CN117940149A - 化疗诱导的神经性疼痛的预防和治疗 - Google Patents

Abstract

本公开文本涉及镍纹蛋白及其在预防和/或治疗化疗诱导的神经性疼痛中的用途。由于用化疗剂治疗而产生的神经性疼痛能够通过向患者施用镍纹蛋白来治疗。镍纹蛋白也能够用于预防性治疗，以防止由于用化疗剂治疗而患上神经性疼痛。

Description

化疗诱导的神经性疼痛的预防和治疗

技术领域

本发明涉及镍纹蛋白及其在预防和/或治疗化疗诱导的神经性疼痛中的用途。

背景技术

癌症是全世界死亡的主要原因之一，并且尽管为实现新颖化疗策略付出了巨大的努力，但这些疾病仍然是一个重大的健康问题，每年报告数百万新病例。

用化疗治疗使得癌症存活期得到改善，但是也经常导致严重的副作用，这大大降低了癌症患者的生活质量。

已知重要的抗癌剂(包括基于铂的药剂、紫杉烷和长春花生物碱)会对周围神经系统造成神经毒性，从而引起具有诸如痛觉超敏、痛觉过敏和自发性疼痛的症状的神经性疼痛。化疗诱导的神经性疼痛(CINP)是化疗的最严重副作用之一。CINP给患者造成长期不适，其副作用在停止治疗后可能持续多年，这降低了癌症幸存者的生活质量。因此，化疗诱导的神经病和疼痛是抗癌药物的最常见非血液学剂量限制性副作用。如果剂量太高，接受它的人将无法忍受副作用，而低剂量将导致潜在癌症/疾病的无效治疗。因此，许多抗癌药物的功效在副作用对于大多数患者是可接受的剂量下是次优的。因此，化疗剂治疗的CINP症状可能导致化疗剂剂量的降低或治疗的停止，从而导致存活率降低。

用于预防或治疗化疗诱导的神经性疼痛的安全且有效的疗法仍然是未满足的临床需求，没有批准的疗法。通常用于治疗慢性疼痛病症的药物(如加巴喷丁、三环类抗抑郁药和阿片类物质)效果不佳，并且与许多副作用相关。

因此，非常需要用于治疗化疗诱导的神经性疼痛的预防性和治疗性策略，优选地没有副作用或仅具有不影响患者的一般健康状况的轻微副作用。

镍纹蛋白是一种内源性蛋白，其先前已经被证明是神经元的存活因子(WO 2005/095450)。WO 2012/041328基于在神经损伤的动物模型中的发现描述了镍纹蛋白用于治疗痛觉超敏、痛觉过敏、自发性疼痛和幻痛的用途。

发明内容

本公开文本的诸位发明人已经令人惊讶地发现，在化疗治疗之前、与其同时或间歇地施用镍纹蛋白使得预防化疗诱导的神经性疼痛(CINP)。因此，通过与化疗联合施用镍纹蛋白，可以预防CINP。CINP是化疗的一种严重副作用，因为除了给患者造成长期不适之外，所述症状还可能要求降低化疗剂的剂量量或停止治疗，从而导致存活率降低。因此，本发明提供了用于通过允许使用较高剂量的化疗剂来改善癌症疗法且发生神经性疼痛的风险得以降低的手段。

在一个方面，本发明涉及一种用于在治疗或预防受试者的化疗诱导的神经性疼痛中使用的分离的多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

i.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和

ii.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。

在第二方面，本发明涉及一种用于在治疗或预防受试者的化疗诱导的神经性疼痛中使用的分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

a.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；

b.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。

在又一方面，本发明涉及一种用于在治疗或预防受试者的化疗诱导的神经性疼痛中使用的载体，所述载体包含编码根据权利要求1至6中任一项所述的多肽的多核苷酸。

在又一方面，本发明涉及一种用于减少有需要的受试者的背根神经节中的谷氨酰胺合成酶表达的方法，所述方法包括施用包含选自以下的氨基酸序列的多肽：

a.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；

b.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性

从而减少背根神经节中谷氨酰胺合成酶的表达。

在又一方面，本发明涉及一种用于减少有需要的受试者的背根神经节中的连接蛋白43表达的方法，所述方法包括施用包含选自以下的氨基酸序列的多肽：

a.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；

b.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性

从而减少背根神经节中连接蛋白43的表达。

附图说明

图1：研究设计预防范例。在第1天、第3天、第5天、第7天和第9天(D1、D3、D5、D7和D9)，皮下施用重组镍纹蛋白(rmMeteorin)0.5mg/kg或1.8mg/kg。在第2天、第4天、第6天和第8天(D2、D4、D6和D8)，腹膜内施用紫杉醇。紫杉醇(PTX)；腹膜内(i.p.)；皮下(s.c.)；脊髓(SC)；背根神经节(DRG)。

图2：在成年C57Bl6J小鼠中，镍纹蛋白防止紫杉醇诱导的机械超敏反应。使用vonFrey细丝在基线(BL)处测量后爪缩爪阈值(PWT)，然后在整个实验持续时间内常规地测量，直至第57天。进行紫杉醇治疗之前皮下注射0.5mg/kg(灰色正方形)或1.8mg/kg(黑色三角形)的重组镍纹蛋白(MTRN)或媒介物(白色圆圈)(n＝8组)，然后每种治疗后再注射4次，如通过箭头所指示。与媒介物治疗相比，重组镍纹蛋白(0.5mg/kg和1.8mg/kg)基本上防止了机械超敏反应的发生。相比于媒介物，*p<0.05；**p<0.01；*＊*p<0.001；****p<0.0001，进行混合效应模型方差分析，随后进行图基事后检验。数据显示为平均值±SEM。

图3：镍纹蛋白防止紫杉醇诱导的卫星胶质细胞密度和间隙连接形成的增加。

在第2天、第4天、第6天、第8天每隔一天向雌性小鼠施用紫杉醇(4mg/kg，腹膜内)持续4天，在第1天、第3天、第5天、第7天、第9天交替注射重组镍纹蛋白(0.5mg/kg或1.8mg/kg，皮下)或媒介物(如图1所示)。在第24天，杀死小鼠，并且取出背根神经节(DRG)组织，用针对外周蛋白(其被用于鉴定神经元胞体-未示出)、谷氨酰胺合成酶(GS)和连接蛋白43(Con43)的抗体进行免疫组织化学处理。随每μm²每种对应的抗体的特异性染色的变化表示平均灰度强度(MGI)。相比于媒介物，*p<0.05，**p<0.01，进行单因素方差分析与图基多重比较。数据显示为平均值±SEM。

图4：先驱性镍纹蛋白治疗防止紫杉醇诱导的后爪表皮内神经纤维的损失。在第2天、第4天、第6天和第8天(D2、D4、D6和D8)每隔一天向雌性小鼠施用紫杉醇(4mg/kg，腹膜内)持续4天，在第1天、第3天、第5天、第7天和第9天(D1、D3、D5、D7和D9)交替注射重组镍纹蛋白(0.5mg/kg或1.8mg/kg，皮下)或媒介物。使用PGP9.5表达作为特异性标记物来计算表皮内神经纤维(IENF)密度，其从发现穿过基底膜的IENF的数量(箭头)计算并相对于表皮的宽度(mm)标准化。相比于媒介物，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，进行单因素方差分析与图基多重比较。数据显示为平均值±SEM。

图5：研究设计治疗范例。在第2天、第4天、第6天和第8天(D2、D4、D6和D8)，将紫杉醇腹膜内施用至雄性和雌性小鼠的单独群组。在第10天、第12天、第14天、第16天和第18天(D10、D12、D14、D16和D18)，皮下施用重组镍纹蛋白0.5mg/kg或1.8mg/kg。紫杉醇(PTX)；腹膜内(i.p.)；皮下(s.c.)；脊髓(SC)；背根神经节(DRG)。

图6：在成年C57Bl6J小鼠中，镍纹蛋白逆转紫杉醇诱导的机械超敏反应。

根据图5的研究计划，每隔一天向雄性和雌性小鼠的单独群组腹膜内注射施用4mg/kg紫杉醇(PTX)，累积剂量为16mg/kg(灰色框)。使用von Frey细丝在基线(BL)处测量PWT，然后在整个实验持续时间内常规地测量，直至第54天。进行紫杉醇治疗之后在通过箭头指示的时间处5次重复皮下注射0.5mg/kg(灰色正方形)或1.8mg/kg(黑色三角形)的重组镍纹蛋白(MTRN)或媒介物(每种性别n＝8组)。

合并雄性和雌性治疗组的数据。与媒介物治疗相比，通过重组镍纹蛋白治疗(0.5mg/kg和1.8mg/kg)更快地减轻和消退了机械超敏反应。相比于媒介物，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001，进行混合效应模型方差分析，随后进行图基事后检验。数据显示为平均值±SEM。

图7：镍纹蛋白逆转紫杉醇诱导的卫星胶质细胞密度和间隙连接形成的增加。

在第2天、第4天、第6天、第8天，每隔一天向雌性小鼠(上图)或雄性小鼠(下图)施用紫杉醇(4mg/kg，腹膜内)持续4天。随后在第10、12、14、16、18天施用重组镍纹蛋白(0.5mg/kg或1.8mg/kg，皮下)或媒介物(如图5所示)。在第24天，杀死小鼠，并且取出背根神经节(DRG)组织，用针对外周蛋白(其被用于鉴定神经元胞体-未示出)、谷氨酰胺合成酶(GS)和连接蛋白43(Con43)的抗体进行免疫组织化学处理。随每μm²每种对应的抗体的特异性染色的变化表示平均灰度强度(MGI)。相比于媒介物，*p<0.05，**p<0.01，进行单因素方差分析与图基多重比较。数据显示为平均值±SEM。

图8：镍纹蛋白的CLUSTAL W(1.82)多序列比对。

A)来自人(SEQ ID NO:2)、大鼠(SEQ ID NO:8)和小鼠(SEQ ID NO:5)的镍纹蛋白前体的比对。B)来自人(SEQ ID NO:3)、大鼠(SEQ ID NO:9)和小鼠(SEQ ID NO:6)的成熟镍纹蛋白的比对。C)由人、小鼠和大鼠序列中的完全保守的残基产生的成熟镍纹蛋白共有序列(SEQ ID NO:11)。X表示由DNA编码的21种天然存在的氨基酸中的任一种。

具体实施方式

定义

如本文所用，“生物相容性胶囊”意指在植入宿主哺乳动物后，胶囊不引发足以导致胶囊排斥或使其不可起作用(例如，通过降解)的有害宿主反应。

如本文所用，“编码序列”是被转录并翻译成多肽的多核苷酸序列。

如本文所用，术语“表达载体”是指能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体。一般来说，用于重组DNA技术中的表达载体通常呈质粒的形式。

如本文所用，“免疫隔离性胶囊”意指在植入哺乳动物宿主后，胶囊使宿主免疫系统对其核心内的细胞的有害作用最小化。

“哺乳动物启动子”是指能够在哺乳动物细胞中发挥功能的启动子。

如本文所用，“镍纹蛋白”是指来自任何来源(无论是天然的、合成的、半合成的还是重组的)的具有从任何物种获得的基本上纯化的镍纹蛋白的氨基酸序列的多肽，所述物种特别是哺乳动物，包括黑猩猩、牛、绵羊、猪、鼠、马，优选人。所述术语还指代从任何这些物种获得的镍纹蛋白的生物活性片段，以及这些的生物活性序列变体和经受翻译后修饰的蛋白质。

如本文所用，术语“可操作地连接”旨在意指目的核苷酸序列与重组表达载体内的一个或多个调节序列以允许核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当将载体引入宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式连接。

如本文所用，术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。

“序列同一性”：高水平的序列同一性指示第一序列可能衍生自第二序列。氨基酸序列同一性需要两个比对序列之间的相同氨基酸序列。因此，与参考序列具有70％氨基酸同一性的候选序列要求在比对后，候选序列中的70％氨基酸与参考序列中的相应氨基酸相同。同一性可以通过借助诸如但不限于ClustalW计算机比对程序(Higgins D.,ThompsonJ.,Gibson T.,Thompson J.D.,Higgins D.G.,Gibson T.J.,1994.CLUSTAL W:improvingthe sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice.NucleicAcids Res.22:4673-4680)的计算机分析以及其中建议的默认参数的帮助来确定。ClustalW软件可作为在欧洲生物信息学研究所的ClustalW WWW服务(ClustalW WWWService)从http://www.ebi.ac.uk/clustalw获得。使用此程序及其默认设置，将询问序列的成熟(生物活性)部分与参考多肽进行比对。对完全保守的残基的数量计数，并且将其除以参考多肽的长度。

ClustalW算法可以类似地用于比对核苷酸序列。序列同一性可以以与针对氨基酸序列所指示的类似的方式来计算。

本文所用的术语“受试者”意指可以向其施用镍纹蛋白多肽或多核苷酸、治疗性细胞或生物相容性胶囊的任何哺乳动物。特别旨在用本发明的方法进行治疗的受试者包括人以及非人灵长类动物、绵羊、马、牛、山羊、猪、狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠和小鼠，以及衍生自或源自这些宿主的器官、肿瘤和细胞。

“治疗”可以以不同的方式进行，包括治愈性的和/或改善性的。治愈性治疗通常旨在治愈已经存在于被治疗个体中的临床病症。改善性治疗通常意指为了改善个体的现有的临床病症而进行的治疗。

如本文所用的术语“预防”是指预防临床病症或降低患上病症的风险或降低病症的程度。预防在本文中也可以被称为预防性治疗或先驱性治疗。

如本文所用，术语“载体”是指能够转运已经与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以可互换地使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括发挥等效功能的此类其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

化疗和神经性疼痛

化疗是一种这样类型的癌症治疗，其使用一种或多种抗癌药物来全身性地治疗癌症。用化疗治疗使得寿命延长，但是也导致严重的副作用。化疗中的抗肿瘤剂旨在消除快速分裂的癌细胞，但是它们也可能损害健康的结构，包括周围神经系统。

化疗的更严重的副作用之一是化疗诱导的神经性疼痛，其是一类这样的疼痛，包括源自由化疗的神经毒性引起的周围神经系统和/或中枢系统的功能障碍的几种形式的疼痛。神经性疼痛的症状包括灼热感、麻刺感、电击感、针刺感、感觉异常、感觉迟钝、僵硬、四肢麻木、身体扭曲的感觉、痛觉超敏(通常无害的由刺激引起的疼痛)、痛觉过敏(对疼痛的异常敏感性)、痛觉过度(疼痛刺激停止后持续很长时间的过度疼痛反应)和自发性疼痛。

CINP折磨30％与40％之间的经历化疗的患者。在化疗完成后的第一个月，这些症状的患病率最高，为68.1％，但是在化疗完成后六个月，仍有多达30％的患者报告CINP症状。症状的严重程度通常与所接受的治疗药物的剂量成比例，并且症状的严重程度可能需要降低化疗剂量。

CINP可以产生自各种癌症适应证的化疗剂治疗，所述癌症适应证包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、胃肠道癌(如食道癌、胰腺癌)、白血病、霍奇金病、威尔姆斯瘤、神经母细胞瘤、睾丸癌、膀胱癌、肺癌和多发性骨髓瘤。因此，在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛是由卵巢癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌、白血病、霍奇金病、威尔姆斯瘤、神经母细胞瘤、睾丸癌、膀胱癌、肺癌或多发性骨髓瘤的化疗剂治疗诱导的。在另一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛是由卵巢癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌、白血病、霍奇金病、威尔姆斯瘤、神经母细胞瘤、睾丸癌、膀胱癌或多发性骨髓瘤的化疗剂治疗诱导的。

CINP可以由不同的抗癌剂诱导，所述抗癌剂包括但不限于基于铂的抗癌剂，如卡铂、顺铂和奥沙利铂；紫杉烷，如紫杉醇和多西他赛；埃博霉素，如伊沙匹隆；长春花生物碱，如长春新碱、长春碱和长春瑞滨；蛋白酶体抑制剂，如硼替佐米；和免疫调节抗癌剂，如沙利度胺。因此，在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛是由用选自以下的抗癌剂治疗诱导的：基于铂的抗癌剂、紫杉烷、埃博霉素、长春花生物碱、蛋白酶体抑制剂和免疫调节抗癌剂。

在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛是由用基于铂的抗癌剂治疗诱导的，如由用卡铂、顺铂和/或奥沙利铂治疗诱导。在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛是由用紫杉烷治疗诱导的，如由用紫杉醇和/或多西他赛治疗诱导。在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛是由用埃博霉素治疗诱导的，如由用伊沙匹隆治疗诱导。在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛是由用长春花生物碱治疗诱导的，如由用长春新碱、长春碱和/或长春瑞滨治疗诱导。在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛是由用蛋白酶体抑制剂治疗诱导的，如由用硼替佐米治疗诱导。在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛是由用免疫调节抗癌剂治疗诱导的，如由用沙利度胺治疗诱导。

抗癌剂可以作为单一药剂治疗给予，或以组合治疗方案给予，其中将抗癌剂与另一种抗癌剂组合施用。

化疗诱导的神经性疼痛最初表现为急性疼痛综合征，在药物施用期间或之后不久出现感觉症状，并且在重复的化疗治疗周期后进展为慢性神经病。关于感觉症状的持续时间，急性神经病通常在治疗之间消退，而慢性神经病可以持续数月或数年，大大降低了癌症幸存者的生活质量。

由CINP引起的症状可以改变，并且包括灼热感、麻刺感、电击感、针刺感、感觉异常、感觉迟钝、僵硬、四肢麻木、身体扭曲的感觉、痛觉超敏、痛觉过敏、痛觉过度和/或自发性疼痛。因此，在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛导致灼热感、麻刺感、电击感、针刺感、感觉异常、感觉迟钝、僵硬、四肢麻木、身体扭曲的感觉、痛觉超敏、痛觉过敏、痛觉过度和/或自发性疼痛。

在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛导致灼热感、麻刺感、电击感、针刺感、感觉异常、感觉迟钝、僵硬、四肢麻木、身体扭曲的感觉。

在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛导致痛觉超敏、痛觉过敏、痛觉过度和/或自发性疼痛。在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛导致痛觉超敏。在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛导致痛觉过敏。在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛导致痛觉过度。在一个实施方案中，化疗诱导的神经性疼痛导致自发性疼痛。

化疗诱导的神经性疼痛的治疗和/或预防

用于预防或治疗化疗诱导的神经性疼痛的安全且有效的疗法仍然是未满足的临床需求。通常对治疗慢性疼痛病症有效的药物(如加巴喷丁、三环类抗抑郁药和阿片类物质)效果不佳，并且与许多副作用相关。

因此，非常需要用于治疗化疗诱导的神经性疼痛的预防性和治疗性策略，优选地仅具有不影响患者的一般健康状况的轻微副作用。本发明提供了通过向接受化疗剂治疗的受试者施用镍纹蛋白来治疗和/或预防CINP。因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于在治疗和/或预防化疗诱导的神经性疼痛中使用的镍纹蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及用于在治疗化疗诱导的神经性疼痛中使用的镍纹蛋白。

在一个实施方案中，本公开文本提供了用于在治疗和/或预防受试者的化疗诱导的神经性疼痛中使用的分离的多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

i.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和

ii.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗和/或预防化疗诱导的神经性疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的多肽，所述分离的多肽包含选自以下的氨基酸序列：

i.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和

ii.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。

在一个实施方案中，本公开文本提供了分离的多肽用于制造用以治疗和/或预防受试者的化疗诱导的神经性疼痛的药剂的用途，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

i.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和

ii.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。

如本公开文本的实施例1、2和3中所证明，在施用化疗剂之前和/或与其间歇地施用镍纹蛋白提供了化疗诱导的神经性疼痛的逆转。因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于在预防化疗诱导的神经性疼痛中使用的镍纹蛋白。

在一个实施方案中，本公开文本提供了用于在预防受试者的化疗诱导的神经性疼痛中使用的分离的多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

i.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和

ii.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及用于预防化疗诱导的神经性疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的多肽，所述分离的多肽包含选自以下的氨基酸序列：

i.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和

ii.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。

在一个实施方案中，本公开文本提供了分离的多肽用于制造用以预防受试者的化疗诱导的神经性疼痛的药剂的用途，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

i.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和

ii.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。

在一个实施方案中，所述治疗的治疗效果改善化疗诱导的神经性疼痛的至少一种症状。所述至少一种症状可以选自灼热感、麻刺感、电击感、针刺感、感觉异常、感觉迟钝、僵硬、四肢麻木、身体扭曲的感觉、痛觉超敏、痛觉过敏、痛觉过度和/或自发性疼痛。在一个实施方案中，所述治疗的治疗效果改善选自以下的至少一种症状：灼热感、麻刺感、电击感、针刺感、感觉异常、感觉迟钝、僵硬、四肢麻木、身体扭曲的感觉。在一个实施方案中，所述治疗的治疗效果改善选自以下的至少一种症状：痛觉超敏、痛觉过敏、痛觉过度和/或自发性疼痛。

在一个实施方案中，所述治疗的治疗效果改善痛觉超敏。在一个实施方案中，痛觉超敏是热学痛觉超敏(thermal allodynia)、冷痛觉超敏、热痛觉超敏(heat allodynia)和/或机械性痛觉超敏。

在一个实施方案中，所述治疗的治疗效果改善痛觉过敏。在一个实施方案中，痛觉过敏是机械性痛觉过敏。

在一个实施方案中，所述治疗的治疗效果改善痛觉过度。

在一个实施方案中，所述治疗的治疗效果改善自发性疼痛。

施用和配制品

镍纹蛋白多肽可以以医学上可接受的任何方式来施用。这可以包括通过肠胃外途径(如静脉内、血管内、动脉内、皮下、肌内、肿瘤内、腹膜内、心室内、硬膜内外(intraepidural)、鞘内、脑室内、脑内等)以及鼻或局部注射。本发明还特别包括缓释施用，通过诸如贮库型注射或易蚀性植入物的手段。

根据本发明的镍纹蛋白的施用可以使用任何合适的递送手段来实现，所述递送手段包括：皮下、静脉内、动脉内、肌内、鞘内注射或注射至其他合适的部位；泵(参见例如，Annals of Pharmacotherapy,27:912(1993)；Cancer,41:1270(1993)；Cancer Research,44:1698(1984)，通过引用并入本文)；微囊化(参见例如，美国专利4,352,883；4,353,888；和5,084,350，通过引用并入本文)；缓释聚合物植入物(参见例如，Sabel,美国专利4,883,666，通过引用并入本文)；包封细胞(参见，“生物相容性胶囊”)；未包封细胞移植物(参见例如，美国专利5,082,670和5,618,531，各自通过引用并入本文)；和吸入。

施用可以通过制剂大丸剂的周期性注射进行，或者可以从外部(例如，静脉输液袋)或内部(例如，镍纹蛋白生产细胞的生物可蚀性植入物、生物人工器官、生物相容性胶囊、或植入的镍纹蛋白生产细胞群体)的储器通过静脉内或腹膜内施用来更加连续地进行。参见例如，US 4,407,957、5,798,113和5,800,828，各自通过引用并入本文。

局部递送可以通过诸如经由导管递送至一个或多个动脉的手段进行。在本发明的一个实施方案中，局部递送包括使用包封细胞(如“生物相容性胶囊”部分中所述)进行递送。又一类型的局部递送包括基因疗法载体的局部递送，其通常是注射的。

在本发明的一个优选的实施方案中，施用是肠胃外注射，优选皮下注射或鞘内注射。

尽管本发明的化合物可以作为化学原料施用，但优选以药物配制品的形式呈递它们。药物配制品可以通过常规技术制备，例如如Remington:The Science and Practice ofPharmacy 2005,Lippincott,Williams&Wilkins中所述。

术语“药学上可接受的载体”意指一种或多种天然的或合成的有机或无机成分，镍纹蛋白多肽与其组合以促进镍纹蛋白多肽的应用。合适的载体包括无菌盐水，尽管已知为药学上可接受的其他水性和非水性等渗无菌溶液和无菌悬浮液是本领域普通技术人员已知的。

本发明的化合物可以被配制用于肠胃外施用，并且可以以单位剂量形式存在于安瓿、载药注射器、小体积输注或多剂量容器中，任选地添加防腐剂。组合物可以采取诸如以下的形式：在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，例如在水性聚乙二醇中的溶液。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄榄油)和可注射的有机酯(例如，油酸乙酯)，并且可以包括诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂或悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的试剂。可替代地，活性成分可以呈粉末形式(通过无菌分离无菌固体或通过从溶液中冻干获得)，用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)构成。

“有效量”是指能够改善或延迟患病、退行性或受损状况的进展的量。有效量可以在个体基础上确定，并且将部分地基于待治疗的症状和所寻求的结果的考虑。有效量可以由本领域普通技术人员采用此类因素并且仅使用常规实验来确定。

脂质体系统可以是任何种类的单层囊泡、多层(multilamellar)囊泡或稳定的多层(plurilamellar)囊泡，并且可以根据本领域技术人员熟知的方法(例如，根据美国专利5,169,637、4,762,915、5,000,958或5,185,154的教导)来制备和施用。此外，可能期望将本发明的新型多肽以及其他所选多肽表达为脂蛋白，以便增强它们与脂质体的结合。例如，通过免疫亲和色谱法或任何其他方便的方法从CHO细胞中纯化重组镍纹蛋白，然后将其与脂质体混合并且高效地掺入它们中。可以在体外测试脂质体包封的蛋白质对刺激细胞生长的任何作用。

在需要以具有适合于治疗需要施用镍纹蛋白多肽的任何疾病或障碍的释放特征的配制品缓释施用镍纹蛋白多肽的情况下，设想了镍纹蛋白多肽的微囊化。已经成功用人生长激素(rhGH)、干扰素(rhIFN-)、白细胞介素-2和MN rgp120进行了重组蛋白的微囊化以持续释放。Johnson等人(1996)；Yasuda(1993)；Hora等人(1990)；Cleland,(1995),第439-462页；WO 97/03692、WO 96/40072、WO 96/07399；和美国专利号5,654,010。

由于这些蛋白质的生物相容性和广泛的可生物降解特性，使用聚-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)聚合物开发了它们的缓释配制品。PLGA、乳酸和乙醇酸的降解产物可以在人体内快速清除。此外，这种聚合物的降解性可以根据其分子量和组成从数月到数年进行调整。Lewis,“Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolidepolymer,”在:M.Chasin和R.Langer(编辑),Biodegradable Polymers as Drug DeliverySystems(Marcel Dekker:New York,1990),第1-41页。

在本发明的一个实施方案中，设想了包含镍纹蛋白的组合物。组合物可以包含如本文所述的分离的多肽、如本文所述的分离的核酸、如本文所述的编码镍纹蛋白的表达载体、如本文所述的表达镍纹蛋白的细胞系或如本文所述的分泌镍纹蛋白的生物相容性胶囊。

剂量

设想了用于全身性施用的各种给药方案。在一个实施方案中，向受试者施用包含镍纹蛋白多肽的配制品的方法包括以每剂1μg/kg与10,000μg/kg受试者体重之间的剂量施用镍纹蛋白。在另一个实施方案中，剂量在每剂1μg/kg与7,500μg/kg受试者体重之间。在又一实施方案中，剂量在每剂1μg/kg与5,000μg/kg受试者体重之间。在一个不同的实施方案中，剂量在每剂1μg/kg与2,000μg/kg受试者体重之间。在又另一个实施方案中，剂量在每剂1μg/kg与1,000μg/kg受试者体重之间。在又另一个实施方案中，剂量在每剂1μg/kg与700μg/kg受试者体重之间。在一个更优选的实施方案中，剂量在每剂5μg/kg与500μg/kg受试者体重之间。在一个最优选的实施方案中，剂量在每剂10μg/kg与100μg/kg受试者体重之间。在一个优选的实施方案中，待治疗的受试者是人。

在文献中提供了关于具体的剂量和递送方法的指导；参见例如，WO 02/78730和WO07/100898。在Reagan-Shaw等人,FASEB J,22,659-661(2007)中提供了基于动物实验中使用的剂量计算人等效剂量的指导。

必须根据所治疗个体的年龄、体重和病症以及施用途径、剂型和方案以及所期望的结果小心地调整所施用的剂量，并且确切的剂量应当由从业者确定。

在本发明的一个实施方案中，每天重复施用。在另一个实施方案中，每周重复施用至少1-3次，如每周2-5次，如每周3-6次。

在一个实施方案中，每天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每7天一次重复施用。在一个优选的实施方案中，每两天重复施用一次。

在一个实施方案中，本发明提供了化疗诱导的神经性疼痛的治疗。因此，在一个实施方案中，在神经性疼痛的症状发作后开始施用。

在一个实施方案中，所述多肽的施用在化疗治疗开始后开始，如在化疗治疗开始后1天、如之后2天、如之后3天、如之后4天、如之后5天、如之后8天、如之后12天开始。在另一个实施方案中，所述多肽的施用在化疗治疗开始后开始，如在化疗治疗开始后1周、如之后2周、如之后3周开始。

在一个实施方案中，本发明提供了化疗诱导的神经性疼痛的预防。因此，在一个实施方案中，在化疗治疗之前、与其同时或间歇地施用神经营养性多肽。

在一个实施方案中，在化疗治疗开始前开始施用。

在一个实施方案中，在化疗治疗开始前至少一天开始施用，如在化疗治疗开始前至少两天，例如在化疗治疗开始前至少三天，如在化疗治疗开始前至少4天、至少5天、至少6天或至少一周开始施用。

在一个实施方案中，将神经营养性多肽在化疗治疗开始的同一天施用，或在化疗治疗开始前至少一天施用，如在化疗治疗开始前至少两天，例如在化疗治疗开始前至少三天，如在化疗治疗开始前至少4天、至少5天、至少一周施用。

化疗剂治疗通常由以给定间隔多次施用抗癌剂构成，如每周一次、每两周一次，如每三周一次，如每月一次。在一个实施方案中，将神经营养性多肽与抗癌剂的每次施用联合施用，如在每次发生抗癌剂的施用之前、与其同时或间歇地施用。

在其他实施方案中，以相对较长的剂量间隔施用镍纹蛋白。相对较长的剂量间隔旨在包括剂量之间有至少2天，如剂量之间有至少3天，例如每周2次剂量。更优选地，长剂量间隔为至少一周，如至少2周，更优选至少3周，如至少4周或至少一个月。

相对较长的剂量间隔是指剂量之间有至少2天，如剂量之间有至少3天，例如每周2次剂量。更优选地，长剂量间隔为至少一周，如至少2周，更优选至少3周，如至少4周或至少一个月。

以不同的方式表达，剂量间隔是如此长，以至于在一次剂量的镍纹蛋白多肽后，当施用下一次剂量时，在待治疗的受试者的血清中不再可检测到多肽。在另一个实施方案中，血清水平低于10ng/mL，如低于5ng/mL，更优选低于1ng/mL，如低于0.5ng/mL，例如低于0.1ng/mL。

在一些实施方案中，在长剂量范围之前更频繁地初始施用镍纹蛋白，例如每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次或每四天一次。此初始给药方案可以维持例如2、3、4、5、6、7、9、11、14、21天或更久。在完成此给药方案后，可以较不频繁地施用镍纹蛋白，例如如上所述。

因此，在一个方面，本发明涉及治疗有需要的人类受试者的神经性疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的神经营养性多肽，所述神经营养性多肽包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述施用是每周三次或更不频繁。

优选地，施用是每周一次或更不频繁的施用。甚至更优选地，施用是每两周一次或更不频繁的施用。

以不同的方式表达，剂量间隔是如此长，以至于在一次剂量的镍纹蛋白多肽后，当施用下一次剂量时，在待治疗的受试者的血清中不再可检测到多肽。在另一个实施方案中，血清水平低于10ng/mL，如低于5ng/mL，更优选低于1ng/mL，如低于0.5ng/mL，例如低于0.1ng/mL。

在一些实施方案中，镍纹蛋白的初始施用是例如每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次或每四天一次。此给药方案可以维持例如2、3、4、5、6、7、9、11、14、21天或更久。在完成此给药方案后，可以较不频繁地施用镍纹蛋白，例如如上所述。

镍纹蛋白

本发明涉及被鉴定为镍纹蛋白的多肽和编码所述蛋白质的多核苷酸在治疗化疗诱导的神经性疼痛中的用途。在一个实施方案中，递送被设想为通过使用胶囊将分泌的生物活性镍纹蛋白和/或其同源物递送至受试者。已经在人(SEQ ID NO:2)、小鼠(SEQ ID NO:5)和大鼠(SEQ ID NO:8)以及多种其他物种中鉴定出镍纹蛋白。

人镍纹蛋白作为293个氨基酸的前体存在，其可以经加工，以产生至少一种生物活性肽。镍纹蛋白在神经系统和眼睛、特别是脑的特定亚区中以高水平表达。小鼠(SEQ IDNO:5)和大鼠(SEQ ID NO:8)镍纹蛋白前体由291个氨基酸组成，并且与人镍纹蛋白(SEQ IDNO:2)的序列同一性％分别为80.3和80.2(参见图8)。

人镍纹蛋白含有23个氨基酸的N末端信号肽序列，其在序列基序ARA-GY处被切割。此信号肽切割位点是通过SignalP方法预测到的。已经通过N末端测序验证了小鼠镍纹蛋白的N末端(等人,2009)。

表1示出了全长人镍纹蛋白与小鼠和大鼠序列之间的序列同一性％。参见在图8a中的比对。

序列	序列同一性％
		人	-
小鼠	80.3
		大鼠	80.2

表2示出了在去除N末端信号肽后，人镍纹蛋白与小鼠和大鼠序列之间的序列同一性％。参见在图8b中的比对。

序列	序列同一性％
		人	-
小鼠	81.9
		大鼠	79.6

基于完全保守的残基，可以衍生出成熟镍纹蛋白的共有序列(SEQ ID NO:11，图8c)，其中X独立地选自由DNA编码的21种天然存在的氨基酸中的任一种。在一个优选的实施方案中，变体镍纹蛋白包含共有序列。

镍纹蛋白的一种生物功能是在分离的背根神经节(DRG)培养物中诱导神经突生长的能力，如等人(2009)和Nishino等人(2004)中所述。

由于半胱氨酸的高度保守，预期这些残基在生物活性蛋白的二级和三级结构中起重要作用。一个或多个半胱氨酸可以参与分子内和/或分子间二硫桥的形成。

镍纹蛋白多肽

除了全长镍纹蛋白、基本上全长镍纹蛋白和前镍纹蛋白之外，本发明还提供了多肽的生物活性变体。如果镍纹蛋白多肽或片段展现出如本文所述的天然存在的镍纹蛋白的生物活性(如是神经营养性的)，则它是有生物活性的。应理解，本发明涉及如本文所定义的镍纹蛋白。

本发明涉及用于在治疗痛觉超敏、痛觉过敏和/或自发性疼痛的方法中使用的分离的多肽分子，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

a)选自SEQ ID NO:3、6和9的氨基酸序列；

b)选自SEQ ID NO:3、6和9的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与所述SEQ ID NO具有至少70％序列同一性；以及

c)a)或b)中任一个的至少50个连续氨基酸的生物活性片段，其中所述片段与所述SEQ ID NO至少70％相同。

在一个实施方案中，本发明涉及选自以下的分离的多肽：

i)SEQ ID NO:2的AA₃₀-AA₂₈₈，和在一端或两端具有来自天然序列的一至五个额外氨基酸的多肽、至多为SEQ ID NO:2的AA₂₅-AA₂₉₃；

ii)SEQ ID NO:8的AA₂₈-AA₂₈₆，和在一端或两端具有来自天然序列的一至五个额外氨基酸的多肽、至多为SEQ ID NO:8的AA₂₃-AA₂₉₁；

iii)SEQ ID NO:5的AA₃₁-AA₂₈₉，和在一端或两端具有来自天然序列的一至五个额外氨基酸的多肽、至多为SEQ ID NO:5的AA₂₆-AA₂₉₄；以及

iv)所述多肽的变体，其中所选序列中指定的任何氨基酸被改变为不同的氨基酸，条件是序列中不超过20个氨基酸残基被如此改变。

生物活性优选地是神经营养活性。神经营养活性变体可以参考以上WO 2005/095450中所述的一种或多种其他体外和/或体内神经营养测定、特别是DRG测定来定义。

优选的生物活性是引发与如等人(2009)中所述的DRG测定中基本上相同的反应的能力。在此测定中，使DRG细胞在全长人镍纹蛋白编码序列(SEQ ID NO:3)的存在下生长。在DRG测定中基本上相同的反应是指DRG细胞的神经突生长是在/>等人(2009)中所述的DRG测定中获得的数量的至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％。镍纹蛋白的片段或变体的生物活性也可以高于天然存在的镍纹蛋白(SEQ ID NO:3)的生物活性。

变体可以在氨基酸序列上或在不涉及序列的方面上或在两个方面上不同于天然存在的镍纹蛋白。当天然存在的镍纹蛋白中的一个或多个氨基酸被不同的天然氨基酸、氨基酸衍生物或非天然氨基酸取代时，产生氨基酸序列的变体(“序列变体”)。特别优选的变体包括天然存在的镍纹蛋白或天然存在的镍纹蛋白的生物活性片段，后者的序列与野生型序列相差一个或多个保守和/或半保守氨基酸取代，其通常对蛋白质或肽的二级和三级结构以及疏水性质具有最小的影响。变体还可以具有因一个或多个不消除镍纹蛋白生物活性的非保守氨基酸取代、缺失或插入而不同的序列。图8中的Clustal W比对可以用于预测哪些氨基酸残基可以被取代而基本上不影响蛋白质的生物活性。在一个优选的实施方案中，变体镍纹蛋白序列包含具有SEQ ID NO:11的共有序列。

下组(Clustal W，“强”保守组)内的取代在本发明的含义内被视为保守取代：

-S、T、A；N、E、Q、K；N、H、Q、K；N、D、E、Q；Q、H、R、K；M、I、L、V；M、I、L、F；H、Y；F、Y、W。

下组(Clustal W，“弱”保守组)内的取代在本发明的含义内被视为半保守取代：

-C、S、A；A、T、V；S、A、G；S、T、N、K；S、T、P、A；S、G、N、D；S、N、D、E、Q、K；N、D、E、Q、H、K；N、E、Q、H、R、K；V、L、I、M；H、F、Y。

本发明内的其他变体是具有增加肽稳定性的修饰的变体。此类变体可以在肽序列中含有例如一个或多个非肽键(其替代肽键)。还包括：包括除天然存在的L-氨基酸之外的残基(如D-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸(如β或γ氨基酸))的变体和环状变体。将D-氨基酸而不是L-氨基酸掺入多肽中可以增加其对蛋白酶的抗性。参见例如，US 5,219,990。本发明特别包括剪接变体。

当不能确定地预测给定取代的结果时，可以根据本文公开的方法容易地测定衍生物以确定神经营养活性的存在或不存在，优选地使用等人,Characterization ofmeteorin-An evolutionary conserved neurotrophic factor,J Mol Neurosci 2009年9月；39(1-2):104-116中所述的DRG测定。

在一个实施方案中，多肽是选自SEQ ID NO:3、6和9的序列的天然存在的等位基因变体。此多肽可以包含与选自SEQ ID NO:1、4和7的核酸序列相差单个核苷酸的核酸序列翻译的氨基酸序列。

在一个实施方案中，如本文所述的变体多肽包括这样的多肽，其中改变所选序列中指定的任何氨基酸以提供保守取代。

在一个实施方案中，在本发明的范围内的变体包括具有与人、鼠或大鼠镍纹蛋白(SEQ ID NO:3、6和9)具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白质和肽。更优选地，序列同一性为至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。

在一个优选的实施方案中，参考人镍纹蛋白多肽(SEQ ID NO:3)确定变体镍纹蛋白的序列同一性。

在一个实施方案中，变体包括包含与SEQ ID NO:3具有至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

在一个实施方案中，优选的变体包括包含与SEQ ID NO:6具有至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

在一个实施方案中，优选的变体包括包含与SEQ ID NO:9具有至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

神经营养性多肽优选地与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％序列同一性。

在一个实施方案中，神经营养性多肽包含SEQ ID NO:11的共有序列。

优选地，神经营养性多肽在相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置7、28、59、95、148、151、161、219、243和265处具有半胱氨酸残基。

在一个实施方案中，镍纹蛋白的优选变体包括包含50-270个氨基酸、更优选75-270个氨基酸、更优选90-270个氨基酸、更优选100-270个氨基酸、更优选125-270个氨基酸、更优选150-270个氨基酸、更优选175-270个氨基酸、更优选200-270个氨基酸、更优选225-270个氨基酸、更优选250-270个氨基酸的蛋白质。

在一个实施方案中，变体镍纹蛋白在相应位置处包含在图8中标记为完全保守的残基(*)，更优选地，变体镍纹蛋白在相应位置处还包含在图8中标记为强保守的残基(强保守组包括：S、T、A；N、E、Q、K；N、H、Q、K；N、D、E、Q；Q、H、R、K；M、I、L、V；M、I、L、F；H、Y；F、Y、W)，更优选地，变体镍纹蛋白在相应位置处还包含在图8中标记为较不保守的残基(较不保守的组包括：C、S、A；A、T、V；S、A、G；S、T、N、K；S、T、P、A；S、G、N、D；S、N、D、E、Q、K；N、D、E、Q、H、K；N、E、Q、H、R、K；V、L、I、M；H、F、Y)。特别地，设想了保守的半胱氨酸必须位于变体镍纹蛋白中的相应位置处。因此，在一个实施方案中，变体镍纹蛋白序列在相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置7、28、59、95、148、151、161、219、243和265处具有半胱氨酸残基。

在一个实施方案中，神经营养性多肽包含SEQ ID NO:11的共有序列。共有序列包含在人、小鼠和大鼠镍纹蛋白中保守的氨基酸残基，如图8所示。优选地，神经营养性多肽在相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置7、28、59、95、148、151、161、219、243和265处具有半胱氨酸残基。

非序列修饰可以包括例如天然存在的镍纹蛋白的部分的体内或体外化学衍生化，以及乙酰化、甲基化、磷酸化、羧化、PEG化或糖基化。正如可以替代蛋白质的取代基一样，也可以用特征在于特征类似的基团取代与蛋白质结合的官能团。此类修饰不改变一级序列。这些最初将是保守的，即替代基团将具有与原始基团大致相同的尺寸、形状、疏水性和电荷。

给定多肽中的许多氨基酸(包括末端氨基酸)可以通过天然过程(如糖基化和其他翻译后修饰)或通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。举几个例子，可以存在于本发明的多肽中的已知修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素部分的共价附接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(如精氨酸化)和泛素化。

此类修饰是技术人员熟知的，并且已经在科学文献中详细描述。几种特别常见的修饰(例如，糖基化、脂质附接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化)在大多数基础文本(例如像Creighton(1993))中有描述。关于本主题有许多详细的综述可用，例如像由Wold,F.(1983)；Seifter等人(1990)和Rattan等人(1992)提供的综述。

此外，蛋白质可以包含蛋白质标签以允许随后纯化，并且任选地使用内肽酶去除标签。标签还可以包含蛋白酶切割位点以促进随后的标签去除。亲和标签的非限制性例子包括多组氨酸标签、GST标签、HA标签、Flag标签、C-myc标签、HSV标签、V5标签、麦芽糖结合蛋白标签、纤维素结合结构域标签。优选地，对于产生和纯化，标签是多组氨酸标签。优选地，标签在蛋白质的C末端部分。

也可以替代镍纹蛋白的天然信号序列，以便在其他哺乳动物细胞类型中的重组产生中增加蛋白质的分泌。

修饰可以发生在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。实际上，通过共价修饰封闭多肽中的氨基或羧基或两者在天然存在的和合成的多肽中是常见的，并且此类修饰也可以存在于本发明的多肽中。

在多肽中发生的修饰通常将随其制备方式变化。例如，对于通过在宿主中表达克隆基因制备的多肽，修饰的性质和程度在很大程度上将由宿主细胞的翻译后修饰能力和多肽氨基酸序列中存在的修饰信号决定。例如，在细菌宿主(如大肠杆菌(E.coli))中通常不发生糖基化。因此，当需要糖基化时，多肽应当在糖基化宿主(通常是真核细胞)中表达。昆虫细胞通常进行与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化，并且由于这个原因，已经开发了昆虫细胞表达系统以有效地表达尤其具有天然糖基化模式的哺乳动物蛋白。类似的考虑适用于其他修饰。

将理解，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定多肽中的几个位点处。此外，给定多肽可以含有许多类型的修饰。

通常，如本文所用，术语多肽包含所有此类修饰，特别是存在于通过在宿主细胞中表达多核苷酸而合成的多肽中的修饰。

镍纹蛋白核苷酸序列

本发明提供了编码镍纹蛋白的基因组DNA和cDNA(包括例如人cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO:1和10)、小鼠cDNA序列(SEQ ID NO:4)和大鼠cDNA序列(SEQ ID NO:7))的医学用途。

这些序列的变体也被包括在本发明的范围内。

本发明涉及用于在治疗和/或预防化疗诱导的神经性疼痛的方法中使用的分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

i.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；

ii.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性；以及

iii.i)或ii)的至少50个连续氨基酸的生物活性片段，其中所述片段与SEQ IDNO:3至少70％相同。

在一个实施方案中，本发明涉及用于在治疗和/或预防化疗诱导的神经性疼痛的方法中使用的编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

i)SEQ ID NO:2的AA₃₀-AA₂₈₈，和在一端或两端具有来自天然序列的一至五个额外氨基酸的多肽、至多为SEQ ID NO:2的AA₂₅-AA₂₉₃；

ii)SEQ ID NO:8的AA₂₈-AA₂₈₆，和在一端或两端具有来自天然序列的一至五个额外氨基酸的多肽、至多为SEQ ID NO:8的AA₂₃-AA₂₉₁；

iii)SEQ ID NO:5的AA₃₁-AA₂₈₉，和在一端或两端具有来自天然序列的一至五个额外氨基酸的多肽、至多为SEQ ID NO:5的AA₂₆-AA₂₉₄；以及

iv)所述多肽的变体，其中所选序列中指定的任何氨基酸被改变为不同的氨基酸，条件是序列中不超过20个氨基酸残基被如此改变。

核酸分子可以包含天然存在的等位基因核酸变体的核苷酸序列。

本发明的核酸分子可以编码变体多肽，其中变体多肽具有天然存在的多肽变体的多肽序列。

在一个实施方案中，核酸分子与选自SEQ ID NO:1、4、7和10的核酸序列相差单个核苷酸。

优选地，所编码的多肽与选自SEQ ID NO:3的序列具有至少60％序列同一性，优选至少65％序列同一性，更优选至少70％序列同一性，更优选75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选地，其中多肽具有选自所述SEQ IDNO的序列。所述序列构成人镍纹蛋白。

在一个优选的实施方案中，所编码的多肽包含具有SEQ ID NO:11的共有序列。

在一个优选的实施方案中，所编码的多肽与SEQ ID NO:3具有至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少95％、更优选至少98％序列同一性，更优选地，其中所述多肽具有SEQ ID NO:3的序列。

在一个方面，核酸分子包含选自以下的核苷酸序列：

a)选自SEQ ID NO:1、4、7和10的核苷酸序列；

b)与选自SEQ ID NO:1、4、7和10的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；以及

c)选自SEQ ID NO:1、4、7和10的序列的至少150个连续核苷酸的核酸序列。

在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸与作为SEQ ID NO:1提供的多核苷酸序列具有至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％序列同一性。

在一个优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸与作为SEQ ID NO:10提供的多核苷酸序列具有至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的优选的分离的多核苷酸变体包含150-900个核酸，更优选175-900个核酸，更优选200-900个核酸，更优选225-900个核酸，更优选250-900个核酸，更优选300-900个核酸，更优选350-900个核酸，更优选400-900个核酸，更优选450-900个核酸，更优选500-900个核酸，更优选550-900个核酸，更优选600-900个核酸，更优选650-900个核酸，更优选700-900个核酸，更优选750-900个核酸，更优选800-900个核酸，更优选850-900个核酸。

一组优选的分离的多核苷酸包括SEQ ID NO:1和10，其是人镍纹蛋白cDNA序列。通常，cDNA序列比基因组序列短得多，更容易插入适当的表达载体中，并且在体内或离体转导/转染到生产细胞或人细胞中。

此外，本发明的核苷酸序列包括作为这些序列的衍生物的序列。本发明还包括载体、脂质体和其他载体媒介物，其包含这些序列之一或这些序列之一的衍生物。本发明还包括从镍纹蛋白cDNA、优选人镍纹蛋白cDNA转录和翻译的蛋白质，包括但不限于人镍纹蛋白以及衍生物和变体。

还设想了用于在所选宿主细胞中增强表达的密码子优化的核酸分子，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母物种、中国仓鼠、幼仓鼠、昆虫、真菌和人。

可以通过现有技术的诱变方法制备变体核酸。还设想了用于将来自人的编码序列与小鼠、大鼠或黑猩猩的编码序列进行改组的方法。

通过将存在于人镍纹蛋白中的氨基酸与存在于小鼠或大鼠镍纹蛋白中的氨基酸在相应位置处交换制备变体核酸，如果此氨基酸与存在于人镍纹蛋白中的氨基酸不同的话。

病毒载体

宽泛地讲，基因疗法寻求将新的遗传材料转移到患者的细胞中，从而对患者产生治疗益处。此类益处包括治疗或预防广泛范围的疾病、障碍和其他病症。

离体基因疗法方法涉及修饰分离的细胞(包括但不限于干细胞、神经和胶质前体细胞以及胎儿干细胞)，然后将其输注、移植(grafted)或以其他方式移植(transplanted)到患者中。参见例如，美国专利号4,868,116、5,399,346和5,460,959。体内基因疗法寻求在体内直接靶向宿主患者组织。

可用作基因转移载体的病毒包括乳多空病毒、腺病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和逆转录病毒。合适的逆转录病毒包括HIV、SIV、FIV、EIAV、MoMLV。又一组合适的逆转录病毒包括HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV。另一组优选的病毒载体包括甲病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头瘤病毒、Mo-MLV，优选腺相关病毒。

用于治疗神经系统障碍的优选病毒是慢病毒和腺相关病毒。这两种类型的病毒都可以在不进行细胞分裂的情况下整合到基因组中，并且这两种类型都已经在神经系统、特别是中枢神经系统的适应证的临床前动物研究中进行了测试。

本领域(例如，US 5,677,158)描述了用于制备AAV的方法。US 6,309,634和US 6,683,058描述了将AAV递送至中枢神经系统的例子。

优选地，慢病毒载体是复制缺陷型慢病毒颗粒。这种慢病毒颗粒可以由慢病毒载体产生，所述慢病毒载体包含5'慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、可操作地连接至编码所述融合蛋白的多核苷酸信号的启动子、第二链DNA合成的起点和3'慢病毒LTR。用于制备慢病毒并将其体内施用至神经细胞的方法描述于US20020037281(用于使用慢病毒载体转导神经细胞的方法(Methods for transducing neural cells using lentiviralvectors))中。

逆转录病毒载体是人类临床试验中最常用的载体，因为它们携带7-8kb，并且因为它们具有感染细胞和使其遗传材料高效地、稳定地整合到宿主细胞中的能力。参见例如，WO95/30761；WO 95/24929。肿瘤病毒亚科(Oncovirinae)需要至少一轮靶细胞增殖，用于将外源核酸序列转移和整合到患者中。逆转录病毒载体随机整合到患者的基因组中。逆转录病毒可以用于靶向神经系统的干细胞，因为在神经系统(特别是CNS)的其他细胞中很少发生细胞分裂。

已经描述了三种类别的逆转录病毒颗粒；同向性的，其可以有效地感染鼠细胞；和兼向性的，其可以感染许多物种的细胞。第三类别包括异向性逆转录病毒，其可以感染与产生病毒的物种不同的另一种物种的细胞。它们仅整合到分裂细胞的基因组中的能力已经使得逆转录病毒在发育研究中标记细胞谱系以及将治疗性或自杀基因递送至癌症或肿瘤方面具有吸引力。

为了在人类患者中使用，逆转录病毒载体必须是复制缺陷型的。这防止在靶组织中进一步产生感染性逆转录病毒颗粒——相反，复制缺陷型载体变为稳定掺入靶细胞基因组中的“俘虏(captive)”转基因。通常，在复制缺陷型载体中，gag、env和pol基因已经被缺失(连同大部分剩余的病毒基因组)。插入异源DNA代替缺失的病毒基因。异源基因可以在内源异源启动子、在靶细胞中有活性的另一种异源启动子或逆转录病毒5'LTR(病毒LTR在多种组织中有活性)的控制下。通常，逆转录病毒载体具有约7-8kb的转基因能力。

复制缺陷型逆转录病毒载体需要从例如工程化包装细胞系提供反式复制和组装所必需的病毒蛋白。重要的是，包装细胞不释放有复制能力的病毒和/或辅助病毒。这已经通过从缺乏ψ信号的RNA表达病毒蛋白并且从单独的转录单元表达gag/pol基因和env基因来实现。此外，在一些2代和3代逆转录病毒中，5’LTR已经被控制这些基因的表达的非病毒启动子替代，并且3'启动子已经被最小化以仅含有近端启动子。这些设计使导致产生有复制能力的载体或辅助病毒的重组的可能性最小化。

表达载体

用以重组表达用于在本发明中使用的镍纹蛋白多肽的载体的构建可以使用不需要对本领域普通技术人员进行详细解释的常规技术来完成。然而，关于综述，普通技术人员可能希望查询等人(1982)。表达载体可以用于产生用以重组产生用于医学用途的镍纹蛋白多肽的生产细胞，以及用于产生分泌用于裸或包封疗法的镍纹蛋白多肽的治疗性细胞。

简而言之，重组表达载体的构建采用标准连接技术。为了进行分析以确认所构建的载体中的正确序列，使用例如Messing等人(1981)的方法、Maxam等人(1980)的方法或本领域技术人员将已知的其他合适的方法对基因进行测序。

使用常规凝胶电泳进行切割片段的大小分离，例如由Maniatis等人(第133-134页,1982)所述。

为了产生有效的表达载体，这些应当含有以正确的阅读框表达编码基因所必需的调节序列。在转录、翻译或翻译后水平上控制基因的表达。转录起始是基因表达的早期且关键的事件。这取决于启动子和增强子序列，并且受到与这些序列相互作用的特定细胞因子的影响。许多基因的转录单元由启动子组成，并且在一些情况下由增强子或调节子元件组成(Banerji等人(1981)；Corden等人(1980)；以及Breathnach和Chambon(1981))。对于逆转录病毒，参与逆转录病毒基因组复制的控制元件位于长末端重复序列(LTR)中(Weiss等人(1982))。莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR含有启动子和增强子序列(Jolly等人(1983)；Capecchi等人(1991))。其他强效启动子包括衍生自巨细胞病毒(CMV)的启动子和其他野生型病毒启动子。

还已经描述了许多非病毒启动子的启动子和增强子区域(Schmidt等人(1985)；Rossi和deCrombrugghe(1987))。用于维持和增加转基因在静止期细胞中的表达的方法包括使用包括以下在内的启动子：I型胶原(1和2)(Prockop和Kivirikko(1984)；Smith和Niles(1980)；de Wet等人(1983))、SV40和LTR启动子。

根据本发明的一个实施方案，启动子是选自以下的组成型启动子：泛素启动子、CMV启动子、JeT启动子(US 6,555,674)、SV40启动子、延伸因子1α启动子(EF1α)、RSV、CAG。诱导型/阻遏型启动子的例子包括：Tet-On、Tet-Off、雷帕霉素诱导型启动子、Mx1、Mo-MLV-LTR、孕酮、RU486。

一组优选的启动子包括CAG、CMV、人UbiC、JeT、SV40、RSV、Tet调控型启动子、Mo-MLV-LTR、Mx1、Mt1和EF-1α。

除了使用病毒和非病毒启动子驱动转基因表达之外，增强子序列也可以用于增加转基因表达的水平。增强子不仅可以增加其天然基因的转录活性，而且可以增加一些外来基因的转录活性(Armelor(1973))。例如，在本发明中，胶原增强子序列可以与胶原启动子2(I)一起使用以增加转基因表达。此外，在SV40病毒中发现的增强子元件可以用于增加转基因表达。此增强子序列由72个碱基对的重复序列组成，如由Gruss等人(1981)；Benoist和Chambon(1981)以及Fromm和Berg(1982)所述，将其全部通过引用并入本文。当此重复序列与各种启动子串联存在时，它可以增加许多不同病毒和细胞基因的转录(Moreau等人(1981))。

其他表达增强序列包括但不限于土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件、WPRE、SP163、CMV增强子和鸡[β]-珠蛋白绝缘子或其他绝缘子。

细胞系

在一个方面，本发明涉及用根据本发明的载体遗传修饰的分离的宿主细胞。

本发明还涉及适合于经由裸细胞或包封细胞生物递送镍纹蛋白的细胞，其被遗传修饰以过表达镍纹蛋白，并且可以移植至患者，以局部递送生物活性镍纹蛋白多肽。此类细胞可以被宽泛地称为治疗性细胞。

对于离体基因疗法，优选组的细胞包括神经元细胞、神经元前体细胞、神经元祖细胞、神经元干细胞、人胶质干细胞、人前体细胞、干细胞和胎儿细胞。

对于包封，优选的细胞包括视网膜色素上皮细胞，包括ARPE-19细胞；人永生化成纤维细胞；和人永生化星形胶质细胞。

ARPE-19细胞系是用于基于包封细胞的递送技术的优异的平台细胞系，并且还可用于基于未包封细胞的递送技术。ARPE-19细胞系是稳健的(即，细胞系在严格条件(如植入中枢神经系统或眼内环境中)下可以存活)。ARPE-19细胞可以被遗传修饰以分泌有治疗意义的物质。ARPE-19细胞具有相对较长的寿命。ARPE-19细胞是人起源的。此外，包封的ARPE-19细胞具有良好的体内装置活力。ARPE-19细胞可以递送有效量的生长因子。ARPE-19细胞引发可忽略的宿主免疫反应。此外，ARPE-19细胞是非致瘤性的。用于培养和包封ARPE-19细胞的方法描述于US 6,361,771中。

在另一个实施方案中，治疗性细胞系选自：人成纤维细胞细胞系、人星形胶质细胞细胞系、人中脑细胞系和人内皮细胞系，优选地用TERT、SV40T或vmyc永生化。

细胞外基质

本发明进一步包括在植入哺乳动物神经系统前，在细胞外基质上体外培养产生镍纹蛋白的细胞。在植入前细胞对微载体的预粘附旨在增强移植细胞的长期活力，并且提供长期功能益处。

可以构成细胞外基质的材料包括在体外孵育后细胞粘附至其上的那些材料和细胞可以在其上生长的那些材料，以及可以植入哺乳动物体内而不产生会破坏植入细胞或以其他方式干扰它们的生物或治疗活性的毒性反应或炎症反应的那些材料。此类材料可以是合成的或天然的化学物质，或者具有生物起源的物质。

基质材料包括但不限于玻璃和其他硅氧化物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、聚氨酯、聚海藻酸酯、聚砜、聚乙烯醇、丙烯腈聚合物、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚戊烯、尼龙、淀粉酶、天然和改性明胶以及天然和改性胶原、天然和改性多糖(包括右旋糖酐和纤维素(例如，硝酸纤维素))、琼脂以及磁铁矿。可以使用可再吸收的或不可再吸收的材料。还预期的是本领域熟知的细胞外基质材料。细胞外基质材料可以商购获得，或者通过以下方式来制备：使分泌这种基质的细胞生长，去除分泌细胞，并且允许待移植的细胞与基质相互作用并粘附至基质。待植入的细胞在其上生长或细胞与其混合的基质材料可以是RPE细胞的固有产物。因此，例如，基质材料可以是细胞外基质或基底膜材料，其由待植入的RPE细胞产生和分泌。

为了改善细胞粘附、存活和功能，固体基质可以任选地在其外表面上涂覆有本领域已知的促进细胞粘附、生长或存活的因子。此类因子包括细胞粘附分子、细胞外基质(例如像纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖或蛋白聚糖)或生长因子。

可替代地，如果植入细胞附接至其上的固体基质是由多孔材料构建的，则可以将一种或多种生长或存活促进因子掺入基质材料中，在体内植入后它们将从其中缓慢释放。

支持物的构造优选地是球形的(如呈珠状)，但是可以是圆柱形的、椭圆形的、扁平的片状或条状、针或销形等。支持基质的优选形式是玻璃珠。另一种优选的珠是聚苯乙烯珠。

珠尺寸的直径的范围可以为约10μm至1mm，优选约90μm至约150μm。关于各种微载体珠的描述，参见例如Fisher Biotech Source 87-88,Fisher Scientific Co.,1987,第72-75页；Sigma Cell Culture Catalog,Sigma Chemical Co.,St,Louis,1991,第162-163页；Ventrex Product Catalog,Ventrex Laboratories,1989；将这些参考文献通过引用特此并入。珠尺寸的上限可以由珠对不期望的宿主反应的刺激来决定，不期望的宿主反应可能干扰移植细胞的功能或对周围组织造成损伤。珠尺寸的上限也可以由施用方法决定。此类限制是本领域技术人员容易确定的。

实施例

实施例1：用镍纹蛋白先驱性治疗逆转PTX诱导的神经性疼痛

材料和方法：

将平均体重为23g的雌性ICR/C57Bl6J小鼠(每组n＝8)分成三组；1：紫杉醇(PTX)和媒介物，2：PTX和重组镍纹蛋白(0.5mg/kg)，以及3：PTX和重组镍纹蛋白(1.8mg/kg)。如图1所示，使用胰岛素注射筒(30G)每隔一天(D1、D3、D5、D7和D9)皮下(s.c)注射施用媒介物(杜尔贝科PBS(Dulbecco’s PBS))或重组镍纹蛋白(0.5mg/kg或1.8mg/kg)。将在Kholepher-乙醇中的PTX(1:1)在杜尔贝科PBS中稀释，并且经由腹膜内注射以4mg/kg的剂量每隔一天(D2、D4、D6和D8)施用，总剂量为16mg/kg。在开始实验前，使小鼠熟悉2h透明的丙烯酸行为室。使用校准的von Frey细丝在基线处测试缩爪阈值(PWT)，然后每隔一天进行测试，直至第57天，作为机械性痛觉超敏的替代标记物。在第24天，对每个治疗组的4只动物实施安乐死用于组织学染色(结果总结在实施例2中)。使用混合效应方差分析进行组间统计学分析。所有数据都表示为平均值+/-SEM，p<0.05被认为是显著的。

结果：

如图2所示，在第4天，所有小鼠都发生了由PTX治疗诱导的稳健的机械性痛觉超敏。在连续间歇地施用重组镍纹蛋白的情况下，分别在第10天和第8天观察到0.5mg/kg(灰色正方形)和1.8mg/kg(黑色三角形)的PWT增加。之后，分别在第20天(P<0.001)和第16天(P<0.0001)获得0.5mg/kg和1.8mg/kg剂量的PWT的完全逆转。在整个实验持续时间内总体上维持了这种效果。然而，从第32天起，在媒介物治疗小鼠中，PWT开始逐渐增加至基线水平，其暗示是在PTX小鼠中，镍纹蛋白介导的PWT逆转仅保持显著直至第35天。

结论：

在开始给药后数天内，通过重复皮下注射重组镍纹蛋白预防性治疗剂量依赖性地逆转了紫杉醇诱导的机械性痛觉超敏。此外，尽管到第8天完成了镍纹蛋白治疗，但这种逆转持续，从而防止神经性超敏反应的任何复发。

实施例2：用镍纹蛋白先驱性治疗防止紫杉醇诱导的背根神经节内过度兴奋标记物的免疫组织化学变化

材料和方法：

用异氟烷(4％)麻醉小鼠，并且通过断头术对其实施安乐死。将组织在干冰上的O.C.T.中快速冷冻，并且将DRG的切片(20μm)封片到SuperFrost Plus载玻片(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)上。然后将它们在冰冷的10％福尔马林中固定15min，随后在渐增百分比(50％、70％、100％)的乙醇中孵育5min。然后将载玻片在室温下伴随轻轻振荡/搅动转移至封闭溶液(10％正常山羊血清，0.3％ Triton-X 100，在0.1M磷酸盐缓冲液(PB)中)中持续1h。将切片在于封闭溶液中稀释的一抗(外周蛋白、谷氨酰胺合成酶、连接蛋白43)中在室温下孵育3h或在4℃下孵育过夜。将切片在0.1M PB中洗涤五次，然后在室温下在于含有DAPI的封闭溶液中稀释的二抗中孵育1h。将切片在0.1M PB中洗涤五次，封片到载玻片上，使用Prolong Gold Antifade(Thermo Fisher Scientific，P36930)盖片，并且用指甲油密封。使用Olympus FluoView 1200共聚焦显微镜拍摄图像。使用Cellsens(Olympus)对从每个治疗组的3-4只动物获得的免疫组织化学图像进行分析。

结果：

神经性损伤后卫星胶质细胞与神经元胞体之间的连通性增加有助于DRG组织内的电耦合和兴奋性增加，这反过来表现为神经性疼痛的体征。图3表明紫杉醇(PTX)介导的谷氨酰胺合成酶(GS)的表达通过重组镍纹蛋白治疗而被减少，GS是卫星胶质细胞的特异性标记物。连接蛋白43是一种关键的间隙连接蛋白，其对损伤后DRG神经元的过度兴奋起重要的促进作用(Kim等人,2016)。图3说明PTX诱导的连接蛋白43(其包封DRG组织内的外周蛋白染色的神经元胞体)表达通过用重组镍纹蛋白先驱性治疗而被防止。

结论：

谷氨酰胺合成酶和连接蛋白43是在DRG组织内发生的PTX诱导的过度兴奋变化的替代标记物，其与行为神经性超敏反应相关。在重复皮下注射重组镍纹蛋白后两种蛋白质表达的减少表明，减弱的神经元-胶质细胞耦合是被重组镍纹蛋白靶向以介导CINP的痛觉缺失的潜在病理生理机制。

实施例3：用镍纹蛋白先驱性治疗防止紫杉醇治疗雌性小鼠的皮肤内表皮内神经纤维的损失。

材料和方法：

将皮肤切片在10％福尔马林溶液中后固定24h，随后在30％蔗糖溶液中后固定48h。使用冷冻切片机(cryostat)切割20μm皮肤切片，随后使用在0.2M HCl中的0.15mg/ml胃蛋白酶进行抗原修复步骤。如实施例2中所述，将切片在0.1M PB中洗涤三次，并且转移至一抗溶液(PGP9.5)中进行免疫组织化学处理，以促进表皮内神经纤维(IENF)的染色。如实施例2的材料和方法中所述，使用Cellsens软件对图像进行分析。

结果：

除了产生稳健的行为痛觉过敏之外，在小鼠中用紫杉醇治疗还导致小鼠足垫皮肤的IENF损失(Singhmar等人,2018)。这反映了在一些临床神经性疼痛病症中IENF的相应损失。图4显示在用0.5mg/kg和1.8mg/kg两种剂量的重组镍纹蛋白治疗的小鼠中，穿过表皮基底膜的IENF比媒介物治疗小鼠既更长又染色更强烈。

结论：

通过重复皮下注射重组镍纹蛋白先驱性治疗防止了紫杉醇治疗雌性小鼠的受后爪皮肤神经支配的IENF的损失，反映了重组镍纹蛋白在CINP中的病情改善作用。

实施例4：用镍纹蛋白干预性治疗逆转紫杉醇诱导的神经性疼痛

材料和方法：

将成年ICR/C57Bl6J小鼠(每组n＝7-8)用于图5所示的2个相同设计的实验中，其中第一个实验使用雌性(体重27g)，并且第二个实验使用雄性(体重34g)。如图5所示，将在Kholepher-乙醇中的PTX(1:1)在杜尔贝科PBS中稀释，并且经由腹膜内注射以4mg/kg的剂量每隔一天(D2、D4、D6和D8)施用，总剂量为16mg/kg。在第10天，将小鼠分成三组；紫杉醇(PTX)和媒介物，PTX和重组镍纹蛋白(0.5mg/kg)，以及PTX和重组镍纹蛋白(1.8mg/kg)。使用胰岛素注射筒(30G)每隔一天(第10天、D12、D14、D16和D18)皮下(s.c)注射施用媒介物(杜尔贝科PBS)或重组镍纹蛋白(0.5mg/kg或1.8mg/kg)。在开始实验前，使小鼠熟悉2h透明的丙烯酸行为室。使用校准的von Frey细丝每隔一天(在不进行注射的天数)测试机械性痛觉超敏。在小鼠群组上测试机械性痛觉超敏，直至所有小鼠都达到基线。在第24天，对每个治疗组的4只动物实施安乐死用于组织学染色。使用混合效应方差分析进行组间统计学分析。所有数据都表示为平均值+/-SEM，p<0.05被认为是显著的。

结果：

出于分析目的，将来自使用雌性和雄性小鼠的单独干预实验的数据合并。如图6所示，在第一次注射PTX后，小鼠已经开始发生后爪机械性痛觉超敏。在第四次PTX注射后，PWT的降低到第9天达到最大值。在第一次注射重组镍纹蛋白后，与媒介物治疗相比，0.5mg/kg和1.8mg/kg两个治疗组都显示出PWT的显著逆转。此逆转在整个重组镍纹蛋白治疗持续时间内以及在其停止后持续。值得注意的是，在重组镍纹蛋白治疗小鼠中，PTX诱导的机械性痛觉超敏的逆转持续直至第48天。

结论：

在开始给药后的数天内，通过重复皮下注射低剂量和高剂量的重组镍纹蛋白干预性治疗都完全逆转了紫杉醇诱导的机械性痛觉超敏。此外，尽管到第18天完成了重组镍纹蛋白治疗，但这种逆转持续，从而防止神经性超敏反应的任何复发。

实施例5：用镍纹蛋白干预性治疗逆转紫杉醇诱导的背根神经节内过度兴奋标记物的免疫组织化学变化

材料和方法：

如实施例2中所述，在第24天，从先前用皮下媒介物(n＝3)或皮下重组镍纹蛋白(0.5mg/kg和1.8mg/kg，每组n＝3)治疗的雌性(总计n＝9)和雄性(总计n＝9)PTX小鼠获得DRG组织，并且进行并分析外周蛋白(未示出)、谷氨酰胺合成酶和连接蛋白43的免疫组织化学。

结果：

神经性损伤后卫星胶质细胞与神经元胞体之间的连通性增加有助于DRG组织内的电耦合和兴奋性增加，这反过来表现为神经性疼痛的体征。图7表明在雌性和雄性小鼠两者中，紫杉醇介导的谷氨酰胺合成酶(GS)的表达通过重组镍纹蛋白治疗而被减少，GS是卫星胶质细胞的特异性标记物。连接蛋白43是一种关键的间隙连接蛋白，其对损伤后DRG神经元的过度兴奋起重要的促进作用(Kim等人,2016)。图7说明在雌性和雄性小鼠两者中，PTX诱导的连接蛋白43(其包封DRG组织内的外周蛋白染色的神经元胞体)表达通过用重组镍纹蛋白治疗而被减少。

结论：

谷氨酰胺合成酶和连接蛋白43是在DRG组织内发生的PTX诱导的过度兴奋变化的替代标记物，其与行为神经性超敏反应相关。在重复干预性皮下注射重组镍纹蛋白后两种蛋白质表达的减少表明，在雌性和雄性小鼠两者中，减弱的神经元-胶质细胞耦合是被重组镍纹蛋白靶向以介导CINP的痛觉缺失的潜在病理生理机制。

序列概述

SEQ ID NO:1：人镍纹蛋白cDNA

SEQ ID NO:2：人镍纹蛋白全长氨基酸序列

SEQ ID NO:3：没有信号肽的人镍纹蛋白氨基酸序列

SEQ ID NO:4：小鼠镍纹蛋白cDNA

SEQ ID NO:5：小鼠镍纹蛋白全长氨基酸序列

SEQ ID NO:6：没有信号肽的小鼠镍纹蛋白氨基酸序列

SEQ ID NO:7：大鼠镍纹蛋白cDNA

SEQ ID NO:8：大鼠镍纹蛋白全长氨基酸序列

SEQ ID NO:9：没有信号肽的大鼠镍纹蛋白氨基酸序列

SEQ ID NO:10：人密码子优化的DNA序列

SEQ ID NO:11：成熟镍纹蛋白共有序列

人镍纹蛋白cDNA(1109bp；CDS＝118-999)(SEQ ID NO:1)

>gi|34147349|ref|NM_024042.2|智人(Homo sapiens)假定蛋白MGC2601(MGC2601)，mRNA

GCTTCGCCGGGGCCGGGCGGCCGGCGCCCCCGGCTGCTCCCGCCGCCGCCCGGACCCGCGCCCCGCCGGGGCAGCGGTGGTGAGAGCCCCGACTCCCCGGACGCCGCCCGCCGTGCCATGGGGTTCCCGGCCGCGGCGCTGCTCTGCGCGCTGTGCTGCGGCCTCCTGGCCCCGGCTGCCCGCGCCGGCTACTCCGAGGAGCGCTGCAGCTGGAGGGGCAGCGGCCTCACCCAGGAGCCCGGCAGCGTGGGGCAGCTGGCCCTGGCCTGTGCGGAGGGCGCGGTTGAGTGGCTGTACCCGGCTGGGGCGCTGCGCCTGACCCTGGGCGGCCCCGATCCCAGAGCGCGGCCCGGCATCGCCTGTCTGCGGCCGGTGCGGCCCTTCGCGGGCGCCCAGGTCTTCGCGGAGCGCGCAGGGGGCGCCCTGGAGCTGCTGCTGGCCGAGGGCCCGGGCCCGGCAGGGGGCCGCTGCGTGCGCTGGGGTCCCCGCGAGCGCCGGGCCCTCTTCCTGCAGGCCACGCCGCACCAGGACATCAGCCGCCGCGTGGCCGCCTTCCGCTTTGAGCTGCGCGAGGACGGGCGCCCCGAGCTGCCCCCGCAGGCCCACGGTCTCGGCGTAGACGGTGCCTGCAGGCCCTGCAGCGACGCTGAGCTGCTCCTGGCCGCATGCACCAGCGACTTCGTAATTCACGGGATCATCCATGGGGTCACCCATGACGTGGAGCTGCAGGAGTCTGTCATCACTGTGGTGGCCGCCCGTGTCCTCCGCCAGACACCGCCGCTGTTCCAGGCGGGGCGATCCGGGGACCAGGGGCTGACCTCCATTCGTACCCCACTGCGCTGTGGCGTCCACCCGGGCCCAGGCACCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGCTTTGGGGAGGCCCGGCTGGGCTGTGCCCCACGATTCCAGGAGTTCCGCCGTGCCTACGAGGCTGCCCGTGCTGCCCACCTCCACCCCTGCGAGGTGGCGCTGCACTGAGGGGCTGGGTGCTGGGGAGGGGCTGGTAGGAGGGAGGGTGGGCCCACTGCTTTGGAGGTGATGGGACTATCAATAAGAACTCTGTTCACGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

人镍纹蛋白全长氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

>IPI00031531.1REFSEQ_NP:NP_076947TREMBL:Q9UJH9

ENSEMBL:ENSP00000219542 Tax_Id＝9606C380A1.2.1(新型蛋白)

人镍纹蛋白，没有信号肽的蛋白质(SEQ ID NO:3)

小鼠镍纹蛋白cDNA，1363bp，CDS 84..959(SEQ ID NO:4)

NM_133719.小家鼠(Mus musculus)镍纹蛋白.[gi:56550040]

小鼠镍纹蛋白全长氨基酸序列(SEQ ID NO:5)

ref|NP_598480.1|镍纹蛋白[小家鼠]

小鼠镍纹蛋白，没有信号肽的蛋白质(SEQ ID NO:6)

大鼠镍纹蛋白cDNA(1026bp；CDS＝1-876)(SEQ ID NO:7)

>gi|34870570|ref|XM_213261.2|褐家鼠(Rattus norvegicus)类似于1810034B16Rik蛋白(LOC287151)，mRNA

ATGCTGGTAGCGGCGCTTCTCTGCGCGCTGTGCTGCGGCCTCTTGGCTGCGTCCGCTCGAGCTGGCTACTCCGAGGACCGCTGCAGCTGGAGGGGCAGCGGTTTGACCCAGGAACCTGGCAGCGTGGGGCAGCTGACCCTGGATTGTACTGAGGGTGCTATCGAGTGGCTGTATCCAGCTGGGGCGCTGCGCCTGACTCTAGGCGGCTCTGATCCGGGCACGCGGCCCAGCATCGTCTGTCTGCGCCCAACACGGCCCTTCGCTGGTGCCCAGGTCTTCGCTGAACGGATGGCCGGCAACCTAGAGTTGCTACTGGCCGAGGGCCAAGGCCTGGCTGGGGGCCGCTGCATGCGCTGGGGTCCTCGCGAGCGCCGAGCCCTTTTCCTGCAGGCCACGCCACACCGGGACATCAGCCGCAGAGTTGCTGCCTTCCAATTTGAACTGCACGAGGACCAACGTGCAGAAATGTCTCCCCAGGCCCAAGGTTTTGGTGTGGATGGTGCCTGCAGGCCCTGCAGTGATGCCGAGCTCCTTCTGACTGCATGCACCAGTGACTTTGTGATCCATGGGACCATCCATGGGGTCGTCCATGACATGGAGCTGCAAGAATCAGTCATCACTGTGGTGGCCACTCGTGTCATCCGCCAGACACTGCCACTGTTCCAGGAAGGGAGCTCGGAGGGCCGGGGCCAGGCCTCCGTTCGTACCTTGTTGCGCTGTGGTGTGCGTCCTGGCCCAGGCTCCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGATTTGGCGAAGCTTGGCTGGGCTGCGCTCCCCGCTTCCAAGAGTTCAGCCGTGTCTATTCAGCTGCTCTCGCGGCCCACCTCAACCCATGTGAGGTGGCACTGGACTGAGAGACCTGGGAGCAAGCCCTGGATGGATCTTCCTCTGGGGATGGGGTGTTGGGGAGGGGTGATAGGAGGGTGGGTGGGAAGGGTGTGGCTCAGATGGCATCCTGGTACCCACAGTGAGGTGGTAGAATACTAAATAACCTGGATCACACC

大鼠镍纹蛋白全长氨基酸序列(SEQ ID NO:8)

>IPI00369281.1|REFSEQ_XP:XP_213261|ENSEMBL:ENSRNOP00000026676

大鼠镍纹蛋白，没有信号肽的蛋白质(SEQ ID NO:9)

存在于构建体pCAn.镍纹蛋白和pT2.CAn.镍纹蛋白中的密码子优化的镍纹蛋白核 苷酸序列(SEQ ID NO:10)

ATGGGCTTTCCCGCTGCCGCCCTGCTGTGCGCTCTGTGCTGCGGACTGCTGGCTCCTGCAGCCAGAGCCGGCTACAGCGAGGAACGGTGCAGCTGGCGGGGCAGCGGCCTGACCCAGGAACCTGGCAGCGTCGGCCAGCTCGCACTGGCCTGTGCAGAAGGCGCCGTGGAGTGGCTGTACCCCGCAGGCGCCCTGAGACTGACCCTGGGCGGACCCGACCCCAGAGCCAGACCCGGCATTGCCTGTCTGAGGCCCGTGCGGCCTTTCGCTGGCGCCCAGGTGTTCGCCGAGAGAGCCGGCGGAGCCCTGGAACTCCTGCTCGCCGAAGGCCCTGGTCCAGCCGGCGGAAGATGCGTGAGATGGGGCCCAAGAGAGCGGAGAGCCCTGTTCCTGCAAGCCACCCCCCACCAGGACATCAGCAGACGGGTGGCCGCCTTCAGATTCGAGCTGCGGGAGGACGGTAGACCCGAGCTGCCACCTCAGGCCCACGGACTGGGAGTGGACGGCGCCTGCAGACCCTGTAGCGACGCCGAGCTGCTGCTCGCCGCCTGCACCAGCGACTTCGTGATCCACGGCATCATCCACGGCGTGACCCACGACGTGGAGCTGCAGGAAAGCGTCATCACCGTCGTCGCCGCCAGAGTGCTGAGACAGACCCCCCCTCTGTTCCAGGCCGGCAGAAGCGGCGACCAGGGCCTGACCAGCATCCGGACCCCCCTGAGATGCGGCGTGCATCCCGGACCCGGCACCTTCCTGTTCATGGGCTGGTCCAGATTCGGCGAGGCCCGGCTGGGCTGCGCTCCCCGGTTCCAGGAATTCAGACGGGCCTACGAGGCCGCCAGGGCCGCTCATCTGCACCCCTGCGAGGTGGCCCTGCATTGA

共有序列，成熟镍纹蛋白(SEQ ID NO:11)

X是可以由DNA编码的21种氨基酸中的任一种。

参考文献

et al.,Characterization of Meteorin-An evolutionary conservedneurotrophic factor,J mol Neurosci 2009Sep；39(1-2):104-116.

Kim Y.S.et al.,Coupled Activation of Primary Sensory NeuronsContributes to Chronic Pain.Neuron.2016,91(5),1085-1096.

Nishino et al.,"Meteorin:a secreted protein that regulates glial celldifferentiation and promotes axonal extension",EMBO J.,23(9):1998-2008(2004).

Johnson et al.,Nat.Med.,2:795-799(1996)

Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221-1223(1993)

Hora et al.,Bio/Technology,8:755-758(1990)

Cleland,"Design and Production of Single Immunization Vaccines UsingPolylactide Polyglycolide Microsphere Systems,"in Vaccine Design:The Subunitand Adjuvant Approach,Powell and Newman,eds,(Plenum Press:New York,1995),pp.439-462

Reagan-Shaw et al.,FASEB J,22,659-661(2007)

Creighton,Proteins-Structure and Molecular Properties,2nd Ed.,W.H.Freeman and Company,New York,1993.

Wold,F.,in Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pp 1-12,1983

Seifter et al.,Meth.Enzymol.182:626-646,1990

Rattan et al.,Protein Synthesis:Posttranslational Modifications andAging,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62,1992

Maniatis et al.,in Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,(NY 1982)

Messing,et al.,(Nucleic Acids Res.,9:309-,1981),

Maxam,et al.,(Methods in Enzymology,65:499,1980).

Banerji et al.,Cell 27:299(1981)

Corden et al.,Science 209:1406(1980)

Breathnach and Chambon,Ann.Rev.Biochem.50:349(1981)).

Weiss et al.,eds.,The molecular biology of tumor viruses:RNA tumorviruses,Cold Spring Harbor Laboratory,(NY 1982)).

Jolly et al.,Nucleic Acids Res.11:1855(1983)

Capecchi et al.,In:Enhancer and eukaryotic gene expression,Gulzmanand Shenk,eds.,pp.101-102,Cold Spring Harbor Laboratories(NY 1991)

Schmidt et al.,Nature 314:285(1985)

Rossi and deCrombrugghe,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5590-5594(1987)).

Prockop and Kivirikko,N.Eng.J.Med.311:376(1984)

Smith and Niles,Biochem.19:1820(1980)

de Wet et al.,J.Biol.Chem.,258:14385(1983)

Gruss et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:943(1981)

Benoist and Chambon,Nature 290:304(1981)

Fromm and Berg,J.Mol.Appl.Genetics,1:457(1982).

Moreau et al.,Nucleic Acids Res.9:6047(1981)

Armelor,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70:2702(1973)

Fisher Biotech Source 87-88,Fisher Scientific Co.,1987,pp.72-75

Sigma Cell Culture Catalog,Sigma Chemical Co.,St,Louis,1991,pp.162-163

Ventrex Product Catalog,Ventrex Laboratories,1989.

序列表

<110> 霍巴治疗公司

<120> 化疗诱导的神经性疼痛的预防和治疗

<130> P5897PC00

<160> 11

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1109

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (118)..(999)

<400> 1

gcttcgccgg ggccgggcgg ccggcgcccc cggctgctcc cgccgccgcc cggacccgcg 60

ccccgccggg gcagcggtgg tgagagcccc gactccccgg acgccgcccg ccgtgcc 117

atg ggg ttc ccg gcc gcg gcg ctg ctc tgc gcg ctg tgc tgc ggc ctc 165

Met Gly Phe Pro Ala Ala Ala Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly Leu

1 5 10 15

ctg gcc ccg gct gcc cgc gcc ggc tac tcc gag gag cgc tgc agc tgg 213

Leu Ala Pro Ala Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Glu Arg Cys Ser Trp

20 25 30

agg ggc agc ggc ctc acc cag gag ccc ggc agc gtg ggg cag ctg gcc 261

Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Ala

35 40 45

ctg gcc tgt gcg gag ggc gcg gtt gag tgg ctg tac ccg gct ggg gcg 309

Leu Ala Cys Ala Glu Gly Ala Val Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala

50 55 60

ctg cgc ctg acc ctg ggc ggc ccc gat ccc aga gcg cgg ccc ggc atc 357

Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly Pro Asp Pro Arg Ala Arg Pro Gly Ile

65 70 75 80

gcc tgt ctg cgg ccg gtg cgg ccc ttc gcg ggc gcc cag gtc ttc gcg 405

Ala Cys Leu Arg Pro Val Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala

85 90 95

gag cgc gca ggg ggc gcc ctg gag ctg ctg ctg gcc gag ggc ccg ggc 453

Glu Arg Ala Gly Gly Ala Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly

100 105 110

ccg gca ggg ggc cgc tgc gtg cgc tgg ggt ccc cgc gag cgc cgg gcc 501

Pro Ala Gly Gly Arg Cys Val Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala

115 120 125

ctc ttc ctg cag gcc acg ccg cac cag gac atc agc cgc cgc gtg gcc 549

Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Gln Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala

130 135 140

gcc ttc cgc ttt gag ctg cgc gag gac ggg cgc ccc gag ctg ccc ccg 597

Ala Phe Arg Phe Glu Leu Arg Glu Asp Gly Arg Pro Glu Leu Pro Pro

145 150 155 160

cag gcc cac ggt ctc ggc gta gac ggt gcc tgc agg ccc tgc agc gac 645

Gln Ala His Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp

165 170 175

gct gag ctg ctc ctg gcc gca tgc acc agc gac ttc gta att cac ggg 693

Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly

180 185 190

atc atc cat ggg gtc acc cat gac gtg gag ctg cag gag tct gtc atc 741

Ile Ile His Gly Val Thr His Asp Val Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile

195 200 205

act gtg gtg gcc gcc cgt gtc ctc cgc cag aca ccg ccg ctg ttc cag 789

Thr Val Val Ala Ala Arg Val Leu Arg Gln Thr Pro Pro Leu Phe Gln

210 215 220

gcg ggg cga tcc ggg gac cag ggg ctg acc tcc att cgt acc cca ctg 837

Ala Gly Arg Ser Gly Asp Gln Gly Leu Thr Ser Ile Arg Thr Pro Leu

225 230 235 240

cgc tgt ggc gtc cac ccg ggc cca ggc acc ttc ctc ttc atg ggc tgg 885

Arg Cys Gly Val His Pro Gly Pro Gly Thr Phe Leu Phe Met Gly Trp

245 250 255

agc cgc ttt ggg gag gcc cgg ctg ggc tgt gcc cca cga ttc cag gag 933

Ser Arg Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu

260 265 270

ttc cgc cgt gcc tac gag gct gcc cgt gct gcc cac ctc cac ccc tgc 981

Phe Arg Arg Ala Tyr Glu Ala Ala Arg Ala Ala His Leu His Pro Cys

275 280 285

gag gtg gcg ctg cac tga ggggctgggt gctggggagg ggctggtagg 1029

Glu Val Ala Leu His

290

agggagggtg ggcccactgc tttggaggtg atgggactat caataagaac tctgttcacg 1089

caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1109

<210> 2

<211> 293

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<400> 2

Met Gly Phe Pro Ala Ala Ala Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly Leu

1 5 10 15

Leu Ala Pro Ala Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Glu Arg Cys Ser Trp

20 25 30

Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Ala

35 40 45

Leu Ala Cys Ala Glu Gly Ala Val Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala

50 55 60

Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly Pro Asp Pro Arg Ala Arg Pro Gly Ile

65 70 75 80

Ala Cys Leu Arg Pro Val Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala

85 90 95

Glu Arg Ala Gly Gly Ala Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly

100 105 110

Pro Ala Gly Gly Arg Cys Val Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala

115 120 125

Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Gln Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala

130 135 140

Ala Phe Arg Phe Glu Leu Arg Glu Asp Gly Arg Pro Glu Leu Pro Pro

145 150 155 160

Gln Ala His Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp

165 170 175

Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly

180 185 190

Ile Ile His Gly Val Thr His Asp Val Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile

195 200 205

Thr Val Val Ala Ala Arg Val Leu Arg Gln Thr Pro Pro Leu Phe Gln

210 215 220

Ala Gly Arg Ser Gly Asp Gln Gly Leu Thr Ser Ile Arg Thr Pro Leu

225 230 235 240

Arg Cys Gly Val His Pro Gly Pro Gly Thr Phe Leu Phe Met Gly Trp

245 250 255

Ser Arg Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu

260 265 270

Phe Arg Arg Ala Tyr Glu Ala Ala Arg Ala Ala His Leu His Pro Cys

275 280 285

Glu Val Ala Leu His

290

<210> 3

<211> 270

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<400> 3

Gly Tyr Ser Glu Glu Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln

1 5 10 15

Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Ala Leu Ala Cys Ala Glu Gly Ala

20 25 30

Val Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly

35 40 45

Pro Asp Pro Arg Ala Arg Pro Gly Ile Ala Cys Leu Arg Pro Val Arg

50 55 60

Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg Ala Gly Gly Ala Leu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly Pro Ala Gly Gly Arg Cys Val

85 90 95

Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro

100 105 110

His Gln Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe Arg Phe Glu Leu Arg

115 120 125

Glu Asp Gly Arg Pro Glu Leu Pro Pro Gln Ala His Gly Leu Gly Val

130 135 140

Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala

145 150 155 160

Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Ile Ile His Gly Val Thr His

165 170 175

Asp Val Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val Val Ala Ala Arg Val

180 185 190

Leu Arg Gln Thr Pro Pro Leu Phe Gln Ala Gly Arg Ser Gly Asp Gln

195 200 205

Gly Leu Thr Ser Ile Arg Thr Pro Leu Arg Cys Gly Val His Pro Gly

210 215 220

Pro Gly Thr Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Arg

225 230 235 240

Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Arg Arg Ala Tyr Glu Ala

245 250 255

Ala Arg Ala Ala His Leu His Pro Cys Glu Val Ala Leu His

260 265 270

<210> 4

<211> 1363

<212> DNA

<213> 小家鼠 (Mus musculus)

<220>

<221> CDS

<222> (84)..(959)

<400> 4

gggcagccgc gccgcgggct gctcgcgctg cggccccgac cctcccgggg cagcagtccg 60

aggccccggc gcgtccccta acc atg ctg gta gcc acg ctt ctt tgc gcg ctc 113

Met Leu Val Ala Thr Leu Leu Cys Ala Leu

1 5 10

tgt tgc ggc ctc ctg gcc gcg tcc gct cac gct ggc tac tcg gaa gac 161

Cys Cys Gly Leu Leu Ala Ala Ser Ala His Ala Gly Tyr Ser Glu Asp

15 20 25

cgc tgc agc tgg agg ggc agc ggt ttg acc cag gag cct ggc agc gtg 209

Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val

30 35 40

ggg cag ctg acc ctg gac tgt act gag ggc gct atc gag tgg ctg tac 257

Gly Gln Leu Thr Leu Asp Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr

45 50 55

cca gct ggg gcg ctg cgc ctg acc ctg ggc ggc ccc gat ccg ggc aca 305

Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly Pro Asp Pro Gly Thr

60 65 70

cgg ccc agc atc gtc tgt ctg cgc cca gag cgg ccc ttc gct ggt gcc 353

Arg Pro Ser Ile Val Cys Leu Arg Pro Glu Arg Pro Phe Ala Gly Ala

75 80 85 90

cag gtc ttc gct gaa cgt atg acc ggc aat cta gag ttg cta ctg gcc 401

Gln Val Phe Ala Glu Arg Met Thr Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala

95 100 105

gag ggc ccg gac ctg gct ggg ggc cgc tgc atg cgc tgg ggt ccc cgc 449

Glu Gly Pro Asp Leu Ala Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg

110 115 120

gag cgc cga gcc ctt ttc ctg cag gcc aca cca cac cgc gac atc agc 497

Glu Arg Arg Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser

125 130 135

cgc aga gtt gct gcc ttc cgt ttt gaa ctg cac gag gac caa cgt gca 545

Arg Arg Val Ala Ala Phe Arg Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala

140 145 150

gaa atg tct ccc cag gct caa ggt ctt ggt gtg gat ggt gcc tgc agg 593

Glu Met Ser Pro Gln Ala Gln Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg

155 160 165 170

ccc tgc agt gat gcc gag ctc ctc ctg gct gca tgc acc agt gat ttt 641

Pro Cys Ser Asp Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe

175 180 185

gtg atc cac ggg acc atc cat ggg gtc gcc cat gac aca gag ctg caa 689

Val Ile His Gly Thr Ile His Gly Val Ala His Asp Thr Glu Leu Gln

190 195 200

gaa tca gtc atc act gtg gtg gtt gct cgt gtc atc cgc cag aca ctg 737

Glu Ser Val Ile Thr Val Val Val Ala Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu

205 210 215

cca ctg ttc aag gaa ggg agc tcg gag ggc caa ggc cgg gcc tcc att 785

Pro Leu Phe Lys Glu Gly Ser Ser Glu Gly Gln Gly Arg Ala Ser Ile

220 225 230

cgt acc ttg ctg cgc tgt ggt gtg cgt cct ggc cca ggc tcc ttc ctc 833

Arg Thr Leu Leu Arg Cys Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu

235 240 245 250

ttc atg ggc tgg agc cga ttt ggc gaa gct tgg ctg ggc tgt gct ccc 881

Phe Met Gly Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro

255 260 265

cgc ttc caa gag ttc agc cgt gtc tat tca gct gct ctc acg acc cat 929

Arg Phe Gln Glu Phe Ser Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Thr Thr His

270 275 280

ctc aac cca tgt gag atg gca ctg gac tga gagacctggg agcaagccct 979

Leu Asn Pro Cys Glu Met Ala Leu Asp

285 290

ggatggacct tcttctggag atggggtgtt ggggagggtg atgggagggt gggtgagaag 1039

ggtgtggctc ggatggcatc ctggtaccca cagtgagctg gtagaatact aagtaatctg 1099

gaccatacca gccactgtag tcatggtctt ctgtggcagg cagcataccc agctctgtgc 1159

ctgcctcact ttgtctactc tccagtctgc tgcccttcta acccttctta gcctgctgac 1219

cagtgagctc atgttttcct cgaattccag ggtgctgctg gggttcagag caaccgtgcc 1279

gtagtttgga agacttgagc taattgtttt ttttttgttt gtttttttgt ttgtttaaag 1339

gtggcctggg gggggcggca aaca 1363

<210> 5

<211> 291

<212> PRT

<213> 小家鼠 (Mus musculus)

<400> 5

Met Leu Val Ala Thr Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ser Ala His Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly

20 25 30

Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp

35 40 45

Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg

50 55 60

Leu Thr Leu Gly Gly Pro Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys

65 70 75 80

Leu Arg Pro Glu Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg

85 90 95

Met Thr Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Asp Leu Ala

100 105 110

Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe

115 120 125

Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe

130 135 140

Arg Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser Pro Gln Ala

145 150 155 160

Gln Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu

165 170 175

Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Thr Ile

180 185 190

His Gly Val Ala His Asp Thr Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val

195 200 205

Val Val Ala Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe Lys Glu Gly

210 215 220

Ser Ser Glu Gly Gln Gly Arg Ala Ser Ile Arg Thr Leu Leu Arg Cys

225 230 235 240

Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg

245 250 255

Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Ser

260 265 270

Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Thr Thr His Leu Asn Pro Cys Glu Met

275 280 285

Ala Leu Asp

290

<210> 6

<211> 270

<212> PRT

<213> 小家鼠 (Mus musculus)

<400> 6

Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln

1 5 10 15

Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp Cys Thr Glu Gly Ala

20 25 30

Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly

35 40 45

Pro Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys Leu Arg Pro Glu Arg

50 55 60

Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg Met Thr Gly Asn Leu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Asp Leu Ala Gly Gly Arg Cys Met

85 90 95

Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro

100 105 110

His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe Arg Phe Glu Leu His

115 120 125

Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser Pro Gln Ala Gln Gly Leu Gly Val

130 135 140

Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala

145 150 155 160

Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Thr Ile His Gly Val Ala His

165 170 175

Asp Thr Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val Val Val Ala Arg Val

180 185 190

Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe Lys Glu Gly Ser Ser Glu Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Ala Ser Ile Arg Thr Leu Leu Arg Cys Gly Val Arg Pro Gly

210 215 220

Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp

225 230 235 240

Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Ser Arg Val Tyr Ser Ala

245 250 255

Ala Leu Thr Thr His Leu Asn Pro Cys Glu Met Ala Leu Asp

260 265 270

<210> 7

<211> 1026

<212> DNA

<213> 褐家鼠 (Rattus norvegicus)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(876)

<400> 7

atg ctg gta gcg gcg ctt ctc tgc gcg ctg tgc tgc ggc ctc ttg gct 48

Met Leu Val Ala Ala Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly Leu Leu Ala

1 5 10 15

gcg tcc gct cga gct ggc tac tcc gag gac cgc tgc agc tgg agg ggc 96

Ala Ser Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly

20 25 30

agc ggt ttg acc cag gaa cct ggc agc gtg ggg cag ctg acc ctg gat 144

Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp

35 40 45

tgt act gag ggt gct atc gag tgg ctg tat cca gct ggg gcg ctg cgc 192

Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg

50 55 60

ctg act cta ggc ggc tct gat ccg ggc acg cgg ccc agc atc gtc tgt 240

Leu Thr Leu Gly Gly Ser Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys

65 70 75 80

ctg cgc cca aca cgg ccc ttc gct ggt gcc cag gtc ttc gct gaa cgg 288

Leu Arg Pro Thr Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg

85 90 95

atg gcc ggc aac cta gag ttg cta ctg gcc gag ggc caa ggc ctg gct 336

Met Ala Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Gln Gly Leu Ala

100 105 110

ggg ggc cgc tgc atg cgc tgg ggt cct cgc gag cgc cga gcc ctt ttc 384

Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe

115 120 125

ctg cag gcc acg cca cac cgg gac atc agc cgc aga gtt gct gcc ttc 432

Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe

130 135 140

caa ttt gaa ctg cac gag gac caa cgt gca gaa atg tct ccc cag gcc 480

Gln Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser Pro Gln Ala

145 150 155 160

caa ggt ttt ggt gtg gat ggt gcc tgc agg ccc tgc agt gat gcc gag 528

Gln Gly Phe Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu

165 170 175

ctc ctt ctg act gca tgc acc agt gac ttt gtg atc cat ggg acc atc 576

Leu Leu Leu Thr Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Thr Ile

180 185 190

cat ggg gtc gtc cat gac atg gag ctg caa gaa tca gtc atc act gtg 624

His Gly Val Val His Asp Met Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val

195 200 205

gtg gcc act cgt gtc atc cgc cag aca ctg cca ctg ttc cag gaa ggg 672

Val Ala Thr Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe Gln Glu Gly

210 215 220

agc tcg gag ggc cgg ggc cag gcc tcc gtt cgt acc ttg ttg cgc tgt 720

Ser Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ser Val Arg Thr Leu Leu Arg Cys

225 230 235 240

ggt gtg cgt cct ggc cca ggc tcc ttc ctc ttc atg ggc tgg agc cga 768

Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg

245 250 255

ttt ggc gaa gct tgg ctg ggc tgc gct ccc cgc ttc caa gag ttc agc 816

Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Ser

260 265 270

cgt gtc tat tca gct gct ctc gcg gcc cac ctc aac cca tgt gag gtg 864

Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Ala Ala His Leu Asn Pro Cys Glu Val

275 280 285

gca ctg gac tga gagacctggg agcaagccct ggatggatct tcctctgggg 916

Ala Leu Asp

290

atggggtgtt ggggaggggt gataggaggg tgggtgggaa gggtgtggct cagatggcat 976

cctggtaccc acagtgaggt ggtagaatac taaataacct ggatcacacc 1026

<210> 8

<211> 291

<212> PRT

<213> 褐家鼠 (Rattus norvegicus)

<400> 8

Met Leu Val Ala Ala Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ser Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly

20 25 30

Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp

35 40 45

Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg

50 55 60

Leu Thr Leu Gly Gly Ser Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys

65 70 75 80

Leu Arg Pro Thr Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg

85 90 95

Met Ala Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Gln Gly Leu Ala

100 105 110

Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe

115 120 125

Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe

130 135 140

Gln Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser Pro Gln Ala

145 150 155 160

Gln Gly Phe Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu

165 170 175

Leu Leu Leu Thr Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Thr Ile

180 185 190

His Gly Val Val His Asp Met Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val

195 200 205

Val Ala Thr Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe Gln Glu Gly

210 215 220

Ser Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ser Val Arg Thr Leu Leu Arg Cys

225 230 235 240

Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg

245 250 255

Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Ser

260 265 270

Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Ala Ala His Leu Asn Pro Cys Glu Val

275 280 285

Ala Leu Asp

290

<210> 9

<211> 270

<212> PRT

<213> 褐家鼠 (Rattus norvegicus)

<400> 9

Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln

1 5 10 15

Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp Cys Thr Glu Gly Ala

20 25 30

Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly

35 40 45

Ser Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys Leu Arg Pro Thr Arg

50 55 60

Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg Met Ala Gly Asn Leu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Gln Gly Leu Ala Gly Gly Arg Cys Met

85 90 95

Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro

100 105 110

His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe Gln Phe Glu Leu His

115 120 125

Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser Pro Gln Ala Gln Gly Phe Gly Val

130 135 140

Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu Leu Leu Leu Thr Ala

145 150 155 160

Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Thr Ile His Gly Val Val His

165 170 175

Asp Met Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val Val Ala Thr Arg Val

180 185 190

Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe Gln Glu Gly Ser Ser Glu Gly Arg

195 200 205

Gly Gln Ala Ser Val Arg Thr Leu Leu Arg Cys Gly Val Arg Pro Gly

210 215 220

Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp

225 230 235 240

Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Ser Arg Val Tyr Ser Ala

245 250 255

Ala Leu Ala Ala His Leu Asn Pro Cys Glu Val Ala Leu Asp

260 265 270

<210> 10

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的

<400> 10

atgggctttc ccgctgccgc cctgctgtgc gctctgtgct gcggactgct ggctcctgca 60

gccagagccg gctacagcga ggaacggtgc agctggcggg gcagcggcct gacccaggaa 120

cctggcagcg tcggccagct cgcactggcc tgtgcagaag gcgccgtgga gtggctgtac 180

cccgcaggcg ccctgagact gaccctgggc ggacccgacc ccagagccag acccggcatt 240

gcctgtctga ggcccgtgcg gcctttcgct ggcgcccagg tgttcgccga gagagccggc 300

ggagccctgg aactcctgct cgccgaaggc cctggtccag ccggcggaag atgcgtgaga 360

tggggcccaa gagagcggag agccctgttc ctgcaagcca ccccccacca ggacatcagc 420

agacgggtgg ccgccttcag attcgagctg cgggaggacg gtagacccga gctgccacct 480

caggcccacg gactgggagt ggacggcgcc tgcagaccct gtagcgacgc cgagctgctg 540

ctcgccgcct gcaccagcga cttcgtgatc cacggcatca tccacggcgt gacccacgac 600

gtggagctgc aggaaagcgt catcaccgtc gtcgccgcca gagtgctgag acagaccccc 660

cctctgttcc aggccggcag aagcggcgac cagggcctga ccagcatccg gacccccctg 720

agatgcggcg tgcatcccgg acccggcacc ttcctgttca tgggctggtc cagattcggc 780

gaggcccggc tgggctgcgc tccccggttc caggaattca gacgggccta cgaggccgcc 840

agggccgctc atctgcaccc ctgcgaggtg gccctgcatt ga 882

<210> 11

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (25)..(25)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (27)..(27)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (29)..(29)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (33)..(33)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (49)..(49)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (52)..(53)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (56)..(56)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (58)..(58)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (63)..(63)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (76)..(77)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (79)..(79)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (88)..(90)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (96)..(96)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (114)..(114)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (124)..(124)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (128)..(128)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (131)..(131)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (133)..(133)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (135)..(136)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (140)..(140)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (142)..(142)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (159)..(159)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (170)..(170)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (175)..(175)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (178)..(178)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (189)..(190)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (193)..(193)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (197)..(197)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (201)..(202)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (204)..(204)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (206)..(208)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (210)..(211)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (213)..(213)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (216)..(216)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (222)..(222)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (227)..(227)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (240)..(240)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (251)..(251)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (253)..(253)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (255)..(255)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (258)..(260)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (263)..(263)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (267)..(267)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (270)..(270)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 11

Gly Tyr Ser Glu Xaa Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln

1 5 10 15

Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Xaa Leu Xaa Cys Xaa Glu Gly Ala

20 25 30

Xaa Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly

35 40 45

Xaa Asp Pro Xaa Xaa Arg Pro Xaa Ile Xaa Cys Leu Arg Pro Xaa Arg

50 55 60

Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg Xaa Xaa Gly Xaa Leu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Xaa Xaa Xaa Ala Gly Gly Arg Cys Xaa

85 90 95

Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro

100 105 110

His Xaa Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe Xaa Phe Glu Leu Xaa

115 120 125

Glu Asp Xaa Arg Xaa Glu Xaa Xaa Pro Gln Ala Xaa Gly Xaa Gly Val

130 135 140

Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu Leu Leu Leu Xaa Ala

145 150 155 160

Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Xaa Ile His Gly Val Xaa His

165 170 175

Asp Xaa Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val Val Xaa Xaa Arg Val

180 185 190

Xaa Arg Gln Thr Xaa Pro Leu Phe Xaa Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Xaa

195 200 205

Gly Xaa Xaa Ser Xaa Arg Thr Xaa Leu Arg Cys Gly Val Xaa Pro Gly

210 215 220

Pro Gly Xaa Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Xaa

225 230 235 240

Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Xaa Arg Xaa Tyr Xaa Ala

245 250 255

Ala Xaa Xaa Xaa His Leu Xaa Pro Cys Glu Xaa Ala Leu Xaa

260 265 270

Claims (42)

1.一种用于在治疗或预防受试者的化疗诱导的神经性疼痛中使用的分离的多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

i.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和

ii.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。

2.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中与化疗治疗同时或间歇地施用所述多肽。

3.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽的施用在化疗治疗开始前开始。

4.根据权利要求3所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽的施用在化疗治疗开始前至少一天开始，如在化疗治疗开始前至少两天，例如在化疗治疗开始前至少三天，如在化疗治疗开始前至少4天、至少5天或至少一周开始。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中将所述多肽与化疗的每次施用联合施用。

6.根据权利要求5所述的用于所述用途的多肽，其中将所述多肽在化疗治疗开始的同一天施用，或在化疗治疗开始前至少一天施用，如在化疗治疗开始前至少两天，例如在化疗治疗开始前至少三天，如在化疗治疗开始前至少4天、至少5天、至少一周施用。

7.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述化疗治疗涉及施用基于铂的药物、紫杉烷、埃博霉素、长春花生物碱和半合成类似物、蛋白酶体抑制剂或免疫调节药物或其组合。

8.根据权利要求7所述的用于所述用途的多肽，其中所述基于铂的药物是卡铂、顺铂或奥沙利铂。

9.根据权利要求7所述的用于所述用途的多肽，其中所述紫杉烷是紫杉醇或多西他赛。

10.根据权利要求7所述的用于所述用途的多肽，其中所述埃博霉素是伊沙匹隆。

11.根据权利要求7所述的用于所述用途的多肽，其中所述长春花生物碱是长春新碱或长春碱。

12.根据权利要求7所述的用于所述用途的多肽，其中所述半合成类似物是长春瑞滨或艾日布林。

13.根据权利要求7所述的用于所述用途的多肽，其中所述蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。

14.根据权利要求7所述的用于所述用途的多肽，其中所述免疫调节药物是沙利度胺或来那度胺。

15.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述待治疗的受试者患有卵巢癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌、白血病、霍奇金病、威尔姆斯瘤、神经母细胞瘤、睾丸癌、膀胱癌或多发性骨髓瘤。

16.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO:3具有至少70％序列同一性，更优选地与SEQ ID NO:3具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选90％、更优选95％、更优选98％序列同一性。

17.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:11的共有序列。

18.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽在相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置7、28、59、95、148、151、161、219、243和265处具有半胱氨酸残基。

19.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽是变体多肽，其中任何氨基酸取代都是保守取代。

20.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽能够形成至少一个分子内二硫桥。

21.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述治疗使得改善痛觉超敏、痛觉过敏或自发性疼痛。

22.根据权利要求21所述的用于所述用途的多肽，其中所述痛觉超敏是热学痛觉超敏。

23.根据权利要求22所述的用于所述用途的多肽，其中所述热学痛觉超敏是冷痛觉超敏或热痛觉超敏。

24.根据权利要求21所述的用于所述用途的多肽，其中所述痛觉超敏是机械性痛觉超敏。

25.根据权利要求21所述的用于所述用途的多肽，其中所述痛觉过敏是机械性痛觉过敏。

26.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述待治疗的受试者是哺乳动物，优选灵长类动物，更优选人。

27.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中将所述多肽通过全身性施用来施用。

28.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中将所述多肽通过肠胃外注射、优选皮下注射或鞘内注射来施用。

29.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中将所述多肽以1μg/kg-10,000μg/kg、如1μg/kg-7,500μg/kg、如1μg/kg-5,000μg/kg、如1μg/kg-2,000μg/kg、如1μg/kg-1,000μg/kg、如1μg/kg-700μg/kg、如5μg/kg-500μg/kg、如10μg/kg至100μg/kg体重的剂量来施用。

30.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中将所述多肽每周施用至少1-3次，如每周2-5次，如每周3-6次。

31.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中将所述多肽每隔一天施用。

32.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中将所述多肽每天施用。

33.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽的施用在神经性疼痛的症状发作后开始。

34.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽的施用在化疗治疗开始后开始。

35.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽的施用在化疗治疗开始后开始，如在化疗治疗开始后1天、如之后2天、如之后3天、如之后4天、如之后5天、如之后8天、如之后12天开始。

36.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的多肽，其中所述多肽的施用在化疗治疗开始后开始，如在化疗治疗开始后1周、如之后2周、如之后3周开始。

37.一种用于在治疗或预防受试者的化疗诱导的神经性疼痛中使用的分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：

a.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；

b.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。

38.一种用于在治疗或预防受试者的化疗诱导的神经性疼痛中使用的载体，所述载体包含编码根据权利要求1至20中任一项所述的多肽的多核苷酸。

39.根据权利要求35所述的用于所述用途的载体，所述载体进一步包含可操作地连接至所述核酸分子的启动子。

40.根据前述权利要求38至39中任一项所述的用于所述用途的载体，其中所述载体选自甲病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头瘤病毒和Mo-MLV，优选腺相关病毒。

41.一种用于减少有需要的受试者的背根神经节中的谷氨酰胺合成酶表达的方法，所述方法包括施用包含选自以下的氨基酸序列的多肽：

a.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；

b.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性

从而减少背根神经节中谷氨酰胺合成酶的表达。

42.一种用于减少有需要的受试者的背根神经节中的连接蛋白43表达的方法，所述方法包括施用包含选自以下的氨基酸序列的多肽：

a.SEQ ID NO:3的氨基酸序列；

b.SEQ ID NO:3的氨基酸序列的生物活性序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性

从而减少背根神经节中连接蛋白43的表达。