KR102467982B1 - Vlp-레플리콘을 이용한 클래스 ii mhc 항원의 전달에 의한 암 면역요법 - Google Patents

Vlp-레플리콘을 이용한 클래스 ii mhc 항원의 전달에 의한 암 면역요법 Download PDF

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Abstract

본원에서는, 포유동물 피험체에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 피험체에, 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 알파 바이러스 레플리콘을 포함하는 바이러스 유사 입자(VLP: virus-like particle)를 포함하는 약학 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 기술하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 클래스 II 주요 조직적합성 항원의 두 가지 서브유닛, 레트로바이러스 gag 단백질 및 융합유도성 외피 단백질을 코딩하는 서열을 포함하고, VLP는 알파 바이러스 구조 단백질 유전자를 함유하지 않는다.

Description

VLP-레플리콘을 이용한 클래스 II MHC 항원의 전달에 의한 암 면역요법{CANCER IMMUNOTHERAPY BY DELIVERING CLASS II MHC ANTIGENS USING A VLP-REPLICON}
<관련 출원의 상호 참조>
본 출원은 미국 법전(U.S.C.) 제35편 119조 (e)항에 따라 2013년 12월 16일에 출원된 미국 특허 가출원 제61/916,394호의 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 본원에서 참고로 인용된다.
<기술 분야>
본원에 기재된 발명은 복제결함 바이러스 유사 입자를 이용하여 포유동물에 클래스 II 주요 조직적합성 항원을 발현하는 핵산을 전달하고 전사하는 것에 관한 것이다.
암 요법, 특히 화학요법에서 주요 난제는 표적 암세포에 대한 특이성이 없다는 것인데, 그 이유는 소분자가 전신에 투여되어 분열 지수가 높은 모든 세포에 영향을 주어 결과적으로 해로운 부작용을 일으키기 때문이다. 항체 기반 요법은 표적 세포에 대해 특이성을 향상시키지만 결과적으로 효능이 낮다. 단클론 항체(mAb)는 시약 또는 약물의 하나의 큰 부류를 구성한다. mAb에 대한 세계 시장은 현재 $360억이 넘는다(Ledford, 2020, Nature 468:18-19). 현재 항체 기반 암 요법에 대한 전략은 접근 가능한, 암세포의 외부 막에서 발현되는 소수의 세포 외 단백질 또는 수용체에만 국한된다(Baker, 2005, Nature Biotech, 23:1065-72; Cohen, et al. 2009, MAbs, 1:56-66). 이들은 접근 가능하기 때문에, 그들에 대한 항체를 생산하는 것이 가능하다. 예로는 림프종 치료를 위한 항-CD20 단클론 항체(mAb)인 리툭시맙(리툭산(RITUXAN)® 또는 맙테라(MABTHERA)®), 일부 유방암 치료를 위한 항-Her2 mAb인 트라스투주맙(허셉틴(HERCEPTIN)®) 및 두경부암과 대장암 치료를 위한 항-FGF 수용체 mAB인 세툭시맙(얼비툭스(ERBITUX)®)이 포함된다(Adams, 2005, Nature Biotech, 23:1147-57). 이들은 암세포를 인식하고 파괴하는 효과적인 제제임이 입증되었다. 그러나 암세포 표면상에 접근 가능한 새로운 암 지표가 존재하지 않아 미래에 발생될 수 있는 Ab 레퍼토리를 제한하고 있다.
암 요법을 위하여 개발되지 않은 수많은 세포 내 암 항원 자원을 이용하려는 요구가 충족되지 못하고 있다. 이러한 세포 내 암 치료 표적의 예로는 Ras 돌연변이체, 포스파타제, 키나아제 전사 인자, 알파 태아단백질(AFP: Alpha fetoprotein), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, 칼시토닌, 칼레티닌, 암성태아성 항원, 크로모그라닌, 시토케라틴, 데스민, 상피 막 단백질(EMA: epithelial membrane antigen), 인자 VIII, CD31, FL1, 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP: glial fibrillary acidic protein), GCDFP-15(gross cystic disease fluid protein-15), HMB-45, 인간 융모성 생식선 자극호르몬(hCG: human chorionic gonadotropin), 인히빈, 케라틴, 림프구 마커, MART-1(멜란-A), Myo D1, 근육 특이적 액틴(MSA: muscle-specific actin), 신경미세섬유, 뉴런 특이적 에놀라아제(NSE: neuron-specific enolase), 태반 알칼리 포스파타제(PLAP: placental alkaline phosphatase), 전립선 특이적 항원, PTPRC(CD45), S100 단백질, 평활근 액틴(SMA: smooth muscle actin), 시냅토파이신, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 종양 M2-PK, 비멘틴, 분화 클러스터 10(CD10), CD13, CD15, CD20, CD25, CD28, CD30, CD34, CD99, 및 CD117이 포함된다. 세포 내 암 항원은 항체에 접근할 수 없고, 항체는 그 크기가 커서 세포 내 위치로 도달할 수 없기 때문에, 따라서 이들 항원에 대한 항체로 암 환자를 치료하는데 더 큰 어려움이 존재한다.
한 가지 접근법은 세포 내 암 항원을 밖으로 끌어내어 종양세포 표면에 드러내어 이들을 유도된 항원 제시세포(iAPC)로 전환하여 종양세포에 대한 암 백신을 생성하고, 그럼으로써 종양세포가 그들에 대한 항체를 만드는 세포 기구를 활성화 시키도록 하는 것이다. 종양세포는 잠재적인 면역원인 많은 단백질을 합성하며 이들 단백질로부터 프로세싱된 펩티드는 환자의 항종양 반응을 활성화시킬 것이라는 것이 공지되었다. 형질감염된 종양세포는 이들 항원을 T(CD+) 보조세포에 제시하고 세포 용해성 T 림프구(CD8+ 세포)를 활성화 시키고 암 백신을 효과적으로 생성하는 이펙터 및 면역 기억 T 세포를 생성할 것이며, 이러한 과정은 암 사멸의 주요 원인이 되는 전이를 막는데 필수적일 것으로 보인다. 암 요법에 대한 이러한 접근법은 암 항원(들)에 대한 사전 지식을 요구하지 않는다는 점에서 관심을 받고 있다. 따라서, 이는 단백질 또는 항원을 유발하는 어떤 유형의 암에든 도움이 될 수 있다. 암 백신은 건강 세포에 최소한의 독성을 가지면서 종양 특이적 반응을 유도한다는 가능성 때문에 암 치료 및 예방에 유망한 수단이 된다.
마우스(자기유래) 시스템의 마우스 HLA/CD80은 생존을 연장 시킨다고 밝혀졌다(Armstrong, et al., 1997, Proc Natl Acad Sci, 94:6886-91; Humphreys, et al., 2004, Cell Mol lmmunol, 1:180-85). 본 시스템은 종양세포의 단리단계, 종양세포의 증식단계, 이들 유전자를 포함하는 재조합 레트로바이러스로 세포(생체 외)의 변형단계, 및 면역요법 연구를 위해 마우스로 상기 세포의 재이식 단계를 요구한다. 절차는 복잡하고 지루하며 생체 외 단계에서는 오염에 대해 민감하다. 게다가, 보고된 결과는 유전적으로 동계이고 면역적으로 동일한 시스템에 기반을 둔다. 레트로바이러스의 사용으로 레트로바이러스가 숙주 게놈에 통합될 가능성이 있으며, 이는 잠재적으로 위험할 수 있다.
생체 외 절차의 단점을 가지지 않으면서 숙주 세포에 해를 줄 수 있는 레트로바이러스 사용을 요구하지 하는 유전자 요법의 제조방법의 개발이 요구되고 있다.
<발명의 요약>
암의 유도 가능한 면역요법을 위한 신규한 방법을 기재하고자 한다. 본 면역요법은 환자의 종양세포 내에서 클래스 II 주요 조직적합성 항원을 동시 발현하여 종양 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 것에 관한 것이다. 형질감염된 세포는 항원 제시세포로서 작용할 것이다. 형질감염된 종양세포에서 발현된 MHC 항원은 항원 제시 분자로서 작용함으로써 종양 항원에 대해 면역 반응을 유발한다는 것을 밝히고자 한다. 그 후 종양세포에 대한 면역 반응은 숙주 항원 제시세포에 제시된 종양 항원의 존재에 의해 정교해질 것이다. 또한, 동물에 투여될 수 있는 종양 항원과 함께 클래스 II MHC 항원을 코딩하는 RNA를 포함하는 바이러스 유사 입자(VLP: virus-like protein)를 기재하며, 이것은 동물의 숙주 세포가 상기 항원을 발현하도록 유도한다. VLP 매개된 RNA 전달 시스템은 WO 2013148302호에 이미 기재되었으며, 이는 이로써 그 전문으로 참고에 포함되며, 그 안에서 포유동물 세포에서 단백질을 발현하는데 효율적임을 보였다.
포유동물 피험체에서 질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 이를 필요로 하는 피험체에
a. 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 알파 바이러스 레플리콘으로서, 폴리뉴클레오티드는 인간 클래스 II 주요 조직적합성 항원의 두 가지 서브유닛을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 알파 바이러스 레플리콘,
b. 레트로바이러스 gag 단백질 및
c. 융합유도성(fusogenic) 외피 단백질
을 포함하고 알파 바이러스 구조 단백질 유전자를 포함하지 않는 VLP를 포함하는 약학 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 기재하고자 한다. 재조합 폴리펩티드는 공자극 신호 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다. 공자극 신호 단백질은 바람직하게는 CD28, CD80, CD86, 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 공자극 신호 단백질은 CD80을 포함한다.
본원에 기재된 방법은 환자가 종양을 갖는 질환의 예방 또는 치료에 관한 것일 수 있다. 환자는 암 환자일 수 있고, 바람직하게는 환자는 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 신장암종, 폐암, 위암, 췌장암, 교모세포종, 및 대장암으로부터 유래한 고형 종양을 가진 암 환자군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 유방암 환자이다. 따라서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 종양 특이적 항원, 바람직하게는 AFP, CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, 칼시토닌, 칼레티닌, 암성태아성 항원, 크로모그라닌, 시토케라틴, 데스민, EMA, 인자 VIII, FL1, GFAP, GCDFP-15, HMB-45, hCG, 인히빈, 케라틴, 림프구 마커, MART-1(멜란-A), Myo D1, MSA, 신경미세섬유, NSE, PLAP, 전립선 특이적 항원, S100 단백질, SMA, 시냅토파이신, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 종양 M2-PK, 비멘틴, CD10, CD13, CD15, CD20, CD25, CD30, CD31, CD34, CD45(PTPRC), CD99, CD117, 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 감염성 질환의 예방 또는 치료에 관한 것일 수 있다. 따라서, 재조합 폴리펩티드는 감염원의 서열을 더 포함할 수 있다. 감염원은 감염성 바이러스일 수 있다.
본원에 기재된 방법의 VLP는 신드비스 바이러스(Sindbis virus) 및 베네수엘라 이콰인 뇌염 바이러스(VEEV: Venezuelean equine encephalititis virus)로부터 유래한 알파 바이러스 레플리콘을 포함할 수 있다. VLP의 융합유도성 외피 단백질은 당단백질을 포함하거나, 또는 그의 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. 융합유도성 외피 단백질은 종양세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, VLP는 진핵 세포에 결합할 수 있다. 진핵 세포는 인간 세포일 수 있다. 결합은 표적 세포에 특이적일 수 있다.
본원에 기재된 방법은 약학 조성물을 비경구 투여할 수 있다. 약학 조성물은 정맥 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 약학 조성물은 종양 내에 주사에 의해 투여될 수 있다.
본원에 기재된 방법에서, 약학 조성물은 화학요법 약물과 병용하여 투여될 수 있다. 화학요법 약물은 탁산(파클리탁셀 또는 도세탁셀), 안트라사이클린(독소루비신 또는 에피루비신), 시클로포스파미드, 카페시타빈, 타목시펜, 레트로졸, 카보플라틴, 젬시타빈, 시스플라틴, 엘로티닙, 이리노테칸, 플루오로우라실, 및 옥살리플라틴으로 이루어진 약물 부류로부터 선택될 수 있다. 약학 조성물은 방사선 요법과 병용하여 투여될 수 있다.
[도 1]은 벡터의 예를 도식으로 나타낸다. 벡터의 DNA 서열은 첨부된 서열 목록(서열 번호 1)에 제공된다.
[도 2]는 본원에 기재된 VLP를 제조하고 이용하기 위한 기본 개념을 나타낸다. 레플리콘 플라스미드는 레플리콘의 발현을 유도하는 CMV 프로모터 및 관심 유전자를 포함한다. 레플리콘은 요소 NSP1, NSP2, NSP3 및 NSP4를 포함한다. 관심 유전자는 두 가지 클래스 II MHC 항원 서브유닛 및 질환 특이적 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 구조 벡터는 CMV 프로모터 조절하에 RSV의 Gag를 포함한다. 외피 벡터는 CMV 프로모터하에 VSV-G 단백질을 포함한다. 이들은 생산 숙주 세포에 형질감염되어, RNA를 포함하는 VLP를 제조한다. VLP를 이용하여 표적 세포를 감염시킬 수 있으며, 표적 세포는 관심 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 생산한다.
[도 3]은 실시예의 구체적인 구조물을 도시한다. 이것은 HLA-DR1 및 CD80 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 레플리콘 플라스미드, VLP-VEE를 도시한다.
[도 4]는 4T1-Luc2(유방암) 세포 이식 후 동물 생존을 나타낸다.
[도 5]는 4T1-Luc2 세포 투여 후 면역화된 동물 생존을 나타낸다.
정의
본 개시에서 용어 "하나"("one," "a," 또는 "an")가 사용될 때, 달리 명시하지 않는다면 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "융합유도성 단백질"은 수용 세포의 막에 VLP의 원형질막 유래 외피의 융합을 유도할 수 있는 단백질을 가리키고자 한다.
용어 "발현" 및 "생산"은 본원에서 동의어로 사용되며, 유전자 산물의 생합성을 언급한다. 본 용어는 RNA로 유전자의 전사를 포함한다. 또한, 본 용어는 한 개 이상의 폴리펩티드로 RNA의 번역을 포함하고, 나아가 전사 후 및 번역 후 자연적으로 발생하는 모든 변형을 모두 포함한다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현 또는 생산은 세포의 세포질 내에서 또는 세포 배양의 성장 배지와 같은 외부 환경으로 일어날 수 있다.
"핵산 분자", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"과 동의적으로 언급되는 "폴리뉴클레오티드"는 모든 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시뉴클레오티드를 언급하며, 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. "폴리뉴클레오티드"는 단일 및 이중 가닥 DNA; 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA; 단일 및 이중 가닥 RNA; 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA; 단일 가닥, 또는 보다 통상적으로 이중 가닥 또는 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA와 RNA를 포함하는 혼성 분자를 제한 없이 포함한다. 또한, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 둘 다를 포함하는 삼중 가닥 영역을 언급한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 안정성 또는 기타 이유로 한 개 이상의 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 및 변형된 골격을 가진 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸레이트된 염기 및 이상 염기, 예를 들어 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA는 다양하게 변형될 수 있으며, 따라서 "폴리뉴클레오티드"는 자연에서 통상적으로 발견되는 폴리뉴클레오티드의 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태뿐아니라 바이러스와 세포의 DNA 및 RNA 특징의 화학적 형태를 포함한다. 또한, "폴리뉴클레오티드"는 대개 올리고뉴클레오티드로 언급되는 비교적 짧은 핵산 사슬을 포함한다.
본원에서 사용되는 "레플리콘"은 서열 복제를 가능하게 하면서 번역을 진행할 수 있는데 필수적인 유전적 요소를 가진 폴리뉴클레오티드를 가리킨다.
본원에서 언급되는 "바이러스 유사 입자(VLP)"는 바이러스 입자를 닮은 구조를 가리킨다. 바람직한 실시양태에서, VLP는 입자의 표면에 나타난 적어도 한 가지 융합유도성 단백질을 포함한다. 본 발명에 따른 바이러스 유사 입자는 바이러스 게놈의 복제 구성요소의 전체 또는 일부분이 결여된다. 통상적으로, 본 발명에 따른 바이러스 유사 입자는 바이러스 유사 입자의 단백질을 코딩하는 유전 정보를 포함하지 않는다.
벡터
알파 바이러스는 바이러스의 토가비리데(Togaviridae)과 IV군에 속한다. 알파 바이러스는 단일 양성 센스 가닥 RNA 게놈을 가진 작고 구형의 외피 바이러스이다. 전체 게놈 길이는 11,000개와 12,000개 뉴클레오티드 사이 범위이며, 5' 캡 및 3' 폴리-A 꼬리를 가진다. 4가지의 비구조 단백질(NSP: nonstructural protein) 유전자는 게놈의 5' 2/3에서 코딩되는 한편, 3가지의 구조 단백질은 게놈의 3' 1/3과 공직선(colinear)의 서브게놈 mRNA로부터 번역된다.
알파 바이러스 게놈에는 비구조 및 구조의 두 가지 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)이 존재한다. 첫 번째는 NSP 유전자를 포함하며 바이러스 RNA의 전사 및 번역에 필수적인 단백질(nsP1-nsP4)을 코딩한다. 두 번째는 3가지 구조 단백질인 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 및 헤테로다이머로 결합하는 외피 단백질 P62와 E1을 코딩한다. 바이러스 막에 고정된 표면 당단백질은 수용체 인식 및 막 융합을 통한 표적 세포로의 진입을 담당한다.
신드비스 바이러스(SIN) 및 베네수엘라 이콰인 뇌염 바이러스(VEEV)는 게놈이 11703개의 뉴클레오티드인 양성 mRNA 가닥을 포함하는 알파 바이러스이다. SIN는 다양한 척추동물 숙주를 감염시킨다. 신드비스 바이러스의 게놈은 비구조(NS(non-structural), 레플리콘) 및 구조 단백질(캡시드 및 pH 의존성 융합유도성 외피)을 코딩하며, 이들은 숙주 세포의 세포질에서 직접 번역된다. 또한, 알파 바이러스는 아우라(Aura) 바이러스, 바반키(Babanki) 바이러스, 바마 삼림(Barmah Forest) 바이러스, 베바루(Bebaru) 바이러스, 사바쑤(Cabassou) 바이러스, 치쿤구니아(Chikungunya) 바이러스, 동부형 이콰인 뇌염(Eastern equine encephalitis) 바이러스, 에버글레이드(Everglades) 바이러스, 포트 모건(Fort Morgan) 바이러스, 게타(Getah) 바이러스, 하이랜드(Highlands) J 바이러스, 키질라가시(Kyzylagach) 바이러스, 마야로(Mayaro) 바이러스, 메 트리(Me Tri) 바이러스, 미델부르크(Middelburg) 바이러스, 모쏘 다스 페드라스(Mosso das Pedras) 바이러스, 무캄보(Mucambo) 바이러스, 엔두무(Ndumu) 바이러스, 오니옹-니옹(O'nyong-nyong) 바이러스, 피슈나(Pixuna) 바이러스, 리오 네그로(Rio Negro) 바이러스, 로스 강(Ross River) 바이러스, 연어 췌장 질병(Salmon pancreas disease) 바이러스, 셀리키 삼림(Semliki Forest) 바이러스(SFV), 남방 코끼리 물범(Southern elephant seal) 바이러스, 토나테(Tonate) 바이러스, 트로카라(Trocara) 바이러스, 우나(Una) 바이러스, 서부형 이콰인 뇌염(Western equine encephalitis) 바이러스, 및 와타로아(Whataroa) 바이러스를 포함한다.
알파 바이러스로 숙주 세포의 감염은 결과적으로 세포독성을 일으켜 아폽토시스로 끝난다. 이것은 주로, 두 가지, 알파 바이러스 게놈 RNA의 대량 발현으로 숙주 세포에서 항바이러스 상태의 유발 및 세포 mRNA 합성 또는 번역 정지와 알파 바이러스 비구조 단백질(SIN의 NSP2 또는 VEEV의 NC)의 직접적인 상호작용으로 숙주 세포에 세포변성 효과(CPE: cytophathic effect)의 유발 모두에 기인한다. 비구조 단백질 중 하나인 NSP2 내 점 돌연변이(위치 726)를 포함하는 자연적인 SIN 변이체는 감염된 세포로부터 회복된 바이러스 역가가 실질적으로 감소하였지만 감염된 세포 내에서 지속된 비변성 성장을 증명하였다(Frolov, et al., 1999, J Virol, 73:3845-65).
알파 바이러스는 유전자 요법 연구자들에게 관심 받고 있다. 로스 강 바이러스, SIN, SFV, 및 VEEV는 모두 유전자 절단을 위한 벡터 개발에 사용되어 왔다. 알파 바이러스의 외피 당단백질과 레트로바이러스의 캡시드를 결합하여 위형(Pseudotyped)의 바이러스가 형성될 수 있다. 알파 바이러스 외피 당단백질 위형 레트로바이러스 또는 렌티바이러스는 그들이 포함하는 유전자를 가능한 숙주 세포로 통합시킬 수 있다. 위형 알파 바이러스는 알파 바이러스 외피 단백질 E2 및 E1에 의해 인식되고 감염된다. 바이러스 유전자의 안정한 통합은 상기 벡터의 레트로바이러스 내부에 의해 매개 된다.
유전자 요법 분야에서 알파 바이러스 사용은 표적화하는 특이성의 결여로 인해 제한받고 있다. 그러나 E2 구조의 비보존적 루프에 가변성 항체 도메인을 도입함으로써, 특이적 세포 집단이 표적화되었다. 게다가, 여러 내부 알파 바이러스 단백질이 감염 시 아폽토시스 도입에 관련되기 때문에 또한 알파 바이러스 캡시드가 단지 숙주 세포로 mRNA의 일시적인 도입만을 매개하기 때문에 유전자 요법에 전체 알파 바이러스의 사용은 제한된 효능을 갖는다. 이러한 어떤 제한도 알파 바이러스 외피 유형의 레트로바이러스 또는 렌티바이러스에 확장되지는 않는다. 표적 세포에서 전이 유전자 발현을 위한 여러 알파 바이러스 기반 발현은 문헌(Xiong, et al., 1989, Science, 243:1188-91; 및 Bredenbeek, et al., 1993, J Virol, 67:6439-46)에 기재되었다. 안정성을 고려하기 위해, 이들 발현 시스템은 대개 두 가지 플라스미드를 포함한다. 한 가지 플라스미드는 레플리콘(즉, 비구조 단백질) 및 내부 프로모터의 코딩 서열 및 전이유전자 코딩 영역을 포함하는 한편, 두 번째 플라스미드는 바이러스 구조 유전자를 코딩한다. 이들 플라스미드를 이용하여 시험관 내에서 mRNA을 생성한 후 숙주 세포로 전기천공하여 한 세대 감염성 바이러스 입자를 생성한다. 그 후 이들 바이러스 입자는 전이 유전자 발현을 위한 표적 세포를 감염시키는데 이용된다. 그러나 비구조 및 구조 바이러스 요소를 코딩하는 서열 요소 사이에 재조합은 생체 내 상당한 세포변성 효과를 매개할 수 있는 복제 가능한(replication competent) 알파 바이러스 입자를 생산할 수 있기 때문에 안정성 문제가 제기된다.
상기 문제에 가능한 해결책은 포유동물 세포의 세포질로 알파 바이러스 레플리콘을 전달하여 어떠한 핵의 개입 없이 관심 유전자를 자율적으로 복제하고 발현할 수 있는 관련없는 VLP를 이용하는 것이다. 이러한 VLP는 세 개의 벡터를 이용하여 생산될 수 있다. 제1 벡터는 포유동물 프로모터(예를 들어, CMV) 조절하의 알파 바이러스 레플리콘의 코딩 서열, 레트로바이러스 특이적 RNA 팩케이징(packaging) 신호, 및 관심 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 유전자는 치료 또는 연구 용도의 단백질, 또는 shRNA 또는 기타 조절 핵산을 발현할 수 있다. 제2 벡터는 레트로바이러스 Gag를 포함한다. 제3 벡터는 표적 세포의 감염에 적합한 외피 당단백질을 제공할 것이다.
적합한 팩케이징 세포주 내에 동시 형질감염 시, 제1 벡터에 존재하는 세포 프로모터로부터 전사되는 RNA 분자는 제2 벡터로부터 생산된 VLP로 팩케이징될 것이다. 이러한 VLP는 알파 바이러스 기반의 레플리콘을 VLP에 존재하는 외피 당단백질을 기초로 하여 표적 세포에 전달할 수 있다. 일단 세포 안에서, 숙주 번역 기구는 도입된 알파 바이러스 RNA를 번역하고 알파 바이러스 복제 단백질을 생산할 것이고, 차례로 RNA를 증폭하고 관심 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 발현할 것이다. 상기에 기재된 것과 같은 변이 레플리콘은 숙주 세포에 최소한의 영향을 주면서 발현 기간을 크게 연장시킬 수 있다. 게다가, 알파 바이러스의 구조 요소를 위한 DNA 코딩 유전자는 표적 세포 내에 존재하지 않을 것이며, 따라서 제안된 시스템의 안정성은 크게 상승된다.
VLP에 관한 조성물, 기재된 VLP의 제조 및 이용 방법을 본원에서 기재한다. 기재된 조성물은 VLP, 및 기재된 VLP를 생산하는데 사용되는 벡터 및 세포를 포함한다. 본원에 기재된 관련 방법은 VLP의 제조 방법, VLP를 이용한 세포의 형질도입 방법, 및 본원에 기재된 VLP를 이용하여 표적 세포 내에서 관심 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 바이러스 감염의 위험 없이 표적 세포에서 관심 단백질 또는 폴리뉴클레오티드을 발현하도록 하는 알파 바이러스 기반 레플리콘을 기재한다.
본원에서, 알파 바이러스 구조 단백질을 코딩하지 않는 알파 바이러스 기반 레플리콘을 포함하는 VLP를 생산하는데 사용하기 위한 벡터를 기재한다. 이러한 종류의 VLP를 생산하기 위해서, 여러 구성요소는 이들 구성요소를 코딩하는 한 가지 이상의 벡터를 시험관 내 생산을 위한 세포주에 형질감염 또는 핵감염시킴으로써 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 구성요소는 생성 VLP가 복제 가능하게 될 가능성을 감소시키기 위해 분리된 벡터에 의해 코딩된다. 예를 들어, 한 플라스미드는 VLP에 의해 팩케이징되는 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질을 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 유전 물질을 코딩하고, 또 다른 플라스미드는 gag와 같은 VLP의 구조 단백질을 코딩하고, 또 다른 플라스미드는 표적 세포막에 VLP 융합을 가능하게 하는 VSV-G와 같은 융합 단백질을 코딩하는 다중 플라스미드 시스템이 이용될 수 있다.
숙주 세포에 의해 팩케이징되는 유전 물질을 코딩하는 벡터는 선택 가능하거나 유도 가능한 플라스미드와 같은 다양한 형태를 가질 수 있지만, 일반적으로 약간의 공통된 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 RNA 알파 바이러스 기반 레플리콘을 코딩하는 벡터는 프로모터 서열, 레트로바이러스 팩케이징 신호 서열, 번역 개시 서열, 비구조 알파 바이러스 단백질, 관심 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 클로닝 부위, 삽입된 관심 유전자 또는 폴리뉴클레오티드, 3' 비번역 영역, 및 폴리-아데노신 꼬리 분절을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 벡터의 분절을 숙주 세포에 의해 전사되도록 하는 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 서열은 VLP로 팩케이징되는 RNA로 전사될 수 있다. 기재된 벡터의 대부분의 실시양태에서, 프로모터 서열은 벡터 내에 포함된 모든 번역 가능한 요소의 상류에 위치할 것이다(예를 들어 거대세포바이러스 프로모터 "pCMV"의 위치를 나타내는 [도 1]을 참조). 본원에 기재된 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 바이러스, 예를 들어 CMV, 또는 원숭이 바이러스 40(SV40)으로부터 유래할 것이다. 수많은 기타 프로모터 서열은 당업자에게 잘 알려져 있으며 본원에 기재된 벡터와 함께 그들의 사용은 제공된 기재 내용을 기초로 하여 자명할 것이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포에 의해 팩케이징되는 유전 물질을 코딩하는 기재된 벡터는 벡터로부터 전사되는 한 개 또는 두 개 이상의 카피의 RNA 서열을 숙주 세포 내에 형성된 VLP 입자로 팩케이징되도록 하는 레트로바이러스 팩케이징 신호 서열(프사이(Ψ) 요소로도 알려짐)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 전부는 아니더라도 대부분의 레트로바이러스는 상기 특성의 팩케이징 서열을 가지며, 따라서, 상기 서열과 기재된 벡터로 그의 편입은 당업자에게 자명할 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터는 라우스(Rous) 육종 바이러스, 몰로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV: simian immunodeficiency virus), HIV, 인간 T-림프친화 바이러스 등으로부터 유래한 레트로바이러스 팩케이징 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 레트로바이러스 팩케이징 서열은 라우스 육종 바이러스로부터 유래한다. 별법으로, 레트로바이러스 팩케이징 서열은 마우스 백혈병 바이러스로부터 유래한다.
본원에 기재된 숙주 세포에 의해 팩케이징되는 유전 물질을 코딩하는 벡터의 또 다른 측면은 벡터에 의해 코딩되는 RNA 서열이 숙주 세포 내에서 번역되도록 하는 번역 개시 서열이다. 일부 실시양태에서, 기재된 번역 개시 서열은 알파 바이러스에 기초한 비구조 단백질의 발현을 가능하게 할 수 있으며, 이는 일단 숙주 세포로 전달된다면 기재된 VLP에 의해 운반되는 RNA 서열을 복제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 번역 개시 서열은 관심 유전자의 발현을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 번역 개시 서열은 관심 유전자가 숙주 세포 번역 복합체에 의해 번역되도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 번역 개시 서열은 알파 바이러스, 예를 들어 신드비스 바이러스 또는 VEEV로부터 유래할 수 있다. 다른 실시양태에서, 번역 개시 서열은 다른 유전자, 예를 들어 포유동물 번역 복합체에 의해 RNA 서열의 번역을 개시할 수 있는 번역 개시 서열을 갖는 것으로 공지된 바이러스 유전자로부터 유래할 수 있다. 별법으로, 번역 개시 서열은 다른 유전자, 예를 들어 기재된 알파 바이러스 레플리콘으로 삽입된 관심 유전자의 천연 번역 개시 서열로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 번역 개시 서열은 팩케이징된 RNA 분자 내 여러 위치에 위치될 수 있으며, 따라서 기재된 벡터에 의해 여러 번 코딩될 수 있다. 예를 들어, 팩케이징된 RNA 분자에 의해 코딩된 관심 유전자와 별개로, 기재된 신드비스 또는 VEEV 비구조 단백질을 번역하는 것이 바람직할 수 있다. 이 같은 경우에, 비구조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들) 및 관심 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 모두는 벡터 및 팩케이징된 RNA 내 그들의 5' 위치에 위치하는 별개의 번역 개시 서열을 가질 것이다. 이러한 기재 내용을 바탕으로, 당업자는 포유동물 세포에서 RNA의 번역을 가능하게 할 수 있는 다양한 번역 개시 서열을 기재된 VLP에 팩케이징된 본원에 기재된 RNA에 포함시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
또한, 숙주 세포에 의해 팩케이징되는 유전 물질을 코딩하는 벡터는 비구조 알파 바이러스 단백질, 예를 들어 SIN 또는 VEEV의 비구조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 한 가지 이상의 신드비스 바이러스 비구조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 한 가지 이상의 VEEV 비구조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 SIN 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 SIN 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 SIN 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP1, NSP2, NSP3, 및 NSP4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 알파 바이러스 비구조 단백질을 코딩하는 기재된 벡터의 폴리뉴클레오티드는 신드비스 바이러스 또는 VEEV의 게놈과 같은 알파 바이러스 게놈의 해당 게놈 서열로부터 유래할 것이다. 일부 실시양태에서, 구조 단백질이 존재하는 비구조 단백질 서열과 동일하거나 상이한 알파 바이러스로부터 유래하던지 관계없이, 알파 바이러스 비구조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에는 알파 바이러스 구조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 전혀 없다.
또한, 숙주 세포에 의해 팩케이징되는 유전 물질을 포함하기 위한 본원에 기재된 벡터는 벡터에 의해 코딩되는 유전 물질을 포함하는 VLP에 의해 형질도입되는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있는 관심 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 VLP로 팩케이징되는 RNA 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩할 수 있으며, 그 후 세포의 VLP 매개된 형질도입에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 일단 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 표적 세포로 전달되면, RNA에 의해 코딩되는 관심 폴리뉴클레오티드는 관심 단백질의 발현을 제공할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 벡터는 일단 표적 세포 안에서 관심 유전자를 발현할 수 있는 VLP 안으로 팩케이징하기 위한 RNA를 코딩하도록 설계된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 기재된 벡터의 일부 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 관심 단백질을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 일부 실시양태에서 녹색 형광 단백질(GFP: green fluorescent protein)을 코딩하여 표적 세포의 바이러스 형질도입을 검출할 수 있는 표지로서 역할을 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 세포에 내인성 단백질의 기능성 형태를 코딩할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 피험체에 내인성 단백질의 기능성 형태를 코딩할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 세포에 외래인 단백질을 코딩할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 피험체에 외래인 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 세포에 치료 효과를 가질 수 있는 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 피험체에 치료 효과를 가질 수 있는 단백질을 코딩할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에서 간섭 RNA 분자로서 역할을 하고 내인성 유전자 발현을 조절하는 기능을 할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA 간섭을 개시하는 RNA 머리핀 루프의 형성을 제공하는 서열을 포함할 수 있다. 게다가, 관심 폴리뉴클레오티드는 팩케이징된 RNA 분자에 의해 코딩된 알파 바이러스 비구조 단백질에 의해 형성된 RNA 의존성 RNA 폴리머라제에 의해 전사될 수 있는 양성 또는 음성 센스 가닥 RNA일 수 있다. 상기 RNA 의존성 RNA 폴리머라제는 양성 센스 및 음성 센스 방향으로 RNA를 전사할 수 있기 때문에, miRNA 또는 shRNA와 같은 간섭 RNA 서열은 팩케이징된 RNA 레플리콘으로 삽입될 수 있고 양방향으로 간섭 폴리뉴클레오티드를 코딩하도록 설계될 수 있다. 당업자는 기재된 형질도입 시스템이 피험체에서 선택된 단백질의 발현을 가능하게 할 수 있기 때문에, 기재된 형질도입 시스템의 이러한 측면의 치료 특성을 인식할 것이다. 기재된 벡터의 이러한 측면에 따라, 관심 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 용이하게 하기 위해 한 개 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는 클로닝 부위도 벡터에 포함될 수 있다.
본원에 기재된 VLP 생산에 유용한 또 다른 벡터는 바이러스 구조 단백질을 코딩하는 벡터이다. 이 같은 단백질의 한 부류는 레트로바이러스군-특이적 항원 (gag) 단백질이다. gag 단백질은 레트로바이러스의 코어 구조 단백질이고, 일부 경우에, 진핵 세포에서 발현될 때 외피 바이러스 코어를 형성할 수 있다. 이러한 특성은 gag 단백질이 VLP 생산에 특히 유용하게 만드는데, 그들이 입자의 기본 구조적 측면을 형성하고 레트로바이러스 팩케이징 신호 서열과 결합된 RNA의 팩케이징을 가능하게 할 수 있기 때문이다. 따라서, 레트로바이러스 gag 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 본원에서 기재한다. 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 레트로바이러스의 gag 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 숙주 세포 RNA 폴리머라제에 의해 gag 유전자 서열이 mRNA로 전사되도록 하는 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열은 SV40 또는 CMV와 같은 바이러스로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 관심 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 것이다. 당업자는 어떤 레트로바이러스로부터 유래한 gag 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열이든 본원에 기재된 벡터 및 VLP를 생산하는데 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, gag 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 라우스 육종 바이러스로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, gag 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 마우스 백혈병 바이러스로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, gag 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SIV로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, gag 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 T-림프친화 바이러스로부터 유래할 수 있다.
본원에 기재된 VLP의 생산에 유용한 또 다른 벡터는 VLP 외피와 숙주 세포 사이에 융합을 매개하는 단백질을 코딩하는 벡터이다. 이러한 목적에 적합한 단백질 부류는 외피 바이러스가 그의 막과 숙주 세포의 막을 융합하도록 함으로써 세포의 바이러스 감염을 가능하게 하는 바이러스 융합 단백질이다. 또한, 많은 바이러스 융합 단백질은 선택된 세포 유형의 표적화를 가능하게 할 수 있는 공지되거나 추측되는 세포 수용체 단백질을 가지는데, 그렇지 않으면, 예를 들어 인플루엔자 바이러스의 경우 시알산과 같이 보다 편재되어 있는 수용체의 경우, 보다 일반화된 표적화가 달성될 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 융합 단백질은 바이러스 부착 단백질, 세포 수용체의 리간드, 세포 리간드의 수용체, 또는 부속 단백질과 함께 작용하며, 따라서 이러한 종류의 단백질도 기재된 벡터에 의해, 추가적으로, 또는, 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 벡터에 의해서 코딩될 수 있다. 별법으로, 일부 실시양태에서, 한 바이러스로부터 유래한 바이러스 융합 단백질은 원하는 세포 유형에 VLP의 표적화를 가능하게 하거나 지시하기 위해서 또 다른 바이러스의 바이러스 부착 단백질, 세포 수용체의 리간드, 세포 리간드의 수용체, 또는 부속 단백질과 함께 기재된 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 융합 단백질, 바이러스 부착 단백질, 세포 수용체의 리간드, 세포 리간드의 수용체, 또는 부속 단백질은 세포 표면에 존재할 때 단백질 세포 외 도메인이 세포 외로 향하도록 하는 I형 막 단백질일 수 있다. 또한, 이것은 융합 단백질이 팩케이징 세포로부터 VLP의 출아 후 정확하게 배치되도록 해줄 것이다. 세포 내에서 이러한 단백질의 발현은 결과적으로 세포 표면이 단백질로 코팅되도록 해주어 세포막의 어떤 부분에서든 VLP의 출아가 VLP에 그 표면상 일정량의 융합 단백질에 제공할 것이다. 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 융합 단백질 유전자 서열이 숙주 세포 RNA 폴리머라제에 의해 mRNA로 번역되도록 하는 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열은 SV40 또는 CMV와 같은 바이러스로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 기재된 벡터는 바이러스 부착 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 부착 단백질 유전자 서열이 숙주 세포 RNA 폴리머라제에 의해 mRNA로 번역되도록 하는 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열은 SV40 또는 CMV와 같은 바이러스로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터는 수포성 구내염 바이러스 G 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터는 인플루엔자 뉴라미니다제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터는 호흡기 세포융합 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터는 로타바이러스 VP7 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 기타 이 같은 융합 단백질은 연관된 바이러스의 바람직한 친화성 또는 세포 표적을 기초로 하여 당업자에게 자명할 것이다.
기재된 벡터를 발현하는 세포
본원에서, VLP를 생산하기 위한 기재된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 이들 세포는 벡터의 폴리뉴클레오티드를 전사하거나 발현함으로써 본원에 기재된 VLP를 생산하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자 또는 폴리뉴클레오티드와 팩케이징 신호를 가진 알파 바이러스 RNA 구조물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 가진 벡터, 레트로바이러스 gag 단백질을 코딩하는 벡터, 및 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는 VLP 내부에 수용된 한 개 또는 두 개 카피의 코딩된 알파 바이러스 RNA 구조물과 함께 표면상에 발현된 바이러스 융합 단백질을 가진 VLP를 생산할 수 있다. 게다가, 상기 어떤 벡터도 알파 바이러스 구조 단백질을 코딩하지 못하기 때문에, 알파 바이러스 구조 단백질을 포함하는 시스템과 비교하여 감염성 바이러스를 생성할 가능성이 실질적으로 감소된다.
기재된 세포는 기재된 벡터의 폴리뉴클레오티드를 전사하고, 필요한 경우(예를 들어 gag 및 융합단백질의 경우) 번역할 수 있는 임의의 진핵 세포일 수 있다. 세포는 많은 실시양태에서 포유동물 세포일 것이다. 예를 들어, 설취류 세포, 예를 들어 마우스, 햄스터(CHO 또는 BHK-21), 또는 랫트 세포가 기재된 벡터를 발현하는데 사용될 수 있고, 마딘 다비(Madin Darby) 개과 신장 세포가 기재된 벡터를 발현하는데 사용될 수 있고, 영장류 세포, 예를 들어 vero 세포가 기재된 벡터를 발현하는데 사용될 수 있고, 인간 세포, 예를 들어 HEK293T 세포(인간 신장), Hep-2 세포(인간 기도), Caco-2(장), HeLa(상피), 및 기타 당 업계에 공지된 이 같은 세포주가 기재된 벡터를 발현하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 세포는 당 업계에 공지된 표준 형질감염 및 선별 방법을 이용하여 기재된 한 가지 이상의 벡터를 안정적으로 포함하도록 형질감염되고 선별될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 세포주는 관심 단백질을 코딩하는 알파 바이러스 레플리콘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, gag 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 및 이종 융합유도성 외피 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함할 것이며, 상기 어떤 벡터나 세포는 알파 바이러스 구조 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 알파 바이러스 레플리콘은 신드비스 바이러스 또는 VEEV로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 알파 바이러스 레플리콘은 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, 및 레트로바이러스 팩케이징 신호를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 팩케이징 신호는 라우스 육종 바이러스 또는 마우스 백혈병 바이러스로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, gag 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 라우스 육종 바이러스로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 이종 융합유도성 외피 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 VSV-G를 코딩한다.
바이러스 유사 입자
또한, 벡터 및 세포를 이용하여 생산된 VLP가 본원에서 기재된다. 본원에서 기재된 VLP는 다음 4가지 일반적인 특징을 가질 것이다; VLP는 알파 바이러스 레플리콘을 코딩하는 한 개 또는 두 개의 RNA 분자, 및 선택적으로 관심 단백질을 포함할 것이다; VLP는 레트로바이러스 gag 단백질 또는, 일부 실시양태에서, gag 융합 단백질을 포함하는 바이러스 코어를 가질 것이다; VLP는 세포와의 융합을 가능하게 하는 표면 단백질을 가질 것이고, 알파 바이러스 구조 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포함하지 않을 것이다.
본원에 기재된 VLP는 세포를 형질도입시켜 그 안에 관심 단백질을 발현하는데 유용할 것이다. 따라서, 기재된 VLP는 관심 단백질을 코딩할 수 있는 한 개 또는 두 개의 알파 바이러스에 기초한 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. RNA 서열의 번역을 가능하게 하기 위하여, 기재된 팩케이징된 RNA의 일부 실시양태는 본원에서 기재된 번역 개시 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, VLP 안에 포함된 RNA 서열은 형성되는 VLP로 RNA의 봉입을 가능하게 할 레트로바이러스 팩케이징 서열을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 팩케이징 서열은 라우스 육종 바이러스, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스, SIV, HIV, 인간 T-림프친화 바이러스 등으로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 레트로바이러스 팩케이징 서열은 라우스 육종 바이러스로부터 유래한다. 별법으로, 레트로바이러스 팩케이징 서열은 마우스 백혈병 바이러스로부터 유래할 수 있다. 게다가, VLP에 포함된 RNA 서열은 비구조 알파 바이러스 단백질을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 팩케이징된 RNA는 한 가지 이상의 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 팩케이징된 RNA는 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP1을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 팩케이징된 RNA는 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP2를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 팩케이징된 RNA는 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP3을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 팩케이징된 RNA는 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP4를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 팩케이징된 RNA는 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP1, NSP2, NSP3, 및 NSP4를 코딩할 수 있다. 팩케이징된 RNA는 또한 관심 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 관심의 폴리뉴클레오티드 서열은 일부 실시양태에서, GFP를 코딩하여 표적 세포의 바이러스 형질도입을 검출할 수 있는 지표로 역할을 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 세포에 내인성 단백질의 기능성 형태를 코딩할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 피험체에 내인성 단백질의 기능성 형태를 코딩할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 세포에 외래인 단백질을 코딩할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 피험체에 외래인 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 세포에 치료 효과를 가질 수 있는 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 피험체에 치료 효과를 가질 수 있는 단백질을 코딩할 수 있다. VLP가 세포 또는 피험체에서 선택된 단백질의 발현을 가능하게 할 수 있기 때문에 당업자는 기재된 VLP의 상기 측면의 치료 특성을 인식할 것이다.
또한, 본원에 기재된 VLP는 입자에 바이러스 코어 구조를 제공하는 바이러스 gag 단백질을 포함할 수 있다. gag 단백질은 레트로바이러스의 코어 구조 단백질이고, 일부 경우에, 진핵세포에서 발현될 때 외피 바이러스 코어를 형성할 수 있다. 이러한 특성은 gag 단백질이 VLP 생산에 특히 유용하게 하는데, 그 이유는 그들이 입자의 기본 구조적인 측면을 형성하고 레트로바이러스 팩케이징 신호 서열과 결합된 RNA의 팩케이징을 가능하게 할 수 있기 때문이다. 당업자는 임의의 레트로바이러스의 gag 단백질이 본원에 기재된 벡터 및 VLP를 생산하는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, gag 단백질은 라우스 육종 바이러스로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, gag 단백질은 마우스 백혈병 바이러스로부터 유래할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, gag 단백질은 SIV, HIV, 인간 T-림프친화 바이러스, 또는 유사한 레트로바이러스로부터 유래할 수 있다.
본원에 기재된 VLP의 또 다른 구성성분은 VLP 외피와 숙주 세포 사이에 융합을 매개하는 단백질이다. 이러한 목적에 적합한 단백질 부류는 바이러스 융합 단백질이며, 이것은 외피 바이러스가 그의 막과 숙주 세포의 막을 융합하도록 함으로써 세포의 바이러스 감염을 가능하게 한다. 또한, 많은 바이러스 융합 단백질은 선택된 세포 유형의 표적화를 가능하게 할 수 있는 공지되거나 추측되는 세포 수용체 단백질을 가지는데, 그렇지 않으면, 예를 들어 인플루엔자 바이러스의 경우 시알산과 같이 보다 편재되어 있는 수용체의 경우, 보다 일반화된 표적화가 달성될 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 융합 단백질은 바이러스 부착 단백질, 세포 수용체의 리간드, 세포 리간드의 수용체, 또는 부속 단백질과 함께 작용할 수 있으며, 따라서 이러한 종류의 단백질도 바이러스 융합 단백질 이외에 VLP 표면에 존재할 수 있다. 별법으로, 일부 실시양태에서, 기재된 VLP는 원하는 세포 유형에 VLP의 표적화를 가능하게 하거나 지시하기 위해 한 바이러스로부터 유래한 바이러스 융합 단백질 및 또 다른 바이러스의 바이러스 부착 단백질, 세포 수용체의 리간드, 세포 리간드의 수용체, 또는 부속 단백질을 가질 수 있다. 유사하게, 기재된 VLP는 VLP 외피 내에 여러 개의 융합 단백질을 갖도록 제조될 수 있는데, 이것은 선택된 다양한 세포 유형에 융합을 가능하게 할 수 있기 때문이다. 일부 실시양태에서, VLP 표면 단백질(들)은 세포 표면에 존재할 때 단백질의 세포 외 도메인이 세포 외로 향하도록 하는 I형 막 단백질일 수 있다. 또한, 이것은 융합 단백질이 팩케이징 세포로부터 VLP의 출아 후 정확하게 배치되도록 해줄 것이다. 통상적으로, 세포 내에서 이러한 단백질의 발현은 결과적으로 세포 표면이 단백질로 코팅되도록 해주어 세포막의 어떤 부분에서든 VLP의 출아가 VLP에 그 표면상 일정량의 융합 단백질을 제공할 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 VLP는 세포 융합을 매개하는 VSV-G 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 VLP는 세포 융합을 매개하는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 VLP는 세포 융합을 가능하게 하는 인플루엔자 뉴라미니다제 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 VLP는 호흡기 세포융합 바이러스 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 VLP는 로타바이러스 VP7 단백질을 포함한다. 그 밖의 융합 단백질은 관련된 바이러스의 바람직한 친화성 또는 세포 표적을 기초로 하여 당업자에게 자명할 것이다.
본원에서 기재된 VLP는 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 관심 단백질, 레트로바이러스의 gag 단백질, 및 이종 융합유도성 외피 단백질을 코딩하는 알파 바이러스 레플리콘을 포함할 수 있으며, 상기 VLP는 알파 바이러스 구조 단백질 유전자를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, VLP의 알파 바이러스 레플리콘은 신드비스 바이러스 또는 VEEV로부터 유래한다. 예를 들어, 본원에서 기재된 VLP는 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP1, NSP2, NSP3, 및 NSP4를 코딩하는 알파 바이러스 레플리콘을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 VLP에서 팩케이징된 RNA와 결합된 레트로바이러스 팩케이징 신호는 라우스 육종 바이러스 또는 마우스 백혈병 바이러스로부터 유래한다. 상기 기재내용을 바탕으로, 당업자는 기재된 VLP가 VLP 안정성, RNA 팩케이징, 또는 세포 진입을 가능하게 할 수 있는 바이러스의 측면을 포함하도록 변형될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 이러한 변형은 본원에 제공된 개시 내용의 범위 내에 있다는 것으로 이해해야한다.
한 실시양태는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 알파 바이러스 레플리콘을 포함하는 VLP로 이루어지며, 상기 폴리뉴클레오티드는 클래스 II 주요 조직적합성 항원의 두 가지 서브유닛, 레트로바이러스 gag 단백질 및 융합유도성 외피 단백질을 코딩하는 서열을 포함하고, 상기 VLP는 알파 바이러스 구조 단백질 분자를 포함하는 않는다.
VLP의 재조합 폴리펩티드는 공자극 신호 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 공자극 신호 단백질은 CD28, CD80, CD86, 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 공자극 신호 단백질은 CD80을 포함한다.
기재된 VLP의 제조 방법
제공된 개시 내용을 기초로 하여 당업자에게는 명백하둣이, 본원에서 기재된 VLP는 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 다양한 방법의 공통점은 필수적인 단백질(gag 및 융합 단백질)을 발현하고 알파 바이러스 기반 RNA 레플리콘을 생산할 수 있는 세포에서 기재된 벡터의 발현이다. 따라서, 본원에 기재된 VLP 제조 방법은 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 관심 단백질을 코딩하는 알파 바이러스 레플리콘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 레트로바이러스의 gag 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 및 이종 융합유도성 외피 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 진핵 세포를 동시 형질전환, 형질감염, 또는 핵감염시키는 단계; 및 각 벡터가 그의 코딩된 산물을 생산하도록 하기에 적합한 조건하에서 동시 형질전환된 세포를 배양함으로써 바이러스 유사 입자를 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 알파 바이러스 레플리콘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 신드비스 바이러스 또는 VEEV로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 알파 바이러스 레플리콘은 신드비스 바이러스 또는 VEEV 비구조 단백질 NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, 및 레트로바이러스 팩케이징 신호를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스의 팩케이징 신호는 라우스 육종 바이러스 또는 마우스 백혈병 바이러스로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, gag 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 라우스 육종 바이러스로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 이종 융합유도성 외피 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 VSV-G를 코딩한다.
조성물 및 투여 방법
본원에서, 적어도 한 가지의 기재된 VLP 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 기재한다. 상기 조성물은 예를 들어 외인성 단백질의 발현 또는 피험체와 동일한 종에서 정상적으로 발견되는 단백질의 증가된 발현을 필요로 하는 피험체에 투여하는데 유용하다. 조성물은 본원에서 기재되고 예시된 것을 포함하여 당 업계에 공지되고 적합한 다양한 어떤 제제로든 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 수성 제제이다. 물 또는 적합한 생리 완충액 중에 VLP를 혼합하고, 선택적으로 기재되는 바와 같은 적합한 착색제, 향미제, 방부제, 안정화제, 및 증점제 등을 첨가하여 수용액을 제조할 수 있다. 또한, 천연 또는 합성 검, 수지, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 및 기타 잘 알려진 현탁화제와 같은 점성 물질을 포함한 물 또는 생리 완충액 중에 VLP를 현탁하여 수성 현탁액을 제조할 수 있다.
조성물은 피험체에 주사용으로 제제화될 수 있다. 주사의 경우, 기재된 조성물은 물 또는 생리적으로 적합한 완충액, 예를 들어 행크스 용액, 링거액, 또는 생리 식염 완충액과 같은 수용액에 제제화될 수 있다. 용액은 현탁화제, 안정화제 또는 분산제와 같은 한 가지 이상의 제제화 제제를 포함할 수 있다. 또한, 주사제는 예를 들어, 멸균수, 식염수, 또는 알코올과 같은 적합한 비히클과 사용 전 재구성하여, 주사에 적합한 액상형 제제로 사용 직전에 전환되도록 의도된 고형 제제로서 제조될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 약학 조성물을 비경구적으로 투여할 수 있다. 약학 조성물은 정맥 내에 의해 투여될 수 있다. 약학 조성물은 조직, 바람직하게는 종양 또는 암에 주사에 의해 투여될 수 있다.
조성물은 피험체에 에어로졸화된 전달용으로 제제화될 수 있다. 에어로졸 전달의 경우, 기재된 조성물은 물 또는 생리적으로 적합한 완충액, 예를 들어 행크스 용액, 링거액, 또는 생리 식염 완충액 중에 수용액으로 제제화될 수 있다. 용액은 한 가지 이상의 현탁화제, 안정화제 또는 분산제와 같은 제제화 제제를 포함할 수 있다.
조성물은 서방형 비히클 또는 데포 제제로 제제화될 수 있다. 이러한 지속적 작용 제제는 이식(예를 들어 피하 또는 근육 내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 조성물은 적합한 중합 또는 소수성 물질(예를 들어 허용 가능한 오일 내 에멀전으로) 또는 이온 교환 수지와, 또는 좀 녹는 유도체, 예를 들어 좀 녹는 염으로서 제제화될 수 있다. 리포솜 및 에멀전은 소수성 약물용 담체로서 사용하기에 적합한 전달 비히클의 잘 알려진 예이다.
치료 방식
본원에 개시된 방법은 환자가 종양을 갖는 질환의 예방 또는 치료에 관한 것일 수 있다. 환자는 암 환자일 수 있고, 바람직하게는 암 환자는 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 신장암종, 폐암, 위암, 췌장암, 교모세포종, 및 대장암으로부터 유래한 고형 종양을 가진 암 환자군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 유방암 환자일 수 있다. 따라서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 종양 특이적 항원, 바람직하게는 알파 태아단백질(AFP), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, 칼시토닌, 칼레티닌, 암성태아성 항원, 크로모그라닌, 시토케라틴, 데스민, 상피 막 단백질(EMA), 인자 VIII, FL1, 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP), GCDFP-15, HMB-45, 인간 융모성 생식선 자극호르몬(hCG), 인히빈, 케라틴, 림프구 마커, MART-1(멜란-A), Myo D1, 근육 특이적 액틴(MSA), 신경미세섬유, 뉴런 특이적 에놀라아제(NSE), 태반 알칼리 포스파타제(PLAP), 전립선 특이적 항원, S100 단백질, 평활근 액틴(SMA), 시냅토파이신, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 종양 M2-PK, 비멘틴, 분화 클러스터 10(CD10), CD13, CD15, CD20, CD25, CD30, CD31, CD34, CD45(PTPRC), CD99, CD117, 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 약학 조성물을 비경구 투여할 수 있다. 약학 조성물은 정맥 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 약학 조성물은 주사에 의해 종양 내에 투여될 수 있다.
본원에 기재된 방법에서, 약학 조성물은 화학요법 약물과 병용하여 투여될 수 있다. 화학요법 약물은 탁산(파클리탁셀 또는 도세탁셀), 안트라사이클린(독소루비신 또는 에피루비신), 시클로포스파미드, 카페시타빈, 타목시펜, 레트로졸, 카보플라틴, 젬시타빈, 시스플라틴, 엘로티닙, 이리노테칸, 플루오로우라실, 및 옥살리플라틴으로 이루어진 약물 부류로부터 선택될 수 있다. 약학 조성물은 방사선 요법과 병용하여 투여될 수 있다.
본원에 기재된 방법에서, 약학 조성물은 종양 특이적 CD8+ 세포 용해성 T 세포를 유도한다. 방법은 종양 특이적 면역을 유도하는 클래스 II MHC 항원을 포함하는 VLP를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본원에 기재된 방법은 감염성 질환의 예방 또는 치료에 관한 것이다. 따라서, 재조합 폴리펩티드는 감염원의 서열을 더 포함할 수 있다. 감염원은 감염성 바이러스일 수 있다.
하기 실시예는 예시 목적으로 제공되며 상기 개시 내용을 보강하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1 - 알파 바이러스 기반 유전자 발현 시스템의 생성
알파 바이러스 유전자 발현 시스템은 관심 외인성 유전자(GOI: exogenous gene of interest) 또는 관심 단백질(POI: protein of interest)을 표적 세포에 세포변성 바이러스 감염을 일으킬 낮은 위험성을 가지고 VLP-매개 전달이 가능하도록 설계하였다. 형질도입하는 VLP를 생산하는 팩케이징 세포주에서 발현될 수 있는 3가지 벡터를 이용한 발현 시스템을 설계하였다. 한 벡터는 알파 바이러스 기반 발현 구조물을 코딩하고, 또 다른 벡터는 VLP 형성을 가능하게 하는 레트로바이러스 gag 단백질을 코딩하고, 세 번째 벡터는 숙주 세포에 VLP 융합을 매개하는 융합 단백질을 코딩한다. 게다가, 시스템은 알파 바이러스 구조 단백질의 존재를 요구하지 않으면서 작용하도록 제작하였다.
상기를 달성하기 위하여, 거대세포바이러스 프로모터(CMV); 이어서, 각각의 레트로바이러스 팩케이징 단백질 GAG의 레트로바이스 팩케이징 신호; 이어서 비구조 단백질 NSP1, NSP2, NSP3, 및 NSP4를 코딩하는 신드비스 또는 VEE 바이러스 유전자; 마지막으로, 재조합 폴리뉴클레오티드로 이루어지고 다중 클로닝 부위에 삽입된, 관심 유전자의 발현을 유도하는 한 개 이상의 서브게놈 프로모터(SGP; subgenomic promoter)(결과적으로 mRNA를 형성하는, 바이러스 코딩된 RNA 의존성 RNA 폴리머라제의 프로모터); 3' 비번역 영역(URT: untranslated region); 및 폴리A 꼬리(도 1)을 가진 알파 바이러스 기반 DNA 플라스미드를 제조하였다.
또 다른 플라스미드는 레트로바이러스의 gag 단백질, 제2의 선택적인 관심 단백질(POI)을 코딩하도록 제작하였다. 제3의 플라스미드는 VSV-G 바이러스 융합 단백질의 발현을 제공하도록 제작하였다.
일단 플라스미드가 제작되면, 관심 유전자를 가진 신드비스 바이러스 레플리콘을 포함하는 VLP를 생산하는 능력에 대해 플라스미드를 시험하였다. 본 실험을 위해, 유전자의 전달 및 세포 내 발현을 용이하게 하기 위하여 GFP를 관심 유전자로서 사용하였다. VLP를 생산하기 위하여, 상기에 기재된 세 개의 플라스미드 각각은 아막사(Amaxa) 시스템(Lonza)을 이용한 표준 핵감염 절차를 이용하여 제조사의 지시에 따라 새끼 햄스터 신장(BHK-21)에 형질감염시켰다.
간략하게, 3x106개의 BHK-21 세포를 100 ㎕의 핵감염 용액 L(Amaxa) 중에 재현탁하고 GAG를 코딩하는 플라스미드 4.5 μg, VSV-G 당단백질을 코딩하는 플라스미드 3 μg 및 신드비스 알파 바이러스 레플리콘을 코딩하는 플라스미드 100 ng 또는 VEE 레플리콘 2.5 μg(전체 부피 10 ㎕)을 포함하는 관으로 옮겼다. 세포와 플라스미드의 혼합물을 핵감염 큐벳에 옮기고 BHK-21에 대한 설정값을 이용한 아막사 뉴클레오펙터(nucleofector) II 장치를 이용하여 핵감염시켰다. 핵감염된 세포를 500 ㎕의 완전 배양 배지에 재현탁하고 배양 배지액을 포함하는 조직 배양 플레이트로 옮기고 37℃에서 72-96시간 또는 32℃에서 72시간 인큐베이션하였다. 그 후, VLP와 캡시드에 싸인 알파 바이러스 레플리콘으로 이루어진 상등액을 4℃에서 3000 RPM/10분 원심분리하여 청정하고, 0.45 um 필터로 여과하고 실온에서 30분간 10 units의 DN아제 I(turboTM-DNAse: Ambion)에 노출시켰다. 처리된 VLP를 4℃에 보관하거나 드라이아이스에서 냉동시키고 -80℃로 옮겼다. 또한, 음성 대조군(융합-결함 VLP)으로서, BHK-21 세포를 VSV-G를 코딩하는 pEnvelope 플라스미드를 제외하고 pCMV-Sin Rep-POI-2 또는 VEEV-Rep-POI 및 pGAG-POI-1 플라스미드로만 핵감염시켰다. 형질감염 후, 플라스미드로 유도된 VLP의 생산을 허용하는 정상적인 성장 조건하의 조직 배양 배지에서 48-72시간 동안 세포를 인큐베이션하였다. 형질감염된 세포 인큐베이션이 종료되면, 생산된 모든 VLP를 포함하는 조직 배양 상등액을 수집하였다. 그 후 수집한 세포 상등액을 배양된 BHK-21 세포에 첨가하여 세포가 GFP로 성공적으로 형질도입될 수 있는 지를 결정하였다. 세 가지 플라스미드 모두로 형질감염된 BHK-21 세포로부터 수집한 세포 상등액은 형질감염되지 않은 BHK-21 세포에 노출되었을 때 GFP를 강력하게 발현하였다. 반대로, pCMV-Sin Rep-POI-2와 pGAG-POI-1 플라스미드로만 형질감염된 BHK-21 세포로부터 수집한 세포 상등액과 인큐베이션된 형질감염되지 않은 BHK-21 세포의 경우 GFP 발현이 관찰되지 않았다. 제작된 VLP가 인간 세포를 형질도입시킬 수 있다는 것을 증명하기 위해서 인간 배아 신장(HEK293T) 세포를 이용하여 유사한 실험을 수행하였다. 게다가, 제작된 VLP는 또한 세포를 형질도입시키는 능력을 잃지 않으면서 4℃에서 적어도 30일 동안 저장할 수 있다.
또한, VEEV 기반 알파 바이러스 레플리콘이 세포 내에서 단백질을 발현할 수 있는 능력을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 본 연구를 위해, VEEV 레플리콘에 삽입된 가우시아(Gaussia) 루시퍼라제 유전자를 가진 VLP로 BHK-21 세포를 형질도입시켰다. 형질도입 후, 세포 상등액을 루시퍼라제 단백질의 발현에 대해 모니터하였다. 외인성 유전자가 없거나 GFP를 코딩하는 유전자를 가진 대조군 VEEV 레플리콘에 비해 가우시아 루시퍼라제 유전자를 가진 VEEV 레플리콘으로 형질도입된 세포의 상등액에서 많은 양의 루시퍼라제가 검출되었다. 추가적으로, 루시퍼라제 단백질의 발현은 형질도입 후 신속하게 증가하였다. cre 리콤비나제 없이 GFP를 발현하도록 조작된 세포에 기능성의 cre 리콤비나제(red 세포)를 전달하는 조건에서 역시 유사한 결과가 관찰되었다.
GFP를 코딩하는 신드비스 기반 VLP 또는 GFP를 코딩하는 VEEV 기반 VLP로 병행하여 세포를 형질도입시켰다. 알파 바이러스 기반 VLP는 모두 강력한 GFP 발현을 유발하였지만, VEEV 기반 VLP로 형질도입된 세포가 더 높은 발현 수준을 보인다는 것이 관찰되었다.
실시예 2 - VEE VLP로 형질도입된 표적 세포에서 여러 단백질의 발현
VLP를 이용한 RNA 전달의 기본 개념은 [도 2]에 나타낸다. 본 실험에서, 유방암 모델을 사용하였다. HLA-DR1 및 CD80을 발현하기 위해 레플리콘의 이중 프로모터 벡터를 개발하였다(도 3). 상기 두 가지 항원을 코딩하는 VLP를 이용하여 4T1-Luc2 유방암 세포를 감염시켰다. 항-HLA-DR 및 CD80 항체를 이용한 결과는 두 가지 단백질 모두 상기 세포에서 실제로 발현된다는 것을 보였다. HLA-DR1 및 CD80은 [도 2]의 VLP-VEE 레플리콘을 가진 VLP로 형질감염된 4T1-Luc2 세포에서 발현된다. HLA-DR1 발현 세포는 FITC 표지된 항-HLA-DR 항체에 의해 확인하였다. CD80 발현 세포는 PE 표지된 항-CD80 항체에 의해 확인하였다.
알파 바이러스 레플리콘이 동일한 세포에서 두 개의 별개의 단백질을 발현할 수 있는 지를 평가하기 위해서, 한 서브게놈 프로모터 조절하의 HLA-DR1 및 또 다른 서브게놈 프로모터 하의 CD80을 가진 VEE 레플리콘을 이용하여 실험을 수행하였다. 기재된 VEE 레플리콘을 가진 VLP를 생산한 후, 세포를 형질도입시키고, 두 가지 단백질의 발현에 대해 조사하였다. [도 4]에 나타낸 바와 같이, 형질도입된 세포는 두 가지 단백질 모두를 발현할 수 있었다(면역표지된 HLA-DR1은 녹색(FITC)으로 나타나고 CD80은 빨강(피코에리트린)으로 나타남).
실시예 3 - VEE VLP로 형질도입된 표적 세포에서 여러 단백질의 발현
마우스 동물 시스템에서 VLP를 시험하기 위하여, 매우 공격적 전이성 유방암 세포인 4T1-Luc2 세포를 10마리 마우스의 유방 지방 층(fat pad)에 이식하였다. 며칠 내에 종양이 나타났으며 1주일 내에 뚜렷해지고 촉진(5-7 mm)되었다. 마우스 중 세 마리는 불활성 단백질(GFP)을 발현하는 VLP로 종양 내 주사하였고, 두 마리 마우스는 인간 HLA-DR1/CD80(이종 발생성)을 발현하는 VLP로 주사하였고, 다섯 마리는 대조군으로 주사하지 않았다.
일주일 후에, 모든 마우스로부터 종양을 절제하고 수 주에 걸쳐 종양 재성장 및 전이를 관찰하였다. 결과(도 5)는 주사하지 않은 5마리 마우스(비처리 대조군) 중 4마리는 폐, 유방 및 간에서 암 재성장 및 전이로 인해 사망하였다는 것을 보여주었다. VLP/GFP(비특이적 단백질 대조군)를 주사한 세 마리 마우스 모두 역시 폐, 유방 및 간에서 암의 재성장 및 전이로 인해 4-6주 내에 사망하였다. 그러나 VLP/HLA-DR1/CD80으로 처리한 마우스 두 마리 모두는 종양 발생의 징후 없이 25주 넘게 생존하였다.
마우스에 실제로 종양세포에 대해 면역이 생겼는지를 보여주기 위하여, 앞선 실험에서 생존한 마우스에 4T1-Luc2 세포를 다시 투여하였다. 또한, 4마리의 새로운 대조군 마우스를 포함시켰다. 투여 실험에서, 마우스 모두에게 10,000개의 4T1-Luc2 세포를 정맥 내 주사하고 종양 성장 및 진행을 모니터하였다. 마우스에 면역이 생길 경우, 생존한 마우스에서 종양이 발생하지 않을 것이고 전이가 발견되지 않을 것이다. 면역이 생기지 않는 경우, 마우스는 전이성 암으로 사망할 것이다. 4마리 대조군 마우스는 4T1-Luc2 세포의 정맥 내 주사 후 2주 내에 전이성 암으로 사망하였지만, 치료 VLP로 처리한 동물은 투여 후 4주 넘게 생존하였다(도 5). 이것은 HLA/CD80으로 처리된 동물이 종양세포에 대해 면역을 획득하였다는 것을 나타낸다.
상기에 기재된 여러 특징 및 과정은 서로 독립적으로 이용될 수 있거나 다양한 방법으로 조합될 수 있다. 가능한 모든 조합 및 부분적인 조합은 본 개시 내용의 범위에 해당하는 것이다. 게다가, 어떤 방법 또는 과정 블록은 일부 실시 내용에서 생략될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 과정은 또한 어떤 특정 순서에 제한되지 않으며, 그에 관련한 블록 또는 언급 내용은 적합한 다른 순서로 수행될 수 있다. 예를 들어, 기재된 블록 또는 언급 내용은 구체적으로 개시된 것과 다른 순서로 수행될 수 있거나, 여러 블록 또는 언급 내용은 단일 블록 또는 언급 내용으로 합해질 수 있다. 실시예 블록 또는 언급 내용은 순차적으로, 병행하여, 또는 어떤 다른 방법으로 수행될 수 있다. 개시된 실시예의 실시양태로부터 블록 또는 언급 내용은 첨가되거나 제거될 수 있다. 본원에 기재된 실시예 시스템 및 구성요소는 기재된 것과 다르게 배열될 수 있다. 예를 들어, 개시된 실시예의 실시양태와 비교하여 요소는 첨가되거나 제거되거나 재배열될 수 있다.
본원에서 사용되는 조건을 나타내는 표현, 예를 들어, 그 중에서도, "할 수 있다"("can," "could," "might," "may"), 예를 들어("e.g.") 등은, 달리 구체적으로 언급되지 않거나 사용되는 상황에서 이해된다면, 일반적으로, 어떤 실시양태에서는 어떤 특징, 요소, 및/또는 단계가 포함되지만, 다른 실시양태에서는 이들이 포함되지 않는다는 것을 전달하고자 한다. 따라서, 이러한 조건을 나타내는 표현은, 일반적으로, 특징, 요소 및/또는 단계가 하나 이상의 실시양태에 어떤 방법으로든 필요하다는 것 또는 이러한 특징, 요소 및/또는 단계가 어떤 특정 실시양태에 포함되거나 실시되어야 하는지를 발명자의 정보 제공과 함께 또는 없이 결정하기 위한 타탕성을 하나 이상의 실시양태가 반드시 포함한다는 것을 암시하려는 의도는 아니다. 용어 "포함하는", "가진"("comprising," "including," "having") 등은 동의어이며 제한 없이 포괄적으로 사용되고, 추가의 요소, 특징, 행위, 조작 등을 배제하지 않는다. 또한, 용어 "또는"은, 예를 들어 열거된 요소와 관련하여 사용될 때, 용어 "또는"이 열거된 요소의 하나, 일부, 또는 전체를 의미하도록 포괄적인 의미(한정적인 의미가 아님)로 사용된다.
특정 실시예의 실시양태를 기재하였지만, 이들 실시양태는 단지 예로써 제시되었으며, 본원에 개시된 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 따라서, 상기에 어떤 기재 내용도 어떤 구체적인 특징, 특성, 단계, 모듈, 또는 블록이 필수적이거나 없어서는 안 된다는 것을 의도하는 것은 아니다. 실제로, 본원에 기재된 신규 방법 및 시스템은 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 게다가, 본원에 개시된 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 다양하게 생략되거나, 치환되거나 변화될 수 있다. 수반되는 청구항 또는 그의 등가물은 본원에 개시된 발명의 일부 범위 및 취지 내에 해당하는 형태 또는 변형을 포함하고자 한다.
<표 1>
서열 번호 1
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Figure 112016068388127-pct00002
Figure 112016068388127-pct00003
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SEQUENCE LISTING <110> The USA, as represented by the Secretary, Dept. of Health and Human Services Chatterjee, Deb K. Kaczmarczyk, Stanislaw J. <120> CANCER IMMUNOTHERAPY BY DELIVERING <130> 6137NCI-40-PCT <140> PCT/US2014/070552 <141> 2014-12-16 <150> 61/916,394 <151> 2013-12-16 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11913 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector Construct <400> 1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac 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Claims (34)

  1. 포유동물 피험체에서 종양을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한, 바이러스 유사 입자(VLP: virus like particle)를 포함하는 약학 조성물로서, VLP는
    a. 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 알파 바이러스 레플리콘으로서, 재조합 폴리뉴클레오티드는
    (i) HLA-DR1의 두 가지 서브유닛을 코딩하는 서열, 및
    (ii) CD28, CD80, CD86 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 공자극 신호 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 알파 바이러스 레플리콘,
    b. 레트로바이러스 gag 단백질, 및
    c. VSV-G 단백질
    을 포함하며, VLP는 알파 바이러스 구조 단백질 유전자를 함유하지 않는 것인 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 공자극 신호 단백질은 CD80을 포함하는 것인 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 알파 바이러스 레플리콘은 신드비스 바이러스 또는 베네수엘라 이콰인 뇌염 바이러스의 핵산 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 알파 바이러스 레플리콘은 신드비스 바이러스 또는 베네수엘라 이콰인 뇌염 바이러스 비구조 단백질 NSP1, NSP2, NSP3, 및 NSP4; 및 라우스 육종 바이러스로부터 유래한 레트로바이러스 팩케이징 신호를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, VLP는 레트로바이러스 pol 유전자를 포함하거나 발현하지 않는 것인 약학 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 레트로바이러스 gag 단백질은 라우스 육종 바이러스 gag 단백질인 약학 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, VSV-G 단백질은 종양세포에 특이적으로 결합하는 것인 약학 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 알파 바이러스 레플리콘은 HLA-DR1에 작동 가능하게 연결된 서브게놈 프로모터 및 CD80에 작동 가능하게 연결된 또 다른 서브게놈 프로모터를 포함하는 것인 약학 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 치료 또는 예방은 종양 특이적 면역의 유도를 포함하는 것인 약학 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유동물 피험체는 유방, 자궁경부, 전립선, 난소, 신장암종, 폐, 위, 췌장, 교모세포종 및 대장으로부터 유래한 고형 종양을 가진 암 환자군으로부터 선택되는 암 환자인 약학 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약학 조성물은 화학요법 약물과의 병용 요법으로 투여되는 것인 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 화학요법 약물은 탁산, 파클리탁셀, 도세탁셀, 안트라사이클린, 독소루비신, 에피루비신, 시클로포스파미드, 카페시타빈, 타목시펜, 레트로졸, 카보플라틴, 젬시타빈, 시스플라틴, 엘로티닙, 이리노테칸, 플루오로우라실 및 옥살리플라틴으로 이루어진 약물 부류로부터 선택된 것인 약학 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약학 조성물은 방사선 요법과의 병용 요법으로 투여되는 것인 약학 조성물.
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