ES2899078T3 - Inmunoterapia contra el cáncer mediante el suministro de antígenos de MHC de clase II y una proteína de señal coestimuladora utilizando un replicón de partículas similares a un virus - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica que comprende una partícula similar a un virus (VLP), comprendiendo la VLP: a. un replicón de alfavirus que comprende un polinucleótido recombinante, en el que el polinucleótido comprende: (i) una secuencia que codifica ambas subunidades de un antígeno mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II humana, y (ii) una secuencia que codifica una proteína de señal coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD80, CD28, CD86 y CTLA-4; b. una proteína gag retroviral, y c. una proteína de envoltura fusogénica, en la que la VLP no contiene un gen de proteína estructural de alfavirus, para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de un tumor en un sujeto mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la transfección in vivo de células de dicho tumor por dicha VLP, preferiblemente mediante administración intratumoral de dicha composición.

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoterapia contra el cáncer mediante el suministro de antígenos de MHC de clase II y una proteína de señal coestimuladora utilizando un replicón de partículas similares a un virus

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención descrita en el presente documento se refiere al suministro y transcripción de ácido nucleico que expresa los antígenos mayores de histocompatibilidad de clase II y una proteína de señal coestimuladora a los mamíferos utilizando partículas similares a un virus con replicación defectuosa virus-como partículas.

ANTECEDENTES

[0002] Un desafío importante en la terapia del cáncer, particularmente la quimioterapia, es la falta de especificidad para las células cancerosas diana, ya que las moléculas pequeñas se administran sistémicamente y afectan a todas las células con un índice mitótico alto, lo que produce efectos secundarios perjudiciales. Las terapias basadas en anticuerpos muestran una especificidad mejorada para las células diana pero dan como resultado una baja eficacia. Los anticuerpos monoclonales (mAb) constituyen una de las clases más grandes de reactivos o fármacos. El mercado global actual de mAbs es de más de $ 36 mil millones (Ledford, 2020, Nature 468: 18-19). Las estrategias actuales para la terapia del cáncer basada en anticuerpos se limitan a solo un puñado de proteínas o receptores extracelulares (Baker, 2005, Nature Biotech, 23: 1065-72; Cohen, et al. 2009, MAbs, 1: 56-66), que son accesibles y se expresan en las membranas externas de las células cancerosas. Porque son accesibles, fue posible generar anticuerpos contra ellas. Los ejemplos incluyen rituximab (RITUXAN® o MABTHERA®) un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD20 para tratar el linfoma, trastuzumab (HERCEPTIN®) un mAb anti-Her2 para tratar algunos cánceres de mama y cetuximab (ERBITUX®) un mAb anti-receptor de FGF para tratar cánceres colorrectales y de cabezacuello (Adams, 2005, Nature Biotech, 23: 1147-57). Se ha demostrado que son agentes eficaces para reconocer y destruir las células cancerosas. Sin embargo, no hay nuevos marcadores de cáncer accesibles en la superficie de las células cancerosas, lo que limita el futuro repertorio de Ab que se puede generar.

[0003] Existe una necesidad insatisfecha de explotar una gran fuente sin explotar de antígenos intracelulares del cáncer para la terapia del cáncer. Ejemplos de tales dianas terapéuticas de cáncer intracelulares incluyen: mutantes Ras, fosfatasas, factores de transcripción de quinasas, alfa fetoproteína (AFP), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, calcitonina, calretinina, antígeno carcinoembrionario, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína de la membrana epitelial (EMA), factor VIII, CD31, FL1, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), HMB-45, gonadotropina coriónica humana (hCG), inhibina, queratina, marcador de linfocitos, MART-1 (Melan-A), Myo D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), antígeno específico de próstata, PTPRC (CD45), proteína S100, actina de músculo liso (SMA), sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroideo-1, tumor M2-PK, vimentina, grupo de diferenciación 10 (CD10), CD13, CD15, CD20, CD25, CD28, CD30, CD34, CD99 y CD117. Los antígenos del cáncer intracelulares no son accesibles a los anticuerpos y, por lo tanto, es más difícil tratar a los pacientes con cáncer con anticuerpos contra estos antígenos, ya que es posible que no alcancen la ubicación intracelular debido al gran tamaño de los anticuerpos.

[0004] Un enfoque es sacar esos antígenos del cáncer y expresarlos en la superficie de las células tumorales para convertirlos en células presentadoras de antígenos inducidos (iAPC) y generar vacunas contra el cáncer contra las células tumorales, enseñando así a las células tumorales a activar la maquinaria celular para producir anticuerpos contra ellas. Se sabe que las células tumorales sintetizan múltiples proteínas que son inmunógenos potenciales y los péptidos procesados a partir de estas proteínas activarán una respuesta antitumoral en el paciente. Las células tumorales transfectadas presentarán esos antígenos al ayudante T (CD4+) y activarán los linfocitos T citolíticos (células CD8+) y generarán células T efectoras y de memoria inmunitaria que generarán eficazmente una vacuna contra el cáncer, que probablemente sea esencial para la protección contra la metástasis, la causa principal de muerte por cáncer. El atractivo de este enfoque para la terapia del cáncer es que no hay necesidad de conocimientos previos sobre el (los) antígeno (s) del cáncer. Por lo tanto, podría funcionar para cualquier tipo de proteína o antígeno que cause cáncer. Las vacunas contra el cáncer son una herramienta prometedora para el tratamiento y la prevención del cáncer debido a su potencial para inducir respuestas específicas de tumores junto con una toxicidad mínima para las células sanas.

[0005] Se ha encontrado que un ratón HLA/CD80 en el sistema de ratones (autólogo) prolonga la supervivencia (Armstrong, et al, 1997, Proc Natl Acad Sci., 94:. 6886-91; Humphreys, et al, 2004, Cell Mol Immunol, 1: 180-85). Este sistema requiere aislar las células tumorales, propagar las células tumorales, modificar las células (ex vivo) con un retrovirus recombinante que contenga estos genes y reimplantar estas células en ratones para estudiar la inmunoterapia. El procedimiento es engorroso, largo y susceptible de contaminación durante los pasos ex vivo. Además, los resultados descritos se basan en sistemas genéticamente y singénicos, inmunológicamente idénticos. El uso de retrovirus crea una oportunidad para la integración retroviral en el genoma del huésped en una posición que podría ser potencialmente peligrosa.

[0006] Zitvogel et al. (1998, Nature Medicine, 4 (5): 594-600) menciona el uso de exosomas derivados de células dendríticas para erradicar o suprimir el crecimiento de tumores murinos establecidos. Pulaski et al. (2000, Cancer Immunol Immunother, 49: 34-45) y Pulaski y Ostrand-Rosendberg (1998, Cancer Research 58: 1486-1493) mencionan vacunas basadas en células que expresan MHC clase II y CD-80 para el tratamiento de enfermedad metastásica.

[0007] Existe una necesidad de desarrollar un medio de producción de una terapia génica que no tiene los defectos de un procedimiento ex vivo, y que no requiere el uso de un retrovirus que puede dañar el huésped.

RESUMEN

[0008] La presente invención se define de acuerdo con las reivindicaciones. Por tanto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una partícula similar a un virus (VLP), comprendiendo la VLP:

a. un replicón de alfavirus que comprende un polinucleótido recombinante, en el que el polinucleótido comprende: (i) una secuencia que codifica ambas subunidades de un antígeno mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II humana, y

(ii) una secuencia que codifica una proteína de señal coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD80, CD28, CD86 y CTLA-4;

b. una proteína gag retroviral, y

c. una proteína de envoltura fusogénica,

en la que la VLP no contiene un gen de proteína estructural de alfavirus, para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de un tumor en un sujeto mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la transfección in vivo de células de dicho tumor por dicha v Lp , preferiblemente mediante administración intratumoral de dicha composición.

[0009] En una realización, la proteína de señal coestimuladora comprende CD80.

[0010] En una realización, el antígeno mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II humano comprende HLA-DR1.

[0011] En una realización, el replicón de alfavirus comprende la secuencia de ácido nucleico del virus Sindbis o el virus de la encefalitis equina venezolana.

[0012] En una realización, el replicón de alfavirus comprende una secuencia que codifica las proteínas no estructurales NSP1, NSP2, NSP3, y NSP4 del virus Sindbis o el virus de la encefalitis equina venezolana; y una señal de empaquetamiento retroviral derivada del virus del sarcoma de Rous.

[0013] En una realización, la VLP no comprende o expresar un gen pol retroviral.

[0014] En una realización, la proteína gag retroviral es una proteína gag del virus del sarcoma de Rous.

[0015] En una realización, la proteína de envoltura fusogénica es una glicoproteína, o un fragmento o derivado de la misma. En una realización, la proteína de la envoltura fusogénica se une específicamente a una célula tumoral.

[0016] En una realización, el replicón de alfavirus comprende un promotor subgenómico unido operativamente a HLA-DR1 y otro promotor subgenómico unido operativamente a CD80.

[0017] En una realización, dicho tratamiento o prevención comprende la inducción de inmunidad específica de tumor.

[0018] En una realización, el sujeto mamífero es un paciente de cáncer seleccionado del grupo de pacientes con cáncer que tienen tumores sólidos derivados de mama, cervical, de próstata, ovario, carcinoma renal, de pulmón, gástrico, páncreas, glioblastoma y colorrectal.

[0019] En una realización, la composición farmacéutica se administra en terapia de combinación con un fármaco quimioterapéutico. En una realización, el fármaco quimioterapéutico se selecciona de las clases de fármacos que consisten en un taxano (paclitaxel o docetaxel), una antraciclina (doxorrubicina o epirrubicina), ciclofosfamida, capecitabina, tamoxifeno, letrozol, carboplatino, gemcitabina, cisplatino, erlotinib, irrainotecán fluorouracilo y oxaliplatino.

[0020] En una realización, la composición farmacéutica se administra en terapia de combinación con radioterapia.

[0021] Lo que se describe es una metodología novedosa para la inmunoterapia inducible del cáncer. Esta inmunoterapia está dirigida a coexpresar antígenos mayores de histocompatibilidad (MHC) de clase II y una proteína de señal coestimuladora dentro de las células tumorales de un paciente para estimular la respuesta inmune a los antígenos tumorales. Las células transfectadas actuarán como células presentadoras de antígeno. Lo que se descubrió es que los antígenos del MHC expresados en las células tumorales transfectadas inducen una reacción inmunitaria dirigida contra los antígenos tumorales actuando como moléculas presentadoras de antígenos. La respuesta inmunitaria dirigida contra las células tumorales a continuación será elaborada por la presencia de antígenos tumorales presentados por las células presentadoras de antígenos del huésped. Lo que también se describe es una partícula similar a un virus (VLP) que contiene ARN que codifica antígenos del MHC de clase II junto con el antígeno tumoral que se puede administrar a un animal, lo que induce a las células huésped del animal a expresar estos antígenos. El sistema de suministro de ARN mediado por VLP se ha descrito previamente en el documento WO 2013148302, y en el mismo se ha demostrado que es eficaz en la expresión de proteínas en células de mamíferos.

[0022] Lo que se describe es un procedimiento para prevenir o tratar un tumor en un sujeto mamífero, que comprende administrar al sujeto que se encuentra en necesidad del mismo una dosificación eficaz de una composición farmacéutica que comprende una VLP que comprende:

a. un replicón de alfavirus que comprende un polinucleótido recombinante, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica ambas subunidades de un antígeno mayor de histocompatibilidad de clase II humana, y una secuencia que codifica una proteína de señal coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD80, CD28, CD86 y CTLA-4;

b. una proteína gag retroviral, y

c. una proteína de envoltura fusogénica,

en la que la VLP no contiene un gen de proteína estructural de alfavirus, y en la que dicho procedimiento comprende la transfección in vivo de células de dicho tumor por dicha VLP, preferiblemente mediante administración intratumoral de dicha composición. La proteína de señal coestimuladora más preferiblemente comprende CD80.

[0023] El procedimiento descrito en el presente documento puede estar dirigido a prevenir o tratar una enfermedad en la que el paciente tiene un tumor. El paciente puede ser un paciente con cáncer, preferiblemente un paciente con cáncer se selecciona del grupo de pacientes con cáncer que tienen tumores sólidos derivados de carcinoma de mama, cervical, próstata, ovario, renal, pulmón, gástrico, páncreas, glioblastoma y colorrectal, más preferiblemente un paciente con cáncer de mama. Por consiguiente, el polinucleótido recombinante puede comprender además una secuencia que codifica un antígeno específico de tumor, preferiblemente un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en AFP, CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, calcitonina, calretinina, antígeno carcinoembrionario, cromogranina, citoqueratina, desmina, EMA, Factor VIII, FL1, GFAP, GCDFP-15, HMB-45, hCG, inhibina, queratina, marcador de linfocitos, MART-1 (Melan-A), Myo D1, MSA, neurofilamento, NSE, PLAP, antígeno específico de próstata, proteína S100, SMA, sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroideo-1, tumor M2-PK, vimentina, CD10, CD13, CD15, CD20, CD25, CD30, CD31, CD34, CD45 (PTPRC), CD99, CD117 y un fragmento de los mismos.

[0024] La VLP del procedimiento descrito en el presente documento puede comprender un replicón de alfavirus derivado del virus Sindbis o virus de la encefalitis equina venezolana. La proteína de la envoltura fusogénica de la VLP puede comprender una glicoproteína, o un fragmento o derivado de la misma. La proteína de la envoltura fusogénica puede unirse específicamente a una célula tumoral. Por consiguiente, la VLP puede ser capaz de unirse a una célula eucariota. La célula eucariota puede ser una célula humana. La unión puede ser específica a una célula diana.

[0025] El procedimiento descrito en este documento puede administrar la composición farmacéutica por vía parenteral. La composición farmacéutica se puede administrar mediante inyección intravenosa. La composición farmacéutica se puede administrar mediante inyección dentro del tumor.

[0026] En el procedimiento descrito en el presente documento, la composición farmacéutica se puede administrar en combinación con un fármaco quimioterapéutico. El fármaco quimioterapéutico puede seleccionarse de las clases de fármacos que consisten en un taxano (paclitaxel o docetaxel), una antraciclina (doxorrubicina o epirrubicina), ciclofosfamida, capecitabina, tamoxifeno, letrozol, carboplatino, gemcitabina, cisplatino, erlotinib, irinotecán, fluorouracilo y oxaliplatino. La composición farmacéutica se puede administrar en combinación con radioterapia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0027]

La figura 1 muestra esquemáticamente un ejemplo de un vector. La secuencia de ADN del vector se proporciona en el Listado de Secuencias, adjunto al presente documento (SEQ ID NO: 1).

La figura 2 muestra el concepto básico para producir y usar la VLP descrita en este documento. El plásmido replicón contiene un promotor de CMV que dirige la expresión de un replicón y un gen de interés. El replicón contiene elementos NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4. El gen de interés contiene un ácido nucleico que codifica las dos subunidades del antígeno MHC de clase II y un antígeno específico de la enfermedad. El vector estructural contiene la Gag de RSV bajo el control de un promotor de CMV. El vector de la envoltura contiene la proteína VSV-G bajo el control de un promotor de CMV. Estos se transfectan a una célula huésped productora, que fabrica el ARN que contiene VLP. La VLP se puede utilizar para infectar células diana, que producen las proteínas codificadas por el gen de interés. La figura 3 muestra la construcción específica de los ejemplos. Esto muestra el plásmido replicón, VLP-VEE, que contiene ácido nucleico que codifica la proteína HLA-DR1 y CD80.

La figura 4 muestra la supervivencia de los animales después del injerto de células 4T1-Luc2 (cáncer de mama). La figura 5 muestra la supervivencia de los animales inmunizados después de la exposición con células 4T1-Luc2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

[0028] La invención es como se define en las reivindicaciones.

Definiciones

[0029] Cuando los términos "uno", "un", o "una" se utilizan en esta divulgación, significan "al menos uno" o "uno o más", a menos que se indique lo contrario.

[0030] El término "proteína fusogénica", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a una proteína que puede inducir la fusión de la envoltura derivada de la membrana plasmática de la VLP a la membrana de la célula receptora.

[0031] Los términos "expresar" y "producir" se utilizan como sinónimos en este documento, y se refieren a la biosíntesis de un producto génico. Estos términos abarcan la transcripción de un gen en ARN. Estos términos también abarcan la traducción de ARN en uno o más polipéptidos, y además abarcan todas las modificaciones postranscripcionales y postraduccionales que ocurren de forma natural. La expresión o producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede estar dentro del citoplasma de la célula, o en el medio extracelular, tal como el medio de crecimiento de un cultivo celular.

[0032] "Polinucleótido", denominado como sinónimo de "molécula de ácido nucleico", "nucleótidos" o "ácidos nucleicos", se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin limitación, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, "polinucleótido" se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término polinucleótido también incluye ADN o ARN que contienen una o más bases modificadas y ADN o ARN con cadenas principales modificadas para estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales, tales como inosina. Se pueden realizar diversas modificaciones en el ADN y el ARN; por tanto, "polinucleótido" abarca formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, tal como se encuentran típicamente en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. "Polinucleótido" también abarca cadenas de ácido nucleico relativamente cortas, a menudo denominadas oligonucleótidos.

[0033] "Replicón", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polinucleótido que tiene los elementos genéticos necesarios para facilitar la replicación de su secuencia y al mismo tiempo ser capaz de experimentar traducción.

[0034] "Partícula similar a virus" (VLP), tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una estructura parecida a una partícula de virus. En realizaciones preferidas, una VLP contiene al menos una proteína fusogénica presentada en la superficie de la partícula. Una partícula similar a un virus de acuerdo con la invención carece de todos o parte de los componentes replicativos del genoma viral. Normalmente, una partícula similar a un virus de acuerdo con la invención no lleva información genética que codifique las proteínas de la partícula similar a un virus.

Vectores

[0035] Los alfavirus pertenecen a la familia de virus del grupo IV de Togaviridae. Los alfavirus son virus pequeños, esféricos y envueltos con un genoma de ARN de una sola hebra de sentido positivo. La longitud total del genoma varía entre 11.000 y 12.000 nucleótidos, y tiene un bloqueador en 5' y una cola de poli-A en 3'. Los cuatro genes de proteínas no estructurales (genes NSP) están codificados en los dos tercios de 5' del genoma, mientras que las tres proteínas estructurales se traducen a partir de un ARNm subgenómico colineal con el un tercio de 3' del genoma.

[0036] Hay dos marcos de lectura abiertos (ORFs) en el genoma del alfavirus, no estructurales y estructurales. El primero incluye genes NSP y codifica proteínas (nsP1-nsP4) necesarias para la transcripción y replicación del ARN viral. El segundo codifica tres proteínas estructurales: la proteína C de la nucleocápside del núcleo y las proteínas de la envoltura P62 y E1 que se asocian como un heterodímero. Las glicoproteínas de superficie ancladas a la membrana viral son responsables del reconocimiento del receptor y la entrada en las células diana a través de la fusión de la membrana.

[0037] El virus Sindbis (SIN) y el virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) son alfavirus cuyo genoma comprende una hebra positiva de ARNm de 11703 nucleótidos. SIN infecta una variedad de huéspedes vertebrados. El genoma del virus Sindbis codifica proteínas no estructurales (NS, replicón) y estructurales (cápside y envoltura fusogénica dependiente del pH) que se traducen directamente en el citoplasma de la célula huésped. Los alfavirus también incluyen virus Aura, virus Babanki, virus Barmah Forest, virus Bebaru, virus Cabassou, virus Chikungunya, virus de la encefalitis equina del este, virus Everglades, virus Fort Morgan, virus Getah, virus Highlands J, virus Kyzylagach, virus Mayaro, virus Me Tri, virus de Middelburg, virus de Mosso das Pedras, virus de Mucambo, virus de Ndumu, virus de O'nyong-nyong, virus de Pixuna, virus de Río Negro, virus de río Ross, virus de la enfermedad del páncreas del salmón, virus del bosque Semliki (SFV), virus del elefante marino del sur, virus de Tonate, virus de Trocara, virus Una, virus de la encefalitis equina del oeste y virus Whataroa.

[0038] La infección de la célula huésped con un alfavirus da como resultado una citotoxicidad que culmina con apoptosis. Esto se debe principalmente a: la expresión del ARN genómico del alfavirus en grandes cantidades que desencadena el estado antiviral en las células huésped y la interacción directa de las proteínas alfavirales no estructurales (NSP2 de SIN o NC de VEEV) con síntesis de ARNm celular o interrupción de la traducción que causa un efecto citofático (CPE) en la célula huésped. Una variante de SIN natural que contiene una mutación puntual en una de las proteínas no estructurales, NSP2 (en la posición 726), demostró un crecimiento sostenido y no citopático en las células infectadas, aunque el título viral recuperado de las células infectadas se redujo sustancialmente (Frolov, et al., 1999, J Virol, 73: 3845-65).

[0039] Los alfavirus son de interés para los investigadores de terapia génica. El virus del río Ross, SIN, SFV y VEEV se han utilizado para desarrollar vectores para la administración de genes. Los virus pseudotipados pueden formarse combinando glicoproteínas de envolturas alfavirales y cápsides retrovirales. Los retrovirus o lentivirus pseudotipados de las glicoproteínas de la envoltura alfavírica son capaces de integrar los genes que llevan en las células huésped potenciales. Los alfavirus pseudotipados son reconocidos e infectados por las proteínas de la envoltura alfavírica E2 y E1. La integración estable de genes virales está mediada por interiores retrovirales de estos vectores.

[0040] Existen limitaciones para el uso de alfavirus en el campo de la terapia génica debido a su falta de especificidad de reconocimiento. Sin embargo, mediante la introducción de dominios de anticuerpos variables en un bucle no conservado en la estructura de E2, se han reconocido poblaciones específicas de células. Además, el uso de alfavirus completos para terapia génica tiene una eficacia limitada tanto porque varias proteínas alfavirales internas están implicadas en la inducción de apoptosis tras la infección como porque la cápside alfaviral media solo la introducción transitoria de ARNm en las células huésped. Ninguna de estas limitaciones se extiende a los pseudotipos de envoltura alfaviral de retrovirus o lentivirus. Se han descrito varios vectores de expresión basados en alfavirus para la expresión transgénica en células diana (Xiong, et al., 1989, Science, 243: 1188-91; y Bredenbeek, et al., 1993, J Virol, 67: 6439 - 46). Por consideraciones de seguridad, estos sistemas de expresión normalmente comprenden dos plásmidos. Un plásmido contiene la secuencia codificante del replicón viral (es decir, proteínas no estructurales) y un promotor interno y una región codificante del transgén, mientras que el segundo plásmido codifica los genes estructurales virales. Estos plásmidos se utilizan para generar ARNm in vitro, que a continuación se electropora en las células huésped para generar partículas de virus infecciosas de una ronda. Estas partículas virales se utilizan a continuación para infectar células diana para la expresión transgénica. Sin embargo, estas partículas plantean problemas de seguridad porque la recombinación entre los elementos de secuencia que codifican los elementos virales no estructurales y estructurales puede producir partículas de alfavirus competentes en replicación que tienen la capacidad de mediar un efecto citopático significativo in vivo.

[0041] Una posible solución a este problema es el uso de VLP no relacionadas para administrar replicones de alfavirus al citoplasma de células de mamífero en el que puedan replicarse de forma autónoma y expresar genes de interés sin ninguna participación nuclear. Estas VLP se pueden producir utilizando tres vectores. El primer vector comprende la secuencia codificante del replicón de alfavirus bajo el control de un promotor de mamífero (por ejemplo, CMV), una señal de empaquetamiento de ARN específica de retrovirus y un gen o polinucleótido de interés. El gen puede expresar una proteína con aplicaciones terapéuticas o de investigación, o un ARNhc u otro ácido nucleico regulador. El segundo vector comprende Gag retroviral. El tercer vector proporcionaría la glicoproteína de envoltura adecuada para la infección de las células diana.

[0042] Tras la cotransfección en una línea celular de empaquetamiento apropiada, las moléculas de ARN transcritas del promotor celular presente en el primer vector se empaquetarán en las VLP producidas a partir del segundo vector. Estas VLP pueden suministrar el replicón basado en alfavirus a una célula diana basándose en la glicoproteína de la envoltura presente en las VLP. Una vez dentro de la célula, la maquinaria de traducción del huésped traducirá el ARN del alfavirus introducido y producirá proteínas de replicación del alfavirus, que a su vez amplificarán el ARN y expresarán el gen o polinucleótido de interés. Los replicones mutantes, tales como el descrito anteriormente, pueden prolongar ampliamente la duración de la expresión con un impacto mínimo en la célula huésped. Además, los genes que codifican el ADN para los elementos estructurales del alfavirus estarán ausentes en la célula diana, por lo que la seguridad del sistema propuesto aumenta considerablemente.

[0043] En el presente documento se describen composiciones relacionadas con VLP y procedimientos para preparar y usar las VLP descritas. Las composiciones descritas incluyen VLP y vectores y células utilizados para producir las VLP descritas. Los procedimientos relacionados descritos en este documento se refieren a procedimientos para producir las VLP, procedimientos de transducción de células utilizando las VLP y procedimientos para producir una proteína o polinucleótido de interés en una célula diana utilizando las VLP descritas en este documento. También se describen replicones basados en alfavirus que permiten la expresión de proteínas o polinucleótidos de interés en una célula diana sin riesgo de infección viral.

[0044] En el presente documento se describen vectores para su uso en la producción de VLP que portan un replicón basado en alfavirus que no codifica proteínas estructurales de alfavirus. Para producir VLP de este tipo, se pueden producir varios componentes mediante la transfección o nucleofección de uno o más vectores que codifican estos componentes en una línea celular para la producción in vitro. Estos componentes pueden estar codificados por vectores separados para reducir la probabilidad de que la VLP resultante sea competente para la replicación. Por ejemplo, se puede usar un sistema de plásmidos múltiples donde un plásmido codifica el material genético, tal como un polinucleótido de ARN que codifica proteínas no estructurales del virus Sindbis o VEEV, para ser empaquetado por la VLP; otro codifica las proteínas estructurales de la VLP, tales como gag; y otro plásmido codifica una proteína de fusión, tal como VSV-G, para facilitar la fusión de la VLP a la membrana de una célula diana.

[0045] Los vectores que codifican el material genético a empaquetar por una célula huésped puede tomar una variedad de formas, tales como plásmidos seleccionables o inducibles, pero generalmente tienen algunas características comunes. Por ejemplo, los vectores que codifican un replicón de ARN basado en alfavirus descritos en este documento pueden incluir una secuencia promotora, una secuencia de señal de empaquetamiento retroviral, secuencias de inicio de traducción, proteínas de alfavirus no estructurales, un sitio de clonación para insertar un gen o polinucleótido de interés, un gen o polinucleótido insertado de interés, una región no traducida 3' y un segmento de cola de poliadenosina.

[0046] Los vectores descritos pueden incluir un elemento promotor que permite que los segmentos del vector sean transcritos por una célula huésped. En algunos casos, la secuencia del vector puede transcribirse en ARN para empaquetarse en una VLP. En la mayoría de los casos, la secuencia promotora se ubicará en dirección 5' de todos los elementos traducibles incluidos dentro del vector (ver, por ejemplo, la Fig. 1 que ilustra la ubicación del promotor de citomegalovirus "pCMV"). La secuencia promotora puede derivar de un virus, tal como CMV, o virus simio 40 (SV40). Los expertos en la técnica conocen bien otras numerosas secuencias promotoras y su uso con los vectores descritos en el presente documento resultará evidente basándose en la descripción proporcionada.

[0047] Los vectores descritos que codifican el material genético que va a empaquetar una célula huésped pueden incluir una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia señal de empaquetamiento retroviral (también conocida como elemento psi (^ )) para permitir una o dos copias de la secuencia de ARN transcrita del vector que se empaquetará en una partícula VLP formada en una célula huésped. La mayoría, si no todos, los retrovirus tienen una secuencia de empaquetamiento de esta naturaleza, por lo que estas secuencias, y su incorporación en los vectores descritos, serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Los vectores descritos en este documento pueden incluir una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de empaquetamiento retroviral derivada del virus del sarcoma de Rous, virus de la leucemia murina de Moloney, virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS), VIH, virus linfotrópico T humano y similares. En un caso particular, la secuencia de empaquetamiento retroviral deriva del virus del sarcoma de Rous. Alternativamente, la secuencia de empaquetamiento retroviral deriva del virus de la leucemia murina.

[0048] Otro aspecto de los vectores que codifican el material genético que va a ser empaquetado por una célula huésped descrito en este documento son las secuencias de inicio de la traducción, que permiten que la secuencia de ARN codificada por el vector se traduzca en una célula huésped. En algunos casos, las secuencias de inicio de la traducción descritas pueden ser capaces de permitir la expresión de proteínas no estructurales basadas en alfavirus, que pueden replicar la secuencia de ARN transportada por las VLP descritas una vez que se administra a la célula huésped. En algunos casos, las secuencias de inicio de la traducción descritas pueden ser capaces de permitir la expresión de un gen de interés. En algunos casos, la secuencia de inicio de la traducción puede permitir que el gen de interés sea traducido por complejos de traducción de la célula huésped. En algunos casos, las secuencias de inicio de la traducción descritas en el presente documento pueden derivar de un alfavirus, tal como el virus Sindbis o VEEV. En otros casos, las secuencias de inicio de la traducción pueden derivar de otros genes, tales como genes de virus que se sabe que tienen secuencias de inicio de la traducción capaces de iniciar la traducción de una secuencia de ARN mediante complejos de traducción de mamíferos. Alternativamente, las secuencias de inicio de la traducción pueden derivar de otros genes, tales como la secuencia de inicio de la traducción nativa del gen de interés insertado en el replicón de alfavirus descrito. En algunos casos, las secuencias de inicio de la traducción descritas en el presente documento pueden estar ubicadas en más de una ubicación en la molécula de ARN empaquetada y, por lo tanto, pueden estar codificadas una o más veces por los vectores descritos. Por ejemplo, puede ser deseable traducir las proteínas no estructurales de Sindbis o VEEV descritas por separado de un gen de interés codificado por la molécula de ARN empaquetada. En tal caso, tanto el polinucleótido o polinucleótidos que codifican las proteínas no estructurales como el polinucleótido que codifica la proteína de interés tendrán secuencias de inicio de traducción separadas ubicadas 5' de su posición en el vector y ARN empaquetado. Basándose en esta descripción, los expertos en la técnica comprenderán que se pueden incorporar una variedad de secuencias de inicio de la traducción capaces de promover la traducción de ARN en una célula de mamífero a los ARN empaquetados con VLP descritos en el presente documento.

[0049] Los vectores que codifican el material genético que va a empaquetar una célula huésped también pueden incluir polinucleótidos que codifican proteínas de alfavirus no estructurales, tales como proteínas no estructurales de SIN o VEEV. Por ejemplo, los vectores descritos pueden incluir polinucleótidos que codifican una o más proteínas no estructurales del virus Sindbis. En algunos casos, los vectores descritos pueden incluir polinucleótidos que codifican una o más proteínas no estructurales de VEEV. En algunos casos, los vectores descritos pueden incluir polinucleótidos que codifican la proteína no estructural NSP1 de SIN o VEEV. En algunos casos, los vectores descritos pueden incluir polinucleótidos que codifican la proteína no estructural NSP2 del virus Sindbis o VEEV. En algunos casos, los vectores descritos pueden incluir polinucleótidos que codifican la proteína no estructural NSP3 de SIN o VEEV. En algunos casos, los vectores descritos pueden incluir polinucleótidos que codifican o la proteína no estructural NSP4 del virus Sindbis o VEEV. En algunos casos, los vectores descritos pueden incluir polinucleótidos que codifican las proteínas no estructurales NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4 de SIN o VEEV. En algunos casos, el polinucleótido del vector descrito que codifica las proteínas no estructurales de alfavirus se derivará de la secuencia genómica correspondiente de un genoma de alfavirus, tal como el del virus Sindbis o VEEV. En algunos casos, los polinucleótidos que codifican las proteínas no estructurales del alfavirus carecen de polinucleótidos que codifiquen las proteínas estructurales del alfavirus, independientemente de si las proteínas estructurales son del mismo alfavirus o de un alfavirus diferente que las secuencias de proteínas no estructurales presentes.

[0050] El vector descrito en el presente documento para incorporar material genético a empaquetar por una célula huésped también puede contener un polinucleótido de interés que puede expresarse en una célula huésped transducida por una VLP que lleva el material genético codificado por el vector. Los vectores descritos pueden codificar una secuencia de polinucleótidos de ARN que se empaquetará en una VLP, que a continuación se puede administrar a una célula huésped mediante transducción de la célula mediada por VLP. Una vez que la secuencia de polinucleótidos de ARN se ha administrado a la célula diana, un polinucleótido de interés codificado por el ARN puede proporcionar la expresión de una proteína de interés. Por consiguiente, los vectores descritos en el presente documento están diseñados para codificar un ARN para empaquetarse en una VLP que puede expresar un gen de interés una vez dentro de una célula diana. Por lo tanto, en algunos casos, los vectores descritos incluirán una secuencia de polinucleótidos de interés. En algunos casos del vector descrito, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una proteína de interés. Por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar la proteína verde fluorescente (GFP) en algunos casos y servir como marcador detectable de la transducción viral de una célula diana. En otro caso, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una versión funcional de una proteína endógena a la célula diana. En otro caso, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una versión funcional de una proteína endógena al sujeto diana. En otro caso, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una proteína que es extraña a la célula diana. En otro caso, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una proteína que es extraña para el sujeto diana. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una proteína capaz de tener un efecto terapéutico en una célula diana. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una proteína capaz de tener un efecto terapéutico en un sujeto diana. En un caso alternativo, la secuencia de polinucleótidos de interés puede servir como una molécula de a Rn de interferencia y funcionar para regular la expresión génica endógena en una célula huésped. Por ejemplo, en algunos casos, la secuencia de polinucleótidos de interés puede comprender una secuencia que proporciona la formación de un bucle en horquilla de ARN para iniciar la interferencia de ARN. Además, el polinucleótido de interés podría ser una hebra de ARN de sentido positivo o negativo que puede ser transcrito por el complejo de ARN polimerasa dependiente de ARN formado por las proteínas no estructurales de alfavirus codificadas por la molécula de ARN empaquetada. Dado que esta ARN polimerasa dependiente de ARN puede transcribir ARN en las direcciones de sentido positivo y negativo, se puede insertar una secuencia de ARN de interferencia, tal como un ARNmi o ARNhc, en el replicón de a Rn empaquetado y se puede diseñar para codificar un polinucleótido de interferencia en cualquier dirección. Los expertos en la técnica entenderán la característica terapéutica de este aspecto del sistema de transducción descrito, ya que puede permitir la expresión de proteínas seleccionadas en un sujeto. De acuerdo con este aspecto del vector descrito, también se puede incluir en el vector un sitio de clonación que tiene uno o más sitios de endonucleasas de restricción para facilitar la inserción de una secuencia de polinucleótido de interés.

[0051] Otro vector útil en la producción de las VLP descritas en este documento es un vector que codifica una proteína estructural de virus. Una de esas clases de proteínas es la proteína del antígeno específico del grupo retroviral (gag). La proteína gag es la proteína estructural del núcleo de los retrovirus y, en algunos casos, es capaz de formar núcleos de virus envueltos cuando se expresa en células eucariotas. Esta propiedad hace que las proteínas gag sean particularmente útiles en la producción de VLP, porque pueden formar el aspecto estructural básico de la partícula y permitir el empaquetamiento de ARN asociado con una secuencia señal de empaquetamiento retroviral. Por consiguiente, en el presente documento se describen vectores que incluyen un polinucleótido que codifica una proteína gag retroviral. En algunos casos, los vectores descritos incluyen un polinucleótido que codifica una proteína gag retroviral y una secuencia de polinucleótidos promotora que permite que la secuencia del gen gag se transcriba en ARNm por la ARN polimerasa de la célula huésped. En un caso, la secuencia de polinucleótidos promotora deriva de un virus, tal como SV40 o CMV. En algunos casos, el vector incluirá además un polinucleótido que codifica una proteína de interés. Los expertos en la técnica pertinente entenderán que se puede usar una secuencia de polinucleótidos de una proteína gag de cualquier retrovirus para producir los vectores y VLP descritos en el presente documento. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína gag puede derivar del virus del sarcoma de Rous. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína gag puede derivar del virus de la leucemia murina. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína gag puede derivar de SIV. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína gag puede derivar del virus linfotrópico T humano.

[0052] Otro vector útil en la producción de las VLP descritas en el presente documento es un vector que codifica una proteína para mediar la fusión entre la envoltura de VLP y una célula huésped. Una clase de proteínas adecuadas para este propósito son las proteínas de fusión viral, que facilitan la infección por virus de las células al permitir que un virus envuelto fusione su membrana con la de una célula huésped. Muchas de las proteínas de fusión viral también tienen proteínas receptoras celulares conocidas, o sospechosas, que pueden permitir el reconocimiento de tipos celulares seleccionados, o en casos de receptores más ubicuos, tales como el ácido siálico para el virus de la influenza, puede desearse un reconocimiento más generalizado. En algunos casos, las proteínas de fusión viral funcionan junto con proteínas de unión viral, ligandos para el receptor celular, un receptor para un ligando celular o proteínas accesorias, por tanto, las proteínas de este tipo también pueden ser codificadas por los vectores descritos, además de, o también por, el vector que codifica una proteína de fusión viral. Alternativamente, en algunos casos, una proteína de fusión viral de un virus puede ser codificada por el vector descrito junto con una proteína de unión viral de otro virus, un ligando de un receptor celular, un receptor de un ligando celular o una proteína accesoria para facilitar, o dirigir, el direccionamiento de una VLP a un tipo de célula deseado. En algunos casos, la proteína de fusión viral, la proteína de unión viral, el ligando de un receptor celular, el receptor de un ligando celular o la proteína accesoria será una proteína de membrana de tipo I, que permitirá que el dominio extracelular de la proteína se oriente extracelularmente cuando está presente en la superficie celular. Esto también permitirá que la proteína de fusión se oriente correctamente después de la gemación de una VLP de una célula de empaquetamiento. La expresión de tales proteínas en una célula dará como resultado típicamente que la superficie celular esté recubierta con las proteínas, de modo que la gemación de una VLP de cualquier parte de la membrana celular proporcionará a la VLP cierta cantidad de proteína(s) en su superficie. En algunos casos, los vectores descritos incluyen un polinucleótido que codifica una proteína de fusión viral y una secuencia de polinucleótidos promotora que permiten que la secuencia del gen de la proteína de fusión se traduzca en ARNm por la ARN polimerasa de la célula huésped. En un caso, la secuencia de polinucleótidos promotora deriva de un virus, tal como SV40 o CMV. En ciertos casos, los vectores descritos incluyen un polinucleótido que codifica una proteína de unión viral y una secuencia de polinucleótidos promotora que permite que la secuencia del gen de la proteína de unión sea traducida en ARNm por la ARN polimerasa de la célula huésped. En un caso, la secuencia de polinucleótidos promotora deriva de un virus, tal como SV40 o CMV. En algunos casos, los vectores descritos en este documento incluyen un polinucleótido que codifica una proteína G del virus de la estomatitis vesicular. En algunos casos, los vectores descritos en este documento incluyen un polinucleótido que codifica la proteína hemaglutinina de la influenza. En algunos casos, los vectores descritos en este documento incluyen un polinucleótido que codifica la proteína neuraminidasa de la influenza. En algunos casos, los vectores descritos en este documento incluyen un polinucleótido que codifica la proteína de fusión del virus sincitial respiratorio. En algunos casos, los vectores descritos en el presente documento incluyen un polinucleótido que codifica la proteína VP7 de rotavirus. Otras de dichas proteínas de fusión resultarán evidentes para los expertos en la técnica basándose en el tropismo deseado o la diana celular del virus asociado.

Células que expresan los vectores descritos

[0053] En el presente documento se proporcionan células que comprenden los vectores descritos para producir VLP. Estas células pueden usarse para producir las VLP descritas en el presente documento transcribiendo o expresando los polinucleótidos de los vectores. Por ejemplo, una célula de mamífero transfectada con un vector que tiene una secuencia de polinucleótidos que codifica una construcción de ARN de alfavirus que tiene un gen o polinucleótido de interés y una señal de empaquetamiento, un vector que codifica una proteína gag retroviral y un vector que codifica una proteína de fusión viral podría producir una VLP que tiene la proteína de fusión viral expresada en su superficie con una o dos copias de la construcción de ARN de alfavirus codificado alojada dentro de la VLP. Además, dado que ninguno de estos vectores codifica las proteínas estructurales de alfavirus, la posibilidad de crear virus infecciosos se reduce sustancialmente en comparación con sistemas que no incluyen proteínas estructurales de alfavirus.

[0054] Las células descritas pueden ser cualquier célula eucariota capaz de transcribir y, cuando sea necesario (tal como en el caso de las proteínas gag y de fusión), traducir los polinucleótidos de los vectores descritos. Es probable que las células sean células de mamífero. Por ejemplo, se podrían usar células de roedores, tales como células murinas, de hámster (CHO o BHK-21) o de rata para expresar los vectores descritos; podrían usarse células caninas, tales como células renales caninas de Madin Darby, para expresar los vectores descritos; podrían usarse células de primates, tales como células vero, para expresar los vectores descritos; y podrían usarse células humanas, tales como células HEK293T (riñón humano), células Hep-2 (vías respiratorias humanas), Caco-2 (intestino), HeLa (epitelio), y otras de dichas líneas celulares conocidas en la técnica, para expresar los vectores descritos. Las células descritas se pueden transfectar y seleccionar, utilizando métodos de transfección y selección estándar conocidos en la técnica, para comprender de manera estable uno o más de los vectores descritos.

[0055] Las líneas celulares descritas en el presente documento pueden contener un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un replicón de alfavirus en el que el replicón de alfavirus codifica una proteína de interés, un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína gag y un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una envoltura fusogénica heteróloga, en las que ni los vectores ni la célula contienen un gen que codifica una proteína estructural de alfavirus. En algunos casos, el replicón de alfavirus puede derivar del virus Sindbis o VEEV. En algunos casos, el replicón de alfavirus puede tener secuencias de polinucleótidos que codifican las proteínas no estructurales NSP1, NSP2, NSP3, NSP4 del virus Sindbis o del VEEV y una señal de empaquetamiento retroviral. En algunos casos, la señal de empaquetamiento retroviral puede derivar del virus del sarcoma de Rous o del virus de la leucemia murina. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína gag deriva del virus del sarcoma de Rous. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de envoltura fusogénica heteróloga codifica VSV-G.

Partículas similares a virus

[0056] Las VLP producidas usando los vectores y las células también se describen en este documento. Las VLP descritas en el presente documento tendrán cuatro características generales: comprenderán una o dos moléculas de ARN que codifican un replicón de alfavirus y, opcionalmente, una proteína de interés; tendrán un núcleo viral que comprende una proteína gag retroviral o, en algunos casos, una proteína de fusión gag; tendrán una proteína de superficie para facilitar la fusión con una célula y no contendrán un polinucleótido que codifique una proteína estructural de alfavirus.

[0057] Las VLP descritas en este documento serán útiles en la transducción de células con el fin de expresar una proteína de interés en las mismas. Por consiguiente, las VLP descritas pueden incorporar uno o dos polinucleótidos de ARN basados en alfavirus capaces de codificar una proteína de interés. Para facilitar la traducción de la secuencia de ARN, algunos casos del ARN empaquetado descrito pueden incluir secuencias de inicio de la traducción, tal como se describen en el presente documento. En algunos casos, la secuencia de ARN incorporada en la VLP incluirá una secuencia de empaquetamiento retroviral que facilitará la inclusión del ARN en una VLP en formación. En algunos casos, la secuencia de empaquetamiento retroviral se deriva del virus del sarcoma de Rous, virus de la leucemia murina de Moloney, VIS, VIH, virus linfotrópico T humano y similares. En un caso particular, la secuencia de empaquetamiento retroviral deriva del virus del sarcoma de Rous. Alternativamente, la secuencia de empaquetamiento retroviral puede derivar del virus de la leucemia murina. Además, las secuencias de ARN incluidas en la VLP pueden ser capaces de codificar proteínas de alfavirus no estructurales. Por ejemplo, en algunos casos, el ARN empaquetado puede codificar una o más proteínas no estructurales de virus Sindbis o del VEEV. En algunos casos, el ARN empaquetado puede codificar la proteína no estructural NSP1 del virus Sindbis o del VEEV. En algunos casos, el ARN empaquetado puede codificar la proteína no estructural NSP2 del virus Sindbis o del VEEV. En algunos casos, el ARN empaquetado puede codificar la proteína no estructural NSP3 del virus Sindbis o del VEEV. En algunos casos, el ARN empaquetado puede codificar la proteína no estructural NSP4 del virus Sindbis o del VEEV. En algunos casos, el ARN empaquetado puede codificar las proteínas no estructurales NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4 del virus Sindbis o del VEEV. El ARN empaquetado también puede incluir la secuencia de polinucleótidos de una proteína de interés. Por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar GFP en algunos casos y servir como marcador detectable de transducción viral de una célula diana. En otro caso, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una versión funcional de una proteína endógena a la célula diana. En otro caso, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una versión funcional de una proteína endógena al sujeto diana. En otro caso, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una proteína que es extraña a la célula diana. En otro caso, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una proteína que es extraña al sujeto diana. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una proteína capaz de tener un efecto terapéutico sobre una célula diana. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos de interés puede codificar una proteína capaz de tener un efecto terapéutico sobre un sujeto diana. Los expertos en la técnica entenderán la característica terapéutica de este aspecto de las VLP descritas, ya que pueden permitir la expresión de proteínas seleccionadas en una célula o sujeto.

[0058] Las VLP descritas en el presente documento también pueden comprender una proteína gag viral para proporcionar una estructura de núcleo viral a la partícula. La proteína gag es la proteína estructural del núcleo de los retrovirus y, en algunos casos, es capaz de formar núcleos de virus envueltos cuando se expresa en células eucariotas. Esta propiedad hace que las proteínas gag sean particularmente útiles en la producción de VLP, porque pueden formar el aspecto estructural básico de la partícula y permitir el empaquetamiento de ARN asociado con una secuencia señal de empaquetamiento retroviral. Los expertos en la técnica pertinente entenderán que se puede usar una proteína gag de cualquier retrovirus para producir los vectores y las VLP descritas en el presente documento. En algunos casos, la proteína gag puede derivar del virus del sarcoma de Rous. En algunos casos, la proteína gag puede derivar del virus de la leucemia murina. En casos alternativos, la proteína gag puede derivar de VIS, VIH, virus linfotrópico T humano y retrovirus similares.

[0059] Otro componente de las VLP descritas en este documento es una proteína para mediar en la fusión entre la envoltura de la VLP y una célula huésped. Una clase de proteínas adecuadas para este propósito son las proteínas de fusión viral, que facilitan la infección por virus de las células al permitir que un virus envuelto fusione su membrana con la de una célula huésped. Muchas de las proteínas de fusión viral también tienen proteínas receptoras celulares conocidas, o sospechosas, que pueden permitir el reconocimiento de tipos celulares seleccionados, o en casos de receptores más ubicuos, tales como el ácido siálico para el virus de la gripe, se puede lograr un reconocimiento más generalizado. En algunos casos, las proteínas de fusión viral pueden funcionar junto con proteínas de unión viral, ligandos de receptores celulares, receptores de ligandos celulares o proteínas accesorias, por tanto, proteínas de este tipo también pueden estar presentes en la superficie de VLP además de una proteína de fusión viral. Alternativamente, en algunos casos, las VLP descritas pueden tener una proteína de fusión viral de un virus y una proteína de unión viral de otro virus, un ligando de un receptor celular, un receptor de un ligando celular o una proteína accesoria para facilitar o dirigir, direccionamiento de una VLP a un tipo de célula deseado. De manera similar, las VLP descritas pueden producirse para que tengan más de una proteína de fusión en la envoltura de VLP, ya que esto puede facilitar la fusión a una variedad seleccionada de tipos de células. En algunos casos, la(s) proteína(s) de superficie de VLP serán una proteína de membrana de tipo I, que permitirá que el dominio extracelular de la proteína se oriente extracelularmente cuando esté presente en la superficie celular. Esto también permitirá que la proteína de fusión se oriente correctamente después de la gemación de una VLP de una célula de empaquetamiento. La expresión de tales proteínas en una célula dará como resultado típicamente que la superficie celular esté recubierta con las proteínas, de modo que la gemación de una VLP de cualquier parte de la membrana celular proporcionará a la VLP cierta cantidad de la proteína de fusión en su superficie. En algunos casos, las VLP descritas en el presente documento incluyen una proteína VSV-G para mediar en la fusión celular. En algunos casos, las VLP descritas en el presente documento incluyen una proteína hemaglutinina de la gripe para mediar en la fusión celular. En algunos casos, las VLP descritas en el presente documento incluyen una proteína neuraminidasa de la gripe para facilitar la fusión celular. En algunos casos, las VLP descritas en el presente documento incluyen la proteína de fusión del virus sincitial respiratorio. En algunos casos, las VLP descritas en este documento incluyen la proteína VP7 de rotavirus. Otras de dichas proteínas de fusión serán evidentes para loa expertos en la materia en base al tropismo deseado o diana celular del virus asociado.

[0060] Las VLP descritas en el presente documento pueden comprender un replicón de alfavirus, en el que el replicón de alfavirus incluye un polinucleótido de interés o codifica una proteína de interés, proteína gag retroviral y proteína de envoltura fusogénica heteróloga; en la que la VLP no contiene un gen de proteína estructural de alfavirus. En algunos casos, el replicón de alfavirus de la VLP se deriva del virus Sindbis o VEEV. Por ejemplo, las VLP descritas en el presente documento pueden tener un replicón de alfavirus que codifique proteínas no estructurales NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4 del virus Sindbis o del VEEV. En algunos casos, la señal de empaquetamiento retroviral asociada con el ARN empaquetado en las VLP descritas se deriva del virus del sarcoma de Rous o del virus de la leucemia murina. Basado en esta descripción, los expertos en la técnica comprenderán fácilmente que las VLP descritas pueden modificarse para incorporar aspectos de los virus que pueden facilitar la estabilidad de las VLP, el empaquetamiento de ARN o la entrada celular. Debe entenderse que tales modificaciones están dentro del alcance de las divulgaciones proporcionadas en el presente documento.

[0061] Un ejemplo consiste en una VLP que comprende: un replicón de alfavirus que comprende un polinucleótido recombinante, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica ambas subunidades de un antígeno mayor de histocompatibilidad de clase II; una proteína gag retroviral y una proteína de envoltura fusogénica, en la que la VLP no contiene un gen de proteína estructural de alfavirus.

[0062] El polipéptido recombinante de la VLP puede comprender además una secuencia que codifica una proteína de señal coestimuladora. La proteína de señal coestimuladora se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en CD28, CD80, CD86 y CTLA-4. La proteína de señal coestimuladora comprende más preferiblemente CD80. Una composición para uso según la invención es como se define en las reivindicaciones.

Procedimientos de producción de las VLP descritas.

[0063] Las VLP descritas en el presente documento se pueden producir de diversas formas, como resultará evidente para los expertos en la técnica basándose en la divulgación proporcionada. La característica común de estos diversos procedimientos es la expresión de los vectores descritos en una célula capaz de expresar las proteínas necesarias (gag y una proteína de fusión) y producir el replicón de ARN basado en alfavirus. Por consiguiente, un procedimiento para producir una VLP descrita en el presente documento puede incluir cotransformar, transfectar o nucleofectar una célula eucariota con un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un replicón de alfavirus, en el que el replicón de alfavirus incluye un polinucleótido de interés o codifica una proteína de interés; un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína gag retroviral; y un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de envoltura fusogénica heteróloga; y cultivar la célula cotransformada en condiciones adecuadas para hacer que cada vector produzca su producto codificado, produciendo así una partícula similar a un virus. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos que codifica el replicón de alfavirus puede derivar del virus Sindbis o VEEV. En algunos casos, el replicón de alfavirus puede tener secuencias de polinucleótidos que codifican las proteínas no estructurales NSP1, NSP2, NSP3, NSP4 del virus Sindbis o del VEEV y una señal de empaquetamiento retroviral. En algunos casos, la señal de empaquetamiento retroviral puede derivar del virus del sarcoma de Rous o del virus de la leucemia murina. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína gag deriva del virus del sarcoma de Rous. En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de envoltura fusogénica heteróloga codifica VSV-G.

Composiciones y procedimientos de administración.

[0064] En el presente documento se describen composiciones que comprenden al menos una VLP descrita y un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones son útiles, por ejemplo, para la administración a sujetos que necesitan la expresión de una proteína exógena o expresión aumentada de una proteína que normalmente se encuentra en aquellos de la misma especie que el sujeto. Las composiciones pueden formularse como cualquiera de las diversas preparaciones que son conocidas y adecuadas en la técnica, incluidas las descritas y ejemplificadas en el presente documento. En algunos casos, las composiciones son formulaciones acuosas. Pueden prepararse soluciones acuosas mezclando las VLP en agua o tampón fisiológico adecuado y, opcionalmente, añadiendo colorantes, aromatizantes, conservantes, agentes estabilizantes y espesantes adecuados y similares, según se desee. Las suspensiones acuosas también se pueden fabricar dispersando las VLP en agua o tampón fisiológico con material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y otros agentes de suspensión conocidos.

[0065] Las composiciones pueden formularse para inyección en un sujeto. Para inyección, las composiciones descritas se pueden formular en soluciones acuosas, tales como agua o en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener uno o más agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. Las formulaciones inyectables también se pueden preparar como preparaciones en forma sólida que están destinadas a convertirse, poco antes de su uso, en preparaciones en forma líquida adecuadas para inyección, por ejemplo, mediante la constitución con un vehículo adecuado, tal como agua estéril, solución salina o alcohol, antes de usarse. El procedimiento descrito en el presente documento puede administrar la composición farmacéutica por vía parenteral. La composición farmacéutica se puede administrar mediante inyección intravenosa. La composición farmacéutica se puede administrar mediante inyección dentro de un tejido, preferiblemente un tumor o un cáncer.

[0066] Las composiciones se pueden formular para la administración en forma de aerosol a un sujeto. Para la administración en aerosol, las composiciones descritas se pueden formular en soluciones acuosas, tales como agua o en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener uno o más agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes.

[0067] Las composiciones se pueden formular en los vehículos de liberación sostenida o preparaciones de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de administración adecuados para su uso como portadores de fármacos hidrófobos.

Modos de terapia

[0068] El procedimiento descrito en el presente documento puede estar dirigido a prevenir o tratar una enfermedad en la que el paciente tiene un tumor. El paciente puede ser un paciente con cáncer, preferiblemente un paciente con cáncer se selecciona del grupo de pacientes con cáncer que tienen tumores sólidos derivados de carcinoma de mama, cervical, próstata, ovario, renal, pulmón, gástrico, páncreas, glioblastoma y colorrectal, más preferiblemente un paciente con cáncer de mama. Por consiguiente, el polinucleótido recombinante puede comprender además una secuencia que codifica un antígeno específico de tumor, preferiblemente un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en alfafetoproteína (AFP), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, calcitonina, calretinina, antígeno carcinoembrionario, cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína de la membrana epitelial (EMA), factor VIII, FL1, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), HMB-45, gonadotropina coriónica humana (hCG), inhibina, queratina, marcador de linfocitos, MART-1 (Melan-A), Myo D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), antígeno específico de próstata, proteína S100, actina del músculo liso (SMA), sinaptofisina, tiroglobulina, factor de transcripción tiroideo-1, tumor M2-PK, vimentina, grupo de diferenciación 10 (CD10), CD13, CD15, CD20, CD25, CD30, CD31, CD34, CD45 (PTPRC), CD99, CD117 y un fragmento de los mismos.

[0069] El procedimiento descrito en este documento puede administrar la composición farmacéutica por vía parenteral. La composición farmacéutica se puede administrar mediante inyección intravenosa. La composición farmacéutica se puede administrar mediante inyección dentro del tumor.

[0070] En el procedimiento descrito en el presente documento la composición farmacéutica se puede administrar en combinación con un fármaco quimioterapéutico. El fármaco quimioterapéutico puede seleccionarse de las clases de fármacos que consisten en un taxano (paclitaxel o docetaxel), una antraciclina (doxorrubicina o epirrubicina), ciclofosfamida, capecitabina, tamoxifeno, letrozol, carboplatino, gemcitabina, cisplatino, erlotinib, irinotecán, fluorouracilo y oxaliplatino. La composición farmacéutica se puede administrar en combinación con radioterapia.

[0071] En el procedimiento descrito en el presente documento, la composición farmacéutica induce células T citolíticas de CD8+ específicas de tumor. El procedimiento además está dirigido a una composición farmacéutica que comprende la VLP que comprende un antígeno de MHC de clase II que induce inmunidad específica de tumor.

[0072] Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y están destinados a mejorar, no limitar, la divulgación precedente.

EJEMPLO 1: Producción de un sistema de expresión génica basado en alfavirus

[0073] Se diseñó un sistema de expresión génica de alfavirus para permitir para que el suministro mediado por VLP de un gen exógeno de interés (GOI) o proteína de interés (POI) a una célula diana con un bajo riesgo de causar infección viral citopático. El sistema de expresión se diseñó utilizando tres vectores, que se pueden expresar en una línea celular de empaquetamiento para producir una VLP transductora. Un vector codifica la construcción de expresión basada en alfavirus, otro vector codifica una proteína gag retroviral para facilitar la formación de VLP y un tercer vector codifica una proteína de fusión para mediar la fusión de VLP a la célula huésped. Además, el sistema se construyó para que funcione sin la necesidad de que estén presentes proteínas estructurales de alfavirus.

[0074] Para lograr esto, se produjo un plásmido de ADN basado en alfavirus con un promotor de citomegalovirus (CMV); seguido de una señal de empaquetamiento retroviral de la respectiva proteína de empaquetamiento retroviral GAG; seguido de genes del virus Sindbis o VEE que codifican proteínas no estructurales NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4; y finalmente, uno o más promotores subgenómicos (SGP; un promotor de la ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por virus, que da como resultado la formación de ARNm) para impulsar la expresión de un gen de interés (GOI), que consiste en un polinucleótido recombinante, y se inserta en un sitio de clonación múltiple; una región 3' sin traducir (URT); y una cola de poliA (Fig. 1).

[0075] Otro plásmido se construyó para codificar una proteína gag retroviral y una segunda proteína opcional de interés (POI). Se construyó un tercer plásmido para proporcionar expresión de una proteína de fusión viral VSV-G.

[0076] Una vez construidos, los plásmidos se ensayaron para determinar la capacidad para producir VLP que llevan un replicón de virus Sindbis que tiene un gen de interés. Para estos experimentos, se utilizó GFP como gen de interés para facilitar la detección de suministro y la expresión intracelular del gen. Para producir VLP, cada uno de los tres plásmidos descritos anteriormente se transfectaron en células de riñón de cría de hámster (BHK-21) usando un procedimiento de nucleofección estándar con un sistema Amaxa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Lonza).

[0077] Brevemente, se resuspendieron células BHK-21 a 3x106en 100 |jl de solución de nucleofección L (Amaxa) y se transfirieron a un tubo que contenía 4,5 jg de plásmido que codificaba GAG, 3 jg de plásmido que codifica la glicoproteína VSV-G y 100 nanogramos de plásmido que codifica el replicón del alfavirus Sindbis o 2,5 microgramos para replicón de VEE (en volumen total de 10 jl). La mezcla de células y plásmidos se transfirió a una cubeta de nucleofección y se nucleofectó usando el aparato Amaxa nucleofector II usando las condiciones para BHK-21. Las células nucleofectadas se resuspendieron en 500 j l de medio de cultivo completo y se transfirieron a una placa de cultivo de tejidos que contenía una solución de medio de cultivo y se incubaron a 37 °C durante 72-96 horas o durante 72 horas a 32 °C. Después de este tiempo, los sobrenadantes que consistían en VLP y replicón de alfavirus encapsidado se depuraron mediante centrifugación a 3000 RPM/10 min a 4 °C, se filtraron con un filtro de 45 um y se expusieron a 10 unidades de DNAsa I (turbo ™ -DNAse: Ambion) durante 30 min a temperatura ambiente. Las VLP procesadas se almacenaron a 4 °C o se congelaron en hielo seco y se transfirieron a -80 °C. Como control negativo (VLP de fusión defectuosa), las células BHK-21 también se nucleofectaron con solo los plásmidos pCMV-Sin Rep-POI-2 o VEEV-Rep-POI y pGAG-POI-1, pero no el plásmido pEnvelope que codifica VSV-G. Después de la transfección, las células se incubaron durante 48-72 horas en medio de cultivo de tejidos en condiciones de crecimiento normales para permitir la producción de VLP impulsada por plásmidos. Una vez que las células transfectadas terminaron de incubar, se recogió el sobrenadante del cultivo de tejidos, que debería contener las VLP producidas. A continuación, los sobrenadantes de células recogidos se añadieron a células BHK-21 cultivadas para determinar si las células podían transducirse satisfactoriamente con GFP. Los sobrenadantes celulares recogidos de células BHK-21 transfectadas con los tres plásmidos dieron como resultado una expresión de GFP robusta cuando se expusieron a células BHK-21 no transfectadas. Por el contrario, no se observó expresión de GFP para las células BHK-21 no transfectadas incubadas con sobrenadantes celulares recogidos de células BHK-21 transfectadas únicamente con los plásmidos pCMV-Sin Rep-POI-2 y pGAG-POI-1. También se llevaron a cabo experimentos similares utilizando células de riñón embrionario humano (HEK293T) para demostrar que las VLP construidas podían transducir células humanas. Además, las VLP construidas también se pueden almacenar a 4 °C durante al menos 30 días sin perder la capacidad de transducir células.

[0078] También se realizaron experimentos para evaluar la capacidad de replicón de alfavirus basado en VEEV para expresar la proteína en las células. Para estos estudios, se transdujeron células BHK-21 con VLP que tenían un gen de luciferasa de Gaussia insertado en un replicón de VEEV. Después de la transducción, los sobrenadantes celulares monitorearon la expresión de la proteína luciferasa. Se detectaron altas cantidades de luciferasa en los sobrenadantes de células transducidas con el replicón de VEEV que tenía el gen de luciferasa de Gaussia, en relación con los replicones de VEEV de control sin un gen exógeno o con un gen que codifica GFP. Además, la expresión de la proteína luciferasa aumentó rápidamente después de la transducción. También se observaron resultados similares en el contexto de la administración de cre recombinasa funcional (glóbulos rojos) a células diseñadas para expresar GFP en ausencia de cre recombinasa.

[0079] Las células se transdujeron en paralelo con cualquiera de las VLP basadas en Sindbis que codifican GFP o VLP basadas en VEEV que codifican GFP. Ambas VLP basados en alfavirus causaron una expresión robusta de GFP, mientras que se observó que las células transducidas con VLP basadas en VEEV tenían los niveles de expresión más altos.

EJEMPLO 2 - Expresión de múltiples proteínas en células diana transducidas con VLP de EEV

[0080] El concepto básico del suministro de ARN usando VLP se muestra en la Fig. 2. En este experimento, se utilizó un modelo de cáncer de mama. Se desarrolló un vector promotor doble del replicón para expresar HLA-DR1 y CD80 (Fig. 3). Se usó una VLP que codifica estos dos antígenos para infectar células de cáncer de mama 4T1-Luc2. Usando anticuerpos anti-HLA-DR y CD80, los resultados mostraron que ambas proteínas se expresan de hecho en esta célula. HLA-DR1 y CD80 se expresan en células 4T1-Luc2 transfectadas con una VLP con el replicón de VLP-VEE de la Fig. 2. Las células que expresan HLA-DR1 se identificaron mediante un anticuerpo anti-HLA-DR marcado con FITC. Las células que expresan CD80 se identificaron mediante un anticuerpo anti-CD80 marcado con PE.

[0081] Para evaluar si un replicón de alfavirus puede expresar dos proteínas separadas en la misma célula, se realizaron experimentos usando un replicón de VEE que tiene HLA-DR1 bajo el control de un promotor subgenómico y CD80 bajo otro promotor subgenómico. Después de la producción de VLP que tienen el replicón de VEE descrito, las células se transdujeron y se examinaron para determinar la expresión de ambas proteínas. Las células transducidas pudieron expresar ambas proteínas (HLA-DR1 y CD80).

EJEMPLO 3: Expresión de múltiples proteínas en células diana transducidas con VLP de EEV

[0082] Para ensayar la VLP en un sistema animal de ratón, se implantaron células 4T1-Luc2, células de cáncer de mama altamente agresivas y metastásicas, en la almohadilla de grasa mamaria de diez ratones. Los tumores fueron visibles a los pocos días y aparentes y palpables (5-7 mm) en una semana. A tres de los ratones se les inyectó intratumoralmente una VLP que expresaba una proteína inerte (GFP), a dos ratones se les inyectó una VLP que expresaba HLA-DR1/CD80 humano (xenogénico) y cinco ratones permanecieron sin inyectar como control.

[0083] Después de una semana, los tumores se extirparon quirúrgicamente de todos los ratones y se siguió el recrecimiento del tumor y la metástasis durante varias semanas. Los resultados (Fig. 5) mostraron que 4 de 5 ratones no inyectados (controles no tratados) murieron en 4-6 semanas debido al recrecimiento del cáncer y metástasis en pulmón, mama e hígado. Los tres ratones inyectados con VLP/GFP (controles de proteínas no específicas) también murieron en 4-6 semanas debido al recrecimiento del cáncer y metástasis en pulmón, mama e hígado. Sin embargo, ambos ratones tratados con VLP/HLA-DR1/CD80 permanecieron vivos durante más de 25 semanas sin signos de desarrollo tumoral.

[0084] Con el fin de demostrar que los ratones de hecho desarrollaron inmunidad contra las células tumorales, los ratones que sobrevivieron al experimento anterior fueron expuestos nuevamente con células 4T1-Luc2. También se incluyeron cuatro nuevos ratones de control. En el experimento de exposición, a todos los ratones se les inyectaron por vía intravenosa 10.000 células 4T1-Luc2 y se monitorizó el crecimiento y la progresión del tumor. Si los ratones desarrollan inmunidad, los ratones que sobrevivieron no desarrollarán un tumor y no se encontrará metástasis. Si no hay inmunidad, los ratones sucumbirán al cáncer metastásico. Cuatro animales de control sucumbieron al cáncer metastásico dentro de las dos semanas de la inyección intravenosa de células 4T1-Luc2, mientras que los animales tratados con VLP terapéuticas sobrevivieron después de más de 4 semanas de exposición (Fig. 5). Esto es indicativo de que los animales tratados con HLA / CD80 han adquirido inmunidad contra las células tumorales.

[0085] El lenguaje condicional utilizado en este documento, tal como, entre otros, "puede", "podría", "por ejemplo" y similares, a menos que se indique específicamente lo contrario, o se entienda de otro modo dentro del contexto según se utiliza, generalmente pretende transmitir que ciertas realizaciones incluyen, mientras que otras realizaciones no incluyen, ciertas características, elementos y/o etapas. Los términos "que comprende", "que incluye", "que tiene" y similares son sinónimos y se usan de manera inclusiva, de forma abierta, y no excluyen elementos, características, actos, operaciones, etc. adicionales. Además, el término "o" se usa en su sentido inclusivo (y no en su sentido exclusivo) de modo que cuando se usa, por ejemplo, para conectar una lista de elementos, el término "o" significa uno, alguno o todos los elementos de la lista.

TABLA 1: SEQ ID NO: 1

i gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 61 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 121 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 181 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 241 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 301 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 361 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 421 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 481 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 541 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 601 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 661 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 721 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 781 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tatggacata ttgtcgttag 841 aacgcggcta 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ccgtaggatc gacactttat ccagaacaca gagccagctt gcagagctgg 1741 catcttccat cggtgttcca cttgaatgga aagcagtcgt acacttgccg ctgtgataca 1801 gtggtgagtt gcgaaggcta cgtagtgaag aaaatcacca tcagtcccgg gatcacggga 1861 gaaaccgtgg gatacgcggt tacacacaat agcgagggct tcttgctatg caaagttact 1921 gacacagtaa aaggagaacg ggtatcgttc cctgtgtgca cgtacatccc ggccaccata 1981 tgcgatcaga tgactggtat aatggccacg gatatatcac ctgacgatgc acaaaaactt 2041 ctggttgggc tcaaccagcg aattgtcatt aacggtagga ctaacaggaa caccaacacc 2101 atgcaaaatt accttctgcc gatcatagca caagggttca gcaaatgggc taaggagcgc 2161 aaggatgatc ttgataacga gaaaatgctg ggtactagag aacgcaagct tacgtatggc 2221 tgcttgtggg cgtttcgcac taagaaagta cattcgtttt atcgcccacc tggaacgcag 2281 acctgcgtaa aagtcccagc ctcttttagc gcttttccca tgtcgtccgt atggacgacc 2341 tctttgccca tgtcgctgag gcagaaattg aaactggcat tgcaaccaaa gaaggaggaa 2401 aaactgctgc aggtctcgga ggaattagtc atggaggcca aggctgcttt tgaggatgct 2461 caggaggaag ccagagcgga gaagctccga gaagcacttc caccattagt ggcagacaaa 2521 ggcatcgagg 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caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 10981 gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 11041 gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 11101 ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 11161 attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 11221 gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 11281 tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 11341 agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 11401 gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 11461 actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 11521 tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 11581 attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 11641 tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 11701 tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Composición farmacéutica que comprende una partícula similar a un virus (VLP), comprendiendo la VLP:

a. un replicón de alfavirus que comprende un polinucleótido recombinante, en el que el polinucleótido comprende: (i) una secuencia que codifica ambas subunidades de un antígeno mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II humana, y

(ii) una secuencia que codifica una proteína de señal coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD80, CD28, CD86 y CTLA-4;

b. una proteína gag retroviral, y

c. una proteína de envoltura fusogénica,

en la que la VLP no contiene un gen de proteína estructural de alfavirus,

para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de un tumor en un sujeto mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la transfección in vivo de células de dicho tumor por dicha VLP, preferiblemente mediante administración intratumoral de dicha composición.

2. Composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 1, en la que la proteína de señal coestimuladora comprende CD80.

3. Composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 2, en la que el antígeno mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II humana comprende HLA-DR1.

4. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el replicón de alfavirus comprende la secuencia de ácido nucleico del virus Sindbis o del virus de la encefalitis equina venezolana.

5. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el replicón de alfavirus comprende además una secuencia que codifica las proteínas no estructurales NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4 del virus Sindbis o del virus de la encefalitis equina venezolana; y una señal de empaquetamiento retroviral derivada del virus del sarcoma de Rous.

6. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la VLP no comprende ni expresa un gen pol retroviral.

7. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína gag retroviral es una proteína gag del virus del sarcoma de Rous.

8. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína de la envoltura fusogénica es una glicoproteína, o un fragmento o derivado de la misma.

9. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína de la envoltura fusogénica se une específicamente a una célula tumoral.

10. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el replicón de alfavirus comprende un promotor subgenómico unido operativamente a HLA-DR1 y otro promotor subgenómico unido operativamente a CD80.

11. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho tratamiento o prevención comprende inducir inmunidad específica de tumor.

12. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el sujeto mamífero es un paciente con cáncer seleccionado del grupo de pacientes con cáncer que tienen tumores sólidos derivados de carcinoma de mama, cervical, de próstata, de ovario, renal, de pulmón, gástrico, páncreas, glioblastoma y colorrectal.

13. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición farmacéutica se administra en terapia de combinación con un fármaco quimioterapéutico.

14. Composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 13, en la que el fármaco quimioterapéutico se selecciona de las clases de fármacos que consisten en un taxano (paclitaxel o docetaxel), una antraciclina (doxorrubicina o epirrubicina), ciclofosfamida, capecitabina, tamoxifeno, letrozol, carboplatino, gemcitabina, cisplatino, erlotinib, irinotecán, fluorouracilo y oxaliplatino.

15. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la composición farmacéutica se administra en terapia de combinación con radioterapia.