CN117778432B - 自复制rna载体、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自复制RNA载体、其制备方法及应用。该自复制RNA载体的序列中按5’端到3’端的方向依次设有：T7启动子序列、ATG序列、SINV RNA复制酶编码序列、目标基因序列、含poly(A)的信号序列。其制备方法为在pKGCT7‑SINV‑GFP骨架的插入序列位置插入ATG序列，获得pKGCT7‑SINV‑GFP，经AscI‑NotI双酶切，切掉GFP的序列，然后使用重组酶将目标基因序列插入AscI‑NotI之间，即得。其应用为制备自复制RNA。本发明的自复制RNA载体可以使用假尿嘧啶核苷或N1‑甲基‑假尿嘧啶核苷实现低免疫原性同时不会降低表达效率。
Description
技术领域
本发明涉及自复制RNA载体、其制备方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
当前最有效的mRNA生产方式是利用T7 RNA聚合酶使用GAG（m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG）或者GAU（m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU）帽类似物进行共转录加帽，同时使用三磷酸假尿苷（或其衍生物）替换三磷酸尿苷（UTP），这样可以一步产生极高加帽率且尿嘧啶全部被替换成假尿嘧啶的mRNA，这样的mRNA可以无需其他的反应，直接进行纯化，即可形成用于包封的mRNA原液。该方法的两个关键是使用帽类似物进行共转录加帽，以及使用假尿嘧啶核苷来降低免疫原性。其中假尿嘧啶核苷以及其衍生物的使用对现今mRNA领域的发展起着决定性作用。当前使用的都是T7 RNA聚合酶，而不是SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，后两者研究较少，尚不清楚是否可以简单的移植当前T7 RNA聚合酶的系统。
自复制RNA载体被认为是下一代RNA载体，相比当前最广泛使用的mRNA载体，自复制RNA载体可以对自身进行复制扩增，因此使用很少的量就可以产生很多目标蛋白，且有较长的持续时间，可以克服当前mRNA载体使用量大且持续时间短的问题。
自复制RNA的核心元件是其RNA复制酶系统，一般使用的序列来自披膜病毒科（Togaviridae）的nsp1-4蛋白，通过识别特定的保守序列（CSE，conserved sequenceelement，一般有四个，其中两个分别在5’、3’端）来对其自身进行复制，并同时产生目标蛋白的mRNA。最常见的序列是委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelanequine encephalitisvirus，VEEV），塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus，SFV）和辛德毕斯病毒（Sindbisvirus，SINV），其他序列使用较少。
由于SINV以及SFV因为其对应的载体都必须使用SP6 RNA聚合酶进行转录，后续再使用加帽系统来完成加帽，这与当前常用的T7 RNA聚合酶系统不同，所以当前最常用的自复制RNA载体使用的是VEEV的RNA复制酶。但是该系统使用假尿嘧啶核苷酸（或N1-甲基假尿嘧啶核苷酸）进行修饰后会导致效率极度下降（文献参见：McGee, Joshua E et al.“Complete substitution with modified nucleotides suppresses the earlyinterferon response and increases the potency of self-amplifying RNA.”bioRxiv : the preprint server for biology 2023.09.15.557994. 17 Sep. 2023,doi:10.1101/2023.09.15.557994. Preprint.）；此外，也有使用其他修饰核苷酸（文献参见：Aboshi, M. et al. “Safety and immunogenicity of VLPCOV-02, a SARS-CoV-2self-amplifying RNA vaccine with a modified base, 5-methylcytosine, inhealthy individuals.” medRxiv (2023).），但是该文献中未对比修饰和不修饰的表达效率。然而，未修饰的RNA会引起很强的固有免疫，会产生较强的副作用。因此，迫切需要研制出一种可以进行假尿嘧啶核苷酸（或N1-甲基假尿嘧啶核苷酸）修饰，但不降低表达效率的自复制RNA载体。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种自复制RNA载体，能利用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷而不降低表达效率。同时还提供自复制RNA载体的制备方法及其应用，以及自复制RNA的制备方法。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种自复制RNA载体，所述自复制RNA载体的序列中按5’端到3’端的方向依次设有：T7启动子序列、ATG序列、SINV RNA复制酶编码序列、目标基因序列、poly(A)序列。
其中，所述T7启动子序列为SEQ ID No.5的1309bp-1325bp。
所述SINV RNA复制酶编码序列为SEQ ID No.5的1329bp-8986bp，或者为在SEQ IDNo.5的1329bp-8986bp基础上通过简并密码子替换得到的序列。
优选地，所述poly(A)序列的长度为至少25bp。
优选地，所述poly(A)序列中含有的非A碱基数量大于或等于0。
优选地，所述自复制RNA载体的序列中，在目标基因序列的5’端设有AscI酶切位点、且3’端设有NotI酶切位点，采用XbaI酶切位点作为载体线性化位点。
优选地，所述自复制RNA载体的序列中，在T7启动子序列之前，还按5’端到3’端的方向依次设有：CMV增强子序列、CMV启动子序列、β-珠蛋白内含子序列；在poly(A)序列之后，还按5’端到3’端的方向依次设有：bGH poly(A)信号序列、ori序列、抗性基因序列。
优选地，所述抗性基因序列为KanR序列。
优选地，所述自复制RNA载体的序列如SEQ ID No.5所示。
本发明还提供：
一种自复制RNA载体的制备方法，包括以下步骤：
第一步、采用pKGCT7-SINV-GFP骨架，序列为SEQ ID No.2；其中，插入序列位置在序列的1325bp-1326bp之间；1309bp-1325bp的序列为T7启动子，8984bp-8991bp的序列为AscI酶切位点，9713bp-9720bp的序列为NotI酶切位点，10101bp-10106bp的序列为XbaI酶切位点；
第二步、在pKGCT7-SINV-GFP骨架的插入序列位置插入ATG序列，获得pKGCT7-SINV-GFP，序列为SEQ ID No.5；
第三步、将pKGCT7-SINV-GFP进行AscI-NotI双酶切，切掉GFP的序列，然后使用重组酶将目标基因序列插入AscI-NotI之间，即得自复制RNA载体。
本发明还提供：
前文所述的一种自复制RNA载体用于制备自复制RNA的应用。
优选地，在制备自复制RNA时采用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷。
本发明还提供：
一种自复制RNA的制备方法，包括以下步骤：
第一步、采用前文所述的一种自复制RNA载体；通过酶切将自复制RNA载体线性化，作为线性化模板；
第二步、采用体外转录体系进行体外转录；该体外转录体系包括：第一步所得线性化模板、转录缓冲液、ATP、GTP、CTP、假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷、GAU帽类似物、T7 RNA聚合酶、无核酸酶水；
第三步、将第二步所得转录产物进行纯化，获得自复制RNA原液。
优选地，所述GAU帽类似物为：m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU或m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
与现有技术相比，本发明通过对SINV进行一个碱基的改变（具体为：将其起始的三个碱基由天然的AUU更换为AUG，相应的质粒序列中将原先的ATT删除并插入ATG），使其可以直接利用T7 RNA聚合酶系统以及GAU帽类似物进行自复制RNA的制备；并通过进一步测试发现通过上述改进后的载体使用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷的表达效率和尿嘧啶核苷酸相同。由此本发明获得了一种可以使用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷，且不会降低表达效率的自复制RNA载体，解决了自复制RNA表达效率和免疫原性不可兼得的问题。
附图说明
图1为本发明实施例1的pKGCT7-SINV-GFP质粒图谱。
图2为本发明实施例1的pKGCT7-VEEV-GFP质粒图谱。
图3为本发明实施例2的pKGCT7-SINV-GFP-Fluc质粒图谱。
图4为本发明实施例2的pKGCT7-VEEV-GFP-Fluc质粒图谱。
具体实施方式
具体实施时，本发明自复制RNA载体的序列中按5’端到3’端的方向依次设有：T7启动子序列、ATG序列、SINV RNA复制酶编码序列、目标基因序列、poly(A)序列。
在自复制RNA载体的序列中，在目标基因序列的5’端设有AscI酶切位点、且3’端设有NotI酶切位点，采用XbaI酶切位点作为载体线性化位点。
在自复制RNA载体的序列中，在T7启动子序列之前，还按5’端到3’端的方向依次设有：CMV增强子序列、CMV启动子序列、β-珠蛋白内含子序列。
在自复制RNA载体的序列中，在poly(A)序列之后，还按5’端到3’端的方向依次设有：bGH poly(A)信号序列、ori序列、抗性基因序列；其中，抗性基因序列为KanR序列。
作为一个具体示例，自复制RNA载体的序列如SEQ ID No.5所示，质粒图谱如图1所示。
在自复制RNA载体的序列中，T7启动子序列为SEQ ID No.5的1309bp-1325bp。
SINV RNA复制酶编码序列为SEQ ID No.5的1329bp-8986bp，或者为在SEQ IDNo.5的1329bp-8986bp基础上通过简并密码子替换得到的序列。
poly(A)序列的长度为至少25bp，poly(A)序列中含有的非A碱基数量大于或等于0。
本发明自复制RNA载体的制备方法包括：
第一步、采用pKGCT7-SINV-GFP骨架，序列为SEQ ID No.2；其中，插入序列位置在序列的1325bp-1326bp之间；1309bp-1325bp的序列为T7启动子，8984bp-8991bp的序列为AscI酶切位点，9713bp-9720bp的序列为NotI酶切位点，10101bp-10106bp的序列为XbaI酶切位点；
第二步、在pKGCT7-SINV-GFP骨架的插入序列位置插入ATG序列，获得pKGCT7-SINV-GFP，序列为SEQ ID No.5；
第三步、将pKGCT7-SINV-GFP进行AscI-NotI双酶切，切掉GFP的序列，然后使用重组酶将目标基因序列插入AscI-NotI之间，即得自复制RNA载体。
本发明自复制RNA载体用于制备自复制RNA。其中，在制备自复制RNA时采用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷。
本发明自复制RNA的制备方法包括：
第一步、通过酶切将自复制RNA载体线性化，作为线性化模板；
第二步、采用体外转录体系进行体外转录；该体外转录体系包括：第一步所得线性化模板、转录缓冲液、ATP、GTP、CTP、假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷、GAU帽类似物、T7 RNA聚合酶、无核酸酶水；
第三步、将第二步所得转录产物进行纯化，获得自复制RNA原液。
其中，GAU帽类似物为：m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU或m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1
本实施例为改造SINV，使其可以用于体外转录，并实现有效表达。
本实施例的具体内容如下：
申请人自行合成以下质粒：
pKGCT7-VEEV-GFP：质粒图谱如图2所示，序列为SEQ ID No.1。
pKGCT7-SINV-GFP骨架：序列为SEQ ID No.2；插入序列位置在序列的1325bp-1326bp之间。其中，1309bp-1325bp的序列taatacgactcactata为T7启动子（已公开的载体均使用sp6启动子），8984bp-8991bp的序列ggcgcgcc为AscI酶切位点，9713bp-9720bp的序列gcggccgc为NotI酶切位点，10101bp-10106bp的序列tctaga为XbaI酶切位点。
在pKGCT7-SINV-GFP骨架的插入序列位置分别插入：
ATT，以获得质粒SINV-ATT；
AGGATT，以获得质粒SINV-AGGATT；
AGG，以获得质粒SINV-AGG；
ATG，以获得质粒pKGCT7-SINV-GFP，质粒图谱如图1所示，序列为SEQ ID No.5。在pKGCT7-SINV-GFP中，关键区域为1309 bp-10109 bp，即从T7启动子AT到XbaI酶切位点（注：T7启动子AT为taatacgactcactataAT）。在更换目标基因时，通过AscI-NotI双酶切，切掉GFP的序列，然后使用重组酶将目标序列插入AscI-NotI之间。
对上面获得的pKGCT7-VEEV-GFP，pKGCT7-SINV-GFP，SINV-ATT，SINV-AGGATT，SINV-AGG共5个质粒分别进行XbaI酶切线性化。
针对pKGCT7-VEEV-GFP，pKGCT7-SINV-GFP，SINV-ATT的体外转录体系如下：
该体外转录体系中，使用江苏申基生物科技有限公司T7体外转录试剂盒(AGCU)，货号10110U；GAU Clean CAP为m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU 100mM Ammonium Solution，货号CAP30112。
针对SINV-AGGATT，SINV-AGG的体外转录体系如下：
该体外转录体系中，GAG CAP为m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 100mM AmmoniumSolution，货号CAP3011。
将各体外转录体系置37℃ 4小时。之后进行DNase I消化去除模板，并使用诺唯赞RNA Clean Beads（N412）进行纯化。
检测并计算RNA的产量，结果如下表所示：
该结果表明：SINV-ATT（即SINV天然序列以及已公布载体的序列）产量极低，极不适合T7 RNA聚合酶的体系，由此也可以佐证现有技术已公布载体均应使用SP6启动子-SP6RNA聚合酶系统。
使用Lipo2000 (Thermo，货号11668019)转染293T细胞，每孔加入10ng RNA（除SINV-ATT外，采用上述各载体转录的RNA），转染48小时后观察绿色荧光，观察结果如下：
该结果表明：将SINV RNA开始的三个碱基由AUU替换为AUG，可以实现有效表达，但是如果把AUU替换成AGGAUU或者AGG则不能表达。
实施例2
本实施例为表达效率的验证比较。
本实施例的具体内容如下：
VEEV使用N1-甲基假尿嘧啶核苷会大幅降低表达效率，但是SINV使用N1甲基假尿嘧啶核苷的表达效率与使用尿嘧啶核苷时无明显差异。
为了更好的定量，本实施例使用GFP-Fluc替换GFP序列，使用荧光素酶报告系统进行定量。
对pKGCT7-SINV-GFP和pKGCT-VEEV-GFP分别使用AscI和NotI双酶切，将GFP替换为GFP-Fluc，其最终序列为：
pKGCT7-SINV-GFP-Fluc：质粒图谱如图3所示，序列为SEQ ID No.3。
pKGCT7-VEEV-GFP-Fluc：质粒图谱如图4所示，序列为SEQ ID No.4。
对上述两个质粒分别使用XbaI进行线性化，再各自分别用以下两个体系进行体外转录，从而获得不修饰的RNA（即采用尿嘧啶UTP）以及N1-甲基假尿嘧啶（即N1-Me-pUTP）修饰的RNA：
获得不修饰的RNA：使用江苏申基生物科技有限公司T7体外转录试剂盒(AGCU)，货号10110U。
获得N1-甲基假尿嘧啶修饰的RNA：使用江苏申基生物科技有限公司T7体外转录试剂盒(AGCN)，货号10110N：
将各体外转录体系置37℃ 4小时。之后进行DNase I消化去除模板，并使用诺唯赞RNA Clean Beads（N412）进行纯化。
检测并计算RNA的产量，结果如下表所示：
该结果表明：使用N1-甲基假尿嘧啶会轻度降低产量，但是该修饰对其体内作用至关重要（降低免疫原性）。
使用Lipo2000 (Thermo，货号11668019)转染293T细胞，每孔加入10ng RNA（采用上述各载体转录的RNA），转染48小时后观察绿色荧光强度，观察结果如下：
该结果表明：与已有报道一致，VEEV载体使用假尿嘧啶核苷修饰后会明显降低表达效率。
为了准确定量，本实施例采用荧光素酶报告系统进行检测，结果如下：
该结果表明：与上述的荧光结果一致，VEEV载体使用假尿嘧啶核苷修饰后会明显降低表达效率，降低了约90%。相比之下，SINV载体使用假尿嘧啶核苷修饰的情况和不修饰的情况则无显著差异。
综合以上各实施例可知：
（1）本发明将SINV第三位碱基由U替换为G，可以获得一种利用T7 RNA聚合酶系统进行高效制备的自复制RNA载体，该自复制RNA载体能利用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷而不降低表达效率。
具体而言，本发明通过对SINV进行一个碱基的改变（具体为：将其起始的三个碱基由天然的AUU更换为AUG，相应的质粒序列中将原先的ATT删除并插入ATG），使其可以直接利用T7 RNA聚合酶（而不必再采用现有的SINV载体所用SP6 RNA聚合酶，参考文献：English,Justin G et al. “VEGAS as a Platform for Facile Directed Evolution inMammalian Cells.” Cell vol. 178,3 (2019): 748-761.e17. doi:10.1016/j.cell.2019.05.051）系统以及GAU帽类似物进行自复制RNA的制备；并通过进一步测试发现通过上述改进后的载体使用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷的表达效率和尿嘧啶核苷酸相同。由此本发明获得了一种可以使用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷，且不会降低表达效率的自复制RNA载体。
（2）本发明制备自复制RNA的过程主要包括：（i）使用XbaI酶切，使质粒线性化；（ii）体外转录，关键成分包括第一步的线性化模板，T7 RNA聚合酶，反应缓冲液，ATP，GTP，CTP以及三磷酸假尿嘧啶核苷（或者其衍生物），GAU帽类似物。本发明通过单碱基替换改造获得的SINV载体可以完美使用当前的T7 RNA聚合酶共转录加帽系统，其制备过程和当前完善的VEEV载体一致，体外转录后直接纯化即可获得自复制RNA原液。
（3）本发明解决了自复制RNA表达效率和免疫原性不可兼得的问题。现有技术使用常见的VEEV序列，如果用尿嘧啶核苷，则免疫原性强，如果用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷，则表达效率低。本发明改造获得的SINV载体，使用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷的表达效率与使用尿嘧啶核苷时一样，如此即可兼顾保持表达效率且免疫原性较低。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种自复制RNA载体，其特征是，所述自复制RNA载体采用序列为SEQ ID No.2的pKGCT7-SINV-GFP骨架；
所述自复制RNA载体的序列中按5’端到3’端的方向依次设有：T7启动子序列、ATG序列、SINV RNA复制酶编码序列、目标基因序列、poly(A)序列；
其中，所述T7启动子序列为SEQ ID No.5的1309bp-1325bp；
所述SINV RNA复制酶编码序列为SEQ ID No.5的1329bp-8986bp，或者为在SEQ IDNo.5的1329bp-8986bp基础上通过简并密码子替换得到的序列；
所述poly(A)序列的长度为至少25bp；
在目标基因序列的5’端设有AscI酶切位点、且3’端设有NotI酶切位点，采用XbaI酶切位点作为载体线性化位点。
2.根据权利要求1所述的一种自复制RNA载体，其特征是，所述自复制RNA载体的序列中，在T7启动子序列之前，还按5’端到3’端的方向依次设有：CMV增强子序列、CMV启动子序列、β-珠蛋白内含子序列；在poly(A)序列之后，还按5’端到3’端的方向依次设有：bGH poly(A)信号序列、ori序列、抗性基因序列。
3.根据权利要求2所述的一种自复制RNA载体，其特征是，所述抗性基因序列为KanR序列。
4.一种自复制RNA载体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、采用pKGCT7-SINV-GFP骨架，序列为SEQ ID No.2；其中，插入序列位置在序列的1325bp-1326bp之间；1309bp-1325bp的序列为T7启动子，8984bp-8991bp的序列为AscI酶切位点，9713bp-9720bp的序列为NotI酶切位点，10101bp-10106bp的序列为XbaI酶切位点；
第二步、在pKGCT7-SINV-GFP骨架的插入序列位置插入ATG序列，获得pKGCT7-SINV-GFP，序列为SEQ ID No.5；
第三步、将pKGCT7-SINV-GFP进行AscI-NotI双酶切，切掉GFP的序列，然后使用重组酶将目标基因序列插入AscI-NotI之间，即得自复制RNA载体。
5.权利要求1至3任一项所述的一种自复制RNA载体用于制备自复制RNA的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，在制备自复制RNA时采用假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷。
7.一种自复制RNA的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、采用权利要求1至3任一项所述的一种自复制RNA载体；通过酶切将自复制RNA载体线性化，作为线性化模板；
第二步、采用体外转录体系进行体外转录；该体外转录体系包括：第一步所得线性化模板、转录缓冲液、ATP、GTP、CTP、假尿嘧啶核苷或N1-甲基-假尿嘧啶核苷、GAU帽类似物、T7RNA聚合酶、无核酸酶水；
第三步、将第二步所得转录产物进行纯化，获得自复制RNA原液。
8.根据权利要求7所述的一种自复制RNA的制备方法，其特征是，所述GAU帽类似物为：m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU或m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
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| CN110835634A (zh) * | 2018-08-15 | 2020-02-25 | 华东师范大学 | 一种新型碱基转换编辑系统及其应用 |
| CN110835629A (zh) * | 2018-08-15 | 2020-02-25 | 华东师范大学 | 一种新型碱基转换编辑系统的构建方法及其应用 |
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| CN110835634A (zh) * | 2018-08-15 | 2020-02-25 | 华东师范大学 | 一种新型碱基转换编辑系统及其应用 |
| CN110835629A (zh) * | 2018-08-15 | 2020-02-25 | 华东师范大学 | 一种新型碱基转换编辑系统的构建方法及其应用 |
| CN112852841A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-05-28 | 郑州大学 | 一种高效表达目的蛋白的顺式复制子rna构建体 |
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