MXPA06011339A

MXPA06011339A - Uso terapeutico de un factor de crecimiento, nsg33.

Info

Publication number: MXPA06011339A
Application number: MXPA06011339A
Authority: MX
Inventors: Nikolaj Blom; Mette Gronborg; Philip Kusk; Lars Wahlberg; Thomas Nordahl Petersen; Teit E Johansen; Soren Brunak
Original assignee: Nsgene As
Priority date: 2004-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2006-12-15
Also published as: KR101204286B1; EP2289911A3; EP2075254A1; EP1745069B1; JP5010464B2; US20120184492A1; CA2561577A1; DK1745069T3; AU2005229434A1; EP1745069A2; JP2007530064A; JP5514243B2; DE602005014354D1; KR20070012664A; ATE430763T1; WO2005095450A2; HK1102598A1; BRPI0509278A; US20070275026A1; ES2326670T3

Abstract

La presente invencion se refiere al campo del uso terapeutico de proteinas, genes y celulas; mas especificamente, la invencion se refiere a terapia basada en la funcion biologica de una proteina terapeutica secretada, NsG33, en particular para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso; NsG33 es un factor de supervivencia y crecimiento nerviosos con efectos antiapoptoticos sobre una linea de celulas con potencial neuronal y con efectos neuroprotectores y/o de neurogenesis sobre una linea de celulas precursoras neurales y sobre cultivos estriatales primarios; la invencion se refiere tambien a fragmentos del polipeptido de NsG33 bioactivos novedosos, y las secuencias de ADN codificantes correspondientes.

Description

TECNICA ANTECEDENTE Las proteínas extracelulares desempeñan funciones importantes, entre otras cosas, en ia formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, crecimiento que incluye proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, es gobernado típicamente por información recibida de otras células y/o el medio ambiente inmediato. Esta información es transmitida con frecuencia por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por receptores celulares o proteínas unidas a membrana diversos. Estos polipéptidos secretados o moléculas de señalización pasan normalmente a través de la vía secretoria celular para llegar a su sitio de acción en el ambiente extracelular. Trastornos tales como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y múltiple, apoplejía, esquizofrenia, epilepsia y neuropatía periférica y dolor asociado, afectan a millones de personas. Es la pérdida de la función neuronal normal, que produce los déficits funcionales y físicos que son característicos de cada uno de los diferentes trastornos neurológicos. Además de trastornos neurodegenerativos crónicos y agudos, el proceso de envejecimiento, trauma físico al sistema nervioso y trastornos metabolicos, pueden resultar en la pérdida, disfunción o degeneración de células neurales acompañadas de los déficits funcionales y físicos asociados. Muchas de estas enfermedades son hoy en día incurables, altamente debilitantes, y las farmacoterapias tradicionales fallan con frecuencia. Existe de esta manera una gran necesidad médica de nuevas proteínas terapéuticas que sean modificadoras de la enfermedad, y no sólo para uso sintomático. Varios factores secretados con expresión en el sistema nervioso o áreas objetivo asociadas, tienen usos terapéuticos importantes en varias indicaciones neurológicas asociadas con la reducción o pérdida de funciones neuronales. Por ejemplo, el NGF es un candidato para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer, Neublastin (Artemin) un candidato para el tratamiento de neuropatía periférica, y el GDNF es un candidato para el tratamiento de enfermedad de Parkinson.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado para uso médico, dicho polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21 , 22, 23 y 24; b) una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23 y 24, en donde la variante tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No.; y c) un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b). Los presentes inventores han encontrado que NsG33 es una proteína secretada con características de factor de crecimiento, que se expresa a altos niveles y selectivamente en el sistema nervioso y el ojo, y especialmente en la sustancia negra, el putamen y la médula espinal, así como en el mesencéfalo del embrión humano en desarrollo. Además, los presentes inventores han encontrado que NsG33 es capaz de proteger a una línea de células neuronales de la muerte celular apoptótica (ejemplo 6). La muerte celular apoptótica contribuye a la pérdida de células neuronales en el sistema nervioso del adulto, causando varios trastornos neurológicos tales como apoplejía isquémica, enfermedades neurodegenerativas o traumas cerebrales (Becker'y Bonni, Prog Neurobiol. 2004 ene; 72(1 ): 1-25). NsG33 ha mostrado también efectos neuroprotectores en dos pruebas basadas en la generación de neuronas y astrocitos de una línea de células progenítoras neurales humanas y de un cultivo primario de células estriatales de rata. Por lo tanto, los presentes inventores han contemplado el uso de NsG33 en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central, en particular en el tratamiento de enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y trastornos de la médula espinal, como es el caso de la ALS. Con base en la actividad neuroprotectora y en la expresión en el cerebelo, el ganglio de la raíz dorsal y la retina, se contempla también a NsG33 para su uso en el tratamiento de neuropatías periféricas y dolor asociado, así como trastornos cerebelares y retinopatías. Otros factores de crecimiento secretados terapéuticamente relevantes se expresan en el sistema nervioso o subregiones del mismo e incluyen, pero no están limitados a, GDNF, NGF, Neurturin, BDNF, NT4/5, NT3 y Neublastin (Artemin). Con base en la identidad de secuencia con una proteína descrita en el documento WO 93/22437, se contempla a NsG33 para su uso en el tratamiento de trastornos inmunológicos. El efecto terapéutico de NsG33 puede mediarse a través de un efecto sobre el crecimiento, supervivencia, regeneración, recuperación o mejora de función, y/o sobre diferenciación de células elegidas como objetivo. Los presentes inventores han mostrado que NsG33 es capaz de proteger a un tipo de célula neuronal contra la muerte celular apoptotica (ejemplo 6, figura 9). Los presentes inventores han mostrado también que una línea de células progenitoras neurales humanas y un cultivo estriatal primario de rata generan un mayor porcentaje de neuronas cuando se exponen a NsG33 que bajo condiciones de control (ejemplos 14 y 15). El último efecto puede ser causado por supervivencia mejorada de neuronas, por diferenciación incrementada de neuronas, y/o por proliferación de precursores neuronales. Con base en estas pruebas biológicas, la presente invención se refiere a un método para prevenir apoptosis en una célula neuronal de mamífero, dicho método comprendiendo exponer dicha célula neuronal a un polipéptido de la presente invención. La invención se refiere también a un método para mejorar la supervivencia de una célula neuronal de mamífero, dicho método comprendiendo exponer dicha célula neuronal a un polipéptido de la presente invención. La invención se refiere además a un método para generar una neurona, dicho método comprendiendo exponer una célula precursora neuronal o una célula madre neuronal a un polipéptido de la presente invención. De preferencia, dicha célula neuronal de mamífero y/o precursor neuronal de mamífero o célula madre neuronal, es una célula humana. En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada para uso médico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido, o la secuencia complementaria de la secuencia codificante, dicho polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21 , 22, 23 y 24; b) una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21 , 22, 23 y 24, en donde la variante tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No.; y c) un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b).

En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada para uso médico, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18; b) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 50% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18; c) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18; c) el complemento de un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18 bajo condiciones de alta severidad; y d) la secuencia de ácido nucleico del complemento de cualquiera de los incisos anteriores. En otro aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención. En otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedera aislada que comprende un vector de expresión de conformidad con la invención. En particular, la invención se refiere a células hospederas útiles para terapia basada en células, ya sea terapia basada en células desnudas o terapia con células encapsuladas. En otro aspecto, la invención se refiere a una línea de células de empacamiento capaz de producir una partícula viral infecciosa, dicha partícula viral comprendiendo un genoma derivado de Retroviridae que comprende una LTR retroviral 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empacamiento, un promotor enlazado operablemente a una secuencia de polinucieótidos que codifica para un polipépíido de la invención, un origen de síntesis de ADN de segunda cadena, y una LTR retroviral 3'. En otro aspecto, la invención se refiere a un dispositivo de células biocompatible implantable, el dispositivo comprendiendo: i) una membrana semipermeable que permite la difusión de una proteína de la invención; y ii) una composición de células de conformidad con la invención, o una composición de células de empacamiento de conformidad con la invención. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende: i) un polipépíido de la invención; o ii) una secuencia de ácido nucleico aislada de la invención; o iii) un vector de expresión de la invención; o iv) una composición de células hospederas de conformidad con la invención; o v) una línea de células de empacamiento de conformidad con la invención; o vi) un dispositivo de células biocompatible implantable de conformidad con la invención; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de: i) un polipéptido de la invención; o ii) una secuencia de ácido nucleico aislada de la invención; o iii) un vector de expresión de la invención; o iv) una composición de células hospederas de conformidad con la invención; o v) una línea de células de empacamiento de conformidad con la invención; o vi) una cápsula biocompatible implantable de conformidad con la invención; en la fabricación de un medicamento. En otro aspecto, la invención se refiere a un método de tratamiento de una condición patológica en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de: i) un polipéptido de la invención; o ii) una secuencia de ácido nucleico aislada de la invención; o iii) un vector de expresión de la invención; o iv) una composición de células hospederas de conformidad con la invención; o v) una línea de células de empacamiento de conformidad con la invención; o vi) una cápsula bioeompatible implantable de conformidad con la invención. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de: i) un polipéptido de la invención; o ii) una secuencia de ácido nucleico aislada de la invención; o iii) un vector de expresión de la invención; o iv) una composición de células hospederas de conformidad con la invención; o v) una línea de células de empacamiento de conformidad con la invención; como un factor de crecimiento en el cultivo de células de mamífero. En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo capaz de mostrar unión a un polipéptido de la invención. En otro aspecto, la invención se refiere a un inmunoconjugado que comprende al anticuerpo de la invención, y un conjugado seleccionado del grupo que consiste de: un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina o un isótopo radiactivo; un miembro de un par de unión específico, tal como avidina o estreptavidina o un antígeno; o una enzima capaz de producir un producto detectable. En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de AA 28-AA293 de SEQ ID No. 3, AA 21-AA293 de SEQ ID No. 3, ??129-??29 de SEQ ID No. 8, AA122-AA294 de SEQ ID No. 8, AA126-AA29i de SEQ ID No. 13, AA119-AA29i de SEQ ID No. 13, y variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 15 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. Estos polipéptidos aislados constituyen péptidos C-terminales de NsG33. De preferencia, cualquiera de los aminoácidos cambiados se selecciona de los designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente conservados en la figura 3A. En otro aspecto, la invención se refiere a formas truncadas específicas de NsG33. En un aspecto, se seleccionan del grupo que consiste de: 1 ) AA30-AA288 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA25-AA293 de SEQ ID No. 3; 2) AA28-AA286 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA23-AA29i de SEQ ID No. 13; 3) AA31-AA289 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA26-AA294 de SEQ ID No. 8; y 4) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 20 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. Estas formas truncadas de NsG33 constituyen una secuencia de núcleo bioactivo de la primera a la última cisterna conservada. En otro aspecto, la invención se refiere a formas truncadas específicas de NsG33. En un aspecto, se seleccionan del grupo que consiste de: 1) AA171-AA288 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AAi65-AA288 de SEQ ID No. 3; 2) AA-i69-AA286 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AAi64-AA29i de SEQ ID No. 13; 3) AA172-AA28g de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta ???67-??294 de SEQ ID No. 8; y 4) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. Estas formas truncadas constituyen una secuencia de núcleo bioactivo de los péptidos de NsG33 C-terminales de la primera a la última cisteína conservada en los péptidos C-terminales. En otro aspecto, la invención se refiere a formas truncadas específicas de NsG33. En un aspecto, se seleccionan del grupo que consiste de: 1) AA30-AA118 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA25-AA 23 de SEQ ID No. 3; 2) AA28-AA116 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA23-AA121 de SEQ ID No. 13; 3) ??31-????9 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA26-AA124 de SEQ ID No. 8; y 4) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. Estas formas truncadas constituyen una secuencia de núcleo bioactivo de los péptidos de NsG33 N-terminales de la primera a la última cisteína conservada en los péptidos N-terminales. La invención se refiere también a ácidos nucleicos que codifican para dicha NsG33 C-terminal, N-terminal y truncada, así como vectores que comprenden los ácidos nucleicos que codifican para las mismas, células capaces de producir las mismas, y métodos para preparar dicha NsG33 C-terminal, N-terminal y truncada.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figuras 1A-1B. Predicción de la presencia y ubicación del péptido de señal en NsG33 de humano. Figura 1A: gráfica de SignalP NN (red neural) de NsG33 de humano. Figura 1B: gráfica de SignalP HMM (modelo oculto de Markov) de NsG33 de humano. Para detalles, refiérase al ejemplo 2. Figura 2: Resultado del servidor de predicción de la función de proteínas ProtFun2.1 en NsG33 de longitud completa de humano (SEQ ID No. 3), péptido N-terminal de humano (SEQ ID No. 19) y péptido C-terminal de humano (SEQ ID No. 5). Para explicaciones, refiérase al ejemplo 2. Figura 3A: Alineación de secuencias múltiples Clustal W (1.82) de NsG33 de humano, parcial de ratón y rata. Las secuencias de señal se muestran en negritas. Se ha subrayado un sitio de digestión de furina putativo. Figura 3B: Alineación de secuencias múltiples Clustal W (1.82) de NsG33 de humano, ratón y rata. Las secuencias de señal predichas se muestran en negritas. * indica posicionas que tienen un residuo individual completamente conservado. : indica que uno de los siguientes grupos "fuertes", está complemente conservado: -STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, ILV, ILF, HY, FYW. . indica que uno de los siguientes grupos "más débiles", está completamente conservado: -CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VL!M, HFY. Figuras 4A-4B: PCR en tiempo real en NsG33. Para detalles, véase el ejemplo 5. La figura 4A muestra la expresión relativa de NsG33 (respecto a tejido con la expresión más baja), asumiendo que se sintetizaron las mismas cantidades de ADNc a partir de cantidades ¡guales de ARN total usado para el paso de ADNc. La figura 4B muestra la expresión relativa de NsG33 normalizada a 2-microglobulina (respecto a tejido con la expresión normalizada más baja). Los resultados deben interpretarse con cuidado, puesto que los niveles de expresión de p2-microglobulina varían entre algunos tejidos. Figura 5: Alineación AlignO de polipéptido de NsG33 de longitud completa de humano, contra polipéptido de longitud completa de humano (Innog.) del documento WO 93/22437 (Innogenetics SA). Matriz de puntuación BLOSUM50, penalizaciones de espacio: -12/-2. Las diez cisternas conservadas se muestran en negritas con asteriscos arriba o abajo de las secuencias alineadas. Figura 6: ADNc de NsG33 de humano y prepro-NsG33 codificada. Figura 7A: ADNc parcial de NsG33 de ratón y pre-pro-NsG33 parcial codificada. Figura 7B: ADNc de longitud completa de NsG33 de ratón y pre- pro-NsG33 codificada. Figura 8: ADNc de NsG33 de rata y pre-pro-NsG33 codificada. Figura 9: Efecto de NsG33 sobre la supervivencia de células PC 2 en medio libre de suero. Para más detalles, véase el ejemplo 6. Se sembraron células en placas de 48 cavidades revestidas de colágena, 2x104 células/cavidad en medio de crecimiento. Al día siguiente, las células fueron transducidas por incubación durante la noche con 05 unidades de transducción de virus/cavidad (MOI = 5) en presencia de 5 µg/ml de Polybrene (bromuro de hexadimetrina). Después de la transducción, se cambió el medio a DMEM libre de suero (Invitrogen), y la supervivencia de células entonces se puso a prueba después de 4 días usando la prueba de MTS. Los datos mostrados son medias ± SEM (n = 6) de un experimento representativo, y el * indica una diferencia significativa de las células transducidas con ADNc para EGFP (P<0.05, ANOVA unidireccional, método de Dunnett). LV-EGFP: células PC12 transducidas con EGFP de lentivirus. LV-NsG33: células PC12 transducidas con NsG33 de longitud completa de humano. La figura 10A muestra la expresión relativa de mNsG33 medida por RT-PCR cuantitativa (respecto a tejido con la expresión más baja), normalizada para GAPDH en la médula espinal en desarrollo en las etapas embrionarias E 0.5, E11.5 y E13.5 (10.5, 11.5 y 13.5 días post-concepción, respectivamente), y en la médula espinal de adulto. Los detalles se describen en el ejemplo 13. La figura 10B muestra la expresión relativa de mNsG33 en dos regiones del cerebro de ratón (CTX = corteza, Cb = cerebelo) en dos etapas de desarrollo (P1 = post-natal de un día y adulto). La expresión se mide por RT-PCR cuantitativa normalizada para la expresión de mGAPDH respecto a tejido con la expresión normalizada más baja. Los detalles se describen en el ejemplo 13. La figura 11A muestra los porcentajes promedio de células gliales positivas para GFAP (barras grises) y las neuronas positivas para ß-???-tubulina (barras negras) en cultivos de hNS1 en diferenciación que reciben medio libre de suero no acondicionado (hNS1 ), medios acondicionados de células ARPE-19 control (Me C) o de cultivos de células ARPE-19 transducidas con NsG33 (Me 33). Más detalles se describen en el ejemplo 14. La figura 11B muestra el número total de células por campo, según se determina contando núcleos teñidos con Hoechst usando un objetivo de 40x en cultivos de hNS1 en diferenciación que reciben medio libre de suero no acondicionado (hNS1 ), medios acondicionados de células ARPE-19 control (Me C) o de cultivos de células ARPE-19 transducidas con NsG33 (Me 33). Más detalles se describen en el ejemplo 14. La figura 12 muestra los porcentajes promedio de neuronas positivas para ß-lll-tubulina en cultivos estriatales de rata que reciben medio libre de suero no acondicionado (UCM), medios acondicionados diluidos de células HEK293T o ARPE-19 pseudotransfectadas (293T-CM y ARPE-CM, respectivamente), o de los cultivos paralelos transfectados con NsG33 (293T- CM33 y ARPE-CM33, respectivamente) a DIV2. Más detalles se describen en el ejemplo 5.

Definiciones NsG33, como se usa en la presente, se refiere a polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de NsG33 sustancialmente purificada obtenida de cualquier especie, en particular de mamífero, que incluye chimpancé, bovino, ovino, porcino, murino, equino y de preferencia humano, de cualquier fuente, ya sea natural, sintética, semisintética o recombinante. El término se refiere también a fragmentos biológicamente activos de NsG33 obtenidos de cualquiera de estas especies, así como a variantes de secuencia biológicamente activas de los mismos, y a las proteínas sujetas a modificaciones post-traducción. Las características del factor de crecimiento, como se usa en la presente, definen rasgos relacionados con las secuencias similares a los de los factores de crecimiento clásicos, los cuales son proteínas secretadas que actúan sobre una célula objetivo a través de un receptor, para causar una o más de las siguientes respuestas en la célula objetivo: crecimiento que incluye proliferación, diferenciación, supervivencia, regeneración, migración, recuperación de función y mejora de función. Un "alelo" o "secuencia alélica", como se usa en la presente, es una forma alternativa del gen que codifica para NsG33. Pueden resultar alelos de por lo menos una mutación en la secuencia de ácido nucleico, y pueden resultar en moléculas de ARN mensajero alteradas o polipéptidos cuya estructura o función puede o no ser alterada. Cualquier gen natural o recombinante determinado puede tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Cambios mutaciones comunes que dan lugar a alelos se atribuyen en general a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios pueden ocurrir solos, o en combinación con los otros, una o más veces en una secuencia determinada. Una "deleción", como se usa en la presente, se refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, y resulta en la ausencia de uno o más residuos de aminoácido o nucleótidos. Una "inserción" o "adición", como se usa en la presente, se refiere a un cambio en una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que resulta en la adición de uno o más residuos de aminoácido o nucleótidos, respectivamente, en comparación con la molécula de ocurrencia natural. Los términos "unión específica" o "que se une específicamente", como se usan en la presente, se refieren a la interacción de alta afinidad entre una proteína o péptido y una molécula de unión tal como un anticuerpo y un receptor o fragmentos del mismo. La interacción depende de la presencia de una estructura particular (es decir, el determinante antigénico o epítope) de la proteína reconocida por la molécula de unión. Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para el epítope "A", la presencia de una proteína que contenga al epítope A (o A no marcado libre) en una reacción que contenga "A" marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo. El término "sustancialmente purificado", como se usa en la presente, se refiere a secuencias de ácido nucleico o aminoácidos que son removidas de su ambiente natural, aisladas o separadas, y están por lo menos 60% libres, de preferencia 75% libres, y más preferiblemente 90% libres de otros componentes con los cuales se asocian naturalmente. Una "sustitución", como se usa en la presente, se refiere al reemplazo de uno o más aminoácidos o nucleótidos por diferentes aminoácidos o nucleótidos, respectivamente.

Identidad de secuencia La determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo preferido de un algoritmo matemático usado para la comparación de dos secuencias, es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Dicho algoritmo está incorporado en los programas BLASTN y BLASTP de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Para caracterizar la identidad, se alinean secuencias sujeto, de modo que se obtenga la homología (coincidencia) de orden más alto. Con base en estos principios generales, puede determinarse el "por ciento de identidad" de dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo BLASTP [Tatiana A. Tatusova, Thomas L Madden: Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotíde sequences; FEMS Microbiol. Lett. 1999 74 247-250], el cual está disponible del sitio web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), y usando los valores predeterminados sugeridos aquí (es decir, matriz = Blosum62; espacio abierto = 11 ; espacio de extensión = 1 ; penalizaciones de espado x_punto de derivación = 50; expectativa = 10, tamaño de palabra = 3; filtro funcionando). El algoritmo BLAST realiza una operación de dos pasos, alineando primero dos secuencias con base en los valores, y determinando entonces el por ciento de identidad de secuencia en una escala de traslape entre dos secuencias alineadas. Además del por ciento de identidad de secuencia, BLASTP determina también el por ciento de similitud de secuencia con base en los valores. Para caracterizar la identidad, se alinean secuencias sujeto, de modo que se obtenga la homología (coincidencia) de orden más alto. Con base en estos principios generales, puede determinarse el "por ciento de identidad" de dos secuencias de ácido nucleico usando el algoritmo BLASTN [Tatiana A. Tatusova, Thomas L Madden: Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotíde sequences; FEMS Microbiol. Lett. 1999 174 247-250], el cual está disponible del sitio web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), y usando los valores predeterminados sugeridos aquí (es decir, retribución por una coincidencia = 1 ; penalización por una no coincidencia = -2; opción de cadena = ambas cadenas; espacio abierto = 5; espacio de extensión = 2; penalizaciones de espacio x_punto de derivación = 50; expectativa = 10; tamaño de palabra = 11 ; filtro funcionando). El algoritmo BLASTN determina el por ciento de identidad de secuencia en una escala de traslape entre dos secuencias de nucleótidos alineadas. Otro ejemplo no limitativo preferido de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias, es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias FASTA (Pearson WR, Methods Mol Biol, 2000, 132: 185-219). Align calcula identidades de secuencias con base en una alineación global. AlignO no penaliza para espacios en el extremo de las secuencias. Cuando se usa el programa ALIGN o AlignO para la comparación de secuencias de aminoácidos, se usa de preferencia una matriz de substitución BLOSUM50 con penalizaciones de apertura/extensión de espacios de -12/-2.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere al uso médico de polipéptidos y polinucleótidos que se identifican como NsG33. La proteína NsG33 ha sido identificada en seres humanos (SEQ ID No. 3), ratón (SEQ ID No. 8) y rata (SEQ ID No. 13). NsG33 de humano existe como un precursor de 293 aminoácidos, que puede ser procesado para dar lugar a por lo menos uno y potencialmente varios péptidos biológicamente activos. NsG33 es expresada a altos niveles en el sistema nervioso y el ojo, y en particular subregiones del cerebro (figuras 4A y 4B). Los polipéptidos de NsG33 más largos de ratón (SEQ ID No. 8) y rata (SEQ ID No. 13) consisten de 294 y 291 aminoácidos, respectivamente, y el por ciento de identidades con la proteína humana son 80.3 y 80.2, respectivamente (véase cuadros 1 y 2 en el ejemplo 2). Debe notarse que las secuencias polipeptídicas de longitud completa predichas de ratón y rata están aún sin verificar, y que por lo menos la secuencia polipeptídica de ratón es parcial en el extremo N-terminal. Una secuencia de proteína de longitud completa de ratón con un extremo N-terminal ligeramente diferente, se ha publicado en Nishino et al (The EMBO Journal, 2004, 23: 2998-2008) con un ADNc correspondiente disponible del NCBI bajo el número de acceso XM128551. La digestión del péptido de señal de esta proteína de ratón resulta en la proteína madura que tiene SEQ ID No. 9. NsG33 de humano contiene una secuencia de péptido de señal N-terminal de 23 aminoácidos, que es digerida en el motivo de secuencia ARA-GY. Este sitio de digestión del péptido de señal es predicho por medio del método SignalP (véase el ejemplo 2) y la gráfica resultado mostrada en la figuras 1A- B. Sin embargo, el experto en la técnica reconocerá que el sitio de digestión real puede ser diferente del predicho por el programa de cómputo. Por ejemplo, la predicción del péptido de señal en NsG33 resulta en predicciones con probabilidades casi iguales en las posiciones 16 y 21. Un sitio de digestión del péptido de señal se encuentra en un sitio similar en la NsG33 de ratón (posición 24) y NsG33 de rata (posición 16 ó 21 ). La digestión del péptido de señal resulta en polipéptidos que tienen SEQ ID No. 4, 9 y 14 para humano, ratón y rata, respectivamente. Como es sabido en la técnica, el procesamiento del péptido de señal no siempre es exactamente como se predice, y la digestión real puede variar de caso a caso. De esta manera, se espera que el extremo N-terminal de la NsG33 madura pueda variar por uno a dos o tres aminoácidos del sitio de digestión predicho. El extremo N-terminal real de la NsG33 madura puede verificarse experimentalmente por marcación del extremo C-terminal con, por ejemplo, un marcador de histidina, purificación subsiguiente usando un anticuerpo específico de poli-histidina, o purificación en una columna de níquel, y finalmente secuenciación N-terminal del péptido maduro purificado. Se predice digestión de la pro-proteína de tipo general en NsG33 de humano, por medio del método ProP (Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Peter Duckert, S ren Brunak y Nikolaj Blom. Protein Engineering, Design and Selection: 17: 107-112, 2004) en la posición 127 con una puntuación de 0.831 , motivo de secuencia 'WGPRERR-AL'. Se predicen sitios de digestión similares en posiciones homologas en NsG33 de ratón (en la posición 128) con una puntuación de 0.831, motivo de secuencia 'WGPRERR-AL', y en NsG33 de rata (en la posición 125), con una puntuación de 0.831 y el motivo de secuencia 'WGPRERR-AL'. Un sitio de digestión de pro-péptido de purina posible, se encuentra también en la posición 121 en NsG33 de humano en el motivo de secuencia 'GGRCVR-WG', y en posiciones correspondientes en NsG33 de rata y ratón. El procesamiento del polipéptido después de la digestión del péptido de señal resulta en la formación de un péptido C-terminal y un péptido N-terminal.. Si la proteína es procesada realmente en estos sitios predichos, puede depender del tipo de célula en el cual el gen es expresado. Puede verificarse experimentalmente la digestión del pro-péptido por medio de marcación de histidina C-terminal, purificación y secuenciación N-terminal subsiguiente del péptido marcado. NsG33 pertenece a la categoría de proteínas que actúan como factores de crecimiento. Esta noción es apoyada por predicciones realizadas por el servidor de predicción de la función de proteínas ProtFun, que provee desigualdades arriba de 1.0 de este tipo de categoría, como se muestra en la figura 2. El método ProtFun predice la función de proteínas con base en rasgos derivados de secuencia, opuestamente a la similitud de secuencia. Rasgos que son importantes para la discriminación entre las clases del "factor de crecimiento" contra las demás clases, son: potencial de distribución de proteínas, potencial de direccionamiento de proteínas, potencial del péptido de señal, regiones de baja complejidad, estructura secundaria de la proteína, número de residuos negativos y número de átomos. En general, una puntuación de desigualdad de 1 indica una predicción que pudo haber ocurrido por azar. Desigualdades arriba de 1 indican que existe una probabilidad incrementada de que la proteína pertenezca a la clase ontológica de genes predichos. Cuanto mayor sea la puntuación de desigualdad, mayor será la probabilidad de que la predicción sea correcta. Los resultados de la PCR en tiempo real cuantitativa se muestran en las figuras 4A y 4B. Con base en las figuras, puede agruparse a los tejidos de acuerdo al nivel de expresión de NsG33. Tejidos con alta expresión incluyeron: putamen, sustancia negra y médula espinal. Tejidos con expresión intermedia incluyeron: cerebro entero, cerebelo, retina* y ganglio de la raíz dorsal*. Tejidos con baja expresión incluyeron: corazón, riñon, pulmón, próstata, glándula salival, músculo esquelético, testículo, estómago, páncreas y cerebro fetal*. Tejidos con muy baja expresión o sin expresión incluyeron: hígado fetal, placenta, timo, tráquea, bazo, útero, colon e intestino delgado. Cuando se analizaron los resultados después de la normalización a la expresión de p2-m¡croglobulina, esencialmente se observaron los mismos resultados, salvo para los tejidos marcados con un *. Los resultados de PCR en tiempo real para NsG33 de ratón, se muestran en las figuras 10A y 10B. Los valores de CT variaron de 17 a 22. De la figura 10A, es evidente que la expresión de NsG33 es regulada durante el desarrollo de la médula espinal, alcanzando un máximo alrededor de E11.5. De la figura 10B, es evidente que NsG33 es regulada durante el desarrollo post-natal en el cerebelo, pero no en la corteza.

El patrón de expresión temporal en médula espinal indica una función en proliferación, diferenciación y/o supervivencia de los progenitores neurales en esta región del SNC. Esto es consistente con la relevancia terapéutica para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y lesiones en la médula espinal que incluyen lesión de médula espinal, ALS y atrofia muscular espinal. Además, este perfil de expresión indica un potencial como reactivo in vitro para la expansión y/o diferenciación de progenitores neurales derivados de la médula espinal. La sobrerregulación de la expresión de NsG33 en el cerebelo del adulto, indica una función para este factor en el mantenimiento y/o supervivencia de uno o más tipos de células cerebelares. Esto es consistente con la relevancia terapéutica para trastornos cerebelares que incluyen, pero no están limitados a, ataxia sensitiva, esclerosis múltiple, trastornos espinocerebelares neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelares (tales como atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de Shy-Drager (atrofia de sistemas múltiples)) y alcoholismo. A diferencia de las proteínas estructurales, los factores de crecimiento están implicados en la señalización celular y en varias funciones tales como crecimiento, proliferación, diferenciación, supervivencia, regeneración, migración, recuperación de función y mejora de función. Por lo tanto, pueden administrarse y usarse factores de crecimiento para ejercer un efecto terapéutico. Con base en la expresión específica del tejido y al hecho de que se predice que NsG33 es un factor de crecimiento secretado, y que NsG33 posee actividad antiapoptótica, neuroprotectora y/o de neurogénesis (figuras 9, 11A-11 B y 12), se contempla a NsG33 para su uso en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso en general (con base en la expresión específica del sistema nervioso), en particular enfermedad de Parkinson (con base en la expresión en la sustancia negra), enfermedad de Huntington (con base en la expresión en el putamen y la sustancia negra), trastornos cerebelares (con base en la expresión en el cerebelo humano, y expresión diferencial en el cerebelo de ratón en desarrollo), lesión de médula espinai (con base en la expresión en la médula espinal del humano adulto, y la expresión diferencial en la médula espinal de ratón en desarrollo), ALS (con base en la expresión en la médula espinal del humano adulto, y la expresión diferencial en la médula espinal de ratón en desarrollo), neuropatías periféricas (con base en la expresión en el ganglio de la raíz dorsal) y retinopatías (con base en la expresión en la retina). La función para las varias indicaciones puede verificarse en pruebas in vitro e in vivo como se describe en los ejemplos. Asimismo, se encuentra expresión de factores de crecimiento secretados terapéuticamente relevantes, que incluyen GDNF, NGF y Neublastin (Artemin) en áreas objetivo del trastorno neurológico, que pueden usarse para tratamiento. El efecto terapéutico de NsG33 puede mediarse a través de un efecto sobre el crecimiento, que incluye proliferación, regeneración, recuperación de función, mejora de función, supervivencia, migración y/o diferenciación de células elegidas como objetivo. Una función biológica verificada de NsG33, es un efecto neuroprotector contra apoptosis inducida por inanición en células PC12 (feocromocitoma). Los feocromocitomas son tumores con características de células cromafín adultas e inmaduras de la médula suprarrenal. Las células cromafín, neuronas sensitivas y del simpático y células de pigmento (melanocitos), se derivan de una célula precursora común en la cresta neural. Su diferenciación en los linajes específicos depende altamente de señales externas que incluyen factores secretados. PC12 es una línea de células clonal, que se estableció originalmente de un feocromocitoma medular suprarrenal trasplantare de rata (Greene y Tischler, 1976, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 73, 2424). Las células PC12 están disponibles de la ATCC (American Type Culture Collection, número de acceso CRL-1721 ). Se considera que las células PC12 son la célula precursora cromafín pluripotente, ya que posee la capacidad de diferenciarse hasta células cromafín maduras, neuronas del simpático y melanocitos, dependiendo de las condiciones de cultivo. Las células PC12 se han usado ampliamente como un sistema modelo para estudios de diferenciación y supervivencia neuronal. En medio que contiene suero, las células PC 2 proliferan, mientras que la adición de ciertos factores neurotróficos que incluyen al NGF, induce la diferenciación de las células PC12 en un fenotipo neuronal muy similar a las neuronas del simpático. En medio libre de suero, las células PC12 llegaran a ser apoptóticas, y mueren a menos que sean provistas con ciertos factores de crecimiento, hormonas o pequeñas moléculas que pueden actuar como factores de supervivencia. Los factores capaces de inducir diferenciación y supervivencia en células PC12, que incluyen una de las neurotrofinas (NGF) y un miembro de la familia de secretina/glucagon/VIP (PACAP), exhiben también una actividad similar en el sistema nervioso central y periférico, indicando que receptores y sistemas de respuesta expresados en células PC12 son compartidos con muchas otras células neuronales. El NGF es un factor de supervivencia y diferenciación importante para neuronas sensitivas y del simpático sensibles, además de neuronas colinérgicas en el prosencéfalo basal. PACAP promueve la diferenciación de neuronas nacientes del ganglio de la raíz dorsal (DRG), porque incrementa el número de células positivas para marcador neural y axonogénesis, sin que afecte la proliferación de células progenitoras neurales (Nieisen et al., Mol Cell Neurosci. 2004 abr; 25(4): 629-41 ). PACAP muestra también actividades similares en poblaciones neuronales en el SNC (Vaudry et al., Proc Nati Acad Sci U.SA. 2002 abr 30; 99(9): 6398-403; Dicicco-BIoom ef al., Ann N Y Acad Sci. 1998 dic 11 ; 865: 274-89). La muerte celular apoptótica contribuye a la pérdida de células neuronales en el sistema nervioso del adulto, causando varios trastornos neurológicos tales como apoplejía isquémica, enfermedades neurodegenerativas o traumas cerebrales (Becker y Bonni, Prog Neurobiol. 2004 ene; 72(1 ): 1-25). Un factor de crecimiento secretado capaz de proteger a las células neuronales contra la muerte celular apoptótica, es por lo tanto un candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso en general, y trastornos neurodegenerativos en particular. De esta manera, la capacidad de un factor secretado para inducir el brote de neuritas y/o para promover la supervivencia bajo condiciones que llevan a apoptosis, es una indicación de que este factor tiene un efecto similar en otros tipos de células neuronales del sistema nervioso central y/o periférico, y que este factor es un candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso, en particular trastornos neurodegenerativos. Otra función biológica de NsG33, es un efecto de estimulación sobre el porcentaje de neuronas generadas por una línea de células madre neurales humanas (hnS1 , en otro tiempo denominada HNSC.100). Células expuestas a medio acondicionado de células ARPE-19 transducidas con secuencias codificantes de NsG33 de humano, dieron un mayor porcentaje de neuronas respecto a astrocitos en comparación con células nNS1 expuestas a medio acondicionado de células ARPE-19 no transducidas. Esto es consistente con el efecto antiapoptótico encontrado en la prueba de células PC12. El efecto puede ser causado por un efecto de supervivencia sobre neuronas, y/o por neurogénesis y/o por proliferación de precursores neuronales. La línea de células nNS1 se establece de cultivos de neuroesferas humanas del prosencéfalo. Se ha mostrado que otros factores tróficos conocidos con potencial terapéutico, incrementan el número de neuronas generadas de cultivos de neuroesferas humanas. Estos incluyen a NT3 y NT4/5 y al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Caldwell et al, Nature Biotechnology, 2001 may, 19(5): 475-9. Growth factors regúlate the survival and fate of cells derived from human neurospheres). Por consiguiente, estos resultados indican también que NsG33 es un factor candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso y en particular trastornos neurodegenerativos. En otra prueba in vitro, medio acondicionado de dos líneas de células transfectadas con ADNc que codifica para NsG33 de humano, incrementó el porcentaje de neuronas en un cultivo primario de células estriatales de rata. Esta prueba es también consistente con un efecto neuroprotector de NsG33. Este efecto puede ser causado por un efecto de supervivencia sobre neuronas, y/o por neurogénesis y/o por proliferación de precursores neuronales. Otros factores con potencial terapéutico tienen un efecto similar sobre células estriatales de rata, e incluyen factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor 1 de crecimiento tipo insulina truncado (tIGF), neurotrofina-3 (NT-3), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la isoforma BB del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) y neurotrofina-4/5 (NT-4/5) (Nakao et al, Exp Neurol 1996, mar 138(1): 144-57, Differential trophic effects of basic fibroblast growth factor, insulin-like growth factor-1 , and neurotrophin-3 on striatal neurons in culture; Nakao et al, Brain Res Dev Barin Res, 1995, dic 21 ; 90(1-2): 92-101 , Trophic and protective actions of brain-derived neurotrophic factor on striatal DARPP-32-containing neurons in vitro; Widmer et al Eur J Neurosci, 1994 nov 1 ; 6(11 ): 1669-79, Neurotrophin 4/5 promotes survival and differentiation of rat striatal neurons developing in culture). En consecuencia, estos resultados indican también que NsG33 es un factor candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso y en particular trastornos neurodegenerativos. NsG33 está estructuralmente relacionada a una proteína descrita en el documento WO 93/22437 (Innogenetics SA), que se identifica en una búsqueda BLASTP. La proteína humana de longitud completa se muestra en la figura 2 del documento WO 93/22437. NsG33 comparte 42% de identidad (AlignO con valores predeterminados) con la proteína de Innogenetics que incluye 10 residuos de cisteína conservados. Un péptido de señal N-terminal de 45 residuos se predice en la proteína de Innogenetics (NsG34). Los datos de expresión recombinante del documento WO 93/22437, indican que la proteína de Innogenetics no está sujeta a procesamiento del pro-péptido bajo las condiciones usadas en esa publicación, sino es secretada como una proteína de 268 aminoácidos. Esto podría considerarse como una indicación de que la digestión predicha del pro-péptido de NsG33 puede no ocurrir cuando el gen es expresado, por lo menos no en las células usadas en la referencia citada. Una alineación de longitud completa de NsG33 de humano con la proteína de Innogenetics de humano, se muestra en la figura 5. Las 10 cisteínas conservadas se muestran en negritas, y están marcadas con asteriscos. Las dos proteínas en conjunto forman una familia de proteínas basada en los residuos de cisteína conservados y los tramos de alta conservación que son evidentes de la figura 5. Ninguna de las dos proteínas muestra una homología de secuencia significativa con alguna otra proteína humana conocida. Aunque las dos proteínas son miembros de la misma pequeña familia de proteínas, las dos proteínas son estructuralmente distintas. Debido a la alta conservación de las cisteínas, se espera que estos residuos desempeñen una función importante en la estructura secundaria y terciaria de la proteína bioactiva. Una o más de las cisteínas pueden participar en la formación de puentes de cistina intramoleculares y/o intermoleculares. La proteína de Innogenetics es, entre otras cosas, funcional en la activación de células T y células B, y como un inductor de células inmunosupresoras. Con base en la homología con la proteína de Innogenetics, se predice que NsG33 tiene asimismo funciones implicadas en inmunología.

I. Polipéptidos de NsG33 Además de NsG33 de longitud completa, NsG33 sustancialmente de longitud, completa, pro-NsG33, péptidos C-terminales, péptidos N-terminales y formas truncadas de NsG33, la presente invención provee variantes biológicamente activas de los polipéptidos. Un polipéptido de NsG33 o fragmento del mismo, es biológicamente activo si exhibe una actividad biológica de NsG33 de ocurrencia natural. Se entenderá que la invención se refiere a NsG33 sustancialmente purificada como se define en la presente. Una actividad biológica es la capacidad para competir con NsG33 de ocurrencia natural en una prueba de unión al receptor. Otra actividad biológica es la capacidad para unirse a un anticuerpo, que sea dirigido en un epítope, que esté presente en NsG33 de ocurrencia natural. Pueden definirse también variantes biológicamente activas con relación a una o más de las demás en pruebas biológicas ¡n vitro y/o in vivo descritas en los ejemplos. Una actividad biológica preferida, es la capacidad para inducir sustancialmente la misma respuesta como en la prueba de células PC 12 descrita en los ejemplos y en la figura 9. En esta prueba, células PC12 son transducidas con secuencias codificantes de NsG33 de longitud completa de humano (figura 6). Por sustancialmente la misma respuesta en la prueba de células PC12, se pretende indicar que el número de células que poseen neuritas es por lo menos 10% del número obtenido en el ejemplo 6 (transducción con NsG33 de longitud completa de humano), más preferiblemente por lo menos 20%, más preferiblemente por lo menos 30%, más preferiblemente por lo menos 40%, más preferiblemente por lo menos 50%, más preferiblemente por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%. La prueba de células PC12 puede usarse también para documentar el porcentaje de mejora en supervivencia sobre un tratamiento control. Sustancialmente la misma respuesta en este contexto, significa una actividad que resulta en por lo menos 10% de la mejora obtenida en el ejemplo 6 (figura 9), más preferiblemente por lo menos 20%, más preferiblemente por lo menos 30%, más preferiblemente por lo menos 40%, más preferiblemente por lo menos 50%, más preferiblemente por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%. La actividad biológica de un fragmento o variante de NsG33 puede ser también mayor que la de la NsG33 de ocurrencia natural. Otras actividades biológicas preferidas incluyen el efecto neuroprotector y/o de neurogénesis mostrado en los ejemplos 14 y 15. Fragmentos específicos de NsG33 incluyen polipéptidos seleccionados del grupo que consiste de AA128-AA293 de SEQ ID No. 3, AA121-AA293 de SEQ ID No. 3, AA129-AA294 de SEQ ID No. 8, AA122-AA2g4 de SEQ ID No. 8, AA126-AA29i de SEQ ID No. 13, AA119-AA29i de SEQ ID No. 13, y variantes de secuencia de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 15 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. Estos polipéptidos aislados constituyen péptidos C-terminales de NsG33. De preferencia, cualquiera de los aminoácidos cambiados se selecciona de los designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente conservados en la figura 3A. ProtFun 2.1 predice con altas desigualdades (8.0), que péptidos C- terminales pertenecen al factor de crecimiento de la clase ontologica de genes (figura 2). Otros polipéptidos específicos se seleccionan del grupo que consiste de SEQ ID No. 19, 20, 21 , 22, 23 y 24, y variantes de secuencia de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 15 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. Estos polipéptidos aislados constituyen péptidos N-terminales de NsG33. De preferencia, cualquiera de los aminoácidos cambiados se selecciona de los designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente conservados en la figura 3A. En una modalidad preferida, menos de 10 aminoácidos han sido cambiados, más preferiblemente menos de 5 aminoácidos, más preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos, más preferiblemente ningún aminoácido ha sido cambiado. ProtFun 2.1 predice con altas desigualdades (8.1 ), que péptidos N-terminales pertenecen al factor de crecimiento de la clase ontologica de genes (figura 2). En un aspecto, formas truncadas preferidas específicas de NsG33 se seleccionan del grupo que consiste de: 1 ) AA30-AA288 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos 8 extremos, hasta AA25-AA293 de SEQ ID No. 3; 2) AA28- A286 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA23-AA291 de SEQ ID No. 13; 3) AA31-AA289 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA26-AA294 de SEQ ID No. 8; y 4) variantes de secuencia de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 20 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. Estas formas truncadas de NsG33 constituyen una secuencia central de la primera a la última cisteína conservada. En una modalidad preferida, menos de 15 aminoácidos han sido cambiados, más preferiblemente menos de 10 aminoácidos, más preferiblemente menos de 5 aminoácidos, tal como 1 ó 2 aminoácidos, más preferiblemente ningún aminoácido ha sido cambiado. En un aspecto, formas truncadas específicas de NsG33 se seleccionan del grupo que consiste de: 1 ) AA171-AA288 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA165-AA288 de SEQ ID No. 3; 2) AA169-AA286 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA164-AA2gi de SEQ ID No. 13; 3) AA 72-AA289 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA 67-AA29 de SEQ ID No. 8; y 4) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. Estas formas truncadas constituyen una secuencia de núcleo bioactivo de la primera a la última cisteína conservada en péptidos C-terminales. En una primera modalidad, menos de 10 aminoácidos han sido cambiados, más preferiblemente menos de 5 aminoácidos, más preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos, más preferiblemente ningún aminoácido ha sido cambiado. En un aspecto, formas truncadas específicas de NsG33 se seleccionan del grupo que consiste de: 1 ) AA30-AA118 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA25-AAi23 de SEQ ID No. 3; 2) AA28-AAii6 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA23-AAi2i de SEQ ID No. 13; 3) AA3i-AA119 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA26-AAi24 de SEQ ID No. 8; y 4) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. Estas formas truncadas constituyen secuencias centrales de la primera a la cuarta cisteína conservada en péptidos de NsG33 N-terminales. En una primera modalidad, menos de 10 aminoácidos han sido cambiados, más preferiblemente menos de 5 aminoácidos, más preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos, más preferiblemente ningún aminoácido ha sido cambiado. Las variantes pueden diferir de NsG33 de ocurrencia natural en secuencia de aminoácidos o en formas que no impliquen secuencia, o en ambas formas. Se producen variantes en secuencia de aminoácidos ("variantes de secuencia"), cuando uno o más aminoácidos en NsG33 de ocurrencia natural son sustituidos con un aminoácido natural, un derivado de aminoácido o un aminoácido no nativo diferente. Variantes particularmente preferidas incluyen NsG33 de ocurrencia natural, o fragmentos biológicamente activos de NsG33 de ocurrencia natural, cuyas secuencias difieran de la secuencia de tipo silvestre por una o más sustituciones de aminoácido conservativas y/o semiconservativas que tengan típicamente influencia mínima sobre la estructura secundaria y terciaria y la naturaleza hidrofóbica de la proteína o péptido. Las variantes pueden tener también secuencias que difieran en una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácido no conservativas, que no supriman la actividad biológica de NsG33. La alineación Clustal W en la figura 3A o la figura 3B puede usarse para predecir qué residuos de aminoácido pueden ser sustituidos sin que se afecte sustancialmente la actividad biológica de la proteína. Sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación "fuerte"), se considerarán como sustituciones conservativas dentro del significado de la presente invención: -STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW. Sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación "débil"), se considerarán como sustituciones semiconservativas dentro del significado de la presente invención: -CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY. Otras variantes dentro de la invención, son aquellas con modificaciones que incrementan la estabilidad de los péptidos. Dichas variantes pueden contener, por ejemplo, uno o más enlaces no peptídicos (que reemplazan a los enlaces peptídicos) en la secuencia peptídica. Incluidas también son: variantes que incluyen residuos diferentes de L-aminoácidos de ocurrencia natural, tales como D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos o de ocurrencia no natural, tales como beta o gamma aminoácidos y variantes cíclicas. La incorporación de D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos en el polipéptido, puede incrementar su resistencia a las proteasas. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,219,990. Se incluyen específicamente variantes de empalme en la invención. Cuando el resultado de una sustitución determinada no pueda predecirse con certeza, los derivados pueden ponerse a prueba fácilmente de conformidad con los métodos descritos en la presente, para determinar la presencia o ausencia de actividad biológica, de preferencia, en la prueba de células PC12 y/o la prueba de hNS1 y/o la prueba de cultivo estriatal de rata. En una modalidad, el polipéptido es una variante alélica de ocurrencia natural de la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21 , 22, 23 y 24. Este polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que sea la traducción de una secuencia de ácido nucleico que difiera por un sólo nucleótido, de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18. Un polipéptido variante, como se describe en la presente en una modalidad, comprende un polipéptido en donde algún aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado para proveer una sustitución conservativa. El péptido de señal puede ser reemplazado por un péptido de señal heterólogo. Las variantes dentro del alcance de la invención en una modalidad, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tengan por lo menos 60% de identidad con NsG33 de humano, murino o rata (SEQ ID NO: 5, 10 y 15). Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. Variantes preferidas dentro del alcance de la invención en una modalidad, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tengan por lo menos 60 por ciento de identidad con un polipéptido que tenga la secuencia de SEQ ID NO: 4, 9 ó 14. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. SEQ ID No. 4, 9 y 14 corresponden a las proteínas maduras después de digestión del péptido de señal y sin digestión del pro-péptido alguna. Variantes dentro del alcance de la invención en una modalidad, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tengan por lo menos 60 por ciento de identidad con un polipéptido que tenga la secuencia de SEQ ID NO: 3, 8 ó 13. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. Variantes dentro del alcance de la invención en una modalidad, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tengan por lo menos 70 por ciento de identidad de secuencia con una proteína que tenga la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 19, 20, 21 , 22, 23 y 24, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tenga la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 19, 20, 21 , 22, 23 y 24. Variantes dentro del alcance de la invención en una modalidad, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tengan por lo menos 60 por ciento de identidad con un polipéptido que tenga la secuencia de SEQ ID NO: 19, 20 ó 21. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%>, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. Variantes dentro del alcance de la invención en una modalidad, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tengan por lo menos 60 por ciento de identidad con un polipéptido que tenga la secuencia de SEQ ID No. 22, 23 o 24. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad preferida, la identidad de secuencia de la NsG33 variante se determina con relación a un polipéptido de NsG33 de humano (SEQ ID No. 3, 4, 5, 19 ó 22). Para los propósitos de determinación de la homología, la longitud mínima de secuencias de comparación será en general por lo menos 8 residuos de aminoácido, usualmente por lo menos 12 residuos de aminoácido. Para los propósitos de la presente invención, el por ciento de identidad de secuencia se calcula de preferencia en una escala de traslape de por lo menos 25 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 30 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 55, más preferiblemente por lo menos 60, tal como por lo menos 70, por ejemplo, por lo menos 80, tal como por lo menos 90, por ejemplo, por lo menos 100, tal como por lo menos 110, por ejemplo, por lo menos 120, tal como por lo menos 130, por ejemplo, por lo menos 150, la escala siendo determinada por medio de BLASTP bajo valores predeterminados. En una modalidad, el por ciento de identidad de secuencia se calcula usando alineación global (GAP o Align), de modo que las secuencias variante y de SEQ ID sean alineadas, y el número total de residuos de aminoácido idénticos sea calculado y dividido entre la longitud de SEQ ID NO. En una modalidad, una NsG33 variante comprende una variante alélica de ocurrencia natural de la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 3, 14 y 15. Dicha secuencia variante alélica puede ser una secuencia de aminoácidos que sea la traducción de una secuencia de ácido nucleico que difiera por un sólo nucleótido de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 3, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 5, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 8, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 9, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 10, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 13, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 14, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 15, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 19, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 20, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 21 , más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 22, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 23, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 24, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 26, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%. En una modalidad, una NsG33 variante en posiciones correspondientes, comprende los residuos marcados en la figura 3A como completamente conservados (*), más preferiblemente una NsG33 variante comprende también en posiciones correspondientes los residuos marcados en la figura 3A como fuertemente conservados (: grupos fuertemente conservados incluyen: STA, NEQK, NHQK, NEDQ, QHRK, MILV, MILF, HY FYW), más preferiblemente una NsG33 variante comprende también en posiciones correspondientes los residuos marcados en la figura 3A como menos conservados (. grupos menos conservados incluyen: CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY). En particular, se contempla que las cisternas conservadas (figura 5) deban localizarse en posiciones correspondientes en una NsG33 variante. Modificaciones no de secuencia pueden incluir, por ejemplo, derivatizacion química in vivo o in vitro de porciones de NsG33 de ocurrencia natural, así como acetilación, metilación, fosforilación, carboxilación, PEG- ilación o glucosilación. Ya que es posible reemplazar sustituyentes de la proteína, es también posible sustituir grupos funcionales, que estén unidos a la proteína con grupos caracterizados por rasgos similares. Dichas modificaciones no alteran la secuencia primaria. Estas serán inicialmente conservativas, es decir, el grupo de reemplazo tendrá casi los mismos tamaño, forma, carácter hidrofóbico y carga que el grupo original. Muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, pueden modificarse en un polipéptido determinado, ya sea por procesos naturales tales como la glucosilación y otras modificaciones post-traducción, o por medio de técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente invención están, por nombrar unas cuantas ilustrativas, acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción hem, unión covalente de un polinucleótido o derivado de polinucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, entrelazamiento, iteración, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrelazamientos covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicación, glucosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodatación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, premiación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia, tal como arginilación, y ubiquitinación. Dichas modificaciones son bien conocidas por los expertos en la técnica, y se han descrito en gran detalle en la literatura científica. Varias modificaciones particularmente comunes, glucosilación, unión de lípidos, sulfatación, carboxilación gamma de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación de ADP, por ejemplo, se describen en la mayoría de textos básicos tales como, por ejemplo, I. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2a. ed., W. H. Freeman and Company, New York, 1993. Muchas revisiones detalladas están disponibles sobre este tema tales como, por ejemplo, las provistas por Wold, F., en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, ed., Academic Press, New York, pp 1- 12, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646, 1990, y Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992. Además, la proteína puede comprender un marcador de la misma que permita la purificación subsiguiente y opcionalmente la remoción del marcador usando una endopeptidasa. El marcador puede comprender también un sitio de digestión por proteasa que facilite la remoción subsiguiente del marcador. Ejemplos no limitativos de marcadores de afinidad, incluyen un marcador de polihistidina, un marcador de GST, un marcador de HA, un marcador Flag, un marcador C-myc, un marcador de HSV, un marcador V5, un marcador de proteína de unión a maltosa y un marcador del dominio de unión a celulosa. De preferencia, para producción y purificación, el marcador es un marcador de polihistidina. De preferencia, el marcador está en la porción C-terminal de la proteína. La secuencia de señal nativa de NsG33 puede reemplazarse también para incrementar la secreción de la proteína en producción recombinante en otros tipos de células de mamífero. Se apreciará, como es bien sabido y como se indicó anteriormente, que los polipéptidos no siempre son enteramente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser ramificados como resultado de ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, en general como resultado de eventos post-traducción, que incluyen eventos de procesamiento naturales y eventos llevados a cabo por medio de manipulación humana que no ocurren en forma natural. Pueden sintetizarse polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados por procesos naturales no de traducción, y por métodos enteramente sintéticos, como es bien sabido y están dentro del alcance de la presente invención. Pueden ocurrir modificaciones en cualquier parte en un polipéptido, incluyendo la estructura de base de péptidos, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. De hecho, el bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, por una modificación covalente, es común en polipéptidos sintéticos y de ocurrencia natural, y dichas modificaciones pueden estar también presentes en los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, el residuo amino terminal de polipéptidos obtenidos en E. coli antes del procesamiento proteolítico, casi invariablemente será N-formilmetionina. Las modificaciones que ocurren en un polipéptido serán con frecuencia una función de cómo se produce. Para poiipéptidos que se obtienen expresando un gen clonado en un hospedero, por ejemplo, la naturaleza y el alcance de las modificaciones serán determinadas en gran parte por la capacidad de modificación post-traducción de la célula hospedera y las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, no ocurre con frecuencia glucosilación en bacterias hospederas tales como E. coli. Por consiguiente, cuando se desee glucosilación, un polipéptido debe expresarse en un hospedero glucosilante, en general una célula eucariótica. Las células de insecto llevan a cabo con frecuencia las mismas glucosiíaciones post-traducción que las células de mamífero y, por esta razón, se han desarrollado sistemas de expresión de células de insecto para expresar eficientemente proteínas de mamífero que tengan patrones nativos de glucosilación, entre otros. Consideraciones similares se aplican a otras modificaciones. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente al mismo grado o un grado variable en varios sitios en un polipéptido determinado. Asimismo, un polipéptido determinado puede contener muchos tipos de modificaciones. En general, como se usa en la presente, el término polipéptido abarca dichas modificaciones, en particular las que están presentes en poiipéptidos sintetizados expresando un polinucleótido en una célula hospedera. Incluidos también dentro de la invención son agentes que se unen específicamente a una proteína de la invención, o un fragmento de dicha proteína. Estos agentes incluyen proteínas de fusión de inmunoglobulina y anticuerpos (incluyendo fragmentos Fab de cadena sencilla y de doble cadena, y otros, ya sea nativos, humanizados, primatizados o quiméricos). Otras descripciones de estas categorías de agentes están en el documento WO 95/16709, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. Los anticuerpos se refieren a moléculas intactas, así como a fragmentos de las mismas, tales como Fat>, F(ab j y Fv, que son capaces de unirse al determinante epitópico. Pueden prepararse anticuerpos que se unen a polipéptidos de NsG33, usando polipéptidos intactos o fragmentos que contengan pequeños péptidos de interés como el antígeno inmunizante. El polipéptido u oligopéptido usado para inmunizar a un animal puede derivarse de la traducción de ARN, o puede sintetizarse químicamente y puede conjugarse con una proteína portadora, si se desea. Vehículos usados comúnmente que se acoplan químicamente a péptidos, incluyen albúmina de suero de bovino, tiroglobulina y hemocianina de la lapa Flssurella. El péptido acoplado se usa entonces para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo). Los anticuerpos humanizados, como se usan en la presente, se refieren a moléculas de anticuerpo en las cuales los aminoácidos han sido reemplazados en las regiones de unión no de antígeno para asemejar más estrechamente un anticuerpo humano, mientras retienen aún la capacidad de unión original. Pueden usarse terapéuticamente anticuerpos humanizados para tratar condiciones, en donde sea deseable limitar o bloquear la acción de NsG33. Incluidos también dentro del alcance de la presente invención, son inmunoconjugados de anticuerpos y conjugados seleccionados del grupo que consiste de: un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina o un isótopo radiactivo; un miembro de un par de unión específico, tal como avidina o estreptavidina, o un antígeno; una enzima capaz de producir un producto detectable. Estos inmunoconjugados pueden usarse para dirigir los conjugados hacia células que expresan un receptor de NsG33. Anticuerpos específicos para alguna NsG33, son también útiles en inmunoensayos para cuantificar la sustancia para la cual un anticuerpo determinado tiene carácter específico. Anticuerpos específicos para una NsG33 pueden unirse también a soportes sólidos, tales como perlas o recipientes, y pueden usarse para remover el ligando de una solución, ya sea para su uso en la purificación de la proteína, o en la limpieza de la misma de la solución. Cada una de estas técnicas es de rutina para los expertos en las técnicas inmunológicas. También dentro del alcance de la presente invención, son proteínas de fusión con NsG33. Una proteína de fusión con NsG33 puede usarse para permitir la formación de imágenes de tejidos que expresen un receptor para NsG33, o en los métodos Ínmunohistologicos o preparativos descritos anteriormente para anticuerpos para una NsG33. Pueden usarse proteínas de fusión que abarquen una NsG33 para dirigir específicamente terapias médicas contra células que expresen un receptor de NsG33.

II. Secuencias de nucleotidos de NsG33 La invención provee el uso médico de ADN genómico y ADNc que codifica para NsG33 incluyendo, por ejemplo, la secuencia de nucleotidos genómica de humano (SEQ ID No. 1 ), las secuencias genómicas de ratón y rata (SEQ ID No. 6 y 11 ), la secuencia de nucleotidos de ADNc de NsG33 de humano, ratón y rata (SEQ ID No. 2, 7 y 12), las secuencias que codifican para NsG33 sin péptido de señal (nucleotidos 187-996 de SEQ ID No. 2, nucleotidos 74-883 de SEQ ID No. 7 y nucleotidos 64-873 de SEQ ID No. 12), y las secuencias que codifican para fragmentos de NsG33 N-terminales originados de humano, ratón y rata (SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 y SEQ ID No. 18). La invención provee también la secuencia de ADNc que codifica para NsG33 de longitud completa de ratón (SEQ ID No. 25). Variantes de estas secuencias se incluyen también dentro del alcance de la presente invención. La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada para uso médico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido o su secuencia complementaria, dicho polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21 , 22, 23 y 24; b) una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23 y 24, en donde la variante tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No.; y c) un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b). La molécula de ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de una variante de ácido nucleico alélica de ocurrencia natural. La molécula de ácido nucleico de la invención puede codificar para un polipéptido variante, en donde el polipéptido variante tiene la secuencia polipeptídica de una variante de polipéptido de ocurrencia natural. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico difiere por un sólo nucleótido de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18. De preferencia, el polipéptido codificado tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 5, 10 y 15, de preferencia por lo menos 65% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 70% de identidad de secuencia, más preferiblemente 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tenga una secuencia seleccionada del grupo que consiste de dichas SEQ ID Nos. En una modalidad preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3 y 4, de preferencia por lo menos 65% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 70% de identidad de secuencia, más preferiblemente 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tenga una secuencia seleccionada del grupo que consiste de dichas SEQ ID Nos. Dichas secuencias constituyen la NsG33 de humano. En una modalidad preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 19 y 22, de preferencia por lo menos 65% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 70% de identidad de secuencia, más preferiblemente 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tenga una secuencia seleccionada del grupo que consiste de dichas SEQ ID Nos. Dichas secuencias constituyen la NsG33 de humano. En una modalidad preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID No. 5, de preferencia por lo menos 65% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 70% de identidad de secuencia, más preferiblemente 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tenga una secuencia seleccionada del grupo que consiste de dicha SEQ ID No. Dicha secuencia constituye el polipéptido de NsG33 N-terminal de humano. En una modalidad preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos 60% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 4, 9 y 14, de preferencia por lo menos 65% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 70% de identidad de secuencia, más preferiblemente 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tenga una secuencia seleccionada del grupo que consiste de dicha SEQ ID No. Dicha secuencia constituye la NsG33 sin péptido de señal. En una modalidad preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 8 y 13, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tenga una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 8 y 13. En una modalidad preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 19, 20, 21 , 22, 23 y 24, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tenga una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 9, 20, 21 , 22, 23 y 24. En una modalidad preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 3, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tenga la secuencia de SEQ ID No. 3. En una modalidad preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tenga la secuencia de SEQ ID No. 4. En una modalidad preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 19, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tenga la secuencia de SEQ ID No. 19. En una modalidad preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 22, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tenga la secuencia de SEQ ID No. 22. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18; b) una secuencia de nucleotidos que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, , 12, 16, 17 y 18; c) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 150 nucleotidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18; c) el complemento de un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. , 2, 6, 7, 11 , 12, 6, 17 y 18 bajo condiciones de alta severidad; y d) la secuencia de ácido nucleico del complemento de cualquiera de los incisos anteriores. SEQ ID No. 16, 17 y 18 representan las secuencias que codifican para polipéptidos NsG33 C-terminales de humano, ratón y rata. Para expresión recombinante en un sistema de expresión eucariótico, éstas son ligadas de preferencia a secuencias codificantes de secuencia de señal adecuadas que aseguran que el polipéptido de NsG33 sea secretado de las células.

En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 2, 7, 12, 16, 17 y 18. En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 16, 17 y 18. En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 2 y 16. En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleotidos seleccionada del grupo que consiste de los nucleótidos 187-996 de SEQ ID No. 2, nucleótidos 74-883 de SEQ ID No. 7 y nucleótidos 64-873 de SEQ ID No. 12. Estos fragmentos de secuencia codifican para NsG33 sin péptido de señal. En una modalidad, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con la secuencia de polinucleotidos presentada como SEQ ID NO: 1. En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 2. En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 16. En una modalidad, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 6. En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%), más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 7.

En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 17. En una modalidad, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 11. En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 2. En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 18. En una modalidad preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 25. Un grupo preferido de polinucleótidos aislados incluye SEQ ID No. 1 , 2 y 16, que son polinucleótidos de NsG33 de humano. Otro grupo preferido de polinucleótidos aislados incluye SEQ ID No. 2, 7 y 12, que representan las secuencias de ADNc. En general, la secuencia de ADNc es mucho más corta que las secuencias genómicas que son insertadas más fácilmente en un vector de expresión adecuado, y transducidas/transfectadas en una célula de producción o una célula humana in vivo o ex vivo. Además, las secuencias de nucleótidos de la invención incluyen secuencias que son derivados de estas secuencias. La invención incluye también vectores, liposomas y otros vehículos portadores, que abarcan una de estas secuencias o un derivado de una de estas secuencias. La invención incluye también proteínas transcritas y traducidas de ADNc de NsG33, de preferencia ADNc de NsG33 de humano que incluye, pero no está limitado a, NsG33 de humano y sus derivados y variantes. En otra modalidad, la invención se refiere al uso de los ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención, para diseñar sondas para aislar otros genes que codifiquen para proteínas con propiedades estructurales o funcionales de las proteínas NsG33 de la invención. Las sondas pueden tener una variedad de pares de bases de longitud. Por ejemplo, una sonda de ácido nucleico puede estar entre aproximadamente 10 pares de bases de longitud a aproximadamente 150 pares de bases de longitud. En forma alternativa, la sonda de ácido nucleico puede ser más grande que aproximadamente 150 pares de bases de longitud. Métodos experimentales se proveen en Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", J. W'iley (ed.) (1999), cuyas enseñanzas enteras se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Ei diseño de la sonda de oligonucleótidos (referida también en la presente como ácido nucleico), debe seguir de preferencia estos parámetros: i) debe diseñarse para un área de la secuencia que tenga el menor número de bases ambiguas, si la hay, y ii) debe diseñarse para que tenga una Tm calculada de aproximadamente 80°C (suponiendo 2°C por cada A o T, y 4°C por cada G o C).

Debe marcarse de preferencia el oligonucleóíido para facilitar la detección de hibridación. La marcación puede ser con ATP ?32? (actividad específica de 6000 Ci/mmol) y T4 polinucleótido cinasa, usando técnicas usadas comúnmente para la marcación de oligonucleótidos. Pueden usarse también otras técnicas de marcación. La marca no incorporada debe removerse de preferencia por medio de cromatografía de filtración en gel u otros métodos establecidos. La cantidad de radiactividad incorporada en la sonda debe cuantificarse por medio de medición en un contador de escintilación. De preferencia, la actividad específica de la sonda resultante debe ser de aproximadamente 4 x 106 dpm/pmol. El cultivo de bacterias que contenga al grupo de clones de longitud completa debe descongelarse de preferencia, y deben usarse 00 ? de la provisión usada para inocular un matraz de cultivo estéril que contenga 25 mi de caldo de Luria estéril que contenga ampicilina a 100 pg/ml. El cultivo debe desarrollarse de preferencia hasta saturación a aproximadamente 37°C, y el cultivo saturado debe diluirse de preferencia en caldo de Luria fresco. Deben sembrarse en placa de preferencia alícuotas de estas diluciones para determinar la dilución y el volumen que darán aproximadamente 5000 colonias distintas y bien separadas sobre medios bacteriológicos sólidos que contengan caldo de Luria conteniendo ampicilina a 100 pg/ml y agar a 1.5% en una caja de Petri de 150 mm cuando se desarrollen durante la noche a aproximadamente 37°C. Pueden usarse también otros métodos conocidos para la obtención de colonias distintas bien separadas. Deben usarse entonces procedimientos estándar de hibridación de colonias para transferir las colonias a filtros de nitrocelulosa y lisarlas, desnaturalizarlas y hornearlas. Condiciones altamente severas (referidas también en la presente como "alta severidad"), son aquellas que son por lo menos tan severas como, por ejemplo, 1xSSC a aproximadamente 65°C, o 1 xSSC y formamida a 50% a aproximadamente 42°C. Condiciones de "severidad moderada", son aquellas que son por lo menos tan severas como 4xSSC a aproximadamente 65°C, o 4x SSC y formamida a 50% a aproximadamente 42°C. Condiciones de "severidad reducida", son aquellas que son por lo menos tan severas como 4x SSC a aproximadamente 50°C, o 6x SSC y formamida a 50% a 40°C. El filtro se incuba entonces de preferencia a aproximadamente 65°C por 1 hora, con agitación suave en 6X SSC (20x de provisión equivale a 175.3 g de NaCI/litro, 88.2 g de citrato de sodio/litro, ajustados a pH 7.0 con NaOH) que contiene SDS a 0.5%, 100 g/ml de ARN de levadura y EDTA a 10 mM (aproximadamente 10 mL por filtro de 150 mm). De preferencia, la sonda se añade entonces a la mezcla de hibridación a una concentración mayor que o igual a 1 x 106 dpm/mL. El filtro se incuba entonces de preferencia a aproximadamente 65°C con agitación suave durante la noche. El filtro se lava entonces de preferencia en 500 mL de 2x SSC/SDS a 0.5% a temperatura ambiente sin agitación, de preferencia seguido por 500 mL de 2x SSC/SDS a 0.1 % a temperatura ambiente con agitación suave por 15 minutos. Un tercer lavado con 0.1x SSC/SDS a 0.5% a aproximadamente 65°C por 30 minutos, es opcional. El filtro se seca entonces de preferencia y se somete a autorradiografía por tiempo suficiente para visualizar los positivos en la película de rayos X. Pueden usarse también otros métodos de hibridación conocidos. Las colonias positivas se seleccionan entonces, se desarrollan en cultivo, y se aisla ADN de plásmido usando procedimientos estándar. Los clones pueden verificarse entonces por análisis de restricción, análisis de hibridación o secuenciación de ADN. En forma alternativa, condiciones experimentales adecuadas para determinar la hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homologa, implican pre-remojo del filtro que contiene a los fragmentos de ADN, o ARN para hibridar en 5 x SSC [cloruro de sodio/citrato de sodio; véase Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989] por 10 minutos, y prehibridación del filtro en una solución de 5x SSC, 5x solución de Denhardt [véase Sambrook et al; en la obra citada], SDS a 0.5% y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado desnaturalizado [véase Sambrook et ai; en la obra citada], seguida de hibridación en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de una sonda cebada al azar [Feinberg A P y Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983 132 6-13], marcada con 32P-dCTP (actividad específica de 1 x 09 cpm/pg) por 12 horas a aproximadamente 45°C. El filtro se lava entonces dos veces por 30 minutos en 0.1 x SSC, SDS a 0.5% a una temperatura de por lo menos 60°C (condiciones de severidad media), de preferencia por lo menos 65°C (condiciones de severidad media/alta), más preferiblemente por lo menos 70°C (condiciones de alta severidad), y aún más preferiblemente de por lo menos 75°C (condiciones de muy alta severidad). Las moléculas con las cuales la sonda de oligonucleótidos híbrida bajo estas condiciones, puede detectarse usando una película de rayos X. En otra modalidad, la invención se refiere a secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN) que hibridan con ácidos nucleicos de NsG33, en particular, ácidos nucleicos que hibridan con SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID No. 1 1 , SEQ ID No. 12, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17 o SEQ ID No 18 bajo condiciones de severidad alta, moderada o reducida como se describió anteriormente. En otra modalidad, la invención se refiere a un complemento de ácido nucleico de NsG33. En particular, se refiere a complementos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No 11 , SEQ ID NO 12, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17 y SEQ ID No 18. En otra modalidad, la invención se refiere a una contraparte de ARN del ácido nucleico (ADN) de NsG33. En particular, se refiere a contrapartes de ARN de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17 y SEQ ID No 18. Se contemplan también moléculas de ácido nucleico optimizadas en codones para expresión mejorada en células hospederas seleccionadas que incluyen, pero no están limitadas a, E. coli, especies de levadura, hámster chino, cría de hámster, insecto y hongo. Pueden obtenerse ácidos nucleicos variantes por medio de métodos de mutagénesis del estado de la técnica. Se contemplan también métodos para entremezclar secuencias codificantes de humano con las de ratón, rata o chimpancé. Específicamente, una variante entremezclada puede estar entre SEQ ID No. 2 por un lado, y 7 y/o 12 por otro. Se incluyen también variantes entremezcladas entre SEQ ID No. 7 y 12.

III. Uso de polipéptidos de NsG33, polinucleótidos y células que secretan NsG33 para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso En una modalidad, se provee NsG33 variante nativa y fragmentos de la misma y/o proteínas de fusión que comprenden NsG33, para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso de mamíferos. Puede usarse NsG33 para estimular el crecimiento de células neurales, que incluye proliferación, función neural, regeneración neural, diferenciación neural, migración neural y/o supervivencia neural en situaciones de enfermedad en donde estas células se pierden o son dañadas. En una modalidad, pueden usarse polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención para tratar condiciones o enfermedades en donde sea deseable el crecimiento neural, que incluye proliferación, diferenciación, función, supervivencia y/o regeneración. Los polipéptidos de la presente invención pueden usarse directamente, por ejemplo, por medio de composiciones farmacéuticas inyectadas, implantadas o ingeridas, para tratar un proceso patológico sensible a los polipéptidos de NsG33. Esto es apoyado por los análisis de bioinformática que muestran que NsG33 es un factor de crecimiento secretado, el hecho de que NsG33 es capaz de proteger a una línea de células neurales de apoptosis (ejemplo 6), el hecho de que NsG33 causa la generación de un porcentaje incrementado de neuronas en una prueba de diferenciación de células progenitoras neurales humanas y en cultivos estriatales primarios de rata, y el hecho de que NsG33 es expresada preferiblemente en el sistema nervioso, incluyendo el ojo (figuras 4A-4B). El efecto antiapoptótico de NsG33, la hace una proteína/gen candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso que implican muerte celular apoptótica. Dichos trastornos incluyen apoplejía, trauma y trastornos neurodegenerativos. El efecto neuroprotector y/o de neurogénesis de NsG33, apoya el uso para el tratamiento de trastornos causados por pérdida, disfunción o degeneración de neuronas o sus procesos. NsG33 puede actuar sobre una gama de diferentes tipos de células que están presentes en el sistema nervioso. En el contexto de la presente invención, se pretende que el sistema nervioso abarque el sistema nervioso central, el sistema nervioso periférico, el ojo y el complejo cocleovestibular. En una modalidad, los polipéptidos de NsG33 pueden actuar sobre neuronas que incluyen, pero no están limitadas a, neuronas motoras y neuronas sensitivas. En otra modalidad, el efecto terapéutico de los polipéptidos de NsG33 puede ser a través de la acción sobre células gliales, tales como oligodendrocitos y/o astrocitos. A través de su acción sobre células gliales, los polipéptidos de NsG33 pueden estar implicados en mielinización y en el mantenimiento de la función y supervivencia neuronales. En otra modalidad, los polipéptidos de NsG33 pueden actuar sobre células sensitivas que incluyen, pero no están limitadas a, células ganglionares retinianas, células fotorreceptoras, tejido de soporte tal como células epiteliales retinianas, y células pilosas del oído. En otra modalidad, los polipéptidos de NsG33 pueden actuar sobre células madre, y células precursoras corriente abajo que incluyen, pero no están limitadas a, precursores neuronales y precursores gliales. Los polipéptidos de NsG33 pueden actuar sobre células madre y/o precursores neuronales o gliales para causar crecimiento que incluye proliferación, para causar diferenciación, y/o migración. La terapia con células madre puede hacerse a través de terapia génica in vivo o ex vivo, o la proteína puede administrarse a un sitio con células madre. Esto es apoyado por el efecto de NsG33 sobre una línea de células progenitoras neurales humanas. El trastorno o enfermedad o daño puede ser daños del sistema nervioso causados por trauma, cirugía, isquemia, infección, enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, malignidad o agentes tóxicos, y procesos genéticos o idiopáticos. En una modalidad del método de la invención, la enfermedad o trastorno o daño implica lesión al cerebro, tallo cerebral, la médula espinal y/o nervios periféricos, que resulta en condiciones tales como apoplejía, lesión cerebral traumática (TBI), lesión de médula espinal (SCI), lesión axonal difusa (DAI), epilepsia, neuropatía, neuropatía periférica y dolor asociado y otros síntomas que estos síndromes pueden causar. En otra modalidad, la enfermedad, trastorno o daño implica la degeneración de neuronas y sus procesos en el cerebro, tallo cerebral, la médula espinal y/o nervios periféricos, tales como trastornos neurodegenerativos que incluyen, pero no están limitados a, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, demencia senil, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), lesión neuronal/axonal asociada con esclerosis múltiple (MS), y síntomas asociados. En otra modalidad, la enfermedad, trastorno o daño implica disfunción y/o pérdida de neuronas en el cerebro, tallo cerebral, la médula espinal y/o nervios periféricos, tales como disfunción y/o pérdida causada por enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, lesión tóxica, malignidad y/o condiciones genéticas o idiopáticas que incluyen, pero no están limitadas a, diabetes, disfunción renal, alcoholismo, quimioterapia, agentes químicos, abuso de fármacos, deficiencias de vitaminas, infección, y síntomas asociados. En otra modalidad, la enfermedad, trastorno o daño implica la degeneración o esclerosis de células gliales, tales como oligodendrocitos, astrocitos y células de Schwann en el cerebro, tallo cerebral, la médula espinal y sistema nervioso periférico e incluye, pero no está limitado a, esclerosis múltiple (MS), neuritis óptica, esclerosis cerebral, encefalomielitis post-infecciosa y epilepsia, y síntomas asociados. En otra modalidad, la enfermedad, trastorno o daño implica la retina, fotorreceptores y nervios asociados e incluye, pero no está limitado a, retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, y síntomas asociados. En otra modalidad, la enfermedad, trastorno o daño implica el epitelio sensitivo y ganglios asociados del complejo vestibuloacústico e incluye, pero no está limitado a, pérdida de audición inducida por ruido, sordera, tinitus, otitis, laberintitis, atrofias hereditaria y cocleovestibular, enfermedad de Meniere, y síntomas asociados. En una modalidad preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y composiciones farmacéuticas de la invención, se usan en el tratamiento de enfermedad de Parkinson. Esta función se basa en el hallazgo de altos niveles de expresión en el cerebro medio central, en la sustancia negra y en el putamen (véase ejemplo 5), y el hallazgo de expresión en el mesencéfalo durante el desarrollo del embrión humano (ejemplo 3), el hecho de que NsG33 causa la generación de un porcentaje incrementado de neuronas en una prueba de diferenciación de células progenitoras neurales humanas y en cultivos estriatales primarios de rata, y es apoyada por el hallazgo de protección contra muerte celular apoptótica (ejemplo 6). La función puede verificarse usando el bioensayo para actividades neurotróficas dopaminérgicas (ejemplo 11 ) e in vivo a través del modelo de lesión con 6-OHDA intraestriatal (ejemplo 12).

La enfermedad de Huntington (HD), es un trastorno autosómico dominante que resulta en la degeneración progresiva de varias poblaciones neuronales dentro del cerebro, en particular las neuronas espinosas medias gabaminérgicas localizadas en el núcleo caudado. Asociadas con esta generación, las neuronas de entrada glutaminérgicas corticales degeneran también, y la degeneración combinada da razón de la mayoría de los síntomas característicos de movimientos motores discinéticos progresivos, así como demencia. En una modalidad preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el tratamiento de enfermedad de Huntington. Esta se basa en el hallazgo de alta expresión en el putamen, combinada con los resultados de los análisis de bioinformática y la actividad neuroprotectora/de neurogénesis de NsG33 (en particular el ejemplo 15, pero también los ejemplos 6 y 14). La enfermedad de Huntington es una enfermedad excitotóxica. Un bioensayo excitotóxico es la prueba descrita en el ejemplo 12 de la presente invención. Otro ejemplo de bioensayo para la verificación de este efecto neuroprotector de NsG33 incluye, por ejemplo, el bioensayo sobre la protección de cultivos primarios de cortes de hipocampo contra los efectos excitotóxicos de NMDA (véase documento WO 03/004527, ejemplo 5). En otra modalidad preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el tratamiento de neuropatías periféricas. Esto se basa 1 en el hallazgo de alta expresión en el ganglio de la raíz dorsal, combinada con los resultados de los análisis de bioinformática y con la actividad neuroprotectora/de neurogénesis y el efecto antiapoptótico de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 15). La verificación de esta función puede hacerse con la prueba del cultivo del ganglio de la raíz dorsal descrita en el ejemplo 9. Entre las neuropatías periféricas contempladas para el tratamiento con las moléculas de esta invención, están neuropatías inducidas por trauma, por ejemplo, las causadas por lesión física o estado de enfermedad, daño físico a los nervios periféricos, tales como discos herniados y el cerebro, daño físico a la médula espinal, apoplejía asociada con daño cerebral, y trastornos neurológicos relacionados con neurodegeneración. Los presentes inventores contemplan también el tratamiento de neuropatías inducidas por quimioterapia (tales como las causadas por el suministro de agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, taxol o cisplatino); neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por deficiencias de vitaminas, neuropatías idiopáticas y neuropatías diabéticas. En otra modalidad preferida, los polípéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y composiciones de la invención se usan en el tratamiento de trastornos, enfermedades o daños asociados con el cerebelo que incluyen, pero no están limitados a, ataxia sensitiva, esclerosis múltiple, trastornos espinocerebelares neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelares (tales como atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de Shy-Drager (atrofia de sistemas múltiples)), y alcoholismo. Esta función es apoyada por los altos niveles de expresión en el cerebelo del humano adulto y la expresión diferencial en el cerebelo de ratón en desarrollo, combinados con los análisis de bioinformática y la actividad neuroprotectora/de neurogénesis y el efecto antiapoptótico de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 15). La verificación de esta función puede hacerse con las pruebas descritas en los ejemplos 7 y 8 (protección de células granulares cerebelares de la toxicidad del glutamato y la privación de potasio). En otra modalidad preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal y lesión de médula espinal (por ejemplo, isquémica o traumática). Esto se basa en el hallazgo de altos niveles de expresión en la médula espinal del humano adulto y la expresión diferencial en la médula espinal de ratón en desarrollo, combinados con los resultados de los análisis de bioinformática y con la actividad neuroprotectora/de neurogénesis y el efecto antiapoptótico de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 5). La verificación de esta función terapéutica específica, puede hacerse con la prueba de neuronas motoras descrita en el ejemplo 10. En una modalidad preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores, cápsulas y composiciones de la invención se usan en el tratamiento de enfermedades, trastornos o daños que implican la retina e incluyen, pero no están limitados a, retinitis pigmentosa, degeneración macular y glaucoma. Este uso terapéutico específico es apoyado por los análisis experimentales y de bioinformática que muestran que NsG33 es un factor de crecimiento secretado altamente expresado en la retina (figuras 4A-4B). Otros factores de crecimiento tienen usos terapéuticos importantes en el sistema nervioso central y periférico, y en varias indicaciones oculares asociadas con pérdida de células en la retina y/o córnea. Por ejemplo, el NGF, es un candidato para enfermedad de Alzheimer, úlcera corneal (véase documentos US 6,063,757 y EP 0 973 872) y retinopatías. Neublastin (Artemin) es un candidato para neuropatía periférica (véase documento WO 02/078730) y cicatrización de herida corneal (véase documento EP 1 223 966). El GDNF es un candidato para enfermedad de Parkinson, ALS, lesión de médula espinal y/o cicatrización de heridas, en particular en córnea (véase documento EP 1 223 966). La confirmación de dicho uso puede lograrse por el uso de varias pruebas in vitro del estado de la técnica (pruebas de explantes retiñíanos, cultivos de córnea). La verificación de la función puede lograrse también en modelos animales del estado de la técnica para heridas de córnea (lesión corneal en conejos) y retina (modelos de mutantes de retinitis pigmentosa disponibles para ratón y rata). En otra modalidad, la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad excitotóxica seleccionada del grupo que consiste de isquemia, epilepsia y trauma debido a lesión, paro cardiaco o apoplejía. Esta función es apoyada también por la actividad neuroprotectora/de neurogénesis y la actividad antiapoptótica de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 15). La prueba del cultivo de cortes de hipocampo mencionada anteriormente y la prueba del ejemplo 7 de la presente Invención son ejemplos no limitativos de la prueba, que pueden usarse para demostrar un efecto biológico, indicativo de uso terapéutico para el tratamiento de enfermedades excitotóxicas. Se considera que el término "sujeto", como se usa en la presente, significa cualquier mamífero al cual pueden administrarse polipéptidos o polinucleótidos, células terapéuticas o cápsulas biocompatibles de NsG33. Los sujetos destinados específicamente para el tratamiento con el método de la invención incluyen humanos, así como primates no humanos, ovejas, caballos, ganado, cabras, cerdos, perros, gatos, conejos, conejillos de Indias, hámsteres, gerbos, ratas y ratones, así como los órganos, tumores y células que se derivan de estos hospederos, o que se originan de los mismos.

IV. Tratamiento de trastornos inmunologicos En una modalidad, se contempla a NsG33 para su uso en el tratamiento de trastornos inmunologicos. Esta función particular de NsG33 se basa en la similitud estructural de NsG33 con una proteína con funciones inmunológicas descrita en el documento WO 93/22437 como se describió anteriormente. De conformidad con esta modalidad, NsG33 puede exhibir actividad de estimulación inmune o de supresión inmune que incluye, sin limitación, las actividades para las cuales se describen pruebas en la presente. NsG33 puede ser útil en el tratamiento de varias deficiencias y trastornos inmunes (que incluyen inmunodeficiencia combinada severa (SCID)), por ejemplo, en la regulación (sobrerregulación o subregulación) del crecimiento y la proliferación de linfocitos T y/o B, así como realización de la actividad citolítica de células NK y otras poblaciones de células. Estas deficiencias inmunes pueden ser genéticas, o pueden ser causadas por infecciones virales (por ejemplo, VIH), así como infecciones bacterianas o por hongos, o pueden resultar de trastornos autoinmunes. Más específicamente, causas de enfermedades infecciosas por infección viral, bacteriana, por hongos u otras infecciones pueden ser tratables usando NsG33, e incluyen infecciones por VIH, virus de hepatitis, virus de herpes, micobacterias, Leishmania spp. y especies de malaria, y varias infecciones por hongos, como es el caso de la candidiasis. A este respecto, NsG33 puede ser también útil en donde pueda ser deseable un refuerzo para el sistema inmune en general, es decir, en el tratamiento de cáncer. Trastornos autoinmunes que pueden tratarse usando NsG33 incluyen, por ejemplo, enfermedad de tejido conectivo, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, inflamación pulmonar autoinmune, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis autoinmune, diabetes mellitus insulinodependiente, miastenia grave, enfermedad de injerto contra hospedero y enfermedad ocular inflamatoria autoinmune. La proteína NsG33 (o antagonistas de la misma, incluyendo anticuerpos) puede ser también útil en el tratamiento de reacciones y condiciones alérgicas (por ejemplo, anafilaxis, enfermedad del suero, reacciones a fármacos, alergias a alimentos, alergias al veneno de insectos, mastocitosis, rinitis alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, urticaria, angioedema, eczema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica por contacto, eritema multiforme, síndrome de Stevens- Johnson, conjuntivitis alérgica, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis venérea, conjuntivis papilar gigante y alergias por contacto), tales como asma (en particular asma alérgico) u otros problemas respiratorios. Otras condiciones en las cuales se desea supresión inmune (incluyendo, por ejemplo, trasplante de órganos), pueden tratarse también usando una proteína NsG33 (o antagonistas de la misma). Los efectos terapéuticos de los polipéptidos o antagonistas de los mismos en reacciones alérgicas pueden evaluarse por medio de modelos animales in vivo, tales como la prueba de mejora acumulativa por contacto (Lastbom et al., Toxicology 125: 59-66,1998), prueba de pinchazo de la piel (Hoffmann et al., Allergy 54: 446-54,1999), prueba de sensibilización de la piel de conejillos de Indias (Vohr et al., Arch. Toxicol. 73: 501-9), y prueba local de nodulos linfáticos de murino (Kimber et al., J. Toxicol. Environ. Health 53: 563-79). Mediante el uso de NsG33 puede ser también posible modular de muchas formas respuestas inmunes. La subregulación puede estar en la forma de inhibición o bloqueo de una respuesta inmune ya en progreso, o puede implicar prevención de la inducción de una respuesta inmune. Las funciones de células T activadas pueden ser inhibidas suprimiendo respuestas de células T, o induciendo tolerancia específica en células T, o ambas. La inmunosupresión de respuestas de células T es en general un proceso activo no específico del antígeno, que requiere exposición continua de las células T al agente supresor. La tolerancia, que implica inducción ante la falta de capacidad de respuesta o anergia en células T, se distingue de la inmunosupresión porque es en general específica del antígeno y persiste después de que ha cesado la exposición al agente de tolerancia. Operacionalmente, puede demostrarse tolerancia por la falta de una respuesta de células T tras la reexposición al antígeno específico en ausencia del agente de tolerancia. La subregulación o prevención de una o más funciones del antígeno (incluyendo, sin limitación, funciones del antígeno de linfocitos B (tal como, por ejemplo, B7)), por ejemplo, prevención de la síntesis de alto nivel de linfocinas por células T activadas, será útil en situaciones de trasplante de tejidos, piel y órganos y en enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD). Por ejemplo, el bloqueo de la función de células T debe resultar en destrucción reducida del tejido en el trasplante de tejidos. Típicamente, en trasplantes de tejidos, el rechazo del trasplante se inicia a través de su reconocimiento como extraño por las células T, seguido de una reacción inmune que destruye al trasplante. La administración de una composición farmacéutica de la invención puede prevenir la síntesis de citocinas por células inmunes, tales como células T, y de esta manera actúa como un Ínmunosupresor. Además, una falta de coestímulacion puede ser también suficiente para anergizar células T, induciendo de esta manera tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia a largo plazo por reactivos que bloquean a los antígenos de los linfocitos B, puede evitar la necesidad de la administración repetida de estos reactivos de bloqueo. Para lograr inmunosupresión o tolerancia suficiente en un sujeto, puede ser también necesario bloquear la función de una combinación de antígenos de linfocitos B. La eficacia de composiciones farmacéuticas particulares en la prevención del rechazo del trasplante de órganos o GVHD, puede evaluarse usando modelos animales que sean proféticos de eficacia en humanos. Ejemplos de sistemas adecuados que pueden usarse incluyen injertos cardiacos alogénicos en ratas, e injertos xenogénicos de células de los islotes pancreáticos en ratones, los cuales se han usado para examinar los efectos inmunosupresores de proteínas de fusión CTLA4lg in vivo como se describe en Lenschow et al., Science 257: 789-792 (1992) y en Turka et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 89: 11102-1 1 105 (1992). Además, pueden usarse modelos de GVDH de murino (véase Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 846-847) para determinar el efecto de composiciones terapéuticas de la invención sobre el desarrollo de esa enfermedad. El bloqueo de la función del antígeno puede ser también terapéuticamente útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de la activación inadecuada de células T que son autorreactivas contra el tejido y que promueven la producción de citocinas y autoanticuerpos implicados en la patología de las enfermedades. La prevención de la activación de células T autorreactivas puede reducir o eliminar síntomas de enfermedad. La administración de agentes que bloqueen la estimulación de células T, puede usarse para inhibir la activación de células T y prevenir la producción de autoanticuerpos o citocinas derivadas de células T que puedan estar implicadas en el proceso de enfermedad. Además, los reactivos de bloqueo pueden inducir tolerancia de células T autorreactivas específica del antígeno, que podría llevar al alivio a largo plazo de la enfermedad. La eficacia de los reactivos de bloqueo en la prevención o el alivio de trastornos autoinmunes, puede determinarse usando muchos modelos animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunes de animales. Ejemplos incluyen encefalitis autoinmune experimental en murinos, lupus eritematoso sistémico en ratones MRL/pr/lpr o ratones híbridos NZB, artritis autoinmune por colágena en murinos, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB, y miastenia grave experimental en murinos (véase Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 840-856). La sobrerregulacion de la función del antígeno (por ejemplo, la función del antígeno de linfocitos B), como un medio de sobrerregulacion de respuestas inmunes, puede ser también útil en terapia. La sobrerregulacion de respuestas inmunes puede estar en la forma de mejora de una respuesta inmune existente o inducción de una respuesta inmune inicial. Por ejemplo, la mejora de una respuesta inmune puede ser útil en casos de infección viral, que incluye enfermedades virales sistémicas tales como influenza, resfriado común y encefalitis.

En forma alternativa, pueden mejorarse respuestas inmunes antivirales en un paciente infectado removiendo células T del paciente, coestimulando a las células T in vitro con APCs pulsadas con antígenos virales ya sea expresando una NsG33, o en conjunto con una forma estimuladora de una NsG33 soluble de la presente invención, y reintroduciendo las células T activadas in vitro en el paciente. Otro método para mejorar respuestas inmunes antivirales, sería aislar células infectadas de un paciente, transfectándolas con un ácido nucleico que codifique para NsG33 como se describe en la presente, de modo que las células expresen la proteína completa o una porción de la misma sobre su superficie, y reintroduciendo las células transfectadas en el paciente. Las células infectadas serían ahora capaces de suministrar una señal coestimuladora hacia células T in vivo, activando de esta manera las mismas. NsG33 puede proveer la señal de estimulación necesaria a células T, para inducir una respuesta inmune mediada por células T contra las células tumorales transfectadas. Además, células tumorales que carezcan de moléculas del MHC clase I o MHC clase II, o que no puedan reexpresar cantidades suficientes de moléculas del MHC clase I o MHC clase II, pueden ser transfectadas con un ácido nucleico que codifique para la totalidad o una porción (por ejemplo, una porción truncada de dominio citoplásmico) de una proteína de la cadena alfa del MHC clase I y la proteína p2-microglobulina o una proteína de la cadena alfa del MHC clase II y una proteína de la cadena beta del MHC clase II, para expresar de esta manera proteínas del MHC clase I o MHC clase II sobre la superficie de la célula. La expresión del MHC clase I o clase II adecuado en conjunto con un péptido que tenga la actividad de un antígeno de linfocitos B (por ejemplo, B7-1 , B7-2, B7-3), induce una respuesta inmune mediada por células T contra la célula tumoral transfectada. Opcionalmente, un gen que codifique para una construcción antisentido que bloquee la expresión de una proteína asociada al MHC clase II, tal como la cadena invariante, puede ser cotransfectado también con un ADN que codifique para un péptido que tenga la actividad de un antígeno de linfocitos B para promover la presentación de antígenos asociados al tumor, e inducir inmunidad específica al tumor. De esta manera, la inducción de una respuesta inmune mediada por células T en un sujeto humano, puede ser suficiente para superar la tolerancia específica del tumor en el sujeto. La actividad de NsG33 puede medirse, entre otros medios, a través de los siguientes métodos: pruebas adecuadas para citotoxicidad de timocitos o esplenocitos incluyen, sin limitación, las descritas en: Current Protocols in Immunology, ed. por J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley- Interscience (capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981 ; Herrmann eí al., J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai er a/., I. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 40: 508-5 2, 1988; Bowman eí al., J. Virology 61 : 1992-1998; Bertagnolli ef al., Cellular Immunology 133: 327-341 , 1991 ; Brown et al., J. Immunol. 153: 3079-3092, 1994. Pruebas para respuestas de inmunoglobulina dependientes de células T y cambio de isotipos (que identificarán, entre otras, proteínas que modulan respuestas de anticuerpo dependientes de células T, y que afectan perfiles Th1/Th2) incluyen, sin limitación, las descritas en: aliszewski, J. Immunol. 144: 3028-3033, 1990; y Assays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J. J. y Brunswick, M. en Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 994. Pruebas de reacción mixta de linfocitos (MLR) (que identificarán, entre otras, proteínas que generan predominantemente respuestas Th1 y CTL) incluyen, sin limitación, las descritas en: Current Protocols in Immunology, ed. por J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley-lnterscience (capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992. Pruebas dependientes de células dendríticas (que identificarán, entre otras, proteínas expresadas por células dendríticas que activan a células T no afectadas) incluyen, sin limitación, las descritas en: Guery et al., J. Immunol. 134: 536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 1 73: 549-559, 1991 ; Macatonia et al., Journal of Immunology 154: 5071-5079, 1995; Porgador et ai, Journal of Experimental Medicine 182: 255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67: 4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264: 961 -965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169: 1255- 1 264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94: 797-807, 1 994; e Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172: 631 -640,1990. Pruebas para apoptosis/supervivencia de linfocitos (que identificarán, entre otras, proteínas que previenen la apoptosis después de la inducción de superantígenos, y proteínas que regulan la homeostasis de linfocitos) incluyen, sin limitación, las descritas en: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7: 659-670, 1993; Gorczyca et al., Cáncer Research 53: 1945-1951 , 1993; Itoh et al., Cell 66: 233-243, 1991 ; Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14: 891 -897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1 : 639-648, 1992. Pruebas para proteínas que influyen sobre las etapas tempranas de compromiso y desarrollo de células T incluyen, sin limitación, las descritas en: Antica et al., Blood 84: 1 1 1 -1 17, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 55: 1 11 -122, 1994; Galy et al., Blood 85: 2770-2778, 1995; y Toki et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 88: 7548-7551 , 1991 .

V. Administración y formulaciones de polipéptidos Un tejido objetivo para terapia con NsG33, es una región del cerebro que se selecciona por su capacidad de respuesta retenida a NsG33. En humanos, neuronas que retienen la capacidad de respuesta a factores de crecimiento en la edad adulta, incluyen las neuronas básales colinérgicas del prosencéfalo, las neuronas corticales entorrinales, las neuronas talámicas, las neuronas del locus cinereus, las neuronas sensitivas espinales, las neuronas motoras espinales, neuronas de la sustancia negra, neuronas del simpático, ganglios de la raíz dorsal, neuronas de la retina, neuronas óticas, neuronas cerebelares y ganglios ciliares. Células madre, tales como las células madre de la zona subventricular, y células progenitoras neurales y gliales, retienen también capacidad de respuesta a factores de crecimiento en la edad adulta. Asimismo, los oligodendrocitos mielinizantes retienen la capacidad de respuesta a factores de crecimiento en la edad adulta. Los polipéptidos de NsG33 pueden administrarse de cualquier manera que sea médicamente aceptable. Esto puede incluir inyecciones, por vías parenterales tales como intravenosa, intravascular, intraarterial, subcutánea, intramuscular, ¡ntratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural, intertraqueal, intratecal, intracerebroventricular, ¡ntercerebral, interpulmonar y otras, así como nasal, oftálmica, rectal o tópica. La administración de liberación sostenida se incluye también específicamente en la invención, por medios tales como inyecciones de depósito o implantes erosionables. La administración per-oral es también concebible, siempre que la proteína sea protegida contra la degradación en el estómago. La administración de una NsG33 de conformidad con esta invención, puede lograrse usando cualquier medio de suministro adecuado, que incluye: - bomba (véase, por ejemplo, Annals of Pharmacotherapy, 27: 912 (1993); Cáncer 41 : 1270 (1993); Cáncer Research, 44: 1698 (1984), incorporadas en la presente como referencia); - microencapsulación (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 4,352,883; 4,353,888; y 5,084,350, incorporadas en la presente como referencia); - implantes de polímeros de liberación continua (véase, por ejemplo, Sabel, patente de los Estados Unidos 4,883,666, incorporada en la presente como referencia); - células encapsuladas (véase, sección X); - injertos de células desnudas o no encapsuladas al SNC (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 5,082,670 y 5,618,531 , incorporadas en la presente como referencia); - inyección, ya sea subcutáneamente, intravenosamente, intraarterialmente, intramuscularmente, o a otro sitio adecuado; - inhalación; y - administración oral, en cápsula, líquido, tableta, pildora o formulación de liberación prolongada. La administración puede ser por inyecciones periódicas de un bolo de la preparación, o puede hacerse más continua por administración intravenosa o intraperitoneal de un depósito que sea externo (por ejemplo, una bolsa IV) o interno (por ejemplo, un implante bioerosionable, un órgano bioartificial, una cápsula biocompatible de células productoras de NsG33 o una colonia de células productoras de NsG33 implantadas). Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,407,957, 5,798,113 y 5,800,828, incorporadas en la presente como referencia. Métodos y aparatos de suministro intrapulmonar se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. 5,654,007, 5,780,014 y 5,814,607, incorporadas en la presente como referencia. Aparte del suministro sistémico, se contempla también el suministro directamente al NsG33 o el ojo detrás de las barreras hemoencefálica o hemorretiniana. El suministro localizado puede ser por medios tales como suministro por medio de un catéter hacia una o más arterias, tales como la arteria oftálmica hacia el ojo, y la arteria cerebral hacia el SNC. Métodos para el suministro local basado en bombas de formulaciones de proteína hacia el SNC, se describen en el documento US 6,042,579 (Medtronic). Otro tipo de suministro localizado comprende suministro usando células encapsuladas (véase sección IX). Otro tipo de suministro localizado comprende suministro local de vectores de terapia génica, que son inyectados normalmente. Para el tratamiento de trastornos oculares, el suministro puede ser sistémico, o local tal como suministro por medio de la arteria oftálmica. En otra modalidad, el suministro es por medio de terapia con células encapsuladas, en donde las células encapsuladas son implantadas intravítreamente. El suministro de formulaciones de proteína o vector de terapia génica puede hacerse usando inyecciones subretinianas, inyección intravítrea o inyección transesclerótica. Para el tratamiento de enfermedad de Parkinson, pueden seguirse varias vías de suministro. Pueden administrarse formulaciones de proteína con bombas intracerebroventricularmente o intraparenquimáticamente, de preferencia hacia el cuerpo estriado y/o la sustancia negra, más preferiblemente hacia el intraputamen. Sin embargo, un método de suministro más preferido comprende terapia con células encapsuladas, en donde las cápsulas son implantadas intracerebroventricularmente o intraparenquimáticamente, de preferencia en el cuerpo estriado y/o la sustancia negra, y más preferiblemente en el putamen. En una modalidad relacionada con el tratamiento de enfermedad de Parkinson, se administra un vector de terapia génica hacia el cuerpo estriado del cerebro. La inyección en el cuerpo estriado puede marcar sitios objetivo localizados en varias regiones distantes del cerebro, por ejemplo, el globo pálido, amígdala, núcleo subtalámico o la sustancia negra. La transducción de células en el cuerpo pálido causa comúnmente marcación retrógrada de células en el tálamo. En una modalidad preferida, el sitio objetivo o los sitios objetivo son la sustancia negra. En una modalidad para tratar HD, se aplica NsG33 al cuerpo estriado, de preferencia el núcleo caudado para proteger a las neuronas de la degeneración, resultando en protección de las neuronas del cuerpo caudado y las neuronas de entrada corticales. En una modalidad preferida, la aplicación debe ocurrir antes del inicio de cambios degenerativos mayores. El tratamiento incluiría el diagnóstico genético de la enfermedad a través de la historia familiar y el análisis del ADN de la sangre, seguidos de la aplicación local de NsG33. Esto iría acompañado del suministro de NsG33 hacia el cuerpo estriado por medio de bombeo de la proteína con el uso de bombas de infusión y catéteres médicamente aplicables, por ejemplo, la bomba Synchrotron de Medtronic. En una segunda estrategia, podría usarse terapia génica directa usando vectores virales o no virales para modificar las células hospederas en el cuerpo estriado u otras neuronas afectadas que secretan NsG33. En una tercera estrategia, pueden aplicarse localmente células desnudas o encapsuladas genéticamente modificadas que producen y secretan NsG33 para suministrar NsG33 detrás de la barrera hemoencefálica y dentro de la región enferma, de preferencia el cuerpo estriado, aún más preferiblemente, el núcleo caudado. En ALS, las neuronas motoras superiores e inferiores degeneran, causando parálisis progresiva, llevando finalmente a muerte, más comúnmente a través de complicaciones respiratorias. Para tratar la ALS, se suministraría NsG33 hacia el SNC, incluyendo la médula espinal a través de la infusión de NsG33 en el espacio intratecal lumbar mezclándola de esta manera con el fluido cerebroespinal (CSF), que baña la médula espinal y el cerebro. El suministro podría lograrse a través de la implantación de una bomba y catéteres, por ejemplo, la bomba Synchrotron de Medtronic, o a través del uso de dispositivos de células encapsuladas implantados en el espacio intratecal lumbar. Podría usarse también terapia génica directa inyectando ADN que posea vectores en el CSF, transfiriendo de esta manera el gen hacia células que revistan el espacio del CSF. Además, pueden inyectarse vectores de transferencia de genes en la médula espinal cervical o lumbar o intracerebral, secretando de esta manera NsG33 en las regiones anatómicas que contienen a la mayoría de las neuronas motoras implicadas en las parálisis motoras y la función respiratoria. Estas inyecciones ocurrirían bajo navegación quirúrgica, y podrían realizarse relativamente con seguridad. En sujetos con enfermedades neurodegenerativas tales como AD, neuronas en la región Ch4 (núcleo basal de Meynert) que tienen receptores del factor de crecimiento nervioso (NGF) sufren atrofia marcada, en comparación con controles normales (véase, por ejemplo, Kobayashi, et al., Mol. Chem. Neuropathol., 15: 193-206 (1991 )). En sujetos normales, las neurotrofinas previenen la muerte de neuronas del simpático y sensitivas durante el desarrollo, y previenen la degeneración neuronal colinérgica en ratas y primates adultos (Tuszynski, et al., Gene Therapy, 3: 305314 (1996)). Se piensa que la pérdida resultante de neuronas funcionales en esta región del prosencéfalo basal, está enlazada causativamente a la declinación cognoscitiva experimentada por sujetos que sufren de condiciones neurodegenerativas tales como AD (Tuszynski, et al., citado anteriormente, y Lehericy, et al., J. Comp. Neurol., 330: 15-31 (1993)). En general se contempla que la AD puede tratarse con formulaciones de proteína NsG33 suministradas intracerebroventricularmente o intraparenquimáticamente. Dentro del área intraparenquimática, el suministro es de preferencia hacia el prosencefálo basal y hacia el hipocampo. Pueden administrarse también vector de terapia génica y células encapsuladas o desnudas que secreten NsG33 hacia el prosencéfalo basal o el hipocampo. Para el tratamiento de lesión de médula espinal, la proteína, el vector de terapia génica o las células encapsuladas o desnudas que secretan NsG33 pueden suministrarse intratecalmente en el sitio de la lesión, como se describió anteriormente para el tratamiento de ALS. Para el tratamiento de neuropatía periférica, el suministro es sistémico (usando formulaciones de proteína), intratecalmente usando formulaciones de proteína, vectores de terapia génica o células encapsuladas o desnudas que secretan NsG33, o intramuscularmente, dependiendo del transporte retrógrado hacia la médula espinal. Para el tratamiento de epilepsia, la proteína NsG33 podría suministrarse intraparenquimáticamente en el foco de epilepsia. Esto puede hacerse con células encapsuladas o desnudas, con formulaciones de proteína administradas con catéter o bomba, o con un vector de terapia génica suministrado hacia este sitio. Para el tratamiento de apoplejía o trauma, el suministro es intratecal, intracerebroventricular o de preferencia intralesional. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable", significa uno o más ingredientes orgánicos o inorgánicos, naturales o sintéticos, con los cuales el polipéptido de NsG33 se combina para facilitar su aplicación. Un vehículo adecuado incluye solución salina estéril, aunque otras soluciones estériles isotónicas acuosas y no acuosas y suspensiones estériles que se sabe son farmacéuticamente aceptables, son conocidas por los expertos en la técnica. Una "cantidad efectiva", se refiere a esa cantidad que es capaz de mejorar o retardar la progresión de la condición enferma, degenerativa o dañada. Puede determinarse una cantidad efectiva sobre una base individual y se basará, en parte, considerando los síntomas que se van a tratar y los resultados buscados. Una cantidad efectiva puede ser determinada por los expertos en la técnica usando dichos factores, y usando no más que experimentación de rutina. Un sistema de liposomas puede ser cualquier variedad de vesículas unilaminares, vesículas multilaminares o vesículas plurilaminares estables, y pueden prepararse y administrarse de acuerdo a métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, de acuerdo con las enseñanzas de las patentes de los Estados Unidos 5,169,637, 4,762,915, 5,000,958 o 5,185,154. Además, puede ser deseable expresar los polipéptidos novedosos de esta invención, así como otros polipéptidos seleccionados, como lipoproteínas, para mejorar su unión a liposomas. Una proteína NsG33 recombinante se purifica, por ejemplo, de células CHO, por cromatografía de inmunoafinidad o cualquier otro método conveniente, y se mezcla entonces con liposomas y se incorpora en los mismos con alta eficiencia. La proteína encapsulada en liposomas puede ponerse a prueba ¡n vitro para algún efecto sobre la estimulación del crecimiento de las células. Cualquiera de los polipéptidos de NsG33 de esta invención puede usarse en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Acidos y bases adecuados que son capaces de formar sales con un polipéptido de NsG33 son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen bases y ácidos orgánicos e inorgánicos. Además de los ingredientes activos, las composiciones farmacéuticas pueden comprender ingredientes adecuados. Más detalles sobre técnicas para formulación y administración pueden encontrarse en la última edición de Reminqton's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Se contemplan varios regímenes de dosificación para administración sistémica. En una modalidad, los métodos para administrar a un sujeto una formulación que comprenda un polipéptido de NsG33, incluyen administrar NsG33 a una dosificación entre 1 µg kg a 30,000 µg/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra modalidad, la dosificación está entre 10 µg/kg a 30,000 µg kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra modalidad, la dosificación está entre 10 µg/kg a 10,000 µg kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una modalidad diferente, la dosificación está entre 25 µg kg a 10,000 µg kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra modalidad, la dosificación está entre 25 µ?/?^ a 3,000 µg kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra modalidad más preferible, la dosificación está entre 50 µg/kg a 3,000 µg/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. Una guía para dosificaciones y métodos de suministro particulares se provee en la literatura; véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que la administración que elige como objetivo un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar de suministro en una forma diferente de la de hacia otro órgano o tejido. En donde se desee administración de liberación sostenida de un polipéptido de NsG33 en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de alguna enfermedad o trastorno que requiera la administración de un polipéptido de NsG33, se contempla la microencapsulación de un polipéptido de NsG33. Se ha realizado exitosamente la microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación sostenida, con hormona de crecimiento humano (rhGH), interferón-(rhlFN-), interleucina-2 y MN rgp120. Véase Johnson er a/., Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221 -1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds. (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; los documentos WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y la patente de E.U.A. No. 5,654,0 0. Se desarrollaron formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas, usando polímero de ácido poli-láctico-coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplia gama de propiedades biodegradables. Los productos de degradación de ácidos PLGA, láctico y glicólico, pueden depurarse rápidamente del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse de meses a años, dependiendo de su peso molecular y composición. Véase Lewis, "Controlled reléase of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin y R. Langer (eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41. La dosis administrada debe ajustarse cuidadosamente a la edad, peso y condición del individuo que se esté tratando, así como la vía de administración, forma y régimen de dosificación y el resultado deseado, y la dosificación exacta debe ser determinada por el médico general.

VI. Preparaciones farmacéuticas para terapia génica Para formar una composición de NsG33 para su uso en terapia génica en la invención, pueden colocarse vectores virales de expresión que codifiquen para NsG33 en una suspensión, solución o emulsión farmacéuticamente aceptable. Medios adecuados incluyen solución salina y preparaciones liposomales. Más específicamente, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir soluciones acuosas estériles de soluciones, suspensiones y emulsiones no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen agua, emulsiones, suspensiones o soluciones alcohólicas/acuosas, que incluyen solución salina y medios regulados en su pH. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactada o aceites fijados. Vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrólitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. Pueden estar presentes también conservadores y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, y similares. Además, puede liofilizarse una composición de transgenes de NsG33 usando medios bien conocidos en la técnica, para reconstitución y uso subsiguientes de conformidad con la invención. Puede usarse también un sistema de dispersión coloidal para suministro de genes dirigido. Los sistemas de dispersión coloidales incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de suministro in vitro e in vivo. Se ha mostrado que grandes vesículas unilaminares (LUV), que varían en tamaño de 0.2-4.0 µ?t?, pueden encapsular un porcentaje sustancial de un regulador de pH acuoso que contiene grandes macromoléculas. ARN, ADN y viriones intactos pueden encapsularse dentro del interior acuoso, y pueden suministrarse hacia células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981 ). Además de células de mamífero, se han usado liposomas para el suministro de transgenes que codifican operativamente en células de plantas, levaduras y bacterias. Para que un liposoma sea un vehículo de transferencia de genes eficiente, deben estar presentes las siguientes características: (1 ) encapsulación de los genes que codifican para NsG33 a alta eficiencia, sin que comprometan su actividad biológica; (2) unión preferencial y sustancial a una célula objetivo en comparación con células no objetivo; (3) suministro de los contenidos acuosos de la vesícula hacia el citoplasma de la célula objetivo a alta eficiencia; y (4) expresión precisa y efectiva de información genética (Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682, 1988). La composición del liposoma es usualmente una combinación de fosfolípidos, en particular fosfolípidos de alta temperatura de transición de fase, usualmente en combinación con esferoides, especialmente coíesterol. Pueden usarse también otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la concentración iónica y la presencia de cationes divalentes. Ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas, incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidiicolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Particularmente útiles son los diacilfosfatidilgliceroles, en donde la porción de lípido contiene de 14 a 18 átomos de carbono, en particular de 16 a 18 átomos de carbono, y es saturada. Fosfolípidos ilustrativos incluyen dipalmitoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina y fosfatidilcolina de huevo. El direccionamiento de los liposomas puede clasificarse con base en factores anatómicos y mecanicistas. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, específico de órganos, específico de células y específico de organelos. El direccionamiento mecanicista puede distinguirse con base en si es pasivo o activo. El direccionamiento pasivo usa la tendencia natural de los liposomas para distribuir las células del sistema reticuloendotelial (RES) en órganos que contienen capilares sinusoidales. El direccionamiento activo, por otra parte, incluye la alteración del liposoma acoplando el liposoma a un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glucolípido o proteína, o cambiando la composición o el tamaño del liposoma para lograr el direccionamiento hacia órganos y tipos de células diferentes de los sitios de localización de ocurrencia natural. La superficie del sistema de suministro de genes elegido como objetivo, puede modificarse de varias formas. En el caso de un sistema de suministro de liposomas elegido como objetivo, pueden incorporarse grupos de lípidos en la bicapa lipídica del liposoma, para mantener el ligando de direccionamiento en asociación estable con la bicapa Iiposomal. Varios grupos de enlace pueden usarse para unir las cadenas de lípidos al ligando de direccionamiento. Otro ejemplo de un sistema de suministro incluye el trasplante, en el área terapéutica, de una composición de células de empacamiento capaz de producir partículas del vector como se describe en la presente invención. Métodos para la encapsulación y el trasplante de dichas células son bien conocidos en la técnica, en particular del documento WO 97/44065 (citoterapéutica). Mediante la selección de una línea de células de empacamiento capaz de producir partículas lentivirales, se logra la transducción de células no en división en el área terapéutica. Mediante el uso de partículas retrovirales capaces de transducir sólo células en división, la transducción se restringe a células diferenciadas de novo en el área terapéutica.

VII. Requisitos de dosificación y protocolo de suministro para terapia qénica Otro parámetro importante es la dosificación del vector de terapia génica de NsG33 que se suministrará en el tejido objetivo. Para vectores virales, la concentración puede definirse por medio del número de unidades de transducción/ml. Óptimamente, para suministro usando un vector de expresión viral, cada dosificación unitaria comprenderá de 2.5 a 25 µ?_ de una composición, en donde la composición incluye un vector de expresión viral en un fluido farmacéuticamente aceptable, y provee de 10 hasta 10 unidades de transducción de NsG33 por mi. De modo importante, se seleccionan sitios específicos de suministro de genes in vivo, de modo que se agrupen en un área de pérdida, daño o disfunción de células neurales, células gliales, células retinianas, células sensitivas o células madre. Dichas áreas pueden identificarse clínicamente usando muchas técnicas conocidas, que incluyen formación de imágenes de resonancia magnética (MRI) y biopsia. En humanos, se preferirán métodos de formación de imágenes in vivo no invasivos tales como MRI. Una vez que se identifican las áreas de pérdida neuronal, se seleccionan sitios de suministro para distribución estereotáxica, de modo que cada dosificación unitaria de NsG33 sea suministrada en el cerebro a, o dentro de, 500 µ?? de una célula elegida como objetivo, y no más de aproximadamente 10 mm de otro sitio de suministro. Dentro de un sitio objetivo determinado, el sistema de vectores puede transducir una célula objetivo. La célula objetivo puede ser una célula presente en el tejido nervioso, tai como una neurona, astrocito, oligodendrocito, microglia, células madre, células precursoras neurales o células del epéndimo. El sistema de vectores se administra de preferencia por medio de inyección directa. Métodos para la inyección en el cerebro son bien conocidos en la técnica (Bilang-Bleuel et al. (1997) Proc. Acad. Nati. Sci. USA 94: 8818-8823; Choi-Lundberg et al (1998) Exp. Neurol. 154: 261-275; Choi- Lundberg et al (1997) Science 275: 838-841 ; y andel et al (1997) Proa Acad. Nati. Sci. USA 94: 14083-14088). Pueden administrarse inyecciones estereotáxicas. Como se mencionó anteriormente, para la transducción en tejidos tales como el cerebro, es necesario usar volúmenes muy pequeños, de modo que la preparación viral sea concentrada por medio de ultracentrifugación. La preparación resultante debe tener por lo menos 108 u.t./ml, de preferencia de 08 a 1010 u.t./ml, más preferiblemente por lo menos 109 u.t./ml (el título se expresa en unidades de transducción por mi (u.t./ml), como se describe en el ejemplo 6). Se ha encontrado que puede lograrse dispersión mejorada de la expresión de transgenes aumentando el número de sitios de inyección, y disminuyendo el régimen de inyección (Horellou y allet (1997) como anteriormente). Usualmente, se usan entre 1 y 10 sitios de inyección, más comúnmente entre 2 y 6. Para una dosis que comprende 1-5x109 u.t./ml, el régimen de inyección está comúnmente entre 0.1 y 10 µ?/min, usualmente aproximadamente 1 µ?/min. La composición del virus se suministra a cada sitio de suministro de la célula en el tejido objetivo, por medio de microinyección, infusión, raspado, carga, electroporación, u otros medios adecuados que suministran directamente la composición directamente en el tejido del sitio de suministro a través de una incisión quirúrgica. El suministro se logra lentamente, tal como durante un período de aproximadamente 5 a 10 minutos (dependiendo del volumen total de composición del virus que se va a suministrar).

VIH. Vectores virales En general, la terapia génica busca transferir nuevo material genético hacia las células de un paciente con beneficio terapéutico resultante para el paciente. Dichos beneficios incluyen tratamiento o profilaxis de una amplia gama de enfermedades, trastornos y otras condiciones. Los procedimientos de terapia génica ex vivo incluyen modificación de células aisladas (que incluyen, pero no están limitadas a, células madre, células precursoras neurales y gliales y células madre fetales), las cuales son entonces infundidas, injertadas o de otra manera trasplantadas, en el paciente. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,868,1 16, 5,399,346 y 5,460,959. La terapia génica in vivo busca elegir directamente como objetivo, tejido del paciente hospedero in vivo. Virus útiles como vectores de transferencia de genes, incluyen papovavirus, adenovirus, virus de la vaccinia, virus adenoasociados, virus de herpes y retrovirus. Retrovirus adecuados incluyen el grupo que consiste de VIH, SIV, FIV, EIAV y MoMLV. Otro grupo de retrovirus adecuados incluye el grupo que consiste de VIH, SIV, FIV, EIAV y CIV. Otro grupo de vectores virales preferidos incluye el grupo que consiste de alfavirus, adenovirus, virus adenoasociados, baculovirus, HSV, coronavirus, virus del papiloma bovino, Mo-MLV, de preferencia virus adenoasociados. Virus preferidos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central, son lentivirus y virus adenoasociados. Ambos tipos de virus pueden integrarse en el genoma sin divisiones celulares, y ambos tipos se han puesto a prueba en estudios preclínicos en animales para indicaciones en el sistema nervioso, en particular en el sistema nervioso central. Métodos para la preparación de AAV se describen en la técnica; véase, por ejemplo, los documentos US 5,677,158, US 6,309,634 y US 6,451 ,306, que describen ejemplos del suministro de AAV hacia el sistema nervioso central. De preferencia, el vector del lentivirus es una partícula de lentivirus de replicación defectuosa. Dicha partícula de lentivirus puede producirse a partir de un vector lentiviral que comprenda una LTR lentivirai 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empacamiento, un promotor enlazado operablemente a una señal de polinucleótidos que codifique para dicha proteína de fusión, un origen de síntesis de ADN de la segunda cadena, y una LTR lentiviral 3'. Métodos para la preparación y administración in vivo de lentivirus hacia células neurales, se describen en el documento US 20020037281 (métodos para transducir células neurales usando vectores lentivirales). Los vectores retrovirales son los vectores que se usan más comúnmente en pruebas clínicas humanas, puesto que tienen sólo 7 a 8 kb, y puesto que tienen la capacidad de infectar a células y tienen su material genético integrado establemente en la célula hospedera con alta eficiencia. Véase, por ejemplo, los documentos WO 95/30761 y WO 95/24929. Los Oncovirinae requieren por lo menos una ronda de proliferación en células objetivo, para transferencia e integración de secuencias de ácido nucleico exógenas en el paciente. Los vectores retrovirales se integran aleatoriamente en el genoma del paciente. Pueden usarse retrovirus para dirigir células madre del sistema nervioso como tan pocas divisiones celulares ocurran en otras células del sistema nervioso (en particular el SNC). Se han descrito tres clases de partículas retrovirales: ecotrópicas, que pueden infectar eficientemente a células de murino, y anfotróficas, que pueden infectar a células de muchas especies. La tercera clase incluye a los retrovirus xenotróficos, que pueden infectar a células de otra especie diferente de la especie que produjo el virus. Su capacidad para integrarse sólo en el genoma de las células en división, ha hecho a los retrovirus atractivos para marcar linajes de células en estudios de desarrollo, y para el suministro de genes terapéuticos o suicidas hacia cánceres o tumores. Para su uso en pacientes humanos, los vectores retrovirales deben ser de replicación defectuosa. Esto previene más generación de partículas retrovirales infecciosas en el tejido objetivo - más bien, el vector de replicación defectuosa llega a ser un transgen "cautivo" incorporado establemente en el genoma de la célula objetivo. Típicamente, en vectores de replicación defectuosa, se han eliminado los genes gag, env y pol (junto con la mayor parte del resto del genoma viral). Se inserta ADN heterologo en lugar de los genes virales eliminados. Los genes heterólogos pueden estar bajo el control del promotor heterologo endógeno, otro promotor heterologo activo en la célula objetivo, o la LTR 5' retroviral (la LTR viral es activa en diversos tejidos). Típicamente, los vectores retrovirales tienen una capacidad de transgenes de aproximadamente 7-8 kb. Los vectores retrovirales de replicación defectuosa requieren la provisión de las proteínas virales necesarias para la replicación y el ensamble a través de, por ejemplo, líneas de células de empacamiento diseñadas. Es importante que las células de empacamiento no liberen virus de replicación competente y/o virus auxiliares. Esto se ha logrado expresando proteínas virales de moléculas de ARN que carecen de la señal ?, y expresando los genes gag/pol y el gen env a partir de unidades de transcripción separadas. Además, en algunos retrovirus de 2a y 3a generación, las LTR's 5' han sido reemplazadas con promotores no virales que controlan la expresión de estos genes, y el promotor 3' ha sido reducido al mínimo para contener sólo el promotor proximal. Estos diseños reducen al mínimo la posibilidad de recombinación que lleva a la producción de vectores de replicación competente, o virus auxiliares.

IX. Vectores de expresión La construcción de vectores para expresión recombinante de polipéptidos NsG33 para su uso en la invención, puede lograrse usando técnicas convencionales que no requieren explicación detallada para los expertos en la técnica. Sin embargo, para una revisión, los expertos en la técnica pueden desear consultar la referencia Maniatis ef al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (NY 1982).

Pueden usarse vectores de expresión para la generación de células productoras para la producción recombinante de polipéptidos de NsG33 para uso médico, y para la generación de células terapéuticas que secreten polipéptidos de NsG33 para terapia con células desnudas o encapsuladas. En resumen, la construcción de vectores de expresión recombinantes usa técnicas de ligación estándar. Para el análisis que confirma secuencias correctas en vectores construidos, los genes son secuenciados usando, por ejemplo, el método de Messing, eí al. (Nucleic Acids Res., 9: 309, 1981 ), el método de Maxam, eí al. (Methods in Enzymology, 65: 499, 1980), u otros métodos adecuados que son bien conocidos por los expertos en la técnica. La separación de los fragmentos digeridos por tamaño, se lleva a cabo usando electroforesis en gel convencional como se describe, por ejemplo, en Maniatis eí al. (Molecular Cloning, pp. 133-134, 1982). Para la generación de vectores de expresión eficientes, estos deben contener secuencias reguladoras necesarias para la expresión del gen codificado en el marco de lectura correcto. La expresión de un gen es controlada a los niveles de transcripción, traducción o post-traducción. El inicio de la transcripción es un evento temprano y crítico en la expresión génica. Esto depende de las secuencias de promotor e intensificador, y es influenciada por factores celulares específicos que interactúan con estas secuencias. La unidad de transcripción de muchos genes consiste del promotor y, en algunos casos, de elementos intensificadores o reguladores (Banerji er a/., Cell 27: 299 (1981 ); Corden et al., Science 209: 1406 (1980); y Breathnach y Chambón, Ann. Rev. Biochem. 50: 349 (1981 )). Para retrovirus, los elementos de control implicados en la replicación del genoma retroviral residen en la repetición terminal larga (LTR) (Weiss et al., eds., The molecular biology of tumor viruses: RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory (NY 982)). Las LTRs del virus de la leucemia de murinos Moloney (MLV) y el virus del sarcoma de Rous (RSV), contienen secuencias de promotor e intensificador (Jolly et al., Nucleic Acids Res. 11 : 1855 (1983); Capecchi er a/., en: Enhancer and eukaryotic gene expression, Gulzman y Shenk, eds., pp. 101-102, Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991 ). Otros promotores potentes incluyen los derivados de citomegalovirus (CMV) y otros promotores virales de tipo silvestre. Se han descrito también las regiones de promotor e intensificador de muchos promotores no virales (Schmidt ef al., Nature 314: 285 (1985); Rossi y deCrombrugghe, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 5590-5594 (1987)). Métodos para mantener e incrementar la expresión de transgenes en células en reposo, incluyen e! uso de promotores que incluyen los promotores de SV40 y LTR de colágena tipo I (1 y 2) (Prockop y Kivirikko, N. Eng. J. Med. 31 1 : 376 (1984); Smith y Niles, Biochem. 19: 1820 (1980); de Wet er a/., J. Biol. Chem. 258: 14385 (1983)), SV40 y promotores de LTR. De conformidad con una modalidad de la invención, el promotor es un promotor constitutivo seleccionado del grupo que consiste de: promotor de ubiquitina, promotor del CMV, promotor JeT (US 6,555,674), promotor de SV40, promotor 1-alfa del factor de elongación (EF1-alfa), RSV y Mo-MLV- LTR. Ejemplos de promotores inducibles/reprimibles, incluyen: Tet-On, Tet- Off, promotor inducible por rapamicina y Mx1. Un grupo de promotores preferidos incluye C V, UbiC de humano, JeT, RSV, promotor regulable por Tet, Mo-MLV-LTR, Mx1 y EF- 1 alfa. Además del uso de promotores virales y no virales que dirigen la expresión de transgenes, puede usarse una secuencia de intensificador para incrementar el nivel de expresión del transgen. Los intensificadores pueden incrementar la actividad de transcripción no sólo de su gen nativo, sino también de algunos genes extraños (Armelor, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 70: 2702 (1973)). Por ejemplo, en la presente invención, pueden usarse secuencias de intensificador de colágena con el promotor de colágena 2 (I) para incrementar la expresión del transgen. Además, puede usarse el elemento intensificador presente en virus SV40 para incrementar la expresión del transgen. Esta secuencia de intensificador consiste de una repetición de 72 pares de bases, como es descrito por Gruss et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 943 (1981 ); Benoist y Chambón, Nature 290: 304 (1981 ) y Fromm y Berg, J. Mol. Appl. Genetics, 1 : 457 (1982), citas que se incorporan en la presente como referencia. Esta secuencia de repetición puede incrementar la transcripción de muchos genes virales y celulares diferentes, cuando está presente en serie con varios promotores (Moreau et al. Nucleic Acids Res. 9: 6047 (1981 ).

Otras secuencias que intensifican la expresión incluyen, pero no están limitadas a, elemento de regulación post-transcripción del virus de la hepatitis de Woodchuck, WPRE, SP163, intensificador del C V, y aislador de [betaj-globina de pollo, y otros aisladores. Puede incrementarse también la expresión del transgen para expresión estable a largo plazo, usando citocinas que modulan la actividad del promotor. Se han reportado varias citocinas que modulan la expresión del transgen de promotores de colágena 2 (I) y LTR (Chua eí al., connective Tissue Res., 25: 161-170 (1990); Elias eí al., Annals . Y. Acad. Sci., 580: 233-244 (1990)); Seliger et al., J. Immunol. 141 : 2138-2144 (1988) y Seliger eí al., J. Virology 62: 619-621 (1988)). Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante (TGF), la interleucina (IL)-I y el interferón (INF), subregulan la expresión de transgenes dirigida por varios promotores tales como LTR. El factor de necrosis tumoral (FNT) y el TGF 1 sobrerregulan, y pueden usarse para controlar, la expresión de transgenes dirigida por un promotor. Otras citocinas que pueden demostrar ser útiles, incluyen al factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF). Puede usarse también el promotor de colágena con la secuencia de intensificador de colágena (Coll (E)), para incrementar la expresión del transgen suprimiendo cualquier otra respuesta inmune para el vector el cual puede generarse en el cerebro tratado, sin importar su estado inmunoprotegido. Además, pueden administrarse agentes antiinflamatorios que incluyen esferoides, por ejemplo, dexametasona, al hospedero tratado inmediatamente después del suministro de la composición de vector, y puede continuarse, de preferencia, hasta que disminuya toda respuesta inflamatoria mediada por citocinas. Puede administrarse también un agente de ¡nmunosupresión tal como ciclosporina para reducir la producción de interferones, que subregulan al promotor de LTR y el ¡ntensificador-promotor de Coll (E) y reducen la expresión de transgenes. El vector puede comprender otras secuencias tales como una secuencia que codifica para la proteína Cre-recombinasa, y secuencias LoxP. Otra forma de asegurar la expresión temporal de NsG33, es por medio del uso del sistema Cre-LoxP que resulta en la excisión de parte de la secuencia de ADN insertada tras la administración de Cre-recombinasa a las células (Daewoong eí al, Nature Biotechnology 19: 929-933), o incorporando un gen que codifica para la recombinasa en la construcción del virus (Plück, Int J Exp Path, 77: 269-278). La incorporación de un gen para la recombinasa en la construcción del virus junto con los sitios LoxP y un gen estructural (una NsG33 en el presente caso), resulta con frecuencia en la expresión del gen estructural por un período de aproximadamente cinco días.

X. Cápsulas biocompatibles La terapia con células encapsuladas se basa en el concepto del aislamiento de células del sistema inmune del hospedero receptor, rodeando las células con un material biocompatible semipermeable antes de la implantación dentro del hospedero. La invención incluye un dispositivo en el cual células que secretan NsG33 son encapsuladas en una cápsula inmunoais!adora. Una "cápsula inmunoaisladora" significa que la cápsula, tras implantación en un hospedero receptor, reduce al mínimo los efectos deletéreos del sistema inmune del hospedero sobre las células en el núcleo del dispositivo. Las células son inmunoaisladas del hospedero encerrándolas dentro de cápsulas poliméricas implantables formadas de una membrana microporosa. Este procedimiento previene el contacto de célula a célula entre el hospedero y los tejidos implantados, eliminando el reconocimiento del antígeno a través de la presentación directa. Las membranas usadas pueden adaptarse también para controlar la difusión de moléculas, tales como anticuerpo y complemento, con base en su peso molecular (Lysaght et al., 56 J. Cell Biochem. 196 (1996), Colton, 14 Trends Biotechnol. 158 (1996)). Mediante el uso de técnicas de encapsulación, las células pueden ser trasplantadas en un hospedero sin rechazo inmune, ya sea con o sin el uso de fármacos inmunosupresores. Las cápsulas de polímeros biocompatibles útiles contienen usualmente un núcleo que contiene células, ya sea suspendidas en un medio líquido o inmovilizadas dentro de una matriz de inmovilización, y una región circundante o periférica de matriz o membrana permoselectiva ("cubierta") que no contiene células aisladas, que es biocompatible, y que es suficiente para proteger a las células en el núcleo del ataque inmunológico perjudicial. La encapsulación impide que los elementos del sistema inmune entren a la cápsula, protegiendo de esta manera a las células encapsuladas de la destrucción inmune. La naturaleza semipermeable de la membrana de la cápsula, permite también que la molécula biológicamente activa de interés se difunda fácilmente desde la cápsula en el tejido circundante del hospedero. La cápsula puede hacerse de un material biocompatible. Un "material biocompatible" es un material que, después de implantación en un hospedero, no induce una respuesta perjudicial sobre el hospedero suficiente para dar como resultado el rechazo de la cápsula o hacerla inoperable, por ejemplo, a través de degradación. El material biocompatible es relativamente impermeable a grandes moléculas, tales como componentes del sistema inmune del hospedero, pero es permeable a pequeñas moléculas, tales como insulina, factores de crecimiento tales como polipéptidos NsG33 y nutrientes, mientras que permite que sean removidos los desechos metabólicos. Varios materiales biocompatibles son adecuados para el suministro de factores de crecimiento por medio de la composición de la invención. Se conocen numerosos materiales biocompatibles, que tienen varias morfologías de la superficie exterior y otras características mecánicas y estructurales. De preferencia, la cápsula de esta invención será similar a las descritas en los documentos WO 92/19195 o WO 95/05452, incorporados en la presente como referencia; o las patentes de E.U.A. Nos. 5,639,275; 5,653,975; 4,892,538; 5,156,844; 5,283,187; o la patente de E.U.A. No. 5,550,050, incorporadas en la presente como referencia. Dichas cápsulas permiten el paso de metabolitos, nutrientes y sustancias terapéuticas, mientras que reducen al mínimo los efectos perjudiciales del sistema inmune del hospedero. Los componentes del material biocompatible pueden incluir una membrana semipermeable circundante y el andamiaje interno que sostiene a las células. De preferencia, las células alteradas genéticamente se siembran sobre el andamiaje, el cual es encapsulado por la membrana permoselectiva. El andamiaje filamentoso que sostiene a las células puede hacerse de cualquier material biocompatible seleccionado del grupo que consiste de acrílico, poliéster, polietileno, polipropileno, poliacetonitrilo, tereftalato de polietileno, nylon, poliamidas, poliuretanos, éster de polibutilo, seda, algodón, quitina, carbono, o metales biocompatibles. Asimismo, pueden usarse estructuras de fibras aglutinadas para implantación de células (véase patente de E.U.A. No. 5,512,600, incorporada en la presente como referencia). Polímeros biodegradables incluyen los que comprenden ácido poli(láctico) PLA, ácido poli(láctico-co-glicólico) PLGA y ácido poli(glicólico) PGA, y sus equivalentes. Se han usado andamios de espuma que proveen superficies sobre las cuales las células trasplantadas pueden adherirse (véase el documento 98/05304, incorporado en la presente como referencia). Se han usado tubos de malla tejida como injertos vasculares (véase el documento WO 99/52573, incorporado en la presente como referencia). Además, el núcleo puede formarse de una matriz de inmovilización formada de un hidrogel, que estabiliza la posición de las células. Un hidrogel es una red tridimensional de polímeros hidrofílicos entrelazados en la forma de un gel, formado sustancialmente de agua. Varios polímeros y combinaciones de polímeros pueden usarse para fabricar la membrana semipermeable circundante, incluyendo poliacrilatos (que incluyen copolímeros de acrílico), polivinilidenos, copolímeros de cloruro de polivinilo, poliuretanos, poliestirenos, poliamidas, acetatos de celulosa, nitratos de celulosa, polisuifonas (que incluyen poliéter sulfonas), polifosfazenos, poliacrilonitrilos, poli(acrilonitrilo/co-cloruro de vinilo), así como derivados, copolímeros y mezclas de los mismos. De preferencia, la membrana semipermeable circundante es una membrana de fibras huecas semipermeable biocompatible. Dichas membranas, y métodos para fabricarlas, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,284,761 y 5,158,881 , incorporadas en la presente como referencia. La membrana semipermeable circundante se forma de una fibra hueca de poliéter sulfona, tal como se describe en las patentes de E.U.A. No. 4,976,859 o 4,968,733, incorporadas en la presente como referencia. Un material alternativo de la membrana semipermeable circundante, es poli(acrilonitrilo/co-cloruro de vinilo). La cápsula puede ser cualquier configuración adecuada para mantener actividad biológica y proveer acceso para el suministro del producto o función incluyendo, por ejemplo, cilindrica, rectangular, en forma de disco, en forma de parche, ovoide, estrellada o esférica. Además, la cápsula puede ser enrollada o envuelta en una estructura anidada o tipo malla. Si la cápsula se va a recuperar después de que sea implantada, no se prefieren configuraciones que tiendan a llevar a la migración de las cápsulas desde el sitio de implantación, tales como cápsulas esféricas bastante pequeñas que viajan en los vasos sanguíneos del hospedero receptor. Ciertas formas, tales como rectángulos, parches, discos, cilindros y hojas planas ofrecen mayor integridad estructural, y se prefieren en donde se desee recuperación. Cuando se usan macrocápsulas, se encapsulan de preferencia entre 103 y 108 células, más preferiblemente se encapsulan de 105 a 107 células en cada dispositivo. La dosificación puede controlarse implantando un número mayor o menor de cápsulas, de preferencia entre 1 y 10 cápsulas por paciente. El andamiaje puede recubrirse con moléculas de la matriz extracelular (ECM). Ejemplos adecuados de moléculas de la matriz extracelular incluyen, por ejemplo, colágena, laminina y fibronectina. La superficie del andamiaje puede modificarse también por medio de tratamiento con irradiación de plasma que imparte carga para mejorar la adhesión de las células. Puede usarse cualquier método adecuado para sellar las cápsulas, incluyendo el uso de adhesivos de polímero o pliegue, anudamiento y termosellado. Además, puede usarse también cualquier método de sellado "en seco" adecuado tal como se describe, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,653,687, incorporada en la presente como referencia. Los dispositivos de células encapsuladas se implantan de acuerdo a técnicas conocidas. Muchos sitios de implantación se contemplan para los dispositivos y métodos de esta invención. Estos sitios de implantación incluyen, pero no están limitados a, el sistema nervioso central, que incluye el cerebro, la médula espinal (véase las patentes de E.U.A. Nos. 5,106,627, 5,156,844 y 5,554,148, incorporadas en la presente como referencia), y los humores acuoso y vitreo del ojo (véase el documento WO 97/34586, incorporado en la presente como referencia). Métodos y aparatos para la implantación de cápsulas en el SNC, se describen en el documento US 5,487,739. Métodos y aparatos para la implantación de cápsulas en el ojo, se describen en los documentos US 5,904,144, US 6,299,895, US 6,439,427 y US 20030031700. En un aspecto, la invención se refiere a una cápsula biocompatible que comprende: un núcleo que comprende células de empacamiento vivas que secretan un vector viral para infección de una célula objetivo, en donde el vector viral es un vector de conformidad con la invención; y una cubierta externa que rodea a dicho núcleo, dicha cubierta comprendiendo un material biocompatible permeable, dicho material teniendo una porosidad seleccionada que permita el paso de vectores retrovirales de aproximadamente 100 nm de diámetro a través, permitiendo la liberación de dicho vector viral desde dicha cápsula. De preferencia, el núcleo comprende además una matriz, las células de empacamiento siendo inmovilizadas por la matriz. De conformidad con una modalidad, la cubierta comprende un hidrogel o material termoplástico. Ejemplos de células adecuadas para líneas de células de empacamiento, incluyen células HEK293, NIH3T3, PG 3 y ARPE- 9. Células preferidas incluyen células PG13 y 3T3.

Las líneas de células de empacamiento pueden encapsularse y administrarse usando los métodos y las composiciones que se describen en los documentos US 6,027,721 y WO 97/01357, incorporados en su totalidad en la presente como referencia.

XI. Matriz de soporte para células que producen NsG33 La presente invención comprende además el cultivo de células que producen NsG33 in vitro, sobre una matriz de soporte antes de la implantación en el sistema nervioso de mamífero. La preadhesión de células a microvehículos antes de la implantación, está diseñada para intensificar la viabilidad a largo plazo de las células trasplantadas y proveer beneficio funcional a largo plazo. Para aumentar la viabilidad a largo plazo de las células trasplantadas, es decir, células trasplantadas que secretan NsG33, las células que serán trasplantadas pueden unirse in vitro a una matriz de soporte antes del trasplante. Materiales de los cuales la matriz de soporte puede formarse, incluyen aquellos materiales a los cuales las células se adhieren después de incubación in vitro, y sobre los cuales las células pueden crecer, y que pueden ser implantados en el cuerpo del mamífero sin que produzcan una reacción tóxica o una reacción de inflamación que de otra manera destruiría a las células implantadas o de otra manera interferiría con su actividad biológica o terapéutica. Dichos materiales pueden ser sustancias químicas sintéticas o naturales, o sustancias que tengan un origen biológico.

Los materiales de la matriz incluyen, pero no están limitados a, vidrio y otros óxidos de silicio, poliestireno, polipropileno, polietileno, fluoruro de polivinilideno, poliuretano, polialginato, polisulfona, alcohol polivinílico, polímeros de acrilonitrilo, poliacrilamida, policarbonato, polipentent, nylon, amilasas, gelatina natural y modificada y colágena natural y modificada, polisacáridos naturales y modificados, incluyendo dextrán y celulosas (por ejemplo, nitrocelulosa), agar y magnetita. Pueden usarse materiales resorbibles o no resorbibles. Se usan también materiales de matriz extracelular, que son bien conocidos en la técnica. Los materiales de matriz extracelular pueden obtenerse comercialmente, o pueden prepararse desarrollando células que secreten dicha matriz, removiendo las células secretorias, y permitiendo que las células que serán trasplantadas interactúen con la matriz y se adhieran a la misma. El material de la matriz sobre el cual crecen las células que serán implantadas, o con el cual las células se mezclan, puede ser un producto nativo de células RPE. De esta manera, por ejemplo, el material de la matriz puede ser matriz extracelular o material de la membrana basal, el cual es producido y secretado por células RPE que serán implantadas. Para mejorar la adhesión, supervivencia y función de las células, la matriz sólida puede recubrirse opcionalmente sobre su superficie externa con factores conocidos en la técnica que promuevan la adhesión, el crecimiento o la supervivencia de las células. Dichos factores incluyen moléculas de adhesión celular, matriz extracelular tal como, por ejemplo, fibronectina, laminina, colágena, elastina, glucosaminoglucanos o proteoglucanos, o factores de crecimiento. En forma alternativa, si la matriz sólida a la cual las células implantadas se unen se construye de material poroso, el factor o los factores que promueven el crecimiento o la supervivencia pueden incorporarse en el material de la matriz, a partir del cual serían liberados lentamente después de la implantación in vivo. Cuando se unen al soporte de conformidad con la presente invención, las células usadas para el trasplante están en general sobre la "superficie exterior" del soporte. El soporte puede ser sólido o poroso. Sin embargo, aún en un soporte poroso, las células están en contacto directo con el ambiente externo sin una membrana intermedia u otra barrera. De esta manera, de conformidad con la presente invención, se considera que las células están sobre la "superficie exterior" del soporte, aún cuando la superficie a la cual se adhieren puede estar en la forma de circunvoluciones o pliegues internos del material de soporte poroso, que no están en el exterior de la partícula o perla misma. La configuración del soporte es de preferencia esférica, como en una perla, pero puede ser cilindrica, elíptica, una tira u hoja plana, en forma de una aguja o pasador, y similares. Una forma preferida de la matriz de soporte es una perla de vidrio. Otra perla preferida es una perla de poliestireno. El tamaño de las perlas puede variar de aproximadamente 10 µ?t? a 1 mm de diámetro, de preferencia de aproximadamente 90 µ?? a aproximadamente 150 µ?t?. Para una descripción de varias perlas de microvehículo véase, por ejemplo, Isher Biotech Source 87-88, Fisher Scientific Co., 1987, pp. 72-75; Sigma Cell Culture Catalog, Sigma Chemical Co., St, Louis, 1991 , pp. 162-163; Ventrex Product Catalog, Ventrex Laboratories, 1989; estas referencias siendo incorporadas en la presente como referencia. El límite superior del tamaño de la perla puede ser determinado por la estimulación, por la perla, de reacciones no deseadas en el hospedero, que pueden interferir con la función de las células trasplantadas o causar daño al tejido circundante. El límite superior del tamaño de la perla puede ser determinado también por el método de administración. Dichas limitaciones son fácilmente determinables por los expertos en la técnica.

XII. Células hospederas En un aspecto, la invención se refiere a células hospederas aisladas y modificadas genéticamente con el vector de conformidad con la invención. De conformidad con una modalidad, las células hospederas son células procarióticas tales como E. coli, que son capaces de producir proteína recombinante en altas cantidades, y las cuales pueden producirse fácilmente a escala industrial. El uso de células productoras procarióticas puede requerir replegamiento y glucosilación de NsG33 para obtener una proteína biológicamente activa. En otra modalidad, las células hospederas son células productoras eucarióticas no de mamíferos que incluyen, pero no están limitadas a, células productoras conocidas tales como levadura (Saccharomyces cerevisiae), hongos filamentosos tales como Aspergillus, y células de insecto tales como Sf9. De conformidad con otra modalidad, las células son de preferencia células hospederas de mamífero, porque estas células son capaces de secretar y procesar correctamente la NsG33 codificada. Especies preferidas incluyen el grupo que consiste de humano, felino, porcino, simio, canino, murino, rata, conejo, ratón y hámster. Ejemplos de líneas de células y cultivos primarios que son buenos candidatos para transducción o transfección con los vectores de la presente invención, incluyen el grupo que consiste de células CHO, CHO-K1 , HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, células neuronales, células fetales, ARPE- 9, C2C12, HeLa, HepG2, células del cuerpo estriado, neuronas, astrocitos e interneuronas. Líneas de células preferidas para producción recombinante en mamíferos, incluyen células CHO, CHO- , HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b y BHK. Para terapia génica ex vivo, el grupo preferido de células incluye células neuronales, células precursoras neuronales, células progenitoras neuronales, células madre y células fetales. La invención se refiere también a células adecuadas para biosuministro de NsG33 por medio de células desnudas o encapsuladas, las cuales son modificadas genéticamente para sobreexpresar NsG33, y las cuales pueden ser trasplantadas al paciente para suministrar Iocalmente polipéptido de NsG33 bioactivo. Dichas células pueden ser referidas ampliamente como células terapéuticas. En una modalidad preferida de la invención, una línea de células terapéutica no ha sido inmortalizada con la inserción de un gen de inmortalización heterólogo. Puesto que la invención se refiere a células que son particularmente adecuadas para el trasplante de células, ya sea como células desnudas o de preferencia como células encapsuladas, dichas líneas de células inmortalizadas se prefieren menos, ya que existe un riesgo inherente de que comiencen a proliferar en una forma no controlada dentro del cuerpo humano, y formen potencialmente tumores. De preferencia, la línea de células es una línea de células inhibida por contacto. Por una línea de células inhibida por contacto, se pretende indicar una línea de células que cuando crece en cultivos bidimensionales, crece hasta confluencia, y entonces sustancialmente deja de dividirse. Esto no excluye la posibilidad de que un número limitado de células escape de la capa bidimensional. Las células inhibidas por contacto pueden desarrollarse también en un ambiente tridimensional, por ejemplo, dentro de una cápsula. También dentro de las cápsulas, las células crecen hasta confluencia, y entonces retardan significativamente su velocidad de proliferación, o completamente dejan de dividirse. Un tipo de células particularmente preferido, incluye células epiteliales que son por su naturaleza inhibidas por contacto, y que forman monocapas estables en cultivo. Aún más preferidas, son las células epiteliales pigmentarias retinianas (células RPE). La fuente de células RPE es por aislamiento de células primarias de la retina de mamíferos. Los protocolos para la cosecha de células RPE, están bien definidos (Li y Tumer, 988, Exp. Eye Res. 47: 91 1- 917; López et al., 1989, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30: 586-588), y consideran una metodología de rutina. En la mayoría de los reportes publicados de co-trasplante de células RPE, las células se derivan de la rata (Li y Tumer, 1988; López et al., 1989). De conformidad con la presente invención, las células RPE se derivan de humanos. Además de células RPE primarias aisladas, pueden usarse líneas de células RPE humanas cultivadas en la práctica de la invención. Para encapsulación, las células necesitan ser capaces de sobrevivir y mantener una secreción funcional de NsG33 a los bajos niveles de tensión de oxígeno del SNC. De preferencia, la línea de células de la invención es capaz de sobrevivir a una tensión de oxígeno menor de 5%, más preferiblemente menor de 2%, más preferiblemente menor de 1 %. Una tensión de oxígeno de 1 % corresponde aproximadamente al nivel de oxígeno en el cerebro. Para ser una línea de células de plataforma para un sistema de suministro basado en células encapsuladas, la línea de células debe tener el mayor número posible de las siguientes características: (1 ) las células deben ser resistentes bajo condiciones severas (las células encapsuladas deben ser funcionales en las cavidades de los tejidos vasculares y avasculares, tal como en el sistema nervioso central intraparenquimáticamente, o dentro de los espacios de fluido ventriculares o intratecales o el ojo, especialmente en el ambiente infraocular). (2) Las células deben ser capaces de ser modificadas genéticamente para expresar NsG33. (3) Las células deben tener una duración de vida relativamente larga (las células deben producir progenies suficientes para ser depositadas en un banco, caracterizadas, diseñadas, puestas a prueba con seguridad y fabricadas en lotes clínicos). (4) Las células deben ser de origen humano (que aumenten la compatibilidad entre las células encapsuladas y el hospedero). (5) Las células deben exhibir más de 80% de viabilidad por un período mayor de un mes in vivo en el dispositivo (que asegure suministro a largo plazo). (6) Las células encapsuladas deben suministrar una cantidad eficaz de NsG33 (que asegure eficacia del tratamiento). (7) Cuando encapsuladas, las células no deben causar una reacción inmune significativa en el hospedero (que asegure la longevidad del injerto). (8) Las células no deben ser tumorígenas (para proveer seguridad agregada al hospedero, en caso de fuga del dispositivo). Para encapsulación, las células preferidas incluyen células epiteliales pigmentadas retinianas, que incluyen células ARPE-19; fibroblastos inmortalizados de humano; y astrocitos inmortalizados de humano. La línea de células ARPE-19 es una línea de células de plataforma superior para la tecnología de suministro basada en células encapsuladas, y es también útil para la tecnología de suministro basada en células no encapsuladas. La línea de células ARPE-19 es resistente (es decir, la línea de células es viable bajo condiciones severas, tal como implantación en el sistema nervioso central o el ambiente infraocular). Las células ARPE-19 pueden ser modificadas genéticamente para que secreten una sustancia de interés terapéutico. Las células ARPE-19 tienen una duración de vida relativamente larga. Las células ARPE- 9 son de origen humano. Además, las células ARPE-19 encapsuladas tienen buena viabilidad del dispositivo in vivo. Las células ARPE-19 pueden suministrar una cantidad eficaz de factor de crecimiento. Las células ARPE-19 inducen una reacción inmune despreciable en el hospedero. Además, las células ARPE-19 no son tumorígenas. Métodos para el cultivo y la encapsulación de células ARPE-19 se describen en el documento US 6,361 ,77 . En otra modalidad, la línea de células terapéutica se selecciona del grupo que consiste de: líneas de fibroblastos humanos, líneas de astrocitos humanos, líneas de células mesencefálicas humanas, y líneas de células endoteliales humanas, de preferencia inmortalizadas con TERT, SV40T o vmyc. El método para la generación de líneas de astrocitos humanos inmortalizados, se ha descrito previamente (Price TN, Burke JF, Mayne LV. A novel human astrocyte cell line (A735) with astrocyte-specific neurotransmitter function. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1999 mayo; 35(5): 279-88). Este protocolo puede usarse para generar líneas de astrocitos. Las tres modificaciones siguientes de ese protocolo, se hacen de preferencia para generar otras líneas de astrocitos humanos. Puede usarse tejido de cerebro fetal humano disectado, de fetos de 5 a 12 semanas, en lugar de tejido de 12 a 16 semanas. Puede usarse el gen de inmortalización v-myc, o TERT (telomerasa) en lugar del antígeno T del SV40. Puede usarse la transferencia de genes retrovirales en lugar de la transfección con plásmidos, usando la técnica de precipitación con fosfato de calcio.

XIII. Producción recombinante y purificación de polipéptidos de NsG33 de la invención Los polipéptidos de NsG33 de la invención pueden producirse usando sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos del estado de la técnica. Ejemplos de métodos se describen en el documento WO 93/22437 (Innogenetics), el cual se incorpora en la presente como referencia. Debido a la similitud estructural entre los polipéptidos de NsG33 y los polipéptidos descritos en el documento WO 93/22437, se contempla que puedan producirse polipéptidos de NsG33 usando los métodos de producción descritos en esta publicación. Los protocolos descritos en el documento WO 93/22437 describen la purificación de una proteína que tiene un peso molecular predicho de 29 kDa. En el caso de la expresión de fragmentos de NsG33, los cuales pueden ser considerablemente más cortos debido a la digestión posible del propéptido, deben modificarse los protocolos para tomar en cuenta la diferencia en peso molecular. Estos ejemplos incluyen expresión en E. coli (ejemplo 5 del documento WO 93/22437), expresión en células COS1 (ejemplo 6 del documento WO 93/22437), expresión en un sistema de expresión de baculovirus (ejemplo 7 del documento WO 93/22437) y expresión en un sistema de virus de la vaccinia (ejemplo 8 del documento WO 93/22437). Cada uno de los sistemas de expresión referidos resultó en la expresión de cantidades significativas de los polipéptidos descritos en el documento WO 93/22437. La purificación de las proteínas NsG33 puede realizarse usando el método de purificación descrito en el documento WO 93/22437. En resumen, se colecta medio acondicionado de células COS1 transfectadas con el ADNc de la invención después de 48 horas, y se filtra sobre un filtro de 0.22 µ?? para remover los restos de células. Una purificación típica comienza de 600 a 1000 mi de medio de transfección de células COS1. A esto se añaden MgCI2 y sulfato de dextrán 500,000 (Pharmacia, Uppsala, Suecia), hasta una concentración final de 60 mM y 0.02%, respectivamente. Después de 1 hora de incubación a 4°C, el precipitado se transforma a pellas por centrifugación (12,000 g, 30 min., 4°C). La fracción de sobrenadante, que contiene a la NsG33, se dializa contra Hepes a 50 mM, pH 7.0, EDTA a 4 mM, se ajusta a pH 8.0, y se carga a una magnitud de flujo de 0.5 ml/minuto sobre una columna de 4 mi de agarosa-fenilboronato (PBA 30, Amicon, A, USA) equilibrada en Hepes a 50 mM, pH 8.5. La NsG33 es eluida de la matriz por medio de sorbitol a 100 mM. El valor máximo eluido del sorbitol se hace pasar entonces a una magnitud de flujo de 0.5 ml/minuto sobre una columna de intercambio iónico FPLC Mono Q de 1 mi (Pharmacia) equilibrada en Hepes pH 8.5 y eluida con un gradiente lineal de sales de NaCI a 0.1 M a una magnitud de flujo de 1 ml/minuto. El eluato se concentra aproximadamente 40 veces por medio de Centricon 10,000 (amicon), y se carga en modo intermitente (3 veces 0.25 mi) sobre una columna de filtración en gel SMART Superdex 75 (Pharmacia) equilibrada contra PBS. Este protocolo puede resultar en elución de proteína de alta pureza. Pueden usarse también otros protocolos de purificación de proteínas del estado de la técnica, para proveer proteína bastante pura para realizar las pruebas in vitro e in vivo descritas en los ejemplos.

XIV. Usos de NsG33 in vitro Pueden usarse polipéptidos de NsG33 y/o polinucleótidos que codifiquen para NsG33 como factores de crecimiento o factores tróficos in vitro. Este uso se basa en el hallazgo de que NsG33 es una proteína secretada con rasgos estructurales de un factor de crecimiento u hormona, y en el hallazgo por los presentes inventores de que NsG33 causa la generación y/o supervivencia de neuronas, y/o la proliferación de precursores neurales en varias pruebas in vitro. El efecto neuroprotector y/o de neurogénesis se ha encontrado en una línea de células precursoras neurales (hNS1 ) y en un cultivo primario (cultivo estriatal de rata). Además, se ha encontrado un efecto antiapoptótico en una línea de células con potencial neuronal (PC12). Puede administrarse NsG33 al cultivo como una composición de proteína, o las células pueden ser transducidas o transfectadas con ADNc que codifique para NsG33. Si la NsG33 sería efectiva en el tratamiento de un tipo particular de célula o tejido, puede ser determinado fácilmente por los expertos en la técnica usando cualquiera de una variedad de pruebas conocidas en la materia. Por ejemplo, con respecto a la provisión de soporte trófico para las células, los factores tróficos pueden producir efectos bioquímicos y morfológicos benéficos y, bajo algunas circunstancias, pueden promover la supervivencia de las células. Con respecto a neuronas, se sabe en la técnica que la privación del soporte trófico a una neurona puede resultar en una disminución en actividad metabólica, es decir, captación de glucosa, síntesis de ARN y síntesis de proteínas, requeridas para funcionamiento y crecimiento normales. Véase Deckwerth y Johnson, J. Cell Biol. 123: 1207-1222, 1993. La remoción del soporte trófico puede resultar también en una reducción en tamaño del cuerpo celular de la neurona. Quizá como una consecuencia de la pérdida de los efectos metabólicos de los factores tróficos, la privación de factores tróficos puede resultar en una disminución o cese del brote de procesos, y puede resultar en retracción de procesos neuronales. Además del requisito del factor trófico para estos aspectos de la biología neuronal, la neurona puede requerir el factor neurotrófico para mantener su supervivencia; de esta manera, pruebas de supervivencia son un medio que se usa con frecuencia para detectar o cuantificar las acciones de un factor neurotrófico. Sin embargo, el soporte trófico puede manifestarse también como cambios morfológicos, bioquímicos y funcionales, independientes del número de neuronas o cualquier efecto sobre la supervivencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Secuencias de NsG33 SEQ ID No. 1 , secuencia genómica de NsG33 de humano con 100 pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y 3'. SEQ ID No. 2, ADNc de NsG33 de humano. SEQ ID No. 3, secuencia de aminoácidos de longitud completa de NsG33 de humano. SEQ ID No. 4, proteína NsG33 de humano sin péptido de señal. SEQ ID No. 5, polipéptido C-terminal de NsG33 de humano. SEQ ID No. 6, secuencia genómica de NsG33 de ratón con 100 pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y 3'. SEQ ID No. 7, ADNc parcial de NsG33 de ratón. SEQ ID No. 8, secuencia de aminoácidos parcial de NsG33 de ratón. SEQ ID No. 9, proteína NsG33 de ratón sin péptido de señal.

SEQ ID No. 10, polipéptido C-terminal de NsG33 de ratón. SEQ ID No. 11 , secuencia genómica de NsG33 de rata con 100 pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y 3'. SEQ ID No. 12, ADNc de NsG33 de rata. SEQ ID No. 13, secuencia de aminoácidos de longitud completa de NsG33 de rata. SEQ ID No. 14, proteína NsG33 de rata sin péptido de señal. SEQ ID No. 15, polipéptido C-terminal de NsG33 de rata. SEQ ID No. 16, secuencia de nucleotidos que codifica para péptido C-terminal de NsG33 de humano. SEQ ID No. 17, secuencia de nucleotidos que codifica para péptido C-terminal de NsG33 de ratón. SEQ ID No. 18, secuencia de nucleotidos que codifica para péptido C-terminal de NsG33 de rata. SEQ ID No. 19, péptido N-terminal de humano. SEQ ID No. 20, péptido N-terminal de ratón. SEQ ID No. 21 , péptido N-terminal de rata. SEQ ID No. 22, péptido N-terminal de humano. SEQ ID No. 23, péptido N-terminal de ratón. SEQ ID No. 24, péptido N-terminal de rata. SEQ ID No. 25, ADNc de ratón. SEQ ID No. 26, secuencia de aminoácidos de longitud completa de ratón.

En el listado de secuencias, los intrones están marcados en minúsculas, y los exones en mayúsculas. En las secuencias polipeptídicas, los péptidos de señal están marcados en negritas. Secuencia de nucleótidos genómica de NsG33 de humano (SEQ ID No. 1 ). actggccgac acgccgcagg ccccgccccc ttcccgaccc gctccaaggc 0050 ggccccggcg ctggggctgc gcggcaggcg gagcggccgc gggcttgggg 0100 GCTTCGCCGG GGCCGGGCGG CCGGCGCCCC CGGCTGCTCC CGCCGCCGCC 0150 CGGACCCGCG CCCCGCCGGG GCAGCGGTGG TGAGAGCCCC GACTCCCCGG 0200 ACGCCGCCCG CCGTGCCATG GGGTTCCCGG CCGCGGCGCT GCTCTGCGCG 0250 CTGTGCTGCG GCCTCCTGGC CCCGGCTGCC CGCGCCGGCT ACTCCGAGGA 0300 GCGCTGCAGC TGGAGGGGCA Ggtacggtcc ggggggctgt ccccgcactt 0350 aggacggggt gcgctgcggc taggaccccc caggcgcccc tcggagcgcg 0400 cagagcgctg ggccggtttc cccatccgcg aggcggcctc gggagggagc 0450 gggggctgcg ccgggcgggg acccgccccc gtctcagcgc cccgtcccgt 0500 cctgtcccca gCGGCCTCAC CCAGGAGCCC GGCAGCGTGG GGCAGCTGGC 0550 CCTGGCCTGT GCGGAGGGCG CGGTTGAGTG GCTGTACCCG GCTGGGGCGC 0600 TGCGCCTGAC CCTGGGCGGC CCCGATCCCA GAGCGCGGCC CGGCATCGCC 0650 TGTCTGCGGC CGGTGCGGCC CTTCGCGGGC GCCCAGGTCT TCGCGGAGCG 0700 CGCAGGGGGC GCCCTGGAGC TGCTGCTGGC CGAGGGCCCG GGCCCGGCAG 0750 GGGGCCGCTG CGTGCGCTGG GGTCCCCGCG AGCGCCGGGC CCTCTTCCTG 0800 CAGGCCACGC CGCACCAGGA CATCAGCCGC CGCGTGGCCG CCTTCCGCTT 0850 TGAGCTGCGC GAGGACGGGC GCCCCGAGCT GCCCCCGCAG GCCCACGGTC 0900 TCGGCGTAGA CGgtgagtgg cggtctggtt gggacagggt gggagtcccg 0950 aagtcttacc ctgcctgggc ttggcgggaa tgtgccttgt cggccccact 1000 gcagaaggaa aaagtgagct acaagggttg gatgggcttg tcaggccaca 1050 cagcctggga ctgctgggga gggatggcct ccccgccctc ccttcccgat 1 100 tcatctctgg aaagagctgg caggggcaga gtggagggaa ggggaggccg 1 150 ggcccagcaa tcctgggcct ctggtccctg aacggttggg ggaagagatg 1200 gtggggacag aatcgaagcc tccggccaaa gctgtccggg gctccctggc 1250 ccagcggtga cctctctccc ctcccccagc ccaaccaaca aaagtccagt 1300 gtgcagcccg gtcaccatgg agacgccgct cgcctccctg cagggcacca 1350 ggcccagctc ttgcttggct ctcctggagc ttggcgcctg accctgaaag 1400 ggatgggctc tcgctattct gccccctggc cctgggccag ggaccccaga 1450 ccacccttcc tctgccccca cttcctatca ccctagctgg gctgctgctc 1500 ttcagacctc agatccggga aactagaggg gtcccagatg ctggggtgca 1550 tatgtcagat gggagtgcag gagggcggcc caggacagct gatcgctagg 1600 catggccccc aggcccacgt ctgtgtgcat tcctgccttg gaggtacgcg 1650 cctgcaagtg tgtttcctga gtacaggtgt cgccgagggc gtgcacatct 1700 gctgtgtagc tctctgggac ccccaggtgc catcaggccc tgagcgtggg 1750 ctctgctcat ttgcctgcíg cctcctgccg cttgtgcgga caagggacgg 1800 ggcctggggt gatgccggga gagggcaggg cctctcctca ccaccccctc 1850 tgcatgccag GTGCCTGC AG GCCCTGGAGC G ACGCTG AGC TGCTCCTGGC 1900 CGCATGCACC AGCGACTTCG gtgagtgtcc ccgccatggg gggagcctgg 1 50 agcctgcctt cccctgaatg cctaccgcag ccacatgcct ccccacagTA 2000 ATTCACGGGA TCATCCATGG GGTCACCCAT GACGTGGAGC TGCAGGAGTC 2050 TGTCATCACT GTGGTGGCCG CCCGTGTCCT CCGCCAGACA CCGCCGCTGT 2100 TCCAGGCGGG GCGATCCGGG GACCAGGGGC TGACCTCCAT TCGTACCCCA 2150 CTGCGCTGTG GCGTCCACCC GGGCCCAGGC ACCTTCCTCT TCATGGGCTG 2200 GAGCCGCTTT GGGGAGGCCC GGCTGGGCTG TGCCCCACGA TTCCAGGAGT 2250 TCCGCCGTGC CTACGAGGCT GCCCGTGCTG CCCACCTCCA CCCCTGCGAG 2300 GTGGCGCTGC ACTGAGGGGC TGGGTGCTGG GGAGGGGCTG GTAGGAGGGA 2350 GGGTGGGCCC ACTGCTTTGG AGGTGATGGG ACTATCAATA AGAACTCTGT 2400 TCACGCAAgc tgctgtggac ctggtctcct gtgtccagcc cagccttggg 2450 cctgcctcgc agctgtgagg atggctccaa ttcctgcctc ctggcgggag 2500 actgaggc NsG33 de humano (1 09 pb; CDS=1 8-999) (SEQ ID No. 2). >gi|34147349|ref|NM_024042.2| proteína hipotética MGC2601 (MGC2601 ) de Homo sapiens, ARNm.

GCTTCGCCGGGGCCGGGCGGCCGGCGCCCCCGGCTGCTCCCGCCGCCGCCCGGACCCGCGCCC CGCCGGGGCAGCGGTGGTGAGAGCCCCGACTCCCCGGACGCCGCCCGCCGTGCCATGGGGTTC CCGGCCGCGGCGCTGCTCTGCGCGCTGTGCTGCGGCCTCCTGGCCCCGGCTGCCCGCGCCGGC TACTCCGAGGAGCGCTGCAGCTGGAGGGGCAGCGGCCTCACCCAGGAGCCCGGCAGCGTGGGG CAGCTGGCCCTGGCCTGTGCGGAGGGCGCGGTTGAGTGGCTGTACCCGGCTGGGGCGCTGCGCC TGACCCTGGGCGGCCCCGATCCCAGAGCGCGGCCGGCATCGCCTGTCTGCGGCCGGTGCGGCCC TTCGCGGGCGCCCAGGTCTTCGCGGAGCGCGCAGGGGGCGCCCTGGAGCTGCTGCTGGCCGAG GGCCCGGGCCCGGCAGGGGGCCGCTGCGTGCGCTGGGGTCCCCGCGAGCGCCGGGCCCTCTTC CTGCAGGCCACGCCGCACCAGGACATCAGCCGCCGCGTGGCCGCCTTCCGCTTTGAGCTGCGCG AGGACGGGCGCCCCGAGCTGCCCCCGCAGGCCCACGGTCTCGGCGTAGACGGTGCCTGCAGGC CCTGCAGCGACGCTGAGCTGCTCCTGGCCGCATGCACCAGCGACTTCGTAATTCACGGGATCATC CATGGGGTCACCCATGACGTGGAGCTGCAGGAGTCTGTCATCACTGTGGTGGCCGCCCGTGTCCT CCGCCAGACACCGCCGCTGTTCCAGGCGGGGCGATCCGGGGACCAGGGGCTGACCTCCATTCGT ACCCCACTGCGCTGTGGCGTCCACCCGGGCCCAGGCACCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGGCGCTT TGGGGAGGCCCGGCTGGGCTGTGCCCCACGATTCCAGGAGTTCCGCCGTGCCTACGAGGCTGCC CGTGCTGCCCACCTCCACCCCTGCGAGGTGGCGCTGCACTGAGGGGCTGGGTGCTGGGGAGGGG CTGGTAGGAGGGAGGGTGGGCCCACTGCTTTGGAGGTGATGGGACTATCAATAAGAACTCTGTTCA CGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Secuencia de nucleótidos que codifica para polipéptido C-terminal de NsG33 de humano (SEQ ID No. 16).

GCCCTCTTCCTGCAGGCCACGCCGCACCAGGACATCAGCCGCCGCGTGGCCGCCTTCCGCTTTGAGC TGCGCGAGGACGGGCGCCCCGAGCTGCCCCCGCAGGCCCACGGTCTCGGCGTAGACGGTGCCTGCA GGCCCTGCAGCGACGCTGAGCTGCTCCTGGCCGCATGCACCAGCGACTTCGTAATTCACGGGATCAT CCATGGGGTCACCCATGACGTGGAGCTGCAGGAGTCTGTCATCACTGTGGTGGCCGCCCGTGTCCTC CGCCAGACACCGCCGCTGTTCCAGGCGGGGCGATCCGGGGACCAGGGGCTGACCTCCATTCGTACC CCACTGCGCTGTGGCGTCCACCCGGGCCCAGGCACCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGCTTTGGGG AGGCCCGGCTGGGCTGTGCCCCACGATTCCAGGAGTTCCGCCGTGCCTACGAGGCTGCCCGTGCTGC CCACCTCCACCCCTGCGAGGTGGCGCTGCAC Secuencia de aminoácidos de longitud completa de NsG33 de humano (SEQ ID No. 3). >IPI00031531.1 REFSEQ NP:NP 076947 TREMBL:Q9UJH9 ENSEMBL:ENSP00000219542 Tax_ld=9606 C380A1.2.1 (proteína novedosa). MGFPAAALLC ALCCGLLAPA ARAGYSEERC SWRGSGLTQE PGSVGQLALA CAEGAVEWLY PAGALRLTLG GPDPRARPGI ACLRPVRPFA GAQVFAERAG GALELLLAEG PGPAGGRCVR WGPRERRALF LQATPHQDIS RRVAAFRFEL REDGRPELPP QAHGLGVDGA CRPCSDAELL LAACTSDFVI HGIIHGVTHD VELQESVITV VAARVLRQTP PLFQAGRSGD QGLTSIRTPL RCGVHPGPGT FLFMGWSRFG EARLGCAPRF QEFRRAYEAA RAAHLHPCEV ALH Proteína NsG33 de humano, sin péptido de señal (SEQ ID No. 4). GYSEERCSWR GSGLTQEPGS VGQLALACAE GAVEWLYPAG ALRLTLGGPD PRARPGIACL RPVRPFAGAQ VFAERAGGAL ELLLAEGPGP AGGRCVRWGP RERRALFLQA TPHQDISRRV AAFRFELRED GRPELPPQAH GLGVDGACRP CSDAELLLAA CTSDFVIHGI IHGVTHDVEL QESVITWAA RVLRQTPPLF QAGRSGDQGL TSIRTPLRCG VHPGPGTFLF MGWSRFGEAR LGCAPRFQEF RRAYEAARAA HLHPCEVALH Polipéptido C-terminal de NsG33 de humano (SEQ ID No. 5). ALFLQATPHQ DISRRVAAFR FELREDGRPE LPPQAHGLGV DGACRPCSDA ELLLAACTSD FVIHGIIHGV THDVELQESV ITWAARVLR QTPPLFQAGR SGDQGLTSIR TPLRCGVHPG PGTFLFMGWS RFGEARLGCA PRFQEFRRAY EAARAAHLHP CEVALH Péptido N-terminal de humano (SEQ ID No. 19). GYSEERCSWR GSGLTQEPGS VGQLALACAE GAVEWLYPAG ALRLTLGGPD PRARPGIACL RPVRPFAGAQ VFAERAGGAL ELLLAEGPGP AGGRCVRWGP RERR Péptido N-terminal de humano (SEQ ID No. 22). GYSEERCSWR GSGLTQEPGS VGQLALACAE GAVEWLYPAG ALRLTLGGPD PRARPGIACL RPVRPFAGAQ VFAERAGGAL ELLLAEGPGP AGGRCVR Secuencia de nucleotidos genómica de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 6). Cromosoma 17 genómico (cadena inversa): ?????????? ???p?????? nnnnnnimiin nnnnnnnnrui nnnnnnnnnn 0050 nimiinnnnnn nnimrLnniinn muniiiniincc cctaaccatg ctggtagcca 0100 CGCTTCTTTG CGCGCTCTGT TGCGGCCTCC TGGCCGCGTC CGCTCACGCT 0150 GGCTACTCGG AAGACCGCTG CAGCTGGAGG GGCAGgtacc aggagggact 0200 gcggggaggg ttgtgggttt atttatttat ttattttatt ttatttactt 0250 cttgggttgg agggttccct cccacttgga actgaggaaa cgcagacttc 0300 aatgtcctgt tacacagagt agaagcagat gttggtagcc gcgggaaaag 0350 ggatgagcgg gctagggaac gagggtcacc cacctgagaa ccaccgtcct 0400 gtccccagCG GTTTGACCCA GGAGCCTGGC AGCGTGGGGC AGCTGACCCT 0450 GGACTGTACT GAGGGCGCTA TCGAGTGGCT GTACCCAGCT GGGGCGCTGC 0500 GCCTGACCCT GGGCGGCCCC GATCCGGGCA CACGGCCCAG CATCGTCTGT 0550 CTGCGCCCAG AGCGGCCCTT CGCTGGTGCC CAGGTCTTCG CTGAACGTAT 0600 GACCGGCAAT CTAGAGTTGC TACTGGCCGA GGGCCCGGAC CTGGCTGGGG 0650 GCCGCTGCAT GCGCTGGGGT CCCCGCGAGC GCCGAGCCCT TTTCCTGCAG 0700 GCCACACCAC ACCGCGACAT CAGCCGCAGA GTTGCTGCCT TCCGTTTTGA 0750 ACTGCACGAG G CCAACGTG CAGAAATGTC TCCCCAGGCT CAAGGTCTTG 0800 GTGTGGATGg tgagtgatta tgagactggc tgggtgtcag aaattggccc 0850 tccacactga cctgatggga ctgggccttg ccaccccatt gcatggagag 0900 tccttctgta gcttgacaga ggccactccg gtggagagca tagtggcttc 0950 caggtcgtaa ggaggtgagt tggaagtgcc cccgcctttc tctcctcctc 1000 ctcttaaaag attcggttta ggaaaagagc aggagggggc aaatgcccga 1050 gaggccagcc ctgggtctct ggtttctgaa ggattggggg aagggttaag 1 100 ctgaggcaga atcaaagcct atggccaagg ctgtccaggg ctccctggcc 1 150 tggtggtgac ctccttcccc tccccccaag cccagccaac aaaagtccag 1200 tgtgcctctt cgtcaccatg gagactgcct gccctgcctc cctgcagggc 1250 accaggccca gtgctttgct cttctggaac ttgtagcctg accctgcagg 1300 gaatgaatgg ctctctgact gttctgccct agctagagac ccccccgaac 1350 tggagtccac tagaatatcc ctagctagag ctgggaggtc acagaacgtt 1400 tcccagtgtt agtctgagtt tatgagatgg taccaagcct gtgtatgagg 1450 cactgaggtg cccatcagta ggcatgtacc tgcagggtgt cttcaggcta 1500 taggatgctg ggagaagggt ttagtctctt gctcctgtac cttttcctct 1550 tgggaggagc tgtgggctcg tgctgagaga tcacaggcct ggctgatgac 1600 ctgccttgca tgctagGTGC CTGCAGGCCC TGC AGTGATG CCGAGCTCCT 1650 CCTGGCTGCA TGCACCAGTG ATTTTGgtga gtgtttctgt tgcgggagag 1700 cttagggtct gcctcacatt cccacgtgcc caccactggc caccatgtct 1750 cctcgtagTG ATCCACGGGA CCATCCATGG GGTCGCCCAT GACACAGAGC 1800 TGC AAG A ATC AGTCATC ACT GTGGTGGTTG CTCGTGTC AT CCGCCAG AC A 1850 CTGCCACTGT TCAAGGAAGG GAGCTCGGAG GGCCAAGGCC GGGCCTCCAT 1900 TCGTACCTTG CTGCGCTGTG GTGTGCGTCC TGGCCCAGGC TCCTTCCTCT 1950 TCATGGGCTG GAGCCGATTT GGCGAAGCTT GGCTGGGCTG TGCTCCCCGC 2000 TTCCAAGAGT TCAGCCGTGT CTATTCAGCT GCTCTCACGA CCCATCTCAA 2050 CCCATGTGAG ATGGCACTGG ACTGAGAGAC CTGGGAGCAA GCCCTGGATG 2100 GACCTTCTTC TGGAGATGGG GTGTTGGGG A GGGTGATGGG AGGGTGGGTG 2150 AGAAGGGTGT GGCTCGGATG GCATCCTGGT ACCCACAGTG AGCTGGTAGA 2200 ATACTAAGTA ATCTGGACCA TAccagccac tgtagtcatg gtcttctgtg 2250 gcaggcagca tacccagctc tgtgcctgcc tcactttgtc tactctccag 2300 tctgctgccc ttctaaccct te ADNc parcial de NsG33 de ratón ( 048 pb; CDS=<2-886) (SEQ ID No. 7).

CCACGCGTCCGCCCACGCGTCCGCGCTTCTTTGCGCGCTCTGTTGCGGCCTCCTGGCCGCGTCCGCTC ACGCTGGCTACTCGGAAGACCGCTGCAGCTGGAGGGGCAGCGGTTTGACCCAGGAGCCTGGCAGCG TGGGGCAGCTGACCCTGGACTGTACTGAGGGCGCTATCGAGTGGCTGTACCCAGCTGGGGCGCTGC GCCTGACCCTGGGCGGCCCCGATCCGGGCACACGGCCCAGCATCGTCTGTCTGCGCCCAGAGCGGC CCTTCGCTGGTGCCCAGGTCTTCGCTGAACGTATGACCGGCAATCTAGAGTTGCTACTGGCCGAGGG CCCGGACCTGGCTGGGGGCCGCTGCATGCGCTGGGGTCCCCGCGAGCGCCGAGCCCTTTTCCTGCAG GCCACACCACACCGCGACATCAGCCGCAGAGTTGCTGCCTTCCGTTTTGAACTGCACGAGGACCAA CGTGCAGAAATGTCTCCCCAGGCTCAAGGTCTTGGTGTGGATGGTGCCTGCAGGCCCTGCAGTGATG CCGAGCTCCTCCTGGCTGCATGCACCAGTGATTTTGTGATCCACGGGACCATCCATGGGGTCGCCCA TGACACAGAGCTGCAAGAATCAGTCATCACTGTGGTGGTTGCTCGTGTCATCCGCCAGACACTGCCA CTGTTCAAGGAAGGGAGCTCGGAGGGCCAAGGCCGGGCCTCCATTCGTACCTTGCTGCGCTGTGGT GTGCGTCCTGGCCCAGGCTCCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGATTTGGCGAAGCTTGGCTGGGCT GTGCTCCCCGCTTCCAAGAGTTCAGCCGTGTCTATTCAGCTGCTCTCACGACCCATCTCAACCCATGT GAGATGGCACTGGACTGAGAGACCTGGGAGCAAGCCCTGGATGGACCTTCTTCTGGAGATGGGGTG TTGGGGAGGGTGATGGGAGGGTGGGTGAGAAGGGTGTGGCTCGGATGGCATCCTGGTACCCACAGT GAGCTGGTAGAATACTAAGTAATCTGGACCATAAAAAAAAAAAAAAAA ADNc de NsG33 de ratón, 1363 pb, CDS 84..959 (SEQ ID No. 25). NIVM 33719. Meteorina de Mus musculus [g¡.56550040]. gggcagccgc gccgcgggct gctcgcgctg cggccccgac cctcccgggg cagcagtccg aggccccggc gcgtccccta accatgctgg tagccacgct tctttgcgcg ctctgttgcg gcctcctggc cgcgtccgct cacgctggct actcggaaga ccgctgcagc tggaggggca gcggtttgac ccaggagcct ggcagcgtgg ggcagctgac cctggactgt actgagggcg ctatcgagtg gctgtaccca gctggggcgc tgcgcctgac cctgggcggc cccgatccgg gcacacggcc cagcatcgtc tgtctgcgcc cagagcggcc cttcgctggt gcccaggtct tcgctgaacg tatgaccggc aatctagagt tgctactggc cgagggcccg gacctggctg ggggccgctg catgcgctgg ggtccccgcg agcgccgagc ccttttcctg caggccacao cacaccgcga catcagccgc agagttgctg ccttccgttt tgaactgcac gaggaccaac gtgcagaaat gtctccccag gctcaaggtc ttggtgtgga tggtgcctgc aggccctgca gtgatgccga gctcctcctg gctgcatgca ccagtgattt tgtgatccac gggaccatcc atggggtcgc ccatgacaca gagctgcaag aatcagtcat cactgtggtg gttgctcgtg tcatccgcca gacactgcca ctgttcaagg aagggagctc ggagggccaa ggccgggcct ccattcgtac cttgctgcgc tgtggtgtgc gtcctggccc aggctcctto ctcttcatgg gctggagccg atttggcgaa gcttggctgg gctgtgctcc ccgcttccaa gagttcagcc gtgtctattc agctgctctc acgacccatc tcaacccatg tgagatggca ctggactgag agacctggga gcaagccctg gatggacctt cttctggaga tggggtgttg gggagggtga tgggagggtg ggtgagaagg gtgtggctcg gatggcatcc tggtacccac agtgagctgg tagaatacta agtaatctgg accataccag ccactgtagt catggtcttc tgtggcaggc agcataccca gctctgtgcc tgcctcactt tgtctactct ccagtctgct gcccttctaa cccttcttag cctgetgacc agtgagctca tgttttcctc gaattccagg gtgctgctgg ggttcagagc aaccgtgccg tagtttggaa gacttgagct aattgttttt tttttgtttg tttttttgtt tgtttaaagg tggcctgggg ggggcggcaa acá Secuencia de nucleótidos que codifica para polipéptido C-terminal de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 17).

GCCCTTTTCCTGCAGGCCACACCACACCGCGACATCAGCCGCAGAGTTGCTGCCTTCCGT TTTGAACTGCACGAGGACCAACGTGCAGAAATGTCTCCCCAGGCTCAAGGTCTTGGTGTG GATGGTGCCTGCAGGCCCTGCAGTGATGCCGAGCTCCTCCTGGCTGCATGCACCAGTGAT TTTGTGATCCACGGGACCATCCATGGGGTCGCCCATGACACAGAGCTGCAAGAATCAGTC ATCACTGTGGTGGTTGCTCGTGTCATCCGCCAGACACTGCCACTGTTCAAGGAAGGGAGC TCGGAGGGCCAAGGCCGGGCCTCCATTCGTACCTTGCTGCGCTGTGGTGTGCGTCCTGGC CCAGGCTCCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGATTTGGCGAAGCTTGGCTGGGCTGTGCT CCCCGCTTCCAAGAGTTCAGCCGTGTCTATTCAGCTGCTCTCACGACCCATCTCAACCCAT GTGAGATGGCACTGGAC NsG33 parcial de ratón (SEQ ID No. 8), es decir, extremo N-terminal faltante. >gil23274274lgbiAAH37181 .1 l proteína 1810034B16Rik [Mus musculus].

HASAHASALL CALCCGLLAA SAHAGYSEDR CSWRGSGLTQ EPGSVGQLTL DCTEGAIEWL YPAGALRLTL GGPDPGTRPS IVCLRPERPF AGAQVFAERM TG LELLLAE GPDLAGGRCM RWGPRERRAL FLQATPHRDI SRRVAAFRFE LHEDQRAEMS PQAQGLGVDG ACRPCSDAEL LLAACTSDFV IHGTIHGVAH DTELQESVIT WVARVIRQT LPLFKEGSSE GQGRASIRTL LRCGVRPGPG SFLF GWSRF GEAWLGCAPR FQEFSRVYSA ALTTHLNPCE MALD Secuencia de aminoácidos de longitud completa de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 26). ref|NP_598480.1 l meteorina [Mus musculus]. MLVATLLCAL CCGLLAASAH AGYSEDRCSW RGSGLTQEPG SVGQLTLDCT EGAIEWLYPA GALRLTLGGP DPGTRPSIVC LRPERPFAGA QVFAERMTGN LELLLAEGPD LAGGRCMRWG PRERRALFLQ ATPHRDISRR VAAFRFELHE DQRAEMSPQA QGLGVDGACR PCSDAELLLA ACTSDFVIHG TIHGVAHDTE LQESVITVW ARVIRQTLPL FKEGSSEGQG RASIRTLLRC GVRPGPGSFL FMGWSRFGEA WLGCAPRFQE FSRVYSAALT THLNPCEMAL D Proteína NsG33 de ratón, sin péptido de señal (SEQ ID No. 9). GYSEDRCSWR GSGLTQEPGS VGQLTLDCTE GAIEWLYPAG ALRLTLGGPD PGTRPSIVCL RPERPFAGAQ VFAERMTGNL ELLLAEGPDL AGGRCMRWGP RERRALFLQA TPHRDISRRV AAFRFELHED QRAEMSPQAQ GLGVDGACRP CSDAELLLAA CTSDFVIHGT IHGVAHDTEL QESVITVWA RVIRQTLPLF KEGSSEGQGR ASIRTLLRCG VRPGPGSFLF MGWSRFGEAW LGCAPRFQEF SRVYSAALTT HLNPCEMALD Polipéptido C-terminal de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 10). ALFLQATPHR DISRRVAAFR FELHEDQRAE MSPQAQGLGV DGACRPCSDA ELLLAACTSD FVIHGTIHGV AHDTELQESV ITWVARVIR QTLPLFKEGS SEGQGRASIR TLLRCGVRPG PGSFLFMGWS RFGEAWLGCA PRFQEFSRVY SAALTTHLNP CEMALD Polipéptido N-terminal de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 20). GYSEDRCSWR GSGLTQEPGS VGQLTLDCTE GAIEWLYPAG ALRLTLGGPD PGTRPSIVCL RPERPFAGAQ VFAERMTGNL ELLLAEGPDL AGGRCMRWGP RERR Polipéptido N-terminal de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 23). GYSEDRCSWR GSGLTQEPGS VGQLTLDCTE GAIEWLYPAG ALRLTLGGPD PGTRPSIVCL RPERPFAGAQ VFAERMTGNL ELLLAEGPDL AGGRCMR Secuencia genómica de NsG33 de rata con 100 pares de bases extra 5 añadidos en los extremos de 5' y 3' (SEQ ID No. 1 ). Cromosoma genómico (cadena inversa): tccccggttg tggggannnn nnnhniuinnn nnnnnnnnnn nnnniumnnn 15064142 nnnnnnnnnn nnnnnnggca gcagcccgag ccccggcgcg tcccctaacc 15064092 ATGCTGGTAG CGGCGCTTCT CTGCGCGCTG TGCTGCGGCC TCTTGGCTGC 15064042 GTCCGCTCGA GCTGGCTACT CCGAGGACCG CTGCAGCTGG AGGGGCAGgt 15063992 acccaggaga gattttgggg aggatttttg ttatttgtgt tttaaattga 15063942 aatcttgggt tggagggctc cctcccactt ggaactgagg aagcgcagac 15063892 ctcaatgtcc tgttccagag ggtggacgca ggtgttggtg gccgcgggaa 15063842 Q aagggttgag cgggctaggg aaatgagggc cacccacctg agaaccaccg 15063792 tcctgtcccc agCGGTTTGA CCCAGGAACC TGGCAGCGTG GGGC AGCTGA 15063742 CCCTGGATTG TACTGAGGGT GCTATCGAGT GGCTGTATCC AGCTGGGGCG 15063692 CTGCGCCTGA CTCTAGGCGG CTCTGATCCG GGCACGCGGC CCAGCATCGT 15063642 CTGTCTGCGC CCAACACGGC CCTTCGCTGG TGCCCAGGTC TTCGCTGAAC 15063592 GGATGGCCGG CAACCTAGAG TTGCTACTGG CCGAGGGCCA AGGCCTGGCT15063542 GGGGGCCGCT GCATGCGCTG GGGTCCTCGC GAGCGCCGAG CCCTTTTCCT 15063492 GCAGGCCACG CCACACCGGG ACATCAGCCG CAGAGTTGCT GCCTTCCAAT 15063442 TTGAACTGCA CGAGGACCAA CGTGCAGAAA TGTCTCCCCA GGCCCAAGGT 15063392 TTTGGTGTGG ATGgtgagtg actagactgg ctggggcgga gctgggtgtc 15063342 agaaactggc cctctacact ggcctgatcc gaatgggcct tgcctcccca 15063292 ctgcaccgaa agccctgtag cttgacggag gctactctgg tggagaacac 15063242 agtggcttcc aggtcatagg gaggtgagtt gagagttctc cctcctttct 15063192 ctcctcctct tcaaggttcg gtttaggaaa agagcgggag ggggcagatg 15063142 ccagagaggc cagccttggg tctctggttt ctgaagggtt ggggggaagg 1 063092 gttgggctgg ggcagaatca aagcctatgg ccgaagctgt ccagggctcc 15063042 ctggccttgt ggtgacctcc ttcccctccc cctagcccaa ccaacaaaag 15062992 tccagtgtgc ctcttcgtca ccatggagac tgcctgccct gcctcccggc 15062942 agggcaccag gcccagtgct ttgctcttct ggaacttgtc tcctgaccct 15062892 gcagggaatg gctctctgac tgctctgcca tagacagaga ccccagaagc 15062842 agagtccact agaatatccc tggctggacc tgggaggcag ctctgggagg 15062792 ttacagaaag ttccccagtg ttggtctgag tttctgagat gggtgtgcag . 15062742 gaatgtgtcc gaggcactga ggggcccatg agtagtcttc aggcagtgtg 15062692 atgctgggag aagggtttag tcgccagctc ctgtaccttc tcctactgtg 15062642 gggagctgtg ggcttgtgct gagagatcac aggcctgcct gatgacctgc 15062592 cttgcatgct agGTGCCTGC AGGCCCTGC A GTG ATGCCGA GCTCCTTCTG 15062542 ACTGCATGC A CCAGTGACTT TGgtgagtgt ttccgtcttg ggagagctta 15062492 gggtctgccc cacattccca cgtgcccacc actggccacc atgtctcttc 15062442 gtagTGATCC ATGGGACCAT CCATGGGGTC GTCCATGACA TGGAGCTGCA 15062392 AGAATCAGTC ATCACTGTGG TGGCCACTCG TGTCATCCGC CAGACACTGC 15062342 CACTGTTCCA GGAAGGGAGC TCGGAGGGCC GGGGCCAGGC CTCCGTTCGT 15062292 ACCTTGTTGC GCTGTGGTGT GCGTCCTGGC CCAGGCTCCT TCCTCTTCAT 15062242 GGGCTGGAGC CGATTTGGCG AAGCTTGGCT GGGCTGCGCT CCCCGCTTCC 150621 2 AAGAGTTC AG CCGTGTCTAT TCAGCTGCTC TCGCGGCCCA CCTCAACCCA 15062142 TGTGAGGTGG CACTGGACTG AGAGACCTGG GAGCAAGCCC TGGATGGATC 15062092 TTCCTCTGGG GATGGGGTGT TGGGGAGGGG TGATAGGAGG GTGGGTGGGA 15062042 AGGGTGTGGC TCAGATGGCA TCCTGGTACC CACAGTGAGG TGGTAGAATA 15061992 CTAAATAACC TGGATCACAC Cagccactgt agacatggtc ttctgtgaca 15061942 ggcaggctca ctcagctctg ctcctgcctc actttaccta ctctccagtc 15061892 tgctgccctt ctgacccttc t SEQ ID No. 12, NsG33 de rata (1026 pb; CDS=876). >gij34870570lref|X _213261.2| Rattus norvegicus, similar a proteína 1810034B16Rik (LOC287151 ), ARNm. ATGCTGGTAGCGGCGCTTCTCTGCGCGCTGTGCTGCGGCCTCTTGGCTGCGTCCGCTCGA GCTGGCTACTCCGAGGACCGCTGCAGCTGGAGGGGCAGCGGTTTGACCCAGGAACCTGG CAGCGTGGGGCAGCTGACCCTGGATTGTACTGAGGGTGCTATCGAGTGGCTGTATCCAGC TGGGGCGCTGCGCCTGACTCTAGGCGGCTCTGATCCGGGCACGCGGCCCAGCATCGTCTG TCTGCGCCCAACACGGCCCTTCGCTGGTGCCCAGGTCTTCGCTGAACGGATGGCCGGCAA CCTAGAGTTGCTACTGGCCGAGGGCCAAGGCCTGGCTGGGGGCCGCTGCATGCGCTGGG GTCCTCGCGAGCGCCGAGCCCTTTTCCTGCAGGCCACGCCACACCGGGACATCAGCCGCA GAGTTGCTGCCTTCCAATTTGAACTGCACGAGGACCAACGTGCAGAAATGTCTCCCCAGG CCCAAGGTTTTGGTGTGGATGGTGCCTGCAGGCCCTGCAGTGATGCCGAGCTCCTTCTGA CTGCATGCACCAGTGACTTTGTGATCCATGGGACCATCCATGGGGTCGTCCATGACATGG AGCTGCAAGAATCAGTCATCACTGTGGTGGCCACTCGTGTCATCCGCCAGACACTGCCAC TGTI CAGGAAGGGAGCTCGGAGGGCCGGGGCCAGGCCTCCGTTCGTACCTTGTTGCGCT GTGGTGTGCGTCCTGGCCCAGGCTCCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGATTTGGCGAAG CTTGGCTGGGCTGCGCTCCCCGCTTCCAAGAGTTCAGCCGTGTCTATTCAGCTGCTCTCGC GGCCCACCTCAACCCATGTGAGGTGGCACTGGACTGAGAGACCTGGGAGCAAGCCCTGG ATGGATCTTCCTCTGGGGATGGGGTGTTGGGGAGGGGTGATAGGAGGGTGGGTGGGAAG GGTGTGGCTCAGATGGCATCCTGGTACCCACAGTGAGGTGGTAGAATACTAAATAACCTG GATCACACC Secuencia codificante de polipéptido C-terminal de NsG33 de rata (SEQ ID No. 18).

GCCCTTTTCCTGCAGGCCACGCCACACCGGGACATCAGCCGCAGAGTTGCTGCCTTCCAA TTTGAACTGCACGAGGACCAACGTGCAGAAATGTCTCCCCAGGCCCAAGGTTTTGGTGTG GATGGTGCCTGCAGGCCCTGCAGTGATGCCGAGCTCCTTCTGACTGCATGCACCAGTGAC TTTGTGATCCATGGGACCATCCATGGGGTCGTCCATGACATGGAGCTGCAAGAATCAGTC ATCACTGTGGTGGCCACTCGTGTCATCCGCCAGACACTGCCACTGTTCCAGGAAGGGAGC TCGGAGGGCCGGGGCCAGGCCTCCGTTCGTACCTTGTTGCGCTGTGGTGTGCGTCCTGGC CCAGGCTCCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGATTTGGCGAAGCTTGGCTGGGCTGCGCT CCCCGCTTCCAAGAGTTCAGCCGTGTCTATTCAGCTGCTCTCGCGGCCCACCTCAACCCA TGTGAGGTGGCACTGGAC Secuencia de aminoácidos de longitud completa de NsG33 de rata (SEQ ID No. 13). >IPI00369281.1 |REFSEQ-XP:XP_213261|ENSEMBL:ENSRNOP00000026676 MLVAALLCAL CCGLLAASAR AGYSEDRCSW RGSGLTQEPG SVGQLTLDCT EGAIEWLYPA GALRLTLGGS DPGTRPSIVC LRPTRPFAGA QVFAERMAG LELLLAEGQG LAGGRCMRWG PRERRALFLQ ATPHRDISRR VAAFQFELHE DQRAEMSPQA QGFGVDGACR PCSDAELLLT ACTSDFVIHG TIHGWHDME LQESVITWA TRVIRQTLPL FQEGSSEGRG QASVRTLLRC GVRPGPGSFL FMGWSRFGEA WLGCAPRFQE FSRVYSAALA AHLNPCEVAL D Proteína NsG33 de rata, sin péptido de señal (SEQ ID No. 14). (ASARA)GYSED RCSWRGSGLT QEPGSVGQLT LDCTEGAIEW LYPAGALRLT LGGSDPGTRP SIVCLRPTRP FAGAQVFAER MAGNLELLLA EGQGLAGGRC MRWGPRERRA LFLQATPHRD ISRRVAAFQF ELHEDQRAEM SPQAQGFGVD GACRPCSDAE LLLTACTSDF VIHGTIHGW HDMELQESVI TWATRVIRQ TLPLFQEGSS EGRGQASVRT LLRCGVRPGP GSFLFMGWSR FGEAWLGCAP RFQEFSRVYS AALAAHLNPC EVALD Polipéptido C-terminal de NsG33 de rata (SEQ ID No. 15).

ALFLQATPHR DISRRVAAFQ FELHEDQRAE MSPQAQGFGV DGACRPCSDA ELLLTACTSD FVIHGTIHGV VHDMELQESV ITWATRVIR QTLPLFQEGS SEGRGQASVR TLLRCGVRPG PGSFLFMGWS RFGEAWLGCA PRFQEFSRVY SAALAAHLNP CEVALD Polipéptido N-terminal de NsG33 de rata (SEQ ID No. 21). (ASARA)GYSED RCSWRGSGLT QEPGSVGQLT LDCTEGAIEW LYPAGALRLT LGGSDPGTRP SIVCLRPTRP FAGAQVFAER MAGKLELLLA EGQGLAGGRC MRWGPRERR Polipéptido N-terminal de NsG33 de rata (SEQ ID No. 24). (ASARA)GYSED RCSWRGSGLT QEPGSVGQLT LDCTEGAIEW LYPAGALRLT LGGSDPGTRP SIVCLPvPTRP FAGAQVFAER MAGNLELLLA EGQGLAGGRC MR EJEMPLO 2 Análisis de bioinformática Descripción general NsG33 de humano es una proteína del factor de crecimiento secretada expresada como un precursor de 293 aminoácidos a altos niveles en el sistema nervioso central y subregiones del mismo, en el sistema nervioso periférico, en la retina y el mesencéfalo de humano en desarrollo. Los homólogos de ratón (SEQ ID No. 8) y rata (SEQ ID No. 13) tienen longitudes completas de 294 y 291 aminoácidos, y los por cientos de identidades son 80.3 y 80.2, respectivamente.

Procesamiento de la proteína NsG33 de humano contiene una secuencia de péptidos de señal N-terminales de 23 aminoácidos, que es digerida en el motivo de secuencia ARA-GY. Este sitio de digestión del péptido de señal es predicho por medio del método SignalP (Nielsen et al., 1997) y la gráfica resultado mostrada en la figuras 1A-1 B. Un sitio de digestión del péptido de señal se encuentra en un sitio similar en la NsG33 de ratón (posición 24) y la NsG33 de rata (posición 16 ó 21 ). La digestión más probable de NsG33 de rata es en la posición 21 , ya que esto corresponde a la posición de digestión predicha en la NsG33 de humano y de ratón. Esto significa que el extremo N-terminal más probable de SEQ ID No. 14, 21 y 24 sea GYSEDRCS y no ASARAGYSED mostrado en el listado de secuencias. La predicción del péptido de señal en la NsG33 de ratón, provee el mismo sitio de digestión para la secuencia parcial de NsG33 (SEQ ID No. 8) y para la secuencia de longitud completa de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 26).

Procesamiento de la proproteína Se predice la digestión de la proproteína de tipo general en la NsG33 de humano (SEQ ID No. 3), por medio del método ProP en la posición 127 con una puntuación de 0.831 , motivo de secuencia 'WGPRERR-AL'. Asimismo, se predice un sitio de digestión en la NsG33 de ratón (SEQ ID No. 8) en la posición 128 con una puntuación de 0.831 , motivo de secuencia 'WGPRERR-AL', y en la NsG33 de rata (SEQ ID No. 13) en la posición 125 con una puntuación de 0.831 y el motivo de secuencia 'WGPRERR-AL'.

Función de la proteína NsG33 pertenece a la categoría de proteínas que actúan como factores de crecimiento. Esta noción es apoyada por predicciones hechas por el servidor de predicción de la función de proteínas ProtFun (Jensen et al., 2002 y 2003), que provee puntuaciones de desigualdad arriba de 1 para exactamente este tipo de categoría, como se muestra en la figura 2. El método ProtFun predice la función de las proteínas con base en rasgos derivados de secuencia, opuestamente a similitud de secuencia. Rasgos que son importantes para la discriminación entre las clases del "factor de crecimiento" contra todas las demás clases, son: potencial de distribución de la proteína, potencial de direccionamiento de la proteína, potencial del péptido de señal, regiones de baja complejidad, estructura secundaria de la proteína, número de residuos negativos, y número de átomos (Jensen et al., 2003). Los cálculos de identidad de secuencia siguientes se han hecho con el programa alignO, usando una matriz BLOSUM50 y penalizaciones de espacio -12/-2. El cuadro 1 muestra el por ciento de identidad de secuencia entre NsG33 de longitud completa de humano, contra secuencias de ratón y rata.

CUADRO 1 El cuadro 2 muestra el por ciento de identidad de secuencia entre NsG33 de humano, contra secuencias de ratón y rata después de la remoción del péptido de señal N-terminal.

CUADRO 2 Referencias ProP: Prediction of proprotein convelíase cleavage sites. Peter Duckert, S0ren Brunak y Nikolaj Blom. Protein Engineering, Design and Selection: 17: 107-112, 2004. SignalP: Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, S0ren Brunak y Gunnar von Heijne, Protein Engineering 10, 1-6 (1997). ProtFun: Ab initio prediction of human orphan protein function from post-translational modifications and localization features. L. Juhl Jensen, R. Gupta, N. Blom, D. Devos, J. Tamames, C. Kesmir, H. Nielsen, H. H. Staerfeldt, . Rapacki, C. Workman, C. A. F. Andersen, S. Knudsen, A. Krogh, A. Valencia y S. Brunak. J. Mol. Biol., 319: 1257-1265, 2002. Prediction of human protein function according to Gene Ontology categories, LJ. Jensen, R. Gupta, H. H. Staerfeldt, S. Brunak. Bioinformatics, 19, 635-642 (2003). alignO Optimal alignments in linear space. Myers, E. W. y Miller, W. Comput. Appl. Biosci., 4, 11-17 (1998).

EJEMPLO 3 Experimentos con chips de genes El material humano provino de piezas de tejido desechadas obtenidas de embarazos selectivamente terminados usando la técnica regular de aspiración al vacío. La colecta de tejido residual para el estudio fue aprobada por el Human Ethics Committee of the Huddinge University Hospital, Karolinska Institute (Diary Nr, 259/00) y Lund University (970401), y estuvo de acuerdo con las normas del Swedish National Board of Health and Welfare (Socialstyrelsen), incluyendo un consentimiento informado de las mujeres embarazadas que buscaban abortos. El tejido nervioso recuperado fue microdisectado dentro de dos horas de cirugía, y fragmentos de tejido adecuados fueron disociados además para el aislamiento de células.

Aislamiento de ARN Se obtuvo tejido fetal humano (8 semanas) en dos rondas, ambas de 8 semanas de gestación. Se usaron regiones de VM y DM disectadas para aislamiento de ARN total con buenos resultados y rendimientos. Se aisló ARN total con el equipo de extracción Trizol siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen) de las regiones mesencefálicas ventral y dorsal subdisectadas de tejido fetal humano, de 8 semanas de gestación. Para concentrar el ARN, y para remover trazas de ARN cromosómico, se usan columnas Rneasy combinadas con el equipo de desoxirribonucleasa libre de ribonucleasa, siguiendo las instrucciones del fabricante. A partir de 5 µg de ARN total, se preparó ADNc biotinilado, y se fragmentó como se describe en protocolos de Affymetrix (GeneChip Expression Analysis, Technical Manual 2000) y se híbrido (15 pg) con GeneChips U133B de humano de Affymetrix (conteniendo aproximadamente 22,000 genes), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se analizaron imágenes exploradas, y fueron convertidas a valores de índice de expresión usando el paquete de software de análisis de GenePublisher (Knudsen S, Workman C, Sicheritz-Ponten T, Friis C. (2003) "GenePublisher: Automated analysis of ADN microarray data", Nucleic Acids Res. 31(13): 3471-6). Mediante el uso de GeneChips U133 de Affymetrix, se analizó la expresión de NsG33 de humano (GeneChip acc. 232269_x_at on U 33 B y acc. 2 9051_x_at on U133 A; Affymetrix, Inc., Santa Clara, Calif.). Se observó la expresión de NsG33 de humano en muestras de tejido de mesencéfalo (cerebro medio) fetal de ocho semanas de humano, indicando que NsG33 de humano puede desempeñar una función en el desarrollo temprano del cerebro fetal. La expresión de un factor de crecimiento en el mesencéfalo de humano durante el desarrollo del embrión, es profética de una función terapéutica posible en el tratamiento de enfermedad de Parkinson.

EJEMPLO 4 Obtención de una secuencia codificante de longitud completa NsG33 fue amplificada por PCR de un clon de IMAGE (The l.M.A.G.E. Consortium: "An integrated molecular analysis of genomes and their expression", Lennon, Auffray, Polymeropoulos y Soares

[1996], Genomics 33: 151-152) obtenido de RZPD1 , Berlín, Alemania (clon RZPD, ID: IRALp962D105Q2), usando los siguientes iniciadores: Iniciador 5': 5'-GCGGATCCAGCGGTGGTGAGAGCCCCGAC-3' Iniciador 3': 5 -TATACTCGAGGCCCACCCTCCCTCCTACCAG- 3'. Se emprendieron tres reacciones de PCR idénticas con 50 ng/µ? del clon RZPD como molde de ADN, en un volumen de reacción de 50 µ?. Se aplicó una polimerasa de lectura de pruebas (polimerasa pfu-turbo, Stratagene) para la amplificación por PCR, con el siguiente perfil de amplificación: paso de predesnaturalización: 95°C, seguido de 35 ciclos de 3 pasos: paso de desnaturalización: 95°C, 30"; paso de unión: 57°C, 30"; paso de alargamiento: 72°C, 90". Entonces, un paso de alargamiento: 72°C, 2', seguido de enfriamiento a 4°C. Se agruparon las reacciones de PCR, y el fragmento de PCR de NsG33 de 988 pb, fue purificado en gel de agarosa, y cortado con BamHI y Xhol. El ahora fragmento de PCR de NsG33 de 976 pb restringido con BamHI/Xhol fue purificado en gel. Cinco µg de un vector de transferencia lentiviral, pHsCXW (número de acceso del GenBank: AY468486) fueron digeridos con BamHI y Xhol, y la estructura de base del vector fue purificada en gel. El fragmento de PCR de NsG33 BamHI/Xhol fue ligado en los sitios BamHI y Xhol del vector de transferencia lentiviral pHsCXW, seguido de transformación en células electrocompetentes XL1-B.

EJEMPLO 5 PCR en tiempo real en NsG33 Los tejidos investigados para la expresión de NsG33, fueron ARN total de retina, cerebro entero, putamen, sustancia negra, ganglio, hígado fetal, cerebelo, corazón, riñon, pulmón, placenta, próstata, glándula salival, músculo esquelético, bazo, testículo, timo, tráquea, útero, colon, intestino delgado, médula espinal, estómago, páncreas y cerebro fetal. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de ARN total, usando la transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies) y un iniciador HT11V usando procedimientos estándar. Para la PCR en tiempo real, se usó como molde el producto de análisis de expresión de la transcripción inversa equivalente a 20 ng de cada ARN, en reacciones de PCR en tiempo real. Se realizó PCR en tiempo real en un thermocycler Opticon-2 (MJ Research), usando el equipo LightCycler- FastStart ADN Master SYBR Green I (Roche). Se llevaron a cabo estudios por duplicado usando los iniciadores 5'- CCAGCGACTTCGTAATTCAC-3' (iniciador 5') y 5'- AGCCCATGAAGAGGAAGG-3' (iniciador 3'). Para la PCR en tiempo real, se preparó una curva estándar por dilución gradual de un producto de PCR purificado en gel, preparado usando los iniciadores anteriores. La curva estándar se usó para verificar que los valores de punto de cruce (CT) de todas las muestras estuvieran dentro de la escala exponencial de la reacción de PCR, y para calcular los niveles de expresión finales. Todas las amplificaciones por RT-PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 10 µ? que contenía MgCI2 a 3 mM, sacarosa a 12% y 1x regulador de pH de reacción incluido en el equipo LightCycler. El perfil del funcionamiento cíclico de la PCR consistió de un paso de predesnaturalización de 10 minutos a 98°C y 35 ciclos de tres pasos a 98°C por 10 segundos, a 62°C por 20 segundos y a 72°C por 20 segundos. Después del paso de extensión de cada ciclo, se añadió un paso de lectura de placa (80°C, 2 segundos) para cuantificar los productos de PCR recién formados. El carácter específico de la reacción de amplificación se determinó realizando un análisis de curva de fusión de los fragmentos de PCR, elevando lentamente la temperatura de 52°C a 95°C con adquisición continua de datos. Para propósitos de normalización, todas las moléculas de ADNc se sometieron a PCR en tiempo real usando iniciadores para ß2-microglobulina (B2M, 5'-TGTGCTCGCGCTACTCTCTC-3' y 5'-CTGAATGCTCCACTTTTTCAATTCT-3'). Se prepararon curvas estándar para p2-microglobulina similar a NsG33. Se llevó a cabo PCR en tiempo real del gen de mantenimiento usando el mismo equipo para el gen objetivo, salvo que se usaron temperaturas de unión óptimas para el gen de mantenimiento. Se determinó el patrón de expresión del gen de mantenimiento a partir de las curvas estándar respectivas, y se usaron los niveles de expresión relativa para normalizar los niveles de expresión de los genes objetivo en los tejidos que se analizaron. Después de la normalización con la ß2- microglobulina, se calcularon los niveles de expresión relativa del gen objetivo usando el tejido con la expresión más baja como referencia. Los resultados normalizados con respecto a p2-microglobulina deben interpretarse con precaución, puesto que la p2-microglobulina puede no expresarse al mismo nivel en todos los tejidos puestos a prueba. Análisis de las muestras de ARN total (mostradas en las figuras 4A y 4B): Alta expresión (valores de C(T)<22): Putamen, sustancia negra, médula espinal Expresión intermedia (22<valores de C(T)<24): Cerebro entero, cerebelo, retina, DRG Baja expresión (24<valores de C(T)<26): Corazón, riñon, pulmón, próstata, glándula salival, músculo esquelético, testículo, estómago, páncreas, cerebro fetal Expresión muy baja o nula (valores de C(T)>26: Hígado fetal, placenta, timo, tráquea, bazo, útero, colon, intestino delgado. Con base en la expresión específica del tejido, y al hecho de que se predice que NsG33 es un factor de crecimiento secretado (véase ejemplo 2), se contempla a NsG33 para su uso en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso en general (con base en la expresión específica del sistema nervioso), en particular enfermedad de Parkinson (con base en la expresión en la sustancia negra), enfermedad de Huntington (con base en la expresión en el putamen), trastornos cerebelares (con base en la expresión en el cerebelo), lesión de médula espinal y ALS (con base en la expresión en la médula espinal), neuropatías periféricas (con base en la expresión en el ganglio de la raíz dorsal) y retinopatías (con base en la expresión en la retina). La función para las varias indicaciones puede verificarse en pruebas in vitro e in vivo como se describe más adelante.

EJEMPLO 6 Prueba para efecto neuroprotector general (prueba de células PC12) Generación de la provisión de virus La secuencia codificante de NsG33 fue subclonada en pHsCXW usando sitios de restricción adecuados como se describe en el ejemplo 4. Para generar provisiones de virus, el vector de transferencia lentiviral resultante fue co-transfectado en células 293T con dos plásmidos auxiliares (pMD.G y pBR8.91 ) que proveen los genes virales necesarios, gag-pol y env, respectivamente,, in trans. En resumen, se sembraron 2x10 células 293T en cada uno de 20 matraces de cultivo T75. Al día siguiente, cada matraz T75 fue transfectado con 15 pg de ppBR8.91 , 5 pg de pMD.G y 20 pg de vector de transferencia usando Lipofectamine+ siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Se cosechó medio que contenía al virus 2 a 3 días después de la transfección, y se esterilizó por filtración a través de un filtro polisulfónico o de acetato de celulosa de 0.45 µ?t?. El virus fue transformado a pellas por ultracentrifugación doble a 50,000xg por 90 minutos a 4°C, y se resuspendió entonces en medio de DMEM. Se tituló el virus usando una prueba de transcriptasa inversa (RT) (Current Protocols in Molecular Biology, editores: Ausubel et al., Wiley). Se calculó el número de unidades de transducción (UT)/ml de la actividad de RT resultante, y se obtuvo la frecuencia de células fluorescentes por transducción de células 293T con un lentivirus de GFP equivalente. La provisión del virus se almacenó en alícuotas a -80°C hasta su uso.

Transducción de células PC 2 Para la prueba, se usaron células PC12 (número de acceso de ATCC: CRL-1721 ) adaptadas a medio DMEM. Las células PC 2 se cultivan en medio de Eagle modificado de Duibecco (DMEM) con 4.5 g/l de glucosa y glutamax (Life Technologies #32430-027) con suero de caballo donador a 7.5% (Life Technologies #16050-098) y FBS a 7.5% (Life Technologies # 10099-141) en presencia de C02 a 5% a 37°C. Se cambia el medio cada 2 a 3 días, y las células se subcultivan dos veces 1 :3-1 :6 por semana sellando el matraz y dispensando en matraces nuevos. El día anterior a la transducción, se sembraron células en placas de seis cavidades revestidas de colágena. Se añadió virus de la solución de provisión a 1 mi del medio de cultivo de células junto con o sin 5 pg/ml (concentración final) de Polybrene. El virus se incubó con las células por cuando menos 3 horas en una incubadora de C02. Se añadió retrovirus del GFP a un cultivo paralelo para calcular la eficiencia de transducción y para servir como control.

Efecto sobre la diferenciación de células PC12 Se siguió el curso de cultivos en placas de 6 cavidades, y se calificaron para el número de células que poseen neuritas, después de 2 a 5 días.

Efecto sobre la supervivencia de células PC12 Las células transducidas de placas de 6 cavidades se resembraron en placas de 96 cavidades revestidas de colágena, en medio de cultivo. Al día siguiente, el medio se cambió a DMEM libre de suero, y se midió la viabilidad de las células después de 24 a 72 horas usando la prueba de MTS siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega). Los resultados de un experimento se muestran en la figura 9. La actividad de MTS en células PC12 transducidas con un lentivirus que contenía ADNc de NsG33 de longitud completa, se incrementó significativamente en comparación con células PC12 control transducidas con un lentivirus que poseía un gen marcador (EGFP). MTS es una medida de la actividad metabólica en la población total de células. De esta manera, el incremento en la actividad de MTS en rLV-NsG33 respecto al cultivo control, puede reflejar la presencia de un número incrementado de células viables en el cultivo, y/o viabilidad incrementada de las células supervivientes. Un efecto positivo en el brote de neuritas y/o la prueba de supervivencia, es indicativo de un efecto terapéutico potencial de la proteína NsG33 en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos.

EJEMPLO 7 Protección de células granulares cerebelares de la toxicidad del lutamato Se lleva a cabo una prueba para los efectos de supervivencia, transduciendo cultivos de células granulares cerebelares que subsiguientemente son expuestas a concentraciones tóxicas de glutamato, esencialmente como se describe en Daniels y Brown, 2001 ; J. Biol. Chem. 276: 22446-22452. Se disectan neuronas granulares cerebelares (CGN) de crías de ratón de 7 a 8 días. Se disocian células de cerebelos recién disectados por disolución enzimática en presencia de tripsina y desoxirribonucleasa, y se siembran entonces en placas de 24 cavidades pre-revestidas de poli-D-lisina (Nunc) a una densidad de 1-2 x 06 células/cm2 en medio DMEM complementado con suero de ternera fetal a 10% inactivado con calor. Las células se cultivan a 37°C en una atmósfera humidificada, y se añade arabinósido de citosina (10 µ??) al medio de cultivo después de 24 horas para detener el crecimiento de las células no neuronales. Se transducen los cultivos con un lentivirus que contiene NsG33 preparado como se describe en el ejemplo 6 en DIV1 por la adición de solución de provisión del virus a medio DMEM que contiene suero de bovino fetal a 10% y 4 µg/nni de Polybrene. Se transducen cultivos control paralelos con un lentivirus de proteína fluorescente verde (GFP). Cinco horas después de la transducción, se reemplaza el medio con medio preacondicionado sobre CGNs. Al DIV5, se añade glutamato (0.1-1 mM) al cultivo, y después de otros dos días, se pone a prueba la supervivencia de las células usando la prueba de MTT. El grado de reducción de MTT a formazán se mide espectrofotométricamente a 570 nm. En resumen, se remueve el medio de cultivo, y las células se lavan en solución salina de sodio (NaCI a 140 mM, KCI a 5 mM, MgCI2 a 1 mM.6H20, NaH2P04 a 1 mM, CaCI2 a 1.5 mM, glucosa a 5.6 mM, HEPES a 20 mM, pH 7.4). Entonces, se añade a las células MTT (concentración final de 0.5 mg/ml), que se preparó como se hizo anteriormente, y se mantiene en la oscuridad en solución salina de sodio. Después de un período de incubación de 3 horas a 37°C, se añade un volumen igual de isopropanol ácido (HCI a 0.04 M en isopropanol), y se mezcla por completo a temperatura ambiente hasta que se disuelvan todos los cristales de formazán. La viabilidad de las células se expresa como un porcentaje de la densidad óptica de células control. Los cultivos paralelos se dejan sin tratar. Puede considerarse a esta prueba como una prueba general para probar la protección contra el daño excitotoxico, así como una prueba profética de factores con potencial terapéutico en el tratamiento de trastornos cerebelares.

EJEMPLO 8 Protección de células granulares cerebelares de la apoptosis inducida por privación de potasio Se lleva a cabo la prueba de efectos de supervivencia, transduciendo células granulares cerebelares privadas de potasio, esencialmente como se describe en Nomura et al., 2001 ; Dev. Neurosci. 23: 145-152. Se disectan neuronas granulares cerebelares (CGN) de crías de ratas Sprague-Dawley de 8 días. Se disocian células de cerebelos recién disectados por disolución enzimática en presencia de tripsina y desoxirribonucleasa, y se siembran entonces en placas de 24 cavidades pre-revestidas de poli-D-lisina (Nunc) a una densidad de 3.5 x 105 células/cm2 en medio basal de Eagle conteniendo KCI a 25 mM y complementado con suero de ternera fetal a 10% inactivado con calor y glutamina a 2 mM. Las células se cultivan a 37°C en una atmósfera humidificada, y se añade arabinósido de citosina (10 µ??) al medio de cultivo después de 24 horas para detener el crecimiento de las células no neuronales. Se transducen los cultivos con un lentivirus que contiene NsG33 preparado como se describe en el ejemplo 6 ["prueba en células PC12"] en DIV1 por la adición de solución de provisión del virus a medio DMEM que contiene suero de bovino fetal a 10% y 4 g/ml de Polybrene. Se transducen cultivos control paralelos con un lentivirus de GFP. Cinco horas después de la transducción, se reemplaza el medio con medio preacondicionado sobre CGNs. A DIV2, se induce apoptosis en cultivos inmaduros cambiando las células a medio libre de suero que contiene KCI a 5 mM, mientras que las células no tratadas reciben medio acondicionado que contiene KCI a 25 mM. Se mide la supervivencia en DIV3, usando la prueba de MTS. A DIV8, se induce apoptosis en cultivos diferenciados (neuronales), cambiando las células a medio libre de suero que contiene KCI a 5 mM, mientras que las células no tratadas reciben medio acondicionado que contiene KCI a 25 mM. Se mide la supervivencia después de 24 a 72 horas, usando la prueba de MTS. La prueba de MTS se lleva a cabo usando la prueba no radiactiva de proliferación de células CelITiter 96® AQueous (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Puede considerarse a esta prueba como una prueba general para efectos neuroprotectores, así como una prueba que predice factores con potencial terapéutico en el tratamiento de trastornos cerebelares.

EJEMPLO 9 Efecto sobre cultivos de DRG Preparación de medios acondicionados a partir de células ARPE- 19 transducidas Para transducir células ARPE-19 con un lentivirus que contiene ADNc que codifica para el gen de NsG33, las células se siembran a una densidad de 1x105 células/cavidad en una placa de 6 cavidades en medio DMEM/F12 complementado con suero de bovino fetal a 10%. Al día siguiente, se añade el virus de la solución de provisión al medio de cultivo de células junto con 5 µg/ml (concentración final) de Polybrene. Se incuba el virus con las células durante la noche en una incubadora de C02. Se añade lentivirus de GFP a un cultivo paralelo. Al día siguiente, se cambian los cultivos a medio libre de suero UltraCULTURE (1 ml/cavidad), y se cosechan medios acondicionados después de otros dos días de incubación.

Aislamiento y cultivo de células DRG P1 Se remueven DRGs de todos los niveles espinales de ratas Sprague-Dawley P1 (día 1 post-natal). Los tejidos se disocian enzimáticamente en 125-250 U/ml de colagenasa tipo 1 (Worthington, Freehold, N.J.) a 37°C por 30 minutos. Las muestras se trituran con pipetas Pasteur pulidas al fuego, y se filtran a través de malla estéril de 70 µ?t? para producir suspensiones de una sola célula. Las células se presiembran en placas de cultivo de tejidos no recubiertas por 2 horas, para remover células no neuronales. Las células no adherentes se siembran a 15,000 células/cavidad en placas de cultivo de tejidos de 24 cavidades que habían sido revestidas con poli-d-ornitina (Life Technologies) y laminina (Collaborative Biomedical). Los controles negativos se cultivan en medio libre de suero UltraCULTURE™ (BioWhittaker, Walkersville, MD) que contiene 2.5 ng/ml de anticuerpo policlonal anti-NGF neutralizante de oveja (Chemicon, Temecula, CA). Los controles positivos tratados con NGF carecían del anticuerpo policlonal anti-NGF neutralizante. Diferentes diluciones de medio acondicionado colectado de células ARPE-19 transducidas con NsG33 o transducidas con GFP, se añaden a los cultivos después de centrifugación y filtración a través de un filtro estéril de 0.4 µ?? Los cultivos se proveen cada segundo día, remplazando los medios.

Inmunocitoquímica Después de siete días en cultivo, se fija a las células en formaldehído a 4% en PBS por 10 minutos a temperatura ambiente. Se bloquea previamente a las células en suero de cabra a 4%, NP40 a 0.1 % por 30 minutos a temperatura ambiente, y se incuban entonces con anti-ß??? tubulina de ratón (1 :100) durante la noche a 4°C. Después de enjuague en solución de prebloqueo, los cultivos se incuban con un anticuerpo secundario anti-murino acoplado a Cy-3 por 1 hora a temperatura ambiente. Después de un enjuague final en solución de prebloqueo, se hace el conteo de células de una tira a través de la parte media de cada cavidad usando óptica de fluorescencia. Todas las células positivas para ß???-tubulina se evalúan como neuronas, y se determina la supervivencia por el número de neuronas contadas por cavidad. Todos los anticuerpos se diluyen en solución de prebloqueo.

Interpretación de resultados Los efectos protectores en esta prueba, indican potencial terapéutico en neuropatías periféricas y dolor neuropático.

EJEMPLO 10 Efecto sobre cultivos de neuronas motoras La prueba para efectos de supervivencia en cultivos de neuronas motoras, se lleva a cabo usando lentivirus que contienen NsG33, esencialmente como se describe en Cisterni et al. 200 (J. Neurochem. 74, 1820-1828). En resumen, se disectan y se disocian médulas espinales ventrales de embriones de ratas Sprague Dawley del día embrionario 14.5 (E14.5). Las neuronas motoras se purifican usando un protocolo basado en la purificación por inmunoafinidad de neuronas motoras con anticuerpos contra el dominio extracelular del receptor de neurotrofina, p75, seguida de distribución de las células usando microperlas magnéticas (Arce et al. 1999). Se siembran neuronas motoras purificadas en placas de cultivo de tejidos de 4 cavidades pre-revestidas con poliornitina/laminina a una densidad de 500 células por cavidad. El medio de cultivo es medio de cultivo Neurobasal (Life Technologies) complementado con el complemento B27 (Life Technologies), suero de caballo (2% en v/v), L-glutamina (0.5 mM) y 2-mercaptoetanol (25 µ?). Se añade al medio L-glutamato (25 µ?) durante los primeros 4 días de cultivo, y se omite subsiguientemente. Las neuronas motoras cultivadas por 16 horas, son transducidas con un lentivirus que contiene NsG33 preparado como se describió anteriormente, por la adición de solución de provisión del virus al medio de cultivo (correspondiendo a MOI = 4). Cultivos control paralelos son transducidos con el lentivirus de GFP. Ocho horas después de la transducción, se reemplaza el medio con medio fresco (DIV1 ). Se cuantifica la supervivencia de las neuronas motoras en DIV3, contando el número de grandes neuronas de fase brillante con largos procesos axonales en un área predeterminada de 1.5 cm2 en el centro de placas por duplicado.

Interpretación de resultados Los efectos protectores en esta prueba, indican potencial terapéutico en enfermedades de neuronas motoras que incluyen ALS, lesión de médula espinal, SMA (atrofia muscular espinal) y DMD (distrofia muscular de Duchenne).

EJEMPLO 11 Bioensavo para actividades neurotróficas dopaminérgícas Condiciones de cultivo Se preparan cultivos de células mesencefálicas disociadas como se describió previamente (Friedman y Mytilineou 1987 Neurosci. Lett. 79: 65-72), con modificaciones menores. En resumen, se disectan tegumentos mesencefálicos rostrales de cerebros de embriones de rata Sprague-Dawley, en los días 13 a 16 de gestación, bajo el microscopio en condiciones estériles, se colectan en solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco libre de Ca2+ y Mg2+ (Gibco, Gaithersburg, Md.), y se disocian mecánicamente por trituración moderada. Las células se siembran en 100 µ? por cavidad en placas de cultivo de tejidos de 16 mm de diámetro (Falcon, Lincoln Park, NJ., placa de 24 cavidades) conteniendo 400 µ? de medio, para dar una densidad de 2.5-3.5x105 células por cavidad. Las cavidades de cultivo habían sido expuestas previamente a 0.1 mg/ml de solución de poli L-ornitina en borato de sodio a 10 mM, pH 8.4, por 3 horas a 37°C, y lavadas tres veces en agua milli-Q y una vez en solución salina balanceada de Earle (Gibco). El medio nutritivo (10/10) consiste de medio esencial mínimo (MEM, Gibco) complementado con glucosa (33 mM), bicarbonato de sodio (24.5 mM), glutamina (2 mM), HEPES (15 mM), penicilina (5 U/mi), estreptomicina (5 µg/ml), suero de ternera fetal a 10% inactivado con calor (Gibco) y suero de caballo a 10% ¡nactivado con calor (Gibco). Los cultivos se mantienen a 37°C en una atmósfera saturada de agua que contiene C02 a 6.5%. Después de 3 horas, cuando la mayoría de las células se han adherido al fondo de la cavidad, el medio se reemplaza con 500 µ? de medio fresco. En este momento, una dilución gradual de la muestra que se va a poner a prueba para actividad neurotrófica dopaminérgica (medio acondicionado) se añade a cada cavidad por duplicado, y las placas se incuban en la incubadora a 37°C. Después de una semana, los cultivos se tratan por 24 horas con fluorodesoxiuridina (13 µg/ml) y uridina (33 µg/ml) para prevenir la proliferación excesiva de células gliales, y se provee subsiguientemente el medio anterior sin suero de ternera fetal. El medio nutritivo se cambia semanalmente. En forma alternativa, se usa medio libre de suero definido químicamente en el cual el suero se reemplaza con una mezcla de proteínas, hormonas y sales. El medio definido (DM) consiste de una mezcla de medio nutritivo F12 y MEM (de Gibco, 1 :1 ; en vol/vol) con glucosa (33 mM), glutamina (2 mM), NaHCO3 (24.5 mM) y HEPES (15 mM), complementado con transferrina (100 pg/ml), insulina (25 pg/ml), putrescina (60 µ?), progesterona (20 nM), selenuro de sodio (30 nM), penicilina G (5 U/ml) y estreptomicina (5 pg/ml). La osmolaridad del DM se ajusta a 325 por la adición de agua milli-Q (110-125 mi de H20/l). El estado funcional de las neuronas dopaminérgicas puede ponerse a prueba en estos cultivos, midiendo la captación de dopamina a través de transportadores "depuradores" específicos en las neuronas dopaminérgicas, y contando el número de neuronas positivas para la enzima tirosina hidroxilasa de la síntesis de dopamina, usando inmunohistoquímica como se describe en Karlsson et al, 2002, Brain Res. 2002 Nov 15; 955(1-2): 268-80.

Preparación de la muestra Antes de que sean puestas a prueba para actividad neurotrófica dopaminérgica en los cultivos de células mesencefálicas, todas las muestras de medio acondicionado se desalan de la manera siguiente. Se añaden 100 µ? del medio 10/ 0 (como vehículo) a un Centricon-10 (Amicon), y se deja que se asienten por 10 minutos. Se añaden alícuotas de la muestra que se va a poner a prueba al Centricon, seguido de 1 mi de medio de Eagle modificado de alto contenido de glucosa de Dulbecco, sin bicarbonato, pero conteniendo HEPES a 10 mM, pH 7.2 (solución A), y se centrifugan a 5,000Xg por 70 minutos. El material retenido (aproximadamente 0.1 mi) es llevado de nuevo a 1.1 mi con solución A fresca, y reconcentrado dos veces. La muestra se filtra a través de una unidad Durapore estéril Ultrafree-MC de 0.11 µ? ( ülipore, Bedford Mass.), antes de que sea añadida a la cavidad de cultivo.

Captación de 3H-dopamina La captación de dopamina tritiada (3H-DA) se realiza en cultivos en el día 6 o el día 7 como se describió previamente (Friedman y Mytilineou (1987) Neurosci. Lett. 79:65-72) con modificaciones menores, y todas las soluciones se mantienen a 37°C. En resumen, el medio de cultivo es removido, enjuagado dos veces con 0.25 mi del regulador de pH de captación que consiste de regulador de pH de fosfato de Krebs-Ringer, pH 7.4, conteniendo glucosa a 5.6 mM, EDTA a 1.3 mM, ácido ascórbico a 0.1 mM y pargilina a 0.5 mM, un inhibidor de monoamina oxidasa. Los cultivos se incuban con 0.25 mi de 3H-DA a 50 nM (New England Nuclear, Boston, Mass., actividad específica de 36-37 Ci/mmol) por 15 minutos a 37°C. Se detiene la captación de 3H-DA removiendo la mezcla de incubación, y las células se lavan entonces dos veces con 0.5 mi del regulador de pH de captación. Para liberar la 3H-DA de las células, los cultivos se incuban con 0.5 mi de etanol a 95% por 30 minutos a 37°C, y se añaden entonces a 10 mi de EcoLite (ICN, Irvine, Calif.), y se hace el conteo en un contador de escintilación. Se obtienen los valores blanco añadiendo al regulador de pH de captación GBR- 2909 a 0.5 mM (RBI), un inhibidor específico de la bomba de captación de alta afinidad de las neuronas de dopamina (Heikkila et al. 1984 Euro J. Pharmacol. 103: 241-48). Un incremento en el número de neuronas positivas para TH y/o un incremento en la captación de 3H-dopamina, en comparación con un tratamiento control, es una indicación de una función posible de NsG33 en el tratamiento de enfermedad de Parkinson.

EJEMPLO 12 Evaluación de la neuroprotección de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra in vivo, en el modelo de lesión con 6-OHDA intraestriatal Se producen vectores pseudotipificados de VSV-G (rLV) como se describió previamente (Zufferey et al., 1997, J. Viral, 73: 2886-2892; Rosenblad et al. In vivo protection of nigral dopamine neurons by lentiviral gene transfer of the novel GDNF-family member neublastin/artemin. Mol Cell Neurosci. Feb de 2000; 15(2): 199-214). En resumen, los plásmidos de transferencia pHR'CMV-W que poseen el ADNc para proteína fluorescente verde (GFP) o NsG33, son co-transfectados con los plásmidos auxiliares pMD.G y pCMVDR8.91 en células 293T. Se colectan sobrenadantes que contengan viriones en los días 2 y 3 después de la transfección, y se concentran a 1 16,000 g por ultracentrifugación. El título de la provisión del vector rLV-GFP es de 1.1x108 U.T./ml, según se determina por dilución gradual del sobrenadante concentrado en células 293T. El título de las partículas virales se determina para provisiones de los virus rLV-NsG33 y rLV-GFP, usando una técnica de slot blot de ARN como se describió previamente (von Schwedler et al. Vif is crucial for human immunodeficiency virus type 1 proviral ADN synthesís in infected cells. Viral, ago de 1993; 67(8): 4945-55), y de la relación entre el título de U.T. y de las partículas virales que se obtiene de rLV-GFP, se calcula que el título del vector rLV-NsG33 es de 1.2x108 U.T./ml. Todos los trabajos que implican animales experimentales se llevan a cabo de acuerdo a las normas establecidas por el Ethical Committee for Use of Laboratory Animáis en la Lund University. Se aloja a los animales en un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 horas con acceso a alimento para ratas y agua. Se usan ratas hembras Sprague Dawley (de aproximadamente 220 g alrededor del tiempo de cirugía). Para cirugía estereotáxica, se anestesia a los animales usando halotano, y se inyecta un total de dos microlitros de rLV-GFP (n = 8) o rLV-NsG33 de una provisión viral 1:2 (1.0-1.2 x 105 U.T.) en dos tractos en el cuerpo estriado derecho a las siguientes coordenadas: (1 ) AP = +1.0 mm, ML = -2.6 mm, DV = -5.0 y -4.5 mm, Tb = 0.0 y (2) AP = 0.0 mm, ML = -3.7 mm, DV = -5.0 y -4.5 mm, Tb = 0.0. Después de dos semanas, se anestesia de nuevo a los animales, y se los pone en una estructura estereotáxica. Se aplica una inyección de 6-hidroxidopamina (20 µg [calculada como la base libre] por 3 µ? de vehículo [solución salina con ácido ascórbico a 0.2%] en el cuerpo estriado derecho, a las siguientes coordenadas: AP = +0.5 mm, ML = -3.4 mm, DV = -5.0 y -4.5 mm, Tb = 0.0. A cuatro semanas después de la lesión, se anestesia profundamente a los animales con pentobarbital (70 mg/kg, Apoteksbolaget, Suecia), y se perfunde transcardiacamente a los mismos con 50 mi de solución salina a temperatura ambiente, seguido de 200 mi de paraformaldehído a 4% regulado en su pH con fosfato enfriado en hielo (pH 7.2-7.4). Los cerebros se fijan posteriormente por 3 a 6 horas en el mismo fijador, se transfieren a sacarosa a 30% por 24 horas, y se cortan en 6 series de secciones de 40 µ?? de espesor en un micrótomo de congelación. Se realiza inmunohistoquímica para detección de tirosina hidroxilasa inmunorreactiva en la sustancia negra, como se describió previamente (Rosenblad et al. In vivo protection of nigral dopamine neurons by lentiviral gene transfer of the novel GDNF-family member neublastin/artemin. Mol Cell Neurosci. Feb de 2000; 15(2): 199-214). El número de neuronas de la sustancia negra con TH-IR y VMAT-IR se evalúa contando bajo el microscopio todas las neuronas inmunorreactivas laterales al núcleo terminal medial del tracto óptico accesorio en tres secciones consecutivas a través del SN, como se describió previamente (Sauer y Oertel, 1994, Neuroscience 59: 401-15). Un incremento en el número de TH-IR en comparación con el control de GFP, es una fuerte indicación de una función en el tratamiento de enfermedad de Parkinson. Un incremento en el número de VMAT-IR refuerza además la conclusión.

EJEMPLO 13 Análisis por PCR en tiempo real de NsG33 en tejidos de SNC de murino en desarrollo Materiales y métodos Iniciadores: Se usaron los siguientes iniciadores para PCR en tiempo real: mNsG33: mNsG33 intronspan 284pb 5': 5 -GTCTTCGCTGAACGTATGAC- 3' mNsG33 intronspan 623 pb 3': 5'-CTGATTCTTGCAGCTCTGTG- 3' GAPDH: mGAPDH-s904: 5'-AACAGCAACTCCCACTCTTC-3' mGAPDH-as1067: 5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3'. Se aisló tejido de diferentes regiones del cerebro de ratones adultos y en desarrollo, y se preparó ARN por extracción con Trizol. Se realizó tratamiento subsiguiente con desoxirnbonucleasa en la columna usando columnas de centrifugación RNeasy para remover trazas de ADNg, y para limpiar además el ARN. Se usaron como molde alícuotas de 2.5 µg de ARN para la síntesis de ADNc con una transcriptasa inversa deficiente en ribonucleasa H derivada de MoMLV (Superscript) e iniciador de poli-dT. Se sintetizó al mismo tiempo el ADNc de todas las muestras usando la misma mezcla maestra para evitar variaciones. El volumen final de la reacción de ADNc fue 120 µ?, que se almacenó en alícuotas a -80°C para evitar congelación y descongelación repetidas. Para analizar la expresión de NsG33 en el desarrollo en médula espinal (SC) en desarrollo, se prepararon moléculas de ADNc derivadas de tejidos de embriones de 10.5, 1.5 y 13.5 días (E10.5, E11.5 y E13.5, respectivamente), además de tejidos de ratones adultos. Se analizó la regulación de la expresión de NsG33 en el desarrollo en el cerebelo (Cb) y corteza (CTX), usando moléculas de ADNc derivadas de tejido de adulto y P1. Para el análisis de expresión en PRC en tiempo real, se usaron como molde aproximadamente 20 ng de cada ADNc. La PCR en tiempo real se realizó en un thermocycler Opticon-2 (MJ Research), usando el equipo LightCycler-FastStart ADN Master SYBR Green I (Roche). Se llevaron a cabo estudios por duplicado usando los iniciadores descritos anteriormente. Para la PCR en tiempo real, se preparó una curva estándar por dilución gradual de un producto de PCR purificado en gel, preparado usando los iniciadores anteriores. La curva estándar se usó para verificar que los valores de punto de cruce (Cj) de todas las muestras estuvieran dentro de la escala exponencial de la reacción de PCR, y para calcular los niveles de expresión finales. Todas las amplificaciones por RT-PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 10 µ? que contenía MgCI2 a 3 mM, sacarosa a 12% y 1x regulador de pH de reacción incluido en el equipo LightCycler. El perfil del funcionamiento cíclico de la PCR consistió de un paso de pre-desnaturalización de 10 minutos a 98°C y 35 ciclos de tres pasos a 98°C por 10 segundos, a 62°C (mGAPDH) o 60°C (mNsG33) por 20 segundos y a 72°C por 20 segundos. Después del paso de extensión de cada ciclo, se añadió un paso de lectura de placa (80°C, 2 segundos) para cuantificar los productos de PCR recién formados. El carácter específico de la reacción de amplificación se determinó realizando un análisis de curva de fusión de los fragmentos de PCR, elevando lentamente la temperatura de 52°C a 95°C con adquisición continua de datos. Para propósitos de normalización, todas las moléculas de ADNc se sometieron a PCR en tiempo real usando iniciadores para el gen de mantenimiento GAPDH. El análisis de GAPDH por PCR en tiempo real, se llevó a cabo de igual manera como para los genes objetivo. El patrón de expresión de mantenimiento se determinó a partir de las curvas estándar respetivas, y los niveles de expresión relativa se usaron para normalizar los niveles de expresión de los genes objetivo en los tejidos que se analizaron. Después de la normalización con GAPDH, se calcularon los niveles de expresión relativa de los genes objetivo usando como referencia el tejido con la expresión más baja.

Resultados La expresión relativa de GAPDH varió no más que entre 1.0 y 1.3 entre las diferentes edades y tejidos que muestran que GAPDH podría usarse para normalización. Los resultados de PCR en tiempo real para NsG33 de ratón, se muestran en las figuras 10A y 10B. Los valores de d variaron de 17 a 22. De la figura 10A, es evidente que la expresión de NsG33 es regulada durante el desarrollo de la médula espinal, alcanzando un máximo alrededor de E11.5. De la figura 10B, es evidente que NsG33 es regulado durante el desarrollo post-natal en cerebelo, pero no en corteza. NsG33 es una molécula secretada que está altamente conservada a través de las especies, con características de un factor de crecimiento u hormona con un patrón de expresión que en combinación con sus otros rasgos, predice fuertemente un uso terapéutico para el tratamiento de trastornos neurológicos. El patrón de expresión temporal en médula espinal indica una función en proliferación, diferenciación y/o supervivencia de los progenitores neurales en esta región del SNC. Esto es de relevancia terapéutica consistente para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y lesiones en la médula espinal, que incluyen lesión de médula espinal, ALS y atrofia muscular espinal. Además, este perfil de expresión indica un potencial como reactivo in vitro para expansión y/o diferenciación de progenitores neurales derivados de la médula espinal. La sobrerregulación de la expresión de NsG33 en el cerebelo del adulto, indica una función para este factor en el mantenimiento y/o supervivencia de uno o más tipos de células cerebelares. Esto es consistente con la relevancia terapéutica para trastornos cerebelares que incluyen, pero no están limitados a, ataxia sensitiva, esclerosis múltiple, trastornos espinocerebelares neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelares (tales como atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de Shy-Drager (atrofia de sistemas múltiples)), y alcoholismo.

EJEMPLO 14 Efecto de hNsG33 sobre la diferenciación de células progenitoras neurales humanas Generación de medios acondicionados Se generaron células que secretan hNsG33, transduciendo células ARPE-19 con una construcción lentiviral que contiene ADNc de hNsG33, LV-sC.NsG33.W. En resumen, se sembraron células en placas de 6 cavidades a 50 a 70% de confluencia (1x105 células/cavidad) en medio DMEM/F12 (1 :1 ) complementado con FCS a 10%. Después de una incubación la noche anterior, se añadió a las células Polybrene (5 µg/ml) y virus. Al día siguiente, las células se pasaron a matraces T25. Se congelaron alícuotas de células transducidas después de un pasaje adicional. Para colectar medio acondicionado de los cultivos de células ARPE-19 transducidas y precursoras (control), se sembraron células en matraces T25. Después de 4 días de incubación, se cambiaron los cultivos a medio HSC libre de suero. Después de otras 24 horas, los medios acondicionados de células ARPE-19 control y NsG33 se colectaron, y se procesaron por centrifugación a 3000x g por 5 minutos antes de su adición a los cultivos de hNS1.

Prueba en células hNS1 hNS1 (antiguamente llamada HNSC.100), es una línea de células clónales embrionarias multipotentes derivadas del prosencéfalo de células madre neurales, que ha sido descrita previamente (Villa ef al., Exp Neurol, 2000, 161(1 ): 67-84). Villa et al 2004, Exp Cell Res. Abr 1 ; 294(2): 559-70). Se obtuvieron células de Alberto Martínez Serrano, Department of Molecular Biology, Center of Molecular Biology Severo Ochoa, Autonomous University of Madrid-CSIC, Campus Cantoblanco, Madrid, 28049, España. Se expandieron cultivos de células nNS1 en matraces TC revestidos de poli-L- lisina a C02 a 5% y 37°C, en medio HSC libre de suero complementado con 20 ng/ml de EGF y bFGF. El medio HSC consistía de medio DMEM/F12 (1 :1 ) complementado con N2 y BSA a 1 %. Para experimentos de diferenciación, se sembraron células hNS1 sobre cubreobjetos pre-revestidos con 50 µ9/?t?? de poli-lisina en medio HSC libre de mitógeno que contenía FBS a 0.5% a una densidad de 105 células/cm2. Un día después de la siembra, se cambió el medio de diferenciación a medio acondicionado a 100% colectado de células ARPE-19 precursoras (Me C) o células ARPE-19 transducidas con hNsG33 lentiviral (Me 33). Un cultivo control recibió medio HSC no acondicionado. Se reemplazaron dos terceras partes del medio al día siguiente, y entonces cada segundo o tercer día. Cuatro días después de la siembra, los cultivos fueron fijados por 10 minutos en paraformaldehído a 4%, y teñidos por ¡nmunohistoquímica.

Inmunohistoquímica Después de bloqueo en suero normal de caballo a 10%, se incubaron cultivos con anticuerpos primarios para GFAP (anticuerpo policlonal anti-vaca de conejo, 1 :1000, DAKO) y ß-tubulina (anticuerpo monoclonal, clon SCL: 3D10, 1 :1000, Sigma). Después de ser enjuagados, los cultivos se incubaron, respectivamente, con anticuerpo secundario anti-ratón de caballo (Vector Laboratories, 1 :200), seguido de detección usando Strep-Cy3 (Jackson InmunoResearch, 1/200), y anticuerpo secundario anti-conejo de cabra marcado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, 1 :200) (ambos biotinilados). Los núcleos de las células fueron contrateñidos con Hoechst 33258 a 0.2 pg/ml (Villa et al., 2004). Para el análisis, se hizo el conteo del número total de células (núcleos) además de las células positivas para GFAP y ß-tubulina, por microscopía confocal usando un objetivo de 63x.

Resultados Como se muestra en la figura 1 1 A, la adición de medio acondicionado y células ARPE-19 transducidas con una construcción lentiviral que contenía ADNc de hNsG33 (Cm 33), incrementó el porcentaje de neuronas positivas para ß-lll-tubulina 73% respecto a cultivos control (hNS1 ), mientras que el medio acondicionado de células ARPE-19 control (Cm C) no tuvo efecto alguno. El incremento observado con medio Cm 33 respecto a medio de hNS1 y medio Cm C, fue estadísticamente significativo en una prueba t (P<0.05). Los medios acondicionados de células ARPE-19 transducidas con NsG33, parecieron también incrementar significativamente el número de células gliales positivas para GFAP en comparación con el medio de hNS1 (17 contra 11%, respectivamente). Sin embargo, se observó un incremento similar con medio acondicionado control (Cm C) (16 contra 11 %, respectivamente), aunque este no fue estadísticamente significativo. La adición de medio acondicionado de células ARPE-19 control (Cm C) y células ARPE-19 transducidas con una construcción lentiviral que contenía ADNc de hNsG33, no alteró significativamente el número total de células como se muestra en la figura 11B. El número neuronal incrementado puede resultar de diferenciación incrementada de células progenitoras neuronales presentes en los cultivos, y/o un efecto de supervivencia sobre las neuronas diferenciadas. Estos datos son consistentes con un potencial neuroprotector y regenerativo de NsG33.

EJEMPLO 15 Prueba del efecto de NsG33 sobre cultivos estriatales Preparación de medios acondicionados para la prueba Se prepararon medios acondicionados de células ARPE-19 y HEK293T transfectadas transitoriamente con una construcción de expresión que contenía ADNc de hNsG33 (pHsC.NsG33.W), además de células ARPE- 19 y HEK293T pseudotransfectadas. Se sembraron células ARPE-19 en placas de 6 cavidades (1x105 células/cavidad) en medio DME :F12 (1 :1) complementado con FCS a 10%. Después de incubación durante la noche, las células fueron transfectadas con Fugene usando 3 µg de ADN/cavidad de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Roche). Se sembraron células HEK293T en placas de 6 cavidades (3x105 células/cavidad) en medio DMEM complementado con FCS a 10%. Después de incubación durante la noche, las células fueron transfectadas con Lipofectamine+ usando 2 µg de ADN/cavidad de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen). El día después de la transfección, se cambió el medio a medio DMEM:F 2 libre de suero. Después de 24 horas de acondicionamiento, se colectaron los medios de las células transfectadas, y se procesaron por centrifugación a 300Ox g por 5 minutos. Los medios acondicionados depurados fueron diluidos con DMEM:F12 (6:16) antes de su adición a los cultivos estriatales. La expresión del ARN mensajero de NsG33 se analizó por RT-PCR cuantitativa usando iniciadores específicos para el ADNc de hNsG33.

RT-PCR cuantitativa Se preparó ARN total de los cultivos transfectados por extracción con Trizol, seguido de tratamiento con desoxirribonucleasa en la columna usando columnas de centrifugación RNeasy para remover las trazas de ADNg y para limpiar además el ARN. Se sintetizó ADNc usando transcriptasa inversa, y cada ADNc que correspondía a aproximadamente 20 ng de ARN total se usó como molde para el análisis de expresión por PCR en tiempo real con iniciadores de hNsG33 como se describe en el ejemplo 5. Para propósitos de normalización, todas las moléculas de ADNc se sometieron a PCR en tiempo real usando los iniciadores 4842 y 4843 para el gen de mantenimiento GAPDH [4842: 5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3* y 4843: 5'- GATCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3']. Después de normalización con GAPDH, se calcularon los niveles de expresión relativa de los genes objetivo usando muestras de ADNc con la expresión de hNsG33 más baja como referencia.

Generación y prueba de cultivos estriatales Se prepararon cultivos de células del cuerpo estriado embrionario de rata, esencialmente como se describió previamente (Nakao et al., 1996 Exp. Neurol. 138, 144-157). En resumen, las eminencias ganglionares lateral y medial fueron disectadas selectivamente de embriones de rata de E14.5 (Sprague-Dawley, B&K Universal, Suecia). Se incubaron piezas de tejido con tripsina/desoxirribonucleasa a 37°C, se enjuagaron y se disociaron mecánicamente. Las células disociadas se sembraron en portaobjetos con cámara de cuatro cavidades (100,000 células/cm2) pre- revestidos con 50 pg/ml de poli-l-lisina y 10 pg/µ? de laminina en medio D EM complementado con HEPES a 15 mM, piruvato de sodio a 1 mM y FCS a 10%. Después de 2 días in vitro, se cambió el medio a DMEM:F12 libre de suero (1 :1 ) complementado con HEPES a 1.5 mM, piruvato de sodio a 1 mM y B27 (1 :50), no acondicionado o acondicionado por células HEK293T o ARPE-19 pseudotransfectadas o transfectadas con NsG33 generadas como se describió anteriormente. Después de 4 días de incubación en medio libre de suero, los cultivos se procesaron para inmunohistoquímica.

Inmunohistoquímica En resumen, se fijaron cultivos de células por 20 minutos en paraformaldehído a 4%. Después de preincubación en suero de bloqueo a 5%, los cultivos se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con anticuerpo anti- -lll-tubulina (Sigma, 1 :333). Después de ser enjuagados, los cultivos se incubaron con anticuerpo secundario anti-ratón de asno conjugado con FITC (1 :200, Jackson Lab) por dos horas, a temperatura ambiente. Los núcleos de las células fueron contrateñidos con DAPI. Para el análisis, se hizo el conteo del número total de células (núcleos) y el número de células positivas para ß-lll-tubulina en 16 campos aleatorios por condición (número total promedio de células = 260), usando el aumento de 40x.

Resultados La expresión del ARN mensajero de hNsG33 en cultivos transfectados transitoriamente, se confirmó usando transcripción inversa-PCR cuantitativa. En cultivos de células HEK293T transfectadas transitoriamente con pHsC.NsG33.W, se determinaron por RT-PCR cuantitativa los niveles normalizados del ARN mensajero de hNsG33 40-6000 veces mayores que en cultivos no transfectados. También en cultivos de células ARPE- 9 transfectadas, se detectó un nivel mayor de ARN mensajero de hNsG33 (30 a 35 veces el nivel control en cultivos pseudotransfectados). Como se muestra en la figura 12, la adición de medios acondicionados de células ARPE-19 transfectadas con una construcción de expresión que contenía ADNc de hNsG33, incrementó el porcentaje de neuronas positivas para ß-lll-tubulina con 49% en los cultivos estriatales, respecto a cultivos que recibieron medio acondicionado de células ARPE-19 pseudotransfectadas (48% contra 32%). El incremento fue estadísticamente significativo en una prueba t (P<0.05). Asimismo, se observó un incremento estadísticamente significativo de 34% en el porcentaje de neuronas en cultivos que recibieron medio acondicionado de células HEK293T transfectadas con la construcción de hNsG33 respecto a cultivos HEK293T pseudotransfectados (50% contra 37%). Ningún efecto de la adición de medios acondicionados de alguno de los cultivos pseudotransfectados, se observó respecto a cultivos control que recibieron medio no acondicionado (UCM). El incremento en el porcentaje de células neuronales no se debió a un incremento en el número total de células determinado del conteo de núcleos teñidos con DAPI, sino un número incrementado de neuronas en los cultivos que recibieron medios que contenían hNsG33. El número incrementado de células neuronales puede resultar de diferenciación incrementada de células progenítoras neuronales presentes en los cultivos, y/o un efecto de supervivencia sobre las neuronas estriatales diferenciadas. Estos datos son consistentes con el efecto neuroprotector y regenerativo general de NsG33, y específicamente, un potencial terapéutico de NsG33 en enfermedad de Huntington.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1. - Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21 , 22, 23 y 24; b) una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21 , 22, 23 y 24, en donde la variante tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No.; y c) un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b). 2. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es una variante alélica de ocurrencia natural de la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21 , 22, 23 y 24. 3. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la variante alélica comprende una secuencia de aminoácidos que es la traducción de una secuencia de ácido nucleico que difiere por un solo nucleótido de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18. 4. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es un polipéptido variante descrito en la presente, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado para proveer una sustitución conservativa. 5. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido de señal ha sido reemplazado por un péptido de señal heterólogo. 6. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 5, 10 y 15, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 5, 10 y 15. 7. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 4, 9 y 14, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 4, 9 y 14. 8. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 8 y 13, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 8 y 13. 9. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 19, 20, 21 , 22, 23 y 24, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 19, 20, 21 , 22, 23 y 24. 10. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 3, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 3. 11. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 4, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 4. 12. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 5, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 5. 13. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 19, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 19. 14. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 22, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene ia secuencia de SEQ iD No. 22. 15. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el fragmento se selecciona del grupo que consiste de: i) AA30-AA288 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA25-AA293 de SEQ ID No. 3; ii) AA28-AA286 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA23-AA291 de SEQ ID No. 13; iii) AA31-AA289 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA26-AA294 de SEQ ID No. 8; y iv) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 20 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. 16. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es seleccionado del grupo que consiste de: i) AA 71-AA288 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA165-AA288 de SEQ ID No. 3; ii) AA 69-AA286 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA 64-AA29i de SEQ ID No. 13; iii) AAi72-AA289 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA167-AA294 de SEQ ID No. 8; y iv) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. 17. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el fragmento se selecciona del grupo que consiste de: i) AA30-AAn8 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA25-AA123 de SEQ ID No. 3; ii) AA28-AA116 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA23-AA 21 de SEQ ID No. 13; iii) AA31-AAn9 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA26-AA124 de SEQ ID No. 8; y iv) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. 18. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado además porque los aminoácidos cambiados se seleccionan de los designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente conservados en la figura 3A. 19. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque es capaz de formar por lo menos un puente de cistina intramolecular. 20. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque comprende un dímero de NsG33 enlazado a través de un puente de cistina intermolecular. 21. - El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un marcador de afinidad, tal como un marcador de polihistidina, un marcador de GST, un marcador de HA, un marcador Flag, un marcador C-myc, un marcador de HSV, un marcador V5, un marcador de proteína de unión a maltosa y un marcador de dominio de unión a celulosa. 22.- Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido o su secuencia complementaria, dicho polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 0, 13, 14, 15, 19, 20, 21 , 22, 23 y 24; b) una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21 , 22, 23 y 24, en donde la variante tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No.; y c) un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b). 23. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de una variante de ácido nucleico alélica de ocurrencia natural. 24. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque codifica para un polipéptido variante, en donde el polipéptido variante tiene la secuencia polipeptídica de una variante de polipéptido de ocurrencia natural. 25. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque la molécula de ácido nucleico difiere por un solo nucleótido de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18. 26. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 5, 10 y 15, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 5, 10 y 15. 27. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 4, 9 y 14, más preferiblemente por io menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 4, 9 y 14. 28. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 8 y 13, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 3, 8 y 13. 29. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 19, 20, 21 , 22, 23 y 24, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 19, 20, 21 , 22, 23 y 24. 30. ·· La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 3, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 3. 31. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 4. 32. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 5, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 5. 33. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 19, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 19. 34. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el polipéptido codificado tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 22, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 22. 35. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18; b) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18; c) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18; c) el complemento de un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 1 , 2, 6, 7, 11 , 12, 16, 17 y 18 bajo condiciones de alta severidad; y d) la secuencia de ácido nucleico del complemento de cualquiera de los incisos anteriores. 36.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 2, 7, 12, 16, 17 y 18, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 2, 7, 12, 16, 17 ó 18. 37. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 16, 17 y 18, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 16, 17 ó 18. 38. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 2 y 16, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 2 y 16. 39. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque tiene por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste de los nucleótidos 187-996 de SEQ ID No. 2, nucleótidos 74-883 de SEQ ID No. 7 y nucleótidos 64-873 de SEQ ID No. 12. 40. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 1 , más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 1. 41. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 2, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 2. 42. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 6, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 6. 43. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 7, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 7. 44. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 11 , más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 11. 45. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 12, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 12. 46. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 16, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 16. 47. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 17, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 17. 48. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 18, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 18. 49. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque es optimizada en codones para expresión en E. coli, hámster chino, cría de hámster, levadura, insecto y/u hongo. 50. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque la molécula de ácido nucleico es una variante entremezclada entre SEQ ID No. 2 y 7 y/o 12. 51. - Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 50 anteriores. 52. - El vector de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque comprende además un promotor enlazado operablemente a la molécula de ácido nucleico. 53. - El vector de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque el promotor se selecciona del grupo que consiste de: CMV, UbiC de humano, Jet, RSV, promotor regulable por Tet, Mo-MLV-LTR, Mx1 y EF-1 alfa. 54. - El vector de conformidad con la reivindicación 51 ó 52, caracterizado además porque es seleccionado del grupo que consiste de vectores derivados de la familia Retroviridae, que incluye lentivirus, VIH, SIV, FIV, EAIV y CIV. 55. - El vector de conformidad con la reivindicación 51 ó 52, caracterizado además porque es seleccionado del grupo que consiste de alfavirus, adenovirus, virus adenoasociados, baculovirus, HSV, coronavirus, virus del papiloma bovino y Mo-MLV, de preferencia virus adenoasociados. 56. - Una célula hospedera aislada transformada o transducida con el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55. 57. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque es seleccionada del grupo que consiste de E. coli, levadura, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus y células Sf9 de insecto. 58. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque es seleccionada del grupo que consiste de células de mamífero, tales como células de humano, felino, porcino, simio, canino, murino, rata, ratón y conejo. 59. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada además porque es seleccionada del grupo que consiste de células epiteliales pigmentadas retinianas inmortalizadas, tales como células ARPE-19, fibroblastos humanos inmortalizados y astrocitos humanos inmortalizados. 60. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada además porque es unida a una matriz. 61. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada además porque es seleccionada del grupo que consiste de células madre, incluyendo células madre o precursoras neurales humanas, células madre o precursoras gliales humanas y células madre fetales. 62. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada además porque es seleccionada del grupo que consiste de células CHO, CHO-K1 , HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b y BHK. 63. - Una línea de células de empacamiento capaz de producir una partícula viral infecciosa, dicha partícula viral comprendiendo un genoma derivado de Retroviridae que comprende una LTR retroviral 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empacamiento, un promotor enlazado operablemente a una secuencia de polinucleótidos que codifica para el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , un origen de síntesis de segunda cadena de ADN y una LTR retroviral 3'. 64. - La línea de células de empacamiento de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada además porque el genoma se deriva lentiviralmente y las LTRs son lentivirales. 65. - Un dispositivo de células biocompatible implantable, el dispositivo comprendiendo: i) una membrana semipermeable que permite la difusión de una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , y/o un vector viral; y ¡i) una composición de células de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56 a 62, o una línea de células de empacamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 63 a 64. 66. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la membrana semipermeable es inmunoaisladora. 67. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque la membrana semipermeable es microporosa. 68. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque el dispositivo comprende además una matriz dispuesta dentro de la membrana semipermeable. 69. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque el dispositivo comprende además un ancla de atadura. 70. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque dicho dispositivo comprende un núcleo que comprende células de empacamiento vivas que secretan un vector viral para la infección de una célula objetivo, en donde el vector viral es un retrovirus, el vector comprendiendo un gen heterologo que codifica para un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , enlazado operablemente a un promotor que regula la expresión de dicho polipéptido en la célula objetivo; y una cubierta externa que rodea a dicho núcleo, dicha cubierta comprendiendo un material biocompatible permeable, dicho material teniendo una porosidad seleccionada para permitir a través el paso de vectores retrovirales de aproximadamente 100 nm de diámetro, permitiendo la liberación de dicho vector viral de dicha cápsula. 71. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque el núcleo comprende adicionalmente una matriz, las células de empacamiento siendo inmovilizadas por la matriz. 72. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque la cubierta comprende un hidrogel o material termoplástico. 73. - Una composición farmacéutica, que comprende: i) el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 ; o ii) la secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 50; o ¡ii) el vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55; o iv) una composición de células hospederas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56 a 62; o v) una línea de células de empacamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 63 a 64; o vi) un dispositivo de células biocompatible implantabie de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 72; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 74. - El uso de: i) ei polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 ; o ii) la secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 50; o ¡ii) el vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55; o iv) una composición de células hospederas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56 a 62; v) un dispositivo de células biocompatible implantable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 72; o vi) una línea de células de empacamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 63 a 64; en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos del sistema inmunológico y nervioso en un paciente. 75. - El uso como se reclama en la reivindicación 74, en donde el trastorno inmunológico se selecciona del grupo que consiste de: enfermedades infecciosas, deficiencias inmunes, cáncer, trastornos autoinmunes que incluyen esclerosis múltiple, reacciones y condiciones alérgicas, y enfermedad de injerto contra hospedero. 76. - El uso como se reclama en la reivindicación 74, en donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño asociado con el sistema nervioso. 77. - El uso como se reclama en la reivindicación 76, en donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño que implica lesión al cerebro, tallo cerebral, la médula espinal y/o nervios periféricos e incluye, pero no está limitado a, condiciones tales como apoplejía, lesión cerebral traumática, lesión de médula espinal, lesión axonal difusa, epilepsia, neuropatía, neuropatía periférica y dolor asociado y otros síntomas. 78. - El uso como se reclama en la reivindicación 76, en donde el trastorno del sistema nervioso implica degeneración de neuronas y sus procesos en el cerebro, tallo cerebral, la médula espinal y/o los nervios periféricos e incluye, pero no está limitado a, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, demencia senil, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, lesión neuronal asociada con esclerosis múltiple, y síntomas asociados. 79. - El uso como se reclama en la reivindicación 78, en donde la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Parkinson. 80. - El uso como se reclama en la reivindicación 78, en donde la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Huntington. 81. - El uso como se reclama en la reivindicación 78, en donde la enfermedad neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica. 82. - El uso como se reclama en la reivindicación 76, en donde el trastorno del sistema nervioso es una enfermedad, trastorno o daño que implica disfunción y/o pérdida de neuronas en el cerebro, tallo cerebral, la médula espinal y/o nervios periféricos e incluye, pero no está limitado a, condiciones causadas por enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, lesión tóxica, malignidad y/o condiciones genéticas o idiopáticas que incluyen, pero no están limitadas a, diabetes, disfunción renal, alcoholismo, quimioterapia, agentes químicos, abuso de fármacos, deficiencia de vitaminas e infección. 83. - El uso como se reclama en las reivindicaciones 82 ó 77, en donde la enfermedad es neuropatía periférica y dolor asociado. 84. - El uso como se reclama en la reivindicación 76, en donde el trastorno del sistema nervioso es una enfermedad, trastorno o daño que implica degeneración o esclerosis de células gliales tales como oligodendrocitos, astrocitos y células de Schwann en el cerebro, tallo cerebral, la médula espinal y los nervios periféricos e incluye, pero no está limitado a, esclerosis múltiple, neuritis óptica, esclerosis cerebral, encefalomielitis post- infecciosa y epilepsia, y síntomas asociados. 85. - El uso como se reclama en la reivindicación 84, en donde la enfermedad o trastorno es esclerosis múltiple, ataxia sensitiva, trastornos espinocerebelares neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelares y alcoholismo. 86. - El uso como se reclama en la reivindicación 76, en donde el trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso implica la retina, fotorreceptores y nervios asociados e incluye, pero no está limitado a, retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, retinopatía diabética, y síntomas asociados. 87. - El uso como se reclama en la reivindicación 76, en donde el trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso implica el epitelio sensitivo y ganglios asociados del complejo vestibuloacustico e incluye, pero no está limitado a, pérdida de la audición inducida por ruido, sordera, tinitus, otitis, laberintitis, atrofias hereditaria y cocleovestibular, enfermedad de Meniere, y síntomas asociados. 88. - El uso como se reclama en la reivindicación 74, en donde el sujeto es un ser humano. 89. - Un método para prevenir apoptosis en una célula neuronal de mamífero, dicho método comprendiendo exponer dicha célula neuronal a un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21. 90. - Un método para mejorar la supervivencia de una célula neuronal de mamífero, dicho método comprendiendo exponer dicha célula neuronal a un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 . 91. - Un método para generar una neurona, dicho método comprendiendo exponer una célula precursora neuronal o una célula madre neuronal a un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21. 92. - Un método para expandir una composición de células de mamífero, que comprende administrar a dicha composición el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 ; o transducir/transfectar las células con el vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55. 93. - Un método para diferenciar una composición de células de mamífero, que comprende administrar a dicha composición el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 ; o transducir/transfectar las células con el vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55. 94. - Un anticuerpo capaz de mostrar unión a un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21. 95. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado además porque es seleccionado del grupo que consiste de: anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos recombinantes. 96. - Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 94, y un conjugado seleccionado del grupo que consiste de: un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina o un isótopo radiactivo; un miembro de un par de unión específico, tal como avidina o estreptavidina o un antígeno; o una enzima capaz de producir un producto detectable. 97. - Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de AA128-AA293 de SEQ ID No. 3, AA121-AA293 de SEQ ID No. 3, AAi29-AA294 de SEQ ID No. 8, AA 22-AA294 de SEQ ID No. 8, AA126-AA29i de SEQ ID No. 13, AA119-AA29i de SEQ ID No. 13, y variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 15 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. 98. - El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado además porque los aminoácidos cambiados se seleccionan de los designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente conservados en la figura 3A. 99. - Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID No. 19, 20, 21 , 22, 23 y 24, y variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 15 de ios residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. 100. - El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado además porque los aminoácidos cambiados se seleccionan de los designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente conservados en la figura 3A. 101. - Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de: i) AA3o-AA288 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA25-AA293 de SEQ ID No. 3; ii) AA28-AA286 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA23-AA291 de SEQ ID No. 13; iii) AA31-AA289 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA26-AA2g4 de SEQ ID No. 8; y iv) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 20 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. 102. - Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de: i) AA-171-AA288 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA165-AA288 de SEQ ID No. 3; ii) AA169-AA286 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA164-AA291 de SEQ ID No. 13; iii) AAi72-AA289 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA167-AA294 de SEQ ID No. 8; y iv) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. 103. - Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de: i) AA30-AA1 8 de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA25-AA123 de SEQ ID No. 3; ii) AA28-AA116 de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA23-AAi21 de SEQ ID No. 13; iii) AA31-AA119 de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tengan de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en un extremo o ambos extremos, hasta AA26-AA-124 de SEQ ID No. 8; y iv) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida es cambiado a un aminoácido diferente, siempre que no más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia sean cambiados de esta manera. 104. - El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 101 , 102 o 103, caracterizado además porque los aminoácidos cambiados se seleccionan de los designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente conservados en la figura 3A. 105.- Un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido d con cualquiera de las reivindicaciones 97 a 103.