ES2326670T3 - Uso terapeutico del factor de crecimiento nsg33. - Google Patents
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Abstract
Uso de i) un polipéptido aislado que comprende a) una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID No. 4; b) una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos, en donde la variante tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No. 4; o c) un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b), teniendo dicho fragmento por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4 en un intervalo de solapamiento de por lo menos 50 aminoácidos, en donde la actividad biológica es neuroprotección, supervivencia de neuronas, neurogénesis y/o proliferación de precursores neuronales, ii) una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido como el que se define en i) o una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido como el que se define en i), iii) un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico como la que se define en ii), iv) una composición de células huésped, en donde dichas células se transforman o transducen con el vector como se define en iii), siempre que no se incluya el uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales, v) una línea de células de empaquetamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico como se define en ii), o vi) un dispositivo de células biocompatible implantable, en donde dicho dispositivo comprende: a) una membrana semipermeable que permite la difusión de un polipéptido como el que se define en i) y/o un vector viral; y b) una composición de células como la que se define en iv), o una línea de células de empaquetamiento como se define en v), para la preparación de un medicamento, es donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño del sistema nervioso, en donde se han perdido o dañado las células neurales.
Description
Uso terapéutico del factor de crecimiento
NsG33.
La presente invención se refiere al campo del
uso terapéutico de proteínas, genes y células, en particular a la
terapia basada en la función biológica de una proteína terapéutica
secretada, NsG33, en particular para el tratamiento de trastornos
del sistema nervioso, y para el tratamiento de trastornos
inmunológicos. NsG33 es un factor de crecimiento y supervivencia
nervioso con efectos neuroprotectores y/o de neurogénesis. La
invención se refiere también a fragmentos polipeptídicos de NsG33
bioactivos, y a las secuencias de ADN codificantes
correspondientes.
Las proteínas extracelulares desempeñan
funciones importantes, entre otras cosas, en la formación,
diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. El
destino de muchas células individuales, por ejemplo, crecimiento
que incluye proliferación, migración, diferenciación o interacción
con otras células, está gobernado típicamente por información
recibida de otras células y/o el entorno más cercano. Esta
información se transmite con frecuencia por polipéptidos secretados
(por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia,
factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y
hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos
receptores celulares o proteínas unidas a membrana. Estos
polipéptidos secretados o moléculas de señalización normalmente
pasan a través de la vía secretora celular para alcanzar su sitio de
acción en el entorno extracelular.
Trastornos tales como enfermedad de Parkinson,
enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis
múltiple y lateral amiotrófica, apoplejía, esquizofrenia, epilepsia
y neuropatía periférica y dolor asociado, afectan a millones de
personas. Es la pérdida de la función neuronal normal, que produce
los déficits de comportamiento y físicos que son característicos de
cada uno de los diferentes trastornos neurológicos. Además de
trastornos neurodegenerativos crónicos y agudos, el proceso de
envejecimiento, traumatismo físico en el sistema nervioso y
trastornos metabólicos, pueden producir la pérdida, disfunción o
degeneración de células neurales acompañadas de los déficits de
comportamiento y físicos asociados. Muchas de estas enfermedades son
hoy en día incurables, altamente debilitantes, y las
farmacoterapias tradicionales fallan con frecuencia. Existe de esta
manera una gran necesidad médica de nuevas proteínas terapéuticas
que sean modificadoras de la enfermedad, y no sólo para uso
sintomático.
Varios factores secretados con expresión en el
sistema nervioso o áreas objetivo asociadas, tienen usos
terapéuticos importantes en varias indicaciones neurológicas
asociadas con la reducción o pérdida de funciones neuronales. Por
ejemplo, el NGF es un candidato para el tratamiento de enfermedad de
Alzheimer, neublastina (artemina) un candidato para el tratamiento
de neuropatía periférica, y el GDNF es un candidato para el
tratamiento de enfermedad de Parkinson.
WO 01/39786 (Innogenetics) divulga polipéptidos
SMAF-2 humano y murino y su uso para el tratamiento
de trastornos inmunológicos. SMAF-2 humana es
idéntica a NsG33 humana.
WO 01/57190 (Hyseq) divulga un polipéptido (SEQ
ID No 1401) que es idéntico a NsG33 humano. WO 01/54474 (Human
Genome Sciences) divulga un polipéptido (SEQ ID NO 675), que es el
99% similar a NsG33 humano. WO 01/83510 (Human Genome Sciences)
divulga dos polipéptidos que son idénticos NsG33 humano en un
solapamiento de 103 aminoácidos. Ninguno de estos documentos
contiene datos biológicos que podrían sugerir una función creíble
para estas secuencias.
En un primer aspecto, la invención se refiere al
uso de
- i)
- un polipéptido aislado que comprende
- a)
- una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID No. 4;
- b)
- una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos, en donde la variante tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4; o
- c)
- un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b) teniendo dicho fragmento por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO. 4,
- \quad
- en donde la actividad biológica es neuroprotección, supervivencia de neuronas, neurogénesis y/o proliferación de precursores neuronales,
- ii)
- una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en i) o una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia complementaria a la secuencia que codifica el polipéptido como se define en i),
- iii)
- un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico como se define en ii),
- iv)
- una composición de células, en donde dichas células se transforman o transducen con el vector como se define en iii), siempre que no incluya el uso de embriones humanos para fines industriales o comerciales,
- v)
- una línea celular empaquetadora que comprende la secuencia del ácido nucleico como se define en ii), o
- vi)
- un dispositivo celular biocompatible implantable, en donde dicho dispositivo comprende:
- a)
- una membrana semipermeable que permite la difusión de un polipéptido como se define en i) y/o un vector vírico; y
- b)
- una composición de células como se define en iv) o una línea celular de empaquetamiento como se define en v)
- \quad
- para la fabricación de un medicamento, en donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño del sistema nervioso, en donde se pierden o dañan células neurales.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional la invención se refiere
a un método in vitro de prevenir apoptosis en una célula
neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha
célula neuronal a un polipéptido como se define aquí.
La invención también se refiere a un método
in vitro para aumentar la supervivencia de una célula
neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha
célula neuronal a un polipéptido como se define aquí.
En un aspecto la invención se refiere a un
método in vitro para generar una neurona, comprendiendo dicho
método exponer una celular precursora neuronal o una célula madre
neuronal a un polipéptido como se define aquí.
Además, la invención se refiere a un método
in vitro para expandir una composición de células neuronales
de mamífero, que comprende administrar a dicha composición el
polipéptido como se define aquí; o transducir/transfectar las
células con el vector de expresión como se define aquí.
En un aspecto la invención se refiere a un
método in vitro para diferenciar una composición de células
neuronales de mamífero, que comprende administrar a dicha
composición el polipéptido como se define aquí; o
transducir/transfectar las células con el vector de expresión como
se define aquí.
Los métodos in vitro de la presente
invención no incluyen el uso de embriones humanos para fines
industriales o comerciales.
Los presentes inventores han encontrado que
NsG33 es una proteína secretada con características de factor de
crecimiento, que se expresa a altos niveles y selectivamente en el
sistema nervioso y el ojo, y especialmente en la sustancia negra,
el putamen y la médula espinal, así como en el mesencéfalo del
embrión humano en desarrollo. Además, los presentes inventores han
encontrado que NsG33 es capaz de proteger una línea de células
neuronales de muerte celular apoptótica (ejemplo 6). La muerte
celular apoptótica contribuye a la pérdida de células neuronales en
el sistema nervioso adulto, causando varios trastornos neurológicos
tales como apoplejía isquémica, enfermedades neurodegenerativas o
traumatismos cerebrales (Becker y Bonni, Prog Neurobiol. Ene 2004;
72(1): 1-25).
NsG33 ha mostrado también efectos
neuroprotectores en dos ensayos basados en la generación de neuronas
y astrocitos de una línea de células progenitoras neurales humanas
y de un cultivo primario de células estriatales de rata. Por lo
tanto, los presentes inventores han contemplado el uso de NsG33 en
el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central, en
particular en el tratamiento de enfermedad de Parkinson, enfermedad
de Huntington y trastornos de la médula espinal, tal como ELA.
Basado en la actividad neuroprotectora y en la expresión en el
cerebelo, el ganglio de la raíz dorsal y la retina, se contempla
también a NsG33 para su uso en el tratamiento de neuropatías
periféricas y dolor asociado, así como trastornos cerebelares y
retinopatías.
Otros factores de crecimiento secretados
terapéuticamente relevantes se expresan en el sistema nervioso o
subregiones del mismo e incluyen, pero no están limitados a, GDNF,
NGF, neurturina, BDNF, NT4/5, NT3 y neublastina (artemina).
El efecto terapéutico de NsG33 puede mediarse a
través de un efecto sobre el crecimiento, supervivencia,
regeneración, recuperación o mejora de función, y/o sobre
diferenciación de células objetivo. Los presentes inventores han
mostrado que NsG33 es capaz de proteger a un tipo de célula neuronal
contra la muerte celular apoptótica (ejemplo 6, figura 9). Los
presentes inventores han mostrado también que una línea de células
progenitoras neurales humanas y un cultivo estriatal primario de
rata generan un mayor porcentaje de neuronas cuando se exponen a
NsG33 que en condiciones control (ejemplos 14 y 15). El último
efecto puede estar causado por supervivencia mejorada de neuronas,
por diferenciación incrementada de neuronas, y/o por proliferación
de precursores neuronales.
\newpage
Basado en estas pruebas biológicas, la presente
invención se refiere a un método in vitro para prevenir
apoptosis en una célula neuronal de mamífero, comprendiendo dicho
método exponer dicha célula neuronal a un polipéptido de la
presente invención. La invención se refiere también a un método
in vitro para mejorar la supervivencia de una célula
neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha
célula neuronal a un polipéptido de la presente invención. La
invención se refiere además a un método in vitro para generar
una neurona, comprendiendo dicho método exponer una célula
precursora neuronal o una célula madre neuronal a un polipéptido de
la presente invención. De preferencia, dicha célula neuronal de
mamífero y/o precursor neuronal de mamífero o célula madre neuronal,
es una célula humana.
Figura 1. Predicción de la presencia y ubicación
del péptido señal en NsG33 humano. Figura 1a: gráfica de SignalP NN
(red neural) de NsG33 humano. Figura 1b: gráfica de SignalP HMM
(modelo oculto de Markov) de NsG33 humano. Para detalles, refiérase
al ejemplo 2.
Figura 2: Resultado del servidor de predicción
de la función de proteínas ProtFun2.1 en NsG33 humano de longitud
completa (SEQ ID No. 3), péptido N-terminal humano
(SEQ ID No. 19) y péptido C-terminal humano (SEQ ID
No. 5). Para explicaciones, refiérase al ejemplo 2.
Figura 3a: Alineamiento múltiple de secuencias
Clustal W (1.82) de NsG33 humano, parcial de ratón y rata. Las
secuencias señal se muestran en negrita. Se ha subrayado un sitio
putativo de corte con furina.
Figura 3b: Alineamiento múltiple de secuencias
Clustal W (1.82) de NsG33 humano, de ratón y rata. Las secuencias
señal predichas se muestran en negrita.
* indica posicionas que tienen un residuo
individual completamente conservado.
: indica que uno de los siguientes grupos
"fuertes", está complemente conservado:
- -STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW.
. indica que uno de los siguientes grupos "más
débiles", está completamente conservado:
- -CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY.
Figuras 4: PCR en tiempo real en NsG33. Para
detalles, véase el ejemplo 5.
La figura 4, panel superior muestra la expresión
relativa de NsG33 (respecto al tejido con la expresión más baja),
asumiendo que se sintetizaron las mismas cantidades de ADNc a partir
de cantidades iguales de ARN total usado para el paso de ADNc.
La figura 4, panel inferior, muestra la
expresión relativa de NsG33 normalizada a
\beta_{2}-microglobulina (respecto al tejido con
la expresión normalizada más baja). Los resultados deben
interpretarse con cuidado, puesto que los niveles de expresión de
\beta_{2}-microglobulina varían entre algunos
tejidos.
Figura 5: Alineamiento con Align0 de polipéptido
NsG33 humano de longitud completa, contra polipéptido humano de
longitud completa (Innog.) del documento WO 93/22437 (Innogenetics
SA). Matriz de puntuación BLOSUM50, penalizaciones de espacio:
-12/-2. Las diez cisteínas conservadas se muestran en negrita con
asteriscos encima o debajo de las secuencias alineadas.
Figura 6: ADNc de NsG33 humano y
prepro-NsG33 codificada.
Figura 7a: ADNc parcial de NsG33 de ratón y
pre-pro-NsG33 parcial
codificada.
Figura 7b: ADNc de longitud completa de NsG33 de
ratón y pre-pro-NsG33
codificada.
Figura 8: ADNc de NsG33 de rata y
pre-pro-NsG33 codificada.
Figura 9: Efecto de NsG33 sobre la supervivencia
de células PC12 en medio sin suero. Para más detalles, véase el
ejemplo 6. Se sembraron células en placas de 48 pocillos recubiertos
de colágeno, 2x10^{4} células/pocillo en medio de crecimiento. Al
día siguiente, las células se transdujeron mediante incubación
durante la noche con 10^{5} unidades de transducción de
virus/pocillo (MOI = 5) en presencia de 5 \mug/ml de polibreno.
Después de la transducción, se cambió el medio a DMEM sin suero
(Invitrogen), y se ensayó entonces la supervivencia de células
después de 4 días usando el ensayo de MTS. Los datos mostrados son
medias \pm EEM (n = 6) de un experimento representativo, y el *
indica una diferencia significativa de las células transducidas con
ADNc para EGFP (P<0,05, ANOVA unidireccional, método de Dunnett).
LV-EGFP: células PC12 transducidas con lentivirus
con EGFP. LV-NsG33: células PC12 transducidas con
NsG33 humano de longitud completa.
La figura 10A muestra la expresión relativa de
mNsG33 medida por RT-PCR cuantitativa (respecto al
tejido con la expresión más baja), normalizada para GAPDH en la
médula espinal en desarrollo en las etapas embrionarias E10,5, E11,5
y E13,5 (10,5, 11,5 y 13,5 días post-concepción,
respectivamente), y en la médula espinal de adulto. Los detalles se
describen en el ejemplo 13.
La figura 10B muestra la expresión relativa de
mNsG33 en dos regiones del cerebro de ratón (CTX = corteza, Cb =
cerebelo) en dos etapas de desarrollo (P1 =
post-natal de un día y adulto). La expresión se mide
mediante RT-PCR cuantitativa normalizada para la
expresión de mGAPDH respecto al tejido con la expresión normalizada
más baja. Los detalles se describen en el ejemplo 13.
La figura 11A muestra los porcentajes promedio
de células gliales positivas para GFAP (barras grises) y las
neuronas positivas para
\beta-III-tubulina (barras negras)
en cultivos de hNS1 en diferenciación que reciben medio sin suero no
condicionado (hNS1), medios condicionados de células
ARPE-19 control (Mc C) o de cultivos de células
ARPE-19 transducidas con NsG33 (Mc 33). Se describen
más detalles en el ejemplo 14.
La figura 11B muestra el número total de células
por campo, según se determina contando núcleos teñidos con Hoechst
usando un objetivo de 40x en cultivos de hNS1 en diferenciación que
reciben medio sin suero no condicionado (hNS1), medios condicionados
de células ARPE-19 control (Mc C) o de cultivos de
células ARPE-19 transducidas con NsG33 (Mc 33). Se
describen más detalles en el ejemplo 14.
La figura 12 muestra los porcentajes promedio de
neuronas positivas para
\beta-III-tubulina en cultivos
estriatales de rata que reciben medio sin suero no condicionado
(UCM), medios condicionados diluidos de células HEK293T o
ARPE-19 transfectadas control
(293T-CM y ARPE-CM,
respectivamente), o de los cultivos paralelos transfectados con
NsG33 (293T-CM33 y ARPE-CM33,
respectivamente) en DIV2. Se describen más detalles en el ejemplo
15.
NsG33, como se usa aquí, se refiere a
polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de NsG33
sustancialmente purificada obtenida de cualquier especie, en
particular de mamífero, que incluye chimpancé, bovino, ovino,
porcino, murino, equino y de preferencia humano, de cualquier
fuente, ya sea natural, sintética, semisintética o recombinante. El
término se refiere también a fragmentos biológicamente activos de
NsG33 obtenidos de cualquiera de estas especies, así como a
variantes de secuencia biológicamente activas de los mismos, y a las
proteínas sujetas a modificaciones postraduccionales.
Las características del factor de crecimiento,
como se usa aquí, definen características relacionadas con las
secuencias similares a los de los factores de crecimiento clásicos,
que son proteínas secretadas que actúan sobre una célula objetivo a
través de un receptor, para producir una o más de las siguientes
respuestas en la célula objetivo: crecimiento que incluye
proliferación, diferenciación, supervivencia, regeneración,
migración, recuperación de función, mejora de función.
Un "alelo" o "secuencia alélica", como
se usa aquí, es una forma alternativa del gen que codifica NsG33.
Los alelos se pueden producir de al menos una mutación en la
secuencia de ácido nucleico, y pueden producir moléculas de ARNm
alteradas o polipéptidos cuya estructura o función puede o no estar
alterada. Cualquier gen natural o recombinante determinado puede
tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios
mutacionales comunes que dan lugar a alelos se atribuyen en general
a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos.
Cada uno de estos tipos de cambios pueden ocurrir solo, o en
combinación con los otros, una o más veces en una secuencia
determinada.
Una "deleción", como se usa aquí, se
refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, y
produce la ausencia de uno o más residuos de aminoácido o
nucleótidos.
Una "inserción" o "adición", como se
usa aquí, se refiere a un cambio en una secuencia de aminoácidos o
nucleótidos que produce la adición de uno o más residuos de
aminoácido o nucleótidos, respectivamente, en comparación con la
molécula natural.
Los términos "unión específica" o "que se
une específicamente", como se usan aquí, se refieren a la
interacción de alta afinidad entre una proteína o péptido y una
molécula de unión tal como un anticuerpo y un receptor o fragmentos
del mismo. La interacción depende de la presencia de una estructura
particular (es decir, el determinante antigénico o epítopo) de la
proteína reconocida por la molécula de unión. Por ejemplo, si un
anticuerpo es específico para el epítopo "A", la presencia de
una proteína que contenga el epítopo A (o A no marcado libre) en
una reacción que contenga "A" marcado y el anticuerpo, reducirá
la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.
El término "sustancialmente purificado",
como se usa aquí, se refiere a secuencias de ácido nucleico o
aminoácidos que se retiran de su ambiente natural, aisladas o
separadas, y están por lo menos libres al 60%, de preferencia
libres al 75%, y lo más preferiblemente libres al 90% de otros
componentes con los que se asocian naturalmente.
Una "sustitución", como se usa aquí, se
refiere al reemplazo de uno o más aminoácidos o nucleótidos por
diferentes aminoácidos o nucleótidos, respectivamente.
"Identidad de secuencia":
La determinación del porcentaje de identidad
entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático.
Un ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático usado
para la comparación de dos secuencias, es el algoritmo de Karlin y
Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
2264-2268, modificado en Karlin y Altschul (1993),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Dicho
algoritmo está incorporado en los programas BLASTN y BLASTP de
Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:
403-410.
Para caracterizar la identidad, se alinean las
secuencias sujeto, de modo que se obtenga la homología
(coincidencia) de orden más alto. Basado en estos principios
generales, puede determinarse el "porcentaje de identidad" de
dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo BLASTP [Tatiana A.
Tatusova, Thomas L Madden: Blast 2 sequences - a new tool for
comparing protein and nucleotide sequences; FEMS Microbiol.
Lett. 1999 174 247-250], que está disponible
del sitio web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica
(NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), y usando los valores
predeterminados sugeridos aquí (es decir, matriz = Blosum62; espacio
abierto = 11; espacio de extensión = 1; penalizaciones de espacio
x_punto de derivación = 50; expectativa = 10, tamaño de palabra =
3; filtro funcionando). El algoritmo BLAST realiza una operación de
dos pasos, alineando primero dos secuencias basado en los ajustes,
y determinando entonces el % de identidad de secuencia en un
intervalo de solapamiento entre dos secuencias alineadas. Además
del % de identidad de secuencia, BLASTP determina también el % de
similitud de secuencia basado en los ajustes.
Para caracterizar la identidad, se alinean
secuencias sujeto, de modo que se obtenga la homología
(coincidencia) de orden más alto. Basado en estos principios
generales, puede determinarse el "porcentaje de identidad" de
dos secuencias de ácido nucleico usando el algoritmo BLASTN [Tatiana
A. Tatusova, Thomas L Madden: Blast 2 sequences - a new tool for
comparing protein and nucleotide sequences; FEMS Microbiol.
Lett. 1999 174 247-250], que está disponible
del sitio web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica
(NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), y usando los valores
predeterminados sugeridos aquí (es decir, retribución por una
coincidencia = 1; penalización por una no coincidencia = -2; opción
de cadena = ambas cadenas; espacio abierto = 5; espacio de extensión
= 2; penalizaciones de espacio x_punto de derivación = 50;
expectativa = 10; tamaño de palabra = 11; filtro funcionando). El
algoritmo BLASTN determina el % de identidad de secuencia en un
intervalo de solapamiento entre dos secuencias de nucleótidos
alineadas.
Otro ejemplo no limitante preferido de un
algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias, es el
algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo está
incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del
paquete de software de alineamiento de secuencias FASTA (Pearson WR,
Methods Mol Biol, 2000, 132: 185-219). Align
calcula identidades de secuencias basadas en un alineamiento global.
Align0 no penaliza para espacios en el extremo de las secuencias.
Cuando se usa el programa ALIGN o Align0 para la comparación de
secuencias de aminoácidos, se usa de preferencia una matriz de
substitución BLOSUM50 con penalizaciones de apertura/extensión de
espacios de -12/-2.
La presente invención se refiere a los usos
médicos como se describen aquí de polipéptidos y polinucleótidos que
se identifican como NsG33. La proteína NsG33 ha sido identificada en
seres humanos (SEQ ID No. 3), ratón (SEQ ID No. 8) y rata (SEQ ID
No. 13).
NsG33 humano existe como un precursor de 293
aminoácidos, que puede ser procesado para dar lugar a por lo menos
uno y potencialmente varios péptidos biológicamente activos. NsG33
se expresa a altos niveles en el sistema nervioso y el ojo, y en
particular en subregiones del cerebro (figuras 4A y 4B). Los
polipéptidos NsG33 más largos de ratón (SEQ ID No. 8) y rata (SEQ
ID No. 13) consisten en 294 y 291 aminoácidos, respectivamente, y
los % de identidades con la proteína humana son del 80,3 y 80,2,
respectivamente (véase las tablas 1 y 2 en el ejemplo 2). Debe
notarse que las secuencias polipeptídicas de longitud completa
predichas de ratón y rata están aún sin verificar, y que por lo
menos la secuencia polipeptídica de ratón es parcial en el extremo
N-terminal. Se ha publicado una secuencia de
proteína de longitud completa de ratón con un extremo
N-terminal ligeramente diferente en Nishino et
al (The EMBO Journal, 2004, 23: 2998-2008) con
un ADNc correspondiente disponible del NCBI con el número de acceso
XM128551. La digestión del péptido señal de esta proteína de ratón
produce la proteína madura que tiene
SEQ ID No. 9.
SEQ ID No. 9.
NsG33 humano contiene una secuencia de péptido
señal N-terminal de 23 aminoácidos, que es digerida
en el motivo de secuencia ARA-GY. Este sitio de
corte del péptido señal se predice por el método SignalP (véase el
ejemplo 2) y la gráfica resultado se muestra en la figura 1. Sin
embargo, el experto en la materia reconocerá que el sitio de corte
real puede ser diferente del predicho por el programa informático.
Por ejemplo, la predicción del péptido señal en NsG33 de rata
produce predicciones con probabilidades casi iguales en las
posiciones 16 y 21. Se encuentra un sitio de digestión del péptido
señal en un sitio similar en NsG33 de ratón (posición 24) y NsG33
de rata (posición 16 ó 21). La digestión del péptido señal produce
polipéptidos que tienen SEQ ID No. 4, 9 y 14 para ser humano, ratón
y rata, respectivamente. Como se sabe en la técnica, el
procesamiento del péptido señal no siempre es exactamente como se
predice, y la digestión real puede variar de caso a caso. De esta
manera, se espera que el extremo N-terminal de NsG33
madura pueda variar en de uno a dos o tres aminoácidos del sitio de
digestión predicho. El extremo N-terminal real de
NsG33 madura puede verificarse experimentalmente marcando el
extremo C-terminal con, por ejemplo, una etiqueta de
histidina, purificación subsiguiente usando un anticuerpo
específico de poli-histidina, o purificación en una
columna de níquel, y finalmente secuenciación
N-terminal del péptido maduro purificado.
Se predice digestión de tipo general de la
pro-proteína en NsG33 humano, por el método ProP
(Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Peter Duckert,
Søren Brunak y Nikolaj Blom. Protein Engineering, Design and
Selection: 17: 107-112, 2004) en la posición 127 con
una puntuación de 0,831, motivo de secuencia
"WGPRERR-AL". Se predicen sitios de digestión
similares en posiciones homólogas en NsG33 de ratón (en la posición
128) con una puntuación de 0,831, motivo de secuencia
"WGPRERR-AL", y en NsG33 de rata (en la
posición 125), con una puntuación de 0,831 y el motivo de secuencia
"WGPRERR-AL". Se encuentra también un posible
sitio de digestión del pro-péptido por furina, en
la posición 121 en NsG33 humano en el motivo de secuencia
"GGRCVR-WG", y en posiciones correspondientes
en NsG33 de rata y ratón. El procesamiento del polipéptido después
de la digestión del péptido señal resulta en la formación de un
péptido C-terminal y un péptido
N-terminal. Si la proteína se procesa realmente en
estos sitios predichos, puede depender del tipo de célula en el que
se expresa el gen. Puede verificarse experimentalmente la digestión
del pro-péptido por medio de marcaje
C-terminal con histidina, purificación y
secuenciación N-terminal subsiguiente del péptido
marcado.
NsG33 pertenece a la categoría de proteínas que
actúan como factores de crecimiento. Esta noción está apoyada por
predicciones realizadas por el servidor de predicción de la función
de proteínas ProtFun, que proporciona posibilidades por encima de
1,0 de este tipo de categoría, como se muestra en la figura 2.
El método ProtFun predice la función de
proteínas basado en características derivadas de secuencia,
opuestamente a la similitud de secuencia. Las características que
son importantes para la discriminación entre las clases de
"factor de crecimiento" frente a las demás clases, son:
potencial de distribución de proteínas, potencial de
direccionamiento de proteínas, potencial del péptido señal, regiones
de baja complejidad, estructura secundaria de la proteína, número
de residuos negativos y número de átomos. En general, una puntuación
de posibilidad de 1 indica una predicción que pudo haber ocurrido
por azar. Posibilidades por encima de 1 indican que existe una
probabilidad incrementada de que la proteína pertenezca a la clase
predicha de genes ontológicos. Cuanto mayor sea la puntuación de
posibilidad, mayor será la probabilidad de que la predicción sea
correcta.
Los resultados de la PCR en tiempo real
cuantitativa se muestran en las figuras 4 A y B. Basadas en las
figuras, los tejidos pueden agruparse según al nivel de expresión de
NsG33.
Tejidos con alta expresión incluyeron:
putamen, sustancia negra y médula espinal.
Tejidos con expresión intermedia incluyeron:
cerebro entero, cerebelo, retina* y ganglio de
la raíz dorsal*.
Tejidos con baja expresión incluyeron:
corazón, riñón, pulmón, próstata, glándula
salival, músculo esquelético, testículo, estómago, páncreas y
cerebro fetal*.
Tejidos con muy baja expresión o sin expresión
incluyeron:
hígado fetal, placenta, timo, tráquea, bazo,
útero, colon e intestino delgado.
Cuando se analizaron los resultados después de
la normalización a la expresión de
\beta_{2}-microglobulina, esencialmente se
observaron los mismos resultados, salvo para los tejidos marcados
con un *.
Los resultados de PCR en tiempo real para NsG33
de ratón, se muestran en las figuras 10A y 10B. Los valores de
C_{T} variaron de 17 a 22. De la figura 10A, es evidente que la
expresión de NsG33 se regula durante el desarrollo de la médula
espinal, alcanzando un máximo alrededor de E11,5. De la figura 10B,
es evidente que NsG33 es regula durante el desarrollo
post-natal en el cerebelo, pero no en la
corteza.
El patrón de expresión temporal en médula
espinal indica un papel en proliferación, diferenciación y/o
supervivencia de los progenitores neurales en esta región del SNC.
Esto es consistente con la relevancia terapéutica para el
tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y lesiones en la
médula espinal que incluyen lesión de médula espinal, ELA y atrofia
muscular espinal. Además, este perfil de expresión indica un
potencial como reactivo in vitro para la expansión y/o
diferenciación de progenitores neurales derivados de la médula
espinal.
El aumento de la expresión de NsG33 en el
cerebelo adulto, indica un papel para este factor en el
mantenimiento y/o supervivencia de uno o más tipos de células
cerebelares. Esto es consistente con la relevancia terapéutica para
trastornos cerebelares que incluyen, pero no están limitados a,
ataxia sensitiva, esclerosis múltiple, trastornos espinocerebelares
neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelares (tales
como atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de
Shy-Drager (atrofia de sistemas múltiples)) y
alcoholismo.
A diferencia de las proteínas estructurales, los
factores de crecimiento están implicados en la señalización celular
y en varias funciones tales como crecimiento, proliferación,
diferenciación, supervivencia, regeneración, migración,
recuperación de función y mejora de función. Por lo tanto, pueden
administrarse y usarse factores de crecimiento para ejercer un
efecto terapéutico.
Basado en la expresión específica de tejido y el
hecho de que se predice que NsG33 es un factor de crecimiento
secretado, y que NsG33 posee actividad antiapoptótica,
neuroprotectora y/o de neurogénesis (figuras 9, 11 y 12), se
contempla NsG33 para su uso en el tratamiento de trastornos del
sistema nervioso en general (basado en la expresión específica del
sistema nervioso), en particular enfermedad de Parkinson (basado en
la expresión en la sustancia negra), enfermedad de Huntington
(basado en la expresión en el putamen y la sustancia negra),
trastornos cerebelares (basado en la expresión en el cerebelo
humano, y expresión diferencial en el cerebelo de ratón en
desarrollo), lesión de médula espinal (basado en la expresión en la
médula espinal de ser humano adulto, y la expresión diferencial en
la médula espinal de ratón en desarrollo), ELA (basado en la
expresión en la médula espinal del ser humano adulto, y la
expresión diferencial en la médula espinal de ratón en desarrollo),
neuropatías periféricas (basado en la expresión en el ganglio de la
raíz dorsal) y retinopatías (basado en la expresión en la retina).
La función para las varias indicaciones puede verificarse en pruebas
in vitro e in vivo como se describe en los
ejemplos.
Asimismo, se encuentra expresión de factores de
crecimiento secretados terapéuticamente relevantes, que incluyen
GDNF, NGF y neublastina (artemina) en áreas objetivo del trastorno
neurológico que pueden usarse para tratamiento.
El efecto terapéutico de NsG33 puede mediarse a
través de un efecto sobre el crecimiento, que incluye proliferación,
regeneración, recuperación de función, mejora de función,
supervivencia, migración y/o diferenciación de células elegidas como
objetivo.
Una función biológica verificada de NsG33, es un
efecto neuroprotector contra apoptosis inducida por inanición en
células PC12 (feocromocitoma). Los feocromocitomas son tumores con
características de células cromafines adultas e inmaduras de la
médula suprarrenal. Las células cromafines, neuronas sensitivas y
del simpático y células de pigmento (melanocitos), derivan de una
célula precursora común en la cresta neural. Su diferenciación en
los linajes específicos depende altamente de señales externas que
incluyen factores secretados.
PC12 es una línea celular clonal, que se
estableció originalmente de un feocromocitoma medular suprarrenal
trasplantable de rata (Greene y Tischler, 1976, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 73, 2424). Las células PC12 están disponibles de la
ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, número de acceso
CRL-1721). Se considera que las células PC12 son la
célula cromafín precursora pluripotente, ya que posee la capacidad
de diferenciarse a células cromafines maduras, neuronas del
simpático y melanocitos, dependiendo de las condiciones de cultivo.
Las células PC12 se han usado ampliamente como un sistema modelo
para estudios de diferenciación y supervivencia neuronal. En medio
que contiene suero, las células PC12 proliferan, mientras que la
adición de ciertos factores neurotróficos que incluye NGF, induce
la diferenciación de las células PC12 en un fenotipo neuronal muy
similar a las neuronas del simpático. En medio sin suero, las
células PC12 se vuelven apoptóticas, y mueren a menos que se les
suministre ciertos factores de crecimiento, hormonas o pequeñas
moléculas que pueden actuar como factores de supervivencia.
Los factores capaces de inducir diferenciación y
supervivencia en células PC12, que incluyen una de las neurotrofinas
(NGF) y un miembro de la familia de secretina/glucagón/VIP (PACAP),
exhiben también una actividad similar tanto en el sistema nervioso
central como periférico, indicando que receptores y sistemas de
respuesta expresados en células PC12 son compartidos con muchas
otras células neuronales.
El NGF es un factor de supervivencia y
diferenciación importante para neuronas sensitivas y del simpático
sensibles, además de neuronas colinérgicas en el prosencéfalo basal.
PACAP promueve la diferenciación de neuronas nacientes del ganglio
de la raíz dorsal (DRG), porque incrementa tanto el número de
células positivas para marcador neural como axonogénesis, sin que
afecte la proliferación de células progenitoras neurales (Nielsen
et al., Mol Cell Neurosci. Abr 2004; 25(4):
629-41). PACAP muestra también actividades similares
en poblaciones neuronales en el SNC (Vaudry et al., Proc
Natl Acad Sci U.SA. 30 Abr 2002; 99(9):
6398-403; Dicicco-Bloom et
al., Ann N Y Acad Sci. 11 Dic 1998; 865:
274-89).
La muerte celular apoptótica contribuye a la
pérdida de células neuronales en el sistema nervioso adulto,
causando varios trastornos neurológicos tales como apoplejía
isquémica, enfermedades neurodegenerativas o traumatismos
cerebrales (Becker y Bonni, Prog Neurobiol. Ene 2004; 72(1):
1-25). Un factor de crecimiento secretado capaz de
proteger las células neuronales contra la muerte celular apoptótica,
es por lo tanto un candidato para el tratamiento de trastornos del
sistema nervioso en general, y trastornos neurodegenerativos en
particular. De esta manera, la capacidad de un factor secretado para
inducir la extensión de neuritas y/o para promover la supervivencia
en condiciones que llevan a apoptosis, es una indicación de que este
factor tiene un efecto similar en otros tipos de células neuronales
del sistema nervioso central y/o periférico, y que este factor es
un candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso,
en particular trastornos neurodegenerativos.
Otra función biológica de NsG33, es un efecto de
estimulación sobre el porcentaje de neuronas generadas por una
línea de células madre neurales humanas (hNS1, anteriormente
denominada HNSC.100). Células expuestas a medio condicionado de
células ARPE-19 transducidas con secuencias
codificantes de NsG33 humano, dieron un mayor porcentaje de
neuronas respecto a astrocitos en comparación con células hNS1
expuestas a medio condicionado de células ARPE-19
no transducidas. Esto es consistente con el efecto antiapoptótico
encontrado en el ensayo de células PC12. El efecto puede estar
causado por un efecto de supervivencia sobre neuronas, y/o por
neurogénesis y/o por proliferación de precursores neuronales. La
línea de células hNS1 se establece de cultivos de neuroesferas
humanas del prosencéfalo. Se ha mostrado que otros factores tróficos
conocidos con potencial terapéutico, incrementan el número de
neuronas generadas de cultivos de neuroesferas humanas. Estos
incluyen NT3 y NT4/5 y el factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF) (Caldwell et al, Nature Biotechnology, Mayo
2001, 19(5): 475-9. Growth factors regulate
the survival and fate of cells derived from human neurospheres). Por
consiguiente, estos resultados indican también que NsG33 es un
factor candidato para el tratamiento de trastornos del sistema
nervioso y en particular trastornos neurodegenerativos.
En otro ensayo in vitro, medio
condicionado de dos líneas de células transfectadas con ADNc que
codifica NsG33 humano, incrementó el porcentaje de neuronas en un
cultivo primario de células estriatales de rata. Este ensayo es
también consistente con un efecto neuroprotector de NsG33. Este
efecto puede estar causado por un efecto de supervivencia en
neuronas, y/o por neurogénesis y/o por proliferación de precursores
neuronales. Otros factores con potencial terapéutico tienen un
efecto similar sobre cultivos estriatales de rata, e incluyen
factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de
crecimiento insulínico 1 truncado (tIGF),
neurotrofina-3 (NT-3), factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la isoforma BB del factor
de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) y
neurotrofina-4/5 (NT-4/5) (Nakao
et al, Exp Neurol 1996, Mar 138(1):
144-57, Differential trophic effects of basic
fibroblast growth factor, insulin-like growth
factor-1, and neurotrophin-3 on
striatal neurons in culture; Nakao et al, Brain Res Dev Barin
Res, 1995, 21 Dic; 90(1-2):
92-101, Trophic and protective actions of
brain-derived neurotrophic factor on striatal
DARPP-32-containing neurons in
vitro; Widmer et al Eur J Neurosci, 1 Nov 1994;
6(11): 1669-79, Neurotrophin 4/5 promotes
survival and differentiation of rat striatal neurons developing in
culture). En consecuencia, estos resultados indican también que
NsG33 es un factor candidato para el tratamiento de trastornos del
sistema nervioso y en particular trastornos neurodegenerativos.
NsG33 está estructuralmente relacionada con una
proteína descrita en el documento WO 93/22437 (Innogenetics SA),
que se identifica en una búsqueda BLASTP. La proteína humana de
longitud completa se muestra en la figura 2 del documento WO
93/22437. NsG33 comparte el 42% de identidad (Align0 con valores
predeterminados) con la proteína de Innogenetics que incluye 10
residuos de cisteína conservados. Se predice un péptido señal
N-terminal de 45 residuos en la proteína de
Innogenetics (NsG34). Los datos de expresión recombinante del
documento WO 93/22437, indican que la proteína de Innogenetics no
está sometida a procesamiento del pro-péptido en las
condiciones usadas en esa publicación, sino que se secreta como una
proteína de 268 aminoácidos. Esto podría considerarse como una
indicación de que la digestión predicha del
pro-péptido de NsG33 puede no ocurrir cuando el gen
se expresa, por lo menos no en las células usadas en la referencia
citada.
Se muestra un alineamiento de NsG33 humano de
longitud completa con la proteína humana de Innogenetics en la
figura 5. Las 10 cisteínas conservadas se muestran en negrita, y
están marcadas con asteriscos. Las dos proteínas en conjunto forman
una familia de proteínas basada en los residuos de cisteína
conservados y los tramos de alta conservación que son evidentes de
la figura 5. Ninguna de las dos proteínas muestra una homología de
secuencia significativa con ninguna otra proteína humana conocida.
Aunque las dos proteínas son miembros de la misma pequeña familia
de proteínas, las dos proteínas son estructuralmente distintas.
Debido a la alta conservación de las cisteínas,
se espera que estos residuos desempeñen un papel importante en la
estructura secundaria y terciaria de la proteína bioactiva. Una o
más de las cisteínas pueden participar en la formación de puentes de
cistina intramoleculares y/o intermoleculares.
La proteína de Innogenetics es, entre otras
cosas, funcional en la activación de células T y células B, y como
un inductor de células inmunosupresoras.
Además de NsG33 de longitud completa, NsG33
sustancialmente de longitud completa, pro-NsG33,
péptidos C-terminales, péptidos
N-terminales y formas truncadas de NsG33, la
presente invención proporciona variantes biológicamente activas de
los polipéptidos. Un polipéptido o fragmento NsG33 es biológicamente
activo si exhibe una actividad biológica de NsG33 natural. Se
entenderá que la invención se refiere a NsG33 sustancialmente
purificada como se define aquí.
Una actividad biológica es la capacidad para
competir con NsG33 natural en un ensayo de unión al receptor.
Otra actividad biológica es la capacidad para
unirse a un anticuerpo, que está dirigido a un epítopo, que está
presente en NsG33 natural.
Pueden definirse también variantes
biológicamente activas con relación a uno o más de los otros ensayos
biológicos in vitro y/o in vivo descritos en los
ejemplos.
Una actividad biológica preferida, es la
capacidad para inducir sustancialmente la misma respuesta que en el
ensayo de células PC12 descrito en los ejemplos y en la figura 9. En
este ensayo, se transducen células PC12 con secuencias codificantes
de NsG33 humano de longitud completa (figura 6). Por sustancialmente
la misma respuesta en el ensayo de células PC12, se pretende
indicar que el número de células que poseen neuritas es por lo
menos el 10% del número obtenido en el ejemplo 6 (transducción con
NsG33 humano de longitud completa), más preferiblemente por lo
menos el 20%, más preferiblemente por lo menos el 30%, más
preferiblemente por lo menos el 40%, más preferiblemente por lo
menos el 50%, más preferiblemente por lo menos el 60%, más
preferiblemente por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo
menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más
preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo
menos el 90%. El ensayo de células PC12 puede usarse también para
documentar el porcentaje de mejora en supervivencia sobre un
tratamiento control. Sustancialmente la misma respuesta en este
contexto, significa una actividad que resulta en por lo menos el 10%
de la mejora obtenida en el ejemplo 6 (figura 9), más
preferiblemente por lo menos el 20%, más preferiblemente por lo
menos el 30%, más preferiblemente por lo menos el 40%, más
preferiblemente por lo menos el 50%, más preferiblemente por lo
menos el 60%, más preferiblemente por lo menos el 70%, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%. La actividad biológica de un
fragmento o variante de NsG33 puede ser también mayor que la de
NsG33 natural. Otras actividades biológicas preferidas incluyen el
efecto neuroprotector y/o de neurogénesis mostrado en los ejemplos
14 y 15.
Fragmentos específicos de NsG33 incluyen
polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en
AA_{128}-AA_{293} de SEQ ID No. 3,
AA_{121}-AA_{293} de SEQ ID No. 3,
AA_{129}-AA_{294} de SEQ ID No. 8,
AA_{122}-AA_{294} de SEQ ID No. 8,
AA_{126}-AA_{291} de SEQ ID No. 13,
AA_{119}-AA_{291} de SEQ ID No. 13, y variantes
de secuencia de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido
especificado en la secuencia elegida se cambia a un aminoácido
diferente, siempre que no se cambien así más de 15 de los residuos
de aminoácido en la secuencia. Estos polipéptidos aislados
constituyen péptidos C-terminales de NsG33. De
preferencia, cualquier aminoácido cambiado se selecciona de los
designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente
conservados en la figura 3a. ProtFun 2.1 predice con altas
posibi-
lidades (8,0), que los péptidos C-terminales pertenecen a la clase ontológica de genes factor de crecimiento (figura 2).
lidades (8,0), que los péptidos C-terminales pertenecen a la clase ontológica de genes factor de crecimiento (figura 2).
Otros polipéptidos específicos se seleccionan
del grupo que consiste en SEQ ID No. 19, 20, 21, 22, 23 y 24, y
variantes de secuencia de dichos polipéptidos, en donde cualquier
aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia a un
aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 15 de los
residuos de aminoácido en la secuencia. Estos polipéptidos aislados
constituyen péptidos N-terminales de NsG33. De
preferencia, cualquier aminoácido cambiado se selecciona de los
designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente
conservados en la figura 3a. En una forma de realización preferida,
se han cambiado menos de 10 aminoácidos, más preferiblemente menos
de 5 aminoácidos, más preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos, más
preferiblemente no se ha cambiado ningún aminoácido. ProtFun 2.1
predice con altas posibilidades (8,1), que los péptidos
N-terminales pertenecen a la clase ontológica de
genes factor de crecimiento (figura 2).
En un aspecto, formas truncadas preferidas
específicas de NsG33 se seleccionan del grupo que consiste en:
1) AA_{30}-AA_{288} de SEQ
ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra
de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta
AA_{25}-AA_{293} de SEQ ID No. 3;
2) AA_{28}-AA_{286} de SEQ
ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos
extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta
AA_{23}-AA_{291} de SEQ ID No. 13;
3) AA_{31}-AA_{289} de SEQ
ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra
de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta
AA_{26}-AA_{294} de SEQ ID No. 8; y
4) variantes de secuencia de dichos
polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la
secuencia elegida se cambia a un aminoácido diferente, siempre que
no se cambien así más de 20 de los residuos de aminoácido en la
secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Estas formas truncadas de NsG33 constituyen una
secuencia central de la primera a la última cisteína conservada. En
una forma de realización preferida, se han cambiado menos de 15
aminoácidos, más preferiblemente menos de 10 aminoácidos, más
preferiblemente menos de 5 aminoácidos, tal como 1 ó 2 aminoácidos,
más preferiblemente no se ha cambiado ningún aminoácido.
En un aspecto, se seleccionan formas truncadas
específicas de NsG33 del grupo que consiste en:
1) AA_{171}-AA_{288} de SEQ
ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra
de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta
AA_{165}-AA_{288} de SEQ ID No. 3;
2) AA_{169}-AA_{286} de SEQ
ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos
extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta
AA_{164}-AA_{291} de SEQ ID No. 13;
3) AA_{172}-AA_{289} de SEQ
ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra
de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta
AA_{167}-AA_{294} de SEQ ID No. 8; y
4) variantes de dichos polipéptidos, en donde
cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia
a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 10
de los residuos de aminoácido en la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Estas formas truncadas constituyen una secuencia
de núcleo bioactivo de la primera a la última cisteína conservada
en péptidos C-terminales. En una forma de
realización preferida, se han cambiado menos de 10 aminoácidos, más
preferiblemente menos de 5 aminoácidos, más preferiblemente 1 ó 2
aminoácidos, más preferiblemente no se ha cambiado ningún
aminoácido.
En un aspecto, se seleccionan formas truncadas
específicas de NsG33 del grupo que consiste en:
1) AA_{30}-AA_{118} de SEQ
ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra
de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta
AA_{25}-AA_{123} de SEQ ID No. 3;
2) AA_{28}-AA_{116} de SEQ
ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos
extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta
AA_{23}-AA_{121} de SEQ ID No. 13;
3) AA_{31}-AA_{119} de SEQ
ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra
de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta
AA_{26}-AA_{124} de SEQ ID No. 8; y
4) variantes de dichos polipéptidos, en donde
cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia
a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 10
de los residuos de aminoácido en la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Estas formas truncadas constituyen secuencias
centrales de la primera a la cuarta cisteína conservada en péptidos
de NsG33 N-terminales. En una forma de realización
preferida, se han cambiado menos de 10 aminoácidos, más
preferiblemente menos de 5 aminoácidos, más preferiblemente 1 ó 2
aminoácidos, más preferiblemente no se ha cambiado ningún
aminoácido.
Las variantes pueden diferir de NsG33 natural en
la secuencia de aminoácidos o en formas que no impliquen secuencia,
o en ambas formas. Se producen variantes en secuencia de aminoácidos
("variantes de secuencia"), cuando uno o más aminoácidos en
NsG33 natural se sustituyen por un aminoácido natural diferente, un
derivado de aminoácido o un aminoácido no nativo. Variantes
particularmente preferidas incluyen NsG33 natural, o fragmentos
biológicamente activos de NsG33 natural, cuyas secuencias difieran
de la secuencia de tipo silvestre en una o más sustituciones de
aminoácido conservadoras y/o semiconservadoras que típicamente
tienen influencia mínima sobre la estructura secundaria y terciaria
y la naturaleza hidrofóbica de la proteína o péptido. Las variantes
pueden tener también secuencias que difieran en una o más
sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácido no
conservadoras, que no suprimen la actividad biológica de NsG33. El
alineamiento por Clustal W en la figura 3a o la figura 3b puede
usarse para predecir qué residuos de aminoácido se pueden sustituir
sin afectar sustancialmente la actividad biológica de la
proteína.
Sustituciones dentro del siguiente grupo
(Clustal W, grupo de conservación "fuerte"), se considerarán
como sustituciones conservadoras dentro del significado de la
presente invención:
-STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY,
FYW.
\vskip1.000000\baselineskip
Sustituciones dentro del siguiente grupo
(Clustal W, grupo de conservación "débil"), se deben considerar
como sustituciones semiconservadoras dentro del significado de la
presente invención:
-CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK,
NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY.
\vskip1.000000\baselineskip
Otras variantes dentro de la invención, son
aquellas con modificaciones que incrementan la estabilidad del
péptido. Tales variantes pueden contener, por ejemplo, uno o más
enlaces no peptídicos (que reemplazan a los enlaces peptídicos) en
la secuencia peptídica. También se incluyen: variantes que incluyen
residuos diferentes de L-aminoácidos naturales,
tales como D-aminoácidos o aminoácidos no naturales
o sintéticos, tales como beta o gamma aminoácidos y variantes
cíclicas. La incorporación de D-aminoácidos en lugar
de L-aminoácidos en el polipéptido, puede
incrementar su resistencia a proteasas. Véase, por ejemplo, la
patente de EE.UU. No. 5219990. Se incluyen específicamente variantes
de ayuste en la invención.
Cuando el resultado de una sustitución
determinada no pueda predecirse con certeza, los derivados pueden
ensayarse fácilmente según los métodos descritos aquí, para
determinar la presencia o ausencia de actividad biológica.
Preferiblemente, en el ensayo de células PC12 y/o el ensayo de hNS1
y/o el ensayo de cultivo estriatal de rata.
En una forma de realización, el polipéptido es
una variante alélica natural de la secuencia seleccionada del grupo
que consiste en SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20,
21, 22, 23 y 24. Este polipéptido puede comprender una secuencia de
aminoácidos que sea la traducción de una secuencia de ácido nucleico
que difiere en un sólo nucleótido, de una secuencia de ácido
nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6,
7, 11, 12, 16, 17 y 18.
Un polipéptido variante como se describe aquí,
en una forma de realización, comprende un polipéptido en donde se
cambia algún aminoácido especificado en la secuencia elegida para
proporcionar una sustitución conservadora.
El péptido señal puede ser reemplazado por un
péptido señal heterólogo.
Las variantes dentro del ámbito de la invención
en una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con
secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos el 70% de
identidad con NsG33 humano, murino o de rata (SEQ ID NO: 5, 10 y
15). Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos
el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más
preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo
menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más
preferiblemente por lo menos el 98%.
Variantes preferidas dentro del ámbito de la
invención en una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos
con secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos el 70 por
ciento de identidad con un polipéptido que tenga la secuencia de
SEQ ID NO: 4, 9 ó 14. Más preferiblemente, la identidad de secuencia
es por lo menos del 75%, más preferiblemente por lo menos del 80%,
más preferiblemente por lo menos del 85%, más preferiblemente por
lo menos del 90%, más preferiblemente por lo menos del 95%, más
preferiblemente por lo menos del 98%. SEQ ID No. 4, 9 y 14
corresponden a las proteínas maduras después de digestión del
péptido señal y sin digestión del pro-péptido.
Variantes dentro del ámbito de la invención en
una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con
secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 70 por ciento de
identidad con un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:
3, 8 ó 13. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo
menos del 75%, más preferiblemente por lo menos del 80%, más
preferiblemente por lo menos del 85%, más preferiblemente por lo
menos del 90%, más preferiblemente por lo menos del 95%, más
preferiblemente por lo menos del 98%.
Variantes dentro del ámbito de la invención en
una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con
secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 70% de identidad
de secuencia con una proteína que tiene una secuencia seleccionada
del grupo que consiste en SEQ ID No. 19, 20, 21, 22, 23 y 24, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más
preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una
proteína que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste
en SEQ ID No. 19, 20, 21, 22, 23 y 24.
Variantes dentro del ámbito de la invención en
una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con
secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos el 70 por ciento
de identidad con un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID
NO: 19, 20 ó 21. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es
por lo menos del 75%, más preferiblemente por lo menos del 80%, más
preferiblemente por lo menos del 85%, más preferiblemente por lo
menos del 90%, más preferiblemente por lo menos del 95%, más
preferiblemente por lo menos del 98%.
Variantes dentro del ámbito de la invención en
una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con
secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos el 70 por ciento
de identidad con un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID
No. 22, 23 o 24. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es
por lo menos del 75%, más preferiblemente por lo menos de 80%, más
preferiblemente por lo menos del 85%, más preferiblemente por lo
menos del 90%, más preferiblemente por lo menos del 95%, más
preferiblemente por lo menos del 98%.
En una forma de realización preferida, la
identidad de secuencia de NsG33 variante se determina con relación a
un polipéptido NsG33 humano (SEQ ID No. 3, 4, 5, 19 ó 22).
Para los propósitos de determinación de la
homología, la longitud mínima de secuencias de comparación será en
general por lo menos 8 residuos de aminoácido, usualmente por lo
menos 12 residuos de aminoácido. Para los propósitos de la presente
invención, el porcentaje de identidad de secuencia se calcula de
preferencia en un intervalo de solapamiento por lo menos 25
aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 30 aminoácidos, más
preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos
40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo
menos 50, más preferiblemente por lo menos 55, más preferiblemente
por lo menos 60, tal como por lo menos 70, por ejemplo, por lo
menos 80, tal como por lo menos 90, por ejemplo, por lo menos 100,
tal como por lo menos 110, por ejemplo, por lo menos 120, tal como
por lo menos 130, por ejemplo, por lo menos 150, estando
determinado el intervalo mediante BLASTP con valores
predeterminados.
En una forma de realización, el porcentaje de
identidad de secuencia se calcula usando alineamiento global (GAP o
Align), de modo que las secuencias variante y de SEQ ID se alinean,
y el número total de residuos de aminoácido idénticos se calcula y
divide entre la longitud de SEQ ID NO.
En una forma de realización, una NsG33 variante
comprende una variante alélica natural de la secuencia seleccionada
del grupo que consiste en SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14 y 15.
Dicha secuencia variante alélica puede ser una secuencia de
aminoácidos que sea la traducción de una secuencia de ácido nucleico
que difiera en un sólo nucleótido de una secuencia de ácido
nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6,
7, 11, 12, 16, 17 y 18.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
3, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por
lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
En una forma de realización, las variantes
preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de
aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia
con SEQ ID No. 4, más preferiblemente por lo menos el 75%, más
preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo
menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más
preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo
menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
5, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por
lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
8, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por
lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de
aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia
con SEQ ID No. 9, más preferiblemente por lo menos el 75%, más
preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo
menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más
preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo
menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
10, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente
por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
13, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente
por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de
aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia
con SEQ ID No. 14, más preferiblemente por lo menos el 75%, más
preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo
menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más
preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo
menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
15, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente
por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
19, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente
por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
20, más preferiblemente por lo el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
21, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente
por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
22, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente
por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
23, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por
lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
24, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por
lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización, las variantes
incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No.
26, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente
por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.
En una forma de realización, una NsG33 variante
en posiciones correspondientes, comprende los residuos marcados en
la figura 3a como completamente conservados (*), más preferiblemente
una NsG33 variante comprende también en posiciones correspondientes
los residuos marcados en la figura 3a como fuertemente conservados
(: grupos fuertemente conservados incluyen: STA, NEQK, NHQK, NEDQ,
QHRK, MILV, MILF, HY FYW), más preferiblemente una NsG33 variante
comprende también en posiciones correspondientes los residuos
marcados en la figura 3a como menos conservados (. grupos menos
conservados incluyen: CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK,
NDEQHK, NEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY). En particular, se contempla que
las cisteínas conservadas (figura 5) deben localizarse en posiciones
correspondientes en una NsG33 variante.
Las modificaciones no de secuencia pueden
incluir, por ejemplo, derivación química in vivo o in
vitro de partes de NsG33, así como acetilación, metilación,
fosforilación, carboxilación, PEG-ilación o
glicosilación. Ya que es posible reemplazar sustituyentes de la
proteína, también es posible sustituir grupos funcionales, que
están unidos a la proteína con grupos caracterizados por
características similares. Tales modificaciones no alteran la
secuencia primaria. Estas serán inicialmente conservadoras, es
decir, el grupo de reemplazo tendrá casi los mismos tamaño, forma,
hidrofobicidad y carga que el grupo original.
Muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos
terminales, pueden modificarse en un polipéptido determinado, ya
sea por procesos naturales tales como la glicosilación y otras
modificaciones postraduccionales, o por medio de técnicas de
modificación química que son bien conocidas en la técnica. Entre las
modificaciones conocidas que pueden estar presentes en los
polipéptidos de la presente invención están, por nombrar unas
cuantas ilustrativas, acetilación, acilación,
ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de
flavina, unión covalente de un grupo hemo, unión covalente de un
polinucleótido o derivado de polinucleótido, unión covalente de un
lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol,
entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro,
desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación
de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación
gamma, glicación, glicosilación, formación de anclaje de GPI,
hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación,
procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación,
racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a
proteínas mediada por ARN de transferencia, tal como arginilación, y
ubiquitinación.
Tales modificaciones son bien conocidas por los
expertos en la materia, y se han descrito en gran detalle en la
literatura científica. Varias modificaciones particularmente
comunes, glicosilación, unión de lípidos, sulfatación,
carboxilación gamma de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y
ADP-ribosilación, por ejemplo, se describen en la
mayoría de textos básicos tales como, por ejemplo, I. E. Creighton,
Proteins-Structure and Molecular Properties, 2a.
ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1993. Están disponibles
muchas revisiones detalladas sobre este tema tales como, por
ejemplo, las proporcionadas por Wold, F., en Posttranslational
Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, ed., Academic
Press, New York, pp 1-12, 1983; Seifter et
al., Meth. Enzymol. 182: 626-646, 1990, y Rattan
et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications
and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62,
1992.
Además, la proteína puede comprender una
etiqueta proteica que permita la purificación subsiguiente y
opcionalmente la eliminación de la etiqueta usando una
endopeptidasa. La etiqueta puede comprender también un sitio de
corte de proteasa que facilite la eliminación subsiguiente de la
etiqueta. Ejemplos no limitantes de etiquetas de afinidad, incluyen
una etiqueta de polihistidina, una etiqueta de GST, una etiqueta de
HA, una etiqueta Flag, una etiqueta C-myc, una
etiqueta de HSV, una etiqueta V5, una etiqueta de proteína de unión
a maltosa y una etiqueta del dominio de unión a celulosa. De
preferencia, para la producción y purificación, la etiqueta es una
etiqueta de polihistidina. De preferencia, la etiqueta está en la
parte C-terminal de la proteína.
La secuencia señal nativa de NsG33 puede
reemplazarse también para incrementar la secreción de la proteína en
producción recombinante en otros tipos de células de mamífero.
Se apreciará, como es bien sabido y como se
indicó anteriormente, que los polipéptidos no siempre son
enteramente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar
ramificados como resultado de ubiquitinación, y pueden ser
circulares, con o sin ramificación, en general como resultado de
eventos postraduccionales, que incluyen eventos de procesamiento
naturales y eventos causados por la manipulación humana que no
ocurren de forma natural. Pueden sintetizarse polipéptidos
circulares, ramificados y circulares ramificados mediante procesos
naturales no de traducción, y mediante métodos enteramente
sintéticos, también y están dentro del ámbito de la presente
invención.
Pueden ocurrir modificaciones en cualquier parte
en un polipéptido, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas
laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. De hecho,
el bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos,
por una modificación covalente, es común en polipéptidos naturales y
sintéticos, y tales modificaciones pueden estar también presentes
en los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, el
residuo amino terminal de polipéptidos obtenidos en E. coli
antes del procesamiento proteolítico, casi invariablemente será
N-formilmetionina.
\newpage
Las modificaciones que ocurren en un polipéptido
serán con frecuencia una función de cómo se produce. Para
polipéptidos que se obtienen expresando un gen clonado en un
huésped, por ejemplo, la naturaleza y el ámbito de las
modificaciones estarán determinadas en gran parte por la capacidad
de modificación postraduccional de la célula huésped y las señales
de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del
polipéptido. Por ejemplo, la glicosilación no ocurre con frecuencia
en bacterias huésped tales como E. coli. Según esto, cuando
se desee glicosilación, un polipéptido debe expresarse en un huésped
glicosilante, en general una célula eucariota. Las células de
insecto llevan a cabo con frecuencia las mismas glicosilaciones
postraduccionales que las células de mamífero y, por esta razón, se
han desarrollado sistemas de expresión de células de insecto para
expresar eficientemente proteínas de mamífero que tengan patrones
nativos de glicosilación, entre otros. Consideraciones similares se
aplican a otras
modificaciones.
modificaciones.
Se apreciará que el mismo tipo de modificación
puede estar presente en el mismo grado o un grado variable en varios
sitios en un polipéptido determinado. Asimismo, un polipéptido
determinado puede contener muchos tipos de modificaciones.
En general, como se usa aquí, el término
polipéptido abarca todas esas modificaciones, en particular las que
están presentes en polipéptidos sintetizados expresando un
polinucleótido en una célula huésped.
También se incluyen dentro de la invención
agentes que se unen específicamente a una proteína de la invención,
o un fragmento de dicha proteína. Estos agentes incluyen proteínas
de fusión de inmunoglobulina y anticuerpos (incluyendo fragmentos
de cadena sencilla, de cadena doble, F_{ab} y otros, ya sea
nativos, humanizados, primatizados o quiméricos). Otras
descripciones de estas categorías de agentes están en el documento
WO 95/16709.
Anticuerpos se refiere a moléculas intactas, así
como a fragmentos de las mismas, tales como F_{ab}, F_{(ab')} y
F_{v}, que son capaces de unirse al determinante epitópico. Pueden
prepararse anticuerpos que se unen a polipéptidos NsG33, usando
polipéptidos intactos o fragmentos que contengan pequeños péptidos
de interés como el antígeno inmunizante. El polipéptido u
oligopéptido usado para inmunizar a un animal puede derivarse de la
traducción de ARN, o puede sintetizarse químicamente y puede
conjugarse con una proteína portadora, si se desea. Vehículos
usados comúnmente que se acoplan químicamente a péptidos, incluyen
seroalbúmina bovina, tiroglobulina y hemocianina de lapa
californiana. El péptido acoplado se usa entonces para inmunizar al
animal (por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo).
Los anticuerpos humanizados, como se usa aquí,
se refiere a moléculas de anticuerpo en las que se han cambiado
aminoácidos en las regiones de no unión a antígeno para asemejar más
estrechamente un anticuerpo humano, mientras retienen aún la
capacidad de unión original. Pueden usarse terapéuticamente
anticuerpos humanizados para tratar afecciones, donde sea deseable
limitar o bloquear la acción de NsG33.
También se incluyen dentro del ámbito de la
presente invención, inmunoconjugados de anticuerpos y conjugados
seleccionados del grupo que consiste en: un agente citotóxico tal
como un agente quimioterapéutico, una toxina o un isótopo
radiactivo; un miembro de un par de unión específico, tal como
avidina o estreptavidina, o un antígeno; una enzima capaz de
producir un producto detectable. Estos inmunoconjugados pueden
usarse para dirigir los conjugados hacia células que expresan un
receptor de NsG33.
Anticuerpos específicos para cualquier NsG33,
son también útiles en inmunoensayos para cuantificar la sustancia
para la que un anticuerpo determinado tiene carácter específico.
Anticuerpos específicos para una NsG33 pueden unirse también a
soportes sólidos, tales como perlas o placas, y pueden usarse para
retirar el ligando de una solución, ya sea para su uso en la
purificación de la proteína, o en la depuración de la solución. Cada
una de estas técnicas es de rutina para los expertos en las técnicas
inmunológicas.
También están dentro del ámbito de la presente
invención, proteínas de fusión de NsG33. Una proteína de fusión de
NsG33 puede usarse para permitir el diagnóstico por imágenes de
tejidos que expresen un receptor para NsG33, o en los métodos
inmunohistológicos o preparativos descritos anteriormente para
anticuerpos para una NsG33. Pueden usarse proteínas de fusión que
abarquen una NsG33 para dirigir específicamente terapias médicas
contra células que expresen un receptor de NsG33.
La invención proporciona el uso médico según la
invención de ADN genómico y ADNc que codifica NsG33 incluyendo, por
ejemplo, la secuencia de nucleótidos genómica humana (SEQ ID No. 1),
las secuencias genómicas de ratón y rata (SEQ ID No. 6 y 11), la
secuencia de nucleótidos de ADNc de NsG33 humano, de ratón y rata
(SEQ ID No. 2, 7 y 12), las secuencias que codifican NsG33 sin
péptido señal (nucleótidos 187-996 de SEQ ID No. 2,
nucleótidos 74-883 de SEQ ID No. 7 y nucleótidos
64-873 de SEQ ID No. 12), y las secuencias que
codifican fragmentos N-terminales de NsG33 de
origen humano, de ratón y rata (SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 y SEQ
ID No. 18). La invención también proporciona la secuencia de ADNc
que codifica NsG33 de longitud completa de ratón (SEQ ID No.
25).
También se incluyen variantes de estas
secuencias dentro del ámbito de la presente invención.
\newpage
En una forma de realización, una molécula de
ácido nucleico aislada para el uso médico de la invención, comprende
una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido o su
secuencia complementaria, comprendiendo dicho polipéptido una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del
grupo que consiste en SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19,
20, 21, 22, 23 y 24;
b) una variante de secuencia de la secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 3, 4,
5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23 y 24, en donde la
variante tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con
dicha SEQ ID No.; y
c) un fragmento biológicamente activo de por lo
menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b).
\vskip1.000000\baselineskip
La molécula de ácido nucleico puede comprender
la secuencia de nucleótidos de una variante alélica de ácido
nucleico natural.
La molécula de ácido nucleico de la invención
puede codificar un polipéptido variante, en donde el polipéptido
variante tiene la secuencia polipeptídica de una variante de
polipéptido natural.
En una forma de realización, la molécula de
ácido nucleico difiere en un solo nucleótido de una secuencia de
ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1,
2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18.
De preferencia, el polipéptido codificado tiene
por lo menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 5, 10 y 15, más
preferiblemente el 75% de identidad de secuencia, más
preferiblemente por lo menos el 80% de identidad de secuencia, más
preferiblemente por lo menos el 85% de identidad de secuencia, más
preferiblemente por lo menos el 90% de identidad de secuencia, más
preferiblemente por lo menos el 95% de identidad de secuencia, más
preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, más
preferiblemente en donde el polipéptido tiene una secuencia
seleccionada del grupo que consiste en dichas SEQ ID Nos.
En una forma de realización preferida, el
polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID No. 3 y 4, más preferiblemente el 75% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 80% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 85% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 90% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 95% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de
secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tiene una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en dichas SEQ ID Nos.
Dichas secuencias constituyen NsG33 humano.
En una forma de realización preferida, el
polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID No. 19 y 22, más preferiblemente el 75% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 80% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 85% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 90% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 95% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de
secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tiene una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en dichas SEQ ID Nos.
Dichas secuencias constituyen NsG33 humano.
En una forma de realización preferida, el
polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con la secuencia de SEQ ID No. 5, más preferiblemente el
75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el
80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el
85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el
90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el
95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el
98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el
polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste
en dicha SEQ ID No. Dicha secuencia constituye NsG33 humano.
En una forma de realización preferida, el
polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID No. 4, 9 y 14, más preferiblemente el 75% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 80% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 85% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 90% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 95% de identidad de
secuencia, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de
secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tiene una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en dichas SEQ ID Nos.
Dichas secuencias constituyen NsG33 sin péptido señal.
En una forma de realización preferida, el
polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID No. 3, 8 y 13, más preferiblemente por lo menos el 75%, más
preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más
preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene una secuencia
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 3, 8 y 13.
En una forma de realización preferida, el
polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID No. 19, 20, 21, 22, 23 y 24, más preferiblemente por lo
menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más
preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo
menos el 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene
una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 19,
20, 21, 22, 23 y 24.
En una forma de realización preferida, el
polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con SEQ ID No. 3, más preferiblemente por lo menos el 75%,
más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más
preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene la secuencia de SEQ
ID No. 3.
En una forma de realización preferida, el
polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con SEQ ID No. 4, más preferiblemente por lo menos el 75%,
más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más
preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene la secuencia de SEQ
ID No. 4.
En una forma de realización preferida, el
polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con SEQ ID No. 19, más preferiblemente por lo menos el
75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente
por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más
preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene la secuencia de SEQ
ID No. 19.
En una forma de realización preferida, el
polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con SEQ ID No. 22, más preferiblemente por lo menos el
75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente
por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más
preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene la secuencia de SEQ
ID No. 22.
En una forma de realización, la molécula de
ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada
del grupo que consiste en:
a) la secuencia de nucleótidos seleccionada del
grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y
18;
b) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo
menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2,
6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18;
c) una secuencia de ácido nucleico de por lo
menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del
grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y
18;
c) el complemento de un ácido nucleico capaz de
hibridar con un ácido nucleico que tiene la secuencia seleccionada
del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18
en condiciones muy rigurosas; y
d) la secuencia de ácido nucleico del
complemento de cualquiera de los anteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No. 16, 17 y 18 representan las
secuencias que codifican polipéptidos C-terminales
de NsG33 humano, de ratón y rata. Para expresión recombinante en un
sistema de expresión eucariótico, éstas están ligadas de
preferencia a secuencias codificantes de secuencia señal adecuadas
que aseguran que el polipéptido NsG33 se secrete de las células.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del
grupo que consiste en SEQ ID No. 2, 7, 12, 16, 17 y 18.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del
grupo que consiste en SEQ ID No. 16, 17 y 18.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del
grupo que consiste en SEQ ID No. 2 y 16.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del
grupo que consiste en los nucleótidos 187-996 de
SEQ ID No. 2, nucleótidos 74-883 de SEQ ID No. 7 y
nucleótidos 64-873 de SEQ ID No. 12. Estos
fragmentos de secuencia codifican NsG33 sin péptido señal.
En una forma de realización, el polinucleótido
aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con la secuencia de polinucleótidos presentada como
SEQ ID NO: 1.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como
SEQ ID NO: 2.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como
SEQ ID NO: 16.
En una forma de realización, el polinucleótido
aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como
SEQ ID NO: 6.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como
SEQ ID NO: 7.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como
SEQ ID NO: 17.
En una forma de realización, el polinucleótido
aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como
SEQ ID NO: 11.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como
SEQ ID NO: 12.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como
SEQ ID NO: 18.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%,
más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como
SEQ ID NO: 25.
Un grupo preferido de polinucleótidos aislados
incluye SEQ ID No. 1, 2 y 16, que son polinucleótidos de NsG33
humano. Otro grupo preferido de polinucleótidos aislados incluye SEQ
ID No. 2, 7 y 12, que representan las secuencias de ADNc. En
general, la secuencia de ADNc es mucho más corta que las secuencias
genómicas, que se insertan más fácilmente en un vector de expresión
adecuado, y se transducen/transfectan en una célula de producción o
una célula humana in vivo o ex vivo.
Además, las secuencias de nucleótidos de la
invención incluyen secuencias que son derivados de estas secuencias.
La invención incluye también vectores, liposomas y otros vehículos
portadores, que abarcan una de estas secuencias o un derivado de
una de estas secuencias. La invención incluye también proteínas
transcritas y traducidas de ADNc de NsG33, de preferencia ADNc de
NsG33 humano que incluye, pero no está limitado a, NsG33 humano y
sus derivados y variantes.
En otra forma de realización, la invención se
refiere al uso de los ácidos nucleicos y proteínas de la presente
invención, para diseñar sondas para aislar otros genes que
codifiquen proteínas con propiedades estructurales o funcionales de
las proteínas NsG33 de la invención. Las sondas pueden tener una
variedad de pares de bases de longitud. Por ejemplo, una sonda de
ácido nucleico puede estar entre aproximadamente 10 pares de bases
de longitud a aproximadamente 150 pares de bases de longitud.
De forma alternativa, la sonda de ácido nucleico
puede ser mayor de aproximadamente 150 pares de bases de longitud.
Se proporcionan métodos experimentales en Ausubel et al.,
"Current Protocols in Molecular Biology", J. Wiley (ed.)
(1999).
El diseño de la sonda de oligonucleótidos
(referida también aquí como ácido nucleico), debe seguir de
preferencia estos parámetros:
i) debe diseñarse para un área de la secuencia
que tenga el menor número de bases ambiguas, si las hay, y
ii) debe diseñarse para que tenga una T_{m}
calculada de aproximadamente 80ºC (suponiendo 2ºC por cada A ó T, y
4ºC por cada G ó C).
\vskip1.000000\baselineskip
El oligonucleótido debe marcarse de preferencia
para facilitar la detección de hibridación. El marcaje puede ser
con \gamma-^{32}P ATP (actividad específica de
6000 Ci/mmol) y polinucleótido cinasa de T4, usando técnicas usadas
comúnmente para el marcaje de oligonucleótidos. Pueden usarse
también otras técnicas de marcaje. La marca no incorporada debe
eliminarse de preferencia por medio de cromatografía de filtración
en gel u otros métodos establecidos. La cantidad de radiactividad
incorporada en la sonda debe cuantificarse por medida en un
contador de centelleo. De preferencia, la actividad específica de la
sonda resultante debe ser de aproximadamente 4 x 10^{6} dpm/pmol.
El cultivo de bacterias que contiene al grupo de clones de longitud
completa debe descongelarse de preferencia, y deben usarse 100
\muL de la solución madre para inocular un matraz de cultivo
estéril que contenga 25 ml de medio de Luria estéril que contenga
ampicilina 100 pg/ml.
El cultivo se debe hacer crecer de preferencia
hasta saturación a aproximadamente 37ºC, y el cultivo saturado debe
diluirse de preferencia en medio de Luria fresco. Deben sembrarse en
placa de preferencia alícuotas de estas diluciones para determinar
la dilución y el volumen que darán aproximadamente 5000 colonias
distintas y bien separadas en medios bacteriológicos sólidos que
contengan medio de Luria con ampicilina a 100 pg/ml y agar al 1,5%
en una placa Petri de 150 mm cuando se hacen crecer durante la noche
a aproximadamente 37ºC. Pueden usarse también otros métodos
conocidos para la obtención de colonias distintas bien
separadas.
Deben usarse entonces procedimientos estándar de
hibridación de colonias para transferir las colonias a filtros de
nitrocelulosa y lisarlas, desnaturalizarlas y hornearlas.
Condiciones muy rigurosas (referidas también en la presente como
"alta severidad"), son aquellas que son por lo menos tan
rigurosas como, por ejemplo, SSC 1x a aproximadamente 65ºC, o SSC
1x y formamida al 50% a aproximadamente 42ºC. Condiciones de
"severidad moderada", son aquellas que son por lo menos tan
rigurosas como SSC 4x a aproximadamente 65ºC, o SSC 4x y formamida
al 50% a aproximadamente 42ºC. Condiciones de "severidad
reducida", son aquellas que son por lo menos tan rigurosas como
SSC 4x a aproximadamente 50ºC, o SSC 6x y formamida al 50% a
40ºC.
El filtro se incuba entonces de preferencia a
aproximadamente 65ºC durante 1 hora, con agitación suave en SSC 6X
(la solución madre 20x es 175,3 g de NaCl/litro, 88,2 g de citrato
de sodio/litro, ajustados a pH 7.0 con NaOH) que contiene SDS al
0,5%, 100 g/ml de ARN de levadura y EDTA 10 mM (aproximadamente 10
mL por filtro de 150 mm). De preferencia, la sonda se añade
entonces a la mezcla de hibridación a una concentración mayor que o
igual a 1 x 10^{6} dpm/mL. El filtro se incuba entonces de
preferencia a aproximadamente 65ºC con agitación suave durante la
noche. El filtro se lava entonces de preferencia en 500 mL de SSC
2x/SDS al 0,5% a temperatura ambiente sin agitación, de preferencia
seguido por 500 mL de SSC 2x/SDS al 0,1% a temperatura ambiente
con agitación suave durante 15 minutos. Un tercer lavado con SSC
0,1x/SDS al 0,5% a aproximadamente 65ºC durante 30 minutos a 1
hora, es opcional. El filtro se seca entonces de preferencia y se
somete a autorradiografía durante tiempo suficiente para visualizar
los positivos en la película de rayos X. Pueden usarse también otros
métodos de hibridación conocidos. Las colonias positivas se recogen
entonces, se hacen crecer en cultivo, y se aísla ADN de plásmido
usando procedimientos estándar.
Los clones pueden verificarse entonces por análisis de restricción, análisis de hibridación o secuenciación de ADN.
Los clones pueden verificarse entonces por análisis de restricción, análisis de hibridación o secuenciación de ADN.
De forma alternativa, condiciones experimentales
adecuadas para determinar la hibridación entre una sonda de
nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homóloga, implican
pre-remojo del filtro que contiene a los fragmentos
de ADN, o ARN para hibridar en SSC 5x [cloruro de sodio/citrato de
sodio; véase Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989]
durante 10 minutos, y prehibridación del filtro en una solución de
SSC 5x, solución de Denhardt 5x [véase Sambrook et al; en la
obra citada], SDS al 0,5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón sonicado desnaturalizado [véase Sambrook et al.; en
la obra citada], seguido de hibridación en la misma solución que
contiene una concentración de 10 ng/ml de una sonda marcada al azar
[Feinberg A P y Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983 132
6-13], marcada conP-dCTP (actividad
específica > 1 x 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a
aproximadamente 45ºC. El filtro se lava entonces dos veces durante
30 minutos en SSC 0,1x, SDS al 0,5% a una temperatura de por lo
menos 60ºC (condiciones de severidad media), de preferencia por lo
menos 65ºC (condiciones de severidad media/alta), más
preferiblemente por lo menos 70ºC (condiciones de alta severidad), y
aún más preferiblemente de por lo menos 75ºC (condiciones de muy
alta severidad). Las moléculas con las que hibrida la sonda de
oligonucleótidos en estas condiciones, pueden detectarse usando una
película de rayos X.
En aún otra forma de realización, la invención
se refiere a secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN)
que hibridan con ácidos nucleicos de NsG33. En particular, ácidos
nucleicos que hibridan con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No 16, SEQ ID
No 17 o SEQ ID No 18 en condiciones de severidad alta, moderada o
reducida como se describió anteriormente.
En otra aún forma de realización, la invención
se refiere a un complemento de ácido nucleico de NsG33. En
particular, se refiere a complementos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID No
16, SEQ ID No 17 y SEQ ID No 18.
En otra forma de realización, la invención se
refiere a un homólogo de ARN del ácido nucleico ADN de NsG33. En
particular, se refiere a homólogos de ARN de SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17 y SEQ ID No 18.
Se contemplan también moléculas de ácido
nucleico con codones optimizados para expresión mejorada en células
huéspedes seleccionadas que incluyen, pero no están limitadas a,
E. coli, especies de levadura, hámster chino, cría de
hámster, insecto y hongo.
Pueden hacerse ácidos nucleicos variantes
mediante métodos de mutagénesis del estado de la técnica. Se
contemplan también métodos para entremezclar secuencias
codificantes humanas con las de ratón, rata o chimpancé.
Específicamente, una variante entremezclada se puede dar entre SEQ
ID No. 2 por un lado, y 7 y/o 12 por otro. Se incluyen también
variantes entremezcladas entre SEQ ID No. 7 y 12.
En una forma de realización, se proporciona
NsG33 variante nativa y fragmentos de la misma y/o proteínas de
fusión que comprenden NsG33, para el tratamiento de trastornos del
sistema nervioso de mamíferos. Puede usarse NsG33 para estimular el
crecimiento de células neurales, que incluye proliferación, función
neural, regeneración neural, diferenciación neural, migración
neural y/o supervivencia neural en situaciones de enfermedad en
donde estas células se pierden o son dañadas.
En una forma de realización, pueden usarse
polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención para tratar
afecciones o enfermedades en donde sea deseable el crecimiento
neural, que incluye proliferación, diferenciación, función,
supervivencia y/o regeneración. Los polipéptidos de la presente
invención pueden usarse directamente, por ejemplo, por medio de
composiciones farmacéuticas inyectadas, implantadas o ingeridas,
para tratar un proceso patológico sensible a los polipéptidos
NsG33. Esto está apoyado por los análisis de bioinformática que
muestran que NsG33 es un factor de crecimiento secretado, el hecho
de que NsG33 sea capaz de proteger a una línea de células neurales
de apoptosis (ejemplo 6), el hecho de que NsG33 produzca la
generación de un porcentaje incrementado de neuronas en un ensayo
de diferenciación de células progenitoras neurales humanas y en
cultivos estriatales primarios de rata, y el hecho de que NsG33 se
exprese preferiblemente en el sistema nervioso, incluyendo el ojo
(figura 4). El efecto antiapoptótico de NsG33, la hace una
proteína/gen candidato para el tratamiento de trastornos del
sistema nervioso que implican muerte celular apoptótica. Tales
trastornos incluyen apoplejía, traumatismo y trastornos
neurodegenerativos. El efecto neuroprotector y/o de neurogénesis de
NsG33, apoya el uso para el tratamiento de trastornos causados por
pérdida, disfunción o degeneración de neuronas o sus
extensiones.
NsG33 puede actuar sobre una gama de diferentes
tipos de células que están presentes en el sistema nervioso. En el
contexto de la presente invención, se pretende que el sistema
nervioso abarque el sistema nervioso central, el sistema nervioso
periférico, el ojo y el complejo cocleovestibular.
En una forma de realización, los polipéptidos
NsG33 pueden actuar sobre neuronas que incluyen, pero no están
limitadas a, neuronas motoras y neuronas sensitivas.
En otra forma de realización, el efecto
terapéutico de los polipéptidos NsG33 puede ser a través de la
acción sobre células gliales, tales como oligodendrocitos y/o
astrocitos. A través de su acción sobre células gliales, los
polipéptidos NsG33 pueden estar implicados en mielinización y en el
mantenimiento de la función y supervivencia neuronales.
En otra forma de realización, los polipéptidos
NsG33 pueden actuar sobre células sensitivas que incluyen, pero no
están limitadas a, células ganglionares retinianas, células
fotorreceptoras, tejido de soporte tal como células epiteliales
retinianas, y células pilosas del oído.
En una forma de realización adicional, los
polipéptidos NsG33 pueden actuar sobre células madre, y células
precursoras posteriores que incluyen, pero no están limitadas a,
precursores neuronales y precursores gliales. Los polipéptidos
NsG33 pueden actuar sobre células madre y/o precursores neuronales o
gliales para causar crecimiento que incluye proliferación, para
causar diferenciación, y/o migración. La terapia con células madre
puede hacerse a través de terapia génica in vivo o ex
vivo, o la proteína puede administrarse a un sitio con células
madre. Esto está apoyado por el efecto de NsG33 sobre una línea de
células progenitoras neurales humanas.
\newpage
El trastorno o enfermedad o daño pueden ser
daños del sistema nervioso causados por traumatismo, cirugía,
isquemia, infección, enfermedades metabólicas, deficiencia
nutricional, cáncer o agentes tóxicos, y procesos genéticos o
idiopáticos.
En una forma de realización del método de la
invención, la enfermedad o trastorno o daño implica lesión en el
cerebro, tronco encefálico, la médula espinal y/o nervios
periféricos, que produce afecciones tales como apoplejía, lesión
cerebral traumática (TBI), lesión de médula espinal (SCI), lesión
axonal difusa (DAI), epilepsia, neuropatía, neuropatía periférica y
dolor asociado y otros síntomas que estos síndromes pueden
causar.
En otra forma de realización, la enfermedad,
trastorno o daño implica la degeneración de neuronas y sus
extensiones en el cerebro, tronce encefálico, la médula espinal y/o
nervios periféricos, tales como trastornos neurodegenerativos que
incluyen, pero no están limitados a, enfermedad de Parkinson,
enfermedad de Alzheimer, demencia senil, enfermedad de Huntington,
esclerosis lateral amiotrófica (ELA), lesión neuronal/axonal
asociada con esclerosis múltiple (EM), y síntomas asociados.
En otra forma de realización, la enfermedad,
trastorno o daño implica disfunción y/o pérdida de neuronas en el
cerebro, tronce encefálico, la médula espinal y/o nervios
periféricos, tales como disfunción y/o pérdida causada por
enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, lesión tóxica,
cáncer y/o afecciones genéticas o idiopáticas que incluyen, pero no
están limitadas a, diabetes, disfunción renal, alcoholismo,
quimioterapia, agentes químicos, toxicomanía, deficiencias de
vitaminas, infección, y síntomas asociados.
En otra forma de realización, la enfermedad,
trastorno o daño implica la degeneración o esclerosis de células
gliales, tales como oligodendrocitos, astrocitos y células de
Schwann en el cerebro, tronco encefálico, la médula espinal y
sistema nervioso periférico e incluye, pero no está limitado a,
esclerosis múltiple (EM), neuritis óptica, esclerosis cerebral,
encefalomielitis post-infecciosa y epilepsia, y
síntomas asociados.
En otra forma de realización, la enfermedad,
trastorno o daño implica la retina, fotorreceptores y nervios
asociados e incluye, pero no está limitado a, retinitis pigmentosa,
degeneración macular, glaucoma, y síntomas asociados.
En otra forma de realización, la enfermedad,
trastorno o daño implica el epitelio sensitivo y ganglios asociados
del complejo vestibuloacústico e incluye, pero no está limitado a,
pérdida de audición inducida por ruido, sordera, acúfenos, otitis,
laberintitis, atrofias hereditaria y cocleovestibular, enfermedad de
Meniere, y síntomas asociados.
En una forma de realización preferida, los
polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y
composiciones farmacéuticas de la invención, se usan en el
tratamiento de enfermedad de Parkinson. Esta función se basa en el
hallazgo de altos niveles de expresión en el cerebro medio central,
en la sustancia negra y en el putamen (véase ejemplo 5), y el
hallazgo de expresión en el mesencéfalo durante el desarrollo del
embrión humano (ejemplo 3), el hecho de que NsG33 causa la
generación de un porcentaje incrementado de neuronas en un ensayo
de diferenciación de células progenitoras neurales humanas y en
cultivos estriatales primarios de rata, y está apoyada por el
hallazgo de protección contra muerte celular apoptótica (ejemplo
6). La función puede verificarse usando el bioensayo para
actividades neurotróficas dopaminérgicas (ejemplo 11) e in
vivo a través del modelo de lesión intraestriatal con
6-OHDA (ejemplo 12).
La enfermedad de Huntington (EH), es un
trastorno autosómico dominante que produce la degeneración
progresiva de varias poblaciones neuronales dentro del cerebro, en
particular las neuronas espinosas medias GABAérgicas localizadas en
el núcleo caudado. Asociadas con esta degeneración, las neuronas de
entrada glutaminérgicas corticales degeneran también, y la
degeneración combinada da razón de la mayoría de los síntomas
característicos de movimientos motores discinéticos progresivos, así
como demencia.
En una forma de realización preferida, los
polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y
composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el
tratamiento de enfermedad de Huntington. Esto se basa en el
hallazgo de alta expresión en el putamen, combinada con los
resultados de los análisis de bioinformática y la actividad
neuroprotectora/de neurogénesis de NsG33 (en particular el ejemplo
15, pero también los ejemplos 6 y 14). La enfermedad de Huntington
es una enfermedad excitotóxica. Un bioensayo excitotóxico es el
ensayo descrito en el ejemplo 12 de la presente invención. Otro
ejemplo de bioensayo para la verificación de este efecto
neuroprotector de NsG33 incluye, por ejemplo, el bioensayo sobre la
protección de cultivos primarios de cortes de hipocampo contra los
efectos excitotóxicos de NMDA (véase documento WO 03/004527, ejemplo
5).
En otra forma de realización preferida, los
polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y
composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el
tratamiento de neuropatías periféricas. Esto se basa en el hallazgo
de alta expresión en el ganglio de la raíz dorsal, combinada con los
resultados de los análisis de bioinformática y con la actividad
neuroprotectora/de neurogénesis y el efecto antiapoptótico de NsG33
(ejemplos 6, 14 y 15). La verificación de esta función puede hacerse
con el ensayo del cultivo del ganglio de la raíz dorsal descrito en
el ejemplo 9. Entre las neuropatías periféricas contempladas para el
tratamiento con las moléculas de esta invención, están neuropatías
inducidas por traumatismo, por ejemplo, las causadas por lesión
física o estado de enfermedad, daño físico a los nervios
periféricos, tales como discos herniados y el cerebro, daño físico
a la médula espinal, apoplejía asociada con daño cerebral, y
trastornos neurológicos relacionados con neurodegeneración. También
se contempla el tratamiento de neuropatías inducidas por
quimioterapia (tales como las causadas por el suministro de agentes
quimioterapéuticos, por ejemplo, taxol o cisplatino); neuropatías
inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por fármacos,
neuropatías inducidas por deficiencias de vitaminas, neuropatías
idiopáticas y neuropatías diabéticas.
En otra forma de realización preferida, los
polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y
composiciones de la invención se usan en el tratamiento de
trastornos, enfermedades o daños asociados con el cerebelo que
incluyen, pero no están limitados a, ataxia sensitiva, esclerosis
múltiple, trastornos espinocerebelares neurodegenerativos, ataxia
hereditaria, atrofias cerebelares (tales como atrofia
olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de Shy-Drager
(atrofia de sistemas múltiples)), y alcoholismo. Esta función está
apoyada por los altos niveles de expresión en el cerebelo humano
adulto y la expresión diferencial en el cerebelo de ratón en
desarrollo, combinados con los análisis de bioinformática y la
actividad neuroprotectora/de neurogénesis y el efecto
antiapoptótico de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 15). La verificación de
esta función puede hacerse con los ensayos descritos en los
ejemplos 7 y 8 (protección de células granulares cerebelares de la
toxicidad del glutamato y la privación de potasio).
En otra forma de realización preferida, los
polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y
composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el
tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular
espinal y lesión de médula espinal (por ejemplo, isquémica o
traumática). Esto se basa en el hallazgo de altos niveles de
expresión en la médula espinal humana adulta y la expresión
diferencial en la médula espinal de ratón en desarrollo, combinados
con los resultados de los análisis de bioinformática y con la
actividad neuroprotectora/de neurogénesis y el efecto antiapoptótico
de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 15). La verificación de esta función
terapéutica específica, puede hacerse con el ensayo de neuronas
motoras descrita en el ejemplo 10.
En una forma de realización preferida, los
polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores, cápsulas y composiciones
de la invención se usan en el tratamiento de enfermedades,
trastornos o daños que implican la retina e incluyen, pero no están
limitados a, retinitis pigmentosa, degeneración macular y glaucoma.
Este uso terapéutico específico está apoyado por los análisis
experimentales y de bioinformática que muestran que NsG33 es un
factor de crecimiento secretado altamente expresado en la retina
(figura 4).
Otros factores de crecimiento tienen usos
terapéuticos importantes en el sistema nervioso central y
periférico, y en varias indicaciones oculares asociadas con pérdida
de células en la retina y/o córnea. Por ejemplo, el NGF, es un
candidato tanto para enfermedad de Alzheimer, úlcera corneal (US
6063757 y EP 0 973 872) como retinopatías. Neublastina (artemina)
es un candidato tanto para neuropatía periférica (WO 02/078730) como
cicatrización de herida corneal (EP 1 223 966). El GDNF es un
candidato para enfermedad de Parkinson, ELA, lesión de médula
espinal y/o cicatrización de heridas, en particular en córnea (EP 1
223 966).
La confirmación de dicho uso puede lograrse por
el uso de varios ensayos in vitro del estado de la técnica
(ensayos de explantes retinianos, cultivos de córnea). La
verificación de la función puede lograrse también en modelos
animales del estado de la técnica para heridas de córnea (lesión
corneal en conejos) y retina (modelos de mutantes de retinitis
pigmentosa disponibles para ratón y rata).
En otra forma de realización, la enfermedad
neurodegenerativa es una enfermedad excitotóxica seleccionada del
grupo que consiste en isquemia, epilepsia y traumatismo debido a
lesión, paro cardiaco o apoplejía. Esta función está apoyada
también por la actividad neuroprotectora/de neurogénesis y la
actividad antiapoptótica de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 15). El ensayo
del cultivo de cortes de hipocampo mencionado anteriormente y el
ensayo del ejemplo 7 de la presente invención son ejemplos no
limitantes del ensayo, que puede usarse para demostrar un efecto
biológico, indicativo de uso terapéutico para el tratamiento de
enfermedades excitotóxicas.
Se considera que el término "sujeto", como
se usa aquí, significa cualquier mamífero al que pueden
administrarse polipéptidos o polinucleótidos NsG33, células
terapéuticas o cápsulas biocompatibles. Los sujetos destinados
específicamente para el tratamiento con el método de la invención
incluyen seres humanos, así como primates no humanos, ovejas,
caballos, ganado, cabras, cerdos, perros, gatos, conejos, conejillos
de Indias, hámsteres, gerbos, ratas y ratones, así como los órganos,
tumores y células que se derivan u originan de estos huéspedes.
Un tejido objetivo para terapia con NsG33, es
una región del cerebro que se selecciona por su capacidad de
respuesta retenida a NsG33. En seres humanos, neuronas que retienen
la capacidad de respuesta a factores de crecimiento en la edad
adulta, incluyen las neuronas basales colinérgicas del prosencéfalo,
las neuronas corticales entorrinales, las neuronas talámicas, las
neuronas del locus coeruleus, las neuronas sensitivas espinales,
las neuronas motoras espinales, neuronas de la sustancia negra,
neuronas del simpático, ganglios de la raíz dorsal, neuronas de la
retina, neuronas ópticas, neuronas cerebelares y ganglios ciliares.
Las células madre, tales como las células madre de la zona
subventricular, y células progenitoras neurales y gliales, retienen
también la capacidad de respuesta a factores de crecimiento en la
edad adulta. Asimismo, los oligodendrocitos mielinizantes retienen
la capacidad de respuesta a factores de crecimiento en la edad
adulta.
Los polipéptidos NsG33 pueden administrarse de
cualquier manera que sea médicamente aceptable. Esto puede incluir
inyecciones, por vías parenterales tales como intravenosa,
intravascular, intraarterial, subcutánea, intramuscular,
intratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural,
intertraqueal, intratecal, intracerebroventricular, intercerebral,
interpulmonar u otras, así como nasal, oftálmica, rectal o tópica.
La administración de liberación sostenida se incluye también
específicamente en la invención, por medios tales como inyecciones
de depósito o implantes erosionables. La administración oral es
también concebible, siempre que la proteína esté protegida contra la
degradación en el estómago.
La administración de una NsG33 según esta
invención, puede lograrse usando cualquier medio de administración
adecuado, que incluye:
- bomba (véase, por ejemplo, Annals of
Pharmacotherapy, 27: 912 (1993); Cancer 41: 1270 (1993);
Cancer Research, 44: 1698 (1984),
- microencapsulación (véase, por ejemplo, las
patentes de los Estados Unidos 4352883; 4353888; y 5084350);
- implantes de polímeros de liberación continua
(véase, por ejemplo, Sabel, patente de los Estados Unidos
4883666);
4883666);
- células encapsuladas (véase, sección X);
- injertos de células desnudas o no encapsuladas
en el SNC (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos
5082670 y 5618531);
- inyección, ya sea por vía subcutánea,
intravenosa, intraarterial, intramuscular, o en otro sitio
adecuado;
- inhalación; y
- administración oral, en cápsula, líquido,
comprimido, píldora o formulación de liberación prolongada.
\vskip1.000000\baselineskip
La administración puede ser por inyecciones
periódicas de un bolo de la preparación, o puede hacerse más
continua mediante administración intravenosa o intraperitoneal de
un depósito que sea externo (por ejemplo, una bolsa IV) o interno
(por ejemplo, un implante bioerosionable, un órgano bioartificial,
una cápsula biocompatible de células productoras de NsG33 o una
colonia de células productoras de NsG33 implantadas). Véase, por
ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 4407957, 5798113 y 5800828. Se
describen métodos y aparatos de suministro intrapulmonar, por
ejemplo, en las patentes de EE.UU. 5654007, 5780014 y 5814607.
Aparte de la administración sistémica, se
contempla también la administración directamente al SNC o el ojo
detrás de las barreras hematoencefálica o hematorretiniana.
La administración localizada puede ser por
medios tales como administración a través de un catéter a una o más
arterias, tales como la arteria oftálmica en el ojo, y la arteria
cerebral en el SNC. Se describen métodos para el suministro local
basado en bombas de formulaciones de proteína en el SNC, en el
documento US 6042579 (Medtronic). Otro tipo de administración
localizada comprende administración usando células encapsuladas
(véase sección IX). Otro tipo de administración localizada
comprende administración local de vectores de terapia génica, que se
inyectan normalmente.
Para el tratamiento de trastornos oculares, la
administración puede ser sistémica, o local tal como administración
a través de la arteria oftálmica. En otra forma de realización, la
administración es por medio de terapia con células encapsuladas,
donde las células encapsuladas se implantan intravítreamente. La
administración de formulaciones de proteína o vector de terapia
génica puede hacerse usando inyecciones subretinianas, inyección
intravítrea o inyección transesclerótica.
Para el tratamiento de enfermedad de Parkinson,
pueden seguirse varias vías de administración. Pueden administrarse
formulaciones de proteína con bombas por vía intracerebroventricular
o intraparenquimática, de preferencia en el cuerpo estriado y/o la
sustancia negra, más preferiblemente en el intraputamen. Sin
embargo, un método de administración más preferido comprende
terapia con células encapsuladas, donde las cápsulas se implantan
intracerebroventricularmente o intraparenquimáticamente, de
preferencia en el cuerpo estriado y/o la sustancia negra, y más
preferiblemente en el putamen. En una forma de realización
relacionada con el tratamiento de enfermedad de Parkinson, se
administra un vector de terapia génica en el cuerpo estriado del
cerebro. La inyección en el cuerpo estriado puede marcar sitios
objetivo localizados en varias regiones distantes del cerebro, por
ejemplo, el globo pálido, amígdala, núcleo subtalámico o la
sustancia negra. La transducción de células en el cuerpo pálido
causa comúnmente marcaje retrógrado de células
en el tálamo. En una forma de realización preferida, el (o uno de los) sitio(s) objetivo son la sustancia negra.
en el tálamo. En una forma de realización preferida, el (o uno de los) sitio(s) objetivo son la sustancia negra.
En una forma de realización para tratar la EH,
se aplica NsG33 al cuerpo estriado, de preferencia el núcleo
caudado para proteger a las neuronas de la degeneración, resultando
tanto en protección de las neuronas del cuerpo caudado como las
neuronas de entrada corticales. En una forma de realización
preferida, la aplicación debe ocurrir antes del inicio de cambios
degenerativos mayores. El tratamiento implicaría el diagnóstico
genético de la enfermedad a través de la historia familiar y el
análisis del ADN de la sangre, seguido de la aplicación local de
NsG33. Esto se lograría mediante administración de NsG33 al cuerpo
estriado por medio de bombeo de la proteína con el uso de bombas de
infusión y catéteres médicamente aplicables, por ejemplo, la bomba
Synchrotron de Medtronic. En una segunda estrategia, podría usarse
terapia génica directa usando vectores virales o no virales para
modificar las células huéspedes en el cuerpo estriado u otras
neuronas afectadas que secretan NsG33. En una tercera estrategia,
pueden aplicarse localmente células desnudas o encapsuladas
genéticamente modificadas que producen y secretan NsG33 para
administrar NsG33 detrás de la barrera hematoencefálica y dentro de
la región enferma, de preferencia el cuerpo estriado, aún más
preferiblemente, el núcleo caudado.
En ELA, tanto las neuronas motoras superiores
como inferiores degeneran, causando parálisis progresiva, llevando
finalmente a muerte, más comúnmente a través de complicaciones
respiratorias. Para tratar ELA, se administraría NsG33 al SNC,
incluyendo la médula espinal a través de la infusión de NsG33 en el
espacio intratecal lumbar mezclándola de esta manera con el líquido
cefalorraquídeo (LCR), que baña la médula espinal y el cerebro. La
administración podría lograrse a través de la implantación de una
bomba y catéteres, por ejemplo, la bomba Synchrotron de Medtronic,
o a través del uso de dispositivos de células encapsuladas
implantados en el espacio intratecal lumbar. Podría usarse también
terapia génica directa inyectando vectores que tengan ADN en el LCR,
transfiriendo de esta manera el gen a células que revisten el
espacio del LCR. Además, pueden inyectarse vectores de
transferencia de genes en la médula espinal cervical o lumbar o
intracerebral, secretando de esta manera NsG33 en las regiones
anatómicas que contienen la mayoría de las neuronas motoras
implicadas en las parálisis motoras y la función respiratoria.
Estas inyecciones ocurrirían con cirugía asistida por ordenador, y
podrían realizarse relativamente con seguridad.
En sujetos con enfermedades neurodegenerativas
tales como EA, las neuronas en la región Ch4 (núcleo basal de
Meynert) que tienen receptores del factor de crecimiento nervioso
(NGF) sufren atrofia marcada, en comparación con controles normales
(véase, por ejemplo, Kobayashi, et al., Mol. Chem.
Neuropathol., 15: 193-206 (1991)).
En sujetos normales, las neurotrofinas previenen
la muerte de neuronas del simpático y sensitivas durante el
desarrollo, y previenen la degeneración neuronal colinérgica en
ratas y primates adultos (Tuszynski, et al., Gene Therapy,
3: 305314 (1996)). Se piensa que la pérdida resultante de neuronas
funcionales en esta región del prosencéfalo basal, está unida
causativamente a la decadencia cognoscitiva experimentada por
sujetos que sufren afecciones neurodegenerativas tales como EA
(Tuszynski, et al., citado anteriormente, y Lehericy, et
al., J. Comp. Neurol., 330: 15-31 (1993)).
En general se contempla que puede tratarse la EA
con formulaciones de proteína NsG33 administradas por vía
intracerebroventricular o intraparenquimática. Dentro del área
intraparenquimática, la administración es de preferencia en el
prosencefálo basal y en el hipocampo.
Pueden administrarse también vector de terapia
génica y células encapsuladas o desnudas que secreten NsG33 en el
prosencéfalo basal o el hipocampo.
Para el tratamiento de lesión de médula espinal,
pueden administrarse la proteína, el vector de terapia génica o las
células encapsuladas o desnudas que secretan NsG33 por vía
intratecal en el sitio de la lesión, como se describió anteriormente
para el tratamiento de ELA.
Para el tratamiento de neuropatía periférica, la
administración es sistémica (usando formulaciones de proteína), por
vía intratecal usando formulaciones de proteína, vectores de terapia
génica o células encapsuladas o desnudas que secretan NsG33, o por
vía intramuscular, dependiendo del transporte retrógrado hacia la
médula espinal.
Para el tratamiento de epilepsia, la proteína
NsG33 podría administrarse por vía intraparenquimática en el foco de
epilepsia. Esto puede hacerse con células encapsuladas o desnudas,
con formulaciones de proteína administradas con catéter o bomba, o
con un vector de terapia génica administrado en este sitio.
Para el tratamiento de apoplejía o traumatismo,
la administración es intratecal, intracerebroventricular o de
preferencia intralesional.
El término "vehículo farmacéuticamente
aceptable", significa uno o más ingredientes orgánicos o
inorgánicos, naturales o sintéticos, con que se combina el
polipéptido NsG33 para facilitar su aplicación. Un vehículo
adecuado incluye solución salina estéril, aunque otras soluciones
estériles isotónicas acuosas y no acuosas y suspensiones estériles
que se sabe son farmacéuticamente aceptables, son conocidas por los
expertos en la materia. Una "cantidad eficaz", se refiere a
esa cantidad que es capaz de mejorar o retardar la progresión de la
condición enferma, degenerativa o dañada. Puede determinarse una
cantidad eficaz en una base individual y se basará, en parte,
considerando los síntomas que se van a tratar y los resultados
buscados. Una cantidad eficaz puede ser determinada por los
expertos en la materia usando tales factores, y usando no más que
experimentación de rutina.
Un sistema de liposomas puede ser cualquier
variedad de vesículas unilaminares, vesículas multilaminares o
vesículas plurilaminares estables, y pueden prepararse y
administrarse según métodos bien conocidos por los expertos en la
materia, por ejemplo, según las enseñanzas de las patentes de los
Estados Unidos 5169637, 4762915, 5000958 ó 5185154. Además, puede
ser deseable expresar los polipéptidos novedosos de esta invención,
así como otros polipéptidos seleccionados, como lipoproteínas, para
mejorar su unión a liposomas. Una proteína NsG33 recombinante se
purifica, por ejemplo, de células CHO, por cromatografía de
inmunoafinidad o cualquier otro método conveniente, y se mezcla
entonces con liposomas y se incorpora en ellos con alta eficacia. La
proteína encapsulada en liposomas puede ensayarse in vitro
para algún efecto sobre la estimulación del crecimiento celular.
Cualquiera de los polipéptidos NsG33 de esta
invención puede usarse en la forma de una sal farmacéuticamente
aceptable. Ácidos y bases adecuados que son capaces de formar sales
con un polipéptido NsG33 son bien conocidos por los expertos en la
materia, e incluyen bases y ácidos orgánicos e inorgánicos.
Además de los principios activos, las
composiciones farmacéuticas pueden comprender ingredientes
adecuados. Pueden encontrarse más detalles sobre técnicas para
formulación y administración en la última edición de Remington's
Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA).
Se contemplan varias pautas de dosificación para
administración sistémica. En una forma de realización, los métodos
para administrar a un sujeto una formulación que comprenda un
polipéptido NsG33, incluyen administrar NsG33 a una dosis entre 1
\mug/kg a 30.000 \mug/kg de peso corporal del sujeto, por dosis.
En otra forma de realización, la dosificación está entre 10
\mug/kg a 30.000 \mug/kg de peso corporal del sujeto, por
dosis. En otra forma de realización, la dosificación está entre 10
\mug/kg a 10.000 \mug/kg de peso corporal del sujeto, por
dosis. En una forma de realización diferente, la dosificación está
entre 25 \mug/kg a 10.000 \mug/kg de peso corporal del sujeto,
por dosis. En aún otra forma de realización, la dosificación está
entre 25 \mug/kg a 3,000 \mug/kg de peso corporal del sujeto,
por dosis. En una forma de realización más preferible, la
dosificación está entre 50 \mug/kg a 3.000 \mug/kg de peso
corporal del sujeto, por dosis.
Se proporciona orientación para dosificaciones y
métodos de administración particulares en la literatura; véase, por
ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 4657760; 5206344; ó 5225212. Se
anticipa que diferentes formulaciones serán eficaces para diferentes
compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que la
administración que se dirige a un órgano o tejido, por ejemplo,
puede necesitar de administración en una forma diferente de la de
otro órgano o
tejido.
tejido.
Donde se desee administración de liberación
sostenida de un polipéptido NsG33 en una formulación con
características de liberación adecuadas para el tratamiento de
cualquier enfermedad o trastorno que requiera la administración de
un polipéptido NsG33, se contempla la microencapsulación de un
polipéptido NsG33. Se ha realizado con éxito la microencapsulación
de proteínas recombinantes para liberación sostenida, con hormona de
crecimiento humano (rhGH), interferón-(rhIFN-),
interleucina-2 y MN rgp120. Johnson et al.,
Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed.
Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora et al.,
Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland,
"Design and Production of Single Immunization Vaccines Using
Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", en Vaccine
Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds.
(Plenum Press: Nueva York, 1995), pp. 439-462; WO
97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y la patente de EE.UU. No.
5654010.
Se desarrollaron formulaciones de liberación
sostenida de estas proteínas, usando polímero de ácido
poli-láctico-coglicólico (PLGA)
debido a su biocompatibilidad y amplia gama de propiedades
biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos
láctico y glicólico, pueden depurarse rápidamente del cuerpo humano.
Además, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse de meses
a años, dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis,
"Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide
polymer", en: M. Chasin y R. Langer (eds.), Biodegradable
Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: Nueva York, 1990),
pp. 1-41.
La dosis administrada debe ajustarse
cuidadosamente a la edad, peso y estado del individuo que se esté
tratando, así como la vía de administración, forma y pauta
posológicas y el resultado deseado, y la dosificación exacta debe
ser determinada por el médico general.
Para formar una composición de NsG33 para uso en
terapia génica en la invención, pueden colocarse vectores virales
de expresión que codifiquen NsG33 en una suspensión, solución o
emulsión farmacéuticamente aceptable. Los medios adecuados incluyen
solución salina y preparaciones liposomales.
Más específicamente, los vehículos
farmacéuticamente aceptables pueden incluir soluciones, suspensiones
y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de solventes
no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales
tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales
como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen agua, soluciones,
emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, que incluyen solución
salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen
solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y
cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato o aceites no
volátiles.
Los vehículos intravenosos incluyen
regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrólitos
(tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares.
Pueden estar presentes también conservadores y
otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos,
antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, y similares.
Además, puede liofilizarse una composición de transgenes de NsG33
usando medios bien conocidos en la técnica, para reconstitución y
uso subsiguientes según la invención.
Puede usarse también un sistema de dispersión
coloidal para la administración dirigida de genes. Los sistemas de
dispersión coloidales incluyen complejos de macromoléculas,
nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos
que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas,
y liposomas. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales
que son útiles como vehículos de administración in vitro e
in vivo. Se ha mostrado que vesículas unilaminares grandes
(LUV), que varían en tamaño de 0,2-4,0 \mum,
pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que
contiene grandes macromoléculas. ARN, ADN y viriones intactos
pueden encapsularse dentro del interior acuoso, y pueden
administrarse a células en una forma biológicamente activa (Fraley,
et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981). Además de células
de mamífero, se han usado liposomas para la administración de
transgenes codificantes operativamente en células de plantas,
levaduras y bacterias. Para que un liposoma sea un vehículo de
transferencia de genes eficaz, deben estar presentes las siguientes
características: (1) encapsulación de los genes que codifican NsG33
con alta eficacia, sin que comprometan su actividad biológica; (2)
unión preferencial y sustancial a una célula objetivo en comparación
con células no objetivo; (3) distribución de los contenidos acuosos
de la vesícula en el citoplasma de la célula objetivo con alta
eficacia; y (4) expresión precisa y eficaz de información genética
(Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682, 1988).
La composición del liposoma es usualmente una
combinación de fosfolípidos, en particular fosfolípidos de alta
temperatura de transición de fase, usualmente en combinación con
esteroides, especialmente colesterol. Pueden usarse también otros
fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los
liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de
cationes divalentes.
Ejemplos de lípidos útiles en la producción de
liposomas, incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como
fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina,
fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos.
Particularmente útiles son los diacilfosfatidilgliceroles, donde el
grupo lipídico contiene de 14-18 átomos de carbono,
en particular de 16-18 átomos de carbono, y es
saturada. Fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de
huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y
diestearoilfosfatidilcolina.
El direccionamiento de los liposomas puede
clasificarse basado en factores anatómicos y mecanicistas. La
clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por
ejemplo, específico de órganos, específico de células y específico
de orgánulos. El direccionamiento mecanicista puede distinguirse
basado en si es pasivo o activo. El direccionamiento pasivo usa la
tendencia natural de los liposomas a distribuirse en las células del
sistema reticuloendotelial (RES) en órganos que contienen capilares
sinusoidales.
El direccionamiento activo, por otra parte,
incluye la alteración del liposoma acoplando el liposoma a un
ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar,
glicolípido o proteína, o cambiando la composición o el tamaño del
liposoma para lograr el direccionamiento hacia órganos y tipos de
células diferentes de los sitios de localización naturales.
La superficie del sistema de administración de
genes dirigido, puede modificarse de varias formas. En el caso de
un sistema de administración de liposomas dirigido, pueden
incorporarse grupos de lípidos en la bicapa lipídica del liposoma,
para mantener el ligando de direccionamiento en asociación estable
con la bicapa liposomal. Pueden usarse varios grupos de enlace para
unir las cadenas de lípidos al ligando de direccionamiento.
Otro ejemplo de un sistema de administración
incluye el trasplante, en el área terapéutica, de una composición
de células de empaquetamiento capaces de producir partículas del
vector como se describe en la presente invención. Métodos para la
encapsulación y el trasplante de dichas células son bien conocidos
en la técnica, en particular del documento WO 97/44065
(citoterapéutica). Seleccioanado de una línea de células de
empaquetamiento capaz de producir partículas lentivirales, se logra
la transducción de células que no se dividen en el área terapéutica.
Mediante el uso de partículas retrovirales capaces de transducir
sólo células en división, la transducción se restringe a células
diferenciadas de novo en el área terapéutica.
Un parámetro importante es la dosificación del
vector de terapia génica de NsG33 que se administrará en el tejido
objetivo. Para vectores virales, la concentración puede definirse
por medio del número de unidades de transducción/ml. Óptimamente,
para la administración usando un vector de expresión viral, cada
unidad de dosificación comprenderá de 2,5 a 25 \muL de una
composición, en donde la composición incluye un vector de expresión
viral en un líquido farmacéuticamente aceptable, y proporciona de
10^{8} hasta 10^{10} unidades de transducción de NsG33 por
ml.
De modo importante, se seleccionan sitios
específicos de administración de genes in vivo, de modo que
se agrupen en un área de pérdida, daño o disfunción de células
neurales, células gliales, células retinianas, células sensitivas o
células madre. Tales áreas pueden identificarse clínicamente usando
muchas técnicas conocidas, que incluyen imágenes por resonancia
magnética (MRI) y biopsia. En seres humanos, se preferirán métodos
de imágenes in vivo no invasivos tales como MRI. Una vez que
se identifican las áreas de pérdida neuronal, se seleccionan sitios
de administración para distribución estereotáxica, de modo que cada
unidad de dosificación de NsG33 se suministre en el cerebro a, o
dentro de, 500 \mum de una célula diana, y no más de
aproximadamente 10 mm de otro sitio de suministro.
Dentro de un sitio objetivo determinado, el
sistema de vectores puede transducir una célula objetivo. La célula
objetivo puede ser una célula presente en el tejido nervioso, tal
como una neurona, astrocito, oligodendrocito, microglia, células
madre, células precursoras neurales o células del epéndimo.
\newpage
El sistema de vectores se administra de
preferencia por medio de inyección directa. Métodos para la
inyección en el cerebro son bien conocidos en la técnica
(Bilang-Bleuel et al. (1997) Proc. Acad.
Natl. Sci. USA 94: 8818-8823;
Choi-Lundberg et al (1998) Exp. Neurol. 154:
261-275; Choi-Lundberg et al
(1997) Science 275: 838-841; y Mandel et al
(1997) Proc. Acad. Natl. Sci. USA 94: 14083-14088).
Pueden administrarse inyecciones estereotáxicas.
Como se mencionó anteriormente, para la
transducción en tejidos tales como el cerebro, es necesario usar
volúmenes muy pequeños, de modo que la preparación viral se
concentra por medio de ultracentrifugación. La preparación
resultante debe tener por lo menos 10^{8} u.t./ml, de preferencia
de 10^{8} a 10^{10} u.t./ml, más preferiblemente por lo menos
10^{9} u.t./ml (el título se expresa en unidades de transducción
por ml (u.t./ml), como se describe en el ejemplo 6). Se ha
encontrado que puede lograrse dispersión mejorada de la expresión de
transgenes aumentando el número de sitios de inyección, y
disminuyendo la velocidad de inyección (Horellou y Mallet (1997)
como anteriormente). Usualmente, se usan entre 1 y 10 sitios de
inyección, más comúnmente entre 2 y 6. Para una dosis que comprende
1-5x10^{9} u.t./ml, la velocidad de inyección está
comúnmente entre 0,1 y 10 \mul/min, usualmente aproximadamente 1
\mul/min.
La composición del virus se administra a cada
sitio de administración de célula en el tejido objetivo, por medio
de microinyección, infusión, carga por raspado ("scrape
loading"), electroporación, u otros medios adecuados que
administran directamente la composición directamente en el tejido
del sitio de administración a través de una incisión quirúrgica. La
administración se logra lentamente, tal como durante un período de
aproximadamente 5-10 minutos (dependiendo del
volumen total de composición del virus que se va a administrar).
En general, la terapia génica busca transferir
nuevo material genético a las células de un paciente con beneficio
terapéutico resultante para el paciente. Dichos beneficios incluyen
tratamiento o profilaxis de una amplia gama de enfermedades,
trastornos y otras afecciones.
Los procedimientos de terapia génica ex
vivo incluyen modificación de células aisladas (que incluyen,
pero no están limitadas a, células madre, células precursoras
neurales y gliales y células madre fetales), que después se
infunden, injertan o de otra manera trasplantan, en el paciente.
Véase, por ejemplo, las patentes de EU.UU. Nos. 4868116, 5399346 y
5460959. La terapia génica in vivo busca dirigirse a tejido
del paciente huésped in vivo.
Virus útiles como vectores de transferencia de
genes, incluyen papovavirus, adenovirus, virus de la vacuna, virus
adenoasociados, virus de herpes y retrovirus. Retrovirus adecuados
incluyen el grupo que consiste en VIH, SIV, FIV, EIAV y MoMLV. Un
grupo adicional de retrovirus adecuados incluye el grupo que
consiste en VIH, SIV, FIV, EIAV y CIV. Otro grupo de vectores
virales preferidos incluye el grupo que consiste en alfavirus,
adenovirus, virus adenoasociados, baculovirus, HSV, coronavirus,
virus del papiloma bovino, Mo-MLV, de preferencia
virus adenoasociados.
Virus preferidos para el tratamiento de
trastornos del sistema nervioso central, son lentivirus y virus
adenoasociados. Ambos tipos de virus pueden integrarse en el genoma
sin divisiones celulares, y ambos tipos se han ensayado en estudios
preclínicos en animales para indicaciones en el sistema nervioso, en
particular en el sistema nervioso central.
Se describen métodos para la preparación de AAV
en la técnica, por ejemplo, los documentos US 5677158, US 6309634 y
US 6683058, que describen ejemplos de la administración de AAV al
sistema nervioso central.
De preferencia, el vector de lentivirus es una
partícula de lentivirus deficiente para replicación. Tal partícula
de lentivirus puede producirse a partir de un vector lentiviral que
comprende una LTR lentiviral 5', un sitio de unión a ARNt, una
señal de empaquetamiento, un promotor operativamente unido a una
señal de polinucleótidos que codifica dicha proteína de fusión, un
origen de síntesis de la segunda cadena de ADN, y una LTR lentiviral
3'. Se describen métodos para la preparación y administración in
vivo de lentivirus a células neurales, en el documento US
20020037281 (métodos para transducir células neurales usando
vectores lentivirales).
Los vectores retrovirales son los vectores que
se usan más comúnmente en ensayos clínicos humanos, puesto que
tienen 7-8 kb, y puesto que tienen la capacidad de
infectar a células integrar su material genético establemente en la
célula huésped con alta eficacia. Véase, por ejemplo, los documentos
WO 95/30761 y WO 95/24929. Los Oncovirinae requieren por lo menos
una ronda de proliferación en células objetivo, para la
transferencia e integración de secuencias exógenas de ácido
nucleico en el paciente. Los vectores retrovirales se integran
aleatoriamente en el genoma del paciente. Pueden usarse retrovirus
para dirigirse a células madre del sistema nervioso ya que tienen
lugar pocas divisiones celulares en otras células del sistema
nervioso (en particular el SNC).
Se han descrito tres clases de partículas
retrovirales: ecotrópicas, que pueden infectar eficazmente células
murinas, y anfotrópicas, que pueden infectar células de muchas
especies. La tercera clase incluye a los retrovirus xenotróficos,
que pueden infectar células de otra especie diferente de la especie
que produjo el virus. Su capacidad para integrarse sólo en el
genoma de las células en división, ha hecho a los retrovirus
atractivos para marcar linajes de células en estudios de
desarrollo, y para la administración de genes terapéuticos o
suicidas a cánceres o tumores.
Para su uso en pacientes humanos, los vectores
retrovirales deben ser deficientes en replicación. Esto previene
más generación de partículas retrovirales infecciosas en el tejido
objetivo - más bien, el vector deficiente en replicación llega a
ser un transgén "cautivo" incorporado establemente en el genoma
de la célula objetivo. Típicamente, en vectores deficientes en
replicación, se han eliminado los genes gag, env y pol (junto con
la mayor parte del resto del genoma viral). Se inserta el ADN
heterólogo en lugar de los genes virales eliminados. Los genes
heterólogos pueden estar bajo el control del promotor heterólogo
endógeno, otro promotor heterólogo activo en la célula objetivo, o
la LTR 5' retroviral (la LTR viral es activa en diversos tejidos).
Típicamente, los vectores retrovirales tienen una capacidad de
transgenes de aproximadamente 7-8 kb.
Los vectores retrovirales deficientes en
replicación requieren el suministro en trans de las proteínas
virales necesarias para la replicación y el ensamblaje a, por
ejemplo, líneas de células de empaquetamiento manipuladas. Es
importante que las células de empaquetamiento no liberen virus
competentes en replicación y/o virus auxiliares. Esto se ha logrado
expresando proteínas virales de moléculas de ARN que carecen de la
señal \Psi, y expresando los genes gag/pol y el gen env de
unidades de transcripción separadas. Además, en algunos retrovirus
de 2ª y 3ª generación, las LTR 5' se han reemplazado con promotores
no virales que controlan la expresión de estos genes, y el promotor
3' se ha reducido al mínimo para contener sólo el promotor proximal.
Estos diseños reducen al mínimo la posibilidad de recombinación que
lleva a la producción de vectores competentes en replicación, o
virus auxiliares.
La construcción de vectores para expresión
recombinante de polipéptidos NsG33 para su uso en la invención,
puede lograrse usando técnicas convencionales que no requieren
explicación detallada para los expertos en la materia. Sin embargo,
para una revisión, los expertos en la materia pueden desear
consultar Maniatis et al., en Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (NY 1982). Pueden
usarse vectores de expresión para la generación de células
productoras para la producción recombinante de polipéptidos NsG33
para uso médico, y para la generación de células terapéuticas que
secretan polipéptidos NsG33 para terapia con células desnudas o
encapsuladas.
Brevemente, la construcción de vectores de
expresión recombinantes usa técnicas de ligación estándar. Para el
análisis que confirma las secuencias correctas en vectores
construidos, los genes se secuencian usando, por ejemplo, el método
de Messing, et al. (Nucleic Acids Res., 9: 309, 1981), el
método de Maxam, et al. (Methods in Enzymology, 65: 499,
1980), u otros métodos adecuados que son bien conocidos por los
expertos en la materia.
La separación por tamaño de los fragmentos
digeridos, se lleva a cabo usando electroforesis en gel convencional
como se describe, por ejemplo, en Maniatis et al. (Molecular
Cloning, pp. 133-134, 1982).
Para la generación de vectores de expresión
eficaces, estos deben contener secuencias reguladoras necesarias
para la expresión del gen codificado en el marco de lectura
correcto. La expresión de un gen se controla a los niveles de
transcripción, traducción o post-traducción. El
inicio de la transcripción es un evento temprano y crítico en la
expresión génica. Esto depende de las secuencias de promotor y
potenciador, y está influido por factores celulares específicos que
interaccionan con estas secuencias. La unidad de transcripción de
muchos genes consiste en el promotor y, en algunos casos, en
elementos potenciadores o reguladores (Banerji et al., Cell
27: 299 (1981); Corden et al., Science 209: 1406 (1980); y
Breathnach y Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349 (1981)). Para
retrovirus, los elementos de control implicados en la replicación
del genoma retroviral residen en la repetición terminal larga (LTR)
(Weiss et al., eds., The molecular biology of tumor viruses:
RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory (NY 1982)). Las LTR
del virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) y el virus del
sarcoma de Rous (RSV), contienen secuencias de promotor y
potenciador (Jolly et al., Nucleic Acids Res. 11: 1855
(1983); Capecchi et al., en: Enhancer and eukaryotic gene
expression, Gulzman y Shenk, eds., pp. 101-102, Cold
Spring Harbor Laboratories (NY 1991). Otros promotores potentes
incluyen los derivados de citomegalovirus (CMV) y otros promotores
virales de tipo silvestre.
Se han descrito también las regiones de promotor
y potenciador de muchos promotores no virales (Schmidt et
al., Nature 314: 285 (1985); Rossi y deCrombrugghe, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84: 5590-5594 (1987)). Métodos para
mantener e incrementar la expresión de transgenes en células
quiescentes, incluyen el uso de promotores que incluyen los
promotores de de colágeno de tipo I (1 y 2) (Prockop y Kivirikko, N.
Eng. J. Med. 311: 376 (1984); Smith y Niles, Biochem. 19: 1820
(1980); de Wet et al., J. Biol. Chem. 258: 14385 (1983)),
SV40 y de LTR.
Según una forma de realización de la invención,
el promotor es un promotor constitutivo seleccionado del grupo que
consiste en: promotor de ubiquitina, promotor del CMV, promotor JeT
(US 6555674), promotor de SV40, promotor del factor de elongación
1-alfa (EF1-alfa), RSV y
Mo-MLV-LTR. Ejemplos de promotores
inducibles/reprimibles, incluyen: Tet-On,
Tet-Off, promotor inducible por rapamicina y
Mx1.
Un grupo de promotores preferidos incluye CMV,
UbiC humano, JeT, RSV, promotor regulable por Tet,
Mo-MLV-LTR, Mx1 y
EF-1alfa.
Además del uso de promotores virales y no
virales que dirigen la expresión de transgenes, puede usarse una
secuencia de potenciador para incrementar el nivel de expresión del
transgén. Los potenciadores pueden incrementar la actividad de
transcripción no sólo de su gen nativo, sino también de algunos
genes exógenos (Armelor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2702
(1973)). Por ejemplo, en la presente invención, pueden usarse
secuencias de potenciador de colágeno con el promotor de colágeno 2
(I) para incrementar la expresión del transgén. Además, puede
usarse el elemento potenciador presente en virus SV40 para
incrementar la expresión del transgén. Esta secuencia de
potenciador consiste en una repetición de 72 pares de bases, como se
describe en Gruss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 943
(1981); Benoist y Chambon, Nature 290: 304 (1981) y Fromm y Berg, J.
Mol. Appl. Genetics, 1: 457 (1982). Esta secuencia de repetición
puede incrementar la transcripción de muchos genes virales y
celulares diferentes, cuando está presente en serie con varios
promotores (Moreau et al. Nucleic Acids Res. 9: 6047
(1981).
Secuencias adicionales que intensifican la
expresión incluyen, pero no están limitadas a, elemento de
regulación postranscripcional del virus de la hepatitis de
Woodchuck, WPRE, SP163, potenciador del CMV, y aislador de
[beta]-globina de pollo, y otros aisladores.
Puede incrementarse también la expresión del
transgén para expresión estable a largo plazo, usando citocinas que
modulan la actividad del promotor. Se han descrito varias citocinas
que modulan la expresión del transgén de promotores de colágeno 2
(I) y LTR (Chua et al., connective Tissue Res., 25:
161-170 (1990); Elias et al., Annals N. Y.
Acad. Sci., 580: 233-244 (1990)); Seliger et
al., J. Immunol. 141: 2138-2144 (1988) y
Seliger et al., J. Virology 62: 619-621
(1988)). Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante (TGF),
la interleucina (IL)-I y el interferón (INF),
disminuyen la expresión de transgenes dirigida por varios
promotores tales como LTR. El factor de necrosis tumoral (TNF) y el
TGF 1 aumentan, y pueden usarse para controlar, la expresión de
transgenes dirigida por un promotor. Otras citocinas que pueden
demostrar ser útiles, incluyen el factor de crecimiento de
fibroblastos básico (bFGF) y el factor de crecimiento epidérmico
(EGF).
Puede usarse también el promotor de colágeno con
la secuencia de potenciador de colágeno (Coll (E)), para
incrementar la expresión del transgén suprimiendo cualquier
respuesta inmune al vector que pueda generarse en el cerebro
tratado, sin importar su estado inmunoprotegido. Además, pueden
administrarse agentes antiinflamatorios que incluyen esteroides,
por ejemplo, dexametasona, al huésped tratado inmediatamente después
de la administración de la composición de vector, y continuarse, de
preferencia, hasta que disminuya toda respuesta inflamatoria
mediada por citocinas. Puede administrarse también un agente de
inmunosupresión tal como ciclosporina para reducir la producción de
interferones, que disminuyen el promotor de LTR y el
promotor-potenciador Coll (E) y reducen la expresión
de transgenes.
El vector puede comprender otras secuencias
tales como una secuencia que codifica para la proteína recombinasa
Cre, y secuencias LoxP. Una forma adicional de asegurar la expresión
temporal de NsG33, es por medio del uso del sistema
Cre-LoxP que produce la escisión de parte de la
secuencia de ADN insertada tras la administración de la recombinasa
Cre a las células (Daewoong et al, Nature Biotechnology 19:
929-933), o incorporando un gen que codifica la
recombinasa en la construcción del virus (Plück, Int J Exp Path, 77:
269-278). La incorporación de un gen para la
recombinasa en la construcción del virus junto con los sitios LoxP y
un gen estructural (una NsG33 en el presente caso), resulta con
frecuencia en la expresión del gen estructural durante un período de
aproximadamente cinco días.
Se puede administrar NsG33 al sistema nervioso
usando cápsulas biocompatibles como se describe aquí. La terapia
con células encapsuladas se basa en el concepto de aislar células
del sistema inmune del huésped receptor, rodeando las células con
un material biocompatible semipermeable antes de la implantación en
el huésped. La invención incluye un dispositivo en el que se
encapsulan células que secretan NsG33 en una cápsula
inmunoaisladora. Una "cápsula inmunoaisladora" significa que
la cápsula, tras implantación en un huésped receptor, reduce al
mínimo los efectos deletéreos del sistema inmune del huésped sobre
las células en el núcleo del dispositivo. Las células se
inmunoaislan del huésped encerrándolas dentro de cápsulas
poliméricas implantables formadas por una membrana microporosa.
Este procedimiento previene el contacto célula a célula entre los
tejidos del huésped y los implantados, eliminando el reconocimiento
del antígeno a través de la presentación directa. Las membranas
usadas pueden adaptarse también para controlar la difusión de
moléculas, tales como anticuerpo y complemento, basado en su peso
molecular (Lysaght et al., 56 J. Cell Biochem. 196 (1996),
Colton, 14 Trends Biotechnol. 158 (1996)). Mediante el uso de
técnicas de encapsulación, las células se pueden trasplantar en un
huésped sin rechazo inmune, ya sea con o sin el uso de fármacos
inmunosupresores. Las cápsulas de polímeros biocompatibles útiles
contienen usualmente un núcleo que contiene células, ya sea
suspendidas en un medio líquido o inmovilizadas en una matriz de
inmovilización, y una región circundante o periférica de matriz o
membrana permoselectiva ("cubierta") que no contiene células
aisladas, que es biocompatible, y que es suficiente para proteger
las células en el núcleo del ataque inmunológico perjudicial. La
encapsulación impide que los elementos del sistema inmune entren a
la cápsula, protegiendo de esta manera las células encapsuladas de
la destrucción inmune. La naturaleza semipermeable de la membrana
de la cápsula, permite también que la molécula biológicamente activa
de interés difunda fácilmente desde la cápsula en el tejido
circundante del huésped.
La cápsula puede hacerse de un material
biocompatible. Un "material biocompatible" es un material que,
después de la implantación en un huésped, no induce una respuesta
perjudicial del huésped suficiente para dar como resultado el
rechazo de la cápsula o hacerla inoperable, por ejemplo, a través de
degradación. El material biocompatible es relativamente impermeable
a grandes moléculas, tales como componentes del sistema inmune del
huésped, pero es permeable a pequeñas moléculas, tales como
insulina, factores de crecimiento tales como polipéptidos NsG33 y
nutrientes, mientras que permite que se eliminen los desechos
metabólicos. Varios materiales biocompatibles son adecuados para la
administración de factores de crecimiento por la composición de la
invención. Se conocen numerosos materiales biocompatibles, que
tienen varias morfologías de la superficie exterior y otras
características mecánicas y estructurales. De preferencia, la
cápsula de esta invención será similar a las descritas en los
documentos WO 92/19195 ó WO 95/05452; o las patentes de EE.UU. Nos.
5639275; 5653975; 4892538; 5156844; 5283187; o la patente de EE.UU.
No. 5550050. Tales cápsulas permiten el paso de metabolitos,
nutrientes y sustancias terapéuticas, mientras que reducen al mínimo
los efectos perjudiciales del sistema inmune del huésped. Los
componentes del material biocompatible pueden incluir una membrana
semipermeable circundante y el andamiaje interno que sostiene a las
células. De preferencia, las células alteradas genéticamente se
siembran sobre el andamiaje, que está encapsulado por la membrana
permoselectiva. El andamiaje filamentoso que sostiene a las células
puede hacerse de cualquier material biocompatible seleccionado del
grupo que consiste en acrílico, poliéster, polietileno,
polipropileno, poliacetonitrilo, tereftalato de polietileno, nylon,
poliamidas, poliuretanos, éster de polibutilo, seda, algodón,
quitina, carbono, o metales biocompatibles. Asimismo, pueden usarse
estructuras de fibras aglutinadas para implantación de células
(patente de EE.UU. No. 5512600). Polímeros biodegradables incluyen
los que comprenden ácido poli(láctico) PLA, ácido
poli(láctico-co-glicólico)
PLGA y ácido poli(glicólico) PGA, y sus equivalentes. Se han
usado andamiajes de espuma para proporcionar superficies sobre las
que pueden adherirse las células trasplantadas (WO 98/05304). Se han
usado tubos de malla tejida como injertos vasculares (WO 99/52573).
Además, el núcleo puede formarse de una matriz de inmovilización
formada de un hidrogel, que estabiliza la posición de las células.
Un hidrogel es una red tridimensional de polímeros hidrofílicos
entrelazados en la forma de un gel, formado sustancialmente de
agua.
Pueden usarse varios polímeros y combinaciones
de polímeros para fabricar la membrana semipermeable circundante,
incluyendo poliacrilatos (que incluyen copolímeros de acrílico),
polivinilidenos, copolímeros de cloruro de polivinilo,
poliuretanos, poliestirenos, poliamidas, acetatos de celulosa,
nitratos de celulosa, polisulfonas (que incluyen poliéter
sulfonas), polifosfazenos, poliacrilonitrilos,
poli(acrilonitrilo/co-cloruro de vinilo),
así como derivados, copolímeros y mezclas de los mismos. De
preferencia, la membrana semipermeable circundante es una membrana
de fibras huecas semipermeable biocompatible. Tales membranas, y
métodos para fabricarlas, se describen en las patentes de EE.UU.
Nos. 5284761 y 5158881. La membrana semipermeable circundante se
forma de una fibra hueca de poliéter sulfona, tales como las
descritas en las patentes de EE.UU. No. 4976859 ó 4968733. Un
material alternativo de la membrana semipermeable circundante, es
poli(acrilonitrilo/co-cloruro de vinilo).
La cápsula puede tener cualquier configuración
adecuada para mantener actividad biológica y proporcionar acceso
para la administración del producto o función incluyendo, por
ejemplo, cilíndrica, rectangular, en forma de disco, en forma de
parche, ovoide, estrellada o esférica. Además, la cápsula puede
estar enrollada o envuelta en una estructura de tipo malla o
anidada. Si la cápsula se va a recuperar después de que sea
implantada, no se prefieren configuraciones que tiendan a producir
la migración de las cápsulas desde el sitio de implantación, tales
como cápsulas esféricas lo bastante pequeñas para viajar en los
vasos sanguíneos del huésped receptor. Ciertas formas, tales como
rectángulos, parches, discos, cilindros y hojas planas ofrecen mayor
integridad estructural, y se prefieren donde se desee
recuperación.
Cuando se usan macrocápsulas, se encapsulan de
preferencia entre 10^{3} y 10^{8} células, lo más
preferiblemente se encapsulan de 10^{5} a 10^{7} células en
cada dispositivo. La dosificación puede controlarse implantando un
número mayor o menor de cápsulas, de preferencia entre 1 y 10
cápsulas por paciente.
El andamiaje puede recubrirse con moléculas de
la matriz extracelular (ECM). Ejemplos adecuados de moléculas de la
matriz extracelular incluyen, por ejemplo, colágeno, laminina y
fibronectina. La superficie del andamiaje puede modificarse también
por medio de tratamiento con irradiación de plasma que imparte carga
para mejorar la adhesión de las células.
Puede usarse cualquier método adecuado para
sellar las cápsulas, incluyendo el uso de adhesivos de polímero o
corrugado, anudamiento y termosellado. Además, puede usarse también
cualquier método de sellado "en seco" adecuado tal como se
describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 5653687.
Los dispositivos de células encapsuladas se
implantan según técnicas conocidas. Se contemplan muchos sitios de
implantación para los dispositivos y métodos de esta invención.
Estos sitios de implantación incluyen, pero no están limitados a,
el sistema nervioso central, que incluye el cerebro, la médula
espinal (véase las patentes de EE.UU. Nos. 5106627, 5156844 y
5554148), y los humores acuoso y vítreo del ojo (véase el documento
WO 97/34586).
Se describen métodos y aparatos para la
implantación de cápsulas en el SNC, en el documento US 5487739. Se
describen métodos y aparatos para la implantación de cápsulas en el
ojo, en los documentos US 5904144, US 6299895, US 6439427 y US
20030031700.
En un aspecto, la invención se refiere a una
cápsula biocompatible que comprende: un núcleo que comprende
células de empaquetamiento vivas que secretan un vector viral para
infección de una célula objetivo, en donde el vector viral es un
vector según la invención; y una cubierta externa que rodea a dicho
núcleo, comprendiendo dicha cubierta un material biocompatible
permeable, teniendo dicho material una porosidad seleccionada que
permita el paso de vectores retrovirales de aproximadamente 100 nm
de diámetro a través, permitiendo la liberación de dicho vector
viral desde dicha cápsula.
De preferencia, el núcleo comprende además una
matriz, estando inmovilizadas las células de empaquetamiento por la
matriz. Según una forma de realización, la cubierta comprende un
hidrogel o material termoplástico.
Ejemplos de células adecuadas para líneas de
células de empaquetamiento, incluyen células HEK293, NIH3T3, PG13 y
ARPE-19. Células preferidas incluyen células PG13 y
3T3.
Las líneas de células de empaquetamiento pueden
encapsularse y administrarse usando los métodos y las composiciones
que se describen en los documentos US 6027721 y WO 97/01357.
La presente invención comprende además el
cultivo de células productoras de NsG33 in vitro, sobre una
matriz soporte antes de la implantación en el sistema nervioso de
mamífero. La preadhesión de células a microvehículos antes de la
implantación, está diseñada para intensificar la viabilidad a largo
plazo de las células trasplantadas y proporcionar beneficio
funcional a largo plazo.
Para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
células trasplantadas, es decir, células trasplantadas que secretan
NsG33, las células que serán trasplantadas pueden unirse in
vitro a una matriz soporte antes del trasplante. Materiales que
puede comprender la matriz soporte, incluyen aquellos materiales a
los que se adhieren las células después de incubación in
vitro, y sobre los que las células pueden crecer, y que pueden
ser implantados en el cuerpo del mamífero sin producir una reacción
tóxica o una reacción inflamatoria que destruiría las células
implantadas o de otra manera interferiría con su actividad biológica
o terapéutica. Tales materiales pueden ser sustancias químicas
sintéticas o naturales, o sustancias que tengan un origen
biológico.
Los materiales de la matriz incluyen, pero no
están limitados a, vidrio y otros óxidos de silicio, poliestireno,
polipropileno, polietileno, fluoruro de polivinilideno, poliuretano,
polialginato, polisulfona, alcohol polivinílico, polímeros de
acrilonitrilo, poliacrilamida, policarbonato, polipentent, nylon,
amilasas, gelatina natural y modificada y colágeno natural y
modificado, polisacáridos naturales y modificados, incluyendo
dextrano y celulosas (por ejemplo, nitrocelulosa), agar y
magnetita. Pueden usarse materiales resorbibles o no resorbibles.
Se proponen también materiales de matriz extracelular, que son bien
conocidos en la técnica. Los materiales de matriz extracelular
pueden obtenerse comercialmente, o pueden prepararse haciendo crecer
células que secreten dicha matriz, eliminando las células
secretoras, y permitiendo que las células que serán trasplantadas
interaccionen con la matriz y se adhieran a la misma. El material
de la matriz sobre el que crecen las células que serán implantadas,
o con el que se mezclan las células, puede ser un producto nativo de
células RPE. De esta manera, por ejemplo, el material de la matriz
puede ser matriz extracelular o material de la membrana basal, que
se produce y secreta por células RPE que serán implantadas.
Para mejorar la adhesión, supervivencia y
función de las células, la matriz sólida puede recubrirse
opcionalmente en su superficie externa con factores que se sabe en
la técnica que promueven la adhesión, el crecimiento o la
supervivencia de las células. Tales factores incluyen moléculas de
adhesión celular, matriz extracelular tales como, por ejemplo,
fibronectina, laminina, colágeno, elastina, glucosaminoglicanos o
proteoglicanos, o factores de crecimiento.
De forma alternativa, si la matriz sólida a la
que se unen las células implantadas se construye de material poroso,
el factor o los factores que promueven el crecimiento o la
supervivencia pueden incorporarse en el material de la matriz, a
partir del que se liberarían lentamente después de la implantación
in vivo.
Cuando se unen al soporte según la presente
invención, las células usadas para el trasplante están en general
sobre la "superficie exterior" del soporte. El soporte puede
ser sólido o poroso. Sin embargo, aún en un soporte poroso, las
células están en contacto directo con el medio externo sin una
membrana intermedia u otra barrera. De esta manera, según la
presente invención, se considera que las células están sobre la
"superficie exterior" del soporte, aún cuando la superficie a
la que se adhieren puede estar en la forma de pliegues o
circunvoluciones internos del material de soporte poroso, que no
están en el exterior de la partícula o perla misma.
La configuración del soporte es de preferencia
esférica, como en una perla, pero puede ser cilíndrica, elíptica,
una hoja plana o tira, en forma de una aguja u horquilla, y
similares. Una forma preferida de la matriz soporte es una perla de
vidrio. Otra perla preferida es una perla de poliestireno.
El tamaño de las perlas puede variar de
aproximadamente 10 \mum a 1 mm de diámetro, de preferencia de
aproximadamente 90 \mum a aproximadamente 150 \mum. Para una
descripción de varias perlas de microvehículo véase, por ejemplo,
Isher Biotech Source 87-88, Fisher Scientific Co.,
1987, pp. 72-75; Sigma Cell Culture Catalog, Sigma
Chemical Co., St., Louis, 1991, pp. 162-163; Ventrex
Product Catalog, Ventrex Laboratories, 1989. El límite superior del
tamaño de la perla puede estar determinado por la estimulación de la
perla de reacciones no deseadas en el huésped, que pueden
interferir con la función de las células trasplantadas o causar daño
al tejido circundante. El límite superior del tamaño de la perla
puede estar determinado también por el método de administración.
Tales limitaciones son fácilmente determinables por los expertos en
la materia.
En un aspecto, la invención se refiere a células
huésped aisladas y modificadas genéticamente con el vector según la
invención.
Según una forma de realización, las células
huésped son células procariotas tales como E. coli, que son
capaces de producir proteína recombinante en grandes cantidades, y
que pueden producirse fácilmente a escala industrial. El uso de
células productoras procariotas puede requerir replegamiento y
glicosilación de NsG33 para obtener una proteína biológicamente
activa. En otra forma de realización, las células huésped son
células productoras eucariotas no de mamíferos que incluyen, pero
no están limitadas a, células productoras conocidas tales como
levadura (Saccharomyces cerevisiae), hongos filamentosos
tales como Aspergillus, y células de insecto tales como
Sf9.
Según otra forma de realización, las células son
de preferencia células huésped de mamífero, porque estas células son
capaces de secretar y procesar correctamente la NsG33 codificada.
Especies preferidas incluyen el grupo que consiste en humano,
felino, porcino, simio, canino, murino, rata, conejo, ratón y
hámster.
Ejemplos de cultivos primarios y líneas
celulares que son buenos candidatos para transducción o transfección
con los vectores de la presente invención, incluyen el grupo que
consiste en células CHO, CHO-K1, HEI193T, HEK293,
COS, PC12, HiB5, RN33b, células neuronales, células fetales,
ARPE-19, C2C12, HeLa, HepG2, células del cuerpo
estriado, neuronas, astrocitos e interneuronas. Líneas celulares
preferidas para producción recombinante en mamíferos, incluyen
células CHO, CHO-1, HEI193T, HEK293, COS, PC12,
HiB5, RN33b y BHK.
Para terapia génica ex vivo, el grupo
preferido de células incluye células neuronales, células precursoras
neuronales, células progenitoras neuronales, células madre y células
fetales.
La invención se refiere también a células
adecuadas para bioadministración de NsG33 a través de células
desnudas o encapsuladas, que están modificadas genéticamente para
sobreexpresar NsG33, y que se pueden trasplantar al paciente para
administrar localmente polipéptido NsG33 bioactivo. Tales células se
pueden denominar ampliamente como células terapéuticas.
En una forma de realización preferida de la
invención, no se ha inmortalizado una línea de células terapéutica
con la inserción de un gen de inmortalización heterólogo. Puesto que
la invención se refiere a células que son particularmente adecuadas
para el trasplante de células, ya sea como células desnudas o de
preferencia como células encapsuladas, dichas líneas de células
inmortalizadas son menos preferidas, ya que existe un riesgo
inherente de que comiencen a proliferar de forma incontrolada dentro
del cuerpo humano, y formen potencialmente tumores.
De preferencia, la línea celular es una línea
celular inhibida por contacto. Por una línea celular inhibida por
contacto, se pretende indicar una línea de células que cuando crece
en cultivos bidimensionales, crece hasta confluencia, y entonces
sustancialmente deja de dividirse. Esto no excluye la posibilidad de
que un número limitado de células escape de la capa bidimensional.
Las células inhibidas por contacto pueden crecer también en un
entorno tridimensional, por ejemplo, dentro de una cápsula. También
dentro de las cápsulas, las células crecen hasta confluencia, y
entonces retrasan significativamente su velocidad de proliferación,
o dejan de dividirse completamente. Un tipo de células
particularmente preferido, incluye células epiteliales que por su
naturaleza se inhiben por contacto, y que forman monocapas estables
en cultivo.
Aún más preferidas, son las células epiteliales
pigmentarias retinianas (células RPE). La fuente de células RPE es
mediante aislamiento de células primarias de la retina de mamíferos.
Los protocolos para recoger células RPE, están bien definidos (Li y
Turner, 1988, Exp. Eye Res. 47: 911-917; López et
al., 1989, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30:
586-588), y se consideran una metodología de rutina.
En la mayoría de los informes publicados de
co-trasplante de células RPE, las células derivan de
la rata (Li y Turner, 1988; López et al., 1989). Según la
presente invención, las células RPE derivan de seres humanos. Además
de células RPE primarias aisladas, pueden usarse líneas de células
RPE humanas cultivadas en la práctica de la invención.
Para la encapsulación, las células necesitan ser
capaces de sobrevivir y mantener una secreción de NsG33 funcional a
los bajos niveles de tensión de oxígeno del SNC. De preferencia, la
línea de células de la invención es capaz de sobrevivir a una
tensión de oxígeno menor del 5%, más preferiblemente menor del 2%,
más preferiblemente menor del 1%. Una tensión de oxígeno del 1%
corresponde aproximadamente al nivel de oxígeno en el cerebro.
Para ser una línea celular de plataforma para un
sistema de administración basado en células encapsuladas, la línea
celular debe tener el mayor número posible de las siguientes
características: (1) las células deben ser resistentes en
condiciones severas (las células encapsuladas deben ser funcionales
en cavidades de los tejidos vasculares y avasculares, tales como en
el sistema nervioso central intraparenquimáticamente, o dentro de
los espacios de fluido ventriculares o intratecales o el ojo,
especialmente en el ambiente intraocular). (2) Las células deben
ser capaces de ser modificadas genéticamente para expresar NsG33.
(3) Las células deben tener una duración de vida relativamente
larga (las células deben producir suficiente progenie para ser
depositadas en un banco, caracterizadas, manipuladas, ensayadas con
seguridad y fabricadas en lotes clínicos). (4) Las células deben
ser de origen humano (que aumenta la compatibilidad entre las
células encapsuladas y el huésped). (5) Las células deben exhibir
más del 80% de viabilidad durante un período mayor de un mes in
vivo en el dispositivo (que asegura la administración a largo
plazo). (6) Las células encapsuladas deben administrar una cantidad
eficaz de NsG33 (que asegure eficacia del tratamiento). (7) Cuando
están encapsuladas, las células no deben causar una reacción inmune
significativa en el huésped (que asegura la longevidad del injerto).
(8) Las células no deben ser tumorígenas (para proporcionar
seguridad añadida al huésped, en caso de fuga del dispositivo).
Para la encapsulación, las células preferidas
incluyen células epiteliales pigmentadas retinianas, que incluyen
células ARPE-19; fibroblastos humanos
inmortalizados; y astrocitos humanos inmortalizados.
\newpage
La línea de células ARPE-19 es
una línea de células de plataforma superior para la tecnología de
administración basada en células encapsuladas, y es también útil
para la tecnología de administración basada en células no
encapsuladas. La línea de células ARPE-19 es
resistente (es decir, la línea de células es viable en condiciones
severas, tal como implantación en el sistema nervioso central o el
ambiente intraocular). Las células ARPE-19 pueden
ser modificadas genéticamente para que secreten una sustancia de
interés terapéutico. Las células ARPE-19 tienen una
vida relativamente larga. Las células ARPE-19 son de
origen humano. Además, las células ARPE-19
encapsuladas tienen buena viabilidad en el dispositivo in
vivo. Las células ARPE-19 pueden administrar
una cantidad eficaz de factor de crecimiento. Las células
ARPE-19 inducen una reacción inmune despreciable en
el huésped. Además, las células ARPE-19 no son
tumorígenas. Se describen métodos para el cultivo y la encapsulación
de células ARPE-19 en el documento US 6361771.
En otra forma de realización, la línea de
células terapéutica se selecciona del grupo que consiste en: líneas
celulares de fibroblastos humanos, líneas celulares de astrocitos
humanos, línea de células mesencefálicas humanas, y línea de células
endoteliales humanas, de preferencia inmortalizadas con TERT, SV40T
o vmyc.
El método para la generación de líneas celulares
de astrocitos humanos inmortalizados, se ha descrito previamente
(Price TN, Burke JF, Mayne LV. A novel human astrocyte cell line
(A735) with astrocyte-specific neurotransmitter
function. in vitro Cell Dev Biol Anim. Mayo 1999;
35(5): 279-88). Este protocolo puede usarse
para generar líneas celulares de astrocitos.
Las tres modificaciones siguientes de ese
protocolo, se hacen de preferencia para generar otras líneas
celulares de astrocitos humanos.
Puede usarse tejido de cerebro fetal humano
disecado, de fetos de 5 a 12 semanas, en lugar de tejido de 12 a 16
semanas.
Puede usarse el gen de inmortalización
v-myc, o TERT (telomerasa) en lugar del
antígeno T de SV40.
Puede usarse la transferencia de genes
retrovirales en lugar de la transfección con plásmidos, mediante la
técnica de precipitación con fosfato de calcio. Estos métodos no
incluyen el uso de embriones humanos para fines industriales o
comerciales.
Los polipéptidos NsG33 de la invención pueden
producirse usando sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos
del estado de la técnica. Se describen métodos ejemplares en el
documento WO 93/22437 (Innogenetics). Debido a la similitud
estructural entre los polipéptidos NsG33 y los polipéptidos
descritos en el documento WO 93/22437, se contempla que puedan
producirse polipéptidos NsG33 usando los métodos de producción
descritos en esta publicación. Los protocolos descritos en el
documento WO 93/22437 describen la purificación de una proteína que
tiene un peso molecular predicho de 29 kDa. En el caso de la
expresión de fragmentos de NsG33, que pueden ser considerablemente
más cortos debido a la posible digestión del propéptido, deben
modificarse los protocolos para tomar en cuenta la diferencia en
peso molecular.
Estos ejemplos incluyen expresión en E.
coli (ejemplo 5 del documento WO 93/22437), expresión en células
COS1 (ejemplo 6 del documento WO 93/22437), expresión en un sistema
de expresión de baculovirus (ejemplo 7 del documento WO 93/22437) y
expresión en un sistema de virus de la vacuna (ejemplo 8 del
documento WO 93/22437). Cada uno de los sistemas de expresión
referidos produjo la expresión de cantidades significativas de los
polipéptidos descritos en el documento WO 93/22437.
La purificación de las proteínas NsG33 puede
realizarse usando el método de purificación descrito en el documento
WO 93/22437. Brevemente, se recoge medio condicionado de células
COS1 transfectadas con el ADNc de la invención después de 48 horas,
y se filtra sobre un filtro de 0.22 \mum para eliminar los restos
de células. Una purificación típica comienza de 600 a 1000 ml de
medio de transfección de células COS1. A esto se añaden MgCl_{2} y
sulfato de dextrano 500.000 (Pharmacia, Uppsala, Suecia), hasta una
concentración final de 60 mM y 0,02%, respectivamente. Después de 1
hora de incubación a 4ºC, el precipitado se precipita mediante
centrifugación (12.000 g, 30 min., 4ºC). La fracción de
sobrenadante, que contiene la NsG33, se dializa contra Hepes 50 mM,
pH 7,0, EDTA 4 mM, se ajusta a pH 8,0, y se carga a una velocidad
de flujo de 0,5 ml/minuto en una columna de 4 ml de
agarosa-fenilboronato (PBA 30, Amicon, MA, USA)
equilibrada en Hepes 50 mM, pH 8,5. La NsG33 se eluye de la matriz
con sorbitol 100 mM.
El pico eluido del sorbitol se hace pasar
entonces a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto sobre una columna
de intercambio iónico FPLC Mono Q de 1 ml (Pharmacia) equilibrada en
Hepes pH 8,5 y se eluye con un gradiente lineal de sal de NaCl de 0
a 1 M a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto.
El eluato se concentra aproximadamente 40 veces
por medio de Centricon 10.000 (Amicon), y se carga por lotes (3
veces 0,25 ml) sobre una columna de filtración en gel SMART Superdex
75 (Pharmacia) equilibrada contra PBS. Este protocolo puede producir
elución de proteína de alta pureza.
\newpage
Pueden usarse también otros protocolos de
purificación de proteínas del estado de la técnica, para
proporcionar proteína bastante pura para realizar las pruebas in
vitro e in vivo descritas en los ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden usarse polipéptidos NsG33 y/o
polinucleótidos que codifiquen NsG33 como factores de crecimiento o
factores tróficos in vitro. Este uso se basa en el hallazgo
de que NsG33 es una proteína secretada con rasgos estructurales de
un factor de crecimiento u hormona, y en el hallazgo por los
presentes inventores de que NsG33 causa la generación y/o
supervivencia de neuronas, y/o la proliferación de precursores
neurales en varios ensayos in vitro. El efecto
neuroprotector y/o de neurogénesis se ha encontrado en una línea de
células precursoras neurales (hNS1) y en un cultivo primario
(cultivo estriatal de rata). Además, se ha encontrado un efecto
antiapoptótico en una línea de células con potencial neuronal
(PC12).
Puede administrarse NsG33 al cultivo como una
composición de proteína, o las células pueden transducir o
transfectar con ADNc que codifique NsG33. Si NsG33 sería efectiva
en el tratamiento de un tipo particular de célula o tejido, se
puede determinar fácilmente por los expertos en la materia usando
cualquiera de una variedad de ensayos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, con respecto a proporcionar soporte trófico para las
células, los factores tróficos pueden producir efectos bioquímicos
y morfológicos beneficiosos y, en algunas circunstancias, pueden
promover la supervivencia celular. Con respecto a neuronas, se sabe
en la técnica que la privación del soporte trófico a una neurona
puede producir una disminución en la actividad metabólica, es decir,
absorción de glucosa, síntesis de ARN y síntesis de proteínas,
requeridas para el funcionamiento y crecimiento normales. Deckwerth
y Johnson, J. Cell Biol. 123: 1207-1222, 1993. La
eliminación del soporte trófico puede resultar también en una
reducción en tamaño del cuerpo celular de la neurona. Quizá como una
consecuencia de la pérdida de los efectos metabólicos de los
factores tróficos, la privación de factores tróficos puede resultar
en una disminución o cese del crecimiento de extensiones, y puede
resultar en retracción de extensiones neuronales. Además del
requerimiento del factor trófico para estos aspectos de la biología
neuronal, la neurona puede requerir el factor neurotrófico para
mantener su supervivencia; de esta manera, los ensayos de
supervivencia son un medio que se usa con frecuencia para detectar
o cuantificar las acciones de un factor neurotrófico. Sin embargo,
el soporte trófico puede manifestarse también como cambios
morfológicos, bioquímicos y funcionales, independientes del número
de neuronas o cualquier efecto sobre la supervivencia.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No. 1, secuencia genómica de NsG33 humano
con 100 pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y
3'.
SEQ ID No. 2, ADNc de NsG33 humano.
SEQ ID No. 3, secuencia de aminoácidos de
longitud completa de NsG33 humano.
SEQ ID No. 4, proteína NsG33 humana sin péptido
señal.
SEQ ID No. 5, polipéptido
C-terminal de NsG33 humano.
SEQ ID No. 6, secuencia genómica de NsG33 de
ratón con 100 pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y
3'.
SEQ ID No. 7, ADNc parcial de NsG33 de
ratón.
SEQ ID No. 8, secuencia de aminoácidos parcial
de NsG33 de ratón.
SEQ ID No. 9, proteína NsG33 de ratón sin
péptido señal.
SEQ ID No. 10, polipéptido
C-terminal de NsG33 de ratón.
SEQ ID No. 11, secuencia genómica de NsG33 de
rata con 100 pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y
3'.
SEQ ID No. 12, ADNc de NsG33 de rata.
SEQ ID No. 13, secuencia de aminoácidos de
longitud completa de NsG33 de rata.
SEQ ID No. 14, proteína NsG33 de rata sin
péptido señal.
SEQ ID No. 15, polipéptido
C-terminal de NsG33 de rata.
SEQ ID No. 16, secuencia de nucleótidos que
codifica el péptido C-terminal de NsG33 humano.
SEQ ID No. 17, secuencia de nucleótidos que
codifica el péptido C-terminal de NsG33 de
ratón.
SEQ ID No. 18, secuencia de nucleótidos que
codifica el péptido C-terminal de NsG33 de rata.
SEQ ID No. 19, péptido
N-terminal humano.
SEQ ID No. 20, péptido
N-terminal de ratón.
SEQ ID No. 21, péptido
N-terminal de rata.
SEQ ID No. 22, péptido
N-terminal humano.
SEQ ID No. 23, péptido
N-terminal de ratón.
SEQ ID No. 24, péptido
N-terminal de rata.
SEQ ID No. 25, ADNc de ratón.
SEQ ID No. 26, secuencia de aminoácidos de
longitud completa de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
En el listado de secuencias, los intrones están
marcados en minúscula, y los exones en MAYÚSCULA. En las secuencias
polipeptídicas, los péptidos señal están marcados en
negrita.
\newpage
Secuencia de nucleótidos genómica de NsG33
humano (SEQ ID No. 1).
NsG33 humano (1109 pb;
CDS=118-999) (SEQ ID No. 2).
>gi|34147349|ref|NM_024042.2| proteína
hipotética MGC2601 (MGC2601) de Homo sapiens, ARNm.
Secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido C-terminal de NsG33 humano (SEQ ID No.
16).
Secuencia de aminoácidos de longitud completa de
NsG33 humano (SEQ ID No. 3).
>IPI00031531.1 REFSEQ_NP:NP_076947
TREMBL:Q9UJH9 ENSEMBL:ENSP00000219542 Tax_Id=9606
C380A1.2.1 (proteína novedosa).
C380A1.2.1 (proteína novedosa).
Proteína NsG33 humano, sin péptido señal (SEQ ID
No. 4).
Polipéptido C-terminal de NsG33
humano (SEQ ID No. 5).
Péptido N-terminal de humano
(SEQ ID No. 19).
Péptido N-terminal humano (SEQ
ID No. 22).
Secuencia genómica de nucleótidos de NsG33 de
ratón (SEQ ID No. 6).
Cromosoma genómico 17 (cadena inversa):
\newpage
ADNc parcial de NsG33 de ratón (1048 pb;
CDS=<2-886) (SEQ ID No. 7).
ADNc de NsG33 de ratón, 1363 pb, CDS 84..959
(SEQ ID No. 25).
NM_133719. Meteorina de Mus musculus
[gi.56550040].
Secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido C-terminal de NsG33 de ratón (SEQ ID No.
17).
NsG33 parcial de ratón (SEQ ID No. 8), es decir,
extremo N-terminal que falta.
>giI23274274IgbIAAH37181.1l proteína
1810034B16Rik [Mus musculus].
Secuencia de aminoácidos de longitud completa de
NsG33 de ratón (SEQ ID No. 26).
ref|NP_598480.1I meteorina [Mus
musculus].
\vskip1.000000\baselineskip
Proteína NsG33 de ratón, sin péptido señal (SEQ
ID No. 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Polipéptido C-terminal de NsG33
de ratón (SEQ ID No. 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Polipéptido N-terminal de NsG33
de ratón (SEQ ID No. 20).
Polipéptido N-terminal de NsG33
de ratón (SEQ ID No. 23).
\newpage
Secuencia genómica de NsG33 de rata con 100
pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y 3' (SEQ ID No.
11). Cromosoma genómico 10 (cadena inversa):
\newpage
SEQ ID No. 12, NsG33 de rata (1026 pb;
CDS=876).
>gi|34870570Iref|XM_213261.2| Rattus
norvegicus, similar a la proteína 1810034B16Rik (LOC287151),
ARNm.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia codificante de polipéptido
C-terminal de NsG33 de rata (SEQ ID No. 18).
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de aminoácidos de longitud completa de
NsG33 de rata (SEQ ID No. 13).
\vskip1.000000\baselineskip
Proteína NsG33 de rata, sin péptido señal (SEQ
ID No. 14).
\vskip1.000000\baselineskip
Polipéptido C-terminal de NsG33
de rata (SEQ ID No. 15).
\newpage
Polipéptido N-terminal de NsG33
de rata (SEQ ID No. 21).
\vskip1.000000\baselineskip
Polipéptido N-terminal de NsG33
de rata (SEQ ID No. 24).
\vskip1.000000\baselineskip
NsG33 humana es una proteína factor de
crecimiento secretada expresada como un precursor de 293 aminoácidos
a altos niveles en el sistema nervioso central y subregiones del
mismo, en el sistema nervioso periférico, en la retina y el
mesencéfalo humano en desarrollo. Los homólogos de ratón (SEQ ID No.
8) y rata (SEQ ID No. 13) tienen longitudes completas de 294 y 291
aminoácidos, y los % de identidades son 80,3 y 80,2,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
NsG33 humana contiene una secuencia de péptido
señal N-terminal de 23 aminoácidos, que es digerida
en el motivo de secuencia ARA-GY. Este sitio de
digestión del péptido señal se predice mediante el método SignalP
(Nielsen et al., 1997) y la gráfica resultado se muestra en
la figura 1. Un sitio de digestión del péptido señal se encuentra
en una localización similar en la NsG33 de ratón (posición 24) y la
NsG33 de rata (posición 16 ó 21). La digestión más probable de
NsG33 de rata es en la posición 21, ya que esto se corresponde a la
posición de digestión predicha tanto en la NsG33 humana como en la
de ratón. Esto significa que el extremo N-terminal
más probable de SEQ ID No. 14, 21 y 24 es GYSEDRCS y no el
ASARAGYSED mostrado en el listado de secuencias.
La predicción del péptido señal en la NsG33 de
ratón, proporciona el mismo sitio de digestión para la secuencia
parcial de NsG33 (SEQ ID No. 8) y para la secuencia de longitud
completa de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 26).
\vskip1.000000\baselineskip
Se predice la digestión de tipo general de
proproteína en NsG33 humana (SEQ ID No. 3), mediante el método ProP
en la posición 127 con una puntuación de 0,831, motivo de secuencia
"WGPRERR-AL". De forma similar, se predice un
sitio de digestión en NsG33 de ratón (SEQ ID No. 8) en la posición
128 con una puntuación de 0,831, motivo de secuencia
"WGPRERR-AL", y en NsG33 de rata (SEQ ID No.
13) en la posición 125 con una puntuación de 0,831 y el motivo de
secuencia "WGPRERR-AL".
\vskip1.000000\baselineskip
NsG33 pertenece a la categoría de proteínas que
actúan como factores de crecimiento. Esta noción está apoyada por
predicciones hechas por el servidor de predicción de la función de
proteínas ProtFun (Jensen et al., 2002 y 2003), que
proporciona puntuaciones de posibilidad por encima de 1 para
exactamente este tipo de categoría, como se muestra en la figura 2.
El método de ProtFun predice la función de las proteínas basado en
características derivadas de secuencia, opuestamente a similitud de
secuencia. Características que son importantes para la
discriminación entre las clases de "factor de crecimiento"
frente a todas las demás clases, son: potencial de distribución de
la proteína, potencial de direccionamiento de la proteína, potencial
del péptido señal, regiones de baja complejidad, estructura
secundaria de la proteína, número de residuos negativos, y número de
átomos (Jensen et al., 2003).
Los cálculos de identidad de secuencia
siguientes se han hecho con el programa align0, usando una matriz
BLOSUM50 y penalizaciones de espacio -12/-2.
\newpage
La tabla 1 muestra el % de identidad de
secuencia entre NsG33 humana de longitud completa, frente a las
secuencias de ratón y rata.
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 2 muestra el % de identidad de
secuencia entre NsG33 humana, frente a las secuencias de ratón y
rata después de la eliminación del péptido señal
N-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
ProP: Prediction of proprotein convertase
cleavage sites. Peter Duckert, Søren Brunak y Nikolaj
Blom. Protein Engineering, Design and Selection: 17:
107-112, 2004.
SignalP: Identification of prokaryotic and
eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.
Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Søren Brunak
y Gunnar von Heijne, Protein Engineering 10,
1-6 (1997).
ProtFun: Ab initio prediction of human orphan
protein function from post-translational
modifications and localization features. L. Juhl Jensen, R.
Gupta, N. Blom, D. Devos, J. Tamames, C.
Kesmir, H. Nielsen, H. H. Staerfeldt, K.
Rapacki, C. Workman, C. A. F. Andersen, S.
Knudsen, A. Krogh, A. Valencia y S.
Brunak. J. Mol. Biol., 319: 1257-1265,
2002.
Prediction of human protein function according
to Gene Ontology categories, LJ. Jensen, R. Gupta, H.
H. Staerfeldt, S. Brunak. Bioinformatics, 19,
635-642 (2003).
align0 Optimal alignments in linear space.
Myers, E. W. y Miller, W. Comput. Appl.
Biosci., 4, 11-17 (1998).
\vskip1.000000\baselineskip
El material humano provino de piezas de tejido
desechadas obtenidas de interrupciones provocadas de embarazos
usando la técnica corriente de aspiración al vacío. La recogida de
tejido residual para el estudio fue aprobada por el Comité de Ética
Humana del Hospital de la Universidad de Huddinge, Karolinska
Institute (Diario Nr. 259/00) y la Universidad de Lund (970401), y
estuvo de acuerdo con las normas de la Comisión Nacional Sueca de
Salud y Bienestar (Socialstyrelsen), incluyendo un consentimiento
informado de las mujeres embarazadas que solicitaron abortos. El
tejido nervioso recuperado se microdisecó a las dos horas de la
cirugía, y se disociaron fragmentos de tejido adecuados
adicionalmente para el aislamiento de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo tejido fetal humano (8 semanas) en dos
rondas, ambas de 8 semanas de gestación. Se usaron regiones de VM y
DM disecadas para aislamiento de ARN total con buenos resultados y
rendimientos.
Se aisló ARN total con extracción con Trizol
siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen) de las
regiones mesencefálicas ventral y dorsal subdisecadas de tejido
fetal humano, de 8 semanas de gestación. Para concentrar el ARN, y
para eliminar trazas de ADN cromosómico, se usan columnas Rneasy
combinadas con el conjunto de DNasa libre de RNasa, siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Se preparó ARNc biotinilado a partir de 5 \mug
de ARN total, y se fragmentó como se describe en los protocolos de
Affymetrix (GeneChip Expression Analysis, Technical Manual 2000) y
se hibridó (15 \mug) con GeneChips U133B humano de Affymetrix
(que contenía aproximadamente 22.000 genes), según las instrucciones
del fabricante. Se analizaron imágenes de barrido, y se
convirtieron a valores de índice de expresión usando el paquete de
software de análisis GenePublisher (Knudsen S, Workman C,
Sicheritz-Ponten T, Friis C. (2003)
"GenePublisher: Automated analysis of DNA microarray data",
Nucleic Acids Res. 31(13): 3471-6).
Mediante el uso de GeneChips U133 de Affymetrix,
se analizó la expresión de NsG33 humano (GeneChip acc. 232269_x_at
on U133 B y acc. 219051_x_at on U133 A; Affymetrix, Inc., Santa
Clara, Calif.). Se observó la expresión de NsG33 humano en muestras
de tejido de mesencéfalo (cerebro medio) fetal humano de ocho
semanas, indicando que NsG33 humana puede desempeñar un papel en el
desarrollo temprano del cerebro fetal. La expresión de un factor de
crecimiento en el mesencéfalo de humano durante el desarrollo
embrionario, es predictiva de una posible función terapéutica en el
tratamiento de enfermedad de Parkinson.
\vskip1.000000\baselineskip
NsG33 se amplificó por PCR de un clon de IMAGE
(The I.M.A.G.E. Consortium: "An integrated molecular analysis of
genomes and their expression", Lennon, Auffray, Polymeropoulos y
Soares [1996], Genomics 33: 151-152) obtenido de
RZPD, Berlín, Alemania (clon RZPD, ID: IRALp962D105Q2), usando los
siguientes cebadores:
Cebador 5': | 5'-GCGGATCCAGCGGTGGTGAGAGCCCCGAC-3' |
Cebador 3': | 5'-TATACTCGAGGCCCACCCTCCCTCCTACCAG-3'. |
\vskip1.000000\baselineskip
Se establecieron tres reacciones de PCR
idénticas con 50 ng/\mul del clon RZPD como molde de ADN, en un
volumen de reacción de 50 \mul. Se aplicó una polimerasa
correctora de errores (polimerasa pfu-turbo,
Stratagene) para la amplificación por PCR, con el siguiente perfil
de amplificación: paso de predesnaturalización: 95ºC, 1' seguido de
35 ciclos de 3 pasos: paso de desnaturalización: 95ºC, 30''; paso de
alineamiento: 57ºC, 30''; paso de elongación: 72ºC, 90''. Después,
un paso de elongación: 72ºC, 2', seguido de enfriamiento a 4ºC.
Se agruparon las reacciones de PCR, y el
fragmento de PCR de NsG33 de 988 pb, se purificó en gel de agarosa,
y se cortó con BamHI y XhoI. El ahora fragmento de PCR de NsG33 de
976 pb digerido con BamHI/XhoI se purificó en gel. Se digirieron
cinco \mug de un vector de transferencia lentiviral, pHsCXW
(número de acceso del GenBank: AY468486) con BamHI y XhoI, y el
esqueleto del vector fue purificada en gel.
El fragmento de PCR de NsG33 BamHI/XhoI se ligó
en los sitios BamHI y XhoI del vector de transferencia lentiviral
pHsCXW, seguido de transformación en células electrocompetentes
XL1-B.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tejidos investigados para la expresión de
NsG33, fueron ARN total de retina, cerebro entero, putamen,
sustancia negra, ganglio, hígado fetal, cerebelo, cerebro entero,
hígado fetal, corazón, riñón, pulmón, placenta, próstata, glándula
salival, músculo esquelético, bazo, testículo, timo, tráquea, útero,
colon, intestino delgado, médula espinal, estómago, páncreas y
cerebro fetal.
Se preparó la primera cadena de ADNc a partir de
ARN total, usando la transcriptasa inversa Superscript II (Life
Technologies) y un cebador HT11V usando procedimientos estándar.
Para el análisis de expresión por PCR en tiempo real, se usó como
molde el producto de la transcripción inversa equivalente a 20 ng de
cada ARN, en reacciones de PCR en tiempo real.
Se realizó la PCR en tiempo real en un
termociclador Opticon-2 (MJ Research), usando el kit
LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I
(Roche). Se llevaron a cabo estudios por duplicado usando los
cebadores
5'-CCAGC
GACTTCGTAATTCAC-3' (cebador 5') y 5'-AGCCCATGAAGAGGAAGG-3' (cebador 3'). Para la PCR en tiempo real, se preparó una curva patrón mediante dilución en serie de un producto de PCR purificado en gel, preparado usando los cebadores anteriores. La curva patrón se usó para verificar que los valores de punto de cruce (CT) de todas las muestras estuvieran dentro del intervalo exponencial de la reacción de PCR, y para calcular los niveles de expresión finales. Todas las amplificaciones por RT-PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 10 \mul que contenía MgCl_{2} 3 mM, sacarosa al 12% y tampón de reacción 1x incluido en el kit LightCycler. El perfil del ciclo de la PCR consistió de un paso de predesnaturalización de 10 minutos a 98ºC y 35 ciclos de tres pasos a 98ºC durante 10 segundos, a 62ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 20 segundos. Después del paso de extensión de cada ciclo, se añadió un paso de lectura de placa (80ºC, 2 segundos) para cuantificar los productos de PCR recién formados. La especificidad de la reacción de amplificación se determinó realizando un análisis de curva de fusión de los fragmentos de PCR, elevando lentamente la temperatura de 52ºC a 95ºC con adquisición continua de datos.
GACTTCGTAATTCAC-3' (cebador 5') y 5'-AGCCCATGAAGAGGAAGG-3' (cebador 3'). Para la PCR en tiempo real, se preparó una curva patrón mediante dilución en serie de un producto de PCR purificado en gel, preparado usando los cebadores anteriores. La curva patrón se usó para verificar que los valores de punto de cruce (CT) de todas las muestras estuvieran dentro del intervalo exponencial de la reacción de PCR, y para calcular los niveles de expresión finales. Todas las amplificaciones por RT-PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 10 \mul que contenía MgCl_{2} 3 mM, sacarosa al 12% y tampón de reacción 1x incluido en el kit LightCycler. El perfil del ciclo de la PCR consistió de un paso de predesnaturalización de 10 minutos a 98ºC y 35 ciclos de tres pasos a 98ºC durante 10 segundos, a 62ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 20 segundos. Después del paso de extensión de cada ciclo, se añadió un paso de lectura de placa (80ºC, 2 segundos) para cuantificar los productos de PCR recién formados. La especificidad de la reacción de amplificación se determinó realizando un análisis de curva de fusión de los fragmentos de PCR, elevando lentamente la temperatura de 52ºC a 95ºC con adquisición continua de datos.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Para propósitos de normalización, todas las
moléculas de ADNc se sometieron a PCR en tiempo real usando
cebadores para \beta_{2}-microglobulina (B2M,
5'-TGTGCTCGCGCTACTCTCTC-3' y 5'-
CTGAATGCTCCACTTTTTCAATTCT-3'). Se prepararon curvas
patrón para \beta_{2}-microglobulina similares a
NsG33. Se llevó a cabo PCR en tiempo real del gen de mantenimiento
usando el mismo kit que para el gen objetivo, salvo que se usaron
temperaturas de alineamiento óptimas para el gen de
mantenimiento.
Se determinó el patrón de expresión del gen de
mantenimiento a partir de las curvas patrones respectivas, y se
usaron los niveles de expresión relativa para normalizar los niveles
de expresión de los genes objetivo en los tejidos que se analizaron.
Después de la normalización con la
\beta_{2}-microglobulina, se calcularon los
niveles de expresión relativa del gen objetivo usando el tejido con
la expresión más baja como referencia. Los resultados normalizados
con respecto a \beta_{2}-microglobulina deben
interpretarse con precaución, puesto que la
\beta_{2}-microglobulina puede no expresarse al
mismo nivel en todos los tejidos ensayados.
Análisis de las muestras de ARN total (mostradas
en las figuras 4A y 4B):
Alta expresión (valores de
C(T)\men{1}22):
Putamen, sustancia negra, médula espinal
\vskip1.000000\baselineskip
Expresión intermedia (22<valores de
C(T)\men{1}24):
Cerebro entero, cerebelo, retina, DRG
\vskip1.000000\baselineskip
Baja expresión (24<valores de
C(T)\men{1}26):
Corazón, riñón, pulmón, próstata, glándula
salival, músculo esquelético, testículo, estómago, páncreas, cerebro
fetal
\vskip1.000000\baselineskip
Expresión muy baja o nula (valores de
C(T)\may{1}26):
Hígado fetal, placenta, timo, tráquea, bazo,
útero, colon, intestino delgado.
\vskip1.000000\baselineskip
Basado en la expresión específica del tejido, y
en el hecho de que se predice que NsG33 es un factor de crecimiento
secretado (véase ejemplo 2), se contempla NsG33 para su uso en el
tratamiento de trastornos del sistema nervioso en general (basado
en la expresión específica en el sistema nervioso), en particular
enfermedad de Parkinson (basado en la expresión en la sustancia
negra), enfermedad de Huntington (basado en la expresión en el
putamen), trastornos cerebelares (basado en la expresión en el
cerebelo), lesión de médula espinal y ELA (basado en la expresión
en la médula espinal), neuropatías periféricas (basado en la
expresión en el ganglio de la raíz dorsal) y retinopatías (basado
en la expresión en la retina). La función para las varias
indicaciones puede verificarse en pruebas in vitro e in
vivo como se describe más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia codificante de NsG33 se subclonó en
pHsCXW usando sitios de restricción adecuados como se describe en
el ejemplo 4. Para generar soluciones madre de virus, el vector de
transferencia lentiviral resultante se
co-transfectó en células 293T con dos plásmidos
auxiliares (pMD.G y pBR8.91) que proporcionan los genes virales
necesarios, gag-pol y env, respectivamente, en
trans. Brevemente, se sembraron 2x10^{6} células 293T en cada una
de 20 botellas de cultivo T75. Al día siguiente, cada botella T75 se
transfectó con 15 \mug de ppBR8.91, 5 \mug de pMD.G y 20 \mug
de vector de transferencia usando Lipofectamine+ siguiendo las
instrucciones del fabricante (Invitrogen). Se recogió medio que
contenía al virus 2-3 días después de la
transfección, y se esterilizó por filtración a través de un filtro
de acetato de celulosa o polisulfónico de 0.45 \mum. El virus se
precipitó por ultracentrifugación doble a 50.000xg durante 90
minutos a 4ºC, y se resuspendió entonces en medio DMEM. Se tituló
el virus usando un ensayo de transcriptasa inversa (RT) (Current
Protocols in Molecular Biology, editores: Ausubel et al.,
Wiley). Se calculó el número de unidades de transducción (UT)/ml de
la actividad de RT resultante, y la frecuencia de células
fluorescentes obtenidas por transducción de células 293T con un
lentivirus con GFP equivalente. La solución madre de virus se
almacenó en alícuotas a -80ºC hasta su uso.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para el ensayo, se usaron células PC12 (número
de acceso de ATCC: CRL-1721) adaptadas a medio DMEM.
Las células PC12 se cultivan en medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/l de glucosa y glutamax (Life
Technologies #32430-027) con suero de caballo
donante al 7,5% (Life Technologies #16050-098) y SBF
al 7,5% (Life Technologies # 10099-141) en
presencia de CO_{2} al 5% a 37ºC. Se cambia el medio cada
2-3 días, y las células se subcultivan
1:3-1:6 dos veces por semana golpeando la botella y
dispensando en botellas nuevas. El día anterior a la transducción,
se sembraron células en placas de seis pocillos recubiertos de
colágeno. Se añadió virus de la solución madre a 1 ml del medio de
cultivo junto con o sin polibreno 5 \mug/ml (concentración
final). El virus se incubó con las células durante al menos 3 horas
en un incubador de CO_{2}. Se añadió retrovirus con GFP a un
cultivo paralelo para estimar la eficiencia de transducción y para
servir como control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se siguió el curso de cultivos en placas de 6
pocillos, y se puntuaron para el número de células que poseen
neuritas, después de 2-5 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Se resembraron las células transducidas de
placas de 6 pocillos en placas de 96 pocillos recubiertos de
colágeno, en medio de cultivo. Al día siguiente, el medio se cambió
a DMEM sin suero, y se midió la viabilidad de las células después
de 24-72 horas usando el ensayo de MTS siguiendo las
instrucciones del fabricante (Promega). Los resultados de un
experimento se muestran en la figura 9. La actividad de MTS en
células PC12 transducidas con un lentivirus que contenía ADNc de
NsG33 de longitud completa, incrementó significativamente en
comparación con células PC12 control transducidas con un lentivirus
que poseía un gen marcador (EGFP). MTS es una medida de la
actividad metabólica en la población total de células. De esta
manera, el incremento en la actividad de MTS en
rLV-NsG33 respecto al cultivo control, puede
reflejar la presencia de un número incrementado de células viables
en el cultivo, y/o viabilidad incrementada de las células
supervivientes.
Un efecto positivo en el ensayo de extensión de
neuritas y/o de supervivencia, es indicativo de un potencial efecto
terapéutico de la proteína NsG33 en el tratamiento de trastornos
neurodegenerativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lleva a cabo un ensayo para los efectos de
supervivencia, transduciendo cultivos de células granulares
cerebelares que subsiguientemente se exponen a concentraciones
tóxicas de glutamato, esencialmente como se describe (Daniels y
Brown, 2001; J. Biol. Chem. 276: 22446-22452).
Se disecan neuronas granulares cerebelares (CGN)
de crías de ratón de 7-8 días. Se disocian las
células de cerebelos recién disecados mediante disolución
enzimática en presencia de tripsina y DNasa, y se siembran entonces
en placas de 24 pocillos pre-recubiertos de
poli-D-lisina (Nunc) a una densidad
de 1-2 x 10^{6} células/cm^{2} en medio DMEM
suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10%.
Las células se cultivan a 37ºC en una atmósfera humidificada, y se
añade arabinósido de citosina (10 \muM) al medio de cultivo
después de 24 horas para detener el crecimiento de las células no
neuronales.
Se transducen los cultivos con un lentivirus que
contiene NsG33 preparado como se describe en el ejemplo 6 en DIV1
por la adición de solución madre del virus a medio DMEM que contiene
suero de bovino fetal al 10% y polibreno 4 \mug/ml. Se transducen
cultivos control paralelos con un lentivirus de proteína
fluorescente verde (GFP). Cinco horas después de la transducción,
se reemplaza el medio con medio precondicionado en CGN.
En DIV5, se añade glutamato
(0,1-1 mM) al cultivo, y después de dos días más, se
ensaya la supervivencia de las células usando el ensayo de MTT. El
grado de reducción de MTT a formazano se mide
espectrofotométricamente a 570 nm. Brevemente, se retira el medio
de cultivo, y las células se lavan en solución salina de sodio (NaCl
140 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2}.6H_{2}O 1 mM, NaH_{2}PO_{4} 1
mM, CaCl_{2} 1,5 mM, glucosa 5,6 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4). Se
añade entonces a las células MTT (concentración final 0,5 mg/ml),
preparado justo antes, y mantenido en la oscuridad en solución
salina de sodio. Después de una incubación de 3 horas a 37ºC, se
añade un volumen igual de ácido-isopropanol (HCl
0,04 M en isopropanol), y se mezcla por completo a temperatura
ambiente hasta que se disuelvan todos los cristales de formazano. La
viabilidad de las células se expresa como un porcentaje de la
densidad óptica de células control. Los cultivos paralelos se dejan
sin tratar.
Puede considerarse este ensayo como un ensayo
general para probar la protección contra el daño excitotóxico, así
como un ensayo predictivo para factores con potencial terapéutico en
el tratamiento de trastornos cerebelares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lleva a cabo el ensayo de efectos de
supervivencia, transduciendo células granulares cerebelares privadas
de potasio, esencialmente como se describe (Nomura et al.,
2001; Dev. Neurosci. 23: 145-152).
Se disecan neuronas granulares cerebelares (CGN)
de crías de ratas Sprague-Dawley de 8 días. Se
disocian células de cerebelos recién disecados mediante disolución
enzimática en presencia de tripsina y DNasa, y se siembran entonces
en placas de 96 pocillos pre-recubiertos de
poli-D-lisina (Nunc) a una densidad
de 3,5 x 10^{5} células/cm^{2} en medio basal de Eagle que
contiene KCl 25 mM y suplementado con suero fetal de ternera
inactivado por calor al 10% y glutamina 2 mM. Las células se
cultivan a 37ºC en una atmósfera humidificada, y se añade
arabinósido de citosina (10 \muM) al medio de cultivo después de
24 horas para detener el crecimiento de las células no
neuronales.
Se transducen los cultivos con un lentivirus que
contiene NsG33 preparado como se describe en el ejemplo 6
["ensayo en células PC12"] en DIV1 mediante la adición de
solución madre del virus a medio DMEM que contiene suero bovino
fetal al 10% y polibreno 4 \mug/ml. Se transducen cultivos control
paralelos con un lentivirus con GFP. Cinco horas después de la
transducción, se reemplaza el medio con medio precondicionado en
CGN.
En DIV2, se induce apoptosis en cultivos
inmaduros cambiando las células a medio sin suero que contiene KCl 5
mM, mientras que las células no tratadas reciben medio condicionado
que contiene KCl 25 mM. Se mide la supervivencia en DIV3, usando el
ensayo de MTS.
En DIV8, se induce apoptosis en cultivos
diferenciados (neuronales), cambiando las células a medio sin suero
que contiene KCl 5 mM, mientras que las células no tratadas reciben
medio condicionado que contiene KCl 25 mM. Se mide la supervivencia
después de 24-72 horas, usando el ensayo de MTS.
El ensayo de MTS se lleva a cabo usando el
ensayo no radiactivo de proliferación de células CellTiter 96®
AQ_{ueous} (Promega), siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Puede considerarse este ensayo como un ensayo
general para efectos neuroprotectores, así como un ensayo que
predice factores con potencial terapéutico en el tratamiento de
trastornos cerebelares.
\vskip1.000000\baselineskip
Para transducir células ARPE-19
con un lentivirus que contiene ADNc que codifica el gen de NsG33,
las células se siembran a una densidad de 1x10^{5}
células/pocillo en una placa de 6 pocillos en medio DMEM/F12
suplementado con suero bovino fetal al 10%. Al día siguiente, se
añade el virus de la solución madre al medio de cultivo junto con
polibreno 5 \mug/ml (concentración final). Se incuba el virus con
las células durante la noche en un incubador de CO_{2}. Se añade
lentivirus con GFP a un cultivo paralelo. Al día siguiente, se
cambian los cultivos a medio sin suero UltraCULTURE (1 ml/pocillo),
y se recogen medios condicionados después de otros dos días de
incubación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se retiran los DRG de todos los niveles
espinales de ratas Sprague-Dawley en P1 (día 1
post-natal). Los tejidos se disocian
enzimáticamente en 125-250 U/ml de colagenasa tipo 1
(Worthington, Freehold, N.J.) a 37ºC durante 30 minutos. Las
muestras se trituran con pipetas Pasteur pulidas al fuego, y se
filtran a través de malla estéril de 70 \mum para producir
suspensiones de células individuales. Las células se presiembran en
placas de cultivo de tejidos no recubiertas durante 2 horas, para
eliminar células no neuronales. Las células no adherentes se
siembran a 15.000 células/pocillo en placas de cultivo de 24
pocillos que se habían recubierto con
poli-d-ornitina (Life Technologies)
y laminina (Collaborative Biomedical). Los controles negativos se
cultivan en medio sin suero UltraCULTURE^{TM} (BioWhittaker,
Walkersville, MD) que contiene 2,5 \mug/ml de anticuerpo
policlonal anti-NGF neutralizante de oveja
(Chemicon, Temecula, CA). Los controles positivos tratados con NGF
carecían del anticuerpo policlonal anti-NGF
neutralizante. Se añaden a los cultivos diferentes diluciones de
medio condicionado recogido de células ARPE-19
transducidas con NsG33 o transducidas con GFP, después de
centrifugación y filtración a través de un filtro estéril de 0,4
\mum. Los cultivos se alimentan cada dos días, remplazando los
medios.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de siete días en cultivo, se fijan las
células en formaldehído al 4% en PBS durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Se bloquean previamente las células en suero
de cabra al 4%, NP40 al 0,1% durante 30 minutos a temperatura
ambiente, y se incuban entonces con anti-\betaIII
tubulina de ratón (1:100) durante la noche a 4ºC. Después de lavar
en solución de prebloqueo, los cultivos se incuban con un anticuerpo
secundario anti-murino acoplado a
Cy-3 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después
de un lavado final en solución de prebloqueo, se cuentan las
células de una tira de la parte media de cada pocillo usando óptica
de fluorescencia. Todas las células positivas para
\betaIII-tubulina se puntúan como neuronas, y se
determina la supervivencia por el número de neuronas contadas por
pocillo. Todos los anticuerpos se diluyen en solución de
prebloqueo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos protectores en este ensayo, indican
potencial terapéutico en neuropatías periféricas y dolor
neuropático.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo para efectos de supervivencia en
cultivos de neuronas motoras, se lleva a cabo usando lentivirus que
contienen NsG33, esencialmente como se describe en Cisterni et
al. 200 (J. Neurochem. 74, 1820-1828).
Brevemente, se disecan y se disocian médulas espinales ventrales de
embriones de ratas Sprague Dawley del día embrionario 14,5 (E14,5).
Las neuronas motoras se purifican usando un protocolo basado en la
purificación por inmunoafinidad de neuronas motoras con anticuerpos
contra el dominio extracelular del receptor de neurotrofina, p75,
seguida de distribución de las células usando microperlas magnéticas
(Arce et al. 1999). Se siembran neuronas motoras purificadas
en placas de cultivo de 4 pocillos pre-recubiertos
con poliornitina/laminina a una densidad de 500 células por
pocillo. El medio de cultivo es medio de cultivo Neurobasal (Life
Technologies) suplementado con el complemento B27 (Life
Technologies), suero de caballo (2% en v/v),
L-glutamina (0,5 mM) y
2-mercaptoetanol (25 \muM). Se añade al medio
L-glutamato (25 \muM) durante los primeros 4 días
de cultivo, y se omite subsiguientemente.
Las neuronas motoras cultivadas durante 16
horas, se transducen con un lentivirus que contiene NsG33 preparado
como se describió anteriormente, mediante la adición de solución
madre del virus al medio de cultivo (que corresponde a MOI = 4). Se
transducen cultivos control paralelos con el lentivirus de GFP. Ocho
horas después de la transducción, se reemplaza el medio con medio
fresco (DIV1).
Se cuantifica la supervivencia de las neuronas
motoras en DIV3, contando el número de neuronas grandes de fase
brillante con largas extensiones axonales en un área predeterminada
de 1,5 cm^{2} en el centro de placas por duplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos protectores en este ensayo, indican
potencial terapéutico en enfermedades de neuronas motoras que
incluyen ELA, lesión de médula espinal, AME (atrofia muscular
espinal) y DMD (distrofia muscular de Duchenne).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan cultivos de células mesencefálicas
disociadas como se describió previamente (Friedman y Mytilineou
1987 Neurosci. Lett. 79: 65-72), con modificaciones
menores. Brevemente, se disecan tegumentos mesencefálicos rostrales
de cerebros de embriones de rata Sprague-Dawley, en
los días 13-16 de gestación, bajo el microscopio en
condiciones estériles, se recogen en solución salina de Dulbecco
tamponada con fosfato libre de Ca^{2+} y Mg^{2+} (Gibco,
Gaithersburg, Md.), y se disocian mecánicamente mediante trituración
moderada. Las células se siembran en 100 \mul por pocillo en
placas de cultivo de tejidos de 16 mm de diámetro (Falcon, Lincoln
Park, NJ., placa de 24 pocillos) que contienen 400 \mul de medio,
para dar una densidad de 2,5-3,5x10^{5} células
por pocillo. Las pocillos de cultivo se habían expuesto previamente
a 0,1 mg/ml de solución de poli L-ornitina en
borato de sodio 10 mM, pH 8,4, durante 3 horas a 37ºC, y lavados
tres veces en agua milli-Q y una vez en solución
salina equilibrada de Earle (Gibco). El medio nutritivo (10/10)
consiste en medio esencial mínimo (MEM, Gibco) suplementado con
glucosa (33 mM), bicarbonato de sodio (24,5 mM), glutamina (2 mM),
HEPES (15 mM), penicilina G (5 U/ml), estreptomicina (5 \mug/ml),
suero fetal de ternera inactivado por calor al 10% (Gibco) y suero
de caballo inactivado por calor al 10% (Gibco). Los cultivos se
mantienen a 37ºC en una atmósfera saturada de agua que contiene
CO_{2} al 6,5%. Después de 3 horas, cuando la mayoría de las
células se han adherido al fondo del pocillo, el medio se reemplaza
con 500 \mul de medio fresco. En este momento, se añade a cada
pocillo por duplicado una dilución en serie de la muestra que se va
a ensayar para actividad neurotrófica dopaminérgica (medio
condicionado), y las placas se incuban en el incubador a 37ºC.
Después de una semana, los cultivos se tratan durante 24 horas con
fluorodesoxiuridina (13 \mug/ml) y uridina (33 \mug/ml) para
prevenir la proliferación excesiva de células gliales, y se
alimentan subsiguientemente con el medio anterior sin suero fetal
de ternera. El medio nutritivo se cambia semanalmente.
De forma alternativa, se usa medio sin suero
definido químicamente en el que se reemplaza el suero con una
mezcla de proteínas, hormonas y sales. El medio definido (MD)
consiste en una mezcla de medio nutritivo MEM y F12 (ambos de
Gibco, 1:1; en vol/vol) con glucosa (33 mM), glutamina (2 mM),
NaHCO_{3} (24,5 mM) y HEPES (15 mM), suplementado con
transferrina (100 \mug/ml), insulina (25 \mug/ml), putrescina
(60 \muM), progesterona (20 nM), selenito de sodio (30 nM),
penicilina G (5 U/ml) y estreptomicina (5 \mug/ml). La osmolaridad
del MD se ajusta a 325 mediante la adición de agua
milli-Q (110-125 ml de
H_{2}O/l).
El estado funcional de las neuronas
dopaminérgicas se puede ensayar en estos cultivos, midiendo la
absorción de dopamina a través de transportadores
"depuradores" específicos en las neuronas dopaminérgicas, y
contando el número de neuronas positivas para la enzima de la
síntesis de dopamina, tirosina hidroxilasa, usando
inmunohistoquímica como se describe en Karlsson et al, 2002,
Brain Res. 15 Nov 2002; 955(1-2):
268-80.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de ensayar la actividad neurotrófica
dopaminérgica en los cultivos de células mesencefálicas, todas las
muestras de medio condicionado se desalan de la manera siguiente. Se
añaden 100 \mul del medio 10/10 (como vehículo) a un
Centricon-10 (Amicon), y se dejan reposar durante 10
minutos. Se añaden alícuotas de la muestra que se va a ensayar al
Centricon, seguido de 1 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco
de alto contenido en glucosa, sin bicarbonato, pero conteniendo
HEPES 10 mM, pH 7,2 (solución A), y se centrifugan a 5.000Xg
durante 70 minutos. El material retenido (aproximadamente 0,1 ml) se
lleva de nuevo a 1,1 ml con solución A fresca, y se reconcentra dos
veces. La muestra se filtra a través de una unidad Durapore estéril
Ultrafree-MC de 0,11 \muM (Millipore, Bedford
Mass.), antes de que sea añadida al pocillo de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
La absorción de dopamina tritiada
(^{3}H-DA) se realiza en cultivos en el día 6 o el
día 7 como se describió previamente (Friedman y Mytilineou (1987)
Neurosci. Lett. 79:65-72) con modificaciones
menores, y todas las soluciones se mantienen a 37ºC. Brevemente, el
medio de cultivo se retira, lavando dos veces con 0,25 ml del
tampón de absorción que consiste en tampón fosfato
Krebs-Ringer, pH 7,4, que contiene glucosa 5,6 mM,
EDTA 1,3 mM, ácido ascórbico 0,1 mM y pargilina 0,5 mM, un
inhibidor de monoamina oxidasa. Los cultivos se incuban con 0,25 ml
de ^{3}H-DA 50 nM (New England Nuclear, Boston,
Mass., actividad específica de 36-37 Ci/mmol)
durante 15 minutos a 37ºC. Se detiene la absorción de
^{3}H-DA eliminando la mezcla de incubación, y las
células se lavan entonces dos veces con 0,5 ml del tampón de
absorción. Para liberar la ^{3}H-DA de las
células, los cultivos se incuban con 0,5 ml de etanol al 95% durante
30 minutos a 37ºC, y se añaden entonces a 10 ml de EcoLite (ICN,
Irvine, Calif.), y se cuentan en un contador de centelleo. Se
obtienen los valores blanco añadiendo al tampón de absorción
GBR-12909 0,5 mM (RBI), un inhibidor específico de
la bomba de absorción de alta afinidad de las neuronas de dopamina
(Heikkila et al. 1984 Euro J. Pharmacol. 103:
241-48).
Un incremento en el número de neuronas positivas
para TH y/o un incremento en la absorción de
3H-dopamina, en comparación con un tratamiento
control, es una indicación de una posible función de NsG33 en el
tratamiento de enfermedad de Parkinson.
\vskip1.000000\baselineskip
Se producen vectores pseudotipificados de
VSV-G (rLV) como se describió previamente (Zufferey
et al., 1997, J. Virol, 73: 2886-2892;
Rosenblad et al. In vivo protection of nigral dopamine
neurons by lentiviral gene transfer of the novel
GDNF-family member neublastin/artemin. Mol Cell
Neurosci. Feb de 2000; 15(2): 199-214).
Brevemente, los plásmidos de transferencia pHR'CMV-W
que poseen el ADNc para proteína fluorescente verde (GFP) o NsG33,
se co-transfectan con los plásmidos auxiliares pMD.G
y pCMVDR8.91 en células 293T. Se recogen sobrenadantes que
contienen viriones en los días 2 y 3 después de la transfección, y
se concentran a 116.000 g mediante ultracentrifugación. El título
de la solución madre del vector rLV-GFP es de
1,1x10^{8} U.T./ml, según se determina por dilución en serie del
sobrenadante concentrado en células 293T. El título de las
partículas virales se determina para soluciones madre de los virus
rLV-NsG33 y rLV-GFP, usando una
técnica de transferencia por ranuras de ARN como se describió
previamente (von Schwedler et al. Vif is crucial for human
immunodeficiency virus type 1 proviral ADN synthesis in infected
cells. Virol. Ago de 1993; 67(8): 4945-55), y
de la relación entre el título de U.T. y de las partículas virales
que se obtienen de rLV-GFP, se estima que el título
del vector rLV-NsG33 es de 1,2x10^{8} U.T./ml.
Todos los trabajos que implican animales
experimentales se llevan a según las normas establecidas por el
Comité de Ética para Uso de Animales de Laboratorio de la
Universidad de Lund. Los animales se enjaulan en un ciclo de
luz/oscuridad de 12:12 horas con acceso a pienso para ratas y agua.
Se usan ratas hembras Sprague Dawley (\sim220 g al tiempo de la
cirugía). Para la cirugía estereotáxica, se anestesia a los animales
usando halotano, y se inyecta un total de dos microlitros de
rLV-GFP (n = 8) o rLV-NsG33 de una
solución madre viral 1:2 (1,0-1,2 x 10^{5} U.T.)
en dos tractos en el cuerpo estriado derecho en las siguientes
coordenadas: (1) AP = +1,0 mm, ML = -2,6 mm, DV = -5,0 y -4,5 mm,
Tb = 0,0 y (2) AP = 0,0 mm, ML = -3,7 mm, DV = -5,0 y -4,5 mm, Tb =
0.0. Después de dos semanas, se anestesia de nuevo a los animales, y
se colocan en una estructura estereotáxica. Se aplica una inyección
de 6-hidroxidopamina (20 \mug [calculada como la
base libre] por 3 \mul de vehículo [solución salina con ácido
ascórbico al 0,2%] en el cuerpo estriado derecho, en las siguientes
coordenadas: AP = +0.5 mm, ML = -3,4 mm, DV = -5,0 y -4,5 mm, Tb =
0,0.
Cuatro semanas después de la lesión, se
anestesia profundamente a los animales con pentobarbital (70 mg/kg,
Apoteksbolaget, Suecia), y se perfunde transcardiacamente a los
mismos con 50 ml de solución salina a temperatura ambiente, seguido
de 200 ml de paraformaldehído al 4% tamponado con fosfato enfriado
en hielo (pH 7,2-7,4). Los cerebros se fijan
posteriormente durante 3-6 horas en el mismo
fijador, se transfieren a sacarosa al 30% durante 24 horas, y se
cortan en 6 series de secciones de 40 \mum de espesor en un
micrótomo de congelación.
Se realiza inmunohistoquímica para detección de
tirosina hidroxilasa inmunorreactiva en la sustancia negra, como se
describió previamente (Rosenblad et al. In vivo protection of
nigral dopamine neurons by lentiviral gene transfer of the novel
GDNF-family member neublastin/artemin. Mol Cell
Neurosci. Feb de 2000; 15(2): 199-214). Se
evalúa el número de neuronas TH-IR y
VMAT-IR de la sustancia negra contando bajo el
microscopio todas las neuronas inmunorreactivas laterales al núcleo
terminal medio de la vía óptica accesoria en tres secciones
consecutivas a través del SN, como se describió previamente (Sauer y
Oertel, 1994, Neuroscience 59: 401-15).
Un incremento en el número de
TH-IR en comparación con el control de GFP, es una
fuerte indicación de una función en el tratamiento de enfermedad de
Parkinson. Un incremento en el número de VMAT-IR
refuerza además la conclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los siguientes iniciadores para PCR en
tiempo real:
mNsG33:
mNsG33 intronspan 284 pb 5': | 5'-GTCTTCGCTGAACGTATGAC-3' |
mNsG33 intronspan 623 pb 3': | 5'-CTGATTCTTGCAGCTCTGTG-3' |
\vskip1.000000\baselineskip
GAPDH:
mGAPDH-s904: | 5'-AACAGCAACTCCCACTCTTC-3' |
mGAPDH-as1067: | 5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3'. |
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló tejido de diferentes regiones del
cerebro de ratones adultos y en desarrollo, y se preparó ARN por
extracción con Trizol. Se realizó tratamiento subsiguiente con DNasa
en columna usando columnas de centrifugación RNeasy para eliminar
trazas de ADNg, y para limpiar además el ARN. Se usaron como molde
alícuotas de 2,5 \mug de ARN para la síntesis de ADNc con una
transcriptasa inversa deficiente en RNasa H derivada de MoMLV
(Superscript) y cebador poli-dT. Se sintetizó al
mismo tiempo el ADNc de todas las muestras usando la misma mezcla
maestra para evitar variaciones. El volumen final de la reacción de
ADNc fue 120 \mul, que se almacenó en alícuotas a -80ºC para
evitar congelación y descongelación repetidas. Para analizar la
expresión de NsG33 en el desarrollo en médula espinal (ME) en
desarrollo, se prepararon moléculas de ADNc derivadas de tejidos de
embriones de 10,5, 11,5 y 13,5 días (E10,5, E11,5 y E13,5,
respectivamente), además de tejidos de ratones adultos. Se analizó
la regulación de la expresión de NsG33 en el desarrollo en el
cerebelo (Cb) y corteza (CTX), usando ADNc derivadas de tejido de P1
y adulto.
Para el análisis de expresión en PCR en tiempo
real, se usaron como molde aproximadamente 20 ng de cada ADNc. La
PCR en tiempo real se realizó en un termociclador
Opticon-2 (MJ Research), usando el kit
LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I
(Roche). Se llevaron a cabo estudios por duplicado usando los
cebadores descritos anteriormente. Para la PCR en tiempo real, se
preparó una curva patrón mediante dilución en serie de un producto
de PCR purificado en gel, preparado usando los cebadores anteriores.
La curva patrón se usó para verificar que los valores de punto de
cruce (C_{T}) de todas las muestras estuvieran dentro del
intervalo exponencial de la reacción de PCR, y para calcular los
niveles de expresión finales. Todas las amplificaciones por PCR en
tiempo real se llevaron a cabo en un volumen total de 10 \mul que
contenía MgCl_{2} 3 mM, sacarosa al 12% y tampón de reacción 1x
incluido en el kit LightCycler. El perfil del ciclo de la PCR
consistió de un paso de pre-desnaturalización de 10
minutos a 98ºC y 35 ciclos de tres pasos a 98ºC durante 10 segundos,
a 62ºC (mGAPDH) ó 60ºC (mNsG33) durante 20 segundos y a 72ºC
durante 20 segundos. Después del paso de extensión de cada ciclo,
se añadió un paso de lectura de placa (80ºC, 2 segundos) para
cuantificar los productos de PCR recién formados. La especificidad
de la reacción de amplificación se determinó realizando un análisis
de curva de fusión de los fragmentos de PCR, elevando lentamente la
temperatura de 52ºC a 95ºC con adquisición continua de datos.
Para propósitos de normalización, todos los ADNc
se sometieron a PCR en tiempo real usando cebadores para el gen de
mantenimiento GAPDH. El análisis de GAPDH por PCR en tiempo real, se
llevó a cabo de igual manera que para los genes objetivo. El patrón
de expresión de mantenimiento se determinó a partir de las curvas
patrones respectivas, y los niveles de expresión relativa se usaron
para normalizar los niveles de expresión de los genes objetivo en
los tejidos que se analizaron. Después de la normalización con
GAPDH, se calcularon los niveles de expresión relativa de los genes
objetivo usando como referencia el tejido con la expresión más
baja.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión relativa de GAPDH varió no más que
entre 1,0 y 1,3 entre las diferentes edades y tejidos lo que muestra
que GAPDH podría usarse para normalización.
Los resultados de PCR en tiempo real para NsG33
de ratón, se muestran en las figuras 10A y 10B. Los valores de
C_{T} variaron de 17 a 22. De la figura 10A, es evidente que la
expresión de NsG33 se regula durante el desarrollo de la médula
espinal, alcanzando un máximo alrededor de E11,5. De la figura 10B,
es evidente que NsG33 se regula durante el desarrollo
post-natal en cerebelo, pero no en corteza.
NsG33 es una molécula secretada que está
altamente conservada a través de las especies, con características
de un factor de crecimiento u hormona con un patrón de expresión que
en combinación con sus otras características, predice fuertemente un
uso terapéutico para el tratamiento de trastornos neurológicos.
El patrón de expresión temporal en médula
espinal indica una función en proliferación, diferenciación y/o
supervivencia de los progenitores neurales en esta región del SNC.
Esto es de relevancia terapéutica consistente para el tratamiento
de enfermedades neurodegenerativas y lesiones en la médula espinal,
que incluyen lesión de médula espinal, ELA y atrofia muscular
espinal. Además, este perfil de expresión indica un potencial como
reactivo in vitro para expansión y/o diferenciación de
progenitores neurales derivados de la médula espinal.
El aumento de la expresión de NsG33 en el
cerebelo del adulto, indica un papel para este factor en el
mantenimiento y/o supervivencia de uno o más tipos de células
cerebelares. Esto es consistente con la relevancia terapéutica para
trastornos cerebelares que incluyen, pero no están limitados a,
ataxia sensitiva, esclerosis múltiple, trastornos espinocerebelares
neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelares (tales
como atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de
Shy-Drager (atrofia de sistemas múltiples)), y
alcoholismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron células que secretan hNsG33,
transduciendo células ARPE-19 con una construcción
lentiviral que contiene ADNc de hNsG33,
LV-sC.NsG33.W. Brevemente, se sembraron células en
placas de 6 pocillos al 50-70% de confluencia
(1x10^{5} células/pocillo) en medio DMEM/F12 (1:1) suplementado
con SFT al 10%. Después de una incubación la noche anterior, se
añadió a las células polibreno (5 \mug/ml) y virus. Al día
siguiente, las células se pasaron a botellas T25. Se congelaron
alícuotas de células transducidas después de un pase adicional.
Para recoger medio condicionado de los cultivos
de células ARPE-19 transducidas y parentales
(control), se sembraron células en botellas T25. Después de 4 días
de incubación, se cambiaron los cultivos a medio HSC sin suero.
Después de otras 24 horas, los medios condicionados de células
ARPE-19 control y NsG33 se recogieron, y se
procesaron mediante centrifugación a 3000x g durante 5 minutos antes
de su adición a los cultivos de hNS1.
\vskip1.000000\baselineskip
hNS1 (anteriormente llamada HNSC.100), es una
línea de células clonales embrionarias multipotentes derivadas del
prosencéfalo de células madre neurales, que se ha descrito
previamente (Villa et al., Exp Neurol, 2000, 161(1):
67-84). Villa et al 2004, Exp Cell Res. 1
Abr; 294(2): 559-70). Se obtuvieron células
de Alberto Martínez Serrano, Departamento de Biología Molecular,
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Universidad Autónoma de
Madrid-CSIC, Campus de Cantoblanco, Madrid, 28049,
España. Se expandieron cultivos de células hNS1 en botellas TC
recubiertas de poli-L-lisina con
CO_{2} al 5% y 37ºC, en medio HSC sin suero suplementado con 20
ng/ml de EGF y bFGF. El medio HSC consistía de medio DMEM/F12 (1:1)
suplementado con N_{2} y BSA al 1%. Para experimentos de
diferenciación, se sembraron células hNS1 sobre cubreobjetos
pre-recubiertos con 50 \mug/ml de
poli-lisina en medio HSC sin mitógeno que contenía
SBF al 0,5% a una densidad de 10^{5} células/cm^{2}. Un día
después de la siembra, se cambió el medio de diferenciación a medio
condicionado al 100% recogido de células ARPE-19
parentales (Mc C) o células ARPE-19 transducidas con
hNsG33 lentiviral (Mc 33). Un cultivo control recibió medio HSC no
condicionado. Se reemplazaron dos terceras partes del medio al día
siguiente, y después cada dos o tres días. Cuatro días después de la
siembra, los cultivos se fijaron durante 10 minutos en
paraformaldehído al 4%, y se tiñeron mediante
inmunohistoquímica.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de bloquear en suero normal de caballo
al 10%, se incubaron los cultivos con anticuerpos primarios para
GFAP (anticuerpo policlonal anti-vaca de conejo,
1:1000, DAKO) y \beta-tubulina (anticuerpo
monoclonal, clon SCL: 3D10, 1:1000, Sigma). Después de lavar, los
cultivos se incubaron con anticuerpos secundarios biotinilados,
anti-ratón de caballo (Vector Laboratories, 1:200),
seguido de detección usando Strep-Cy3 (Jackson
InmunoResearch, 1/200), y anti-conejo de cabra
marcado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, 1:200),
respectivamente. Los núcleos de las células se contratiñeron con
Hoechst 33258 0,2 \mug/ml (Villa et al., 2004). Para el
análisis, se contó el número total de células (núcleos) además de
las células positivas para GFAP y \beta-tubulina,
por microscopía confocal usando un objetivo de 63x.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la figura 11A, la adición de
medio condicionado de células ARPE-19 transducidas
con una construcción lentiviral que contenía ADNc de hNsG33 (Cm
33), incrementó el porcentaje de neuronas positivas para
\beta-III-tubulina un 73% respecto
a cultivos control (hNS1), mientras que el medio condicionado de
células ARPE-19 control (Cm C) no tuvo efecto
alguno. El incremento observado con medio Cm 33 respecto tanto
medio de hNS1 como medio Cm C, fue estadísticamente significativo en
una prueba t (P<0,05).
Los medios condicionados de células
ARPE-19 transducidas con NsG33, parecieron también
incrementar significativamente el número de células gliales
positivas para GFAP en comparación con el medio de hNS1 (17 frente
al 11%, respectivamente). Sin embargo, se observó un incremento
similar con medio condicionado control (Cm C) (16 frente al 11%,
respectivamente), aunque este no fue estadísticamente
significativo. La adición de medio condicionado de células
ARPE-19 control (Cm C) y células
ARPE-19 transducidas con una construcción lentiviral
que contenía ADNc de hNsG33, no alteró significativamente el número
total de células como se muestra en la figura 11B.
El número neuronal incrementado puede resultar
de diferenciación incrementada de células progenitoras neuronales
presentes en los cultivos, y/o un efecto de supervivencia sobre las
neuronas diferenciadas. Estos datos son consistentes con un
potencial neuroprotector y regenerativo de NsG33.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon medios condicionados de células
ARPE-19 y HEK293T transfectadas transitoriamente con
una construcción de expresión que contenía ADNc de hNsG33
(pHsC.NsG33.W), además de células ARPE-19 y HEK293T
transfectadas control.
Se sembraron células ARPE-19 en
placas de 6 pocillos (1x10^{5} células/pocillo) en medio DMEM:F12
(1:1) suplementado con SFT al 10%. Después de incubar durante la
noche, las células se transfectaron con Fugene usando 3 \mug de
ADN/pocillo según las instrucciones del fabricante (Roche).
Se sembraron células HEK293T en placas de 6
pocillos (3x10^{5} células/pocillo) en medio DMEM suplementado con
SFT al 10%. Después de incubar durante la noche, las células se
transfectaron con Lipofectamine+ usando 2 \mug de ADN/pocillo
según las instrucciones del fabricante (Invitrogen).
El día después de la transfección, se cambió el
medio a medio DMEM:F12 sin suero. Después de 24 horas de
condicionamiento, se recogieron los medios de las células
transfectadas, y se procesaron mediante centrifugación a 300Ox g
durante 5 minutos. Los medios condicionados clarificados se
diluyeron con DMEM:F12 (6:16) antes de su adición a los cultivos
estriatales. La expresión del ARNm de NsG33 se analizó por
RT-PCR cuantitativa usando cebadores específicos
para el ADNc de hNsG33.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó ARN total de los cultivos
transfectados por extracción con Trizol, seguido de tratamiento con
DNasa en columna usando columnas de centrifugación RNeasy para
eliminar las trazas de ADNg y para limpiar además el ARN. Se
sintetizó el ADNc usando transcriptasa inversa, y cada ADNc que
correspondía a aproximadamente 20 ng de ARN total se usó como molde
para el análisis de expresión por PCR en tiempo real con cebadores
de hNsG33 como se describe en el ejemplo 5.
Para propósitos de normalización, todos los ADNc
se sometieron a PCR en tiempo real usando los cebadores 4842 y 4843
para el gen de mantenimiento GAPDH [4842:
5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3' y 4843:
5'-GATCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3'].
Después de normalización con GAPDH, se calcularon los niveles de
expresión relativa de los genes objetivo usando muestras de ADNc con
la expresión de hNsG33 más baja como referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon cultivos de células del cuerpo
estriado embrionario de rata, esencialmente como se describió
previamente (Nakao et al., 1996 Exp. Neurol. 138,
144-157). Brevemente, las eminencias ganglionares
lateral y media se disecaron selectivamente de embriones de rata de
E14,5 (Sprague-Dawley, B&K Universal, Suecia).
Se incubaron trozos de tejido con tripsina/DNasa a 37ºC, se lavaron
y se disociaron mecánicamente. Las células disociadas se sembraron
en portaobjetos con cámara de cuatro pocillos (100.000
células/cm^{2}) pre-recubiertos con 50 \mug/ml
de poli-l-lisina y 10 \mug/\mul
de laminina en medio DMEM suplementado con HEPES 15 mM, piruvato de
sodio 1 mM y SFT al 10%. Después de 2 días in vitro, se
cambió el medio a DMEM:F12 (1:1) sin suero suplementado con HEPES
1,5 mM, piruvato de sodio a 1 mM y B27 (1:50), no condicionado o
condicionado por células HEK293T o ARPE-19
transfectadas control o transfectadas con NsG33 generadas como se
describió anteriormente. Después de 4 días de incubación en medio
sin suero, los cultivos se procesaron para inmunohistoquímica.
\vskip1.000000\baselineskip
Brevemente, se fijaron cultivos de células
durante 20 minutos en paraformaldehído al 4%. Después de preincubar
en suero de bloqueo al 5%, los cultivos se incubaron durante la
noche a temperatura ambiente con anticuerpo
anti-\beta-III-tubulina
(Sigma, 1:333). Después de lavar, los cultivos se incubaron con
anticuerpo secundario anti-ratón de asno conjugado
con FITC (1:200, Jackson Lab) durante dos horas, a temperatura
ambiente. Los núcleos de las células se contratiñeron con DAPI.
Para el análisis, se contó el número total de células (núcleos) y
el número de células positivas para
\beta-III-tubulina en 16 campos
aleatorios por condición (número total de células promedio = 260),
usando el aumento de 40x.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión del ARNm de hNsG33 en cultivos
transfectados transitoriamente, se confirmó usando transcripción
inversa-PCR cuantitativa. En cultivos de HEK293T
transfectadas transitoriamente con pHsC.NsG33.W, se determinaron
mediante qRT-PCR niveles normalizados del ARNm de
hNsG33 40-6000 veces mayores que en cultivos no
transfectados. También en cultivos de células
ARPE-19 transfectadas, se detectó un nivel mayor de
ARNm de hNsG33 (30-35 veces el nivel control en
cultivos transfectados control).
Como se muestra en la figura 12, la adición de
medios condicionados de células ARPE-19
transfectadas con una construcción de expresión que contenía ADNc
de hNsG33, incrementó el porcentaje de neuronas positivas para
\beta-III-tubulina con el 49% en
los cultivos estriatales, respecto a cultivos que recibieron medio
condicionado de células ARPE-19 transfectadas
control (48% frente al 32%). El incremento fue estadísticamente
significativo en una prueba t (P<0,05).
Similarmente, se observó un incremento
estadísticamente significativo del 34% en el porcentaje de neuronas
en cultivos que recibieron medio condicionado de células HEK293T
transfectadas con la construcción de hNsG33 respecto a cultivos
HEK293T transfectados control (50% frente al 37%).
No se observó ningún efecto de la adición de
medios condicionados de cualquiera de los cultivos transfectados
controles respecto a cultivos control que recibieron medio no
condicionado (UCM). El incremento en el porcentaje de células
neuronales no se debió a un incremento en el número total de células
determinado contando núcleos teñidos con DAPI, sino un número
incrementado de neuronas en los cultivos que recibieron medios que
contenían hNsG33. El número incrementado de células neuronales
puede resultar de diferenciación incrementada de células
progenitoras neuronales presentes en los cultivos, y/o un efecto de
supervivencia sobre las neuronas estriatales diferenciadas. Estos
datos son consistentes con el efecto neuroprotector y regenerativo
general de NsG33, y específicamente, un potencial terapéutico de
NsG33 en enfermedad de Huntington.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> NsGene A/S
\hskip1cmNordahl Petersen, Thomas
\hskip1cmBlom, Nikolaj
\hskip1cmGrønborg, Mette
\hskip1cmKusk, Philip
\hskip1cmJohansen, Teit
\hskip1cmWahlberg, Lars
\hskip1cmBrunak, Søren
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso terapéutico de un factor de
crecimiento, NSG33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
522-204-WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DK PA 2004 00510
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-03-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DK PA 2004 00843
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
28-05-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/575,086
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
28-05-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2508
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (118)..(999)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(78)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, ó t
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1048
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(886)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(66)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, ó t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1026
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(876)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 275
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Potencialmente parte de péptido
señal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Potencialmente parte de péptido
señal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Potencialmente parte de péptido
señal
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (84)..(959)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (51)
1. Uso de
- i)
- un polipéptido aislado que comprende
- a)
- una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID No. 4;
- b)
- una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos, en donde la variante tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No. 4; o
- c)
- un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b), teniendo dicho fragmento por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4 en un intervalo de solapamiento de por lo menos 50 aminoácidos,
- \quad
- en donde la actividad biológica es neuroprotección, supervivencia de neuronas, neurogénesis y/o proliferación de precursores neuronales,
- ii)
- una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido como el que se define en i) o una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido como el que se define en i),
- iii)
- un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico como la que se define en ii),
- iv)
- una composición de células huésped, en donde dichas células se transforman o transducen con el vector como se define en iii), siempre que no se incluya el uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales,
- v)
- una línea de células de empaquetamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico como se define en ii), o
- vi)
- un dispositivo de células biocompatible implantable, en donde dicho dispositivo comprende:
- a)
- una membrana semipermeable que permite la difusión de un polipéptido como el que se define en i) y/o un vector viral; y
- b)
- una composición de células como la que se define en iv), o una línea de células de empaquetamiento como se define en v),
- \quad
- para la preparación de un medicamento, es donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño del sistema nervioso, en donde se han perdido o dañado las células neurales.
2. El uso de la reivindicación 1, en donde el
polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona
del grupo que consiste en SEQ ID Nos. 3, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15,
19, 20, 21, 22, 23 y 24.
3. El uso de la reivindicación 1, en donde el
polipéptido tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con
la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 3, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más
preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una
proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 3.
4. El uso de la reivindicación 1, en donde el
polipéptido tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con
la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 4, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más
preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una
proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 4.
5. El uso de la reivindicación 1, en donde el
polipéptido tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con
la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 5, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más
preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una
proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 5.
6. El uso como de la reivindicación 1, en donde
el polipéptido tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia
con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 19, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más
preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una
proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 19.
7. El uso de la reivindicación 1, en donde el
polipéptido tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con
la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 22, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más
preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una
proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 22.
8. El uso de la reivindicación 1, en donde el
fragmento se selecciona del grupo que consiste en:
- i)
- AA_{30}-AA_{288} de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{25}-AA_{293} de SEQ ID No. 3;
- ii)
- AA_{28}-AA_{286} de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{23}-AA_{291} de SEQ ID No. 13;
- iii)
- AA_{31}-AA_{289} de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{26}-AA_{294} de SEQ ID No. 8; y
- iv)
- variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 20 de los residuos de aminoácido en la secuencia.
9. El uso de la reivindicación 1, en donde el
fragmento se selecciona del grupo que consiste en:
- i)
- AA_{171}-AA_{288} de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{165}-AA_{288} de SEQ ID No. 3;
- ii)
- AA_{169}-AA_{286} de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{164}-AA_{291} de SEQ ID No. 13;
- iii)
- AA_{172}-AA_{289} de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{167}-AA_{294} de SEQ ID No. 8; y
- iv)
- variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia.
10. El uso de la reivindicación 1, en donde el
fragmento se selecciona del grupo que consiste en:
- i)
- AA_{30}-AA_{118} de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{25}-AA_{123} de SEQ ID No. 3;
- ii)
- AA_{28}-AA_{116} de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{23}-AA_{121} de SEQ ID No. 13;
- iii)
- AA_{31}-AA_{119} de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{26}-AA_{124} de SEQ ID No. 8; y
- iv)
- variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia.
11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en donde el polipéptido es capaz de formar por lo menos
un puente intramolecular de cisteína.
12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en donde el polipéptido comprende un dímero de NsG33
unido a través de un puente intermolecular de cisteína.
13 El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido comprende
adicionalmente una etiqueta de afinidad, tal como una etiqueta de
polihistidina, una etiqueta de GST, una etiqueta de HA, una etiqueta
Flag, una etiqueta C-myc, una etiqueta de HSV, una
etiqueta V5, una etiqueta de proteína de unión a maltosa, una
etiqueta de dominio de unión a celulosa.
14. El uso de la reivindicación 1, en donde la
molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo que consiste en:
- a)
- la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18;
- b)
- una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18;
- c)
- una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18;
- d)
- el complemento de un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18 en condiciones muy severas; y
- e)
- la secuencia de ácido nucleico del complemento de cualquiera de los anteriores.
15. El uso de la reivindicación 1, en donde la
molécula de ácido nucleico tiene por lo menos el 70%, más
preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo
menos el 80%, preferiblemente por lo menos el 85%, más
preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad
de secuencia con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del
grupo que consiste en los nucleótidos 187-996 de SEQ
ID No. 2, nucleótidos 74-883 de SEQ ID No. 7 y
nucleótidos 64-873 de SEQ ID No. 12.
16. El uso de la reivindicación 1, en donde la
molécula de ácido nucleico tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia
de SEQ ID No. 1, más preferiblemente por lo menos el 75%, más
preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más
preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID
No. 1.
17. El uso de la reivindicación 1, en donde la
molécula de ácido nucleico tiene por lo menos el 70% de identidad de
secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia
de SEQ ID No. 2, más preferiblemente por lo menos el 75%, más
preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo
menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más
preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID
No. 2.
18. El uso de la reivindicación 1, en donde la
molécula de ácido nucleico es una variante entremezclada entre SEQ
ID No. 2 y 7 y/o 12.
19. El uso de la reivindicación 1, en donde el
vector comprende adicionalmente un promotor operativamente unido a
la molécula de ácido nucleico.
20. El uso de la reivindicación 19, en donde el
promotor se selecciona del grupo que consiste en: CMV, UbiC humano,
JeT, RSV, promotor regulable por Tet,
Mo-MLV-LTR, Mx1 y
EF-1alfa.
21. El uso de la reivindicación 1, en donde el
vector se selecciona del grupo que consiste en vectores derivados de
la familia Retroviridae que incluye lentivirus, VIH, SIV, FIV, EAIV
y CIV.
22. El uso de la reivindicación 1, en donde el
vector se selecciona del grupo que consiste en alfavirus,
adenovirus, virus adenoasociados, baculovirus, HSV, coronavirus,
virus del papiloma bovino y Mo-MLV, preferiblemente
virus adenoasociados.
23. El uso de la reivindicación 1, en donde la
célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células de
E. coli, levadura, Saccharomyces cerevisiae,
Aspergillus y Sf9 de insecto.
24. El uso de la reivindicación 1, en donde la
célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células
epiteliales pigmentadas retinianas inmortalizadas, tales como
células ARPE-19, fibroblastos humanos inmortalizados
y astrocitos humanos inmortalizados.
25. El uso de la reivindicación 24, en donde la
célula huésped está unida a una matriz.
26. El uso de la reivindicación 24, en donde la
célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células
madre, incluyendo células madre o precursoras neurales humanas,
células madre o precursoras gliales humanas y células madre
fetales.
27. El uso de la reivindicación 24, en donde la
célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células CHO,
CHO-K1, HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b y
BHK.
28. El uso de la reivindicación 1, en donde la
línea de células de empaquetamiento es capaz de producir una
partícula viral infecciosa, comprendiendo dicha partícula viral un
genoma derivado de Retroviridae que comprende una LTR retroviral 5',
un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un promotor
operativamente unido a una secuencia de polinucleótidos que codifica
un polipéptido como el que se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, un origen de síntesis de segunda cadena de
ADN y una LTR retroviral 3'.
29. El uso de la reivindicación 28, en donde el
genoma deriva de lentivirus y las LTR son lentivirales.
30. El uso de la reivindicación 1, en donde la
membrana semipermeable es inmunoaisladora.
31. El uso de la reivindicación 1, en donde la
membrana semipermeable es microporosa.
32. El uso de la reivindicación 1, en donde el
dispositivo comprende adicionalmente una matriz dispuesta dentro de
la membrana semipermeable.
33. El uso de la reivindicación 1, en donde el
dispositivo comprende adicionalmente un ancla de atadura.
34. El uso de la reivindicación 1, en donde
dicho dispositivo comprende un núcleo que comprende células de
empaquetamiento vivas que secretan un vector viral para la infección
de una célula objetivo, en donde el vector viral es un retrovirus,
comprendiendo el vector un gen heterólogo que codifica un
polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a
12, operativamente unido a un promotor que regula la expresión de
dicho polipéptido en la célula objetivo; y una cubierta externa que
rodea a dicho núcleo, comprendiendo dicha cubierta un material
biocompatible permeable, teniendo dicho material una porosidad
seleccionada para permitir el paso de vectores retrovirales de
aproximadamente 100 nm de diámetro a través del mismo, permitiendo
la liberación de dicho vector viral de dicha cápsula.
35. El uso de la reivindicación 34, en donde el
núcleo comprende adicionalmente una matriz, estando inmovilizadas
las células de empaquetamiento por la matriz.
36. El uso de la reivindicación 34, en donde la
cubierta comprende un hidrogel o material termoplástico.
37. El uso de la reivindicación 1, en donde
dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad,
trastorno o daño que implica lesión al cerebro, tronco encefálico,
médula espinal y/o nervios periféricos que incluye, pero no está
limitado a afecciones tales como apoplejía, lesión cerebral
traumática, lesión de médula espinal, lesión axonal difusa,
epilepsia, neuropatía, neuropatía periférica y dolor asociado.
38. El uso como el que se reclama en la
reivindicación 1, en donde el trastorno del sistema nervioso implica
degeneración de neuronas y sus extensiones en el cerebro, tronco
encefálico, la médula espinal y/o los nervios periféricos que
incluye, pero no está limitado a enfermedad de Parkinson, enfermedad
de Alzheimer, demencia senil, enfermedad de Huntington, esclerosis
lateral amiotrófica y lesión neuronal asociada con esclerosis
múltiple.
39. El uso de la reivindicación 38, en donde la
enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Parkinson.
40. El uso de la reivindicación 38, en donde la
enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Huntington.
41. El uso de la reivindicación 38, en donde la
enfermedad neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica.
42. El uso de la reivindicación 1, en donde el
trastorno del sistema nervioso es una enfermedad, trastorno o daño
que implica disfunción y/o pérdida de neuronas en el cerebro, tronco
encefálico, la médula espinal, y/o nervios periféricos que incluye,
pero no está limitado a afecciones causadas por enfermedades
metabólicas, deficiencia nutricional, lesión tóxica, cáncer y/o
afecciones genéticas o idiopáticas que incluyen, pero no están
limitadas a diabetes, disfunción renal, alcoholismo, quimioterapia,
agentes químicos, toxicomanía, deficiencia de vitaminas e
infección.
43. El uso de la reivindicación 42 ó 37, en
donde la enfermedad es neuropatía periférica y dolor asociado.
44. El uso de la reivindicación 1, en donde el
trastorno del sistema nervioso es una enfermedad, trastorno o daño
que implica degeneración o esclerosis de células gliales tales como
oligodendrocitos, astrocitos y células de Schwann en el cerebro,
tronco encefálico, la médula espinal y los nervios periféricos que
incluye, pero no está limitado a esclerosis múltiple, neuritis
óptica, esclerosis cerebral, encefalomielitis
post-infecciosa y epilepsia.
45. El uso de la reivindicación 44, en donde la
enfermedad o trastorno es esclerosis múltiple, ataxia sensitiva,
trastornos espinocerebelares neurodegenerativos, ataxia hereditaria,
atrofias cerebelares y alcoholismo.
46. El uso de la reivindicación 1, en donde el
trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso implica la retina,
fotorreceptores y nervios asociados que incluye, pero no está
limitado a retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma y
retinopatía diabética.
47. El uso de la reivindicación 1, en donde el
trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso implica el
epitelio sensitivo y ganglios asociados del complejo
vestibuloacústico que incluye, pero no está limitado a pérdida de la
audición inducida por ruido, sordera, acúfenos, otitis,
laberintitis, atrofias hereditaria y cocleovestibular y enfermedad
de Meniere.
48. Un método in vitro para prevenir la
apoptosis en una célula neuronal de mamífero, comprendiendo dicho
método exponer dicha célula neuronal a un polipéptido como el que se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde dicho
método no incluye el uso de embriones humanos con fines industriales
o comerciales.
49. Un método in vitro para mejorar la
supervivencia de una célula neuronal de mamífero, comprendiendo
dicho método exponer dicha célula neuronal a un polipéptido como el
que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde
dicho método no incluye el uso de embriones humanos con fines
industriales o comerciales.
50. Un método in vitro para generar una
neurona, comprendiendo dicho método exponer una célula precursora
neuronal o una célula madre neuronal a un polipéptido como el que se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde dicho
método no incluye el uso de embriones humanos con fines industriales
o comerciales.
51. Un método in vitro para expandir una
composición de células de mamífero, que comprende administrar a
dicha composición el polipéptido como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22; o transducir/transfectar las células con el
vector de expresión como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 44, en donde dicho método no incluye el uso de
embriones humanos con fines industriales o comerciales.
52. Un método in vitro para diferenciar
una composición de células neuronales de mamífero, que comprende
administrar a dicha composición el polipéptido como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22; o transducir/transfectar
las células con el vector de expresión como se define en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 44, en donde dicho método no incluye el
uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales.
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