JP2020532284A

JP2020532284A - 脊髄性筋萎縮症の治療

Info

Publication number: JP2020532284A
Application number: JP2020500646A
Authority: JP
Inventors: アナ・ビュジ・ベロ; マルティナ・マリネッロ; サミア・マルティン
Original assignee: ジェネトン; アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）; ユニヴェルシテ・デヴリ・ヴァル・デソンヌ
Priority date: 2017-07-08
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2020-11-12
Also published as: CA3068906A1; US20200370069A1; WO2019011817A1; EP3652324A1; CN111065741A

Abstract

本発明は、脊髄性筋萎縮症(SMA)の治療の方法で使用するための、血清型9又はrh10AAVキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターに関する。

Description

脊髄性筋萎縮症(「SMA」)は、最も広義には、筋力低下及び筋萎縮の原因となる脊髄における運動ニューロン欠如を特徴とする遺伝性及び後天性中枢神経系(CNS)疾患の一群を示す。SMAの最も一般的な形態は、生存運動ニューロン(「SMN」)遺伝子の突然変異によって引き起こされ、乳児から成人まで影響を与える広い範囲の重篤度で表れる。乳児型SMAは、この神経変性障害の最も重篤な形態の1つである。発症は通常、突発的で劇的である。症状のいくつかには、筋力低下、筋緊張低下、弱い泣き声、弱々しさ(limpness)又はばったり倒れ込む(flop)傾向、哺乳(sucking)又は嚥下困難、肺又は喉における分泌物の蓄積、摂食困難及び気道感染に対する感受性増加が含まれる。足は腕よりも弱くなる傾向があり、頭を上げる又は上半身を起こす(sitting up)等の発達の重要な段階に達することができない。一般的に、症状が早く現れるほど、寿命は短い。症状が現れて間もなく、運動ニューロン細胞は迅速に悪化する。疾患は致命的であり得る。SMAの経過は弱さの重篤度に直接関係する。重篤な形態のSMAである乳児は、呼吸を支援する筋肉が弱いために、呼吸器疾患で死亡することが多い。軽度の形態のSMAである小児、特に、スペクトルのより重篤な側にいる小児は、広範な医療支援を必要とすることがあるが、ずっと長く生きる。疾患の悪化及び平均余命は、患者の発症時の年齢及び弱さのレベルと強く相関する。SMA障害の臨床スペクトルは、以下の5つの群に分けられている。
(a)新生児SMA(0型SMA;出生前):非常に重篤なSMAとしても知られている0型は、SMAの最も重篤な形態であり、出生前に始まる。通常、0型の最初の症状は、妊娠30週と36週の間で最初に観測される胎児の運動減少である。出生後、これらの新生児はほとんど動かず、嚥下及び呼吸に困難を有する。
(b)乳児SMA(1型SMA又はウェルドニッヒ・ホフマン病;一般的に0〜6ヵ月):重篤な小児SMA又はウェルドニッヒ・ホフマン病としても知られている1型SMAは非常に重篤で、出生時又は生後6ヵ月以内に表れる。患者は座る能力を獲得せず、通常、換気補助無しでは最初の2年以内で死に至る。
(c)中間型SMA(2型SMA又はデュボヴィッツ病、一般的に6〜18ヵ月):2型SMA又は中間型SMAの患者は、補助無しで座る能力を獲得するが、援助無しで立ったり歩いたりすることできない。弱さの発症は通常、6ヵ月と18ヵ月との間のどこかで認められる。この群の予後は、呼吸器障害の程度に大きく左右される。
(d)若年性SMA(3型又はクーゲルベルク・ヴェランダー病、一般に>18ヵ月):3型SMAは、疾患経過の間のある時点では自力で歩くことができるが、青年期又は成人期には車いすに束縛されるようになることが多い人を示す。
(e)成人型SMA(4型SMA):通常、青年期後期に舌、手、又は足が弱くなり始め、その後体のその他の領域に進行する。成人型疾患の経過はずっと遅く、平均余命にはほとんど又は全く影響しない。

SMA疾患遺伝子は、連鎖解析によって染色体5qの複合体領域にマッピングされている。ヒトでは、この領域は大きな逆位重複を有し、結果として、2コピーのSMN遺伝子が存在する。SMAは、両染色体中の遺伝子SMN1のテロメア側コピーの劣性突然変異又は欠失によって引き起こされ、SMN1遺伝子機能の欠如が生じている。しかし、ほとんどの患者は、遺伝子SMN2のセントロメア側コピーを保持しており、SMA患者におけるSMN2遺伝子のコピー数は、疾患の重篤度に対して重大な変更効果を有するとされており、すなわち、重篤度の低い疾患では、SMN2のコピー数の増加が認められる。それにも関わらず、SMN2遺伝子によって産生される完全長RNAの量は少なく、タンパク質形成の効率が不十分なので、SMN2はSMN1機能の欠如を完全には補償することはできないが、少量ならば補償する。より詳細には、SMN1及びSMN2遺伝子は5個のヌクレオチドが異なっており、これらの違いの1つ、エキソンスプライシング領域のCからTへの翻訳上サイレントな置換は、SMN2の転写の間にエキソン7のスキッピングをしばしば引き起こす。結果として、SMN2から産生する転写物の大半は、エキソン7を欠如しており(SMNΔE×7)、迅速に分解される短縮型タンパク質(SMN2転写物の約10%は完全長で、機能的SMNタンパク質をコードする)をコードする。

結果として、SMN1の遺伝子置換がSMAの治療戦略として提案された。特に、以前は、全身経路によって投与された2本鎖自己相補的AAV9ベクターを用いて血液脳関門を横断するSMN遺伝子の送達によるSMAの治療に焦点が当てられた(国際公開第2010/071832号パンフレット等)。実際に、AAV9キャプシドを含むAAVベクターは、血液脳関門を横断することができ、その後運動ニューロン及びグリア細胞等のSMA進行に関与する細胞を形質導入することができることが示された。国際公開第2014/022582号パンフレットの出願では、形質導入効率を改善するために、非イオン性低浸透圧造影剤と共に組換え2本鎖自己相補的AAV9ベクターをそれらを必要とする対象にくも膜下腔内注射することが提案された。しかし、先行技術から、2本鎖自己相補的ゲノムを含むAAV9ベクターが中枢神経系(CNS)に最良の形質導入をもたらすための最適なベクターであることが一般的な教示であることが認められた。自己相補的ベクターはAAVベクターの律速段階である2本鎖合成を必要としない。McCarty等によって(McCarty等、Gene Ther., 2001, 8(16):1248〜54;McCarthy等、Gene Ther., 2003, 10(26): 2112〜2118)自己相補的AAVベクターを用いた5から140倍効率的な形質導入が記載されたので、これらのベクターは、組換えAAVベクターで送達される導入遺伝子の大量で迅速な発現を実現するための第1選択のベクターとして選択された。自己相補的rAAVベクターは、低用量では1本鎖ベクターよりもずっと効率的であると現在考えられている。したがって、2本鎖自己相補的ゲノムを含むrAAVベクターでは、SMNタンパク質のより良い発現が得られ、したがってより良い治療が得られると予想されたことを考慮すると、当業者は、1本鎖ゲノムを含むrAAVベクターよりも2本鎖自己相補的ゲノムを含むrAAVベクターを実装するように促された。

国際公開第2010/071832号パンフレット国際公開第2014/022582号パンフレット国際公開第01/83692号パンフレット米国特許第5173414号国際公開第95/13365号パンフレット米国特許第5658776号国際公開第95/13392号パンフレット国際公開第96/17947号パンフレット PCT/US98/18600 国際公開第97/09441号パンフレット(PCT/US96/14423) 国際公開第97/08298号パンフレット(PCT/US96/13872) 国際公開第97/21825号パンフレット(PCT/US96/20777) 国際公開第97/06243号パンフレット(PCT/FR96/01064) 国際公開第99/11764号パンフレット米国特許第5786211号米国特許第5871982号米国特許第6258595号米国特許第6566118号国際公開第98/09657号パンフレット

McCarty等、Gene Ther., 2001, 8(16):1248〜54 McCarthy等、Gene Ther., 2003, 10(26): 2112〜2118 Meyer等、Molecular Therapy, 2015, 23(3): 477〜487 Sharp and Li, 1987,Nucleic Acids Research 15: 1281〜1295 Kim等、Gene. 1997, 199:293〜301 zur Megede等、Journal of Virology, 2000, 74: 2628〜2635 Boshart等、Cell, 41:521〜530(1985) Samulski等、1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077〜2081 Laughlin等、1983, Gene, 23:65〜73 Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661〜4666 Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533〜539 Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial, and Immunol., 158:97〜129 Ratschin等、Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984) Hermonat等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984) Tratschin等、Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985) McLaughlin等、J. Virol., 62: 1963 (1988) Lebkowski等、1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988) Samulski等(1989, J. Virol., 63:3822-3828) Perrin等(1995)Vaccine 13:1244〜1250 Paul等(1993) Human Gene Therapy 4:609〜615 Clark等(1996) Gene Therapy 3: 1124〜1132 Clark等、Hum. Gene Ther., 10(6):1031〜1039(1999) Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69: 427〜443 (2002) Xiao等、J. Virol. 1998;72:2224〜2232 Bowermann等、Neuromusc Disord 2012 Mar;22(3):263〜76

この先入観に対して、本明細書では、AAV9又はAAVrh10キャプシド及び1本鎖ゲノムを含むAAVベクターがSMAのマウスモデルの生存を大幅に増加させることができることが示される。

本発明は、脊髄性筋萎縮症(SMA)の治療の方法で使用するための、
(i)AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、及び
(ii)脊髄運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする遺伝子を含む1本鎖ゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターに関する。

特定の実施形態では、前記SMNタンパク質はヒトSMN1遺伝子に由来する。

更に特定の実施形態では、前記rAAVベクターはAAV9キャプシドを含む。

別の実施形態では、前記rAAVベクターは対象の脳脊髄液に、特にくも膜下腔内及び/又は脳室内注射によって投与される。

別の実施形態では、前記SMAは乳児SMA、中間型SMA、若年性SMA又は成人発症型SMAである。

更なる実施形態では、前記SMNタンパク質をコードする前記遺伝子は、下位運動ニューロン又は脊髄グリア細胞で機能するプロモーターの制御下にある。

別の実施形態では、rAAVベクター、特にAAV9又はAAVrh10キャプシド、特にAAV9キャプシドを含むrAAVベクターは、AAV5'-ITR(AAV2 5'-ITR等)、プロモーター(ユビキタスプロモーター、特にCAGプロモーター等)、SMNタンパク質をコードする遺伝子(ヒトSMN1遺伝子等)、ポリアデニル化シグナル(HBB2ポリアデニル化シグナル等)及びAAV3'-ITR(AAV2 3'-ITR等)をこの順番で含む1本鎖ゲノムを含有する。特定の実施形態では、rAAVベクターは、
AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、特にAAV9キャプシド、並びに
AAV2 5'-ITR、CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV2 3'-ITRをこの順番で含む1本鎖ゲノムを含む。

別の態様によれば、本発明は、
(i)AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、特に、AAV9キャプシド、及び
(ii)脊髄運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする遺伝子を含む1本鎖ゲノムを含むrAAVベクターに関する。

特定の実施形態では、前記rAAVベクターは、AAV5'-ITR(AAV2 5'-ITR等)、プロモーター(ユビキタスプロモーター、特にCAGプロモーター等)、SMNタンパク質をコードする遺伝子(ヒトSMN1遺伝子等)、ポリアデニル化シグナル(HBB2ポリアデニル化シグナル等)及びAAV3'-ITR(AAV2 3'-ITR等)をこの順番で含むゲノムを含有する。別の実施形態では、rAAVベクターは、
AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、特にAAV9キャプシド、並びに
AAV2 5'-ITR、CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV2 3'-ITRをこの順番で含む1本鎖ゲノムを含む。

別の態様によれば、本発明は、AAV5'-ITR(AAV2 5'-ITR等)、プロモーター(ユビキタスプロモーター、特にCAGプロモーター等)、SMNタンパク質をコードする遺伝子(ヒトSMN1遺伝子等)、ポリアデニル化シグナル(HBB2ポリアデニル化シグナル等)及びAAV3'-ITR(AAV2 3'-ITR等)をこの順番で含む単離核酸に関し、前記単離核酸は1本鎖AAVベクターを形成するように構築されている。特定の実施形態によれば、単離核酸は、AAV2 5'-ITR、CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV2 3'-ITRをこの順番で含む。特定の実施形態では、前記核酸配列は配列番号1で示した配列、又は配列番号1と少なくとも80%同一、例えば、配列番号1と少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一な配列を有する。

別の態様によれば、本発明は、本発明の単離核酸構築物を含むプラスミドに関する。

未治療の突然変異マウス(n=4)及びWTマウス(n=10)と比較した、ssAAV9-hSMN1ベクターのICV投与によって治療したSMAマウス(Smn^2B/-)(n=10)のカプラン-マイヤー生存曲線を示した図である。未治療及びssAAV-hSMN1治療Smn^2B/-マウス並びに野生型動物(群当たりマウスn=10)のカプラン-マイヤー生存曲線を示した図である。

本発明は、SMAの治療に有用な材料及び方法を提供する。

より詳細には、本発明は、脊髄性筋萎縮症(SMA)の治療の方法で使用するための、(i)AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、及び(ii)脊髄運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする遺伝子を含む1本鎖ゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを提供する。特定の実施形態では、本発明は、(i)AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、及び(ii)脊髄運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする遺伝子を含む導入遺伝子発現カセットを含む1本鎖ゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターであって、前記導入遺伝子発現カセットが、脊髄性筋萎縮症(SMA)の治療の方法で使用するために、2100ヌクレオチドと4400ヌクレオチドとの間に含まれるサイズを有するベクターに関する。本発明は更に、(i)AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、及び(ii)脊髄運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする遺伝子を含む1本鎖ゲノムを含むrAAVベクターをそれを必要とする対象に投与することを含む、SMAの治療の方法に関する。別の態様によれば、本発明は、SMAの治療のための医薬の製造のための、(i)AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、及び(ii)脊髄運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする遺伝子を含む1本鎖ゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターの使用に関する。本出願の実験の部で示したように、本発明のおかげで、自己相補的AAVベクターを使用して認められる生存の増加と少なくとも同等、又はほとんど同等のレベル、又はより良いレベルで、SMAを有する対象の生存を増加させることができる。上記で述べたように、ウイルス媒介遺伝子療法の分野での主な意見では、scAAVベクターがより優れた形質導入効率並びに迅速でより着実な導入遺伝子発現を実現するので、この効果は全く予想外であった。この一般的見解によれば、自己相補的AAVベクターによる形質導入効率のこの増加は、極めて低い用量のベクター投与で、伝統的な1本鎖AAVベクターと比較して同じ遺伝子産物レベル又は形質導入細胞数を実現できると解釈されることが予測された(McCarty等、2001,前掲)。この見方に対して、本明細書では、8×10¹²vg/kgのssAAV9-hSMN1ベクターの注射がSMAの動物モデルの寿命及び成長の著しい救済をもたらし、245日目に動物の40%が生存していることを示した。他の研究者による以前の研究では、2.6×10¹³及び1.8×10¹³vg/kgの自己相補的AAV9ベクターのICV注射がそれぞれ最高274日及び165日の生存の増加をもたらすことが示された(Meyer等、Molecular Therapy, 2015, 23(3): 477〜487)。明らかに、これらの用量は本発明者等が使用した1本鎖AAV9ベクターで効率的であることが示された用量よりも高い。顕著なことに、Meyer等は、1×10¹³及び2.7×10¹²vg/kgの自己相補的AAV9ベクターで治療したマウスの生存はそれぞれ24日及び19日で、未治療対照マウスと治療マウスとの間に統計学的差を認めなかった。前記の研究から、165日の顕著な生存増加には、ICV経路を介して注射した自己相補的AAV9ベクター(すなわち、1本鎖ベクターよりも形質導入効率がよいことが知られているベクター)の少なくとも1.8×10¹³vg/kgの用量が必要であることが予測された。本明細書では、1本鎖AAV9ベクター等の1本鎖AAVベクターの使用は、生存率(本発明では245日)及び実行された用量(8×10¹²vg/kg)の両方が本研究において良好であったので、より有利であり得ることが示されている。上記で示したように、先行技術では、ssAAVベクターのこのような良好な性能を示唆するものはなかった。

本発明は、1本鎖AAVベクターを実装し、1本鎖AAVベクターは産生が容易で、このベクターに導入することができる発現カセットがより長くてもよいという点において、自己相補的AAVベクターと比較して有利であり得る。この後者の点は、1本鎖AAVベクターには自己相補的AAVベクターよりも長い発現制御配列、及び/又はより多くの発現制御配列の導入を可能にする。SMN1遺伝子等の比較的小さい遺伝子では、一般的な見方は、このような自己相補的AAVベクターから当業者を遠ざけることになる自己相補的AAVベクターの欠点とは考えられないということである。それどころか、上記で述べたように、本発明の前は、自己相補的AAVベクターは、良好な形質導入効率が認識されたおかげで、1本鎖AAVベクターと比較して第1選択のベクターと考えられていた。本明細書では、SMN遺伝子を含有するrAAVは、自己相補的ベクターと同じくらい有利であるか、又は自己相補的ベクターよりも有利であり得ることが示される。

本発明の場合、rAAVベクターはAAV9又はAAVrh10キャプシドを含んでもよい。本明細書では、このようなベクターはそれぞれ、rAAVベクターに含有されるゲノムが得られる血清型とは関係なく「AAV9ベクター」又は「AAVrh10ベクター」と称される。したがって、AAV9ベクターは、AAV9キャプシド及びAAV9から得られたゲノム(すなわち、AAV9ITRを含む)を含むベクター又はAAV9キャプシド及びAAV9血清型とは異なる血清型から得られたゲノムを含むシュードタイプ化ベクターであってもよい。同様に、AAVrh10ベクターは、AAVrh10キャプシド及びAAV10から得られたゲノム(すなわち、AAVrh10ITRを含む)を含むベクター又はAAVrh10キャプシド及びAAVrh10血清型とは異なる血清型から得られたゲノムを含むシュードタイプ化ベクターであってもよい。

本発明のrAAVベクター内に存在するゲノムは、1本鎖である。特に、「1本鎖ゲノム」は、自己相補的ではないゲノムであり、すなわち、そこに含有されるコーディング領域は、分子内の2本鎖DNA鋳型を形成するためにMcCarty等、2001及び2003(前掲)で開示されたようには設計されていない。

rAAVベクター内に存在するゲノムは、AAVrep及びcap遺伝子を欠如しており、AAV ITRに隣接したSMNタンパク質をコードする遺伝子を含む。AAV ITRは、限定はしないが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10及びAAV11を含む任意のAAV血清型であってもよい。特定の実施形態では、本発明によって使用されたrAAVベクターは、AAV9キャプシド並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10及びAAV11 ITRから選択された5'及び3'ITRを含む1本鎖ゲノムを有する。更なる実施形態では、本発明によって使用されたrAAVベクターは、AAV9キャプシド並びに5'及び3'AAV2 ITRを含む1本鎖ゲノムを有する。更に特定の実施形態では、本発明によって使用されたrAAVベクターは、AAVrh10キャプシド並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10及びAAV11 ITRから選択された5'及び3'ITRを含む1本鎖ゲノムを有する。更なる実施形態では、本発明によって使用されたrAAVベクターは、AAVrh10キャプシド並びに5'及び3'AAV2 ITRを含む1本鎖ゲノムを有する。

特定の実施形態では、SMNタンパク質はヒトSMNタンパク質である。特定の実施形態では、ヒトSMNタンパク質をコードする核酸は、ジェンバンク受入番号NM_000344.3を有する配列から得られる。特定の実施形態では、SMNタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号8で示された配列からなるか、又はこの配列を含む。別の特定の実施形態では、SMNタンパク質、特にヒトSMNタンパク質をコードする遺伝子の配列は最適化されている。配列の最適化は、コドン最適化、GC含量の増加、CpG島の数の減少、選択的オープンリーディングフレーム(ARF)の数の減少及び/又はスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位の数の減少を含む、核酸配列中の複数の変化を含むことができる。遺伝子コードの縮重のため、異なる核酸分子が同じタンパク質をコードすることがある。異なる生物の遺伝子コードが、同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンの1つをその他のものよりも使用しがちなことが多いこともよく知られている。コドン最適化によって、所与の細胞の状況において存在するコドンの偏りを利用する変化がヌクレオチド配列に導入され、したがって、得られたコドン最適化ヌクレオチド配列は、コドン非最適化配列と比較して、このような所与の細胞の状況において比較的高いレベルで発現しやすい。本発明の好ましい実施形態では、SMNタンパク質をコードするヌクレオチド配列を最適化したこのような配列は、同じSMNタンパク質をコードするコドン非最適化ヌクレオチド配列と比較して、例えば、ヒトの特定のコドン使用頻度の偏りを利用することによって、ヒト細胞における配列の発現を改善するようにコドン最適化されている。

特定の実施形態では、最適化したSMNコーディング配列はコドンが最適化されており、並びに/又は配列番号8の野生型ヒトSMN1コーディング配列と比較して、GC含量が増加しており、並びに/又は選択的オープンリーディングフレームの数が減少しており、並びに/又はスプライスドナー及び/若しくはスプライスアクセプター部位の数が減少している。特定の実施形態では、SMNタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号8で示した配列と少なくとも70%同一、特に少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一である。

上記で述べたように、GC含量及び/又はARFの数に加えて、配列最適化はまた、配列中のCpG島の数の減少及び/又はスプライスドナー及びアクセプター部位の数の減少を含んでいてもよい。もちろん、当業者にはよく知られているように、配列最適化は、これらのパラメータ全ての間の調和であり、上記パラメータの少なくとも1つが改善され、その他のパラメータの1つ又は複数が改善されていない場合、最適化された配列が、インビボにおける導入遺伝子の発現改善及び/又は導入遺伝子に対する免疫応答の減少等の導入遺伝子の改善を導く限り、配列は最適化されたと考えてもよいことを意味する。

更に、ヒト細胞のコドン使用頻度に対するSMNタンパク質をコードするヌクレオチド配列の適合性は、コドン適合係数(CAI)として表すことができる。本明細書では、コドン適合係数は、高度に発現したヒト遺伝子のコドン使用頻度に対するある遺伝子のコドン使用頻度の相対的適合性の測定値と定義する。各コドンの相対的適合性(w)とは、同じアミノ酸の最も豊富なコドンの使用頻度に対する各コドンの使用頻度の比である。CAIは、これらの相対的適合性の値の相乗平均と定義する。非同義コドン及び終止コドン(遺伝コードに左右される)は除外する。CAI値は、0〜1の範囲で、値が高いほど最も豊富なコドンの割合が高いことを示している(Sharp and Li, 1987,Nucleic Acids Research 15: 1281〜1295を参照のこと、Kim等、Gene. 1997, 199:293〜301、zur Megede等、Journal of Virology, 2000, 74: 2628〜2635も参照のこと)。

特定の実施形態では、ヒトSMNタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号12、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示した配列のような最適化した配列からなるか、又はこの配列を含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、SMNタンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む。本発明の場合、「発現カセット」又は「導入遺伝子発現カセット」は、真核細胞において前記導入遺伝子の発現を可能にする配列に操作可能に連結した導入遺伝子(本明細書では、SMNタンパク質をコードする遺伝子)を含む核酸配列である。本発明のAAVベクターでは、SMNタンパク質をコードする遺伝子は、1つ又は複数の発現制御配列及び/又は導入遺伝子の発現を改善するその他の配列に操作可能に連結していてもよい。本明細書で使用したように、「操作可能に連結した」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチド要素の連結を意味する。ある核酸が別の核酸配列と機能的関係に配置されている場合に、その核酸は「操作可能に連結している」。例えば、プロモーター、又は別の転写調節配列は、コーディング配列の転写に影響を及ぼすならば、コーディング配列に操作可能に連結している。プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル等のこのような発現制御配列は当業界では公知である。

特定の実施形態では、発現カセットは2100ヌクレオチドと4400ヌクレオチドとの間、特に、2700ヌクレオチドと4300ヌクレオチドとの間、より詳細には3200ヌクレオチドと4200ヌクレオチドとの間を含むサイズである。特定の実施形態では、発現カセットのサイズは、約3200ヌクレオチド、約3300ヌクレオチド、約3400ヌクレオチド、約3500ヌクレオチド、約3600ヌクレオチド、約3700ヌクレオチド、約3800ヌクレオチド、約3900ヌクレオチド、約4000ヌクレオチド、約4100ヌクレオチド、又は約4200ヌクレオチドである。本発明によれば、数字の値に関するときの用語「約」は、この数字の値の5%プラス又はマイナスを意味する。

本発明のrAAVベクターでは、SMNタンパク質をコードする遺伝子は、プロモーターに操作可能に連結している。

本発明によれば、プロモーターは少なくとも下位運動ニューロン又は脊髄グリア細胞において、好ましくは少なくとも下位運動ニューロンにおいて機能する。運動ニューロンにおいて機能するプロモーターには、限定はしないが、ユビキタス及び運動ニューロン特異的プロモーターが含まれる。代表的なユビキタスプロモーターには、サイトメガロウイルスエンハンサー/トリベータアクチンプロモーター、ウサギベータグロビン遺伝子の第1エキソン及び第1イントロン/スプライスアクセプター(すなわち、配列番号3、4、5及び6で示した配列の、5'から3'までこの順番での融合から得られるCAGプロモーター)、サイトメガロウイルスエンハンサー/プロモーター(CMV)(場合によってはCMVエンハンサーを有する)(例えば、Boshart等、Cell, 41:521〜530(1985)を参照のこと)、SV40初期プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター(場合によって、RSVエンハンサーを有する)、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β-アクチンプロモーター及びEF1プロモーターが含まれる。運動ニューロンに特異的な代表的プロモーターには、公知の運動ニューロン由来因子であるカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)のプロモーターが含まれる。運動ニューロンで機能するその他のプロモーターには、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、シナプシンのプロモーター、Hb9又はニューロン制限サイレンサーエレメント(NRSE)を含むユビキタスプロモーターが含まれる。グリア細胞に特異的な代表的プロモーターには、グリア繊維性酸性タンパク質遺伝子(GFAP)のプロモーターが含まれる。

発現カセットは更に、ポリアデニル化シグナルを含む。例示的ポリアデニル化シグナルには、限定はしないが、SMN1遺伝子ポリアデニル化シグナル或いはヒトベータグロビン(HBB2)ポリアデニル化シグナル(配列番号9又は配列番号16で示された配列等)、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、SV40ポリアデニル化シグナル又は別の天然に生じる、若しくは人工的ポリアデニル化シグナル等の異種ポリアデニル化シグナルが含まれる。

コザック配列(配列番号7で示された配列等)等のその他の配列は当業者には公知で、導入遺伝子の発現を可能にするために導入される。

特定の実施形態では、発現カセットは、プロモーター、SMNタンパク質をコードする遺伝子及びポリアデニル化シグナルをこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、発現カセットは、SMNタンパク質をコードする遺伝子とポリアデニル化シグナルとの間に位置する調節エレメントを更に含んでいてもよい。本発明において有用であり得る代表的な調節エレメントには、限定はしないが、SMNタンパク質をコードする遺伝子の3'-UTR(ヒトSMN1遺伝子の3'-UTR、例えば、配列番号17で示した配列等)、HBB2遺伝子の3'-UTR、SV40の3'-UTR又はウシ成長ホルモンの3'-UTR等の、遺伝子の3'-非翻訳領域(3'-UTR)が含まれる。

特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号18で示したWPRE等のWPRE配列を含まない。

別の実施形態では、発現カセットは、CAGプロモーター(例えば、配列番号3、4、5及び6で示した配列の5'から3'までこの順番での融合から得られた配列)、SMNタンパク質をコードする遺伝子(配列番号8、配列番号12、配列番号13、配列番号14又は配列番号15、特に配列番号8で示した配列等)及びポリアデニル化シグナル(配列番号9又は配列番号17で示した配列、特に配列番号9等のHBB2ポリアデニル化シグナル等)をこの順番で含む。

特定の実施形態では、本発明のrAAVベクター中のゲノム(特に、本発明のrAAV9ベクター)は、AAV5'-ITR(AAV2 5'-ITR、特に配列番号2で示した配列等)、プロモーター(ユビキタスプロモーター、特にCAGプロモーター等)、SMNタンパク質(ヒトSMNタンパク質等)をコードする遺伝子、ポリアデニル化シグナル(HBB2ポリアデニル化シグナル等)及びAAV3'-ITR(AAV2 3'-ITR、特に配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

更に特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。特に、ゲノムは配列番号1で示した配列を含む。別の特定の実施形態では、ゲノムは、配列番号1と少なくとも80%同一、例えば、配列番号1と少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一な、真核細胞中でSMNタンパク質の発現を可能にする核酸配列を含む。別の特定の実施形態では、ゲノムは、配列番号11と少なくとも80%同一、例えば、配列番号11と少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一な、真核細胞中でSMNタンパク質の発現を可能にする核酸配列を含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号8からなるヒトSMN1コーディング配列、
- 配列番号9又は配列番号16で示した配列等のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号12からなるヒトSMN1コーディング配列、
- 配列番号9又は配列番号16で示した配列等のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号13からなるヒトSMN1コーディング配列、
- 配列番号9又は配列番号16で示した配列等のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号14からなるヒトSMN1コーディング配列、
- 配列番号9又は配列番号16で示した配列等のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号15からなるヒトSMN1コーディング配列、
- 配列番号9又は配列番号16で示した配列等のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号8からなるヒトSMN1コーディング配列、
- 配列番号9のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号12からなるヒトSMN1コーディング配列、
- 配列番号9のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号13からなるヒトSMN1コーディング配列、
- 配列番号9のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号14からなるヒトSMN1コーディング配列、
- 配列番号9のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号15からなるヒトSMN1コーディング配列、
- 配列番号9のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号8からなるヒトSMN1コーディング配列、
- ヒトSMN1 3'-UTR等の調節エレメント(例えば、配列番号17で示した配列)、
- 配列番号9又は配列番号16で示した配列等のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号12からなるヒトSMN1コーディング配列、
- ヒトSMN1 3'-UTR等の調節エレメント(例えば、配列番号17で示した配列)、
- 配列番号9又は配列番号16で示した配列等のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号13からなるヒトSMN1コーディング配列、
- ヒトSMN1 3'-UTR等の調節エレメント(例えば、配列番号17で示した配列)、
- 配列番号9又は配列番号16で示した配列等のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号14からなるヒトSMN1コーディング配列、
- ヒトSMN1 3'-UTR等の調節エレメント(例えば、配列番号17で示した配列)、
- 配列番号9又は配列番号16で示した配列等のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号15からなるヒトSMN1コーディング配列、
- ヒトSMN1 3'-UTR等の調節エレメント(例えば、配列番号17で示した配列)、
- 配列番号9又は配列番号16で示した配列等のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号8からなるヒトSMN1コーディング配列、
- ヒトSMN1 3'-UTR等の調節エレメント(例えば、配列番号17で示した配列)、
- 配列番号16のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号12からなるヒトSMN1コーディング配列、
- ヒトSMN1 3'-UTR等の調節エレメント(例えば、配列番号17で示した配列)、
- 配列番号16のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号13からなるヒトSMN1コーディング配列、
- ヒトSMN1 3'-UTR等の調節エレメント(例えば、配列番号17で示した配列)、
- 配列番号16のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号14からなるヒトSMN1コーディング配列、
- ヒトSMN1 3'-UTR等の調節エレメント(例えば、配列番号17で示した配列)、
- 配列番号16のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

別の特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- CAGプロモーター、
- 配列番号15からなるヒトSMN1コーディング配列、
- ヒトSMN1 3'-UTR等の調節エレメント(例えば、配列番号17で示した配列)、
- 配列番号16のHBB2ポリアデニル化シグナル、及び
- AAV2 3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

本発明のおかげで、SMNタンパク質をコードする遺伝子は、脊髄運動ニューロン等の下位運動ニューロン(すなわち、細胞体が脊髄内にある運動ニューロン)及び脊髄グリア細胞に送達され得る。

特定の実施形態では、SMAは、新生児SMA、乳児SMA、中間型SMA、若年性SMA又は成人発症型SMAである。

別の態様では、本発明は本発明のrAAVゲノムを含むDNAプラスミドを提供する。rAAVの産生は、以下の成分:rAAVゲノム、rAAVゲノムから分離した(すなわち、rAAVゲノム中にはない)AAVrep及びcap遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が単一細胞(本明細書では、パッケージング細胞と呼ぶ)内に存在することを必要とする。シュードタイプ化rAAVの産生は、例えば、国際公開第01/83692号パンフレットに開示されている。産生は、2、3又はそれ以上のプラスミドによる細胞のトランスフェクションを実行してもよい。例えば、(i)Rep/Capカセットを有するプラスミド、(ii)rAAVゲノム(すなわち、AAV ITRに隣接した導入遺伝子)を有するプラスミド、及び(iii)ヘルパーウイルス機能(アデノウイルスヘルパー機能等)を有するプラスミドを含む3つのプラスミドを使用してもよい。別の実施形態では、(i)Rep及びCap遺伝子及びヘルパーウイルス機能を含むプラスミド、並びに(ii)rAAVゲノムを含むプラスミドを含む2プラスミド系を使用してもよい。

したがって、特定の態様では、本発明は更に、AAV5'-ITR(AAV2 5'-ITR、特に配列番号2で示した配列等)、上記で提供した任意の実施形態によって上記で定義したような発現カセット及びAAV ITRをこの順番で含む単離核酸に関する。特定の実施形態では、本発明の単離核酸は、プロモーター(ユビキタスプロモーター、特にCAGプロモーター等)、SMNタンパク質をコードする遺伝子(ヒトSMN1遺伝子等)、ポリアデニル化シグナル(HBB2ポリアデニル化シグナル等)及びAAV3'-ITR(AAV2 3'-ITR、特に配列番号10で示した配列等)をこの順番で含み、前記単離核酸は1本鎖AAVベクターを形成するように構築されている。特に、本発明の単離核酸は、AAV2 ITR、CAGプロモーター、ヒトSMN遺伝子(ヒトSMN1遺伝子等)、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV2 ITRをこの順番で含んでいてもよい。より詳細には、本発明の単離核酸は、配列番号1と少なくとも80%同一、例えば、配列番号1と少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一な、真核細胞中でSMNタンパク質の発現を可能にする核酸配列を含むことができる。より詳細には、本発明の単離核酸は、配列番号11と少なくとも80%同一、例えば、配列番号11と少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一な、真核細胞中でSMNタンパク質の発現を可能にする核酸配列を含むことができる。

更なる態様では、本発明は、本発明の単離核酸構築物を含むプラスミドに関する。このプラスミドは、本発明によるrAAVベクターを産生する細胞にrAAVゲノムを提供することによって、前記細胞に導入することができる。

パッケージング細胞の作製方法は、AAV粒子産生のために必要な成分全てを安定して発現する細胞株を生成することである。例えば、AAVrep及びcap遺伝子を欠如したrAAVゲノムを含む1つのプラスミド(又は複数のプラスミド)、rAAVゲノムから分離したAAVrep及びcap遺伝子並びにネオマイシン耐性遺伝子等の選択マーカーを細胞のゲノムに組み込む。AAVゲノムは、GCテーリング(Samulski等、1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077〜2081)、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加(Laughlin等、1983, Gene, 23:65〜73)等の手法によって、又は平滑末端直接連結(Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661〜4666)によって、細菌プラスミドに導入されたことがある。この方法の利点は、細胞が選択可能で、rAAVの大規模産生のために適切であることである。適切な方法のその他の例は、rAAVゲノム及び/又はrep及びcap遺伝子をパッケージング細胞に導入するために、プラスミドよりもアデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。

rAAV産生の一般的原理は、例えば、Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533〜539及びMuzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial, and Immunol., 158:97〜129に概説されている。様々なアプローチが、Ratschin等、Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984);Hermonat等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984);Tratschin等、Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985);McLaughlin等、J. Virol., 62: 1963 (1988);及びLebkowski等、1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988);Samulski等(1989, J. Virol., 63:3822-3828);米国特許第5173414号;国際公開第95/13365号パンフレット及び対応する米国特許第5658776号;国際公開第95/13392号パンフレット;国際公開第96/17947号パンフレット;PCT/US98/18600;国際公開第97/09441号パンフレット(PCT/US96/14423);国際公開第97/08298号パンフレット(PCT/US96/13872);国際公開第97/21825号パンフレット(PCT/US96/20777);国際公開第97/06243号パンフレット(PCT/FR96/01064);国際公開第99/11764号パンフレット;Perrin等(1995)Vaccine 13:1244〜1250;Paul等(1993) Human Gene Therapy 4:609〜615;Clark等(1996) Gene Therapy 3: 1124〜1132;米国特許第5786211号; 米国特許第5871982号及び米国特許第6258595号に記載されている。したがって、本発明はまた、感染性rAAVを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、HeLa細胞、HEK293細胞、HEK293T、HEK293vc及びPerC.6細胞(コグネイト293株)等の安定的に形質転換された
がん細胞であってもよい。別の実施形態では、パッケージング細胞は、継代数の少ない293細胞(アデノウイルスのE1で形質転換したヒト胎児腎細胞)、MRC-5細胞(ヒト胎児線維芽細胞)、WI-38細胞(ヒト胎児線維芽細胞)、ベロ細胞(サル腎細胞)及びFRhL-2細胞(アカゲザル胎児肺細胞)等の形質転換されたがん細胞ではない細胞である。

rAAVは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配等による当業界で標準の方法によって精製することができる。ヘルパーウイルスからrAAVベクターを精製する方法は当業界では公知で、例えば、Clark等、Hum. Gene Ther., 10(6):1031〜1039(1999);Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69: 427〜443 (2002);米国特許第6566118号及び国際公開第98/09657号パンフレットで開示された方法を含む。

別の態様では、本発明は本出願で開示したrAAVを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体中にrAAVを含む。組成物はまた、希釈剤及びアジュバント等のその他の成分を含んでいてもよい。許容される担体、希釈剤及びアジュバントは、レシピエントに対して無毒で、使用した投薬量及び濃度では好ましくは不活性で、リン酸、クエン酸又はその他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸等の抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又はイムノグロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の疎水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、2糖類及びその他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、ナトリウム等の塩形成対イオン、及び/又はTween、プルロニック又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。

本発明による使用のためのrAAVベクターは、全身同時送達の有無にかかわらず、局所的に投与してもよい。本発明の場合、局所投与はrAAVベクターのくも膜下腔内注射等を介した、対象の脳脊髄液への投与を意味する。一部の実施形態では、本発明は更に、有効量のrAAVの脳内投与による投与を含む。一部の実施形態では、rAAVはくも膜下腔内投与及び脳内投与によって投与してもよい。一部の実施形態では、rAAVベクターは、くも膜下腔内及び/又は脳内及び/又は末梢(血管、例えば、静脈内又は動脈内、特に静脈内等)投与の併用によって投与してもよい。

本明細書で使用したように、用語「くも膜下腔内投与」は、rAAV又はrAAVを含む組成物の脊柱管への投与を意味する。例えば、くも膜下腔内投与は、脊柱管の頸部領域、脊柱管の胸部領域、又は脊柱管の腰部領域への注射を含むことができる。典型的に、くも膜下腔内投与は、薬剤、例えば、rAAVを含む組成物を、脊柱管のくも膜と脳軟膜との間の領域である、脊柱管のくも膜下腔(くも膜下腔)に注射することによって実施する。くも膜下腔は、くも膜小柱(くも膜から伸び、軟膜に入り込む繊細な結合組織繊維)及び脳脊髄液が含有される相互連絡するチャネルからなる海綿状組織によって占有されている。一部の実施形態では、くも膜下腔内投与は、脊髄の脈管構造への投与ではない。ある特定の実施形態では、くも膜下腔内投与は対象の腰部領域内である。

本明細書で使用したように、用語「脳内投与」は、薬剤の脳内及び/又は脳周囲への投与を意味する。脳内投与には、限定はしないが、薬剤の大脳、髄質、脳橋、小脳、頭蓋腔及び脳の周囲の髄膜への投与を含む。脳内投与は、脳の硬膜、くも膜及び軟膜への投与を含んでいてもよい。脳内投与には、一部の実施形態では、薬剤の脳の周囲のくも膜下腔の脳脊髄液(CSF)への投与を含んでいてもよい。脳内投与は、一部の実施形態では、薬剤の脳/前脳の脳室、例えば、右側脳室、左側脳室、第3脳室、第4脳室への投与を含んでいてもよい。一部の実施形態では、脳内投与は、脳の脈管構造への投与ではない。

一部の実施形態では、脳内投与は、定位固定手法を使用した注射を含む。定位固定手法は当業界ではよく知られており、典型的には、注射を特定の脳内領域、例えば、脳室領域に導くために一緒に使用されるコンピュータ及び3次元走査装置の使用を含む。微量注入ポンプ(例えば、World Precision Instruments社製)も使用することができる。一部の実施形態では、rAAVを含む組成物を送達するために微量注入ポンプを使用する。一部の実施形態では、組成物の注入速度は、1μl/分から100μl/分の範囲内である。当業者に理解されるように、注入速度は、例えば、対象の種、対象の年齢、対象の体重/大きさ、rAAVの血清型、必要な投薬量、標的とする脳内領域等を含む様々な要素に左右される。したがって、ある特定の環境では、当業者はその他の注入速度が適切であると判断することがある。

更に、rAAVベクターが血液脳関門を横断する能力のおかげで、本発明で実装されたrAAVベクター(すなわち、rAAV9又はrAAVrh10ベクター)は、全身経路を介して投与することができる。したがって、rAAVベクターの投与方法には、限定はしないが、筋肉内、腹腔内、血管(例えば、静脈内又は動脈内)、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が含まれる。特定の実施形態では、全身投与とは、rAAVベクターの血管注射、特に静脈内注射である。

特定の実施形態では、rAAVベクターは脳脊髄液内に、特にくも膜下腔内注射によって投与する。特定の実施形態では、rAAVベクターのくも膜下腔内送達後、患者をトレンデレンブルグ体位にする。

SMAの治療に有効な本発明のrAAVベクターの量は、標準臨床技術によって決定することができる。更に、最適な投薬量範囲の予測に役立てるために、インビボ及び/又はインビトロアッセイを任意選択で使用することができる。本発明のrAAVベクターを必要とする対象に投与したrAAVベクターの投薬量は、限定はしないが、治療する疾患の特定の種類又は段階、対象の年齢又は治療効果を得るために必要な発現のレベルを含むいくつかの要素に基づいて変化する。当業者は、当分野における知識に基づいて、これらの要素及びその他に基づいて必要な投薬量範囲を容易に決定することができる。ベクターの典型的な用量は、体重キログラム当たり少なくとも1×10⁸ベクターゲノム(vg/kg)、少なくとも1×10⁹vg/kg、少なくとも1×10¹⁰vg/kg、少なくとも1×10¹¹vg/kg、少なくとも1×10¹²vg/kg、少なくとも1×10¹³vg/kg、少なくとも1×10¹⁴vg/kg又は少なくとも1×10¹⁵vg/kg等である。

特定の実施形態では、単一ゲノムはCAGプロモーターを含む。特に、ゲノムは、AAV 5'-ITR、CAGプロモーター、SMNタンパク質をコードする遺伝子、ポリアデニル化シグナル及びAAV3'-ITRをこの順番で含む。

別の実施形態では、単一ゲノムはHBB2ポリアデニル化シグナルを含む。特に、ゲノムは、AAV 5'-ITR、プロモーター、SMNタンパク質をコードする遺伝子、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV3'-ITRをこの順番で含む。

これらの実施形態では、1本鎖ゲノムは更に、遺伝子とポリアデニル化シグナルとの間に、SMN1遺伝子の3'-UTR等の遺伝子の3'-UTR等の調節エレメントを含んでいてもよい。

特定の実施形態では、rAAVベクターのゲノムは、
- AAV2 5'-ITR等のAAV 5'-ITR(配列番号2で示した配列等)、
- 上記で提供した任意の実施形態によって上記で定義した発現カセット、
- AAV2 3'-ITR等のAAV3'-ITR(配列番号10で示した配列等)をこの順番で含む。

更に特定の実施形態によれば、rAAVベクターのゲノムは、AAV2 5'-ITR、CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV2 3'-ITRをこの順番で含む。特に、ゲノムは、配列番号1で示した配列、又は、配列番号1と少なくとも80%同一、例えば、配列番号1と少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一な、真核細胞中でSMNタンパク質の発現を可能にする配列を含む。特に、ゲノムは、配列番号11で示した配列、又は、配列番号11と少なくとも80%同一、例えば、配列番号11と少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一な、真
核細胞中でSMNタンパク質の発現を可能にする配列を含む。

本発明の特定の目的
1.AAV5'-ITR、
プロモーター、
SMNタンパク質をコードする遺伝子、
場合によって、WPREではない更なる調節エレメント、
ポリアデニル化シグナル、及び
AAV3'-ITR、をこの順番で含む単離核酸配列であって、
自己相補的ではない1本鎖AAVゲノムから構築される単離核酸配列。

2.AAV5'-ITRがAAV2 5'-ITRであり、AAV3'-ITRがAAV2 3'-ITRである、目的1に記載の単離核酸配列。

3.プロモーターがユビキタスプロモーターである、目的1又は2に記載の単離核酸配列。

4.ユビキタスプロモーターがCAGプロモーターである、目的3に記載の単離核酸配列。

5.SMNタンパク質をコードする遺伝子がヒトSMN1遺伝子である、目的1から4のいずれか1つに記載の単離核酸配列。

6.前記核酸配列がプロモーターと遺伝子との間にSV40イントロンを含まない、目的1から5のいずれか1つに記載の単離核酸配列。

7.前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル配列ではない、目的1から6のいずれか1つに記載の単離核酸配列。

8.ポリアデニル化シグナルがHBB2ポリアデニル化シグナルである、目的1から7のいずれか1つに記載の単離核酸配列。

9.AAV2 5'-ITR、
CAGプロモーター、
ヒトSMN1遺伝子、
場合によって、WPREではない更なる調節エレメント、
HBB2ポリアデニル化シグナル、及び
AAV2 3'-ITRをこの順番で含む、目的1から8のいずれか1つに記載の単離核酸配列。

10.更なる調節エレメントがSMNタンパク質をコードする遺伝子の3'-非翻訳領域(UTR)である、目的1から9のいずれか1つに記載の単離核酸配列。

11.更なる調節エレメントがヒトSMN1遺伝子の3'-UTRである、目的10に記載の単離核酸配列。

12.AAV2 5'-ITR、
CAGプロモーター、
ヒトSMN1遺伝子、
ヒトSMN1遺伝子の3'-UTR、
HBB2ポリアデニル化シグナル、及び
AAV2 3'-ITRをこの順番で含む、目的1から11のいずれか1つに記載の単離核酸配列。

13.前記核酸配列が、配列番号1若しくは配列番号11で示した配列、又は配列番号1若しくは配列番号11と少なくとも80%同一な配列、例えば、配列番号1若しくは配列番号11と少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一な配列を含むか又はこれからなる、目的1から12のいずれか1つに記載の単離核酸配列。

14.目的1から13のいずれか1つに記載の核酸配列を含むベクター。

15.プラスミド又はAAVベクターである、目的14に記載のベクター。

16.AAVベクターがAAV9キャプシド及びAAVrh10キャプシドから選択されるキャプシドを含む、目的15に記載のベクター。

17.AAVベクターがAAV9キャプシドを含む、目的15又は16に記載のベクター。

18.脊髄性筋萎縮症(SMA)の治療の方法で使用するための、目的14から17のいずれか1つに記載のベクター。

19.前記ベクターが対象の脳脊髄液への投与のためである、目的18に記載の使用のためのベクター。

20.前記ベクターがクモ膜下腔内及び/又は脳室内注射による投与のためである、目的19に記載の使用のためのベクター。

(実施例1)
1本鎖ゲノムにヒトSMN1遺伝子を有するAAVベクターを投与した後、SMAのマウスモデルの生存が予測を超えて大いに改善されることを本明細書で実証する。

材料及び方法
ベクター産生
使用するAAVベクターは、CAGプロモーター(ハイブリッドCMVエンハンサー/トリ-β-アクチンプロモーター及びベータグロビンスプライスアクセプター部位)の制御下にあるヒトSMN1遺伝子並びにHBB2遺伝子のポリA領域を有する1本鎖組換えAAV9ベクターである。

ssAAV9ベクターは、標準手法を使用する3トランスフェクション系(Xiao等、J. Virol. 1998;72:2224〜2232)によって産生した。シュードタイプ化組換えrAAV2/9(rAAV9)ウイルス調製物は、AAV2逆方向末端反復(ITR)組換えゲノムのAAV9キャプシドへのパッケージングによって作製した。簡単に説明すると、CAG-hSMN1構築物を有するシス作用プラスミド、ベクターの複製及び構造に必要なタンパク質をコードするトランス補完rep-cap9プラスミド、並びにアデノウイルスヘルパープラスミドをHEK293細胞にコトランスフェクトした。ベクター粒子は、2回連続した塩化セシウム勾配超遠心及び滅菌PBS-MKに対する透析によって精製した。DNAse I耐性ウイルス粒子は、プロテイナーゼKで処理した。ウイルス力価は、TaqManリアルタイムPCRアッセイ(Applied Biosystem社)によってポリA領域に特異的なプライマー及びプローブを用いて定量し、ml当たりウイルスゲノム(vg/ml)として表現した。

動物
Smn^2B/-マウスは、Smn^2B/2Bホモ接合体(Rashmi Kothary, Ottawa, Ontario, Canadaから恵与された)及びSmn^+/-ヘテロ接合体マウス(Jackson Laboratories)を交配して2つのコロニーによって得られ、繁殖させてSmn^2B/+及びSmn^2B/-マウスを作製した。同腹仔は出生時に遺伝子型を同定した。マウスは12時間明12時間暗サイクル下に維持し、Diet Recoveryゲルを補給した標準食、食物及び水は不断給餌した。マウスの世話及び処置は、動物実験法に関する国内及び欧州の法令に従って実施し、施設内倫理委員会によって承認された。

インビボにおける遺伝子療法
Smn^2B/-マウスは、出生時(P0)に脳室内(ICV)注射によってウイルス粒子で治療した;ssAAV9-hSMN1(8×10e¹²vg/kg、全体積7μl)を右側脳室に投与した。対照Smn^2B/+同腹仔及び野生型マウスには、出生時に同じ手法を使用してPBS-MK(MgCl₂ 1mM、KCl 2.5mM)7μlを与えた。

結果
結果を図1に示す。

未治療Smn^2B/-マウスは全て、約25日齢で死亡する(n=4)ことがわかった。対照的に、試験終了時、すなわち、200日目に、治療したマウス(n=10)の70%はまだ生きており、本発明のrAAVベクターのおかげで生存の目覚ましい改善が得られることが示された。245日目に、動物の40%がまだ生きていたことは印象深かった。

以前に、SMNΔ7マウスモデルは、SMAのAAV9遺伝子療法の評価のために使用されたが、SMNΔ7モデルはSmn^2B/-マウスモデルよりも重篤な表現型を表し、前記SMNΔ7マウスは早期に死亡するので、この長期間の改善を観察することはできなかった。以前のデータは、AAV9キャプシドが、AAV9ベクターの血液脳関門の横断並びに中枢神経系中の運動ニューロン及びグリア細胞の形質導入に関与することを示しているが、当分野における共通の一般知識は、最適な生存改善を得るために、当業者に1本鎖AAV9ベクターよりも2本鎖自己相補的AAV9ベクターの実装を促すだろう。したがって、本明細書で提示した範囲までの改善は、予期されなかった。

(実施例2)
本発明で得られた改善を示すために、更に実験を実施した。

この研究の目的は、脊髄性筋萎縮症のマウスモデルにおいてヒトSMN1を発現する1本鎖(ss)AAV9ベクターの治療有効性を評価することである。Smn^2B/-新生仔マウスに脳室内(ICV)投与した3つのssAAV9-hSMN1ベクター及び1つのssAAVrh10-hSMN1ベクターの効果を、注射後21日目及び90日目に比較した。

異なるパラメータ:
-生存率、
-体重、
- 移動及び筋肉強度、
- ベクター体内分布及び導入遺伝子発現、
- 様々な組織におけるヒトSMNタンパク質の発現、
- 脊髄運動ニューロンの計数、
- 骨格筋組織学的検査、
- 神経筋接合(NMJ)形態を分析した。

野生型ヒトSMN1コーディング配列(NCBI参照配列:NM_000344.3)及び異なるプロモーター及び調節配列を含有する3つのssAAV9-hSMN1ベクター(7209、7210及び7211)は、HEK293細胞において3トランスフェクション系によって産生した。ベクターは、以下に示したように設計した:
- ベクター7209:
CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、ヒトSMN1 3'-UTR及びHBB2遺伝子のポリA領域を有するプラスミド;
- ベクター7210:
CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子及びHBB2遺伝子のポリA領域を有する実施例1のベクター;
- ベクター7211:
CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)及びHBB2遺伝子のポリA領域を有するベクター。

ssAAVrh10-hSMN1ベクターはまた、HEK293細胞において3トランスフェクション系によって産生した。このベクターは、以下の要素:CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子及びHBB2遺伝子のポリA領域を含有する。

このベクターをSmn^2B/-新生仔マウスの脳脊髄液に投与した(出生後日数0〜1日-P0/1、ICV注射による)。Smn^2B/-マウスは、約15日齢で体重減少及び疾患の臨床徴候を伴う重篤な表現型を発症し、コロニーのSmn^2B/-マウスの現在の平均生存率は26日である(Bowermann等、Neuromusc Disord 2012 Mar;22(3):263〜76によって開発されたマウス系統)。

インビボにおける手順は、治療後の突然変異マウスの寿命を対照と比較して評価するために設計した。動物の群(3系列、群当たりマウスn=10)を使用して、治療したSmn^2B/-マウスの平均余命を注射していない突然変異マウスと比較して分析した。

これまでのところ、ssAAV9_7209、_7210及び_7211ベクター並びにssAAVrh10_7210の効果を評価するには4つの現行のインビボにおける手順がある。これらの実験で使用した用量は、いずれのベクターも8×10¹²vg/Kgであった。図2は、治療した、及び未治療のSmn^2B/-マウス及び野生型動物の生存率を示しており、治療後に寿命の明らかな延長が認められた(各ベクターのデータ収集時の平均生存率を図に示す)。

Claims

脊髄性筋萎縮症(SMA)の治療の方法で使用するための組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターであって、
(i)AAV9キャプシド及びAAVrh10キャプシドから選択されたキャプシド、並びに
(ii)自己相補的ではない1本鎖ゲノムであり、
AAV5'-ITR、
CAGプロモーター、
ヒト生存運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする遺伝子、
場合によって、更なる調節エレメント、
HBB2ポリアデニル化シグナル、及び
AAV3'-ITRをこの順番で含む核酸配列を含有するゲノムを含み、
前記更なる調節エレメントがWPREではない、rAVVベクター。
核酸配列が、
AAV5'-ITR、
CAGプロモーター、
ヒト生存運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする遺伝子、
更なる調節エレメント、
HBB2ポリアデニル化シグナル、及び
AAV3'-ITRをこの順番で含む、請求項1に記載の使用のためのrAAVベクター。
キャプシドがAAV9キャプシドである、請求項1又は2に記載の使用のためのrAAVベクター。
遺伝子がヒトSMN1遺伝子である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
更なる調節エレメントがヒトSMN1遺伝子の3'-非翻訳領域(UTR)である、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
核酸配列が、配列番号1若しくは配列番号11で示した配列、又は、配列番号1若しくは配列番号11と少なくとも80%同一、例えば、配列番号1若しくは配列番号11と少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一な配列を含むか又はこれからなる、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
rAAVベクターが対象の脳脊髄液に投与される、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
脊髄性筋萎縮症(SMA)の治療の方法で使用するための組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターであって、
(i)AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、及び
(ii)ヒト生存運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする遺伝子を含む自己相補的ゲノムではない1本鎖ゲノムであり、WPREを含まず、SV40イントロンを含まない1本鎖ゲノムを含み、
対象の脳脊髄液に投与される、rAAVベクター。
前記SMNタンパク質がヒトSMN1遺伝子に由来する、請求項8に記載の使用のためのrAAVベクター。
rAAVベクターがAAV9キャプシドを含む、請求項8又は9に記載の使用のためのrAAVベクター。
rAAVベクターがクモ膜下腔内及び/又は脳室内注射によって投与される、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
前記SMAが、乳児SMA、中間型SMA、若年性SMA又は成人発症型SMAである、請求項1から11のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
前記SMNタンパク質をコードする前記遺伝子が、下位運動ニューロン及び/又は脊髄グリア細胞で機能するプロモーターの制御下にある、請求項7から12のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
1本鎖ゲノムが、AAV5'-ITR、プロモーター、SMNタンパク質をコードする遺伝子、ポリアデニル化シグナル及びAAV3'-ITRをこの順番で含む、請求項7から13のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
AAV5'-ITRがAAV2 5'-ITRであり、AAV3'-ITRがAAV2 3'-ITRである、請求項1から6のいずれか一項に記載の、又は請求項14に記載の使用のためのrAAVベクター。
プロモーターがユビキタスプロモーターである、請求項14又は15に記載の使用のためのrAAVベクター。
ユビキタスプロモーターがCAGプロモーターである、請求項16に記載の使用のためのrAAVベクター。
SMNタンパク質をコードする遺伝子がヒトSMN1遺伝子である、請求項14から17のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
ポリアデニル化シグナルがHBB2ポリアデニル化シグナルである、請求項14から18のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
(i)AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、及び
(ii)自己相補的ではない1本鎖ゲノムであり、CAGプロモーターの制御下にヒト生存運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする遺伝子を含む1本鎖ゲノムを含む、rAAVベクター。
AAV5'-ITR、プロモーター、SMNタンパク質をコードする遺伝子、ポリアデニル化シグナル及びAAV3'-ITRをこの順番で含むゲノムを含有する、請求項20に記載のrAAVベクター。
AAV5'-ITRがAAV2 5'-ITRであり、AAV3'-ITRがAAV2 3'-ITRである、請求項21に記載のrAAVベクター。
プロモーターがユビキタスプロモーターである、請求項21又は22に記載のrAAVベクター。
ユビキタスプロモーターがCAGプロモーターである、請求項23に記載のrAAVベクター。
SMNタンパク質をコードする遺伝子がヒトSMN1遺伝子である、請求項20から23のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
ポリアデニル化シグナルがHBB2ポリアデニル化シグナルである、請求項20から25のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
前記rAAVベクターが、
(i)AAV9キャプシド又はAAVrh10キャプシド、並びに
(ii)AAV2 5'-ITR、CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV2 3'-ITRをこの順番で含む1本鎖ゲノムを含む、請求項20から26のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
ゲノムが、ヒトSMNタンパク質をコードする遺伝子とポリアデニル化シグナルとの間に位置する更なる調節エレメントを含む、請求項20から27のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
更なる調節エレメントが、ヒトSMNタンパク質をコードする遺伝子の3'-非翻訳領域(UTR)に対応する、請求項28に記載のrAAVベクター。
更なる調節エレメントが、ヒトSMN1遺伝子の3'-UTRに対応する、請求項29に記載のrAAVベクター。
前記rAAVベクターがAAV9キャプシドを含む、請求項20から30のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
AAV5'-ITR、プロモーター、SMNタンパク質をコードする遺伝子、ポリアデニル化シグナル及びAAV3'-ITRをこの順番で含む単離核酸配列であって、自己相補的ではない1本鎖AAVゲノムを形成するために構築される単離核酸配列。
AAV5'-ITRがAAV2 5'-ITRであり、前記AAV3'-ITRがAAV2 3'-ITRである、請求項32に記載の単離核酸配列。
プロモーターがユビキタスプロモーターである、請求項32又は33に記載の単離核酸配列。
ユビキタスプロモーターがCAGプロモーターである、請求項34に記載の単離核酸配列。
ヒトSMNタンパク質をコードする遺伝子がヒトSMN1遺伝子である、請求項32から35のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
ポリアデニル化シグナルがHBB2ポリアデニル化シグナルである、請求項32から36のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
AAV2 5'-ITR、CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV2 3'-ITRをこの順番で含む、請求項32から37のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
ヒトSMNタンパク質をコードする遺伝子とポリアデニル化シグナルとの間に位置する更なる調節エレメントを更に含む、請求項32から38のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
更なる調節エレメントが、ヒトSMNタンパク質をコードする遺伝子の3'-非翻訳領域(UTR)に対応する、請求項39に記載の単離核酸配列。
更なる調節エレメントが、ヒトSMN1遺伝子の3'-UTRに対応する、請求項40に記載の単離核酸配列。
AAV2 5'-ITR、CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、ヒトSMN1遺伝子の3'-ITR、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV2 3'-ITRをこの順番で含む、請求項32から41のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
AAV2 5'-ITR、CAGプロモーター、ヒトSMN1遺伝子、ヒトSMN1遺伝子の3'-ITR、HBB2ポリアデニル化シグナル及びAAV2 3'-ITRからこの順番からなる、請求項42に記載の単離核酸配列。
前記核酸配列が、配列番号1若しくは配列番号11で示した配列、又は配列番号1若しくは配列番号11と少なくとも80%同一、例えば、配列番号1若しくは配列番号11と少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一な配列を含むか又はこれからなる、請求項38又は43に記載の単離核酸配列。
請求項32から44のいずれか一項の単離核酸配列を含むプラスミド。