON; cmlc2:GFP 및 대조군 klf1 -OFF; cmlc2:GFP 피쉬를 4-HT로 처리하고 cmlc2:GFP로 표지된 CM에서 역분화 마커 Sm22α (Sm22)의 발현을 평가했다. 놀랍게도, 대조군 심장(12d klf1 -OFF)과 비교하여, Sm22 발현 수준은 Klf1-과발현된 심장에서 크게 증가했으며, 이 발현은 4-HT 처리 후 7일(dpt)에 심실의 최외측 심근에서 처음 검출되었고, 나중에 12 dpt에서 내부 섬유주 심근에서도 관찰되었다. 제브라피쉬 CM의 또 다른 역분화 마커인 Tg ( gata4:EGFP ) (이하, gata4:GFP ) 를 사용한 분석에서도 gata4:GFP의 공간적 및 시간적 패턴이 Sm22와 유사한 것으로 나타났다. Z-라인의 주요 구성요소인 α-액티닌의 면역형광은 klf1 -OFF 심근에 비해, klf1-ON 심근에서 고도로 와해된 근절(sarcomere) 구조를 나타냈다. 더욱이, CM 역분화에 대한 조직학적 증거와 일치하여, klf1 -ON 심장은 마우스에서 줄기 세포 및 CM 역분화 마커인 runx 1의 발현을 유의하게 증가시켰으며(도 4A), 미오신 중쇄(vmhc), 심장 근육 액틴(actc1a) 및 미오메신(myom2a)과 같은 수축성 유전자의 발현 감소를 동반했다(도 4B). 이러한 데이터는 Klf1 발현이 제브라피쉬 심장에서 CM을 덜 성숙한 상태로 역분화하기에 충분함을 나타낸다.
실시예 4: Klf1 발현은 제브라피쉬 심장에서 CM 증식을 유도한다.
CM 역분화를 통해 획득된 감소된 수축 상태가 세포 분열을 촉진하기 위해 제안되었기 때문에, 본 발명자들은 다음으로 EdU 혼입 분석을 사용하여 CM 증식이 Klf1 과발현에 의해 향상되었는지 여부를 다루었다. 놀랍게도, klf1 -OFF 심장의 증식의 백그라운드 수준(EdU+ CM) 과 비교하여(도 5A), klf1 -ON 심장에서의 증식은 거의 200배 증가했다(도 5A). 우리는 다음으로 phospho-Histone H3(pHH3)에 대한 항체를 사용하여 면역형광법으로 CM 유사분열을 평가했다. 유사분열 CM을 식별하는 것은 세포 주기에서 유사분열 단계의 짧은 기간으로 인해 재생 중인 제브라피쉬 심장에서는 극히 어려운 것이었다. 그러나, 본 발명자들은 klf1 -ON 심장에서 섹션당 ~6 pHH3+ CM을 지속적으로 관찰했고, 대조군 심장에서는 유사분열 CM이 전혀 검출되지 않았는데(도 5B), 이는 세포 주기 재진입을 위한 CM에서 Klf1 과발현의 강력한 효과를 강력하게 나타낸다. 매우 높은 수준의 CM 증식과 일치하여, klf1 -ON 심장은 FoxM1, PCNA, E2F2, Cdc25b, 사이클린 의존성 키나제(Cdk1/2) 및 G1/S(CyclinD1) 및 G2/M cyclins (CyclinB2/A2)와 같은 광범위한 세포 주기 조절자의 발현을 유의하게 증가시켰다(도 5C). 함께, 이러한 데이터는 Klf1 발현이 정지된 CM이 성체 제브라피쉬 심장에서 세포 주기를 다시 진입하도록 하기에 충분함을 나타낸다.
실시예 5: 성체 마우스 심장에서 KLF1 기능.
제브라피쉬 심장과 유사하게, 마우스 Klf1 (mKlf1) mRNA를 경색 후 재생 중인 신생체 심장에서 기준선 수준으로부터 상향조절하였다(신생체; 도 6A). 그러나 흥미롭게도 mKlf1 발현은 경색된 성체 심장에서 유도되지 않았으며(성체; 도 6A), 이는 그 발현 수준과 마우스 심장의 재생 능력 사이의 상관관계를 나타낸다.
성체 마우스 심장에서 KLF 기능을 조사하기 위해, 본 발명자들은 mKlf1 cDNA가 P2A 펩티드 서열을 통해 EGFP cDNA에 연결되어 감염된 세포(Ad-Klf1)를 가시화하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 생성하였다. 또한, EGFP cDNA(Ad-GFP)만을 함유하는 대조군 벡터도 생성하였다. 정제된 Ad-GFP 또는 Ad-Klf1 바이러스를 성체 C57BL/6 마우스의 손상되지 않은 심장의 심근에 주사하고 Ki67 면역형광 분석에 의해 CM 증식을 평가했다. Ad- Klf1 바이러스의 주입은 대조군 바이러스(GFP; 도 6B)의 주입과 비교하여 Ki67과 Troponin-T(TnT)의 공동 표지(KLF1; 도 6B)를 유의하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. GFP의 면역형광 검출은 증식성 CM에서 mKlf1의 발현을 나타냈다.
본 발명자들은 삼투성 미니 펌프를 사용하여 EdU를 전달하고 CM 증식을 평가하여 TnT의 면역형광과 연결된 막 마커 밀 배아 응집소(WGA)로 CM을 식별하였다. 이는 성체 마우스 심장 섹션에서 증식성 CM을 식별하는 보다 민감한 방법이다. Ki67 및 TnT의 면역표지 결과와 일치하게, WGA 염색을 사용한 분석은 Ad-Klf1 바이러스(KLF1; 도 6C)가 주입된 심장에서 크게 증가한 EdU+ CM을 검출했다. 함께, 이러한 데이터는 mKlf1이 마우스 내 CM 증식에서 보존된 기능을 갖고, 심지어 손상이 없는 경우에도 생체 내에서 CM 세포 주기 재진입을 유도할 수 있음을 나타낸다.
Klf1를 또한 심근경색증(MI) 후 성체 마우스 심장에 전달하였다. 유의하게 증가된 CM 증식(도 7A) 및 유사분열(도 7B)도 Ad-Klf1 형질도입으로 관찰되었으며, 이는 mKlf1이 마우스에서 보존된 재생 기능을 갖는다는 것을 나타낸다. 증가된 CM 재생과 일치하여, Ad-Klf1 형질도입으로 심장에서 심장 흉터가 현저하게 감소하고 손상된 부위에서 심근생성이 증가하고(도 7C) 심장 기능이 크게 회복됨을 발견했다(도 7D). 함께, 이러한 데이터는 mKlf1이 마우스 내 CM 증식 및 재생시 보존된 기능을 가지고 있음을 나타낸다.
실시예 6: 조건부 유전자 트랩 라인
심장 재생에서 Klf1의 역할을 다루기 위해, 본 발명자들은, 상기 기술된 바와 대로, 상동 재조합을 통해 klf1 유전자의 첫 번째 인트론내로 Zwitch2라는 Cre 의존성 유전자 트랩 카세트를 삽입하여, 조건부 유전자-트랩 라인, Tg(klf1:Zwitch2)vcc33Gt(이하 klf1-ct 또는 klf1 ct 라고 함)를 생성했다 (도 8A, B). Zwitch2는 스플라이스-수용체(SA) 부위과 그 후속 트리플렛 폴리-A 서열(3xBGHpA) 및 스크리닝을 위한 강화 녹색 형광 단백질(EGFP) 발현이 있는 제거가능한 렌즈 특이적 태그로 구성된다(도 8A). SA 및 3xBGHpA를 포함하는 세그먼트는 반대 방향의 탠덤 loxP 및 lox5171 사이트에 의해 인접해 있으며, 이는 Cre-매개 재조합을 통해 영구적으로 반전되고 비정상적인 스플라이싱을 통해 klf1 발현을 비활성화할 수 있다(돌연변이, 도 8B).
확립된 라인에서, Zwitch2의 정확한 삽입은 게놈 PCR, 서던 블롯, 및 DNA 시퀀싱 분석에 의해 확인되었다(도 9A-D). 본 발명자들은 또한 klf1 -ct/+ 를 Tg(ubb:iCre-P2A-EGFP) 와 교배시켜 확립된 대립유전자를 특성화했는데, 이 균주는 Cre가 강력하고 편재적으로 발현되는 유비퀴틴 B (ubb ) 프로모터에 의해 발현되는 균주이다. 육종을 통해, 우리는 WT 및/또는 돌연변이 유발성 klf1 대립유전자를 보유하는 배아를 얻었고(도 9E, F), 제브라피쉬의 적혈구 발달에서 Klf1의 진화적으로 보존된 역할을 확인하는 이들 배아의 표현형을 분석하였다(도 10A).
본 발명자들은 klf1 -ct/+ 피쉬와 Tg ( cmlc2:CreER ) (cmlc2:CreER )를 교배시켰는데, 이 균주는 4-하이드록시타목시펜(4-HT)-유도성 Cre가 수축성 유전자인 심장 미오신 경쇄 2 (cmlc2 / myl7 )의 조절 서열에 의해 발현되는 균주이고, 이는 심근에서 klf1 발현을 비활성화하였다. 본 발명자들은 klf1 -ct/ct 및 cmlc2:CreER : klf1-ct/ct 피쉬를 얻었고; 이 피쉬를 4-HT로 3일 연속 밤새 처리하고, 마지막 처리 후 2일째에 절제 손상을 시행하였다. 4-HT 치료 요법은 7 dpi cmlc2:CreER ; klf1-ct/ct 심실에서 심근 klf1 발현을 손상되지 않은 대조군 수준으로 성공적으로 감소시켰다(도 8C, 9H). CM 증식은 심근 발현 klf1의 비활성화와 함께 증식성 Mef2+, PCNA+ CM의 수의 유의한 감소를 확인하기 위해 심근 마커 Mef2 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)에 대한 면역형광에 의해 분석되었다(도 8D). 평활근 단백질 22 α(Sm22a; 트랜스젤린이라고도 함)(도 8E) 및 활성화된 백혈구 세포 부착 분자 a(Alcama, DM-GRASP라고도 함)와 같은 태아 CM 마커에 대해 면역형광을 수행했다(도 8F). 이는 klf1 발현이 결여된 심장에서 이들 마커의 발현을 상당히 감소시켰다(도 8F). 함께, 이러한 데이터는 Klf1이 적혈구 생성 및 선천성 빈혈에서 중요한 역할을 하면서도 제브라피쉬에서 심장 재생 동안 CM 역분화 및 증식의 새로운 메커니즘을 유도함을 나타낸다.
기술된 klf1ct의 생성 및 특성화에 대한 세부 정보(도 9A-D). 보편적으로 발현되는 Cre-유도 klf1 ct 활성화로 klf1 ct 의 전체적인 활성화(도 9E) 및 klf1 발현의 심각한 감소(도 9F)는 심각한 빈혈로 인한 심장 부종을 유발한다(도 10A). klf1 ct 의 조직-특이적 활성화는 심근세포-제한 Cre 라인 Tg(cmlc2:CreER)가 있는 성체 심근에서 달성되었다. 이 심근 트랩 라인과 cmlc2:CreER 음성 대조군 라인은, 각각 klf1-MT 및 klf1-CT로 지칭되며, 4-HT 치료 후 심실 절제를 받았고, 이는 Cre 의존성 유도를, 심장 klf1-CT 반전(도 9G) 및 손상되지 않은 대조군과 동일한 수준으로 7dpi에서 klf1의 심실 발현 감소(도 9H)를 확인하였다. 심근 klf1 발현의 비활성화는 지속적인 섬유소 및 콜라겐 흉터를 나타내는 재생 심장의 비율을 유의하게 증가시켰으며(도 3D), 이는 심근 Klf1이 제브라피쉬의 심장 재생에 필요함을 나타낸다.
평활근 단백질 22α/트랜스겔린(Sm22, 도 3E) 및 활성화된 백혈구 세포 부착 분자(Alcam, 도 3F)와 같은 알려진 심근 세포 역분화 마커는 klf1-MT 심장에서 현저하게 감소했다. 이는 근세포 인핸서 인자 2(Mef2) 및 증식성 세포 핵 항원(PCNA)에 대해 이중 양성인 증식성 심근세포의 수의 상당한 감소를 동반했다(도 3G). 유사하게, 우리는 Klf1의 우성-음성 형태의 조건부 발현 하에서 심근세포 역분화 및 증식의 현저한 감소와 심각하게 손상된 심장 재생을 관찰하여, 심장 재생에서 Klf1의 필수적인 역할에 대한 추가 증거를 제공한다(dn-Klf1; 도 11A-D). 종합하면, 이러한 데이터는 심근 재생에서 Klf1의 새로운 비조혈 기능을 확인하여, 이로써 Klf1이 심근세포 역분화 및 증식의 성공적인 유도에 필수적인 역할을 함을 규명한다.
klf1은 심장 발달동안 사실상 검출할 수 없었다(검사된 81개의 심실 심근 절편당 하나의 mRNA 누점). Klf1이 심근 발달에 기능적 역할을 하는지 여부를 테스트했다. 놀랍게도, Klf1의 전체적인 억제로 관찰된 빈혈 표현형과는 대조적으로(도 10A, B), 심근 klf1 ct 활성화(도 10C)도 심근 dn-Klf1 과발현(도 10D)도 발달 동안 심장 형태 형성 및 심근 세포 증식에 영향을 미치지 않았다. 심장 부종이 발생하기 전에 분석을 수행했을 때 보편적으로 발현된 Cre 드라이버를 사용하여 klf1 ct 활성화 또는 dn-Klf1 발현이 구성적으로 유도된 심장에서도 유사한 표현형이 관찰되었다(도 10E, F). 함께, 이러한 데이터는 심근에서 Klf1에 대한 재생-특이적 역할을 나타낸다.
실시예 8: Klf1은 손상-독립적 재생 반응을 유발한다.
klf1 발현이 손상되지 않은 심장에서 재생 표현형을 유도하는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 심근에서 3xHA-태그된 Klf1을 구동하기 위한 조건부 전략을 사용하였다(klf1 - ON; 도 12A). 우리는 klf1 -ON 피쉬 또는 Cre 음성 대조군(klf1-OFF; 도 12A)을 4-HT로 밤새 처리하고(도 12B) 면역형광에 의해 심근에서 3xHA-Klf1의 핵 국소화를 검출했다. klf1 -ON 심장에서, Sm22 및 Alcam의 심근 발현은 치료 7일 후(dpt)에서 증가했고, 4-HT 치료 후 12일(dpt)에 더 증가했다. 심근 재생 동안, 심근 세포 분열은 수축성 감소에 의해 촉진될 가능성이 있으며 미성숙 증식 상태와 관련된 유전자의 발현을 동반한다. 7 dpt에서 klf1 -ON 심장에서 부분적인 심근세포 역분화와 일치하여, Z-라인의 주요 성분인 α-액티닌, 피질층 심근에서 무질서한 근절이 섬유주 심근에서 관찰되었고 12 dpt에서는 더 확장되었다. 이러한 구조적 이상은 7 및 12 dpt에서 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 확산 Z-디스크로 시각화되었다.
Klf1-유도 심근세포 역분화가 심근세포 증식 증가를 동반하는지 여부를 결정하기 위해 증식 마커 PCNA를 조사하였고, klf1 -ON 심실에서 PCNA+ Mef2+ 심근세포 수의 대규모 증가가 관찰되었다(도 12C). klf1 -ON 심근세포에서 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)의 혼입이 크게 증가하여 많은 심근세포가 DNA 합성을 겪었음을 확인했다(도 12D). 유사분열 포스포-히스톤 H3+ (pHH3+) 심근세포의 시각화는 제브라피시 심장을 활발하게 재생하는 경우에도 극히 드물다. 그러나, klf1 -ON 심실에서 많은 pHH3+ 심근세포가 검출되었고(도 12E), 심근세포가 유사분열을 통해 후기(anaphase)로 성공적으로 진행되었음을 분명히 보여주었다. 함께, 이러한 데이터는 klf1 과발현이 강력한 심근세포 역분화 반응을 유발하기에 충분하고 손상되지 않은 제브라피쉬 심장에서 심근세포 세포 주기 재진입 및 증식을 강력하게 촉진함을 나타낸다.
klf1 -ON 심장에서 관찰된 광범위한 증식 반응의 과정 동안, EGFP로 유전적으로 표지된 심근 세포는 심근 계통의 세포로 제한되었고 심내막 또는 심외막 세포와 같은 다른 심장 세포 계통에 기여하지 않았다. 이러한 데이터는 Klf1이 성숙한 심근 세포를 증식성 다능 전구 세포로 재프로그래밍함으로써가 아니라 오히려 혈통 적응성(lineage plasticity)에 영향을 미치지 않으면서 심근세포 자가재생의 광범위한 상향조절에 의해 심근세포 확장을 유도함을 나타낸다. klf1 -ON 심장에서 증가된 수의 혈관계 내피 세포 및 심외막 세포가 관찰되었으며(도 13A, B), 이는 심근 Klf1 발현이 간접적으로 다른 심장 세포 내의 재생 프로그램을 자극함을 나타낸다.
KLF1 서브패밀리 구성원 KLF2 및 KLF4는 심혈관 발달 및 기능을 조절한다. 우리는 klf1 -ON에 대해 설명한 대로, 제브라피쉬 KLF2 및 KLF4 오르토로그, Klf2a, Klf2b 및 Klf4를 유도 가능한 방식으로 발현하여 KLF1 서브패밀리의 심근 생성 능력을 비교했다(도 12A, B). 특히, 심근세포 유사분열의 가장 강력한 유도는 Klf1 과발현 동안이었다(도 13C). 심근세포 유사분열은 Klf2b 과발현 동안 중간 수준으로 유도된 반면(도 13C), 이러한 유도는 Klf2a 및 Klf4 과발현에서는 무시할 수 있을 정도였다(도 13C). 패밀리 구성원인 Klf2 및 Klf4와 비교하여 Klf1의 비교적 높은 효능은 성체-특이적 심근생성 표적의 조절에서 Klf1의 독특한 역할을 보여준다.
KLF1은 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 주목할 만한 기능을 갖는 KLF2 및 KLF4와 유사한 도메인 구조를 갖는다. KLF2 및 4보다 훨씬 낮은 효율이지만, KLF1은 다른 재프로그래밍 인자를 사용하여, 유도 만능 줄기 세포를 생성할 수도 있으며, 이는 Klf1에 의해 유도된 심근생성이 CM 재프로그래밍 및 전구 세포 증폭을 통해 매개된 후 심장 근육으로 재분화되는 기전임을 나타낸다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 klf1 -ON 심실에서 훨씬 더 많은 심외막 세포 및 혈관계 내피 세포를 관찰했으며, 이는 klf1 + CM의 측분비 효과를 나타내지만 재프로그래밍된 klf1 + CM으로부터의 새로운 분화에 의해 설명될 수도 있다. 세포 재프로그래밍과 관련된 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 klf1 유도가 시작될 때 CM에 영구적으로 라벨을 붙일 수 있는 타목시펜 의존성 지표 이식유전자를 보유하는 klf1 -ON 피쉬를 사용하여 유전적 페이트 매핑 분석을 수행했다. 유전적으로 표지된 세포는 감소된 수준에서 여전히 12dpt에서 미오신 중쇄(MHC)를 발현하였고 심외막 및 내피 세포에 대한 마커인 Raldh2(레틴알데히드 탈수소효소 2; Aldh1a2로도 알려짐)를 발현하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이는 klf1 + CM이 광범위한 증식 기간 동안 세포 계통을 변경하지 않았음을 나타낸다. 따라서, Klf1 과발현은 성체 CM을 증식성 다능성 심장 전구세포로 재프로그래밍하는 것이 아니라 성체 CM을 인접 조직의 성장을 촉진하는 능력과 함께 증식성 미성숙 상태로 역분화함으로써 성체 심장에서 광범위한 수준의 심근신생을 달성했다.
실시예 9: Klf1 -유도된 심근세포 증식은 심장 재성장을 유도한다
klf1 -ON 제브라피시는 9dpt까지 생존에 영향을 미치는 융기된 비늘(도 14A), 무기력 및 빠른 호흡을 포함하는 심부전의 징후를 점진적으로 나타냈다(도 14B). Klf1의 일시적인 치료 전달을 모델링하기 위해, Tg ( cmlc2:3xHA - klf1 -ER; cryaa:TagBFP) vcc32 (이하 klf1 -ER)가 설정되었다. klf1 -ER에서, Klf1은 4-HT에 반응하여 핵으로 가역적으로 전위된다(도 12F).
7일 동안 1일 1회 4-HT 처리(도 12G)는 심실에서 핵 klf1 -ER 국소화 및 재생 반응을 유도하였다. klf1 -ON 과 달리, 4-HT 처리 중단 후 klf1 -ER 피쉬의 생존에 영향이 없었으므로 본 발명자들은 30일 후 Klf1 유도 반응이 활발하지 않을 때 심장을 분석했다(도 12G). 흥미롭게도, 실험 심장의 총체적 분석은 4-HT 처리된 klf1-ER 피쉬에서 수집된 심장의 대규모 확대를 보여주었다(도 12H). 확장된 심장의 섹션은 병리학적 확장이나 섬유증을 나타내지 않았고(도 12I), 심근 영역은 상당히 더 컸다(~2배, 도 12J). Mef2+ 핵의 수는 klf1 -ER 심실에서 크게 증가했으며, 여기서 α-액티닌 염색은 Z-밴드의 뚜렷하고 잘 조직화된 줄무늬 패턴을 명확하게 표시했다. 더욱이, 확대된 심실의 개별 심근세포의 크기는 작았기 때문에(도 12K), 비대하지는 않았지만 대조군 심실에 비해 수에서 약 5배만큼 유의하게 증가하였다(도 12L). 따라서 Klf1 활성화 7일 만에 손상되지 않은 제브라피쉬 심장에서 심근세포가 거의 5배 증가하였는데, 이는 성체 심장에서 심근생성을 자극하는 Klf1의 극도의 증식 촉진 효능을 강조하는 것이었다.
실시예 10: Klf1은 심근 유전자 프로그램을 억제하기 위해 염색질 리모델링을 유도한다
Klf1의 심근 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해, 본 발명자들은 7 dpt에서 항-HA-태그 항체를 사용하여 klf1 -OFF 및 klf1 -ON 심실에 대한 염색질 면역침전(ChIP) 후 시퀀싱(ChIP-seq)을 수행하였다. 3xHA-Klf1 ChIP 피크는 klf1 -ON 심실에서 특이적으로 검출되었다(도 15A). 이들 피크는 항-HA 항체를 사용한 Klf1 정제의 특이성을 검증하는 KLF1 모티프(도 15B)에 대해 가장 유의하게 많았다. Klf1 피크 아래의 잠재적인 표적 유전자를 GREAT(genomic regionenrichment of annotations tool) 로 분석하고 심장 근육 발달을 포함한 기관형성 경로에 관여하는 유전자를 확인했다(도 15C).
Klf1 결합 부위를 특성화하기 위해, 활성 프로모터 마크(히스톤 H3K4me3)에 대한 ChIP-seq 및 활성 인핸서 마크(히스톤 H3K4me1 및 H3K27ac)를 수행하고 Klf1 피크에 대해 얻은 히스톤 피크를 플롯팅하였다(도 15D). 예기치 않게, 활성 프로모터에서 Klf1 피크의 작은 부분(98개 피크, 8.6%)만 발견되었고, 나머지 대다수(1,039개 피크, 91.4%)는 활성 인핸서에 있었으며, 이는 klf1 또는 심근 형성 반응의 발현과 관계없이, 구성적으로 H3K27ac 및 H3K4me1(도 15D)뿐만 아니라 DNA 메틸화(5-메틸시토신, 5mC, 도 15D)의 감소로 표시되었다. 또한, 이전에 공개된 데이터 세트와 본 발명자의 데이터를 상호참조하면 Klf1 표적 인핸서가 수정 후 48시간(hpf)만큼 일찍 활성화된 후성 유전학적 프로파일을 얻었고, 일부 Klf1 표적 부위는 VISTA 인핸서 브라우저의 기능적으로 검증된 발달-활성 인핸서 게놈 위치와 일치함을 보여주었다. 이러한 데이터는 Klf1이 성체 심근세포에서 발달적으로 활성화되고 구성적으로 활성인 인핸서를 우선적으로 표적화한다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용한 트랜스포사제-접근성 염색질에 대한 검정으로 klf1-ON 심장에서 염색질 접근성의 전역적 변화를 평가하였다. 놀랍게도, 차등적으로 풍부한 ATAC 피크의 대부분은 H3K27ac의 감소(도 15F) 및 인근 유전자의 전사(도 15G)를 수반하는 klf1 -ON 심장(도 15E)의 감소된 염색질 접근성 영역에 달려 있었다. 놀랍게도, 접근성이 감소된 영역은 MEF2C, GATA4, MEF2A 및 NKX2.5의 결합 부위에 대해 풍부해졌으며(도 15H), 이는 심장 세포 운명, 구조 및 형태 형성, 수축성 유전자 발현을 제어하는 핵심 심장 조절 네트워크를 포함한다. 이 결과와 일치하게, 심장 조직 발달을 조절하는 경로는 감소된 접근성 영역과 가장 유의하게 연결되었다(도 15I). 더욱이, klf1 -ON 심실의 RNA-seq 분석은 심근세포 역분화 마커 유전자가 상향조절되는 반면 심근 구조 및 조절 유전자는 완전히 하향조절된다는 것을 보여주었다(도 15I). 종합하면, 이 데이터는 심근세포 역분화 모델을 보여준다. Klf1은 성인 심장의 기존 심근 인핸서에 결합하고 핵심 심장 전사 인자 결합 부위에서 염색질 접근성을 감소시켜 심장 근육 발달 및 기능을 제어하는 유전자 프로그램을 억제한다.
실시예 11: Klf1은 다양한 세포 주기 유전자를 상향조절하여 심근세포 증식 및 분열을 촉진한다
klf1 -ON 심장에서 증가된 심근세포 증식에 대한 조직학적 증거와 일관되게(도 12D, E), 본 발명자들은 klf1 과발현으로 상향조절된 유전자 서명의 대부분이 세포 주기 기구와 관련되어 있음을 발견하였다(도 16A, B). klf1 -ON 심장에서 DNA 복제, 세포 주기 및 세포질 분열의 필수 조절인자를 암호화하는 유전자 발현의 강력한 증가가 관찰되었다(도 16C, D). 참고로, 본 발명자들은 Cdk 억제제 유전자(cdkn1ca)의 발현은 하향 조절되는 반면, 사이클린 D (ccnd1, ccnd2a, ccnd2b ), 사이클린 E(ccne1, ccne2 ), 사이클린 A(ccna2 ), 및 사이클린 B(ccnb1, ccnb2 ) 및 사이클린 의존성 키나제(cdk1, cdk2 ) 와 같은 많은 유형의 사이클린을 코딩하는 유전자에 대해서는 상당한 상향 조절을 확인했다. 이들 사이클린 유전자 중, 본 발명자들은 ccnd1 및 ccnd2a 유전자의 Klf1 결합 조절 영역을 검출하여 Klf1이 D형 사이클린의 발현을 직접적으로 조절함을 확인하였다.
본 발명자들은 또한 Hippo-yes-associated protein(YAP) 경로 및 Neuregulin-ErbB2 경로와 같은 성체 심근생성을 위한 공지된 유전자 경로와 Klf1의 상호작용을 분석하였다. klf1 -ON 및 klf -OFF 심장의 RNA-seq 데이터를 사용한 유전자 세트 농축 분석을 수행하였고, klf1 과발현과 함께, Hippo 경로(도 19A)의 유전자 서명의 상당한 농축을 감지하였지만, ErbB 경로의 유전자 서명은 그렇지 않았다(도 19B). 본 발명자들은 이들 경로의 억제가 klf1 -ON 심장에서 심근세포 증식에 영향을 미치는지 여부를 평가하였고 ErbB (Fig. 19D)의 약리학적 억제가 아닌, YAP(도 19C)의 약리학적 억제가 klf1 -ON 심장에서 심근세포 증식을 유의하게 감소시킨다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 Klf1이 부분적으로 Hippo-YAP 경로를 통해 심근세포 증식을 매개한다는 것을 보여준다. 많은 YAP 표적 유전자의 발현은 klf1-ON 심장에서 증가했지만 핵심 Hippo 경로 구성 요소를 인코딩하는 유전자의 발현은 크게 변하지 않았고, Klf1 피크는 이러한 핵심 구성 유전자에서 발견되지 않았으며(데이터는 표시되지 않음), Klf1이 간접적인 메커니즘을 통해 Hippo-YAP 경로를 활성화함을 입증하였다.
실시예 12: Klf1은 강력한 심근세포 증식을 지원하기 위해 대사 재프로그래밍을 유도한다
klf1 -ON 심장에서 하향조절되는 유전자 서명의 대부분은 미토콘드리아 대사 및 바이오에너지 생산과 관련이 있었다(도 16A, B, E). klf1 -ON 심근의 TEM 분석은 감소된 크리스타 및 확대된 기질을 갖는 미토콘드리아를 나타내었으며(도 16F), 이는 배아 및 신생체 마우스 심장에서 기능적으로 미성숙한 미토콘드리아의 것과 유사한 형태학적 표현형이다. 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 함량은, 또한 트리카르복실산(TCA) 주기 및 산화적 인산화와 같은 미토콘드리아 에너지 대사를 조절하는 유전자의 전체적인 하향조절과 함께, klf1 -ON 심장에서 상당히 감소했다(도 16G). NADH, NAD+ 및 ATP와 같은 이러한 경로의 주요 대사 산물은 또한 klf1 -ON 심장에서 상당히 감소되어(도 16H-K), klf1 과발현 동안 미토콘드리아 에너지 대사 감소에 대한 추가 증거를 제공하였다. 이러한 데이터는 다른 심장 형성 경로와 유사한 Klf1 경로가 출생 후 심근 세포에서 세포 주기 정지에 대한 주요 메커니즘인 OXPHOS를 약화시켜 심근 세포 증식을 촉진한다는 것을 나타낸다.
Klf4는 미토콘드리아 생합성 및 자가포식 제거(autophagic clearance) 를 조절함으로써 심장 미토콘드리아 항상성을 조절하는 것으로 나타났다. 우리는 klf1 -ON 심장에서 자가포식(autophagy) 유전자의 상당한 농축이나 자가포식 플럭스의 증가를 감지하지 못했다. 오히려, klf1 -ON 심장에서 우리는 미토콘드리아 항상성과 기능을 조절하는 핵 유전자의 발현에서 상당한 감소를 발견했다(도 16L). 참고로, 우리는 미토콘드리아 생합성 및 산화 기능을 제어하는 마스터 조절 전사 인자인 PPARγ 공활성자-1α (PGC-1α/PPARGC1a)를 코딩하는 유전자의 하향조절을 발견했다(도 16L). 우리는, 또한 ppargc1a 유전자의 인핸서에서 Klf1 ChIP 피크 와 klf1 -ON 심장에서 H3K27ac 수준의 감소를 발견했는데, 이는 Klf1이 ppargc1a의 발현을 직접적으로 감소시켜 미토콘드리아 기능을 조절하는 메커니즘을 나타낸다.
OXPHOS에서 호기성 해당(glycolysis) 작용으로의 에너지 생산 전환은 암세포와 같은 고도로 증식하는 세포 를 지원하며 최근에는 심근 재생도 지원하는 것으로 나타났다. 그러나 해당 효소 유전자의 발현은 klf1 -ON 심장에서 하향 조절되어 kfl1 -ON 심근 세포가 증식을 지원하기 위해 다른 대사 메커니즘을 사용함을 보여준다. Klf1의 대사 역할에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해 7 dpt에서 klf1 -ON 및 OFF 심실의 대사체를 분석했다. 우리는 글루코오스 6-인산(도 16M)과 젖산염의 상당한 감소를 발견했으며, 이는 klf1 -ON 심장에서 해당 작용의 하향 조절을 확인시켜준다. 대조적으로, 5탄당 인산 경로(PPP; 도 16N, O, Q, S) 및 세린 합성 경로(SSP; 도 16P)의 주요 대사 산물과 그 조절 효소에 대한 유전자는 klf1 - ON 심장에서 상향조절되었고, 이는 klf1 과발현이 해당 경로로부터 PPP 및 SSP로 글루코오스 대사의 발산을 유도한다는 것을 보여준다. 암에서, PPP와 SSP는 세포 증식과 성장을 지원하는 거대분자(예: 핵산, 아미노산) 및 항산화제(예: NADPH)의 합성에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 우리의 데이터는 Klf1이 심근세포의 광범위한 증식에 필요한 바이오매스 및 항산화 방어를 제공하기 위해 산화 호흡 경로의 대사 재배선을 유도함을 나타낸다.
실시예 13: 마우스 심장에서 Klf1의 보존된 재생 기능
마우스 심장에서 Klf1의 기능을 조사하였다. RT-qPCR을 사용하여, 심근경색증(MI) 후 신생아 마우스 심장에서 마우스 Klf1 (mKlf1 ) 유전자 발현의 유의한 상향조절이 검출되었다(도 17A). 고해상도 인시츄 혼성화는 경색 영역에 인접한 심근에서 심장 트로포닌 T(TnT) 염색과 mKlf1 mRNA의 공동 국소화를 감지했다. 이러한 발견은 제브라피쉬 심장과 유사하게 mKlf1 발현이 부상시 신생체 마우스 심장에서 유도됨을 나타낸다. 그러나, mKlf1 유전자의 발현은 MI 후 성체 마우스 심장에서 유의하게 상향조절되지 않았고(도 17A), 연령에 따른 재생 능력의 손실에 기여하였다.
mKlf1 발현이 성체 마우스 심장에서 재생 능력을 해제하는지 여부를 다루기 위해, 우리는 심장초음파검사에 의해 기준 심장 기능을 측정한 후 MI를 유도하고 대조군 리포터(Ad-GFP; 도 17B) 또는 mKlf1 구성체(Ad -mKlf1, 도 17B)를 보유하는 아데노바이러스 벡터를 MI 심장의 경색-주변 심근 내로(도 17C, D) 주입했다. 심장 초음파를 사용하여, 3dpi에서 두 그룹 모두에서 좌심실 박출률(도 17E)과 분획 단축률(도 17F)의 현저한 감소를 관찰했고, 이러한 코호트에서 MI의 유도를 확인한다. 시간 경과에 따른 심초음파 분석에서, 대조군 심장의 심장 기능은 28dpi에서 더 감소했으며(도 17E, F), 이는 허혈성 심부전의 발병을 나타내는 것이었다. 대조적으로, Ad-mKlf1 처리된 심장의 심장 기능은 7 dpi에서 크게 개선되어 14 dpi까지 기준선 수준의 거의 50%로 회복되었으며(도 17E-G), 대조군에 비해 상당한 개선이 28dpi에서 유지되었다(도 17G, H).
이러한 결과와 일치하게, 조직학적 분석은 대조군 심장이 심각한 심장 리모델링을 진행하는 동안, mKlf1 처리된 심장은 28 dpi에서 흉터가 유의하게 덜하면서 현저하게 더 나은 심장 형태(도 17H, I)를 유지했음을 보여주었다. 17H, J). 우리는 밀 배아 응집소(WGA)에 의해 캡슐화된 TnT+ 영역으로 정의되는 심근 세포 크기를 측정했으며, 심근 세포가 Ad-mKlf1 처리된 심장의 경계 구역 심근을 따라 상당히 더 작다는 것을 발견했다(도 17K), 이는 mKlf1 형질도입이 심근세포 증식을 유도함을 나타낸다. 이러한 관찰과 일치하게, 우리는 또한 세포 증식 마커 Ki67(도 17L), S-상 마커 EdU(도 17M) 및 유사분열 마커 pHH3(도 17N)로 공동표지된 TnT+ 심근세포의 수의 상당한 증가를 발견했다. Ad-mKlf1 형질도입이, 성체 마우스에서 재생성이 높은 기관인 간에 미치는 영향을 평가했다. 세포 증식의 유의미한 변화는 관찰되지 않았으며(도 18A), 이는 Klf1의 재생 촉진 기능이 심장에 특이적임을 나타낸다. 함께, 이러한 데이터는 제브라피쉬 Klf1과 유사하게 마우스 Klf1이 성체 심장에서 재생 촉진 기능을 갖고 포스트 MI 심장에서 복구를 유도한다는 것을 보여준다.
이들 데이터는 생존-전 경로가 Ad-mKlf1 주사에 의한 MI-후(post-MI) 심장의 회복에서 주요 역할을 할 가능성이 없음을 나타낸다. 제브라피쉬의 klf1 -ON 심장에서 증가된 혈관구조의 관찰과 유사하게 (도 13A), 마우스에서 Ad-mKlf1 처리된 심장의 상처 부위 근처에서 훨씬 더 많은 관상 혈관이 관찰되었다(도 18B). 이러한 데이터는 제브라피쉬 심장과 유사하게 마우스 심장에서 Klf1 경로의 활성화가 관상동맥 혈관계를 포함하는 재생 프로그램을 자극하고 혈관의 증가가 적어도 부분적으로 Klf1 과발현으로 더 나은 복구에 기여함을 나타낸다. 종합하면, 우리의 데이터는 성체 포유동물에서 Klf1의 심근 역할이 약화되지만, 외인성 Klf1의 투여는 심장 재생을 다시 시작하므로 KLF1은 손상된 인간 심장의 절약된 심근 내에서 심장 근육을 회복시키는 적합한 치료 전략임을 나타낸다.
실시예 14: 방법
14.1 동물
4 개월에서 12개월 사이의 외래종 Ekkwill(EK) 백그라운드 균주의 야생형 및 유전자 변형 제브라피쉬가 이 연구에서 사용되었다. klf1 ct 계통을 제외한 모든 형질전환 균주는 반접합체(hemizygotes)로 분석되었다. 이 연구에 사용된 공개된 유전자 변형 계통은 다음과 같다.
Tg ( cmlc2:EGFP ) - Burns, CG et al. Nat Chem Biol 1, 263-264 (2005),
TgBAC ( tcf21:DsRed2 ) - Kikuchi, K. et al. Development 138, 2895-2902 (2011),
Tg ( fli1a:EGFP ) - Lawson, ND 및 Weinstein, BM Dev Biol 248, 307-318 (2002),
Tg ( cmlc2:CreER ) - Kikuchi, K. et al., et al. Nature 464, 601-605 (2010),
Tg ( bactin2:loxP - mCherry -STOP- loxP - DTA176 ) - Wang, J. et al. Development 138, 3421-3430 (2011),
Tg ( gata4:EGFP ) - Heicklen-Klein & Evans. Dev Biol 267, 490-504(2004), 및
Tg ( ubb:iCRE - GFP ) - Sugimoto, K. et al Elife 6, e24635 (2017).
새로운 형질전환 균주의 생성에 대한 세부사항은 아래에 설명되어 있다. 물고기를 리터당 대략 5마리의 물고기로 수용하였고 매일 3번 먹이를 주었다. 수온은 28℃로 유지하였다. 이전에 설명한 대로, 트리카인으로 마취된 제브라피쉬에서 절제 손상을 수행하였다(Poss, K. D., Wilson, L. G. & Keating, M. T. Science 298, 2188-2190 (2002)). 유전적 심근세포 고갈은 기술된 바와 같이 수행되었다 (Wang, J. et al. Development 138, 3421-3430 (2011)).
8주 내지 12주령 범위의 수컷 C57BL/6J 마우스를 본 연구에 사용하였다. 마우스를 12:12시간 명암 주기로 랙에 있는 케이지당 최대 5마리의 마우스에 수용하고 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 했다. 모든 동물 실험은 기관 및 국가 동물 윤리 지침에 따라 수행되었으며 Garvan Institute of Medical Research/St Vincent's Hospital 동물 윤리 위원회의 승인을 받았다.
14.2 심근경색
MI는 이전에 설명한 대로 자일라진(13mg/kg) 및 케타민(100mg/kg)의 복강내 주사에 의해 마취된 마우스에서 수행하였다(Naqvi, N. et al. Cell 157, 795-807(2014)). 마취된 마우스는 산소 내 1.5%-2% 이소플루란(분당 120회 스트로크에서 0.5mL 스트로크 부피)이 있는 미니 환기 인공호흡기(Harvard Apparatus, Hollistion, MA, USA)를 사용하여 환기되었다. 네 번째 늑골 공간이 열리고 테이퍼 바늘에 8-0 프롤렌 봉합사를 사용하여 좌전하행(LAD) 동맥을 영구적으로 결찰하고, 가슴을 6-0 프롤렌 봉합사로 닫았다.
14.3 actb2:BS - klf1 , klf2a , klf2b 및 klf4의 생성
TagBFP cDNA를 pTagBFP-C(Evrogen, Moscow, Russia)로부터 PCR 증폭하였고, 3xHA-tag는 Ultramer Oligo Synthesis(IDT Technologies, Coralville, IA, USA)를 사용하여 합성하였다. actb2:loxP - DsRed -STOP- loxP - EGFP 구조체의 DsRed 및 EGFP (Kikuchi, K. et al., et al. Nature 464, 601-605(2010))는 각각 TagBFP 및 3xHA-tag로 대체되었다. Klf1, Klf2a, Klf2b 및 Klf4 cDNA는 야생형(Ekkwill) 제브라피쉬 cDNA 라이브러리를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었고 3xHA 태그를 사용하여 다운스트림 및 인-프레임 복제되었다. 각각의 구성체에서, 전체 카세트는 메가뉴클레아제 방법을 사용하여 형질전환을 위한 I- Sce I 부위에 인접하였다(Thermes, V. et al. Mech Dev 118, 91-98(2002).). 이러한 형질전환 계통의 전체 명칭은 다음과 같다. Tg (actb2:loxP-TagBFP-STOP-loxP-3xHA-klf1) vcc29 :Tg(actb2:loxP-TagBFP-STOP-loxP-3xHA-klf2a) vcc36 :Tg(actb2:loxP-TagBFP-STOP-loxP-3xHA-klf2b) vcc38 : 및 Tg(actb2:loxP-TagBFP-STOP-loxP-3xHA-klf4) vcc35 . 각 계통에 대해 최소 2개의 기본 계통을 분리하고 cmlc2:CreER과 교차시켜 3xHA-태그에 대한 면역형광 염색을 통해 성체 심장에서 Klf1, Klf2a, Klf2b 및 Klf4 단백질의 발현을 조사했다. 3xHA-Klf1과 유사하거나 더 높은 수준에서 3xHA-Klf2a, Klf2b 또는 Klf4를 발현하는 라인이 본 연구에 사용되었다.
14.4 actb2:BS - dn - klf1의 생성
Klf1의 우성-음성 형태는 Klf5의 우성-음성 형태의 구축에 사용된 전략에 기초한 EnR(engrailed repressor domain)을 사용하여 생성되었다(Oishi, Y. et al. Cell Metab 1, 27-39(2005)).
EnR를 pCS2-EnR로부터 PCR 증폭하였고 Klf1 cDNA의 5' 말단으로 인-프레임 융합되었다. p026 pCS2-EnR은 Ramesh Shivdasani 박사의 선물이었다(Addgene 플라스미드 #11028; http://n2t.net/addgene:11028; RRID: Addgene_11028). 생성된 EnR-Klf1 키메라 유전자는 actb2 : loxP - TagBFP -STOP- loxP 백본 구성체의 loxP-플랭크 STOP 카세트의 다운스트림에 클로닝되었다. 전체 카세트는 메가뉴클레아제 방법을 사용한 형질전환을 위한 I- Sce I 부위와 플랭킹되었다. 이 형질전환 계통의 전체 이름은 Tg(actb2:loxP-TagBFP-STOP-loxP-dn-klf1) vcc22 이다.
14.5 ubb:loxP - TagBFP -STOP- loxP - EGFP의 생성
이 형질전환 구조체는 Red/ET 재조합(GeneBridges, Heidelberg, Germany)을 사용하여 ubb 번역 시작 코돈 뒤에 loxP-TagBFP-STOP-loxP-EGFP 카세트를 CH211-202A12 BAC에 삽입하여 생성되었다. 최종 구조체를 정제하고 SfiI로 선형화하고 단일 세포 단계 배아에 주입했다. 이 형질전환 계통의 전체 명칭은 TgBAC(ubb:loxP-TagBFP-STOP-loxP-EGFP) vcc18 이다.
14.6 klf1 -ER의 생성
3 xHA -Klf1 cDNA를 actb2:BS - klf1 구조체로부터 PCR 증폭하고 5.1kb cmlc2 프로모터의 다운스트림에 서브클로닝하였다. 인간 에스트로겐 수용체(ER) cDNA를 pBabepuro-myc-ER에서 PCR 증폭하고 3xHA-Klf1으로 다운스트림 및 인-프레임으로 서브클로닝했다. pBabepuro-myc-ER은 Wafik El-Deiry의 선물이었다(Addgene plasmid #19128; http://n2t.net/addgene:19128; RRID:Addgene_19128). 렌즈 형광에 의해 형질전환 동물의 시각적 식별을 가능하게 하는 렌즈-특이적 α A-크리스탈 린 프로모터에 의해 제어되는 TagBFP 카세트도 반대 방향으로 cmlc2 프로모터의 상류에 삽입되었다. 전체 카세트는 메가뉴클레아제 방법을 사용한 형질전환을 위한 I- Sce I 부위와 플랭킹되었다. 이 형질전환 계통의 전체 이름은 Tg ( cmlc2:3xHA -klf1-ER; cryaa:TagBFP) vcc32 이다.
14.7 조건부 klf1 대립유전자의 생성
pZwitch는 TagRFP 서열 및 5x BGHpA의 2 반복을 제거하여 크기를 줄이도록 수정되었다. 생성된 플라스미드를 pZwitch2로 명명했다. 상동성 서열의 LA 및 RA는 LA 증폭 프라이머 klf1-LA-F 및 klf1-LA-R 및 RA 증폭 프라이머 klf1-RA-F 및 klf1-RA-R를 사용하여 성체 야생형 제브라피쉬(EK)에서 분리된 게놈 DNA로부터 증폭되었다. LA 및 RA PCR 산물은 제한 효소 분해를 통해 pZwitch2의 해당 제한 효소 부위에 클로닝되었다. 결과 제품인 pZwitch2-klf1-int1은 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)와 함께 단일 세포 단계 배아에 공동 주입되었고, 주입된 배아는 이전에 설명된 대로 파운더 피쉬를 식별하기 위해 스크리닝되었다(Sugimoto, K. et al Elife 6, e24635(2017)). 이 형질전환 계통의 전체 이름은 Tg ( klf1:Zwitch2 ) vcc33Gt 이다.
플래티넘 TALEN을 구성하는 데 사용된 TALEN 키트는 Takashi Yamamoto 박사의 선물이었다(Addgene kit #1000000043). 서던 블롯팅은 Prime-a-Gene Labeling System(Promega, Madison, WI, USA)으로 방사성 표지된 프로브를 사용하여 수행되었다. 검출 프로브는 야생형 게놈 DNA와 증폭 프라이머 klf1-probe-F 및 klf1-probe-R을 사용한 PCR을 사용하여 생성되었다(보충 표 1). DNA 밴드는 FLA-5100 바이오 이미징 분석기(FujiFilm, Tokyo, Japan)에서 이미지화되었다.
14.8 RT- PCR
TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하고, 이어서 Transcriptor 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트(Roche, Basel, Switzerland) 또는 SensiFAST cDNA 합성 키트(Bioline, Eveleigh, Australia)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RT-qPCR은 LightCycler 480 System(Roche) 또는 CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. cDNA의 총량은 RT-qPCR 실험에서 actb2 또는 rpl13a 증폭으로 정규화되었다. 모든 RT-qPCR 분석은 SYBR Select Master Mix(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 또는 TaqMan Universal Master Mix(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행되었다. 프라이머에 대한 자세한 내용은 보충 표 1을 참조하라.
14.9 세포 분류
심근세포, 심내막 세포 및 심외막 세포를 각각 cmlc2:EGFP, tcf21:DsRed2 또는 fli1a:EGFP를 보유하는 형질전환 리포터 제브라피쉬의 심실로부터 설명된 바 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 정제하였다(Hui, SP et al. Dev Cell 43, 659-672.e5(2017)).
14.10 제자리 혼성화
제브라피쉬 klf1 및 마우스 Klf1 mRNA를 RNAscope 프로브(Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA)를 사용하여 검출하였다. 제브라피쉬 klf1 및 마우스 Klf1 RNAscope 프로브는 Advanced Cell Diagnostics에서 설계 및 합성되었다. RNAscope 2.5 HD Detection Kit-Red(Advanced Cell Diagnostics)에 대한 제조업체 프로토콜을 사용하여 신호를 감지한 다음 항트로포닌 C 또는 항트로포닌 T 항체를 사용한 면역형광법을 사용했다. 이미징은 설명된 대로 Zeiss LSM 710 공초점 현미경으로 수행되었다(Hecksher-Sørensen, J. & Sharpe, J. Mech Dev 100, 59-63(2001)).///2.26
14.11 조직학적 분석
Picro-Mallory 염색, 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) 염색 및 Gomori-trichrome 염색을 수행했다. 면역형광은 이전에 설명한 바와 같이, 파라포름알데히드로 고정된 10μm 동결절편에서 수행하였다(Hui, SP et al. Dev Cell 43, 659-672.e5(2017)). 보충 표 2는 이 연구에 사용된 1차 및 2차 항체의 세부 정보를 보여준다. 배아의 헤모글로빈 염색은 Detrich et al. Proc Natl Acad Sci USA 92, 10713-10717(1995)에 기술된 o-Dianisidine을 사용하여 수행하였다.
14.12 현미경
Picro-Mallory, DAB 또는 Gomori-trichrome 방법으로 염색된 섹션을 Leica DM4000 B 현미경(Leica Camera AG, Wetzlar, Germany)에서 이미지화했다. 면역형광 섹션은 Zeiss AXIO imager M1 현미경(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)을 사용하여 이미지화하였고 공초점 이미지는 Zeiss LSM 710 공초점 현미경(Carl Zeiss AG)으로 촬영하였다. 제브라피쉬 배아의 전체 마운트 이미지는 MVX10 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 촬영했다.
14.13 투과전자현미경
제브라피쉬 심실을 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액 중 2.5% 글루타르알데히드로 고정하고 PELCO BioWave 마이크로웨이브 프로세서(Ted Pella Inc., Redding, CA, USA)에서 새로운 고정액으로 다시 고정했다. 후고정은 카코딜레이트 완충액에서 1% OsO4 로 수행하였다. 조직을 Procure 812 수지(ProSciTech, Kirwan, Australia)로 포매하고 Leica Ultracut EM UC6(Leica Camera AG)을 사용하여 절단했다. 초박형 섹션을 구리 그리드에 수집하고 FEI Tecnai G2 20 투과 전자 현미경(FEI company, Hillsboro, OR, USA)에서 200kV로 이미지화했다.
14.14 4-HT 투여
제브라피쉬를 설명된 대로 10-12시간 동안 오버나잇으로 5μM 4-HT가 보충된 수족관 물의 작은 비커에 넣었다(Kikuchi, K. et al. Development 138, 2895-2902(2011)). 제브라피쉬를 신선한 수족관 물로 헹구고 먹이를 위해 순환 수계로 되돌려 놓았다. 이 주기는 여러 처리에 대해 반복되었다. 제브라피쉬 배아는 먹이를 주지 않는다는 점을 제외하고는 유사하게 처리되었다.
14.15 EdU 분석
klf1-OFF 및 ON 피쉬는 4-HT 처리 후 5, 6 및 7일에 매일 1회 50 μL의 8 mM EdU를 복강내 주사하였다. 마우스의 경우 MI 수술 후 1주일 후에 삼투성 미니펌프(ALZET, Charles River, MA, USA)를 피하 이식하고 EdU를 7일 동안 매일 10mg/kg으로 주입했다.
14.16 심근 역분화의 정량화
미오신 중쇄(MHC) 및 Sm22로 공동 표지된 제브라피쉬 심실 조직을 ImageJ(NIH, Bethesda, MD, USA)에 의해 픽셀 단위로 정량화되었다. 총 MHC+ 면적도 픽셀로 정량화하고 총 MHC+ 면적당 Sm22+ MHC+ 면적의 백분율을 결정했다. 각 심장에 대해 3개의 선택된 섹션을 분석했다. Alcam의 심근 발현은 트로포닌 C가 심근에 대한 마커로 사용되었다는 점을 제외하고는 유사하게 정량화되었다.
14.17 제브라피쉬 심장에서 심근세포 증식의 정량화
PCNA+ 심근세포를 이전에 기재된 바와 같이, 손상된 심장에서 정량화하였다(Hui, SP et al. Dev Cell 43, 659-672.e5(2017)). 간단히 말해서, 손상 경계 영역 영역의 이미지를 Zeiss AXIO imager M1 현미경(수직으로 약 185μm)을 사용하여 촬영하였고 Mef2+ 및 Mef2+ PCNA+ 세포의 수를 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 수동으로 계산하였다. 각 심장에 대해 3개의 선택된 섹션을 분석했다. 손상되지 않은 심실의 정량화는 중간 심실 심근의 이미지(세로 490μm × 가로 420μm)를 정량화에 사용한 것을 제외하고 유사하게 수행되었다.
손상되지 않은 제브라피쉬 심실의 EdU+ 심근 세포를 정량화하기 위해, 전체 심근 두께에 걸친 z-스택으로 중간 심실 심근의 공초점 이미지(세로 490μm × 가로 420μm)를 촬영했다. cmlc2:EGFP+ 심근 내에 임베딩된 EdU+ 핵의 수를 수동으로 계산하고 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 정량화된 총 cmlc2:EGFP+ 면적으로 정규화했다. 각 심장에 대해 3개의 선택된 섹션을 분석했다. pHH3+ 심근세포의 정량화는 전체 심실 내의 pHH3+ 핵을 세는 것을 제외하고 유사하게 수행하였다.
14.18 마우스 심장에서 심근세포 증식의 정량화
Ki67+ 심근세포의 정량화를 위해, 흉터 조직에 인접한 영역의 단면 이미지를 유두(papillary) 근육 수준에서 촬영하였다. 흉터로부터 약 700 μm 거리 내의 영역 안 건강한 심근으로 정의된 상처 경계대 심근(the injury border zone myocardium)의 Ki67+ 핵의 수를 수동으로 계산했다. WGA 염색으로 둘러싸인 Ki67+ 핵은 비-심근세포로 정의되고 계산에서 제외되었다(Ang, KL et al. Am J Physiol Cell Physiol 298, C1603-9(2010)). 숫자는 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 정량화된 총 트로포닌 T+ 영역으로 정규화되었다. EdU+ 심근세포 또는 pHH3+ 심근세포의 정량을 유사하게 수행하였다.
14.19 심근세포 수 및 크기 측정
제브라피쉬 배아의 심근세포 수를 이전에 설명한 대로 정량화하였다(Sugimoto, K. et al Elife 6, e24635 (2017)). 성체 심장의 심근세포 수는 다음과 같이 측정하였다. 심실을 5분 동안 3% PFA에서 간단히 고정하고 4℃에서 밤새 1 mg/mL 콜라게나제 유형 4(Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA)와 함께 PBS에서 인큐베이션했다. 해리된 세포를 PBS에 재현탁하고 가장자리가 정의되고 줄무늬가 명확한 막대 모양의 세포를 혈구계를 사용하여 수동으로 심근 세포로 계산했다.
심근 세포 크기를 측정하기 위해, 제브라피쉬 심실을 3% PFA에서 5분 동안 고정하고 1 mg/mL 콜라게나아제 유형 4(Worthington Biochemical)가 보충된 PBS에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 부드러운 피펫 분쇄로 심장 세포를 해리한 후 세포를 PBS에 재현탁하고 Cyto-Tek Cytocentrifuge (Sakura Finetek, Tokyo, Japan)를 사용하여 슬라이드에 침착시킨 다음 항 α-액티닌 항체를 사용하여 면역 형광법을 시행했다(보충 표 2). ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 각 심근세포의 크기를 측정하기 위해 α-액티닌+ 세포의 공초점 이미지를 사용했다.
14.20 심실 면적 측정
성체 제브라피쉬 심실의 섹션을 Picro-Mallory 염색하고 심실 근육 영역은 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 정량화하였다. 각 심장에 대해 3개의 선택된 섹션을 분석했다.
실시예 15: 요약
본 개시내용은 성체 심근세포의 재생 적응성에서 Klf1에 대한 기능을 제공한다. Klf4의 도메인 구조와 유사함에도 불구하고. Klf1은 세포 재프로그래밍에서 Klf4의 알려진 기능과 완전히 다른 메커니즘으로 심근 세포 적응성(plasticity)을 조절한다. Klf4는 메틸화된 DNA에 결합하는 능력을 가지고 있으며, 만능 유전자의 발현을 유도하는 개척 인자로서 침묵 염색질을 표적으로 한다. 대조적으로, Klf1은 저메틸화되고 구성적으로 활성인 심근 인핸서와 연관되고, 심근 발달 및 기능을 조절하는 핵심 전사 인자에 대한 결합 부위에서의 염색질 접근성을 감소시킨다. 최근에, 활성 염색질의 게놈 전체 감소는 제브라피쉬에서 심근세포 재생 동안 발생하는 것으로 나타났다. 본원에 제시된 데이터는 이러한 발견을 뒷받침하고, Klf1이 심근세포 역분화를 유발하는 심근 유전자 프로그램의 전체적인 억제에서 핵심적인 역할을 한다는 것을 추가로 보여준다.
본원에 제시된 데이터는 Klf1이 부분적으로 YAP를 통해 심근세포 증식을 유도함을 나타낸다(도 19A, C). YAP의 심근 활성화는 세포골격 및 근절(sarcomeric) 변화로 인한 기계적 신호에 의해 조절된다. Klf1은 심장 근육 수축 및 액틴 세포골격 조직을 제어하는 유전자의 하향 조절에 의해 유도된 근절의 감소의 결과로 Hippo 신호 전달을 활성화할 수 있다(도 15H, I). Klf1 ChIP-seq의 모티프 분석은 YAP 보조인자, TEA 도메인 전사 인자 4(TEAD4)의 결합 부위에 대한 강화를 확인했으며(도 15B), 이는 이 작용에 대한 하나의 메커니즘이 핵에서 YAP-TEAD4 복합체와의 결합을 통해 Hippo 경로를 조절하는 Klf1과 연관됨을 나타낸다.
Klf1은 세포 호흡 경로에서 5탄당 인산 경로(PPP) 및 세린 합성 경로(SSP)로의 성체 심근세포의 대사 재프로그래밍을 유도한다. 이들은 거대분자 및 항산화제의 합성을 상향 조절하여 klf1 -ON 심근세포가 광범위한 증식을 겪도록 돕고, 이는 심근세포 재생 요법에서 이러한 경로를 표적으로 할 가능성을 나타낸다. 그러나, PPP와 SSP는 ATP를 생성하지 않으며 이러한 경로의 지속적인 활성화는 에너지 결핍(도 16K)과 치명적인 심장 기능 장애(도 14A, B)로 이어질 가능성이 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Victor Chang Cardiac Research Institute National Cerebral and Cardiovascular Center <120> KLF INDUCED CARDIOMYOGENESIS <130> 120948503 <150> 2019902703 <151> 2019-07-30 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Thr Ala Glu Thr Ala Leu Pro Ser Ile Ser Thr Leu Thr Ala 1 5 10 15 Leu Gly Pro Phe Pro Asp Thr Gln Asp Asp Phe Leu Lys Trp Trp Arg 20 25 30 Ser Glu Glu Ala Gln Asp Met Gly Pro Gly Pro Pro Asp Pro Thr Glu 35 40 45 Pro Pro Leu His Val Lys Ser Glu Asp Gln Pro Gly Glu Glu Glu Asp 50 55 60 Asp Glu Arg Gly Ala Asp Ala Thr Trp Asp Leu Asp Leu Leu Leu Thr 65 70 75 80 Asn Phe Ser Gly Pro Glu Pro Gly Gly Ala Pro Gln Thr Cys Ala Leu 85 90 95 Ala Pro Ser Glu Ala Ser Gly Ala Gln Tyr Pro Pro Pro Pro Glu Thr 100 105 110 Leu Gly Ala Tyr Ala Gly Gly Pro Gly Leu Val Ala Gly Leu Leu Gly 115 120 125 Ser Glu Asp His Ser Gly Trp Val Arg Pro Ala Leu Arg Ala Arg Ala 130 135 140 Pro Asp Ala Phe Val Gly Pro Ala Leu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu 145 150 155 160 Pro Lys Ala Leu Ala Leu Gln Pro Val Tyr Pro Gly Pro Gly Ala Gly 165 170 175 Ser Ser Gly Gly Tyr Phe Pro Arg Thr Gly Leu Ser Val Pro Ala Ala 180 185 190 Ser Gly Ala Pro Tyr Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Ala Met Tyr Pro 195 200 205 Ala Pro Gln Tyr Gln Gly His Phe Gln Leu Phe Arg Gly Leu Gln Gly 210 215 220 Pro Ala Pro Gly Pro Ala Thr Ser Pro Ser Phe Leu Ser Cys Leu Gly 225 230 235 240 Pro Gly Thr Val Gly Thr Gly Leu Gly Gly Thr Ala Glu Asp Pro Gly 245 250 255 Val Ile Ala Glu Thr Ala Pro Ser Lys Arg Gly Arg Arg Ser Trp Ala 260 265 270 Arg Lys Arg Gln Ala Ala His Thr Cys Ala His Pro Gly Cys Gly Lys 275 280 285 Ser Tyr Thr Lys Ser Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His Thr 290 295 300 Gly Glu Lys Pro Tyr Ala Cys Thr Trp Glu Gly Cys Gly Trp Arg Phe 305 310 315 320 Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly Gln 325 330 335 Arg Pro Phe Arg Cys Gln Leu Cys Pro Arg Ala Phe Ser Arg Ser Asp 340 345 350 His Leu Ala Leu His Met Lys Arg His Leu 355 360 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gggactgcag aggatccagg tgtgatagcc 840 gagaccgcgc catccaagcg aggccgacgt tcgtgggcgc gcaagaggca ggcagcgcac 900 acgtgcgcgc acccgggttg cggcaagagc tacaccaaga gctcccacct gaaggcgcat 960 ctgcgcacgc acacagggga gaagccatac gcctgcacgt gggaaggctg cggctggaga 1020 ttcgcgcgct cggacgagct gacccgccac taccggaaac acacggggca gcgccccttc 1080 cgctgccagc tctgcccacg tgctttttcg cgctctgacc acctggcctt gcacatgaag 1140 cgccaccttt gagccctgcc ctggcacttg gactctccta gtgactgggg atgggacaag 1200 aagcctgttt ggtggtctct tcacacggac gcgcgtgaca caatgctggg tggttttccc 1260 acgaatggac cctctcctgg actcgcgttc ccaaagatcc acccaaatat caaacacgga 1320 cccatagaca gccctggggg agcctcttac ggaaaatccg acaagccttc agccacaggg 1380 agccacacag agatgtccaa actgtcgtgc aaacccagtg agacagaccg ccaaataaac 1440 ggactcagtg gacactcaga ccagctccca gatggccctg gacagcagga gagggtgtgg 1500 gatgaggctt cccagagacc ctgggtctag aaagcggctc ctgaaggtcc cttattgtgg 1560 ctgatattaa ctgtcaatgg ttatgggtcc tataaaaatg cccctcccag ataaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1645 <210> 3 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1380 gactggggtg agatttccta agatctagaa gggagcttca cactgtgccc atctgctagg 1440 attgttgtcg ttactataaa aatttcccat ataaaa 1476 <210> 5 <211> 1077 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 atggcctcag ctgagactgt cttaccctcc atcagtacac tcaccaccct gggacagttc 60 ctggacaccc aggaggactt cctcaagtgg tggcggtctg aggagacgca ggatttgggg 120 ccggggcccc cgaatcccac ggggccgtcc catcacgtga gtctgaaatc ggaggaccct 180 tccggagagg acgatgagag ggacgtgacc tgtgcgtggg acccggatct tttccttaca 240 aactttccag gttccgagtc tcccggcact tcccggacct gtgccctggc gcccagcgtg 300 gggccagtgg cacagttcga gccgcctgag tctctgggcg cctatgcggg tggcccaggg 360 ttggtgactg ggcctttggg ctccgaggag cacacaagct gggcgcaccc gactccgaga 420 cccccagccc ctgaaccctt cgtggcccct gccctggccc cgggactcgc tcccaaggct 480 cagccctcgt actccgactc gcgagcgggc tccgtagggg gcttcttccc gcgggcgggg 540 cttgcggtgc ccgcagctcc aggcgccccc tatgggctgc tgtcgggata ccccgcgctg 600 taccccgcgc cacagtacca aggccacttc cagctctttc gcgggctcgc ggcgccttct 660 gctggtccca cggcgccccc ttccttcttg aattgtctgg gacctgggac tgtggccaca 720 gaactcgggg ccactgcgat cgccggagac gcaggcttgt ccccgggaac tgcgccgccc 780 aaacgcagcc ggcgaacttt ggcacctaag aggcaggcgg cacatacgtg cgggcacgaa 840 ggctgcggga agagctacac caagagctcg cacctcaagg cgcacctgcg cacgcacacg 900 ggagagaagc cttatgcctg ctcctgggac ggctgtgact ggaggttcgc tcgctcagac 960 gaactgacgc gccactaccg gaagcacact ggacatcgtc ccttctgctg tggcctctgc 1020 ccacgtgctt tttcacgctc tgaccactta gctctgcaca tgaagcgtca cctctga 1077 <210> 6 <211> 363 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 6 Met Ala Leu Pro Cys Leu Leu Pro Ser Ile Ser Thr Phe Ala Asn Gln 1 5 10 15 Lys Glu Lys Leu Trp Glu Asp Arg Trp Lys Ile Glu Glu His Lys Pro 20 25 30 Leu Asn Ala Ser Cys Pro Pro Leu Asn Val Ala Leu Asn Thr Asp Thr 35 40 45 Cys Arg Gly Arg Lys Asp Asp Glu Asp Leu Ser Asn Tyr Leu Asp Leu 50 55 60 Glu Phe Ile Leu Ala Asn Thr Thr Gly Pro Leu Glu Ala Gly Ala Glu 65 70 75 80 Phe Ile Ser His Ser Glu Pro Cys Gly Met Tyr Ser Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Ser Ser Pro Glu Ala Pro Pro Pro Tyr Gly Leu Met Ala Glu Leu Leu 100 105 110 Arg Ser Asp Val Asp Ser Thr Tyr Asp Thr Thr Val Gln Gly Arg Phe 115 120 125 Leu Leu Asn Ser Ser Gly Phe Pro Arg Gln Glu Phe Pro Glu Ile Lys 130 135 140 Val Glu Pro Pro Met Asp Gly Tyr Gly Pro Val Ile Gly Met Val Pro 145 150 155 160 Gln Thr Cys Gln Lys Ile Lys Gln Glu Gly Asn Val Ser Cys Met Met 165 170 175 Ser Phe Glu Gln Pro Arg Leu Ala Val Ser Pro Gln Ala Thr Gly Asn 180 185 190 Met Thr Pro Pro Leu Ser Pro Asp Asp Ser His Leu Arg Gln Thr Thr 195 200 205 Tyr Thr Gln Ser Tyr His His Ser Pro Pro Ala Tyr Pro Gln Val Pro 210 215 220 Met Gln Phe Thr Ala Pro His Gln Phe Ala Met Tyr Glu Glu Ala Met 225 230 235 240 Gly Met Gln Pro Ser Met Gln Arg Ala Leu Leu Thr Pro Pro Ser Ser 245 250 255 Pro Leu Glu Leu Met Glu Ser Lys Pro Lys Arg Gly Arg Arg Thr Trp 260 265 270 Pro Arg Lys Arg Met Ala Thr His Thr Cys Thr Tyr Ala Gly Cys Gly 275 280 285 Lys Thr Tyr Thr Lys Ser Ser His Leu Lys Ala His His Arg Thr His 290 295 300 Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys Asn Trp Glu Gly Cys Gly Trp Lys 305 310 315 320 Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Phe Arg Lys His Thr Gly 325 330 335 His Arg Pro Phe Gln Cys His Leu Cys Glu Arg Ala Phe Ser Arg Ser 340 345 350 Asp His Leu Ala Leu His Met Lys Arg His Leu 355 360 <210> 7 <211> 3573 <212> DNA <213> Danio rerio <400> 7 ggcacgaggc gcactgtgcc ttatatatag actatctttg ggaactctga acgcggtttc 60 caccgcgcac acaattggtc taggagccgt atttattaag taggaggcgc tccagccggg 120 caaactttgt tcatgactgt ggaagttcac tcgaggaaaa agcgcgcaga cgtttgacat 180 ctcttcagga gcaagtgcat taatactgaa tacacaccga gcacgcgtgg acatggcttt 240 accttgcctt ttgccttcga tttcaacgtt tgcaaaccag aaggagaagc tctgggagga 300 tagatggaag attgaggagc acaaaccact gaacgccagc tgccctccgc tcaacgtggc 360 actgaacaca gacacttgtc gaggccgcaa ggatgacgag gatctcagca attatttaga 420 cctggagttt atcctggcca acaccacggg ccctctggag gccggagccg agttcatctc 480 ccactccgag ccatgcggca tgtactccac tgcagtttac tcatctccag aagcacctcc 540 accatacggc ctcatggcag agctcctgcg atctgatgta gactccacgt atgacaccac 600 agtgcagggg agattcctgc tcaactccag cggcttcccc agacaggagt ttcctgaaat 660 caaagtggag ccgccgatgg atggctacgg tccggtgata ggcatggtgc cacaaacctg 720 ccaaaaaatc aagcaggaag gcaacgtttc atgcatgatg tctttcgagc agcccagact 780 agcagtttct ccgcaggcca ccgggaatat gactcctccg ctgagtcctg acgactccca 840 cctccgtcaa acgacatata cacagagcta ccatcactct cctccggcgt atccgcaggt 900 gccaatgcag ttcacagcgc cacaccagtt tgccatgtat gaggaggcaa tggggatgca 960 acccagcatg cagcgggctc ttctcacccc tccgtcctct ccgttagagc taatggagtc 1020 caaacccaag cgagggcgac gcacctggcc gaggaagcgc atggcgacac atacatgcac 1080 gtacgccggc tgcgggaaga cgtacaccaa aagctcccat ttaaaagcgc atcaccgcac 1140 tcacaccggt gaaaaaccat accactgcaa ctgggaggga tgcggatgga agttcgcccg 1200 ttctgacgag ctgacgcgtc acttccgtaa acacacgggc caccggccgt tccagtgcca 1260 cctgtgtgaa cgtgccttct cccgctccga ccacctggcg ctgcacatga agagacacct 1320 gtgagggccg gatccaccac aactgcctta tttaatgact cttattatat atatatatca 1380 tcatactttt ataacaaagt agctggtact acatagatca cgcagagctc tttttaaggc 1440 ctttttttgg ggttaaaaag catcctgaaa ggctggtcct acgaatcggt gtccaatccg 1500 gagactgtta tgttgaatta acgatgccac aacgagtgca aagcctgacg actagcaaac 1560 caaagtggaa aatgcacaac gatgttgaca atgttttgct cgaaactgcc atgcaacaaa 1620 tgtgtttcat ttttaccagg gctgggagga taaaatcatt attgtgaatc aagaaatgat 1680 tcctacattt tctgaatgca ttgcgatttc cttttgaatc gatttgaagc ttagttttta 1740 ccaccagagg gcactgtatg ctttacacat acaatttaaa tgtaaaacaa ttattaatac 1800 atacatttgt acataaacta gcctagacct ctgttaaaag ttaacctata gtgcgtctgc 1860 tgttaaaaac tagcctagag cgccctctag tgttaaaaac tagcctagag tactgtctgg 1920 tgtttacaaa ctagtctaga gcttcatcta ctgttcaaac ctagcctaga cctctgttaa 1980 agattaacct atagtgcttc tgctgttaaa aactagcata gagctgcctc tggtgttaaa 2040 aactagccta gagtgtcatc tgctgtttga aaactagcct agagtgcatt cttctgctca 2100 aaactagcct tgacctctgt taaaattagc ctatagtgcg tctgctgtta aaaactagcc 2160 tagagcgcca tctggtgtta aaaactagcc tagagcgccc tctgctgctc aaaactaacc 2220 taaacctctg ttaaaaatta gcctatatag tgtctggtgt taaacactag tctagactgc 2280 cctctgatgt taaaaaaact agcctagagt gccttttgtt gcttaaaact agcctagacc 2340 tcagtttaaa aattagccta cagtgcatct gctgataaaa actagcctag agcgctctca 2400 ggtgttaaaa actagcctag agtgccgtct gcttctcaaa aactagccta gagttgattc 2460 ctttgctcaa aactagccta gacctctgtt aaaaaattag cctatagtgc gtctgctgtt 2520 acaaactagc ccagaacatc atctggtgtt aataactagc ctagagcgcc atctgctgct 2580 cagaactagc ctagacctct gttaaaaatt agcctttagt gcgtctccgg ttaaaaacta 2640 gcctagagcg ccctctagtg ttaaaaacta gtctagagcg ccctctgctg cacaaaatta 2700 gcctaaacct ctgttaaaat tagacaagag tgcgtttgct ggtaaaaact agcatagagc 2760 accctctggt gttaaaatct agcctagagc acactgtggt gttaaaaact agccaagagc 2820 gccatttgca gttcaaaact agcctagatt gctgttaaac attagtctag attccatatg 2880 ctgttataaa ctcacctaga gcgccatctg ctgtcaaaaa acccacctag agcgccatct 2940 gctgttaaaa acggatctta gaattgattc catagagaat cgggacgcag ttaaaaatct 3000 aacaatcgat tcatgaataa caatacaatg atttatcaat tccagcccta attttttaca 3060 tatttctttc caaatgttgg taacgcttta caataatgct gcatttagta aatgcattga 3120 gcaaaaaaaa gtgtgtaatt taggtgcatt ggatcacacc aacagatgca acttttgtaa 3180 gtgttaaagg gacggctcac tccaaaaatg aagatgacct ccattgactt taatagtaat 3240 tgttttttta tcctatggaa gtcagtggag accatcaagt agcattcttc aaaatatctt 3300 ctgtagtgtt taacagatga aaagagtgag tgaatgatga cagatctaat tccttgtgtg 3360 aactatccct ttaacgcatg ttccctattg taaaacattc ctcaaacggc ggcacattca 3420 gtgtcctctt gttcaatagc accggatgcg ctgggtcttg aagtcctggg tcttttttta 3480 tatgattgtg tacatacatt ttatattgta agtactgtat ttattgtaaa tattaaacta 3540 aatttgaata taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 3573 <210> 8 <211> 1092 <212> DNA <213> Danio rerio <400> 8 atggctttac cttgcctttt gccttcgatt tcaacgtttg caaaccagaa ggagaagctc 60 tgggaggata gatggaagat tgaggagcac aaaccactga acgccagctg ccctccgctc 120 aacgtggcac tgaacacaga cacttgtcga ggccgcaagg atgacgagga tctcagcaat 180 tatttagacc tggagtttat cctggccaac accacgggcc ctctggaggc cggagccgag 240 ttcatctccc actccgagcc atgcggcatg tactccactg cagtttactc atctccagaa 300 gcacctccac catacggcct catggcagag ctcctgcgat ctgatgtaga ctccacgtat 360 gacaccacag tgcaggggag attcctgctc aactccagcg gcttccccag acaggagttt 420 cctgaaatca aagtggagcc gccgatggat ggctacggtc cggtgatagg catggtgcca 480 caaacctgcc aaaaaatcaa gcaggaaggc aacgtttcat gcatgatgtc tttcgagcag 540 cccagactag cagtttctcc gcaggccacc gggaatatga ctcctccgct gagtcctgac 600 gactcccacc tccgtcaaac gacatataca cagagctacc atcactctcc tccggcgtat 660 ccgcaggtgc caatgcagtt cacagcgcca caccagtttg ccatgtatga ggaggcaatg 720 gggatgcaac ccagcatgca gcgggctctt ctcacccctc cgtcctctcc gttagagcta 780 atggagtcca aacccaagcg agggcgacgc acctggccga ggaagcgcat ggcgacacat 840 acatgcacgt acgccggctg cgggaagacg tacaccaaaa gctcccattt aaaagcgcat 900 caccgcactc acaccggtga aaaaccatac cactgcaact gggagggatg cggatggaag 960 ttcgcccgtt ctgacgagct gacgcgtcac ttccgtaaac acacgggcca ccggccgttc 1020 cagtgccacc tgtgtgaacg tgccttctcc cgctccgacc acctggcgct gcacatgaag 1080 agacacctgt ga 1092 <210> 9 <211> 2532 <212> DNA <213> Danio rerio <400> 9 ggcacgagga taaagtaacc tttaatggca ctgtgaagtt ttatgtaaat atatttgact 60 ttaacactaa attctgggtt cttacccttt gtgtattgca catgtaaata aatacaattc 120 tggacaaata tcaaacactc tatttggaga caattgtttg tgtaataaat gctgaaaggg 180 caccaaacgg atggctgtga ctcaagccgt actgccttca ttttcaaact tctgcaccaa 240 ctccgaaaac atgaagtttg aaaaaggctt tctggatctg gactccaagg atctgcacca 300 aagcccagcc agctacaaac cttcccagtt cctgactgat gagcaccagg acgacagcga 360 gggatgctgg gacatggagt tcctactgtc tgactgggcc agtatgtcac ctgaacggtc 420 caactctcaa aactacactc cccagcggcc gaccctacag gaccagcttc acagtccaga 480 tctttatcag gagctgaacg caccaaaacc aaacagacat caagtgtgcg ttgcaagttc 540 cctagctgag ctgcttcctc ctgaagcaac cttaagttcc tccctgcctc ctgacctcca 600 gtttaattgt ggatttctag atcaacaagc tgccaaatca tattcccagg cagaaaaccc 660 ccagcagttc agtgctttcc ctgtcacaag taatgtaaac agagacagca gcatgggaaa 720 aatggggaag tcctgggatt tcggacatta ctatcagcct gcgcctctga tatccttccc 780 agactccaaa tttgtccaaa cgcaggggat cacaatggaa acagtggtct ttcctccgca 840 tcatcactac aacttcatcc cgagctactc gcatcccaga ctctaccagc agcaggcaaa 900 ctacgtccac aggccgccgc cgcagagcca ctttccctcc acacagagca tggtgcccga 960 ctccacagtg ccgcctgcag gccttgagag caagcgcatc cgcagagggc tggtcaagag 1020 gaaagccacg gtgcacagct gtgaatatcc aggctgccag aagacataca ccaagagctc 1080 tcatctcaaa gcacacctcc gtacacacac aggtgaaaag ccgtatcact gcacatggga 1140 tggctgcggg tggaagttcg cccgttcaga cgagctgacg agacacttcc gaaaacacac 1200 cggacagaag ccgtatgagt gtctgctgtg ccacagagcc ttcagcaggt ccgaccacct 1260 ggcgttacac atgaagagac acgtgtgagg aaaaacacta acaaaacaca acaaaccaca 1320 tgagcttcat ccatttcaaa ggcttgcgag gacctgtgtt cagctggaga gatgctggac 1380 gctgtttatg catgataaag aaagtataga agcactatta tatacacata caatcagtgt 1440 tgggggtaac gtgttacaag taatgcagat attacttttt gaagtaaaga gtaaagtgat 1500 gcagtacttt taaaaatgaa tgtaatgcaa gttacttttt agtttaatta acccagatag 1560 cacacataca cttgaagtca gaattattag tccccctgta tacttttctc ccaatttctt 1620 tttaacagag aaaaaattta tttctgaaca caatagcttt aataactcat ttctaataac 1680 tgatttattt tatttacttt gccatggtga taataaataa tattttacta gctatttttt 1740 caagacactt ctatacaact taaagtgaca tttaaaggct taactaggtt tattaggcaa 1800 ttcattgtat aacagtggtt tgttctgtag acaataaaaa aatgcttaag gaggctaata 1860 atattgacct taaaatgtct ttaaaaaatt ggaaactgct tttattttag cggaaataaa 1920 acaaataaga ctttctctag aagaaataaa tattataaga aatactgtga aaagttcctt 1980 gctctgttaa acatcatttg ggaaaaataa aaaaaaatgt aacaaataaa taaaataaaa 2040 taaattacag gagggcgaat acttttgact tcaactatac gtcgaggaaa agtcaatgaa 2100 agatcgtaac atctacagca tcgcattcga tcaaacattt gtattttaat gagccgtctt 2160 ctttacctct atacactgtc tatgaatctt caactcctga aattatgcga tggcaagctc 2220 tggtaaaaag acgcaacaac ttcatcttga atagctttaa aaaattcatt gttgaattaa 2280 aattgacatt ttgaaaagtg gattgtctca ctgggactga ctacttaatg cataggaaaa 2340 aagtacaaaa gtagcaaaca tgttgcttta aatttgcatt attctgtata tacagcatgt 2400 atagctcaaa agatcacttt attctaaaca acttttagat gtgtgtgtgt gtttttttaa 2460 agctaaacaa aagttataga gagtgttgtt agttgcaaag ctcgtcatat aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aa 2532 <210> 10 <211> 1098 <212> DNA <213> Danio rerio <400> 10 atggctgtga ctcaagccgt actgccttca ttttcaaact tctgcaccaa ctccgaaaac 60 atgaagtttg aaaaaggctt tctggatctg gactccaagg atctgcacca aagcccagcc 120 agctacaaac cttcccagtt cctgactgat gagcaccagg acgacagcga gggatgctgg 180 gacatggagt tcctactgtc tgactgggcc agtatgtcac ctgaacggtc caactctcaa 240 aactacactc cccagcggcc gaccctacag gaccagcttc acagtccaga tctttatcag 300 gagctgaacg caccaaaacc aaacagacat caagtgtgcg ttgcaagttc cctagctgag 360 ctgcttcctc ctgaagcaac cttaagttcc tccctgcctc ctgacctcca gtttaattgt 420 ggatttctag atcaacaagc tgccaaatca tattcccagg cagaaaaccc ccagcagttc 480 agtgctttcc ctgtcacaag taatgtaaac agagacagca gcatgggaaa aatggggaag 540 tcctgggatt tcggacatta ctatcagcct gcgcctctga tatccttccc agactccaaa 600 tttgtccaaa cgcaggggat cacaatggaa acagtggtct ttcctccgca tcatcactac 660 aacttcatcc cgagctactc gcatcccaga ctctaccagc agcaggcaaa ctacgtccac 720 aggccgccgc cgcagagcca ctttccctcc acacagagca tggtgcccga ctccacagtg 780 ccgcctgcag gccttgagag caagcgcatc cgcagagggc tggtcaagag gaaagccacg 840 gtgcacagct gtgaatatcc aggctgccag aagacataca ccaagagctc tcatctcaaa 900 gcacacctcc gtacacacac aggtgaaaag ccgtatcact gcacatggga tggctgcggg 960 tggaagttcg cccgttcaga cgagctgacg agacacttcc gaaaacacac cggacagaag 1020 ccgtatgagt gtctgctgtg ccacagagcc ttcagcaggt ccgaccacct ggcgttacac 1080 atgaagagac acgtgtga 1098 <210> 11 <211> 365 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 11 Met Ala Val Thr Gln Ala Val Leu Pro Ser Phe Ser Asn Phe Cys Thr 1 5 10 15 Asn Ser Glu Asn Met Lys Phe Glu Lys Gly Phe Leu Asp Leu Asp Ser 20 25 30 Lys Asp Leu His Gln Ser Pro Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Gln Phe Leu 35 40 45 Thr Asp Glu His Gln Asp Asp Ser Glu Gly Cys Trp Asp Met Glu Phe 50 55 60 Leu Leu Ser Asp Trp Ala Ser Met Ser Pro Glu Arg Ser Asn Ser Gln 65 70 75 80 Asn Tyr Thr Pro Gln Arg Pro Thr Leu Gln Asp Gln Leu His Ser Pro 85 90 95 Asp Leu Tyr Gln Glu Leu Asn Ala Pro Lys Pro Asn Arg His Gln Val 100 105 110 Cys Val Ala Ser Ser Leu Ala Glu Leu Leu Pro Pro Glu Ala Thr Leu 115 120 125 Ser Ser Ser Leu Pro Pro Asp Leu Gln Phe Asn Cys Gly Phe Leu Asp 130 135 140 Gln Gln Ala Ala Lys Ser Tyr Ser Gln Ala Glu Asn Pro Gln Gln Phe 145 150 155 160 Ser Ala Phe Pro Val Thr Ser Asn Val Asn Arg Asp Ser Ser Met Gly 165 170 175 Lys Met Gly Lys Ser Trp Asp Phe Gly His Tyr Tyr Gln Pro Ala Pro 180 185 190 Leu Ile Ser Phe Pro Asp Ser Lys Phe Val Gln Thr Gln Gly Ile Thr 195 200 205 Met Glu Thr Val Val Phe Pro Pro His His His Tyr Asn Phe Ile Pro 210 215 220 Ser Tyr Ser His Pro Arg Leu Tyr Gln Gln Gln Ala Asn Tyr Val His 225 230 235 240 Arg Pro Pro Pro Gln Ser His Phe Pro Ser Thr Gln Ser Met Val Pro 245 250 255 Asp Ser Thr Val Pro Pro Ala Gly Leu Glu Ser Lys Arg Ile Arg Arg 260 265 270 Gly Leu Val Lys Arg Lys Ala Thr Val His Ser Cys Glu Tyr Pro Gly 275 280 285 Cys Gln Lys Thr Tyr Thr Lys Ser Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg 290 295 300 Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys Thr Trp Asp Gly Cys Gly 305 310 315 320 Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Phe Arg Lys His 325 330 335 Thr Gly Gln Lys Pro Tyr Glu Cys Leu Leu Cys His Arg Ala Phe Ser 340 345 350 Arg Ser Asp His Leu Ala Leu His Met Lys Arg His Val 355 360 365

Claims (38)

  1. 치료학적 유효량의 KLF를 심근세포에 투여하거나, 또는 심근세포에서 KLF의 발현을 유도하는 단계
    를 포함하는, 심근생성의 유도 방법.
  2. 제1항에 있어서, 심근세포가 유아, 어린이 또는 성인의 심근세포인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법이 시험관 내에서 수행되는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 심근세포가 개체 내에 존재하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, KLF가 개체에게 투여되는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, KLF가 개체의 심장에 투여되는, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 심근생성이 개체에서 심장 재생을 촉진하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 심장 재생은 박출률, 분획 단축률 또는 둘 모두의 증가를 특징으로 하는, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 심장 재생이 혈관 내피세포, 심외막 세포 또는 둘 모두의 증가를 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, KLF가 심근세포의 역분화를 유도하여 증식성 심근세포를 생성하고, 바람직하게는 증식성 심근세포가 유사분열성인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 증식성 심근세포가 KLF의 존재 하에 증식하여 증식성 심근세포 집단을 생성하도록 하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 증식성 심근세포가 5탄당 인산 경로, 세린 합성 경로 또는 둘 다를 사용하여 글루코오스를 우선적으로 대사하는, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 증식성 심근세포 집단의 분화를 허용하여 심근세포 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 분화가 KLF가 실질적으로 없을 때, 또는 KLF의 유도가 중단된 후에 발생하는, 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, KLF가 탈분화를 촉진하기 위해 염색질 리모델링을 유도하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, KLF 유도된 염색질 리모델링이 MEF2C, GATA4, MEF2A, 및 NKX2.5 중 하나 또는 임의의 조합의 결합 부위에 대한 접근성을 감소시키는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, KLF가 KLF1 단백질, KLF1 핵산 또는 KLF1 핵산을 포함하는 벡터인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, KLF1 단백질이 서열번호 1 또는 서열번호 11의 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 11과 80% 이상 동일한 서열의 단백질인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, KLF1 핵산이 서열번호 2, 3, 4, 5, 9 또는 10 중 어느 하나의 서열, 또는 서열번호 2, 3, 4, 5, 9 또는 10 중 어느 하나와 80% 이상 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, KLF가 KLF2b 단백질, KLF2b 핵산 또는 KLF2b 핵산을 포함하는 벡터인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, KLF2b 단백질이 서열번호 6의 서열, 또는 서열번호 6과 80% 이상 동일한 서열의 단백질인, 방법.
  22. 제20항에 있어서, KLF2b 핵산이 서열번호 7 또는 8의 서열, 또는 서열번호 7 또는 8 중 어느 하나와 80% 이상 동일한 서열의 핵산을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
  23. 제17항, 제19항, 제20항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 프로모터에 작동가능하게 커플링된 KLF 핵산을 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 프로모터가 심장 특이적 프로모터인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 심장 특이적 프로모터가 α-미오신 중쇄(α-MHC) 프로모터, 미오신 경쇄 2(MLC-2) 프로모터, 심장 트로포닌 C(cTnC) 프로모터, NCX1 프로모터 및 TNNT2 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  26. 제23항에 있어서, 프로모터가 유도성 프로모터인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 유도성 프로모터가 테트라사이클린 유도성 프로모터, 스테로이드 호르몬 유도성 프로모터, 또는 저산소증 유도성 프로모터, 심장 손상 부위 근처 영역에 특이적인 프로모터, 또는 허혈 및 재관류로 인한 스트레스에 반응하는 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  28. 제10항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 심근세포가 심근세포 전구 세포, 미성숙 심근세포, 또는 배아 표현형을 갖는 심근세포인, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 심근생성이 심근세포의 세포 계통을 재프로그래밍하는 것을 포함하지 않는, 방법.
  30. 제10항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 심근세포가 세포 주기에 재진입하는, 방법.
  31. 제10항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 심근세포가 심근세포와 비교하여, 5탄당 포스페이트 경로(PPP), 세린 합성 경로 또는 둘 모두에 대한 의존도가 증가된 것을 특징으로 하는, 방법.
  32. 제4항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 심근생성이 심외막 세포, 혈관 내피세포 또는 둘 모두의 증가된 수를 특징으로 하는, 방법.
  33. 제4항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 심근세포 손실과 관련된 심장 병태를 갖는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 심장 병태가 심근경색증, 허혈성 심근병증, 확장성 심근병증 또는 심부전인, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 심근세포 또는 증식성 심근세포의 집단.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 심근 세포, 증식성 심근세포, 또는 둘 다를 포함하는 조성물.
  37. 제35항의 심근세포 또는 증식성 심근세포 집단, 또는 제36항의 조성물의 치료학적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 심장 병태의 치료 방법.
  38. 제35항의 심근세포 또는 증식성 심근세포 집단, 또는 제36항의 조성물의, 심장 병태 치료용 약제의 제조에서의, 용도.
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