KR20210054320A - mir-10a를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

mir-10a 또는 이의 모방체를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 약학적 조성물은 개체의 중량을 감소시키고, 백색 지방조직을 갈색 지방조직으로 분화시키는 효과를 나타내므로, 비만의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

mir-10a를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating obesity comprising mir-10a}

mir-10a를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

miRNA는 식물, 동물, 바이러스 등에서 발견되는, 약 22 개의 뉴클레오티드 서열로 이루어져 있는 작은 RNA 분자이다. 이는 코돈이 아닌 부위에서 전사된 후 변형되어 유전자 발현을 조절하는 기능을 할 수 있다. miRNA는 진화를 통해 보존되면서 세포주기, 분화, 발달, 대사, 노화와 같은 다양한 생물학적 과정에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 인간 유전체는 전체 유전자의 1/3을 조절하는 약 1,000 개의 miRNA를 가지는 것으로 추정되고 있다.

비만은 현대인의 사망 원인 중 교정 가능한 첫 번째 원인으로 지목되고 있는 것으로, 건강하고 활력 있는 삶을 누리기 위해서는 반드시 관리해야 하는 만성질환이다. 비만은 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 협심증, 지방간, 암, 퇴행성 관절염 등 다양한 질환과 연관되어 있다는 것이 알려져 있다.

이러한 기술적 배경 하에서, 상술한 비만 예방 및 치료에 관한 문제를 해결하기 위한 연구가 지속적으로 있어 왔으나(대한민국 등록특허공보 제10-0470204호(2015.02.04)), 아직 이를 해결하기에는 미비한 실정이다.

mir-10a와 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

mir-10a와 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 비만을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

mir-10a와 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비만 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

일 양상은 mir-10a와 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 mir-10a는 miRNA의 일종으로 올리고뉴클레오티드 형태이며, 이의 모방체일 수 있다. 상기 mir-10a는 “microRNA-10a”또는 “miRNA-10a”와 혼용될 수 있다. 상기 mir-10a는 혹스 유전자 군집(Hox gene cluster)에 속하며, Hoxb4의 상류(upstream)에 위치하는 것으로 알려져 있다. 상기 mir-10a는 기관(organ)마다 발현량이 다를 수 있다. 마우스에서 mir-10a는 신장에서 농도가 높으며, 소장, 폐, 및 비장에서 낮은 농도를 나타낸다. 상기 mir-10a는 mir-10a-5p 또는 mir-10a-3p로 전환될 수 있다. 한편, 상기 mir-10a의 서열은 miRNA 데이터베이스(www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다. 특정 miRNA 또는 이의 모방체는 상업적으로도 구입할 수 있다.

상기 "올리고뉴클레오티드"는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"과 상호교환할 수 있는 용어이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 임의의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함한다.

상기 "miRNA" 또는 "마이크로RNA"는 올리고뉴클레오티드의 형태를 가지며, 유전자의 기능을 조절하는 것일 수 있다. 상기 miRNA는 pre-miRNA, 성숙 miRNA, 또는 다른 단백질과 결합하여 복합체를 형성한 것일 수 있다. 상기 복합체는 RISC(RNA induced silencing complex)일 수 있다.

상기 miRNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. RISC를 형성하는 성숙 miRNA는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, pre-miRNA는 주로 이중가닥 부분을 형성할 수 있는 부분적인 자가-상보적(예를 들어 스템- 및 루프 구조) 구조를 가질 수 있다. 특히, 상기 mir-10a 또는 mir-10a-5p는 이에 상보적인 서열과 결합하여 이중 가닥 형태인 것일 수 있다. 용어 "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 "상보적"은 "완전 상보적(perfectly complementary)"과는 다른 의미를 가지며, 상기 miRNA의 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

상기 "모방체(mimics)" 또는 "miRNA 모방체"는 miRNA의 발현 및/또는 기능을 증가시키는데 사용되는 물질을 의미할 수 있다. 상기 miRNA 모방체는 천연 miRNA의 기능을 증가, 보충 또는 대체할 수 있다. 또한, miRNA 모방체는 miRNA의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는 기능적 등가물인, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 갖는 변이체를 포함할 수 있다.

상기 miRNA 모방체는 성숙 miRNA 서열, pre-miRNA 또는 pri-miRNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 특히, 상기 miRNA 모방체는 miRNA의 세포 내 안정성 등을 고려한 이중가닥 miRNA일 수 있다. 상기 이중가닥 miRNA 모방체는 성숙 miRNA로 기능을 나타낼 경우 단일가닥으로 분리되는 것일 수 있다.

상기 모방체의 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi(RNA interference) 효과에 의하여 억제할 수 있는 임의의 구조일 수 있다. 상기 모방체의 구조는 평활(blunt) 말단 또는 접착(cohesive) 말단일 수 있다. 상기 접착 말단 구조는 3'-말단이 돌출(overhang)한 구조 및 5'-말단이 돌출(overhang)한 구조일 수 있다. 돌출하는 뉴클레오티드 수는 한정되지 않으나, 예를 들어 1 내지 8 뉴클레오티드일 수 있다.

상기 miRNA 모방체는 예를 들어, 뉴클레아제 저항성, 결합 친화성, 세포 흡수, 또는 선천 면역 유도에 영향을 미치기 위한 임의의 변이를 포함할 수 있다. 상기 변이는 포스포디에스테르(phosphodiester), 포스포라미데이트(phosphoramidate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)와 같은 인산 변이, 2'-O-알킬화, 2'-메톡시알킬화, 2-플루오로화와 같은 당(sugar) 변이, 포스포로디마이데이트 모르폴리노 올리고머(phosphorodiamidate morpholino oligomer: PMO), 잠금 핵산(locked nucleic acid: LNA)과 같은 비-리보오스 변이일 수 있다. 상기 miRNA 모방체는 플라스미드계 pre-miRNA 벡터 및 PCR 유도 miRNA 발현 카세트에 의한 형질전환에 이용될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수 있다.

상기 miRNA 모방체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 합성할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 직접 화학적으로 합성하는 방법, 인 비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법, 인 비트로 전사에 의해 합성된 긴 이중가닥 RNA를 RNaseⅢ 패밀리 효소를 이용하여 절단하는 방법이다.

상기 miRNA는 생체 내 전달 효율을 높이기 위하여 당업계에 알려진 다양한 핵산 전달체(바이러스성 또는 비바이러스성 전달체)와의 복합체를 형성한 것일 수 있다. 예를 들어, miRNA는 이를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 포함될 수 있다. 이를 위하여 사용가능한 플라스미드는 pSilencer(Ambion), pSiEx(Novagen), siXpress(Takara Bio), pBLOCKiT, pcDNA3.1, pCEP4(Invtrogen), SilenCircle^TM (Allele)일 수 있다. 바이러스성 전달체는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, EB 바이러스 벡터, 파필로마바이러스 벡터, 포오미바이러스 벡터일 수 있다. 비바이러스성 전달체는 전달 시약으로 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), G-fectin, 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀, 리간드-DNA 복합체, 유전자총(gene gun)이 사용될 수 있다. 또한, 상기 miRNA는 세포 내 전달 기술을 이용해 세포로 전달될 수 있다. 상기 기술은 폴리에틸렌글리콜과 같은 고분자 접합, 전기천공법(electroporation)일 수 있다.

상기 "비만"은 체지방이 과도한 상태를 말한다. 상기 비만은 임상적으로 체질량지수(BMI)가 한국의 경우 25, 세계보건기구(WHO)에 의하면 30 이상인 경우일 수 있다. 일반적으로 비만은 체중이 정상치보다 높은 경우를 의미하지만 체중이 많이 나가지 않더라도 몸의 구성성분 중 체지방의 비율이 높은 경우 비만일 수 있다. 상기 비만은 성인과 어린이 모두에서 발병할 수 있다. 상기 비만은 체중의 증가뿐만 아니라 과식, 과음 및 과식증, 고혈압, 당뇨, 증가된 혈장 인슐린 농도, 인슐린 내성, 고지혈증, 대사 증후군, 인슐린 내성 증후군, 비만관련 위식도 역류, 동맥경화증, 과콜레스테롤혈증, 요산과다혈증, 심장비대 및 좌심실 비대, 지방이영양증, 비알콜성 지방간염, 심혈관 질환 또는 다낭성 난소 증후군과 같은 비만 관련 질환을 유발할 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 비만 뿐만 아니라 상기 비만 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 비만이 아니더라도 체중을 줄이려는 욕구가 있는 개체에 사용될 수 있다.

상기 비만은 다양한 원인에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 원인은 고지방 식이, 운동량 감소, 유전, 심리적인 요인, 내분비계 이상, 대사 이상, 사회 및 환경적 요인일 수 있다. 특히, 상기 비만은 고지방식이로 유도된 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 백색 지방조직을 갈색 지방조직으로 분화하도록 촉진할 수 있다. 포유류는 크게는 백색 지방조직과 갈색 지방조직이라는 두 가지 형태의 지방조직이 존재한다(Gesta S etal., Cell 2007;131:242-256). 또한, 베이지(beige) 지방조직은 백색지방의 갈색지방화에 기여하는 것으로 알려져 있다. 상기 백색 지방 조직은 개체에서 에너지 저장에 사용되므로 과잉 시 비만과 연관된다. 이에 반해, 갈색 지방 조직은 미토콘드리아의 농도가 높으며, 독특하게 짝풀림 단백질(uncoupling protein 1: UCP1)을 발현할 수 있다. 따라서, 갈색 지방조직은 에너지 소비 및 열생성(thermogenesis)을 일으켜 비만을 개선하는 역할을 할 수 있다. 상기 에너지 소비 및 열생성량은 인간에서 갈색 지방조직 50 g이 최대로 활성화되는 경우 기초대사량의 20%까지 소모할 수 있을 정도로 매우 뛰어나다고 알려져 있다.

상기 백색 지방조직은 단일의 큰 지방 방울 및 적은 미토콘드리아를 갖는 것이 특징인 반면, 갈색 지방조직은 다수의 작은 지방 방울 및 많은 미토콘드리아를 갖는다. 일 실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 마우스에서 단일의 큰 지방 방울을 갖는 백색 지방조직을 다수의 작은 지방 방울을 갖는 갈색 지방조직으로 분화시켜 비만을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낸다.

상기 "예방"은 상기 비만 또는 비만 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 상기 "치료"는 상기 비만 또는 비만 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 임의의 제제로 개체에 제공될 수 있다. 상기 제제는 경구용 또는 비경구용 제제일 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크와 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 또는 좌제일 수 있다. 비수성용제 또는 현탁제는 식물성 기름 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 식물성 기름은 예를 들면, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 또는 올리브 오일일 수 있다. 에스테르는 예를 들면 에틸올레이트이다. 좌제의 기제는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 또는 글리세로젤라틴일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 mir-10a를 약학적으로 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 유효한 양은 상기 조성물 1,000 mg 당 약 0.01 mg 내지 1,000 mg, 약 0.01 mg 내지 500 mg, 약 0.01 mg 내지 250 mg, 약 0.01 mg 내지 100 mg, 약 0.01 mg 내지 25 mg, 약 0.01 mg 내지 10 mg, 약 0.01 mg 내지 1 mg, 약 0.1 mg 내지 500 mg, 약 0.1 mg 내지 250 mg, 약 0.1 mg 내지 100 mg, 약 0.1 mg 내지 25 mg, 약 0.1 mg 내지 10 mg, 약 0.1 mg 내지 1 mg, 약 1 mg 내지 500 mg, 약 1 mg 내지 250 mg, 약 1 mg 내지 100 mg, 약 1 mg 내지 25 mg, 약 1 mg 내지 10 mg, 약 1 mg 내지 5 mg일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 예를 들어 피하, 정맥내 또는 근육내로 주사제 제형으로 투여될 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있고, 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 5 ㎎/kg, 약 1 ㎎/kg 내지 약 5 ㎎/kg, 또는 약 1 ㎎/kg 내지 약 3 ㎎/kg의 범위내일 수 있다. 상기 투여는 1 일 1 회, 1 일 2 회, 1 일 3 회, 1 일 4 회, 1 주일에 1 회, 2 주일에 1 회, 3 주일에 1 회, 4 주일에 1 회, 1 달에 1 회, 3 달에 1회 또는 1 년에 1 회 투여될 수 있다.

다른 양상은 mir-10a와 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 비만을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 mir-10a, 상보적, 비만 등은 상술한 바와 같다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 비만 또는 이와 연관된 증상을 앓고 있거나, 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다.

상기 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 상기 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 도입될 수 있다.

또 다른 양상은 mir-10a와 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비만 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 비만 예방 또는 개선의 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및/또는 가공할 수 있다.

상기 건강기능식품이라 함은, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및/또는 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

상기 건강기능식품은 mir-10a를 임의의 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 건강기능식품은 부형제, 결합제, 붕해제, 또는 교미제와 혼합한 혼합물의 형태로 제공될 수 있다.

상기 mir-10a를 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능식품은 체중을 줄여 비만을 개선하는 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 백색 지방조직을 갈색 지방조직으로 분화시킴으로써 개체의 체질을 개선하여 비만에 대한 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 마우스에서 mir-10a-5p 모방체 투여에 따른 mir-10a-5p의 개체 내 수준을 나타내는 것이다. U6은 내부 대조군을 나타낸다.
도 2는 gWAT(gonadal white adipose tissue)을 H/E 염색한 것이다. 마우스는 일반 고형사료(Chow Diet) 또는 고지방식이(high fat diet: HFD)로 식단이 조절되었으며, mir-10a-5p 모방체 투여군(miR-10a-5p)과 대조군(NC)으로 나누어 염색되였다.
도 3은 고지방식이로 조절한 마우스에서 mir-10a-5p 모방체의 투여에 따른 지방세포 크기에 따른 비율을 나타낸 것이다.
도 4는 고지방식이로 조절한 마우스에서 mir-10a-5p 모방체의 투여에 따른 지방세포 수를 나타낸 것이다.
도 5는 고지방식이 및 일반 고형사료로 조절하면서 mir-10a-5p를 투여한 군(miR) 및 투여하지 않은 군(NC)에서 gWAT의 중량을 나타낸 것이다.
도 6은 고지방식이로 조절한 군에서 mir-10a-5p 모방체 투여에 따른 CLS(crown like structure)의 수를 나타낸 것이다.
도 7은 mir-10a-5p 및 mir-10a-3p 모방체 투여 시 지방세포에서의 UCP1, Dio2, Elovl3, 및 Cidea 유전자의 발현 수준을 나타낸 것이다(n=3, mean +/- SEM, *p<0.05, **p<0.01).
도 8은 mir-10a-5p 및 mir-10a-3p 모방체 투여 시 지방세포에서 세포 내 트리글리세리드 수준을 나타낸 것이다(n=6, mean +/- SEM, *p<0.05, ***p<0.001).
도 9은 mir-10a-5p 모방에 투여에 따라 염증 유전자 마커인 Emr1, Ccl2, 및 Il1b를 qPCR로 정량한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 방법

1-1. 실험동물의 준비

C57BL/6 마우스를 Central Lab으로부터 구매하였다. 실험기간 동안 마우스는 일반 고형사료(chow) 및 HFD(high-fat diet)로 조절되었고, 온도 22℃, 12 시간 밤낮주기 환경에서 유지되었다. 마우스를 5 일 동안 복강 내 주사로 CL (1 mg/kg/day)를 처리하여 β3 아드레날린 수용체 자극하였다.

제조자의 지시에 따라 In Vivo Jet-PEI (Polyplus Transfection)를 사용하여 형성된 리포좀으로 mir-10a-5p 모방체(mimics)(2'-Fluoro dsRNA, Genepharma) 또는 miRNA 모방체 이중 가닥 음성 대조군(Genepharma)을 마우스에 주사하여 miRNA의 인 비보(in vivo) 과발현을 유도하였다. 구체적으로, 주사당 40 μg의 mir-10a-5p 모방체 및 6 μl의 in vivo-jet PEI 시약을 사용하여 5%의 글루코오스 용액으로 최종 부피 200 μl를 만들어 사용하였다. 일주일에 2 번 간격으로 miRNA 리포좀 용액(200 μl/mouse, i.p.)을 마우스에 처리하였다. 첫 주사 2 주 후에, 마우스를 CL로 3일 동안 처리하였다.

1-2. 조직학적 분석

지방조직을 조직학적 절편으로 가공하여, 5 μm 두께의 파라핀 또는 동결 절편을 H/E 염색 또는 면역조직화학 분석을 하였다. 조직학적 샘플에 대한 모든 정량은 블라인드 분석으로 수행되었다.

1-3. 유전자 발현 분석 및 RNAseq

유전자 발현 분석 및 RNAseq 분석을 수행하였다. qRT-PCR로 mRNA를 정량하기 위해 사용한 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다. Mir-X^TM miRNA First strand 합성 키트 및 miRNA qRT-PCR TB Green 키트(Takara)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 cDNA를 합성하고 miRNA을 정량하였다. CFX96 real-time PCR 검출 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. miRNA의 상대적 발현 수준을 내부 대조군인 U6 발현 수준으로 표준화하였다. 발현 수준은 2-ΔΔC_T 방법을 사용하여 계산하였다. qRT-PCR에 사용된 프라이머를 하기 표 2에 나타내었다.

유전자	정방향(5'→3')	역방향(5'→3')
Emr1(NM_001355722.1)	GTG ACT CAC CTT GTG GTC CT	CAG ACA CTC ATC AAC ATC TGC G
Ccl2(NM_011333.3)	CTG GAT CGG AAC CAA ATG AG	AAG GCA TCA CAG TCC GAG TC
IL1b (NM_008361.4)	CTG GTG TGT GAC GTT CCC ATT A	CCG ACA GCA CGA GGC TTT

타겟 miRNA	Accession no.	서열
mmu-miR-10a-5p	MIMAT0000648	5'TACCCTGTAGATCCGAATTTGTG3'
mmu-miR-10a-3p	MIMAT0004659	5'CAAATTCGTATCTAGGGGAATA3'

1-4. 세포 배양

miRNA 과발현을 위해, C3H10T1/2 세포 (ATCC)를 24 웰 플레이트에서 0.5 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 도말하고 INTERFERin (Polyplus Transfection)을 사용하여 10 nM syn-mmu-mir-10a-5p miScript miRNA 모방체 또는 음성 대조군 miRNA(Qiagen)로 형질감염시켜 miRNA를 과발현하였다. 형질 감염 후 2 일 후, 세포를 qPCR 분석하거나, 지방 생성 유도 배지 (10 % FBS가 보충된 DMEM), 인도메타신 (0.125 mM, Cayman), 이소부틸메틸크산틴(isobutylmethylxanthine) (IBMX) (2.5 mM, Cayman), 덱사메타손(dexamethasone) (1 μM, Cayman), 인슐린(insulin) (10 ㎍/mL, Sigma) 및 트리아이오도티로닌(triiodothyronine) (T3, 1 nM, Cayman)로 3 일 동안 처리하였다.

실시예 1-5. 통계적 분석

GraphPad Prism 5 소프트웨어 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

실시예 2. 비만 감소 및 갈색지방화 효과 확인

2-1. gWAT에서 mir-10a-5p의 수준 확인

mir-10a-5p 모방체를 2 주 간격으로 마우스에 주입 시, 실제로 마우스에서 mir-10a-5p의 증가된 수준이 나타나는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 8주 동안 마우스를 HFD로 조절하면서, mir-10a-5p 모방체를 주입한 군과 주입하지 않은 군(NC)으로 나누어 gWAT에서 miRNA를 qPCR로 정량하였다. 내부 대조군으로는 U6를 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, mir-10a-5p 모방체를 주입한 군은 대조군에 비하여 유의하게 높은 mir-10a-5p 수준을 나타내었다.

2-2. 갈색 지방세포 분화 촉진 효과 확인

비만을 치료하는데 도움이 되는 갈색 지방세포는 일반적으로 지방을 저장하는 백색 지방세포보다 크기가 작으므로, mir-10a-5p가 갈색 지방세포 분화에 미치는 효과를 확인하고자, 지방세포의 크기 및 수를 분석하였다. 구체적으로, mir-10a-5p 모방체를 주입한 마우스 및 mir-10a-5p 모방체를 주입하지 않은 마우스 각각을 일반 고형사료 및 HFD로 조절한 후 gWAT을 적출하여 H/E 염색을 하였다.

도 2는 각 군에 대한 gWAT의 H/E 염색 결과를 나타낸 것이다. 이에 대해 정량한 결과, gWAT에서 mir-10a-5p의 주입 시 지방세포의 크기는 유의하게 감소하고(도 3), 지방세포의 수는 증가한다는 것을 알 수 있었다(도 4). 이와 같은 결과로부터 mir-10a-5p가 백색 지방세포를 갈색 지방세포로 분화하도록 촉진하는 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

2-3. gWAT의 중량 변화 확인

mir-10a-5p가 gWAT의 중량에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, mir-10a-5p 모방체를 주입한 마우스(mir) 및 mir-10a-5p 모방체를 주입하지 않은 마우스(NC) 각각을 일반 고형사료 및 HFD로 조절한 후 gWAT을 적출하여 중량을 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 일반 고형사료를 공급한 마우스에서는 mir-10a-5p 모방체 주입 전 후 gWAT의 중량에 유의한 변화가 없었으나, HFD로 조절한 경우에는 gWAT의 중량이 mir-10a-5p에 의해 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다. 비만 환자들은 일반적으로 HFD와 유사한 식이를 보일 가능성이 높으므로, mir-10a-5p는 특히 비만환자에게 보다 우수한 지방조직 중량 감소 효과를 나타낼 수 있을 것이다.

2-4. CLS의 감소 확인

죽은 지방세포의 존재는 비만의 전형적인 특징이다. CLS(Crown-like structure)는 죽어가는 지방세포를 매크로파지가 둘러싼 형태이므로, CLS는 비만과 밀접하게 연관되어 있으며, 지방조직에서의 염증과도 관련이 있다. 구체적으로, mir-10a-5p가 CLS의 형성에 미치는 영향을 확인하고자 gWAT의 파라핀 절편을 H/E 염색하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, HFD로 조절한 마우스에서 mir-10a-5p 모방체를 주입한 경우 대조군보다 CLS의 수가 매우 크게 감소하였음을 확인할 수 있었다.

2-5. 지방세포에서 갈색 지방 분화 효과 확인

C3H10T1/2 세포주로부터 유래된 지방세포에서 mir-10a-5p가 지방세포의 갈색 지방화에 나타내는 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 세포에 mir-10a-3p 및 mir-10a-5p 모방체를 주입시킨 후, 지방분화배지에서 3일을 배양하였다. 갈색 지방에서 과발현되는 UCP1, Dio2, Elovl3, 및 Cidea 유전자를 qPCR로 정량하여, mir-10a-5p의 갈색 지방 분화 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, mir-10a-5p 처리군(miR-10a-5p)이 대조군(Control) 및 mir-10a-3p 처리군(miR-10a-3p) 보다 각 유전자의 발현이 유의하게 증가하였음을 확인할 수 있었다.

2-6. 지방세포에서 지방 함량 감소 확인

C3H10T1/2 세포주로부터 유래된 지방세포에서 mir-10a-5p가 지방 함량에 나타내는 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 세포에 mir-10a-3p 및 mir-10a-5p의 모방체를 주입시킨 후, 지방분화배지에서 3일을 배양하였다. 상업적으로 이용가능한 TG colorimetric assay kit (Cayman)를 이용하여 세포 내 트리글리세리드 함량을 제조자의 지시에 따라 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 세포내 트리글리세리드 수준을 확인한 결과, mir-10a-5p 처리군(miR-10a-5p)이 대조군(Control) 및 mir-10a-3p 처리군(miR-10a-3p)보다 세포 내 트리글리세리드 함량이 현저하게 감소하였음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 mir-10a-5p가 이와 유사한 mir-10a-3p보다 비만에 대해 현저히 우수한 효과를 발현함을 나타낸다.

실시예 3. mir-10a-5p의 염증 감소 효과

mir-10a-5p가 염증에 미치는 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, mir-10a-5p 모방체를 HFD 마우스에 주입 시 염증의 유전자 마커인 Emr1, Ccl2, 및 Il1b의 발현 변화 여부를 qPCR로 정량화하였다. 비교를 위하여 내부 대조군으로 Ppia(peptidylprolyl isomerase A)을 사용하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, HFD에 의해 유도된 염증으로 증가된 Emr1, Ccl2, 및 Il1b의 발현이 mir-10a-5p 투여에 의해 모두 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 mir-10a-5p의 염증 억제 효과를 입증하는 것이다.

Claims (7)

1. mir-10a와 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 mir-10a는 mir-10a-5p인 것인 약학적 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 mir-10a-5p는 이에 상보적인 서열과 결합된 것인 약학적 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 주사제 제형인 것인 약학적 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 비만 예방 또는 치료는 갈색지방 분화에 의한 것인 약학적 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
7. 청구항 1의 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 비만을 예방 또는 치료하는 방법.

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