CN102164611B - 生长因子metrnl的治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质、基因和细胞的治疗性应用，特别是基于分泌性治疗蛋白METRNL的生物学功能的治疗方法，尤其是用于治疗神经系统疾病的治疗方法。METRNL是一种具有神经元保护和/或神经发生作用的神经生存和生长因子(Nerve Survival and Growth factor)。

Description

生长因子METRNL的治疗用途
本申请主张2008年7月24日递交的US 61/083,316的权益，本文通过提述并入其全部内容。本申请主张于2008年7月24日提交的丹麦专利申请PA 200801036的优先权。本文通过提述并入在上述申请和本申请中引用的全部参考文献的全部内容。
技术领域
本发明涉及蛋白质、基因和细胞的治疗性应用，特别是基于分泌性治疗蛋白METRNL的生物学功能的治疗方法，尤其是用于治疗神经系统疾病的治疗方法。METRNL是一种具有神经元保护和/或神经发生作用的神经生存和生长因子。
背景技术
细胞外蛋白质在多细胞生物体的形成、分化和保持等过程中发挥重要作用。许多细胞个体的命运，例如生长包括生存、增殖、迁移、分化或与其它细胞的互作，典型地受到从其它细胞和/或直接环境(immediate environment)接收的信息的控制。这一信息经常通过分泌性多肽(例如有丝分裂因子、存活因子、细胞毒因子、分化因子、神经肽和激素)传送，这些多肽则被各种细胞受体或膜结合蛋白质接收和诠释(interpreted)。这些分泌性多肽或信号分子通常通过细胞分泌途径到达其在细胞外环境中的作用位点。
帕金森病、阿尔兹海默病、亨廷顿病、多发性硬化、肌萎缩性侧束硬化、卒中、精神分裂症、癫痫和外周神经病等多种疾病和相关的疼痛影响着数以百万计的人。这些不同神经疾病特征都在于正常神经元功能的丧失，其造成行为和躯体缺陷。除了慢性和急性神经退行性疾病之外，老化过程、神经系统的物理外伤、和代谢性疾病也可以导致神经细胞丧失、功能失常或退化，伴随着相关行为和躯体缺陷。这些疾病中有许多在今天是无法治愈的、致失能性高，并且常规的药物治疗往往无效。因此非常需要有新的可以减轻疾病和/或用于对症使用的治疗蛋白。
有数种在神经系统或相关的靶区域中表达的分泌性因子在各种伴随神经元功能减弱或丧失的神经适应症(neurological indication)中具有重要的治疗性应用。例如，NGF是治疗阿尔茨海默病的候选物，Neublastin(Artemin)是治疗外周神经病的候选物，GDNF是治疗帕金森病的候选物。
WO 93/22437(Innogenetics)公开了一种与METRNL相同的多肽。有人提示这种蛋白质或其拮抗剂可以用作抗肿瘤化合物，或抗炎化合物，或者作为T细胞和B细胞的生长激活剂，作为骨修复化合物，作为免疫抑制细胞的诱导剂，作为抗克隆刺激因子的抑制剂，或者作为杀锥虫剂。
WO 01/039786(Innogenetics)公开了被命名为抑制性巨噬细胞激活因子(suppressive macrophage activation factors)(SMAFs)的多肽的特定用途，其中SMAF-1与METRNL 100％相同。具体地，它公开了SMAF-1和/或SMAF-2可调制Th1，Th2和/或Th3细胞因子的产生，指示了后者分子、编码它们的核酸和针对它们的抗体如何可以用来治疗由1型、2型和/或3型响应介导的疾病，例如炎症、感染、变态反应、自身免疫疾病、移植排斥、移植物抗宿主病、恶性肿瘤和涉及粘膜免疫的疾病。
METRNL在科学文献中没有个别的介绍。然而，在一种检查不同大鼠种系的数种组织的很大的基因表达数据系列(Walker et al(2004).Applicationsof a rat multiple tissue gene expression data set.Genome Res.14，742-749)中，Meteorin样蛋白(Meteorin样)在CNS中不存在，仅能在角膜、脾脏、内皮细胞和肠中检测到(GEO，GDS589/rc_AI639012_at)。在GNF SymAtlas v1.2.4中，Meteorin样蛋白在所检查的60个小鼠组织中均不能被可靠地检测到(GFN1M，gnf1m08104_at)。
已经证明，METRNL是受Pax2调节的数种基因之一，藉此在青鳉(Japanese killifish)(medaka(Oryzias latipes))的发育过程中在内耳中表达(Ramialison et al.，Genome Biol.2008Oct 1；9(10)：R145)。作者做出结论，受Pax2调节的基因是“新的听囊特异性基因，值得进一步进行功能分析”。
WO 2005/095450(NsGene)公开了NsG33，也称作Meteorin(METRN)，及其在治疗神经病症或疾病中的用途。METRN与METRNL相关，但是全长多肽仅有44％的序列同一性。METRN的表达主要被限制在中枢神经系统，已显示其在多种使用初级和次级神经元细胞类型进行的体外测定中有活性。Nishino等(EMBO Journal(2004)23，1998-2008)也公开了METRN及其在调节神经胶质细胞分化和轴突延伸方面的作用。
尽管现有技术清晰地表明METRN是神经营养因子，但是尚未有人提出METRNL具有这方面的用途。根据WO 01/039786和WO 93/22437中可用的功能数据，无法预期METRNL对神经系统具有任何影响。现有技术中可得的表达数据也没有暗示这一方向。
发明概要
本发明人发现，METRNL是一种具有生长因子特性的分泌蛋白，并且对神经系统有作用。首先，本发明人发现，METRNL在一种听力丧失的体内模型中具有功能(实施例2A)。已观察到的作用可能包括神经再生作用和/或神经保护和/或生存作用。这些作用预示着一般性的神经保护作用，更具体地说是对中枢神经系统的保护作用。特别是与涉及内耳感觉上皮和相关神经节的疾病、疾患或损害的治疗有关，包括但不限于，噪音诱发的听觉丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传性和耳蜗前庭萎缩、梅尼埃病和相关症状。
此外，本发明人发现，METRNL能够促进解离的大鼠p5背根神经节细胞培养物中的轴突伸长(实施例2)。观察到的作用可能包括致分化作用、神经再生作用、和/或神经保护和/或生存作用。这些作用预示着一般性的神经保护作用，更具体地说是对周围神经系统的保护作用，特别是与外周神经病和/或相关的疼痛的治疗有关，或者与脊髓病症例如脊髓损伤、根性撕脱(rootavulsion)、根损伤，和外周神经损伤例如臂丛损伤(brachial plexus injury)的治疗有关。
METRNL还显示对室下区(subventricular zone)的成神经细胞(神经元前体)的迁移具有刺激作用(实施例2)。这一作用被看作是一种神经迁移作用，也可能包括神经再生作用和生存作用。观察到的作用预示着在神经系统中期望促进神经元和/或神经胶质前体的生存、神经再生或招募的场合(例如与外伤、损伤、卒中和神经退行性疾病相关)的用途。
其它治疗相关的分泌性生长因子已显示在一种或多种这些功能测定中具有相似的作用，它们包括但不限于，BDNF，Neublastin(Artemin)，GDNF，NGF，Neurturin，NT4/5，NT3和SDF1a。细胞死亡，例如细胞凋亡，在成年动物神经系统中促成神经元细胞损失，导致多种神经疾病，例如缺血性卒中、神经退行性疾病或脑损伤(Becker and Bonni，Prog Neurobiol.2004Jan；72(1)：1-25)。
因此，本发明人预期使用METRNL治疗中枢神经系统疾病，特别是治疗听觉丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传和耳蜗前庭萎缩、梅尼埃病，治疗卒中、CNS损伤或外伤，治疗帕金森病和亨廷顿舞蹈症，外周神经病和相关的疼痛，以及治疗脊髓疾病，例如脊髓损伤、疼痛、外伤、根损伤、根性撕脱，外周神经损伤，例如臂丛损伤和ALS。
因此，在本发明的一个特定的实施方案中，METRNL可用于治疗神经系统疾病、疾患或损害，其中神经细胞丧失或受到伤害。
METRNL的治疗作用可以通过对靶细胞迁移、分化、生长、生存、再生和/或恢复、或提高其功能的作用的介导而实现。本发明人已经证明，METRNL在听力丧失的体外模型中发挥功能(实施例2A)。本发明人已经显示，METRNL能够刺激背根神经节(DRG)培养物的神经再生、生存和/或分化(实施例2)。本发明人还显示，当暴露于METRNL时，鼠室下区(SVZ)的外植体显示出更高的神经元前体迁移，更高的神经再生和/或更高的生存(实施例2)。后一作用可能是由于神经元的迁移改善、神经元的生存提高、和/或神经再生造成的。
根据这些生物学试验，本发明涉及一种分化神经元细胞的方法，所述方法包括将所述神经元细胞暴露于本发明的多肽或编码多核苷酸。神经元细胞可以理解为少突胶质细胞(oligodendrycyte)、星形胶质细胞、神经胶质细胞、施万细胞、神经元及其前体。本发明还涉及一种刺激神经元细胞迁移的方法，所述方法包括将所述神经元细胞暴露于本发明的多肽或编码多核苷酸。本发明还涉及一种防止哺乳动物神经元细胞凋亡的方法，所述方法包括将所述神经元细胞暴露于本发明的多肽或编码多核苷酸。本发明还涉及一种提高哺乳动物神经元细胞生存的方法，所述方法包括将所述神经元细胞暴露于本发明的多肽或编码多核苷酸。本发明还涉及一种产生神经元的方法，所述方法包括将神经元前体细胞或神经元干细胞(包括干细胞和神经干细胞)暴露于本发明的多肽或编码多核苷酸。优选地，所述哺乳动物神经元细胞和/或哺乳动物神经元前体或干细胞或神经干细胞是人细胞。
本发明另一个方面涉及一种分离的宿主细胞，其包含根据本发明的表达载体，用于在神经系统的疾病、疾患或损害的治疗方法中使用。特别地，本发明涉及可用于基于细胞的治疗(基于裸细胞的治疗或基于包被细胞的治疗)的宿主细胞，用于所述方法。
本发明另一个方面涉及一种包装细胞系，其能够产生感染性病毒颗粒，用于在神经系统的疾病、疾患或损害的治疗方法中使用，所述病毒颗粒包含逆转录病毒科(Retroviridae)来源的基因组，包含5’逆转录病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、与编码本发明多肽多核苷酸序列可操作连接的启动子、第二链DNA合成起点和3’逆转录病毒LTR。
本发明另一个方面涉及一种可植入的生物相容性细胞装置，该装置包括：
i)允许本发明蛋白质扩散的半渗透膜；和
ii)根据本发明的细胞的组合物(composition)，或根据本发明的包装细胞的组合物。
本发明另一个方面涉及：
i)本发明的多肽；或
ii)本发明的分离核酸序列；或
iii)本发明的表达载体；或
iv)本发明的宿主细胞组合物；或
v)依照本发明的包装细胞系；
vi)依照本发明的可植入生物相容性胶囊
在神经系统的疾病、疾患或损害的治疗方法中的用途。
本发明进一步的方面涉及一种治疗受试者体内神经系统疾病、疾患或损害的方法，包含向需要的受试者施加治疗有效量的：
i)本发明的多肽；或
ii)本发明的分离核酸序列；或
iii)本发明的表达载体；或
iv)本发明的宿主细胞组合物；或
v)依照本发明的包装细胞系；
vi)依照本发明的可植入生物相容性胶囊。
本发明另一个方面涉及
i)本发明的多肽；或
ii)本发明的分离核酸序列；或
iii)本发明的表达载体；或
iv)依照本发明的宿主细胞组合物；
v)依照本发明的包装细胞系
作为神经元哺乳动物细胞培养物的生长因子的用途。
本发明的一个方面涉及能够与本发明多肽结合的抗体在神经系统的疾病、疾患或损害的治疗方法中的用途。
本发明另一个方面涉及一种免疫连接物(immunoconjugate)，其包含本发明的抗体和选自下组的交联物，用于神经系统的疾病、疾患或损害的治疗方法：细胞毒剂例如化疗剂、毒素或放射性同位素；特异结合对的成员，例如亲和素或链亲和素或抗原；能够产生可检测产物的酶。
本发明另一个方面涉及METRNL的特殊截短形式。这些METRNL的截短形式包含从第一个保守半胱氨酸起到最后一个保守半胱氨酸止的生物活性核心序列。优选地，这些METRNL的截短形式在第一个保守半胱氨酸的N端包含至少一个额外的氨基酸，并且在第10个保守半胱氨酸的C端包含至少一个额外的氨基酸。优选地，这些末端氨基酸不是半胱氨酸。
本发明另一个方面涉及一种分离的多肽，包含从除Gln或Cys之外的天然存在的氨基酸中选出的N端氨基酸，所述N端氨基酸的C端与选自下的多肽连接：具有SEQ ID No 2、SEQ ID NO 4或SEQ ID No 6的AA2-AA311所示的氨基酸序列的多肽，以及所述多肽的变体(其中任意氨基酸被改变成不同的氨基酸，条件是序列中被如此改变的氨基酸残基不超过20个)。所述多肽可避免N端吡咯烷酮羧酸的存在，因此便于所得产物的N端测序。
在本发明的另一个方面中，涉及一种分离的多肽，其从下组多肽中选出：具有如SEQ ID No 2，SEQ ID NO 4或SEQ ID No 6所示的氨基酸序列，具有N端吡咯烷酮羧酸代替N端谷氨酰胺残基的多肽；和所述多肽的变体(其中除N端吡咯烷酮羧酸之外，所选序列中任意的规定氨基酸被改变成不同的氨基酸，条件是序列中被如此改变的氨基酸残基不超过20个)。
本发明人发现，N端Gln残基在重组表达时被定量地转变成吡咯烷酮羧酸。而且，本发明人分析了所述残基在物种间的保守性。被分析的所有物种在切割信号肽之后均具有完全保守的N端。由于具有N端吡咯烷酮羧酸的METRNL是生物活性的，所以相信N端吡咯烷酮羧酸的存在对于保持生物活性是重要的。
在本发明的相关方面中，涉及一种用于制造重组METRNL多肽的方法，包含在细胞中表达编码本发明METRNL多肽的核酸；纯化所述多肽；和验证纯化多肽中N端吡咯烷酮羧酸的存在。
本发明另一个方面涉及一种植入体，其中其表面的至少一部分包被有METRNL蛋白制剂，所述METRNL蛋白是本发明的多肽。优选地，该植入体选自下组：耳蜗植入体、中耳植入体、骨锚式助听器、和听觉脑干植入体，优选地耳蜗植入体和中耳植入体。
附图简述
图1.人、小鼠和大鼠Meteorin样蛋白(SEQ ID NO 2，4和6)的比对。预测的信号肽用粗体显示。比对使用CLUSTAL W(1.7)(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.and Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic AcidsResearch，22：4673-4680.)。用BLOSUM 62作为评分矩阵。
图2.人、小鼠和大鼠Meteorin样蛋白(SEQ ID NO 2，4和6)和人、小鼠和大鼠Meteorin(SEQ ID NO 23，24和25)的比对。信号肽用粗体显示。保守的Cys残基被框起。使用Clustal W(1.7)用于比对。
图3.人(NP_001004431.1；SEQ ID NO 2)、小鼠(NP_659046.1；SEQ IDNO 4)、大鼠(NP_001014126；SEQ ID NO 6)、牛(XP_614019.3；SEQ ID NO19)、鸡(CR352488；SEQ ID NO 20)、非洲爪蟾(BX757299.1；SEQ ID NO 21)和斑马鱼(NP 998150.1；SEQ ID NO 22)METRNL蛋白序列的比对。与人序列相同的保守残基用阴影显示，预测的信号肽用粗体显示，10个保守的半胱氨酸残基被框起，成熟蛋白序列的保守的N端谷氨酰胺(Q)用箭头标记。
图4.人和小鼠METRNL是分泌性分子。HEK293细胞用带组氨酸标签的人或小鼠METRNL转染，进行六个重复。48小时后，用抗-HIS Western印迹分析条件培养基(conditioned media)。两种成熟分子均具有预期的31.2kDa大小。hMETRNL符合预期地迁移，但mMETRNL由于糖基化而迁移至更高的分子量。
图5.重组mMETRNL的产生。A)293F悬浮细胞用pNS1n-mMETRNL-HIS转染，并在随后几天收集条件化培养基。抗-HISWestern印迹证明存在连续的积累，直到96小时。B)纯化后，用SDS-PAGE随后通过抗-HIS Western印迹(左)和Gelcode Blue染色(右)对重组mMETRNL进行分析。C)通过反相色谱对纯化的重组mMETRNL进行进一步的分析，表明纯度高。≥31的级分处的肩(shoulder in fractions)是异质的糖基化蛋白质的典型特征。D)纯化的重组mMETRNL如图所示地用不同的去糖基化酶处理，并通过抗-HIS Western印迹进行分析。从分子量的迁移可以显见，mMETRNL是N-糖基化的。
图6.METRNL诱导轴突从解离的背根神经节(DRG)长出(outgrowth)。左，轴突长度的定量。右，没有神经营养支持(阴性)或有NGF或METRNL支持的条件下生长的β-III-微管蛋白染色的背根神经节细胞。
图7.METRNL以剂量依赖的形式增加SVZ来源的成神经细胞的神经元迁移。在这个过程中响应METRNL的细胞被鉴定为成神经细胞，因为它们对标记物DCX具有免疫反应性。
图8.METRNL在体外刺激SVZ来源的成神经细胞迁移。A)将来自P2-P5大鼠幼仔(pubs)的SVZ外植体埋置在具有不同浓度的重组METRNL(0，20，200，2000ng/ml)的基质胶(Matrigel)中。METRNL的存在以剂量依赖的形式使细胞迁移显著增加。B)迁移细胞是成神经细胞，因为它们是Doublecortin(DCX)阳性和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)阴性。
图9.METRNL通过肌动蛋白多聚体化促进细胞迁移。SVZ外植体和单层培养物用重组METRNL或SDF1a(阳性对照)处理，随后与肌动蛋白结合性的FITC-鬼笔环肽孵育。肌动蛋白多聚体化的增加是METRNL促进成神经细胞迁移的作用的进一步证据。
图10.人重组METRNL刺激SVZ来源成神经细胞迁移。将来自P2-P5大鼠幼仔的SVZ外植体埋置在具有25ng/ml人重组METRNL的基质胶中，与对照相比，迁移增加了2倍。A)人METRNL诱发的成神经细胞迁移与对照相比的摄影示例。注意典型的成神经细胞链式迁移(chain migration)。B)成神经细胞迁移的定量。
图11.METRNL在致聋豚鼠中保护听力。A)实验设置。详细介绍见方法。B)在用METRNL处理的正常听力豚鼠(○)，用人工外淋巴液处理的致聋豚鼠(●)和用重组小鼠METRNL处理的致聋豚鼠(△)中测得的平均电听性脑干反应(eABR)阈值。竖线表示平均值(SEM)的标准误差。注意，与未处理的对照组相比，用METRNL处理显著降低eABR阈值(*p＜0.05)。
定义：
如本文中所使用的，METRNL是指具有基本上纯化的METRNL的氨基酸序列的多肽，所述基本上纯化的METRNL可获自任何物种(特别是哺乳动物包括黑猩猩、牛、绵羊、猪、鼠、马，优选人)，来自任何来源，无论是天然、合成、半合成还是重组的。该术语还指从任何上述物种获得的METRNL的生物活性片段，以及这些片段的生物活性序列变体，以及经受翻译后修饰的蛋白质。METRNL的生物活性片段可以和野生型METRNL序列在一个或多个位置不同，优选地最多20个位置，更优选地最多10个位置，更优选地最多5个位置，例如在1、2、3或4个位置不同。
本文中使用的生长因子特性定义了与经典生长因子相似的序列相关特征。经典生长因子是分泌性蛋白质，它们通过受体作用于靶细胞，导致靶细胞产生一种或多种如下响应：生长包含增殖、分化、生存、再生、迁移、功能恢复、功能提高。
如本文中使用的，“等位基因”或“等位序列”是编码METRNL的基因的可选择形式。等位基因可以是核酸序列的至少一个突变的结果，并可以导致mRNA或多肽发生改变，而mRNA或多肽的结构或功能可以改变或不改变。任何给定的天然或重组基因可以具有0、1或多个等位形式。产生等位基因的常见突变性改变(Common mutational change)一般是由于核苷酸的自然缺失、添加或替换。这些类型的改变均可单独发生或者与彼此组合发生，在一个给定序列内可以发生一次或多次。
如本文中使用的，“缺失”是指氨基酸或核苷酸序列中导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸缺无的改变。
如本文中使用的，“插入”或“添加”是指氨基酸或核苷酸序列中导致与天然存在的分子相比分别增加1个或多个氨基酸残基或核苷酸的改变。
如本文中使用的，术语“特异结合”或“特异地结合”是指蛋白或肽与结合分子(例如抗体和受体或其片段)之间的高亲和性互作。该互作取决于蛋白的被结合分子识别的特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在。例如，如果抗体对表位“A”特异，那么含有表位A(或游离的、未标记的A)的蛋白质在含有被标记“A”和抗体的反应中的存在将减少与抗体结合的被标记A的量。
如本文中使用的，术语“基本上纯化的”是指从其自然环境取出的核酸或氨基酸序列，其是分离的(isolated或separated)，并且至少60％不含(freefrom)，优选地75％，更优选地90％不含与其天然伴随的其它组分。
如本文中使用的，“替换”是指一个或多个氨基酸和核苷酸分别被其它氨基酸或核苷酸代替。
“治疗”可以通过多种不同的方式实施，包括治愈、减轻和作为预防(prophylaxis)。治愈性治疗一般旨在治愈已经存在于被治疗个体中的临床症候，例如疾病或病症。减轻性治疗一般是指旨在改善个体中已存在的临床症候的治疗，而无需治愈该疾病或病症。预防性治疗一般旨在防止临床症状的发生或恶化，即防止其发展到更严重的阶段。
“序列同一性”：
两个序列之间百分比同一性的确定可以用数学算法来实现。用于比较两个序列的数学算法的一种优选的非限制性实例是Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268的算法，Karlin and Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877对其进行了修改。这种算法被整合在Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTP程序中。
为了表征同一性，对目标序列进行比对，以获得最高的同源性(匹配)。根据这些一般的原则，两条核酸序列的“百分比同一性”可以用BLASTN算法[Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden：Blast 2sequences-a new toolforcomparing protein and nucleotide sequences；FEMS Microbiol.Lett.1999174247-250]来加以确定，该算法可以从美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI))网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得，其中使用这里建议的默认设置(即匹配奖分(Reward for a match)＝1；错配罚分(Penalty for a mismatch)＝-2；标准选项(Strand option)＝双链(bothstrands)；缺口形成(Open gap)＝5；缺口延伸(Extension gap)＝2；罚分缺口x脱出(Penalties gap x_dropoff)＝50；期望值(Expect)＝10；字长(Word size)＝11；过滤器打开(Filter on))。BLASTN算法确定两条已比对好的核苷酸序列之间的一定重叠范围内的％序列同一性。
另一种优选的用于比较序列的数学算法的非限制性实例是CLUSTALW(1.7)比对算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.and Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties andweight matrix choice.Nucleic Acids Research，22：4673-4680.)。CLUSTAL W能够用于多序列比对，优选地使用BLOSUM 62作为打分矩阵。当计算序列同一性时，CLUSTAL W包含在参考序列长度内比对所产生的任何缺口。因此，在图2中，尽管参考序列(hMETRNL)只有311个氨基酸长，但带缺口的比对序列的总长度为322。序列同一性通过用带缺口的比对序列的长度除以匹配数来算出。
详细说明
本发明涉及被鉴定为METRNL的多肽和多核苷酸的医疗用途。METRNL蛋白已经在人(SEQ ID No.2)、小鼠(SEQ ID No.4)和大鼠(SEQ IDNo.6)、以及牛(SEQ ID NO 19)、鸡(SEQ ID NO 20)、非洲爪蟾(SEQ ID NO 21)，和斑马鱼(SEQ ID NO 22)(图3)中被鉴定出来。
人METRNL以311个氨基酸的前体存在，前体可以被加工而产生至少一种生物活性肽。METRNL似乎在任何组织中均没有高水平表达。小鼠(SEQID No 4)和大鼠(SEQ ID No 6)METRNL多肽相似地分别由311个氨基酸构成。全长序列的计算结果显示它们与人类蛋白的％同一性分别为77和78。
小鼠METRNL含有45个氨基酸的N端信号肽，其在序列基序ASA-QY处被切割。该信号肽切割位点是用SignalP方法预测的，并且已经通过质谱得到了实验确认。预期在人和大鼠蛋白中也存在相同的切割位点。信号肽的切割在人、小鼠和大鼠中分别产生具有SEQ ID No.7，8和9的多肽。如本领域已知的，信号肽加工并不总是与预测完全一致，实际的切割可能在不同情况下有差异。因此，预期成熟METRNL的N端可能会与预测的切割位点相差1-2或3个氨基酸。
METRNL与WO 2005/095450(NsGene)中描述的METRN(NsG33，Meteorin)蛋白在结构上相关。全长人、小鼠和大鼠蛋白在图2中有显示。METRN与人METRNL蛋白具有42/43％的同一性(使用标准设定的ClustalW(1.7))。
图2中显示了人METRNL与METRN蛋白的全长比对结果。10个保守的半胱氨酸被框出。基于保守的半胱氨酸残基以及从图2中明显可见的高度保守的序列段(stretch)，这两个蛋白一起构成一个蛋白家族。这两个蛋白与任何其它已知的人类蛋白均不具有显著的序列相似性。尽管两个蛋白是同一小蛋白家族的成员，但是两个蛋白在结构上迥异。
由于半胱氨酸的高度保守性，预期这些残基在生物活性蛋白的二级和四级结构中发挥重要作用。这些半胱氨酸中的一个或多个可能参与分子内和/或分子间胱氨酸桥的形成。
METRNL属于发挥生长因子功能的蛋白质的范畴。这一观点得到了如下几点的支持：该蛋白是分泌性的；其结构特征(具有保守半胱氨酸模式的相对较小的蛋白)，及其对靶细胞发挥生长因子的作用。而且，METRNL与生长因子METRN在结构上相关。
与结构蛋白不同，生长因子参与细胞信号传导和多种功能，例如生长、增殖、分化、生存、再生、迁移、功能恢复、和/或功能提高。因此，可以施用生长因子，并可以使用生长因子发挥治疗作用。
能够在脊神经节细胞中诱导分化、再生和生存的因子包括CNTF，GDNF，NT-3和BDNF。这些因子还在外周和中枢神经系统中都显示相似的活性，这提示在脊根神经节(spiral root ganglion)中表达的受体和响应系统也被许多其它神经元细胞分享。
能够在背根神经节(dorsal root ganglion)外植体细胞中诱导分化、再生和生存的因子包括神经营养因子(NGF)其中之一，胰泌素/胰高血糖素/VIP家族(PACAP)中的成员，Neublastin(Artemin)，Meteorin，GDNF，NT-3和BDNF。这些因子在外周和中枢神经系统中也显示相似的活性，这表明在背根神经节中表达的受体和响应系统也被许多其它神经元细胞分享。
除了在基底前脑中的胆碱能神经元之外，NGF也是响应性交感神经元和感觉神经元(responsive sympathetic and sensory neurons)的一种重要的分化和生存因子。PACAP促进新生背根神经节(DRG)神经元的分化，因为它可增加神经标记物阳性细胞的数目和增加轴突生成(axonogenesis)，而不影响神经祖细胞的增殖(Nielsen et al.，Mol Cell Neurosci.2004Apr；25(4)：629-41)。PACAP在CNS中的神经元群体中也显示相似的活性(Vaudry et al.，Proc NatlAcad Sci U S A.2002Apr 30；99(9)：6398-403；Dicicco-Bloom et al.，Ann N YAcad Sci.1998Dec 11；865：274-89)。
细胞死亡例如凋亡性细胞死亡会促成成年动物神经系统中的神经元细胞丧失，导致神经病症例如缺血性卒中、神经退行性疾病或脑创伤(Beckerand Bonni，Prog Neurobiol.2004Jan；72(1)：1-25)。因此，能够保护神经元细胞免于凋亡性死亡的分泌性生长因子是用于治疗一般的神经系统病症，特别是神经退行性疾病的候选者。因此，分泌性因子的诱发轴突长出和/或在导致细胞死亡的条件下提高生存的能力，指示该因子对于中枢和/或外周神经系统中其他神经元细胞类型具有的相似的作用，也指示该因子是用于治疗神经系统疾病，特别是神经退行性疾病的候选者。
根据METRNL是分泌性生长因子、METRNL可促进神经迁移、神经再生和分化；而且METRNL潜在地具有提高生存、神经保护和/或神经发生的活性等事实，预期METRNL可用于治疗一般性的神经系统病症，特别是用于治疗涉及脑、脑干或脊髓和/或外周神经损伤的疾病、疾患或损害，包括但不限于如下病症，例如卒中、创伤性脑损伤、脊髓损伤、弥漫性轴突损伤、癫痫、神经病、根损伤、根性撕脱和外周神经损伤，例如背丛损伤(根据DRG测定的效果)、外周神经病及相关的疼痛(根据DRG测定中的效应)、帕金森病(根据SVZ测定中的效应)、亨廷顿病(根据SVZ测定中的效应)、ALS(根据在DRG测定中见到的生物学效应，和根据沿着中央管的SVZ中招募神经前体的能力)，和神经病疼痛和外周神经病(根据DRG测定中的生物学效应)，并用于治疗涉及内耳感觉上皮和相关神经节(ganglia)的疾病、疾患或损害，包括但不限于，噪音诱发的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传性和耳蜗前庭萎缩、梅尼埃病和相关症状。(根据实施例2A听力丧失体内模型中的效应)。有关各种适应症(indications)的功能可以在如实施例中所述的体外和体内测定中进行核实。
METRNL的治疗作用可能是藉由对靶细胞的下述过程的影响而介导的：生长包括增殖、再生、功能恢复、功能提高、生存、迁移、和/或分化。
METRNL的一种已核实的生物学功能是对内耳神经细胞的神经保护/再生/生存作用，其导致针对听力丧失的保护和潜在的治愈作用。
METRNL的一种已核实的生物学功能是对DRG培养物的分化/再生/生存诱导作用。
METRNL的另一种生物学功能是对来自室下区的神经前体的迁移/产生/生存的刺激作用。
成体神经发生(adult neurogenesis)是一种直到最近才被科学界普遍接受的概念。先前人们认为，CMS中神经元的产生仅限于胚胎阶段。在过去数十年里，已经证实成体神经再生也在发生着，并且其似乎在进化过程中是保守的。在哺乳动物中，成体神经发生大多被限制在CNS中特定和离散(discreet)的区域，例如侧室的SVZ和海马中齿状回的颗粒下层区(subgranular zone，SGZ)(Ming and Song，2005，Annu Rev Neurosci，28，223，250)。小鼠脑侧室的侧壁的SVZ已经被广泛研究，这一区域中产生的神经元通常沿着吻侧迁移流(rostral migratory stream)(RMS)向嗅球迁移，在那里它们分化成颗粒(granule)和小球周内神经元(periglomerular interneurons)(Doetsch andAlvarez-Buylla，1996，Proc Natl Acad Sci USA，93，14895-900；Lois andAlvarez-Buylla，1994，Science，264，1145-1148)。从SVZ到其最后的终点，出生后产生的神经元经历数个发育阶段，并表达特异的蛋白标志，可以利用这些标志鉴定它们。
SVZ中的成体神经发生引起人们特别的关注，是当一篇报道称在大鼠卒中模型中发生CNS损伤之后，该区域产生大量新神经元作为应答，这些新神经元向被损伤组织迁移(Arvidsson et al.，2002，Nat Med，8，963-970)，从而为解决神经退行性疾病如卒中、帕金森病或阿尔兹海默病等提供了有希望的新治疗前景。
其它已知具有治疗潜力的营养因子已被显示可增加神经细胞从室下区的迁移。这些营养因子包括SDF1a，BDNF，NT3和NT4/5和血小板来源的生长因子(PDGF)(Caldwell et al，Nature Biotechnology，2001May，19(5)：475-9.Growth factors regulate the survival and fate of cells derived from humanneurospheres)。因此，这些结果还提示，METRNL是用于治疗神经系统疾患，特别是神经元丧失或被损害并且期望招募新的神经前体细胞的疾患、损害和疾病(例如外伤和神经退行性疾病)的候选因子。
I.METRNL多肽
除了全长METRNL、基本上全长的METRNL和截短的METRNL之外，本发明还提供了这些多肽的生物活性片段和序列变体。当METRNL多肽、序列变体或片段显示天然存在的METRNL的生物活性时，它是有生物活性的。METRNL的生物活性片段与野生型METRNL序列相比可以在一个或多个位置处有不同，最多在20个位置，更优选地最多在10个位置，更优选地最多在5个位置，例如在1、2、3或4个位置不同。可以理解，本发明涉及如这里定义的基本上纯化的METRNL。
一种生物活性是在受体结合测定中与天然存在的METRNL竞争的能力。
另一种生物活性是结合抗体的能力，所述抗体针对天然存在的METRNL上存在的表位。
生物活性变体也可以通过参考实施例中所述的一种或多种生物学测定加以定义。
优选的生物学活性是在实施例2和图6中所述的DRG测定中引发基本上相同的响应的能力。在该测定中，将解离的大鼠P5DRG培养物暴露于具有C端his标签(SEQ ID NO 26)的小鼠METRNL蛋白(SEQ ID NO 8)。所谓DRG测定中基本上相同的响应，是指每个细胞的轴突(neurite)长度至少为实施例2中带C端his标签的小鼠METRNL所得数目的10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％。
图6的结果还可以作为带有轴突的细胞的百分比或数目来计算。在此情况下，DRG测定中基本上相同的响应，是指带有轴突的细胞的数目为实施例2中所得数目的至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％。METRNL片段或变体的生物学活性还可以被天然存在的METRNL更高。
另一种优选的生物学活性包括如实施例2中所示的迁移作用。在该测定中，将来自室下区(SVZ)的外植体暴露于具有C端his标签(SEQ ID NO 26)的小鼠METRNL蛋白(SEQ ID NO 8)或人METRNL蛋白(SEQ ID NO 7)，并且诱导神经细胞从外植体迁移。所谓SVZ测定中基本上相同的响应，是指平均迁移距离至少为实施例2中所得数目的10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％。METRNL片段或变体的生物学活性还可以被天然存在的的METRNL更高。
进一步优选的生物学活性包括实施例2A所述的针对听力丧失的保护作用。在该测定中，将致聋豚鼠暴露于具有C端his标签(SEQ ID NO 26)的小鼠METRNL蛋白(SEQ ID NO 8)，并且保护防止进一步的听力丧失。听力丧失测定中基本上相同的响应是指阈值最多达METRNL处理动物所得阈值的+/-50μA，例如最多达METRNL所得阈值的+/-40μA，例如最多达+/-30μA，例如最多达+/-20μA，例如最多达+/-10μA。
在一个方面中，METRNL的具体的优选截短形式选自下组：
i)具有如SEQ ID No 10所示的氨基酸序列的多肽，和具有1-5个额外的氨基酸的多肽；
ii)具有如SEQ ID No 11所示的氨基酸序列的多肽，和具有1-5个额外的氨基酸的多肽；
iii)具有如SEQ ID No 12所示的氨基酸序列的多肽，和具有1-5个额外的氨基酸的多肽；和
iv)所述多肽的变体，其中所选序列中被规定的任何氨基酸被改变成不同的氨基酸，但序列中被如此改变的氨基酸残基不超过20个。
这些截短形式的METRNL包含从第一个起到最后一个保守半胱氨酸止的核心序列。在一个优选实施方案中，被改变的氨基酸少于15个，更优选地少于10个，更优选地少于5个，例如1或2个氨基酸，更优选地没有氨基酸被改变。
变体可以在氨基酸序列方面或者不涉及序列的方面与天然存在的METRNL不同，或者两方面均可以与天然存在的METRNL不同。当天然存在的METRNL的一个或多个氨基酸被不同的天然氨基酸、氨基酸衍生物或非天然氨基酸代替时，可产生氨基酸序列变体(“序列变体”)。特别优选的变体包含如下所述的天然存在的METRNL或天然存在的METRNL的生物活性片段，其序列与野生型序列相差一个或多个保守和/或半保守氨基酸取代，其通常对蛋白质或肽的二级和三级结构以及疏水特性具有最小的影响。变体还可以具有如下的序列，其相差一个或多个非保守的氨基酸替换、替代或插入，这些非保守的氨基酸替换、替代或插入不消除METRNL的生物学活性。
图1和/或图2中的Clustal W比对可用于预测哪些氨基酸残基可以被替换而不会实质性地影响蛋白质的生物学活性。
下组中的替换(Clustal W，′强′保守组)被认为是本发明意义内的保守替换：
-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，FYW。
下组中的替换(Clustal W，′弱′保守组)被认为是本发明意义内的半保守替换：
-CSA，ATV，SAG，STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK，NEQHRK，VLIM，HFY。
本发明内的其它变体是经过修饰从而具有更高肽稳定性的变体。这些变体的肽序列内可以含有例如一个或多个非肽键(它们代替肽键)。还包括含有天然存在的L-氨基酸之外的残基的变体，所述的天然存在的L-氨基酸之外的残基例如D-氨基酸，或非天然存在的或合成氨基酸例如β或γ氨基酸和环变体。多肽中掺入D-氨基酸代替L-氨基酸可能增加其对蛋白酶的抗性。见例如美国专利5,219,990。本发明明确地包括剪接变体。
一种特别优选的突变将所有的成熟METRNL序列中出现的N端Gln残基替换为从除了Gln和Cys之外的天然存在的氨基酸中选出的另一种氨基酸(见例如图3)。优选地，该残基突变成非疏水残基。更优选地，残基突变成Asn或Ala。这些N端突变的METRNL多肽可避免N端Gln残基环化成焦谷氨酸。这种环化作用可导致多肽无法进行常规N端测序。
当无法肯定地预测给定替换的结果时，可以根据本文中公开的方法容易地对衍生物实施测定以确定生物学活性的有无。优选地，使用DRG和/或SVZ测定。
在一个实施方案中，多肽是具有从SEQ ID No.2，4和6中选出的序列的天然存在的等位变体。该多肽可以包含如下核酸序列翻译的氨基酸序列：该核酸序列与选自SEQ ID No.1，3和5中的的核酸序列相差单个核苷酸。
如这里所述的变体多肽，在一个实施方案中，包含如下的多肽，其中所选序列中规定的任何氨基酸被改变以提供保守替换。
该信号肽可以用异源信号肽代替。
在一个实施方案中，本发明范围内的变体包含如下的蛋白质和肽，它们具有与人、小鼠或大鼠METRNL(SEQ ID NO：2，4和6)具有至少60％同一性的氨基酸序列。更优选地，序列同一性为至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，本发明范围内的变体包括如下的蛋白质和肽，它们具有这样的氨基酸序列，所述序列与具有SEQ ID NO：7，8和9的序列的多肽具有至少60％的同一性。更优选地，序列同一性为至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。SEQ ID NO：7，8和9相应于信号肽切断后的成熟蛋白。优选地，N端谷氨酰胺残基已被转变成吡咯烷酮羧酸。
在一个实施方案中，本发明范围内的变体包括如下的蛋白质和肽，它们具有这样的氨基酸序列，所述序列与具有SEQ ID NO：10，11和12的序列的多肽具有至少60％同一性。更优选地，序列同一性为至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个优选实施方案中，变体METRNL的序列同一性是参考人METRNL多肽(SEQ ID No 2，7或10)确定的。
为确定同源性的目的，比较序列的最小长度一般最少8个氨基酸残基，通常至少12个氨基酸残基。为本发明的目的，百分比序列同一性优选地在至少25个氨基酸重叠的范围内计算，所述范围更优选至少30个氨基酸，更优选至少35个氨基酸，更优选至少40个氨基酸，更优选至少45个氨基酸，更优选至少50个氨基酸，更优选至少55个氨基酸，更优选至少60个氨基酸，例如至少70个氨基酸，例如至少80个氨基酸，例如至少90个氨基酸，例如至少100个氨基酸，例如至少110个氨基酸，例如至少120个氨基酸，例如至少130个氨基酸，例如至少150个氨基酸，范围由BLASTP在缺省设定下确定。
在一个实施方案中，百分比序列同一性用全局比对(GAP或Align)计算，使得变体与SEQ ID序列比对，计算相同氨基酸残基的总数，并除以SEQ IDNO的长度。
在一个实施方案中，变体METRNL包括从SEQ ID No 2，4和6中选出的序列的天然存在的等位变体。所述等位变体序列可以是如下核酸序列翻译的氨基酸序列，所述核酸序列与从SEQ ID No 1，3和5中选出的核酸序列相差单个核苷酸。
在一个实施方案中，变体包括如下的蛋白质，其包含与SEQ ID NO 7具有至少60％序列同一性，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。
在一个实施方案中，优选的变体包括如下的蛋白质，其包含与SEQ IDNO 8具有至少60％序列同一性，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。
在一个实施方案中，变体包括如下的蛋白质，其包含与SEQ ID NO 9具有至少60％序列同一性，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。
在一个实施方案中，变体包括如下的蛋白质，其包含与SEQ ID NO 2具有至少60％序列同一性，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。
在一个实施方案中，变体包括如下的蛋白质，其包含与SEQ ID NO 7具有至少60％序列同一性，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。
在一个实施方案中，优选的变体包括如下的蛋白质，其包含与SEQ IDNO 10具有至少60％序列同一性，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。
在一个实施方案中，变体METRNL在相应位点包含图1或2中标记为完全保守(*)的残基，更优选地，变体METRNL在相应位点还包含强保守的残基(：强保守组包括：STA，NEQK，NHQK，NEDQ，QHRK，MILV，MILF，HYFYW)，更优选地，变体METRNL在相应位置还包含较弱保守的残基(.较弱保守组包括：CSA，ATV，SAG，STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK，NEQHK，NEQHRK，VLIM，HFY)。特别地，预期在变体METRNL中保守的半胱氨酸(图2)必须位于保持野生型METRNL中的间隔的相应位置。
非序列修饰可以包括例如天然存在的METRNL的部分的体内或体外化学衍生化，以及乙酰化、甲基化、磷酸化、羧化、磺化、氨基酸缀合、GSH缀合、氧化、还原、水解、PEG化或糖基化。正如可能改变蛋白质的取代基一样，同样也可能用具有相似特征的基团代替与蛋白质结合的功能基团。这些修饰不会改变一级序列。这些修饰最初是保守的，即取代基团具有与原始基团近似的尺寸、形状、疏水性和电荷。
给定的多肽中的许多氨基酸，包含末端氨基酸，可以被修饰，修饰可以是通过自然过程例如糖基化和其它翻译后修饰，或者可以是通过本领域众所周知的化学修饰技术实现的。众所周知的可以在本发明多肽中存在的修饰有，仅举数例，乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素共价连接、血红素模块共价连接、或多核苷酸或多核苷酸衍生物共价连接、脂质或脂质衍生物共价连接、磷脂酰肌醇共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ-羧基化、糖化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化(prenylation)、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化(sulfation)、转运RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加例如精氨酰化，和泛素化。
这些修饰是本领域技术人员众所周知的，并且在科学文献中有非常详细地介绍。一些特别常见的修饰，例如糖基化、脂质连接(lipid attachment)、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP核糖基化，在大多数基础教科书中均有介绍，例如I.E.Creighton，Proteins-Structure and MolecularProperties，2nd Ed.，W.H.Freeman and Company，New York，1993。关于这个主题，有许多详细的综述，例如Wold，F.于Posttranslational CovalentModification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pp1-12，1983中；Seifter等，Meth.Enzymo1.182：626-646，1990，和Rattan等，Protein Synthesis：Posttranslational Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992。
此外，蛋白质可以包含蛋白标签，以便随后进行纯化并任选地用内肽酶除去该标签。该标签还可包含蛋白酶切位点，以便于随后除去该标签。亲和标签的非限制性实例包括多聚组氨酸标签、GST标签、HA标签、Flag标签、C-myc标签、HSV标签、V5标签、麦芽糖结合蛋白标签、纤维素结合域标签。对于生产和纯化而言，标签优选是多聚组氨酸标签。优选地，该标签在蛋白质的C端部分中，例如恰好在C端。
也可以替换METRNL的天然信号序列，以便在其它哺乳动物细胞类型中重组产生时增加该蛋白的分泌。
正如众所周知的并且如上文所述的那样，应当理解，多肽不总是完全直链(linear)的。例如，多肽可以由于泛素化而发生分支，而且它们可以呈具有或者没有分支的环状，这通常是翻译后事件的结果，这样的翻译后事件包括天然加工事件和非天然存在的人工操作事件。环状的、分支的或分状环形的多肽可以通过非翻译的天然过程合成以及通过完全合成的方法合成，它们全都包含在本发明的范围内。
修饰可以在多肽的任何位置发生，包含多肽骨架、氨基酸侧链、和氨基或羧基端。实际上，多肽内的氨基或羧基或者两者通过共价修饰被封闭是天然存在的多肽和合成多肽中常见的，这样的修饰也可以存在于本发明的多肽内。例如，大肠杆菌内产生的多肽的氨基端残基在蛋白水解处理之前基本上无一例外地是N-甲酰甲硫氨酸。
多肽内发生的修饰往往取决于其产生的方式。例如，对于通过在宿主内表达克隆基因而产生的多肽，修饰的性质和程度在很大程度上将由宿主细胞的翻译后修饰能力和多肽氨基酸序列中存在的修饰信号所决定。例如，在细菌宿主如大肠杆菌中往往不会发生糖基化。因此，当期望有糖基化时，多肽应当在能糖基化的宿主内表达，一般是真核细胞。昆虫细胞经常进行与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化，因此，人们已经开发了昆虫细胞表达系统用于高效表达具有天生糖基化模式等的哺乳动物蛋白质。类似的考虑适用于其它的修饰。
应当理解，在给定的多肽中，相同类型的修饰可以在多个位点以相同或不同的程度存在。另外，给定的多肽可以含有许多类型的修饰。
一般地，如本文中使用的，术语“多肽”涵盖所有这些修饰，特别是通过在宿主细胞内表达多核苷酸而合成的多肽中存在的修饰。
本发明还包括与本发明蛋白或这些蛋白的片段特异结合的作用剂。这些作用剂包括Ig融合蛋白和抗体(包括单链、双链、Fab片段和其它，无论是天然的、人源化的、灵长源化的或是嵌合的)。关于此类作用剂更多介绍见WO 95/16709，本文通过提述并入其公开的内容。
抗体是指完整的分子及其能够结合表位决定簇的片段，例如Fab，F(ab′)，和Fv等。结合METRNL多肽的抗体可以用完整多肽或含有感兴趣的小肽作为免疫抗原的片段制备。用来免疫动物的多肽或寡肽可以来自于RNA翻译或化学合成，并且如果期望，可以和载体蛋白偶联。常用的与肽化学偶联的载体包含牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)。然后用偶联的肽免疫动物(例如小鼠、大鼠或家兔)。
如本文中使用的，人源化抗体是指非抗原结合区内的氨基酸被替换从而更加接近人抗体，而仍然保留原始结合能力的抗体分子。人源化抗体可以在治疗上使用，用来在期望限制或阻断METRNL作用的场合治疗症候。
本发明的范围内还包含抗体与选自下组的偶联物(conjugate)构成的免疫偶联物：细胞毒剂如化疗剂，毒素，或放射性同位素；特异结合对成员，例如亲和素或链亲和素或抗原；能够产生可检测产物的酶。这些免疫偶联物可用于将偶联物靶定到表达METRNL受体的细胞。
针对任何METRNL的特异抗体也可用于免疫测定，定量给定抗体特异的物质。这对METRNL的特异抗体还可以结合到固体支持物上，例如珠子或皿，并用于从溶液中分离配体，或者用于纯化蛋白或者用于将其从溶液中清除。这些技术的每一项对于免疫球蛋白技术领域的技术人员而言都是常规的。
本发明的范围内还包含METRNL融合蛋白。METRNL融合蛋白可用于对表达METRNL受体的组织进行成像，或者用于上述针对METRNL的抗体的免疫组化或制备方法。包含METRNL的融合蛋白可用于特异靶定针对表达METRNL受体的细胞的医学疗法。
II.METRNL核苷酸序列
本发明提供了编码METRNL的cDNA的医疗用途，编码METRNL的cDNA包括例如人、小鼠和大鼠METRNL cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 1，3和5)，编码METRNL的核苷酸序列(SEQ ID NO 13，14和15)，和编码无信号肽的METRNL的核苷酸序列(SEQ ID NO 16，或SEQ ID No 1的核苷酸136-936；SEQ ID NO 17，或SEQ ID No.3的核苷酸136-936；和SEQ ID NO18，或SEQ ID No.5的核苷酸136-936)。
这些序列的变体也包含在本发明的范围内。
本发明涉及用于医学使用的分离核酸分子，包含编码多肽或其互补序列的核酸序列，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：
a)选自SEQ ID No.2，4，6，7，8，9，10，11和12中的氨基酸序列；
b)选自SEQ ID No.2，4，6，7，8，9，10，11和12中的氨基酸序列的序列变体，其中该变体与所述的SEQ ID No具有至少70％的序列同一性；和
c)包含a)到b)中任一个的至少50个连续氨基酸的生物活性片段。
d)c)片段的生物活性片段变体，其中该序列变体与该片段具有至少70％的序列同一性。
核酸分子可以包含天然存在的等位核酸变体的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可以编码变体多肽，其中该变体多肽具有天然存在的多肽变体的多肽序列。
在一个实施方案中，核酸分子与从SEQ ID No.1，3，5，13，14，15，16，17，和18中选出的核酸序列具有单个核苷酸的差异。
优选地，所编码的多肽与选自SEQ ID No.2，7和10中的序列具有至少60％的序列同一性，优选地至少65％的序列同一性，更优选至少70％的序列同一性，更优选至少75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选地，其中该多肽具有从所述SEQ ID No中选出的序列。所述序列构成人METRNL。
在一个优选实施方案中，所编码的多肽与选自SEQ ID No.4，8和11中的序列具有至少60％的序列同一性，优选地至少65％的序列同一性，更优选至少70％的序列同一性，更优选至少75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选地，其中该多肽具有从所述SEQ ID No中选出的序列。所述序列构成小鼠METRNL。
在一个优选实施方案中，所编码的多肽与选自SEQ ID No.6，9和12中的序列具有至少60％的序列同一性，优选地至少65％的序列同一性，更优选至少70％的序列同一性，更优选至少75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选地，其中该多肽具有从所述SEQ ID No中选出的序列。所述序列构成大鼠METRNL。
在一个优选实施方案中，所编码的多肽与选自SEQ ID No.7，8和9中的序列具有至少60％的序列同一性，优选地至少65％的序列同一性，更优选至少70％的序列同一性，更优选至少75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选地，其中该多肽具有从所述SEQ ID No中选出的序列。所述序列构成成熟的METRNL。
在一个优选的实施方案中，所编码的多肽与SEQ ID No.7具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选地其中所述多肽具有SEQ ID No.7的序列。
在一个优选的实施方案中，所编码的多肽与SEQ ID No.2具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选地其中所述多肽具有SEQ ID No.2的序列。
在一个优选的实施方案中，所编码的多肽与SEQ ID No.10具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选地其中所述多肽具有SEQ ID No.10的序列。
在一个方面中，核酸分子包含选自下组的核苷酸序列：
a)从SEQ ID No.1，3，5，13，14，15，16，17和18中选出的核苷酸序列；
b)与从SEQ ID No.1，3，5，13，14，15，16，17和18中选出的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)包含从SEQ ID No.1，3，5，13，14，15，16，17和18中选出的核苷酸序列中的至少150个连续核苷酸的核酸序列；
c)能够在高严格条件下与具有从SEQ ID No.1，3，5，13，14，15，16，17和18中选出的核苷酸序列的核酸杂交的核酸的互补物；和
d)上述任一序列的互补物的核酸序列。
SEQ ID No 7，8和9代表了编码人、小鼠和大鼠成熟METRNL多肽的序列。为了在真核表达系统中进行重组表达，它们优选地与合适的信号序列编码序列连接，以确保METRNL多肽从细胞分泌。这同样适用于由SEQ ID NO10，11和12限定的多肽的重组表达。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与从SEQ ID NO：1，3和5中选出的多核苷酸序列具有至少50％，优选地至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与从SEQ ID NO：13，14和15中选出的多核苷酸序列具有至少50％，优选地至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与从SEQ ID NO：16，17和18中选出的多核苷酸序列具有至少50％，优选地至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列具有至少50％，优选地至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与如SEQ ID NO：13所示的多核苷酸序列具有至少50％，优选地至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与如SEQ ID NO：16所示的多核苷酸序列具有至少50％，优选地至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性。
优选的一组分离多核苷酸包括SEQ ID No 1，13和16，它们是人METRNL多核苷酸。另一组优选的分离多核苷酸包括SEQ ID No.1，3和5，它们代表cDNA序列。
此外，本发明的核苷酸序列包括这些序列衍生的序列。本发明还包括含有这些序列之一或这些序列之一的衍生物的载体、脂质体和其它载体工具。本发明还包括从METRNL cDNA，优选从人METRNL cDNA转录和翻译的蛋白质，包括但不限于，人METRNL和片段及变体。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的核酸和蛋白质用于设计探针以分离其它编码具有本发明METRNL蛋白的结构或功能性质的蛋白的基因的用途。探针可以具有不同碱基对数的长度。例如，核酸探针的长度可以从大约10个碱基对到大约150个碱基对。
或者，核酸探针的长度可以大于约150个碱基对。实验方法见Ausubel等，″Current Protocols in Molecular Biology″，J.Wiley(ed.)(1999)，本文通过提述并入其全部内容。
寡核苷酸(这里也称作核酸)探针的设计优选应当遵循如下参数：
i)应当设计在模糊碱基(ambiguous base)最少(如果有的话)的序列区域内，和
ii)应当设计为计算Tm值大约80℃(假定每个A或T为2℃，每个G或C为4℃)。
寡核苷酸优选地应当被标记，以便于检测杂交。标记可以用γ-32p ATP(特异活性6000Ci/mmole)和T4多核苷酸激酶，并使用通常用于标记寡核苷酸的标记技术。也可以使用其它标记技术。未掺入的标记优选地应当通过凝胶过滤色谱或其它现成的方法加以除去。整合到探针内的放射性活性量应当通过液闪计数器测量加以定量。优选地，最终探针的比活性应当为大约4x 106dpm/pmole。含有全长克隆池的细菌培养物优选地应当被解冻，取100μL储液用于接种含有25ml含100pg/ml氨苄青霉素的无菌L-肉汤的无菌培养瓶。
培养物应当优选地在大约37℃生长至饱和，并且饱和培养物优选地应当在新鲜L-肉汤中稀释。优选地，应当取等量的稀释物涂板，以确定可以在含有100pg/ml氨苄青霉素LB的固体细菌培养基上产生大约5000个不同的分离良好的克隆所需的稀释度和体积，固体培养基含1.5％琼脂，置于150mm培养皿中，在大约37℃过夜生长。也可以采用其它用于获得不同的分离良好的克隆的已知方法。
然后，应当采用标准克隆杂交程序将克隆转移到硝酸纤维素滤膜，然后进行裂解、变性和烘焙。高度严格(这里也称作“高严格性”)条件是指至少具有如下严格性的条件，例如大约65℃、1xSSC，或大约42℃、1xSSC和50％甲酰胺。“中等严格性”条件是指至少具有如下严格性的条件，大约65℃、4xSSC，或大约42℃、4xSSC和50％甲酰胺。“低严格性”条件是指至少与大约50℃的4xSSC，或大约40℃的6xSSC和50％甲酰胺同样严格的条件。
然后，滤膜优选地在大约65℃的含有0.5％SDS、100g/ml酵母RNA、和10mM EDTA(每个150mm滤膜大约10mL)的6X SSC (20x储液为175.3g NaCl/升，88.2g柠檬酸钠/升，用NaOH调节到pH 7.0)中温和震荡孵育1小时。优选地，然后将探针以大于或等于1x 106dpm/mL的浓度添加到杂交混合物中，然后，将滤膜优选地在大约65℃温和震荡孵育过夜。然后，将滤膜优选地在500mL 2x SSC/0.5％SDS中在室温下清洗，不震荡，随后优选地在500mL 2x SSC/0.1％SDS中在室温下温和震荡15分钟。任选地，在大约65℃用0.1x SSC/0.5％SDS进行第三次清洗，30分钟-1小时。然后，优选地干燥滤膜并进行放射自显影足够时间，以便在X射线底板上显示阳性信号。也可以采用其它已知的杂交方法。然后挑选阳性克隆，在培养中生长，用标准程序分离质粒DNA。然后，可以通过限制性分析、杂交分析或DNA测序对克隆进行确认。
可选择地，用于确定核苷酸探针与同源DNA或RNA序列之间杂交的合适实验条件包括，在5x SSC[氯化钠/柠檬酸钠；参见Sambrook等；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，Cold SpringHarbor，NY 1989]中预浸泡含有待杂交DNA片段或RNA的滤膜10分钟，在含有5x SSC，5x Denhardt’s溶液[参见Sambrook等；上文已引用]，0.5％SDS和100μg/ml变性超声降解鲑鱼精子DNA[参见Sambrook等；上文已引用]的溶液中将滤膜进行预杂交，然后在大约45℃在相同溶液中杂交12小时，此相同溶液中含有10ng/ml随机引导(random-primed)的[Feinberg A P&Vogelstein B；Anal.Biochem.19831326-13]的、32P-dCTP-标记的(比活性＞1x 109cpm/μg)探针。然后用0.1x SSC，0.5％SDS在至少60℃(中等严格条件)，优选地至少65℃(中等/高严格条件)，更优选至少70℃(高严格条件)，甚至再优选地至少75℃(极高严格条件)下对滤膜清洗2次，每次30分钟。寡核苷酸探针在这些条件下杂交上的分子可以用X射线底片检测。
在另一个实施方案中，本发明涉及与METRNL的核酸杂交的核酸序列(例如DNA，RNA)。特别地，在如上所述高、中或低严格条件下与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：13，SEQ ID No.14，SEQ ID No.15，SEQ ID No 16，SEQ ID No 17或SEQ ID No 18杂交的核酸。
在另外一个实施方案中，本发明涉及METRNL核酸的互补物。特别地，涉及SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：13，SEQ IDNo.14，SEQ ID No.15，SEQ ID No 16，SEQ ID No 17或SEQ ID No 18的互补物。
在另一个实施方案中，本发明涉及METRNL DNA核酸的相应RNA(counterpart)。特别地，涉及SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQID NO：13，SEQ ID No.14，SEQ ID No.15，SEQ ID No 16，SEQ ID No 17或SEQ ID No 18的相应RNA。类似地，预期了所述SEQ ID No的相应LNA或PNA的用途。
还预期了密码子优化的核酸分子，用于提高在所选宿主细胞中的表达，宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母、中国仓鼠、幼仓鼠、昆虫和真菌。
变体核酸可以通过诱变方法加以制备。还预期了在人的编码序列与小鼠、大鼠或黑猩猩的编码序列之间进行改组(shuffling)的方法。具体地，改组的变体可以是一边为SEQ ID No 1，另一边为3和/或5。还包含SEQ ID No3和5之间的混排变体。
III.使用METRNL多肽、多核苷酸和METRNL分泌细胞治疗神经系统疾病
在一个实施方案中，提供了天然、变体METRNL及其片段和/或含有METRNL的融合蛋白，用于治疗哺乳动物神经系统的疾病。METRNL可以用于在神经细胞损失或损伤的疾病状态下刺激神经细胞生长包括增殖、神经功能、神经再生、神经分化、神经迁移、和/或神经存活。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸和/或多肽可用于治疗其中期望神经生长包括增殖、分化、功能、迁移、生存和/或再生的病症或疾病。本发明的多肽可以直接使用，通过例如注射、植入或口服药物组合物，用于治疗可响应METRNL多肽的病理过程。
这得到了如下事实的支持：分泌性生长因子METRNL能够保护豚鼠免于神经毒素诱发的听力丧失(实施例2A)；分泌性生长因子METRNL能够诱导大鼠P5背根神经节中轴突的长出(轴突延伸)并促进生存(实施例2)；以及METRNL促进成神经细胞从室下区外植体迁出(实施例2)。由于METRNL的生存、再生、神经发生、分化、特别是促神经迁移作用，它是用于治疗涉及神经细胞损失或损伤的神经系统疾患的候选蛋白/基因。这些疾患包括卒中、外伤和神经退行性疾病，以及涉及内耳感觉上皮和相关神经节的疾病、疾患或损害，噪音诱发的听力丧失，耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传和耳蜗前庭萎缩、和梅尼埃病。METRNL的神经保护和/或神经再生和/或神经迁移作用支持其用于治疗由于神经元损失、功能失调或退行(degeneration)造成的疾患或其进程。
METRNL可以作用于神经系统中存在的多种不同的细胞类型。在本发明的内容中，神经系统意图包含中枢神经系统、外周神经系统、眼睛和内耳。
在一个实施方案中，METRNL多肽可以作用于神经元，包括但不限于，运动神经元和感觉神经元。
在另一个实施方案中，METRNL多肽的治疗效果可以通过作用于施万细胞和神经胶质细胞，例如少突胶质细胞和/或星形胶质细胞而实现。通过它们对施万细胞和神经胶质细胞的作用，METRNL多肽可以参与髓鞘形成，以及神经元功能和生存的维持。
在另一个实施方案中，METRNL多肽可以作用于感觉细胞，包括但不限于，视网膜神经节细胞、光受体细胞、支持组织例如视网膜上皮细胞，和脊髓神经节细胞，和耳的听毛细胞。
在进一步的实施方案中，METRNL多肽可以作用于干细胞及其神经后代(neural progeny)，包括但不限于，神经和神经元前体和神经胶质前体。METRNL多肽可以作用于干细胞和/或神经元或神经胶质前体，导致生长包括增殖，导致分化和/或迁移。干细胞疗法(包括神经后代疗法)可以通过体内或回体基因治疗实现，或者可以把蛋白施用到具有内源或移植干细胞的位置，或者体外施用给从患者分离的干细胞。
疾患或疾病或损伤可以是由外伤、手术、缺血、感染、代谢疾病、营养缺乏、恶性肿瘤或毒剂造成的、以及由遗传或特发性过程造成的神经系统损伤。
在本发明方法的一个实施方案中，疾病或疾患或损伤包括脑、脑干、脊髓、和/或外周神经损伤，导致例如卒中、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤(SCI)、弥漫性轴突损伤(DAI)、癫痫、神经病、外周神经病及相关的疼痛等症候，以及其它可能由这些综合征导致的症状。
在另一个实施方案中，疾病、疾患或损害涉及大脑、脑干、脊髓和/或外周神经的神经元及其突起(processes)的退行，例如神经退行性疾患，包括但不限于，帕金森病、阿尔兹海默病、老年痴呆、亨廷顿病、肌萎缩性侧束硬化(ALS)、与多发性硬化相关的神经元/轴突损伤，和相关症状。
在另一个实施方案中，疾病、疾患或损害涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经的功能失调和/或丧失，例如由代谢病、营养缺乏、毒素伤害、恶性肿瘤、和/或遗传性或特发性症候导致的功能失调和/或丧失，上述疾患包括但不限于，糖尿病、肾功能失调、酒精中毒、化疗、化学剂、药物滥用、维生素缺乏、感染，和相关疾患。
在另一个实施方案中，疾病、疾患或损害涉及脑、脑干、脊髓和外周神经系统中的神经胶质细胞，例如少突胶质细胞、星形胶质细胞和施万细胞的退化或硬化，包括但不限于，多发性硬化(MS)、视神经炎、脑硬化、感染后脑脊髓炎、和癫痫及相关症状。
在另一个实施方案中，疾病、疾患或损害涉及视网膜、光受体和相关神经，包括但不限于，色素性视网膜炎、黄斑变性、青光眼和相关症状。
在另一个实施方案中，疾病、疾患或损害涉及内耳感觉上皮和相关神经节，包括但不限于，噪音诱发的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、遗传性和耳蜗前庭萎缩、梅尼埃病和相关症状。本发明人在实施例2A中已经证明了对致聋豚鼠的体内作用。对内耳感觉上皮和相关神经节的损伤可以使对内耳进行的外科手术导致的，这样的手术例如植入体的植入、镫骨足板切除术、乳突切除术和中耳整复术。植入体可以是耳蜗植入体、中耳植入体、骨锚式助听器、和听觉脑干植入体。因此，本发明人构想了将METRNL与内耳手术联合施用。本发明人进一步构想了用METRNL蛋白制剂包被(coating)耳植入体，例如耳蜗植入体、中耳植入体、骨锚式助听器、和听觉脑干植入体，以保护避免神经元损伤和促进手术后恢复。一个进一步的用于核实METRNL对脊髓神经节细胞效果的相关模型是Warnecke等，“The biological effects ofcell-delivered brain-derived neurotrophic factor on cultured spiral ganglion cells”.Neuroreport.2007Oct 29；18(16)：1683-6。
在一个优选实施方案中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和药物组合物用于治疗帕金森病。这个功能是基于如下的事实，即METRNL导致SVZ外植体内神经细胞的神经发生和/或迁移。该功能可以用多巴胺能神经营养活性生物测定(实施例6)和在体内通过纹状体内6-OHDA损伤模型(实施例7)加以核实。
亨廷顿舞蹈症(HD)是一种常染色体显性疾患，其导致脑内多种神经元群体，特别是位于尾状核内的GABA-能中型多棘神经元，发生渐进性退化。伴随着这一退化，皮层谷氨酸能输入神经元(glutaminergic input neurons)也退化，这种联合退化是造成大多数渐进性运动障碍性运动(dyskinetic motormovement)以及痴呆等特征症状的原因。
在一个优选实施方案中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和药物组合物用于治疗亨廷顿舞蹈症。这一功能基于METRNL导致SVZ外植体内神经细胞的神经发生和/或迁移的事实。亨廷顿舞蹈症是一种兴奋毒性疾病(excitotoxic disease)。一种兴奋毒性体外生物测定是本发明实施例3中介绍的测定。另一种用于确认METRNL的这种神经保护作用的生物测定实例包括例如保护原代海马切片培养物免于NMDA兴奋毒性作用的生物测定(WO03/004527，实施例5)。优选的用于确认该功能的动物模型在Anderson等，1996..Proc Natl Acad Sci U S A.；93(14)：7346-7351或Pereira de Almeidab等，2001Neurobiology of Disease.Volume 8，Issue 3，433-446中有描述。
在另一个优选实施方案中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和药物组合物用于治疗外周神经病。这是基于对大鼠P5DRG的神经营养/分化/再生作用(实施例2)的发现。预期用本发明分子治疗的外周神经病包括外伤诱发的神经疾病，例如由物理损伤或疾病状态导致的神经病、对外周神经的物理损伤例如椎间盘脱出、和对脑的物理损伤、对脊髓的物理损伤、伴随脑损伤的卒中，和与神经退化相关的神经疾患。我们还构想了对化疗诱发的神经病(例如由化疗剂如紫杉醇或顺铂的递送导致的神经病)；毒素诱发的神经疾病、药物诱发的神经病、维生素缺乏诱发的神经病、特发性神经病；感染性神经病例如疱疹后神经痛、和糖尿病性神经病的治疗。效果可以在Gardell等，2003Nat Med.；9(11)：1383-9介绍的动物模型中进行确认。
在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和组合物用于治疗伴随神经根和外周神经相关疾病、损伤或外伤的疾患、疾病或损伤，例如根性撕脱、根损伤，和臂丛损伤。这是基于对大鼠P5DRG培养物的神经营养/分化/再生作用的发现(实施例2)。对根性撕脱或根损伤的作用可以用Wang等，2008Nat Neurosci.11(4)：488-96介绍的动物模型进行确认。Hanna-Mitchell等，2008.The impact of neurotrophin-3on the dorsal roottransitional zone following injury.Spinal Cord.2008年6月10日印刷前电子发表，介绍了另一种动物模型。
在另一个实施方案中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和组合物用于治疗与小脑相关的疾患、疾病或损伤，包括但不限于，感觉性共济失调、多发性硬化、神经退行性脊髓小脑病、遗传性共济失调、小脑萎缩(例如橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)、Shy-Drager综合征(多系统萎缩))和酒精中毒。这一功能得到METRNL的一般性神经营养作用的支持(实施例2)。该功能的确认可以用实施例3和4(保护小脑颗粒细胞免于谷氨酸毒性和钾剥夺)中介绍的测定进行。
在另一个优选实施方案中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和药物组合物用于治疗肌萎缩侧索硬化、脊髓性肌萎缩、和脊髓损伤(例如缺血性或外伤性)。这是基于METRNL的神经迁移/神经营养/神经保护/神经再生活性(实施例的DRG和SVZ测定)。这一特殊治疗功能可以用实施例5中说明的运动神经元测定加以核实。
在一个优选实施方案中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和组合物用于治疗涉及视网膜的疾病、疾患或损害，包括但不限于，色素性视网膜炎、黄斑变性和青光眼。
其它生长因子在中枢和外周神经系统中和在各种与视网膜和/或角膜细胞损失有关的眼疾中具有重要的治疗应用。例如，NGF是阿尔茨海默病、角膜溃疡(US 6,063,757和EP 0973872)和视网膜病的候选物。Neublastin(Artemin)是外周神经病(WO 02/078730)和角膜伤口愈合(EP 1223966)的候选物。GDNF是帕金森氏病、ALS、脊髓损伤和伤口特别是角膜伤口愈合(EP1223966)的候选物。
这些应用可以通过使用各种体外测定技术(视网膜外植体测定、角膜培养)获得确认。也可以在现有技术的角膜伤口(家兔角膜损伤)及视网膜动物模型(小鼠和大鼠可得的色素性视网膜炎突变模型)中进行功能核实。
在另一个实施方案中，神经退行性疾病是选自下组的兴奋毒性疾病：缺血、癫痫(特别是海马中的局限型癫痫)，和由于损伤(injury)、心脏停搏或卒中导致的外伤(trauma)。这一功能也得到了METRNL的神经营养/神经迁移/神经保护/神经再生活性的支持(实施例2)。上述海马切片培养测定和本发明实施例3的测定是非限制性的测定实例，其可用于证明生物学效果，提示治疗兴奋毒性疾病的治疗用途。
这里所用的术语“受试者”是指可以对其施用METRNL多肽或多核苷酸、治疗细胞或生物相容性胶囊的任何哺乳动物。具体预期用本发明方法治疗的受试者包括人，以及非人灵长动物，绵羊、马、牛、山羊、猪、狗、猫、家兔、豚鼠、仓鼠、沙鼠(gerbil)、大鼠和小鼠，以及来自或源自于这些宿主的器官、肿瘤和细胞。
IV.多肽施用和制剂
用于METRNL治疗的靶组织，是以保留对METRNL响应性为由而选择的脑区域。在人类中，保留对生长因子响应性直至成年的神经元包括基底前脑胆碱能神经元(cholinergic basal forebrain neuron)、内嗅皮质神经元(entorhinal cortical neuron)、视丘神经元(thalamic neuron)、蓝斑神经元(locuscoeruleus neurons)、脊髓感觉神经元(spinal sensory neurons)、脊髓运动神经元、黑质神经元、交感神经元、背根神经节、视网膜神经元、耳神经元、小脑神经元、和睫状神经支(ciliary ganglia)。干细胞，例如室下区的干细胞，和神经和神经胶质祖细胞也保持对生长因子的响应性直至成年。此外，髓鞘化少突胶质细胞(myelinating oligodendrocyte)也保持对生长因子的响应性直至成年。
METRNL多肽可以用任何医学可接受的方式施用。这可以包括注射，通过肠胃外途径，例如静脉内、血管内、动脉内、皮下、肌肉内、肿瘤内、腹膜内、心室内、硬膜内(intraepidural)、气管内、鞘内、脑室内、脑内、肺内、或其它途径以及鼻、眼、直肠或表面。持续释放施用也明确地包括在本发明之内，通过如下方式例如积存注射(depot injection)或易蚀性植入体。如果蛋白质被保护不受胃内降解，则也可以使用经口施用。
根据本发明的METRNL的施用可以用合适的传送装置实现，包括：
泵(见例如Annals of Pharmacotherapy，27：912(1993)；Cancer，41：1270(1993)；Cancer Research，44：1698(1984)，本文通过提述并入其内容)，
微封装(microencapsulation)(见例如美国专利4,352,883；4,353,888；和5,084,350，本文通过提述并入其内容)，
连续释放聚合物植入体(见例如Sabel，美国专利4,883,666，本文通过提述并入其内容)，
封装的表达METRNL的细胞(见第IX节)，
向CNS表达METRNL的裸露或为封装细胞抑制物(见例如美国专利5,082,670和5,618,531，本文通过提述并入其内容)；
注射，方式为皮下、静脉内、动脉内、肌肉内或向其他合适的部位；
栓剂；
吸入；和
口服，以胶囊、液体、药片、药丸或缓释形式。
施用可以通过定期注射制备剂的大丸剂(a bolus ofthe preparation)，或者可以从贮池通过静脉内或腹膜内更加连续地给药，所述贮池可以是体外的(例如IV袋)或体外的(例如生物可降解的植入体、生物人工器官、METRNL产生细胞的生物相容性胶囊、或者已植入METRNL产生细胞的集落)。见例如美国专利4,407,957，5,798,113和5,800,828，本文分别通过引用并入其内容。肺内递送方法和装置在例如美国专利5,654,007，5,780,014和5,814,607中有介绍，本文分别通过引用并入其内容。
除了系统递送之外，也构想了向CNS或眼的血-脑或血-视网膜屏障后直接递送。
局部递送可以通过如下方式，例如通过导管向一条或多条动脉递送，例如经眼动脉向眼递送，经脑动脉向CNS递送。向眼的局部递送可以使用表面应用于角膜的方式，或者直接玻璃体内注射蛋白质或病毒载体。US6,042,579(Medtronic)描述了局部基于泵(pump-based)将蛋白制剂向CNS递送的方法。本申请的体内实验(实施例2A)是局部蛋白递送的一个实例，在该实例中是向内耳递送。另一种类型的局部递送包括使用封装细胞递送(见第IX部分)。另一局部化递送类型包括基因治疗载体的局部递送，通常是通过注射。
为了治疗眼疾患，递送可以是系统的，或者是局部的，例如通过眼动脉递送。在另一个实施方案中，递送是通过封装细胞疗法(Encapsulated CellTherapy)，其中将包装细胞植入玻璃体内。蛋白制剂或基因治疗载体的递送可以通过视网膜下注射、玻璃体内注射或经巩膜注射来实现。
为了治疗帕金森病，可以采用多种递送途径。可以用泵将蛋白制剂施用到脑室内(intracerbroventricularly)或实质内(intraparenchymally)，优选地施用到纹状体和/或黑质，更优选地施用到核内(intraputamen)。然而，一种更优选的递送方法包括封装细胞治疗，其中胶囊被植入脑室内或实质内，优选植入到纹状体内、和/或黑质内，更优选地植入到核内。在一个涉及治疗帕金森病的实施方案中，基因治疗载体被施用到脑的纹状体。向纹状体内的注射可以标记位于脑不同区域(例如苍白球、杏仁核、底丘脑核或黑质)内的靶位点。苍白球内的细胞转导通常导致丘脑内细胞的逆行标记(retrograde labelling)。在优选的实施方案中，靶位点(或其中之一)是黑质。
在一个治疗HD的实施方案中，METRNL被施用到纹状体，优选地施用到尾状核，以保护神经元免于退化，结果使得尾状核神经元和皮层输入神经元都得到保护。在一个优选实施方案中，该施用应当在发生大的退化改变之前发生。治疗应当涉及通过家族史和血液DNA分析对疾病进行遗传诊断，随后进行METRNL施用。这可以通过用医学上可接受的输注泵和导管，例如Medtronic Synchrotron泵，泵汲蛋白质，将METRNL递送到纹状体而实现。根据第二种策略，可使用病毒或非病毒载体进行直接基因治疗来修饰纹状体内的宿主细胞或其它被影响的神经元，以分泌METRNL。根据第三种策略，可利用经过遗传修饰从而制造并分泌METRNL的裸露或封装细胞将METRNL局部施用到血脑屏障之后和患病区域内，优选纹状体，更优选尾状核。
为了治疗根性撕脱、根损伤或外周神经损伤包括臂丛损伤，可以将METRNL系统地、鞘内、直接施用到背根进入区(dorsal root entry zone)，或者局部地置于受影响的生皮节(dermatome)内。
在ALS中，上下运动神经元均退化，导致进行性瘫痪，最终导致死亡(最常见的是由于呼吸系统并发症)。还构想了用编码METRNL的病毒载体，例如AAV，将METRNL施用到运动皮层中投射(project)到皮质脊髓束(corticalspinal tract)、脊髓小脑束(spinocerebellar tract)或脑红核小脑束(rubralcerebellar tract)的细胞内。为了治疗ALS，将METRNL灌注到腰鞘内空间内，藉此与浸浴脊髓和脑的脑脊液(CSF)混合，从而将METRNL递送到CNS(包括脊髓)中。递送可以通过植入泵和导管，例如Medtronic Synchrotron泵，或者通过使用植入到腰鞘内空间内的封装细胞装置实现。还可以使用直接基因治疗，方法是将携带DNA的载体注射到CSF内，借此将基因转移到CSF空间内衬的细胞中。此外，可以将基因转移载体注射到颈椎或腰椎脊髓或大脑内，借此在含有大部分涉及运动瘫痪和呼吸功能的运动神经元的解剖学区域内分泌METRNL。这些注射可以在手术导航下进行，并可以相对安全地进行。
在患有神经退行性疾病(例如AD)的患者中，在具有神经生长因子(NGF)受体的Ch4区(迈内特基底核)中的神经元与正常对照相比经历显著的萎缩(见例如Kobayashi，et al.，Mol.Chem.Neuropathol.，15：193-206(1991))。
在正常受试者中，神经营养蛋白防止发育期间交感神经和感觉神经元死亡，并防止成年大鼠和灵长动物体内胆碱能神经元退化(Tuszynski，et al.，Gene Therapy，3：305314(1996))。由此造成的基底前脑的这一区域内的功能神经元的丧失被认为与罹患神经退行性疾病例如AD的患者所经历的认知退化具有因果联系(Tuszynski，et al.，supra；Lehericy，et al.，J.Comp.Neurol.，330：15-31(1993))。
一般地，预期可以通过脑室内或实质内递送METRNL蛋白制剂来治疗AD。在实质区域内，优选地递送到基底前脑和海马。
也可以将基因治疗载体、分泌METRNL的封装或裸露细胞施用到基底前脑或海马。
为了治疗涉及前庭听觉(vestibuloacoustic)复合体感觉上皮和相关神经节的疾患、疾病或损伤，包括但不限于，噪音诱发的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传和耳蜗前庭萎缩、梅尼埃病，构想了将蛋白、基因治疗载体或分泌METRNL的封装或裸露细胞递送到内耳。这方面的一个实例在实施例中有说明(实施例2A)。
为了治疗脊髓损伤，可以将蛋白、基因治疗载体或分泌METRNL的封装或裸露细胞鞘内递送到受损伤的位置，如上文关于ALS治疗所述。
为了治疗外周神经病，进行系统性递送(使用蛋白制剂)，或者用蛋白制剂、基因治疗载体或分泌METRNL的封装或裸露细胞进行鞘内递送，或者依赖于向脊髓的逆向运输进行肌肉内递送。
为了治疗癫痫，可以将METRNL蛋白实质内地递送到癫痫病灶。这可以用封装或裸露细胞、用导管或泵施用的蛋白制剂、或者用递送到该位点的基因治疗载体实现。
为了治疗卒中或外伤，递送是鞘内、脑室内，或者优选地病灶内。
术语“药物可接受的载体”是指与METRNL多肽组合以便于其施用的一种或多种有机或无机、天然的或合成的成分。合适的载体包括无菌盐水，但本领域普通技术人员知道有其它的药物可接受的水性和非水性等张无菌溶液和无菌悬浮液。“有效量”是指能够减轻疾病、退化或损伤症状或延迟其发展的量。有效量可以以个体为基础加以确定，并且部分地基于对要治疗的疾患和所追求的结果的考虑。有效量可以由本领域的普通技术人员采用这些因素和使用不超过常规的实验加以确定。
脂质体系统可以是任何单层(unilamellar)囊泡、多层(multilamellar)囊泡、或稳定的复层(plurilamellar)囊泡，可以根据本领域技术人员众所周知的方法加以制备和施用，例如根据美国专利5,169,637、4,762,915、5,000,958或5,185,154的教导。此外，可以将本发明的新型多肽以及其它分泌性多肽表达为脂蛋白，以提高其与脂质体的结合。通过例如免疫亲和色谱或任何其它便宜的方法从CHO细胞纯化重组METRNL蛋白，然后与脂质体混合，并以高效率掺入到脂质体内。可以在体外对脂质体封装的蛋白进行测试，检测其促进细胞生长的任何作用。
本发明的任何METRNL多肽可以药物可接受的盐的形式来使用。能够与METRNL多肽形成盐的合适的酸和碱是本领域技术人员众所周知的，包括无机和有机酸和碱。
除了活性成分之外，药物组合物还可以包含合适的成分。关于配制和施用技术的进一步的细节可以在最新版本的Remington’s PharmaceuticalSciences(Maack Publishing Co.，Easton，PA)中找到。
构想了用于系统施用的各种给药方案。在一个实施方案中，向受试者施用含有METRNL多肽的制剂的方法包括每剂以1μg/kg-30,000μg/kg受试者体重的剂量施用METRNL。在另一个实施方案中，剂量为每剂10μg/kg-30,000μg/kg受试者体重。在进一步的实施方案中，剂量是每剂10μg/kg-10,000μg/kg受试者体重。在不同的实施方案中，剂量是每剂25μg/kg-10,000μg/kg受试者体重。在另一个实施方案中，剂量是每剂25μg/kg-3,000μg/kg受试者体重。在最优选的实施方案中，剂量是每剂50μg/kg-3,000μg/kg受试者体重。
文献中提供了关于具体的剂量和递送方法的指导；见例如美国专利4,657,760；5,206,344；或5,225,212。可以预期，不同的制剂对不同的治疗化合物和不同的疾患有效，并且例如靶向一种器官或组织的施用可能与靶向另一种器官或组织的施用在所需的递送方式上不同。
如果期望METRNL多肽的缓释给药，该METRNL多肽的制剂的释放特性适合于治疗任何需要施用METRNL多肽的疾病和疾患，则考虑METRNL多肽的微胶囊。用于缓释的重组蛋白微封装已经被成功地应用于人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白介素-2、和MN rgp120。Johnson et al.，Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，27：1221-1223(1993)；Hora et al.，Bio/Technology，8：755-758(1990)；Cleland，″Design and Production of SingleImmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems，″in Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach，Powell and Newman，eds，(Plenum Press：New York，1995)，pp.439-462；WO 97/03692，WO96/40072，WO 96/07399；和美国专利No.5,654,010。
这些蛋白的缓释制剂是使用乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)开发的，因为其具有良好的生物相容性和广泛的生物可降解性质。PLGA的降解产物乳酸和乙醇酸可以在人体内被快速清除。而且，这些聚合物的可降解性可以被调节，从数月到数年，取决于其分子量和组成。Lewis，″Controlled release ofbioactiveagents from lactide/glycolide polymer，″in：M.Chasin and R.Langer(Eds.)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker：New York，1990)，pp.1-41。
所施用的剂量必须根据所治疗个体的年龄、体重和状况、以及施用途径、剂量形式和给药方案、和期望的结果仔细地加以调节，精确的剂量应当由从业者确定。
V.用于基因治疗的药物制备物
为了形成用于本发明基因治疗使用的METRNL组合物，可以将METRNL编码表达病毒载体置于药物可接受的悬浮液、溶液或乳液中。合适的介质包括盐水和脂质体制备物。
更具体地，药物可接受的载体可以包括非水溶液的灭菌水、悬液和乳液。非水溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液和不挥发性油。
静脉内溶媒包括液体和营养补充液、电解液补充液(例如基于林格氏右旋糖的补充液)等。
也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如杀微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体等。进一步，METRNL转基因组合物可以用本领域众所周知的方法冻干，用于随后的重建和根据本发明的使用。
也可以使用胶体分散系统进行靶向基因递送。胶体分散系统包括大分子复合体、纳米胶囊、微球、珠子、和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。脂质体是人工膜囊泡，其可以在体外和体内用作递送工具。已经显示，尺寸范围在0.2-4.0μm的大单室囊泡(LUV)能够封装相当大百分比的含有大分子的水成缓冲液。RNA、DNA和完整病毒粒子可以被封装在水性的内部(aqueous interior)，并以生物活性的形式递送到细胞(Fraley，et al.，Trends Biochem.Sci.，6：77，1981)。除了哺乳动物细胞之外，脂质体已经被用于在植物、酵母和细菌细胞内递送操作编码的转基因。为了使脂质体成为高效的基因转移工具，应当具备如下的特征：(1)高效地封装编码METRNL的基因同时无损于其生物学活性；(2)与非靶细胞相比，优先并且牢固地(substantial)与靶细胞结合；(3)高效地将囊泡内的水性内容物递送到靶细胞细胞质；和(4)精确地并且有效地表达遗传信息(Mannino，et al.，Biotechniques，6：682，1988)。
脂质体的组成通常是磷脂(特别是高相变温度磷脂)的组合，且通常与类固醇，特别是胆固醇组合。也可以使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
可用于产生脂质体的脂质实例包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、脑苷脂和神经节苷脂。特别有用的是二酰基磷脂酰甘油，其中脂模块含有14-18个碳原子，特别是16-18个碳原子，并且是饱和的。示例性磷脂包括鸡蛋卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰卵磷脂(distearoylphosphatidylcholine)。
脂质体的靶定性(targeting)可以根据解剖学因素和机理因素加以分类。解剖学分类是基于选择性的水平，例如器官特异性、细胞特异性或细胞器特异性。机理上的靶定性可以根据其是被动还是主动来加以区分。被动靶定是利用脂质体的一种自然倾向，即它们倾向于分布到含有窦状隙毛细管的器官的网状内皮组织系统细胞。
另一方面，主动靶定涉及通过将脂质体偶联于特异的配体，例如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白，或者通过改变脂质体的组成或尺寸，来改变脂质体，以实现靶定到天然存在的部位之外的器官和细胞类型。
靶定的细胞递送系统的表面可以通过多种方式进行修饰。在脂质体靶定递送系统中，脂基团可以掺入脂质体的脂双层内，以便保持靶定配体与脂质体双层稳定缔合。多种连接基团可用于将脂链与靶定配体连接。
递送系统的另一实例包括将能够产生如本发明所述的载体颗粒的封装细胞的组合物移植到治疗区域内。这些细胞的封装和移植方法是本领域已知的，特别参见WO 97/44065(细胞疗法)。通过选择能够产生慢病毒颗粒的包装细胞系，实现对治疗区域内非分裂中的细胞的转导。通过使用仅能够转导分裂中细胞的逆转录病毒颗粒，将转导局限于治疗区域中从头(de novo)分化的细胞。
VI.基因治疗的给药要求和递送规程
一个重要的参数是待递送到靶组织内的METRNL基因治疗载体的剂量。对于病毒载体，浓度可以用转导单位/ml的数目来定义。任选地，对于使用病毒表达载体的递送，每单位剂量包括2.5-25μL组合物，其中该组合物包括置于药物可接受的液体内的病毒表达载体，并且每毫升提供从108到1010个METRNL转染单位。
重要地，选择特定的体内基因递送位点，以便聚集在神经细胞、神经胶质细胞、视网膜细胞、感觉细胞或干细胞损失、损伤或功能失调的区域。这些区域可以用多种已知的技术在临床上鉴定，包括磁共振成像(MRI)和活组织检查。在人体内，优选的是非侵入性的体内成像方法，例如MRI。一旦鉴定了神经元损失的区域，即可选择用于立体定向分配的递送位点，从而每个单位剂量的METRNL递送到脑内的靶定细胞处或者在其500μm的范围内，且与另一个递送位点不超过大约10mm。
在给定的靶位点，载体系统可以转导靶细胞。靶细胞可以是在神经组织中发现的细胞，例如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、干细胞、神经前体细胞或室管膜细胞。
载体系统优选地通过直接注射施用。用于注射到脑内的方法是本领域众所周知的(Bilang-Bleuel et al(1997)Proc.Acad.Nati.Sci.USA 94：8818-8823；Choi-Lundberg et al(1998)Exp.Neurol.154：261-275；Choi-Lundberg et al(1997)Science 275：838-841；和Mandel et al(1997))Proc.Acad.Natl.Sci.USA94：14083-14088)。可以进行立体定向注射。
如上所述，为了在组织例如脑内进行转导，必须使用非常小的体积，所以将病毒制备物通过超离心加以浓集。所得的制备物应为至少108TU/ml，优选地108-1010TU/ml，更优选至少109TU./ml.(滴度用每毫升的转导单位数(T U./ml)表示)。已经发现，增加注射位点的数目和降低注射的速度可以提高转基因表达的分散(Horellou and Mallet(1997)，如上)。通常使用1-10个注射位点，更通常地2-6个。对于包括1-5×109TU./ml的剂量，注射速度经常是0.1-10μl/min，通常大约1μl/min。
病毒组合物可以通过如下方式递送到靶组织内的每个递送细胞位点，包括微注射、输注、划痕标记(scrape loading)、电穿孔或其它适合于经手术切口将组合物直接递送到递送位点组织的方法。该递送缓慢实施，例如经5-10分钟时间完成(取决于待递送的病毒组合物的总体积)。
VII.病毒载体
广义上说，基因治疗寻求将新的遗传材料转移到患者的细胞内，对患者产生治疗益处。这些益处包括治疗或预防广泛的疾病、疾患和其它状况。
回体(ex vivo)基因治疗方法涉及对分离的细胞(包括但不限于干细胞、神经和神经胶质前体细胞、和胚胎干细胞)进行修饰，随后将它们输注、嫁接或者以其他方式移植到患者体内。见例如美国专利Nos.4,868,116，5,399,346和5,460,959。体内基因治疗寻求直接靶定患者组织。
可用作基因转移载体的病毒包括乳多空病毒(papovavirus)、腺病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和逆转录病毒。合适的逆转录病毒包括HIV，SIV，FIV，EIAV，MoMLV。另一组合适的逆转录病毒包括HIV，SIV，FIV，EAIV，CIV。另一组优选的病毒载体包括α病毒、腺病毒、腺伴随病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头瘤病毒、Mo-MLV，优选腺伴随病毒。
用于治疗神经系统疾患的优选病毒是慢病毒和腺伴随病毒。这两类病毒均可以无需细胞分裂而整合到基因组中，并且这两类病毒均已经在神经系统疾患特别是中枢神经系统疾患的临床前动物研究中进行过测试。
用于制备AAV的方法在本领域已有介绍，例如US 5,677,158。US6,309,634和US 6,683,058介绍了将AAV递送到中枢神经系统的实例。
优选地，慢病毒载体是复制缺陷型慢病毒颗粒。这种慢病毒颗粒能够从包含下述元件的慢病毒载体产生：5’慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、与编码所述融合蛋白的多核苷酸信号可操作连接的启动子、第二链DNA合成起点和3’慢病毒LTR。用于制备慢病毒和体内施用慢病毒到神经细胞的方法在US 20020037281(用慢病毒转导神经细胞的方法)中有介绍。
逆转录病毒载体是人临床试验中最普遍使用的载体，因为它们携带7-8kb，并且因为它们具有感染细胞的能力，并且其遗传材料可高效地稳定整合到宿主细胞内。见例如WO 95/30761；WO 95/24929。致肿瘤病毒亚科(Oncovirinae)将外源核酸序列转移并整合到患者体内需要至少一轮靶细胞增殖。逆转录病毒载体随机整合到患者基因组中。逆转录病毒能够用于靶定神经系统的干细胞，因为在神经系统(特别是CNS)的其它细胞中很少发生细胞分裂。
三种类型的逆转录病毒已被描述过；同向性的(ecotropic)，其能够高效转染小鼠细胞；和兼向性的(amphotropic)，其能够感染许多物种的细胞。第三种类型包括嗜异性逆转录病毒，其能够感染不同于产生该病毒的物种的其他物种。逆转录病毒的这种只整合到分裂中的细胞基因组的能力使得人们有兴趣用它们制造细胞系进行发育研究，以及用它们向癌或肿瘤递送治疗或自杀基因。
对于人类患者用途而言，逆转录病毒载体必须是复制缺陷型的。这使得靶组织内不会进一步产生感染性的逆转录病毒颗粒。相反，复制缺陷病毒成为稳定整合到靶细胞基因组内的“俘虏”转基因。典型地，在复制缺陷病毒中，gag、env和pol基因被删除(连同其余的大部分病毒基因组)。异源DNA被插入而替代被删除的病毒基因。异源基因可以处于内在异源启动子、在靶细胞内活跃的另一种异源启动子、或逆转录病毒5’LTR(病毒LTR在多种组织中有活性)的控制之下。典型地，逆转录病毒载体具有大约7-8kb的转基因容量。
复制缺陷逆转录病毒载体需要从例如工程化的封装细胞系反式提供复制和组装所需的病毒蛋白。重要的是，包装细胞不释放能够复制的病毒和/或辅助病毒。这已经通过从缺少ψ信号的RNA表达病毒蛋白，并从分离的转录单位表达gag/pol基因和env基因而实现。此外，在一些2和3代逆转录病毒中，5’LTR被控制这些基因表达的非病毒启动子替代，3’启动子被最小化到仅含有最接近的启动子。这些设计将使得导致能够复制的病毒或辅助病毒生成的重组的可能性最小化。
VIII.表达载体
用于重组表达本发明中使用的METRNL多肽的载体的构建可以用传统的技术实现，其对本领域普通技术人员而言不需要详细的解释。至于综述，普通技术人员可查询Maniatis et al.，in Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，(NY 1982)。可以利用表达载体生成生产细胞，这些生产细胞用于重组生产医用METRNL多肽，和生产分泌METRNL多肽的治疗细胞用于裸露或封装的疗法。
简而言之，重组表达载体的构建采用标准的连接技术。为了分析确认所构建载体的序列正确与否，用例如Messing等(Nucleic Acids Res.，9：309-，1981)的方法、Maxam等(Methods in Enzymology，65：499，1980)的方法、或其它合适的本领域技术人员已知的方法对基因进行测序。
用常规的凝胶电泳按大小分离经过切割的片段，如例如Maniatis等(Molecular Cloning，pp.133-134，1982)所述。
为了产生高效表达载体，它们应当含有表达处于正确阅读框内的编码基因所需的调节序列。基因的表达在转录、翻译或翻译后水平被控制。转录起始是基因表达早期并且关键的事件。这取决于启动子和增强子序列，并且受到与这些序列互作的特定细胞因子的影响。许多基因的转录单位由启动子组成，在一些情况下有增强子或调节元件(Banerji et al.1981，Cell 27：299；Corden et al.1980，Science 209：1406；and Breathnach and Chambon 1981，Ann.Rev.Biochem.50：349)。对于逆转录病毒，参与逆转录病毒基因组复制的控制元件位于长末端重复(LTR)内(Weiss et al.，eds.，The molecular biology oftumor viruses：RNA tumor viruses，Cold Spring Harbor Laboratory，(NY 1982))。莫洛尼小鼠白血病毒(MLV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR含有启动子和增强子序列(Jolly et al.1983，Nucleic Acids Res.11：1855；Capecchi et al.，In：Enhancer and eukaryotic gene expression，Gulzman and Shenk，eds.，pp.101-102，Cold Spring Harbor Laboratories(NY 1991)。其它强力的启动子包括来自巨细胞病毒(CMV)的启动子和其它野生型病毒启动子。
人们还描述了若干非病毒启动子的启动子和增强子区(Schmidt et al.1985，Nature 314：285；Rossi and deCrombrugghe 1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5590-5594)。用于维持和增强转基因在静止期细胞(quiescent cell)内表达的方法包括使用启动子，包括I型胶原(1和2)(Prockop and Kivirikko，1984N.Eng.J.Med.311：376；Smith and Niles 1980，Biochem.19：1820；deWet et al.1983，J.Biol.Chem.，258：14385)、SV40和LTR启动子。
根据本发明的一个实施方案，启动子是选自下组的组成型启动子：泛素启动子、CMV启动子、JeT启动子(US 6,555,674)，SV40启动子，鸡β-肌动蛋白启动子，延伸因子1α启动子(EF1-α)，RSV，Mo-MLV-LTR。可诱导/可抑制启动子的实例包括：Tet-On，Tet-Off雷帕霉素诱导的启动子，Mx1。
一组优选的启动子包括鸡β-肌动蛋白启动子、CMV、人UbiC、JeT、RSV、Tet-可调节启动子、Mo-MLV-LTR、Mx1和EF-1α。
除了使用病毒和非病毒启动子驱动转基因表达之外，也可以使用增强子序列增加转基因表达的水平。增强子不仅能够提高其自身基因的转录活性，也可以提高一些外来基因的转录活性(Armelor 1973，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70：2702)。例如，在本发明中，胶原增强子序列可以和胶原启动子2(I)一起使用，提高转基因的表达。此外，SV40病毒中发现的增强子元件可用于增强转基因表达。该增强子序列由72个碱基对重复序列构成，如Gruss etal.1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：943；Benoist and Chambon 1981，Nature290：304，和Fromm and Berg 1982，J.Mol.Appl.Genetics，1：457所述，本文通过提述并入它们的全部内容。当与各种启动子串联存在时，该重复序列可以增加许多不同病毒和细胞基因的转录(Moreau et al.1981，Nucleic AcidsRes.9：6047)。
其他表达增强序列包括但不限于：土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，WPRE，SP163，CMV增强子，和鸡[β]-球蛋白绝缘子或其它绝缘子(insulator)。
还可以用细胞因子调节启动子活性而增强转基因表达以实现长期稳定表达。数种细胞因子已经被报道可调节从胶原2(I)和LTR启动子的转基因表达(Chua et al.，connective Tissue Res.，25：161-170(1990)；Elias et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.，580：233-244(1990))；Seliger et al.，J.Immunol.141：2138-2144(1988)；和Seliger et al.，J.Virology 62：619-621(1988))。例如，转化生长因子(TGF)、白介素(IL)-l和干扰素(INF)下调受各种启动子例如LTR驱动的转基因的表达。肿瘤坏死因子(TNF)和TGF1上调并可用于控制受启动子驱动的转基因的表达。其它可以证明有用的细胞因子包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)
具有胶原增强子序列(Coll(E))的胶原蛋白启动子也可用于增强转基因表达，该增强作用是通过抑制接受治疗的脑可能对载体产生的任何免疫响应(尽管其处于免疫保护状态)而实现的。此外，在递送载体组合物后，可以立即对被治疗宿主施用抗炎剂包括类固醇如地塞米松，并且优选地持续施用直到任何细胞因子介导的炎症响应平息为止。也可以施用免疫抑制剂如环孢菌素以降低干扰素的产生。其下调LTR启动子和Coll(E)启动子-增强子，并降低转基因表达。
载体可以包括其他的序列，例如编码Cre重组酶蛋白的序列和LoxP序列。另一种确保METRNL瞬时表达的方法是通过使用Cre-LoxP系统，其结果是被插入的DNA序列的一部分当向细胞施用Cre重组酶时(Daewoong et al，Nature Biotechnology 19：929-933)或向病毒构建体内导入编码重组酶的基因时(Plück，Int J Exp Path，77：269-278)被切除。向病毒构建体内导入重组酶基因以及LoxP位点和结构基因(在本实例中是METRNL)经常导致结构基因表达大约5天的时间。
IX.生物相容性胶囊
封装细胞疗法是基于如下的构思，即通过在植入到宿主体内之前用半透性生物相容材料包围细胞来使细胞与受体宿主免疫系统隔离。本发明包括一种装置，其中能够表达和分泌METRNL的细胞被封装在免疫隔离性(immunoisolatory)胶囊内。“免疫隔离性胶囊”是指胶囊当植入到受体宿主内时，可以将宿主免疫系统对装置核心中细胞的不良效应最小化。通过用微孔膜制成的可植入聚合物胶囊包裹细胞，将细胞与宿主免疫隔离。该方法使宿主与被植入组织之间不发生细胞-细胞接触，消除通过直接呈递进行的抗原识别。所用膜也可以调整，以便根据分子(例如抗体和补体)的大小来控制分子的扩散(Lysaght et al.，56J.Cell Biochem.196(1996)，Colton，14TrendsBiotechnol.158(1996))。使用封装技术，可以在使用或不使用免疫抑制药物的情况下将细胞移植到宿主内而不发生免疫排斥。有用的生物相容性聚合物胶囊通常包含：含有细胞的核心，其或是悬浮在液体介质中或是固定化在固定基质内；和由选择渗透性基质或膜(″外衣″)构成的周围或外周区域，其不含有分离细胞，是生物相容性的，并且足以保护核心中的细胞免于免疫攻击的伤害。封装可阻碍免疫系统的元件进入胶囊，借此保护被封装细胞免于免疫破坏。胶囊膜的半渗透性还允许感兴趣的生物活性分子容易地从胶囊扩散到四周的宿主组织。
胶囊可以用生物相容性材料制成。“生物相容性材料”是如下的材料，其在植入宿主内之后，不会引发足以导致胶囊被排斥或者使其不可操作(通过例如降解)的有害宿主响应。生物相容性材料对大分子，例如宿主免疫系统的组分，是相对不可渗透的，但是对小分子，例如胰岛素、生长因子如METRNL多肽、以及营养物质是可渗透的，同时允许代谢废物被清除。许多生物相容性材料适合用于通过本发明的组合物递送生长因子。已知有多种生物相容性材料，其具有不同的外表面形态和其它机械和结构特征。优选地，本发明的胶囊与下列文献中所述的相似：WO 92/19195或WO 95/05452，通过提述并入；或美国专利Nos.5,639,275；5,653,975；4,892,538；5,156,844；5,283,187；或美国专利No.5,550,050，通过提述并入。这些胶囊允许代谢物、营养物和治疗物质通过，同时将宿主免疫系统的有害作用最小化。生物相容性材料的组分可以包括周围的半渗透膜和内部的细胞支持性基架(scaffolding)。优选地，将遗传改变的细胞接种到基架上，其中基架被选择渗透性膜包裹。纤维状细胞支持性基架可以用选自下组的任何生物相容性材料制成：丙烯酸、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙腈、涤纶、尼龙、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯(polybutester)、丝、棉、几丁质、碳、或生物相容性金属。另外，键合纤维结构(bonded fiber structures)可用于细胞植入(美国专利No.5,512,600，通过提述并入)。生物可降解聚合物包括由聚(乳酸)PLA、聚(乳酸-共乙醇酸)PLGA、和聚(乙醇酸)PGA和其等价物构成的聚合物。泡沫基架(foam scaffolds)已经被用于提供移植细胞可以附着的表面(WO 98/05304，通过提述并入)。纺网管(Woven mesh tube)已经用作血管移植体(WO99/52573，通过提述并入)。此外，核心可以由水凝胶形成的固定基质构成，其可固定化细胞的位置。水凝胶是一种交联亲水聚合物的三维网络，处于基本上由水构成的凝胶的形式。
各种聚合物和共混聚合物可用于制造周围的半透膜，包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物)、聚偏二乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚酰胺、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜(包括聚醚砜)、聚磷嗪、聚丙烯腈、聚丙烯腈/氯乙烯共聚物、以及它们的衍生物，共聚物和其混合物。优选地，周围的半透膜是生物相容性半透性中空纤维膜。这些膜和制造它们的方法在美国专利Nos.5,284,761和5,158,881中有公开，本文通过提述并入。周围的半透膜用聚醚砜中空纤维形成，例如美国专利No.4,976,859或美国专利No.4,968,733所述，本文通过提述并入。一种可选择的周围半透膜材料是聚丙烯腈/氯乙烯共聚物。
胶囊可以是任何适合于保持生物活性并为产物或功能的送达提供途径的构型，包括例如圆柱形、矩形、圆盘形、小片形、卵形、星形或球形。而且，胶囊可以被卷曲或包裹成网状或巢状结构。如果胶囊需要在植入后回收，则不优选易于导致胶囊从植入位置迁移的构型，例如小到足以在受体宿主血管内移动的球形胶囊。某些形状，例如矩形、小片形、圆盘形、圆柱形和平板，可提供更大的结构整体性，当期望回收时，这些形状是优选的。
当使用大胶囊时，优选地每个装置中封装103-108个细胞，更优选地封装105-107个细胞。剂量可以通过植入更少或更大数目的胶囊进行控制，优选每个患者1-10个胶囊。
基架可以用细胞外基质(ECM)分子加以包被。细胞外基质分子的合适实例包括，例如胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白。还可以通过用等离子体辐射处理对基架的表面进行改性，使其带电荷以提高细胞的附着。
可以使用任何合适的密封胶囊的方法，包括使用聚合物粘合剂或卷边(crimping)、打结(knotting)和热密封。此外，也可以使用任何合适的“干”密封方法，如美国专利No.5,653,687中所述，本文通过提述并入。
封装的细胞装置依照已知的技术进行植入。为本发明装置和方法预期了许多植入位点。这些植入位点包括，但不仅限于，中枢神经系统，包括脑、脊髓(见美国专利Nos.5,106,627，5,156,844和5,554,148，本文通过提述并入)，和眼的水状和玻璃状体液(见WO 97/34586，本文通过提述并入)。
用于将胶囊植入CNS的方法和设备在US 5,487,739中有介绍。用于将胶囊植入眼的方法在US 5,904,144，US 6,299,895，US 6,439,427和US20030031700中有介绍。
在一个方面中，本发明涉及生物相容性胶囊，包括：含有可分泌用于感染靶细胞的病毒载体的活包装细胞的内核，其中该病毒载体是根据本发明的载体；和包围所述内核的外套(external jacket)，所述外套包括可渗透的生物相容性材料，所述材料具有选定的孔隙度容许直径大约100nm的逆转录病毒载体通过，从而容许所述病毒载体从所述胶囊释放。
优选地，内核还包含基质，该封装细胞被该基质固定。根据一个实施方案，该外套包括水凝胶或热塑性材料。
用于包装细胞系的合适细胞的实例包括HEK293，NIH3T3，PG13和ARPE-19细胞。优选的细胞包括PG13和3T3细胞。
包装细胞系可以用下列文献中公开的方法和组合物封装和施用：US6,027,721和WO 97/01357，这里通过提述并入其全部内容。
X.用于METRNL产生细胞的支持基质
本发明进一步包括在植入哺乳动物神经系统之前，在支持基质上体外培养METRNL产生细胞。在植入之前使细胞预附着到微载体上的目的是提高移植细胞的长期生存能力，并提供长期的功能益处。
为了提高移植细胞即被移植的METRNL分泌细胞的长期生存能力，在移植之前，可以将待移植的细胞在体外附着到支持基质上。可以构成支持基质的材料包括这样的材料：细胞在体外孵育后可以附着于它，细胞能够在它上面生长，并且它能够被植入到哺乳动物体内而不会产生毒性反应或者会破坏植入细胞或者干扰植入细胞生物或治疗活性的炎症反应。这些材料可以是合成的或天然化学物质，或者生物来源的物质。
基质材料包括，但不仅限于，玻璃和其它硅氧化物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氨酯、聚藻酸酯(polyalginate)、聚砜、聚乙烯醇、丙烯腈聚合物、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚戊烯(polypentent)、尼龙、淀粉酶、天然和经过修饰的明胶和天然和经过修饰的胶原、天然和经过修饰的多糖，包括右旋糖和纤维素(例如硝酸纤维素)、琼脂和磁石。可再吸收的或不可再吸收的材料均可使用。还预期了细胞外基质材料，这是本领域众所周知的。细胞外基质材料可以商业获得，或者如下方法加以制备：生长可分泌这种基质的细胞，移除分泌细胞，并使这些待移植细胞与该基质相互作用并粘附于该基质。就待移植细胞在其上生长、或与这些细胞混合的基质材料而言，可以是RPE细胞的固有产物。因此，例如，基质材料可以是细胞外基质或基底膜材料，其由待植入的RPE细胞产生并分泌。
为了提高细胞的粘附、生存和机能，固体基质的外表面上可以任选地包被本领域已知的可促进细胞粘附、生长或生存的因子。这些因子包括细胞粘附分子、细胞外基质，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖或蛋白多糖或生长因子。
或者，如果植入细胞所附着的固体基质是用多孔材料构建的，则可以将促进生长或生存的因子导入到该基质材料内，在体内植入后，它们可以从那里缓慢被释放。
当附着于根据本发明的支持物时，用于移植的细胞一般位于支持物的“外表面”。支持物可以是致密的(solid)或多孔的。然而，即使在多孔支持物中，细胞与外部环境仍然是直接接触，而没有中间膜或其它屏障。因此，根据本发明，即使细胞所附着的表面可能是多孔支持材料的内部折叠或者卷曲部分的形式而不位于颗粒或珠子自身的外部，仍然将细胞视为处于支持物的“外表面”。
支持物的构型优选地是球形，如珠子的形式，但是也可以是圆柱形、椭圆形、平片或条状、针或别针形状等。支持基质的优选形式是玻璃珠子。另一种优选的珠子是聚苯乙烯珠。
珠子尺寸的范围是直径大约10μm-1mm，优选地大约90μm-大约150μm。关于各种微载体珠子的介绍，见例如isher Biotech Source 87-88，FisherScientific Co.，1987，pp.72-75；Sigma Cell Culture Catalog，Sigma Chemical Co.，St，Louis，1991，pp.162-163；Ventrex Product Catalog，Ventrex Laboratories，1989；本文通过提述并入这些参考文献的内容。珠子尺寸的上限可以受制于珠子对不良宿主反应的刺激作用，其可能干扰所移植细胞的功能，或者对周围组织造成损伤。珠子尺寸的上限还可受制于施用方法。这些限制可以被本领域技术人员容易地确定。
XI.宿主细胞
在一个方面中，本发明涉及分离的宿主细胞，其用根据本发明的载体进行了遗传修饰。
根据一个实施方案，宿主细胞是原核细胞，例如能够大量产生重组蛋白并能够容易地放大到工业规模的大肠杆菌。使用原核生产细胞可能需要对METRNL的重折叠和糖基化，以获得生物活性的蛋白。在另一个实施方案中，宿主细胞是来自非哺乳动物的真核生产细胞，包括但不限于已知的生产细胞，例如酵母(酿酒酵母)、丝状真菌如曲霉(aspergillus)、和昆虫细胞如Sf9。
根据另一个实施方案，细胞优选地是哺乳动物宿主细胞，因为它们能够正确分泌和加工所编码的METRNL。优选的物种包括人、猫(feline)、猪(porcine)、猿或猴(simian)、犬(canina)、小鼠(murine)、大鼠、家兔、小鼠和仓鼠。
作为用本发明载体转化或转染的良好候选物的原代培养物和细胞系的实例包括CHO，CHO-K1，HEI193T，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b，神经元细胞，胎儿细胞，ARPE-19，C2C12，MDX12，HeLa，HepG2，纹状体细胞，神经元，星形胶质细胞和中间神经元。用于哺乳动物重组表达优选的细胞系包括CHO，CHO-1，HEI193T，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b和BHK细胞。
对于回体基因治疗，优选的细胞组包括神经元细胞、神经元前体细胞、神经元祖细胞、干细胞和胎儿细胞。
本发明还涉及适合于通过裸露或封装细胞的生物递送的细胞，它们被遗传修饰从而过表达METRNL，并可以移植给患者以局部地递送生物活性METRNL多肽。这些细胞可泛称为治疗细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，治疗细胞系没有通过插入异源永生基因而永生化。既然本发明涉及特别适合于细胞移植的细胞，无论是作为裸细胞还是优选地作为封装细胞，这些永生细胞系是不太优选的，因为它们具有在人体内不受控制地开始增殖，并可能形成肿瘤的内在风险。
优选地，细胞系是接触抑制性细胞系。接触抑制性细胞系是指当在2D培养时会生长到汇合(confluency)然后基本上停止分裂的细胞系。这不排除有限数目的细胞逃离2D层的可能。接触抑制性细胞也可以在3D内生长，例如在胶囊内。在胶囊内同样，细胞生长到汇合，然后增殖速度显著降低或者完全停止分裂。特别优选的细胞类型包括上皮细胞，其本质上是接触抑制性的，并且在培养中形成稳定的单层。
更加优选的是视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)。RPE细胞来源是从哺乳动物视网膜分离的原代细胞。用于收集RPE细胞的规程已经明确(Li andTurner，1988，Exp.Eye Res.47：911-917；Lopez et al.，1989，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.30：586-588)，并且被认为是常规的方法。在大多数关于RPE细胞共移植的公开报道中，细胞来自于大鼠(Li and Turner，1988；Lopez et al.，1989)。根据本发明，RPE细胞来自人类。除了分离的原代RPE细胞之外，在实践本发明时也可以使用培养的人RPE细胞系。
为了封装，细胞需要能够在CNS的低氧压力水平下生存并保持功能性METRNL分泌。优选地，本发明的细胞系能够在低于5％、更优选地低于2％、更优选地低于1％的氧压力下生存。1％的氧分压近似与脑中的氧水平相当。
为了成为基于封装细胞的递送系统的平台细胞系，细胞系应当具有尽可能多的如下特征：(1)细胞在严格的条件下应该强健(封装细胞应当在血管和无血管组织空腔内，例如中枢神经系统实质内或在脑室内或鞘内液体空间或眼内，特别是在眼内环境中具有功能)。(2)细胞应当能够被遗传修饰从而表达METRNL。(3)细胞应当具有相对长的寿命(细胞应当产生充足的用于建库(banked)、表征、工程化、安全测试和临床分批制造(clinical lot manufacture)的后代)。(4)细胞必须是人类来源(这样可以增加封装细胞与宿主之间的相容性)。(5)细胞应当在体内的装置中在超过1个月的时间内显示大于80％的生存能力(以确保长期递送)。(6)封装细胞应当递送有效量的METRNL(以确保治疗的有效性)。(7)被封装后细胞应当不会导致显著的宿主免疫反应(以确保移植体的长寿命)。(8)细胞应当是非致瘤的(以提供对宿主的更高的安全性，万一装置泄漏)。
为了封装，优选的细胞系包括视网膜色素上皮细胞，包括ARPE-19细胞；人永生化成纤维细胞；和人永生化星形胶质细胞。
ARPE-19细胞系是用于基于封装细胞的递送技术的优秀的平台细胞系，并且也可用于基于非封装细胞的递送技术。ARPE-19细胞系具有强健性(即细胞系在严格条件下，例如植入到中枢神经系统或眼内环境中，可以存活)。ARPE-19细胞可以被遗传修饰而分泌有治疗意义的物质。ARPE-19细胞具有相对长的寿命。ARPE-19细胞是人类来源的。而且，包装的ARPE-19细胞具有良好的体内装置生存能力(in vivo device viability)。ARPE-19细胞可以投递有效量的生长因子。ARPE-19细胞引发的宿主免疫反应可以忽略。而且，ARPE-19细胞是非致瘤性的。用于培养和封装ARPE-19细胞的方法如US6,361,771所述。
在另一个实施方案中，治疗细胞系选自下组：人成纤维细胞系、人星形胶质细胞系、人中脑细胞系和人内皮细胞系，优选地是用TERT、SV40T或vmyc永生化的。
用于产生永生化人星形胶质细胞系的方法在先前已有介绍(Price TN，Burke JF，Mayne LV.A novel human astrocyte cell line(A735)withastrocyte-specific neurotransmitter function.In Vitro Cell Dev Biol Anim.1999May；35(5)：279-88.)。该规程可以用于产生星形胶质细胞系。
优选地对实验规程进行如下三方面的修改，以产生更多的人星形胶质细胞系。
可以使用从5-12周龄胎儿切除的人胎儿脑组织代替12-16周龄组织。
可以用永生化基因v-myc或TERT(端粒酶)代替SV40T抗原。
可以使用逆转录病毒基因转移代替借助磷酸钙沉淀技术的质粒转染。
XII.本发明METRNL多肽的重组产生和纯化
本发明的METRNL多肽可以用现有技术的原核或真核表达系统技术来生产。真核表达系统在实施例2中有描述，其产生基本上纯的带his标签的METRNL多肽。
进一步的方法实例在WO 93/22437(Innogenetics公司)中有介绍，本文通过提述并入其内容。WO 93/22437中所述的方法介绍了预测分子量为29kDa的蛋白质的纯化。在表达METRNL的片段--其可能要短得多--的场合，该方法应当进行修改，以考虑分子量的差异。
这些实例包括在大肠杆菌中表达(WO 93/22437的实施例5)，在COS1细胞中表达(WO 93/22437的实施例6)，在杆状病毒表达系统中表达(WO93/22437的实施例7)，在牛痘病毒系统中表达(WO 93/22437的实施例8)。上面提到的表达系统均产生了显著量的如WO 93/22437所述多肽的表达。
METRNL蛋白的纯化可以用WO 93/22437所述的纯化方法进行。简而言之，48小时后收集用本发明cDNA转染的COS1细胞的条件化培养基，用0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。典型的纯化从600-1000ml COS1转染培养基起始。为此，添加MgCl2和硫酸右旋糖500.000(dextrane-sulphate)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，使终浓度分别为60mM和0.02％。4℃孵育1h后，通过离心(12.000g，30min.，4℃)进行沉淀。含有METRNL的上清级分对50mM Hepes pH 7.0，4mM EDTA渗析，调节到pH 8.0，并以0.5ml/分钟的流速加载到用50mM Hepes pH 8.5平衡的4ml苯基硼酸琼脂糖(Phenylboronate agarose)(PBA 30，Amicon，MA，USA)柱上。用100mM山梨醇从基质中将METRNL洗脱出来。
然后，以0.5ml/分钟的流速使山梨醇洗脱峰通过用Hepes pH 8.5平衡的1ml FPLC Mono Q阴离子交换柱(Pharmacia)，用0-1M NaCl的线性盐梯度以1ml/分钟进行洗脱。
洗脱物用Centricon 10.000(Amicon)浓缩大约40倍，并分批加载(3次0.25ml)到用PBS平衡的SMART Superdex 75凝胶过滤柱(Pharmacia)上。该规程可以产生高纯度的蛋白洗脱。
其他现有技术的蛋白纯化规程也可用于提供足够的纯蛋白质，以进行实施例中所述的体外和体内测定。
XIII.METRNL的体外应用
METRNL多肽和/或METRNL编码多核苷酸可以在体外用作生长因子或营养因子。这一应用是根据如下的发现，即METRNL是具有生长因子或激素的结构特征的分泌蛋白，以及本发明人在不同的体外测定中发现METRNL可导致神经突长出(轴突延长)、神经存活、神经发生、和神经前体的迁移。神经营养和/或神经迁移和/或神经保护和/或神经发生作用已经在背根神经节和室下区外植体中发现。
可以将METRNL作为蛋白组合物施用到培养基中，或者可以用编码METRNL的cDNA转导或转染细胞。METRNL是否在针对特定细胞类型或组织的治疗中有效可以由本领域技术人员使用本领域已知的多种测定方法中的任意一种容易地加以确定。例如，关于为细胞提供营养支持，营养因子可以产生有利的生物化学或形态学效应，而且在某些情况下，能够促进细胞生存。关于神经元，本领域已知，夺去神经元的营养支持会导致正常功能和生长必需的代谢活性例如葡萄糖摄取、RNA合成和蛋白质合成的降低(Deckwerth and Johnson 1993，J.Cell Biol.123：1207-1222)。除去营养支持还会导致神经元细胞体大小减少。营养因子缺乏会导致突起长出(processoutgrowth)的降低或停止，并可能导致神经元突起的退缩(retraction)，推测可能是营养因子的代谢作用丧失的结果。除了在这些神经元生物学方面需要营养因子之外，神经元还需要神经营养因子以维持生存；因此，生存测定经常被用作检测或定量神经营养因子的作用的手段。然而，营养支持还可以表现为形态、生物化学和功能改变；而与神经元数目或者任何对生存的影响无关。
METRNL蛋白或多核苷酸可以用于干细胞和它们的神经后代以及神经元、神经胶质细胞、施万细胞、星形胶质细胞少突胶质细胞的繁殖、分化、再生或生存。体外培养可以是对从患者分离的细胞的刺激或体外基因治疗的一部分，并且意图用于在体外刺激或转染/转化后施用给患者。
XIV抗-METRNL抗体
本发明的METRNL多肽或多肽片段用于产生METRNL-特异性抗体。如本文中使用的，“METRNL-特异抗体”是指如下的抗体，例如多克隆抗体或单克隆抗体，其与METRNL多肽或多肽片段具有免疫反应性，或者与METRNL多肽的表位特异结合。
单克隆和单克隆抗体的制备是本领域众所周知的。多克隆抗体具体可以如下列文献所述地获得，例如Green等《Production of Polyclonal Antisera》，于Immunochemical Protocols(Manson等编)；Humana Press，1992，第1-5页；byColigan等，：“Production of Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice andHamsters”于Current Protocols in Immunology中，1992，第2.4.1节，和EdHarlow与David Lane(编)，于“Antibodies；A laboratory manual”中，ColdSpring Harbor Lab.Press 1988。单克隆抗体具体可以如下列文献所述地获得：例如Kohler&Milstein，Nature，1975，256：495；Coligan等，于Current Protocols in Immunology中，1992，第2.5.1-2.6.7节；和Harlow等，于Antibodies：A Laboratory Manual中；Cold Spring Harbor，Pub.，1988，第726页。
简而言之，单克隆抗体可以通过用包含抗原的组合物注射例如小鼠，通过分离血清样品确认抗体产生的存在，分离脾脏获得B淋巴细胞，使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对抗原的抗体的阳性克隆，和从杂交瘤培养物分离抗体。
可以通过多种现成的技术从杂交瘤培养物分离和纯化单克隆抗体，这些技术包括使用蛋白A Sepharose的亲和色谱、大小排阻色谱、和离子交换色谱，见例如Coligan等.于Current Protocols in Immunology中，1992，第2.7.1-2.7.12和第2.9.1-2.9.3节；和Barne等：“Purification of Immunoglobulin G(IgG)”，于Methods in Molecular Biology中；Humana Press，1992，Vol.10，第79-104页。多克隆或单克隆抗体可以任选地进一步进行纯化，例如通过与结合有用于制备抗体的多肽的基质结合并洗脱。
与本发明METRNL多肽结合的抗体可以用完整多肽或者含有目标小肽的片段作为免疫接种抗原加以制备。用于免疫接种动物的多肽可以通过重组DNA技术或通过化学合成获得，并可以任选地与载体蛋白偶联。与肽化学偶联的通用载体蛋白包括钥孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。偶联的多肽随后可用于免疫动物，特别是小鼠、大鼠、仓鼠或家兔。
实施例
实施例1，METRNL序列
序列列举编号。
SEQ ID NO 1：人Meteorin样cDNA
SEQ ID NO 2：人Meteorin样蛋白(包括信号肽)
SEQ ID NO 3：小鼠Meteorin样cDNA
SEQ ID NO 4：小鼠Meteorin样蛋白(包括信号肽)
SEQ ID NO 5：大鼠Meteorin样cDNA
SEQ ID NO 6：大鼠Meteorin样蛋白(包括信号肽)
SEQ ID NO 7：人成熟meteorin样蛋白
SEQ ID NO 8：小鼠成熟meteorin样蛋白
SEQ ID NO 9：大鼠成熟meteorin样蛋白
SEQ ID NO 10：人meteorin样核心片段
SEQ ID NO 11：小鼠meteorin样核心片段
SEQ ID NO 12：大鼠meteorin样核心片段
SEQ ID NO 13：hMTRNL开放阅读框
SEQ ID NO 14：mMTRNL开放阅读框
SEQ ID NO 15：rMTRNL开放阅读框
SEQ ID NO 16：人CDS成熟METRNL
SEQ ID NO 17：小鼠CDS成熟METRNL
SEQ ID NO 18：大鼠CDS成熟METRNL
SEQ ID NO 19：牛Meteorin样蛋白(包括信号肽)
SEQ ID NO 20：鸡meteorin样蛋白(包括信号肽)
SEQ ID NO 21：蛙Meteorin样蛋白(包括信号肽)
SEQ ID NO 22：斑马鱼Meteorin样蛋白(包括信号肽)
SEQ ID NO 23：人METRN蛋白(包括信号肽)
SEQ ID NO 24：小鼠METRN蛋白(包括信号肽)
SEQ ID NO 25：大鼠METRN蛋白(包括信号肽)
SEQ ID NO 26：METRNL的C-端His标签
SEQ ID NO 2：人Meteorin样蛋白(NP_001004431.1)
  1 mrgaaraawg ragqpwprpp apgppppplp 111111agll ggagaqyssd
 51 rcswkgsglt heahrkeveq vylrcaagav ewmyptgali vnlrpntfsp
101 arhltvcirs ftdssganiy lektgelrll vpdgdgrpgr vqcfgleqgg
151 lfveatpqqd igrrttgfqy elvrrhrasd lhelsapcrp csdtevllav
201 ctsdfavrgs iqqvtheper qdsaihlrvs rlyrqksrvf epvpegdghw
251 qgrvrtllec gvrpghgdfl ftghmhfgea rlgcaprfkd fqrmyrdaqe
301 rglnpcevgt d
SEQ ID NO 4：小鼠Meteorin样蛋白(NP_659046.1)
  1 mrgavwaarr ragqqwprsp gpgpgppppp plllllllll ggasaqyssd
 51 lcswkgsglt rearskeveq vylrcsagsv ewmyptgali vnlrpntfsp
101 aqnltvcikp frdssganiy lektgelrll vrdirgepgq vqcfsleqgg
151 lfveatpqqd isrrttgfqy elmsgqrgld lhvlsapcrp csdtevllai
201 ctsdfvvrgf iedvthvpeq qvsviylrvn rlhrqksrvf qpapedsghw
251 lghvttllqc gvrpghgefl ftghvhfgea qlgcaprfsd fqrmyrkaee
301 mginpceinm e
SEQ ID NO 6：大鼠Meteorin样蛋白(NP_001014126)
  1 mrgvvwaarr ragqqwprsp gpgpgppppp plllllllll ggasaqyssd
 51 lcswkgsglt reahskeveq vylrcsagsv ewmyptgali vnlrpntfsp
101 aqnltvcikp frdssganiy lektgelrll vrdvrgepgq vqcfsleqgg
151 lfveatpqqd isrrttgfqy elmsgqrgld lhvlsapcrp csdtevllai
201 ctsdfvvrgf iedvthvpeq qvsvihlrvs rlhrqksrvf qpapedsghw
251 lghvttllqc gvrpghgefl ftghvhfgea qlgcaprfsd fqkmyrkaee
301 rginpceinm e
SEQ ID NO 7：人成熟meteorin样蛋白
QYSSDRCSWK GSGLTHEAHR KEVEQVYLRC AAGAVEWMYP TGALIVNLRP NTFSPARHLT    60
VCIRSFTDSS GANIYLEKTG ELRLLVPDGD GRPGRVQCFG LEQGGLFVEA TPQQDIGRRT    120
TGFQYELVRR HRASDLHELS APCRPCSDTE VLLAVCTSDF AVRGSIQQVT HEPERQDSAI    180
HLRVSRLYRQ KSRVFEPVPE GDGHWQGRVR TLLECGVRPG HGDFLFTGHM HFGEARLGCA    240
PRFKDFQRMY RDAQERGLNP CEVGTD                                         266
SEQ ID NO 8：小鼠成熟meteorin样蛋白
QYSSDLCSWK GSGLTREARS KEVEQVYLRC SAGSVEWMYP TGALIVNLRP NTFSPAQNLT    60
VCIKPFRDSS GANIYLEKTG ELRLLVRDIR GEPGQVQCFS LEQGGLFVEA TPQQDISRRT    120
TGFQYELMSG QRGLDLHVLS APCRPCSDTE VLLAICTSDF VVRGFIEDVT HVPEQQVSVI    180
YLRVNRLHRQ KSRVFQPAPE DSGHWLGHVT TLLQCGVRPG HGEFLFTGHV HFGEAQLGCA    240
PRFSDFQRMY RKAEEMGINP CEINME                                         266
SEQ ID NO 9：大鼠成熟meteorin样蛋白
QYSSDLCSWK GSGLTREAHS KEVEQVYLRC SAGSVEWMYP TGALIVNLRP NTFSPAQNLT    60
VCIKPFRDSS GANIYLEKTG ELRLLVRDVR GEPGQVQCFS LEQGGLFVEA TPQQDISRRT    120
TGFQYELMSG QRGLDLHVLS APCRPCSDTE VLLAICTSDF VVRGFIEDVT HVPEQQVSVI    180
HLRVSRLHRQ KSRVFQPAPE DSGHWLGHVT TLLQCGVRPG HGEFLFTGHV HFGEAQLGCA    240
PRFSDFQKMY RKAEERGINP CEINME                                         266
SEQ ID NO 10：人meteorin样核心片段
CSWKGSGLTH EAHRKEVEQV YLRCAAGAVE WMYPTGALIV NLRPNTFSPA RHLTVCIRSF    60
TDSSGANIYL EKTGELRLLV PDGDGRPGRV QCFGLEQGGL FVEATPQQDI GRRTTGFQYE    120
LVRRHRASDL HELSAPCRPC SDTEVLLAVC TSDFAVRGSI QQVTHEPERQ DSAIHLRVSR    180
LYRQKSRVFE PVPEGDGHWQ GRVRTLLECG VRPGHGDFLF TGHMHFGEAR LGCAPRFKDF    240
QRMYRDAQER                                                         GLNPC255
SEQ ID NO 11：小鼠meteorin样核心片段
CSWKGSGLTR EARSKEVEQV YLRCSAGSVE WMYPTGALIV NLRPNTFSPA QNLTVCIKPF    60
RDSSGANIYL EKTGELRLLV RDIRGEPGQV QCFSLEQGGL FVEATPQQDI SRRTTGFQYE    120
LMSGQRGLDL HVLSAPCRPC SDTEVLLAIC TSDFVVRGFI EDVTHVPEQQ VSVIYLRVNR    180
LHRQKSRVFQ PAPEDSGHWL GHVTTLLQCG VRPGHGEFLF TGHVHFGEAQ LGCAPRFSDF    240
QRMYRKAEEM                                                         GINPC255
SEQ ID NO 12：大鼠meteorin样核心片段
CSWKGSGLTR EAHSKEVEQV YLRCSAGSVE WMYPTGALIV NLRPNTFSPA QNLTVCIKPF    60
RDSSGANIYL EKTGELRLLV RDVRGEPGQV QCFSLEQGGL FVEATPQQDI SRRTTGFQYE    120
LMSGQRGLDL HVLSAPCRPC SDTEVLLAIC TSDFVVRGFI EDVTHVPEQQ VSVIHLRVSR    180
LHRQKSRVFQ PAPEDSGHWL GHVTTLLQCG VRPGHGEFLF TGHVHFGEAQ LGCAPRFSDF    240
QKMYRKAEER GINPC                                                     255
SEQ ID NO 1：人Meteorin样cDNA(NM_001004431.1)
  1 gcggggggcg cgcgacgtga ccacccggac tcgaagcccg ccccgccccc
 51 gcccggctcg ccggctccgg ggtctgctcc gggggtcgcg gacgcggggc
101 cgggcggcgg agccggcgcc agag
151 
201 
251 
301 
351 
 401 
 451 
 501 
 551 
 601 
 651 
 701 
 751 
 801 
 851 
 901 
 951 
1001 
1051 ctccgtggg ccgctgccct tcctctcctg atgagtcaca
1101 ggctgcggtg ggcgctgcgg tcctggtggg gccgtgcggt gagggccgcg
1151 cgctgggagc cgcatgccct gggcccaggc ctgaccctgg taccgaagct
1201 gtggacgttc tcgccacact caaccccatg agcttccagc caaggatgcc
1251 ctggccgatt ggaaatgctg taaaatgcaa actaagttat tatatttttt
1301 tttggtaaaa aagaaatgtc cataggaaac aaaaaaaaaa aaaaaaaa
ORF粗体显示
SEQ ID NO 3：小鼠Meteorin样cDNA(NM_144797.3)
  1 agaggttcta ggggcagccg gcgcgcttct ctagttgcag cttgggcggc
 51 tcctgtggtg ggcggctagg ggcgagccgg gatgggctat agacgcgcga
101 cgtgatcagt tcgcacgcgg acccacgcct cccatcgctc tgcctcaaga
151 gcctattctg tgggtgcagg cacgcaccgg acgcagaccc ggccggagc
201 
251 
301 
 351 
 401 
 451 
 501 
 551 
 601 
 651 
 701 
 751 
 801 
 851 
 901 
 951 
1001 
1051 
1101 cttgc agggtgacac
1151 agtactgttg tccttcagat gagccatgtt ttgtgggctc agtcgctcta
1201 tcatatcctg atagagattg cagactggtg gcatgggccc agcctggtgc
1251 tagaactggg aaggtacatg ctgctctgac cccttaggtc ccagccaagg
1301 atgccctgac ccattggaac tgctgtaaaa tgcaaactaa gttattatat
1351 tttttttgta aaagatgcct tggtgtgcca tttaatagtg tttttacaaa
1401 gttattttca ggcattggat ttggcctggt atattggtgg gagctaggtt
1451 atggtgtgca gtgatggcta tggctcagcc ttgttattcc tgtgatggaa
1501 atgtatggag caaatacttt ctaatttccc cttcatttta ttttctattt
1551 taaaagacca tctttgccgt tgagaacctt tccagactgt atggaggctg
1601 ctcccattcc agggagtaaa gaccaggatc tgagactagt attacatcca
1651 tcttaaccca tcagatgggt acctgcattg aaccttctct gctcagctat
1701 ggcctgctgt cccaaagacc ttttgctctc tggacagttc cagatggtgc
1751 tgcctggctt aagggacttg ttcctccctt gctcctacca ggccactgtt
1801 gctttctgca tctgtcccac tgaaccagtc ttgtcctttg accctgagtt
1851 tccccaaatg cacacatcaa atccctgaat accaagggac taacctactt
1901 aatggcccat ttcttcagag ggtgtgggtt ttccctatag taagaaaatc
1951 tccacaagtt gaagcttaaa cagtaggctt tcgttcatac agtcctggaa
2001 gccagaatgg gtgtgagcag aatcacattt cctccggaga ctccaggagg
2051 gactttatag cttctggtga ctccaggaat ccttggcttg taacaatttc
2101 actctggcat tgctttccct gccatgtgac ttctgccttg tatgtgaggg
2151 cctgtatcaa atctctgtct tgggaggata cagatcattg acttagggcc
2201 cactccggtg acctcacctt cacctgaaat ttactcgatt tccatttagg
2251 tcagaggcaa aggctacaaa aaatatcaaa tccggagaaa gattcaatgg
2301 ttaggcactt gctactctta caaaggacct gtgttcgatt cccatgttgg
2351 gaactcatgt taggtggctt aaaattgcct ataactacaa ttccagggga
2401 tctagcaacc tcttctcgcc acacacaagc acacacacac acacacacac
2451 acacacacaa ttaaaaac
ORF粗体显示
SEQ ID NO 5：大鼠Meteorin样cDNA(NM_001014104.1)
  1 ggcagccggc gcgcttctct ggttgcagct tgggcggctg gggcggctcc
 51 tatggtgggc ggccaggggc tagacgggat ggcctgtaga cgcgcgacgt
101 gatcagctcg cacgcggacc cacgcctccc gcagcactgc ctcaacagtc
151 tattctgtgg gtgcaggcac gcaccggtct cagaccctgc cggagc
201 
251 
301 
351 
401 
451 
501 
551 
601 
651 
 701 
 751 
 801 
 851 
 901 
 951 
1001 
1051 
1101 cttgcagg gtgacaccgt
1151 actgctgtcc ttcagatgag ccatggctca gttgctctat caaatcccga
1201 tagagattgc agactggtgg catgagcccc gcctggtgct tgaactggga
1251 agggaggtac atgctgctct gaccccttag gtcccattca aggatgccct
1301 gacccattgg aaatgttgta aaatgcaaac taagttatta tatttttttt
1351 gtaaaagaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
ORF粗体显示
SEQ ID NO 13，人ORF
atgcggggcg cggcgcgggc ggcctggggg cgcgcggggc agccgtggcc gcgacccccc    60
gccccgggcc cgcccccgcc gccgctcccg ctgctgctcc tgctcctggc cgggctgctg    120
ggcggcgcgg gcgcgcagta ctccagcgac cggtgcagct ggaaggggag cgggctgacg    180
cacgaggcac acaggaagga ggtggagcag gtgtatctgc gctgtgcggc gggtgccgtg    240
gagtggatgt acccaacagg tgctctcatc gttaacctgc ggcccaacac cttctcgcct    300
gcccggcacc tgaccgtgtg catcaggtcc ttcacggact cctcgggggc caatatttat    360
ttggaaaaaa ctggagaact gagactgctg gtaccggacg gggacggcag gcccggccgg    420
gtgcagtgtt ttggcctgga gcagggcggc ctgttcgtgg aggccacgcc gcagcaggat    480
atcggccgga ggaccacagg cttccagtac gagctggtta ggaggcacag ggcgtcggac    540
ctgcacgagc tgtctgcgcc gtgccgtccc tgcagtgaca ccgaggtgct cctagccgtc    600
tgcaccagcg acttcgccgt tcgaggctcc atccagcaag ttacccacga gcctgagcgg    660
caggactcag ccatccacct gcgcgtgagc agactctatc ggcagaaaag cagggtcttc    720
gagccggtgc ccgagggtga cggccactgg caggggcgcg tcaggacgct gctggagtgt    780
ggcgtgcggc cggggcatgg cgacttcctc ttcactggcc acatgcactt cggggaggcg    840
cggctcggct gtgccccacg cttcaaggac ttccagagga tgtacaggga tgcccaggag    900
agggggctga acccttgtga ggttggcacg gactga                              936
SEQ ID No 14，小鼠ORF
atgcggggtg cggtgtgggc ggcccggagg cgcgcggggc agcagtggcc tcggtccccg    60
ggccctgggc cgggtccgcc cccgccgcca ccgctgctgt tgctgctact actgctgctg    120
ggcggcgcga gcgctcagta ctccagcgac ctgtgcagct ggaaggggag tgggctcacc    180
cgagaggcac gcagcaagga ggtggagcag gtgtacctgc gctgctccgc aggctctgtg    240
gagtggatgt acccaactgg ggcgctcatt gttaacctac ggcccaacac cttctcacct    300
gcccagaact tgactgtgtg catcaagcct ttcagggact cctctggagc caatatttat    360
ttggaaaaaa ctggagaact aagactgttg gtgcgggaca tcagaggtga gcctggccaa    420
gtgcagtgct tcagcctgga gcagggaggc ttatttgtgg aggcgacacc ccaacaggac    480
atcagcagaa ggaccacagg cttccagtat gagctgatga gtgggcagag gggactggac    540
ctgcacgtgc tgtctgcccc ctgtcggcct tgcagtgaca ctgaggtcct ccttgccatc    600
tgtaccagtg actttgttgt ccgaggcttc attgaggacg tcacacatgt accagaacag    660
caagtgtcag tcatctacct gcgggtgaac aggcttcaca ggcagaagag cagggtcttc    720
cagccagctc ctgaggacag tggccactgg ctgggccatg tcacaacact gctgcagtgt    780
ggagtacgac cagggcatgg ggaattcctc ttcactggac atgtgcactt tggggaggca    840
caacttggat gtgccccacg ctttagtgac tttcaaagga tgtacaggaa agcagaagaa    900
atgggcataa acccctgtga aatcaatatg gagtga                              936
SEQ ID NO 15，大鼠ORF
atgcggggtg tggtgtgggc ggcccggagg cgcgcggggc agcagtggcc tcggtccccg    60
ggccctgggc cgggtccgcc cccgccgcca ccgctgctgt tgctgctact gctgctgctg    120
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cgggaggcac acagcaagga ggtggagcag gtgtacctgc gctgctcagc aggctctgtg    240
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tgcaccagtg actttgttgt ccgaggcttc atcgaggatg tcacccatgt accagaacag    660
caagtgtcag tcattcacct acgggtgagc aggctccaca ggcagaagag cagggtcttc    720
cagccagctc ctgaggacag tggccactgg ctgggccatg tcacaacact gttgcagtgt    780
ggagtacgac cagggcatgg agaattcctc ttcactggac atgtgcactt tggggaggca    840
caacttggat gtgccccacg ctttagtgac tttcaaaaga tgtacaggaa agcagaagaa    900
aggggcataa acccttgtga aataaatatg gagtga                              936
SEQ ID NO 16，人CDS成熟METRNL
cagtactcca gcgaccggtg cagctggaag gggagcgggc tgacgcacga ggcacacagg    60
aaggaggtgg agcaggtgta tctgcgctgt gcggcgggtg ccgtggagtg gatgtaccca    120
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gtgtgcatca ggtccttcac ggactcctcg ggggccaata tttatttgga aaaaactgga    240
gaactgagac tgctggtacc ggacggggac ggcaggcccg gccgggtgca gtgttttggc    300
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acaggcttcc agtacgagct ggttaggagg cacagggcgt cggacctgca cgagctgtct    420
gcgccgtgcc gtccctgcag tgacaccgag gtgctcctag ccgtctgcac cagcgacttc    480
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ccacgcttca aggacttcca gaggatgtac agggatgccc aggagagggg gctgaaccct    780
tgtgaggttg gcacggactg a                                              801
SEQ ID NO 17，小鼠CDS成熟METRNL
cagtactcca gcgacctgtg cagctggaag gggagtgggc tcacccgaga ggcacgcagc    60
aaggaggtgg agcaggtgta cctgcgctgc tccgcaggct ctgtggagtg gatgtaccca    120
actggggcgc tcattgttaa cctacggccc aacaccttct cacctgccca gaacttgact    180
gtgtgcatca agcctttcag ggactcctct ggagccaata tttatttgga aaaaactgga    240
gaactaagac tgttggtgcg ggacatcaga ggtgagcctg gccaagtgca gtgcttcagc    300
ctggagcagg gaggcttatt tgtggaggcg acaccccaac aggacatcag cagaaggacc    360
acaggcttcc agtatgagct gatgagtggg cagaggggac tggacctgca cgtgctgtct    420
gccccctgtc ggccttgcag tgacactgag gtcctccttg ccatctgtac cagtgacttt    480
gttgtccgag gcttcattga ggacgtcaca catgtaccag aacagcaagt gtcagtcatc    540
tacctgcggg tgaacaggct tcacaggcag aagagcaggg tcttccagcc agctcctgag    600
gacagtggcc actggctggg ccatgtcaca acactgctgc agtgtggagt acgaccaggg    660
catggggaat tcctcttcac tggacatgtg cactttgggg aggcacaact tggatgtgcc    720
ccacgcttta gtgactttca aaggatgtac aggaaagcag aagaaatggg cataaacccc    780
tgtgaaatca atatggagtg a                                              801
SEQ ID NO 18，大鼠CDS成熟METRNL
cagtactcca gcgacctgtg cagctggaag gggagtgggc tcacccggga ggcacacagc    60
aaggaggtgg agcaggtgta cctgcgctgc tcagcaggct ctgtggaatg gatgtaccca    120
accggggcgc tcattgttaa cctacggccc aacaccttct cacctgccca gaacttgact    180
gtgtgcatca agcctttcag ggactcctct ggggccaata tttatttgga aaaaactgga    240
gaactaagac tgttggtgcg ggatgtcaga ggcgaacctg gccaagtgca gtgcttcagc    300
ctagagcagg gaggcttatt tgtggaggcc acaccccagc aggacatcag cagaaggacc    360
acaggcttcc agtatgagct gatgagtggg cagaggggac tggacctgca cgtgctctct    420
gccccctgtc gaccttgcag cgacactgag gtcctccttg ccatctgcac cagtgacttt    480
gttgtccgag gcttcatcga ggatgtcacc catgtaccag aacagcaagt gtcagtcatt    540
cacctacggg tgagcaggct ccacaggcag aagagcaggg tcttccagcc agctcctgag    600
gacagtggcc actggctggg ccatgtcaca acactgttgc agtgtggagt acgaccaggg    660
catggagaat tcctcttcac tggacatgtg cactttgggg aggcacaact tggatgtgcc    720
ccacgcttta gtgactttca aaagatgtac aggaaagcag aagaaagggg cataaaccct    780
tgtgaaataa atatggagtg a                                              801
实施例2.获得METRNL多肽和METRNL多肽的功能测试
方法
序列分析.同源搜索用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast/)并浏览Ensembl Genome Browser(http://www.ensembl.org/index.html)来进行。氨基酸序列的比对用CLUSTAL W(1.7)(Thompson et al(1994)NucleicAcids Res.22，4673-4680)进行，该程序含在Sci Ed Software(Cary，NC)出品的Clone Manager 9专业版程序包中。信号肽切割位点的预测用SignalP(Bendtsen et al(2004)，J.Mol.Biol.340，783-795)(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行。
克隆.带有C端组氨酸标签(GSGSGSHHHHHH；SEQ ID NO 26)的来自小鼠(NM_144797)和人(NM_001004431)的Meteorin样蛋白的编码序列由GenScript(NJ，USA)合成，并PCR克隆到pNS 1n中的BamHI/XhoI(Jensen etal.，2002)。所有的构建体通过DNA测序进行了确认(MWG Biotech AG，Germany)。
细胞培养.HEK293细胞在补充有10％FCS(Seromed，S 0115)的DMEM(Invitrogen，41965-039)中贴壁培养生长。转染使用LipofectAMINE 2000(LifeTechnologies，11668-027)根据制造商的使用说明进行。细胞在5％CO2湿润气氛下在37℃孵育。
SDS-PAGE和Western印迹.细胞裂解物和条件化培养基的制备如前所述(Fjord-Larsen et al(2005)，Exp.Neurol.195，49-60)。将样品装载在15％均质SDS PAGE凝胶(Amersham Pharmacia，Sweden)上，电泳并电转到PVDF膜上。用0.2μg/ml的抗HIS(C-末端)(Invitrogen，R930-25)作为第一抗体，HRP-连接的抗-小鼠Ab(Dako，P0260，1∶2000)作为第二抗体，检测带HIS标签的重组Meteorin样蛋白。或者，凝胶用GelCode蓝染色剂(Pierce，24590)根据制造商的使用说明进行染色。
重组小鼠Meteorin样蛋白的制备.FreeStyleTM 293-F细胞(Invitrogen，K9000)借助Lipofectamine  2000(Life Technologies，11668-027)用pNS1n-mMETRNL-HIS DNA转染。培养物在37℃和8％CO2下震荡孵育4天，并通过离心分成细胞沉淀和上清。上清过滤除菌，并用TALON金属亲和树脂(Clonetech，635502)随后用PD-10凝胶过滤(GE Healthcare，17-0851-01)纯化重组蛋白。
RP-HPLC.反相色谱在C4柱(1x 150mm，Phenomenex Jupiter，C4，5μm，)上进行。洗脱采用溶于0.1％TFA的乙腈的线性梯度(60分钟内0-100％)，流速为50μl/min。在214nm进行检测。
质变谱.基质辅助激光解吸/离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱如前所述(Ylonen et al.，1999)。对于肽质量指纹图谱分析，将mMETRNL蛋白还原并用碘乙酰胺烷基化，用胰蛋白酶消化后进行分析。
DRG培养.大鼠P5背根神经节用补充有1.2ma/ml胶原酶D(Roche)和4.8mg/ml分散酶(Roche)的木瓜蛋白酶解离系统(Papain Dissociation System)(Worthington Biochemical Corp，US)解离。随后，将细胞以1.5x 104细胞/em2的细胞密度铺在多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的24孔板上，置于含5％热失活马血清(Seromed)的DMEM/F12培养基(Invitrogen)中。1小时后，当细胞已经附着时，将培养基换成含1％庆大霉素(Invitrogen)和如示明地添加了重组小鼠Meteorin样蛋白或大鼠NGF(R&D Systems，556-NG)的无血清DMEM/F12。细胞在37℃和5％CO2下孵育1天，用4％PFA固定。对固定了的培养物进行免疫细胞化学分析，使用以1∶15.000稀释于含1％正常马血清和0.1％Triton X-100的PBS溶液中的β-III-微管蛋白抗体(Sigma，T-8660)，随后用生物素化的第二抗体(马抗小鼠)，再用ABC Elite试剂盒(VectorLaboratories)，之后用3′3′-二氨基联苯胺(DAB)作为色素原进行颜色反应。每个细胞的神经突长度用VisioMorph图像分析进行定量。使用来自一式三重复的孔的至少9个图像。
SVZ外植体.P2-P3新生大鼠通过断头处死。切除脑并置于冷的Neurobasal培养基(Gibco-Invitrogen，Carlsbad，CA)中，用振动切片机获得250μm厚的脑切片。从侧脑室的前角(anterior horn)的侧壁切除SVZ，并切成直径150-200μm的薄片。SVZ外植体与基质胶(Becton Dickinson)以1∶5的比例混合，并培养于4孔板(four-multiwell plate)中。在500μl补充有B-27(Gibco-Invitrogen)的37℃Neurobasal培养基中多聚体化(25min)后，向对照培养物(control cultures)中添加N2-因子(Gibco-Invitrgen)和青霉素/链霉素(Gibco-Invitrogen)。其它条件使用相同的培养基，但具有不同浓度的小鼠METRNL(20ng/ml-200ng/ml)。培养物保持在湿润的5％CO237℃培养箱中。
免疫荧光.24h后，SVZ外植体用PBS清洗并用含4％PFA、0.05％Triton-X 100的PBS溶液固定15分钟。外植体用含有PBS、2％马血清、1％BSA、0.1％明胶、0.1％Triton X-100和0.05％Tween 20的封闭缓冲液孵育1小时。外植体在室温下用山羊抗-DCX(1∶100，Santa Cruz)孵育1小时。用PBS漂洗外植体，并在室温下用Cy3偶联的抗山羊第二抗体(1∶200，JacksonImmunoResearch)孵育1小时。用PBS漂洗切片，装载到玻璃片上并盖上盖玻片(cover-slipped)。
细胞迁移的定量.24h后，用DIC显微镜监视外植体，用AxioVision软件(Zeiss)测量从每个外植体出发的迁移链(migratory chains)的长度。测量外植体边缘和可辨识的迁移前沿之间的距离，然后相对于从对照测量获得的数值进行标准化。实验进行两个独立的测定。
对室下区(SVZ)外植体进行FITC-鬼笔环肽测定
如前所述地从P2-P5大鼠幼仔分离SVZ组织并培养。外植体用20ng/mlMETRNL或10ng/ml SDF1a刺激24小时，并在用4％PFA/0.05％Triton-X固定之前再刺激1小时。固定后，用PBS清洗外植体，并用1∶50稀释的FITC-鬼笔环肽(Invitrogen)染色20分钟。将染色的外植体装载到玻片上，并用荧光显微镜显现。
对SVZ衍生的细胞单层进行FITC-鬼笔环肽测定
SVZ组织从P2-P5大鼠幼仔分离并用accutase孵育15分钟以解离细胞。Accutase处理后，用玻璃巴斯德吸管解离细胞，计数后置于包被有鸟氨酸/纤连蛋白的玻璃盖玻片上。将SVZ细胞保持在补充有B-27、N2补充物、谷氨酰胺和青链霉素(pen-strep)的神经基础培养基中。24小时后，用20ng/mlMETRNL或10ng/ml SDF1-a刺激细胞1小时，然后用4％PFA/0.05％Triton-X固定。固定之后，用PBS洗涤细胞，并用1∶50稀释的FITC-鬼笔环肽(Invitrogen)染色20分钟。将染色后的细胞装载到玻片上，并用荧光显微镜显现。
重组人METRNL的制备
FreeStyle 293F细胞用表达密码子优化的带HIS标签的人METRNL的pNS1n转染。细胞培养和纯化如前所述。
结果
Meteorin样蛋白和Meteorin构成一个新的分泌蛋白家族
人METRNL和METRN蛋白有42％相同，并且成熟序列10个半胱氨酸残基中10个均是保守的(图1和3)。来自各种生物的EST和基因组序列分析提示METRNL在所有脊椎动物中，包括斑马鱼和非洲爪蟾在内，均有直系同源物，而在无脊椎动物例如果蝇(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))和线虫(秀丽线虫(Caenorhabditis elegans))中则没有发现直系同源物(图3)。
SignalP预测人、小鼠和大鼠METRNL中存在一个N端信号肽，其在A45和Q45之间有一个预测的切割位点。
克隆人和小鼠METRNL的带C端HIS标签版本，并在HEK293细胞中瞬时转染。图4可以显见，两种分子均被产生和分泌。hMETRNL移动到预期的31.2kDa，但mMETRNL移动到更高的分子量。
重组mMETRNL的产生
为了能够研究METRNL的生物化学性质，在FreeStyleTM 293-F细胞中产生重组蛋白。从图5A可以显见，转染后，mMETRNL-HIS蛋白在条件化培养基中连续积累到转染后96小时。因此，在放大培养中，在转染后96小时收集条件化培养基，通过TALON树脂结合纯化重组mMETRNL-HIS。从图5B中对纯化蛋白质的SDS-PAGE分析可见，只存在一条与GelCode蓝染色检测到的单一条带大小相当的抗-HIS免疫反应条带。同样，mMETRNL-HIS移动到比预期31.2kDa大一些的分子量。进一步通过反相色谱对纯化蛋白质进行分析。从色谱图上显然可见(图 5C)，mMETRN-HIS呈单一主峰洗脱，杂质极少。≥级分31的肩(shoulder)是异源糖基化蛋白的典型特征。为了研究糖基化，纯化后的重组蛋白用不同的去糖基化酶及其组合进行孵育。从图5D显见，用N-聚糖酶处理可以使分子量降低，而添加其它的去糖基化酶不会进一步降低分子量。这意味着mMETRNL是仅具有N-连接寡糖的糖蛋白。
最后，将纯化蛋白的胰蛋白酶肽质量指纹与带组氨酸标签的mMETRNL的理论计算机模拟(in silico)消化物进行比较。这样，检测范围(800-3500Da)内的序列的主要部分被确认，但是没有1272.5Da的胰蛋白酶切肽--如果信号序列如所预期地在A45和Q46之间切割的话，这个胰蛋白酶切肽预期应当存在。然而，如果在N端是谷氨酰胺残基，则它可以自发或酶促环化形成吡咯烷酮羧酸，其导致质量减少17Da。因此，这会导致形成1255.5Da的胰蛋白酶切N端肽，而这个质量的确出现在所产生的肽质量的列表中。由此可见，成熟的mMETRNL从被环化的Q46开始。通过比对人、牛、小鼠、大鼠、鸡、非洲爪蟾和斑马鱼的METRNL可以显见(图3)，成熟蛋白质的N端谷氨酰胺在整个发展(development)中是保守的。
METRNL是神经营养性的
为了研究mMETRNL的神经营养作用，将纯化的蛋白质添加到大鼠P5的解离背根神经节(DRG)培养物中。确实，Meteorin样蛋白可促进神经突长出(图6)，其能力与NGF相当。当没有营养支持时，从DRG细胞的神经突生长非常有限，但是在NGF或mMETRNL存在下，会从β-III-微管蛋白阳性神经元形成长的神经突。所观察到的作用包括提高神经细胞的生存、提高神经细胞的再生和神经细胞的分化。
在该测定中作用表明了在ALS、根损伤、根性撕脱、臂神经损伤、外周神经病和神经痛方面的治疗潜力。
一般地，神经营养因子负责在发育期间神经元的生长和生存，并维持成年神经元。而且，这些因子还能够修复特定的被损伤神经元群体，因此具有逆转中枢神经系统的疾病治疗潜力，此类包括阿尔茨海默病(Schindowski etal(2008).Genes Brain Behav.7Suppl 1，43-56)、帕金森病(Evans et al(2008)，Expert.Opin.Ther.Targets.12，437-447)和侧索硬化(Ekestern(2004)Neurodegener.Dis.1，88-100)。
METRNL以剂量依赖的方式增加来自大鼠SVZ的成神经细胞的神经元迁移
METRNL所导致对背根神经节神经突生长的作用(图6)提示该蛋白在细胞膜重塑(remodelling)水平上具有功能。若果真如此，则还可以想见METRNL应当会影响迁移细胞(例如来自SVZ的成神经细胞)的行为，如果这些细胞表达转导由METRNL存在所触发的信号的体系的话。为了研究其在成神经细胞迁移中可能的功能，将纯化的重组METRNL添加到培养在三维细胞外基质(基质胶)中的大鼠SVZ外植体中。METRNL的存在以剂量依赖的方式导致细胞迁移显著增加，其中与对照条件相比，200ng/ml浓度的METRNL可以使迁移距离增加大约50％(图7)。因为来自SVZ的外植体具有异源成分，所以重要的是鉴定哪些细胞响应于METRNL。因此，用针对一种由迁移的成神经细胞表达的标记物--双皮质素(Doublecortin)(DCX)的特异抗体进行免疫染色。结果揭示，显示迁移增加的细胞是成神经细胞而非星形胶质细胞(图7)。
METRNL增加SVZ来源的成神经细胞的神经元迁移
为了确认METRNL对成神经细胞迁移的作用，将纯化的重组小鼠METRNL添加到培养在三维细胞外基质(基质胶)中的大鼠SVZ外植体中。小鼠METRNL的存在导致细胞迁移以剂量依赖的方式显著增加。与对照条件相比，200ng/ml浓度的METRNL几乎使迁移距离加倍(图 8A)。增加METRNL浓度到2000ng/ml没有进一步增加迁移。迁移细胞被鉴定为成神经细胞，因为它们是双皮质素(DCX)阳性并且胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)阴性的(图8B)。
肌动蛋白多聚体化为细胞迁移提供了基础机制。这可以容易地通过用偶联有FITC的能结合肌动蛋白的鬼笔环肽孵育，随后进行荧光显微镜观察来加以监视。从图9可以显见，用METRNL刺激导致外植体和单层培养的SVZ成神经细胞中的肌动蛋白多聚体化增加与阳性对照SDF1a相同的程度。在外植体培养物中非常清晰地显示了细胞如何彼此相互利用作为基底来形成长链细胞，这是成神经细胞迁移(链迁移)的典型特征。肌动蛋白多聚体化的增加和迁移模式进一步证明了METRNL在促进成神经细胞迁移中的作用。此外，与对照相比，DCX阳性成神经细胞的数目在同时具有METRNL和SDF-1的培养物中增加，指示了神经发生的证据。有关SDF-1对神经发生的作用已有很多描述，并且因为受METRNL刺激的培养物中DCX+成神经细胞的数目和迁移方式与SDF-1培养物难以区分，所以可以得出结论，METRNL对神经发生和成神经细胞迁移均具有正面作用，虽然在这些实验中没有尝试定量成神经细胞的数目。
成熟的小鼠和人METRNL具有78％同一性。为了证明这两个分子具有相似的生物学活性，向大鼠SVZ外植体添加人重组METRNL。确实，从图10可以显见，人METRNL也促进成神经细胞迁移。
这些结果提示，METRNL在成神经细胞迁移中具有刺激作用，这种作用是有前景的。所观察到的结果还可包括神经细胞生存的改善和神经发生的增强。
该蛋白质的递送对于可受益于损伤区域招募新神经元的神经退行性疾病例如卒中、PD、HD、ALS和阿尔茨海默病等的治疗具有潜在的用处。
分泌性因子似乎对治疗目的的研究特别有用，因为一旦它们能够影响细胞如何增殖、迁移和分化，它们就可能影响具有高组织修复潜力的迁移细胞。如果能够获得假设的因子加以测试，可以使用一系列允许快速读出和核实的实验体系作为方法研究其功能。在这里，我们使用Wichterle(Wichterle et al(1997)，Neuron 18，779-791)介绍的方法，其包括从小鼠SVZ制备组织外植体，并将它们埋置在由胶原IV、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白(entactin-nidogen)构成的三维细胞外基质凝胶中。一旦将SVZ外植体埋置在基质胶中，就可以将它们保持在存在要测试的因子的培养物中，并可以在不同时间点监视迁移。在标准条件下，迁移成神经细胞从外植体放射状离开，形成链，因为它们彼此相互利用作为迁移的底物。根据测量的时间点，这些迁移链可以从1-5个细胞宽度到高达600μm长，显示平均速度为122μm/小时(Wichterle et al.，1997)。当进行因子、抑制剂或转基因组织分析时，可以考虑这些参数以进行定量测量并与对照条件进行比较(Hack et al(2002)Nat.Neurosci.5，939-945；Alberti et al(2005)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102，6148-6153；Chiaramello et al(2007)，Eur.J.Neurosci.26，1780-1790)。这些方法特别便于筛选可能用于治疗涉及SVZ处的受调节细胞迁移(regulated cellmigration)的神经退行性疾病的因子，因为测试细胞正是来自于这个区域，而不是来自含有在相同条件下具有不同行为模式的不同细胞类型的区域。
实施例2A：METRNL保护致聋豚鼠免于听力丧失
材料和方法
实验设计概观如图11A所示。最初，测试18只豚鼠(白化)的短声诱发的(click-evoked)听性脑干反应(ABR)，考察其正常的听力，并分成如下三个实验组：
1.用METRNL处理的正常听力动物
2.用METRNL处理的3周致聋动物
3.用人工外淋巴(AP)处理的3周致聋动物
组1：在0时，6只正常听力豚鼠接受与微型渗透泵连接的用于内耳灌注METRNL的插管和用于监视脊髓神经节神经元的电响应的耳蜗植入体(Maruyama et al.，Neurobiol Dis.25，309-318，2007)。动物用AP处理2天，随后用1μg/ml METRNL的AP溶液处理2周，以0.5μl/h输送。
组2：在最初的ABR测试(时间＝-21天)后，通过鼓膜用10％新霉素向两耳单次注射。7和14天后，测量短声-ABR以研究致聋后阈值。目的是获得＞60dB的阈值迁移，指示非常严重的听力丧失。6只动物中有1只没有＞60dB的阈值，因此被排除在实验之外。致聋3周后(时间＝0)，5只动物进行了外科手术，接受了耳蜗植入体和与微型渗透泵连接的导管。AP处理动物2天后，用METRNL处理2周，如上所述。
组3：如组2一样致聋动物，同样有1只动物由于没有被有效致聋而被排除在外。剩余5只动物在t＝0接受耳蜗植入体，并且在研究的其余全部过程中用AP处理。
对于所有组，在手术后2、9和16天测量电引发的听性脑干反应(eABR)。
结果
METRNL在体内对脊髓神经节生存和电响应具有正作用
为了确认METRNL对内耳感觉上皮和相关神经节损伤(包括但不限于噪声诱发的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传和耳蜗前庭萎缩、梅尼埃病和相关症状)的治疗的效果，在耳聋动物模型中对METRNL进行测试。简而言之，豚鼠用单剂量的新霉素致聋，在3周后通过蛋白灌注用METRNL处理(图11A)。手术后2、9和16天记录电听性脑干反应(eABR)，以监视与不同处理相关的阈值改变(图11B)。用METRNL处理的正常听力豚鼠的阈值在整个实验期间稳定(～50μA)，表明METRNL对听力没有有害作用。在2个致聋组中，第一次记录的阈值提高，表明听力严重降低。重要的是，在用人工淋巴处理的对照组中，eABR阈值持续升高，而相比之下，处理16天后，METRNL处理组显示统计学显著地(p＜0.05)更低的阈值。这提示METRNL在体内对脊髓神经节神经元生存和它们的电响应性具有正作用。这是一项短期研究，更长期的处理预期可以更进一步地提高听力(Maruyamaet al.，Neurobiol Dis.2008Jan；29(1)：14-21)。因此，METRNL可用于治疗对内耳感觉上皮和相关神经节的损伤，包括但不限于，噪声诱发的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传和耳蜗前庭萎缩、梅尼埃病和相关症状。
实施例3：保护小脑颗粒细胞免于谷氨酸盐毒性
生存作用测试的进行通过用重组METRNL处理小脑颗粒细胞培养物，随后暴露于有毒浓度的谷氨酸盐，大体上如文献所述(Daniels and Brown，2001；J.Biol.Chem.276：22446-22452)。
从7-8日龄小鼠幼仔切除小脑颗粒神经元(CGN)。从新鲜切除的小脑通过在胰蛋白酶和DNA酶存在下进行酶分解而解离出细胞，然后以1-2×106细胞/cm2的密度植入聚-D-赖氨酸预包被的24孔板(Nunc)，置于补充有10％热失活胎牛血清的DMEM培养基中。细胞在湿润气氛下37℃培养，24h后向培养基添加胞嘧啶阿拉伯糖苷(10μM)以终止非神经元细胞的生长。
在DIV1，培养物用系列稀释的重组METRNL处理，对平行的培养物给予PBS作为阴性对照。培养基每天更换。在DIV5，向培养物添加谷氨酸盐(0.1-1mM)，再过2天后，用MTT测定法测定细胞生存。MTT被还原成甲 的程度在570nm下通过分光光度计测量。简而言之，除去培养基，用钠盐水溶液(140mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2.6H2O，1mM NaH2PO4，1.5mM CaCl2，5.6mM葡萄糖，20mM HEPES，pH 7.4)洗涤细胞，然后向细胞添加在使用前临时配制并保存在黑暗钠盐水溶液中的MTT(终浓度0.5mg/ml)。37℃孵育3h后，添加等体积的酸性异丙醇(0.04M HCl异丙醇溶液)，在室温下完全混合，直至所有的甲体全部融解。细胞生存能力表示为对照细胞光密度的百分比。平行培养物不进行处理。
实施例4，保护小脑颗粒细胞免于钾剥夺引发的细胞凋亡
通过用系列稀释的重组METRNL处理经钾剥夺的小脑颗粒细胞培养物进行生存作用的测试，大体上如文献所述(Nomura et al.，2001；Dev.Neurosci.23：145-152)。
从P8NMRI小鼠幼仔切除小脑颗粒神经元(CGN)。通过在胰蛋白酶和DNA酶存在下进行酶分解从新鲜切除的小脑解离细胞，然后以4.4×105细胞/cm2的密度植入聚-L-赖氨酸包被的48孔板(Nunc)，置于含有25mM KCl并补充有10％热失活胎牛血清、2mM谷氨酰胺和100g/ml庆大霉素的Eagle基础培养基(BME)中。细胞在湿润气氛下37℃培养，24h后向培养基添加胞嘧啶阿拉伯糖苷(10μM)以终止非神经元细胞的生长。
在DIV2，通过将细胞转移到含5mM KCl并补充有2mM谷氨酰胺和100g/ml庆大霉素和胞嘧啶阿拉伯糖苷的无血清BME(低钾培养基)中，诱导未成熟培养物的细胞凋亡。向孔内添加系列稀释的重组METRNL，对平行的培养物给予PBS作为阴性对照，或接受100ng/ml胰岛素样生长因子-1(IGF-1)作为阳性对照。为了确定由钾剥夺诱发的细胞死亡，用含25mMKCl的培养基孵育的培养物作为参考。
在DIV3用MTS测定法测量生存。
在DIV8，通过将细胞转移到含5mM KCl的无血清低钾培养基中，诱导已分化(神经元)培养物的细胞凋亡。添加不同浓度的METRNL，并包括与上述相同的对照培养物。在24-72h后用MTS测定法测定生存情况。
MTS测定使用CellTiter水成非放射性细胞增殖测定系统(AqueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay)(Promega)遵循制造商的使用说明来进行。
该测定被看作是用于神经保护作用的通用测定法，并被看作是一种预测因子在治疗小脑疾患中是否具有治疗潜力的测定。
实施例5，对运动神经元培养物的作用
简而言之，切除胚龄12.5天(E12.5)的小鼠胚胎的脊髓并加以解离。按照基于运动神经元免疫亲和纯化的规程纯化运动神经元，其中使用针对神经营养蛋白受体p75的胞外域的抗体，随后用磁性微珠进行细胞分选(Arce et al.1999J Neurosci Res 55：119-126)。将纯化的运动神经元以每孔1000个细胞的密度接种在用多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的4孔组织培养皿(Nunc)上。培养基是补充有B27补充物(Life Technologies)、马血清(2％v/v)、L-谷氨酸盐(0.5mM)和2-巯基乙醇(25μM)的神经基础培养基(Life Technologies)。
在接种时添加系列稀释的重组METRNL，对平行的培养物给予PBS作为阴性对照。培养2天后对运动神经元的生存情况进行定量，方法是计数两个重复皿的中心处1.5cm2预定面积内的具有长轴突突出的大的、相明亮(phase-bright)的神经元的数目。
该测定中的保护作用提示了在运动神经元疾病包括ALS、脊髓损伤、SMA(脊髓肌肉萎缩)、DMD(肌营养不良)中的治疗潜力。
实施例6：多巴胺能神经营养活性的生物学测定
培养条件：
解离的中脑细胞培养物的制备如前所述(Friedman and Mytilineou 1987Neurosci.Lett.79：65-72)，进行了微小的修改。简而言之，对妊娠第13-16天的Sprague-Dawley大鼠胚胎在无菌条件下在显微镜下切除脑的中脑盖吻侧(rostral mesencephalic tegmentum)，收集在无Ca2+-和Mg2+的Dulbecco磷酸缓冲盐水(Gibco，Gaithersburg，Md.)中，并通过温和研磨机械解离。将细胞以每孔100μl置于含有400μl培养基的16-mm直径组织培养孔(Falcon，LincolnPark，N.J.，24-well plate)中，密度为每孔2.5-3.5x105个细胞。培养孔在先前已暴露于37℃的0.1mg/ml多聚-L-鸟氨酸溶液(于10mM硼酸钠(pH 8.4)中)3小时，在milli-Q H2O中清洗3次，并在Earle平衡盐溶液(Gibco)中清洗1次。滋养培养基(10/10)由补充了如下物质的最低必需培养基(MEM，Gibco)构成：葡萄糖(33mM)，碳酸氢钠(24.5mM)，谷氨酰胺(2mM)，HEPES(15mM)，青霉素G(5U/ml)，链霉素(5μg/ml)，10％热失活胎牛血清(Gibco)和10％热失活马血清(Gibco)。培养物在含有6.5％CO2的水饱和气氛中37℃保存。3小时后，当大多数细胞已经贴附在孔底部时，用500μl新鲜培养基替换该培养基。此时，一式二份地向各个孔添加待测试多巴胺能神经营养活性的样品的系列稀释物(METRNL蛋白溶液)，并将平板在37℃孵育箱中孵育。1周后，用氟代脱氧尿苷(13μg/ml)和尿嘧啶核苷(33μg/ml)对培养物处理24小时，以防止过度的神经胶质增殖，随后添加没有胎牛血清的上述培养基。滋养培养基每周更换。
作为备选方式，使用化学限定的无血清培养基，其中用蛋白质、激素和盐的混合物代替血清。限定培养基(DM)由MEM和F12营养混合物(均购自Gibco，1∶1；vol/vol)与葡萄糖(33mM)，谷氨酰胺(2mM)NaHCO3(24.5mM)，HEPES(15mM)的混合物构成，并补充运铁蛋白(100μg/ml)，胰岛素(25μg/ml)，腐胺(60μM)，黄体酮(20nM)，亚硒酸钠(30nM)，青霉素G(5U/ml)和链霉素(5μg/ml)。通过添加milli-Q H2O.(110-125ml H2O/l)将DM的摩尔渗透压浓度调节到325。
多巴胺能神经元的功能状态可以在这些培养物中如下地进行测定，即通过测量通过多巴胺能神经元中特异的“清道夫”转运蛋白被摄取的多巴胺，并用免疫组织化学统计多巴胺合成酶酪氨酸羟化酶阳性的神经元的数目，如Karlsson et al，2002，Brain Res.2002Nov 15；955(1-2)：268-80所述。
样品制备：
在中脑细胞培养物中测定多巴胺能神经营养活性之前，如下地对所有条件化培养基样品进行脱盐。将100μl培养基10/10(作为载体)添加到Centricon-10(Amicon)，静置10分钟。将等量的待测样品添加到Centricon中，随后加入1ml不含碳酸盐但含有10mM HEPES，pH 7.2(溶液A)的Dulbecco高葡萄糖调节Eagle培养基，5,000xg离心70分钟。用新鲜的溶液A将保留物(大约0.1ml)体积返回至1.1ml，并重新离心2次。在添加到培养孔之前，将样品过滤通过0.11μm Ultrafree-MC无菌Durapore单位(Millipore，Bedford Mass.)。
3H-多巴胺吸收：
在第6或第7天进行氚示踪多巴胺(3H-DA)的摄取，如前所述(Friedmanand Mytilineou(1987)Neurosci.Lett.79：65-72)，并进行了微小的修改。所有的溶液保持在37℃。简而言之，移出培养基，用0.25ml摄取缓冲液漂洗2次，其中摄取缓冲液由Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液pH 7.4构成，含有5.6mM葡萄糖，1.3mM EDTA，0.1mM抗坏血酸和0.5mM帕吉林(一种单胺氧化酶抑制剂)。培养物用0.25ml 50nM3H-DA(New England Nuclear，Boston，Mass.比活性36-37Ci/mmol)37℃孵育15分钟。通过移出孵育混合物终止3H-DA摄取，然后用0.5ml吸收缓冲液清洗细胞两次。为了从细胞释放3H-DA，培养物用0.5ml 95％乙醇在37℃孵育30min，然后添加到10ml EcoLite(ICN，Irvine，Calif.)中，并用液体闪烁计数器计数。通过向摄取缓冲液添加0.5mMGBR-12909(RBI)(一种多巴胺神经元高亲和性吸收泵的特异抑制剂)(Heikkila et al.1984Euro J.Pharmacol.103：241-48)获得空白值。
与对照处理相比，TH阳性神经元数目的增加和/或3H-多巴胺摄取的增加提示METRNL在治疗帕金森病中可能的功能。
实施例7：在大鼠纹状体内6-OHDA损伤模型中评估对黑质多巴胺神经元的神经保护
按文献描述制备VSV-G假型化(rLV)载体(Zufferey et al.，1997，J.Virol，73：2886-2892；Rosenblad et al.2000Mol Cell Neurosci.15(2)：199-214)。简而言之，携带绿色荧光蛋白(GFP)或METRNL cDNA的转移质粒pHR’CMV-W与辅助质粒pMD.G和pCMVDR8.91共转染到293T细胞中。在转染后第2和3天收集含有病毒粒子的上清，通过116000g超离心浓缩。rLV-GFP载体储液的滴度通过在293T细胞上对浓缩上清进行系列稀释加以确定。rLV-METRNL和rLV-GFP病毒储液的病毒颗粒滴度用RNA条形印迹(slotblot)技术如前人所述地加以确定(von Schwedler et al.1993Virol.67(8)：4945-55)，并且由rLV-GFP的TU和病毒颗粒滴度之间的比值估计rLV-METRNL载体的滴度TU/ml。
所有本工作涉及的实验动物均根据实验动物使用伦理委员会的规定进行管理。大鼠放在12：12h光亮/黑暗循环中，可自由摄取鼠食和水。使用雌性Sprague-Dawley大鼠(手术时～220g)。为了进行立体定位手术，将动物用异氟烷(Baxter)麻醉，将总共2x105TU/只的rLV-GFP(n＝8)或rLV-METRNL(n＝8)病毒储液注射到右侧纹状体中的两块区域(tract)(1，2)和黑质上方的一块区域(3)，坐标如下：(1)AP＝+1.4mm，ML＝-2.6mm，DV＝-5.0and-4.0mm，Tb＝-2.3，(2)AP＝0.0mm，ML＝-3.7mm，DV＝-5.0and-4.0mm，Tb＝-2.3，和(3)AP＝-5.2mm，ML＝-2.0mm，DV＝-6.8mm，Tb＝-2.3。2周后，再次将动物麻醉，并置于立体定位架内。在如下坐标处向右侧纹状体内注射6-羟基多巴胺(20μg[以游离碱计]/3μl溶媒[含0.2％抗坏血酸的盐水])：AP＝+1.0mm，ML＝-3.0mm，DV＝-5.0mm，Tb＝-2.3。
在损伤后第4周，动物用戊巴比妥(70mg/kg，Apoteksbolaget，Sweden)深度麻醉，并在室温下用50ml盐水，随后用200ml冰冷磷酸盐缓冲的4％多聚甲醛(pH 7.2-7.4)经心脏(transcardially)进行灌注。脑在相同固定剂中后固定(postfix)3-6小时，转移到30％蔗糖中24小时，并在冷冻切片机上切成6组40μm厚的切片。
如前所述地进行免疫组织化学(Rosenblad et al.2000Mol Cell Neurosci.15(2)：199-214)以检测黑质中的多巴胺能神经元(酪氨酸羟化酶(TH)和囊泡单胺转运蛋白(VMAT)-免疫反应性的)。通过立体定位细胞计数方法估计每只实验组动物损伤处与对照侧中的TH-IR和VMAT-IR黑质神经元的数目。
METRNL处理组与GFP对照组相比存活TH-IR神经元的数目增加是在治疗帕金森病中发挥功能的强力指示。VMAT-IR数目的增加进一步强化这一结论。
实施例8：hMETRNL对人神经前体细胞分化的作用
hNS1细胞中的测试
hNS1(先前称作HNSC.100)是一种胚胎前脑来源的、多能神经干细胞克隆细胞系，在先前已有介绍(Villa et al.2000，Exp Neurol，161(1)：67-84).Villaet al 2004，Exp Cell Res.Apr 1；294(2)：559-70)。细胞从马德里-CSIC自治大学Severo Ochoa分子生物学中心分子生物学系(Campus Cantoblanco，Madrid，28049，Spain)的Alberto Martinez Serrano处获得。hNS 1培养物在多聚赖氨酸包被的TC摇瓶中在补充有20ng/ml EGF和bFGF的无血清HSC培养基中在37℃5％CO2环境下扩增。HSC培养基由补充有N2和1％BSA的DMEM/F12(1∶1)构成。为了进行分化实验，将hNS1细胞接种到包被有50μg/ml多聚赖氨酸的盖玻片上，以105细胞/cm2的密度置于无有丝分裂原的含0.5％FBS的HSC培养基中。接种1天后，将分化培养基变成含有METRNL的培养基。对照培养基接受HSC培养基。次日更换2/3的培养基，然后每2或3天更换2/3培养基。铺板4天后，培养物在4％多聚甲醛中固定10min，并通过免疫组织化学染色。
免疫组织化学
在10％正常马血清中封闭后，用针对GFAP(pAb兔抗牛，1∶1000，DAKO)和β-微管蛋白(mAb clone SCL：3D10，1∶1000，Sigma)的第一抗体孵育培养物。漂洗后，培养物用生物素化的马抗小鼠第二抗体(Vector Laboratories，1∶200)孵育，随后分别用Strep-Cy3(Jackson InmunoResearch，1/200)和Alexa Fluor488-标记的山羊抗兔抗体(Molecular Probes，1∶200)进行检测。细胞核用0.2μg/ml Hoechst 33258(Villa et al.，2004)复染色。为了进行分析，用共聚焦显微镜在63x物镜下计数除GFAP和β-微管蛋白阳性细胞之外的总细胞数(细胞核)。
METRNL存在下神经元数目的增加可能是培养物中存在的神经元祖细胞的分化的增加和/或对已分化神经元的促生存作用的结果。

Claims (16)

1.i)由SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列组成的分离的多肽；
ii)编码i)中定义的多肽的分离的核酸序列或作为编码i)中限定的多肽的序列的互补序列的核酸序列；
iii)包含如ii)中限定的核酸序列的载体；
iv)分离的宿主细胞的组合物，其中所述细胞用如iii)中限定的载体转化或转导；或
v)可植入生物相容性细胞装置，其中所述装置包括：
a)半透膜，其允许如i)中限定的多肽的扩散；和
b)如iv)中限定的细胞；
用于制备治疗神经系统的疾病、疾患或损害的药物的用途，所述疾病、疾患或损害选自肌萎缩性侧索硬化、根损伤、根性撕脱、臂神经损伤、外周神经病、神经痛、卒中、亨廷顿病、帕金森病、阿尔兹海默病、和涉及前庭听觉复合体的感觉上皮和相关神经节的听力丧失。
2.权利要求1的用途，其中该听力丧失为噪音诱发的听力丧失、耳聋、耳炎、耳鸣、迷路炎、遗传性和耳蜗前庭萎缩、梅尼埃病，或由内耳手术，以及植入体的植入所造成。
3.权利要求2的用途，其中该内耳手术为镫骨足板切除术、乳突切除术或鼓室成形术。
4.权利要求2或3的用途，其中该植入体为耳蜗植入体或中耳植入体。
5.权利要求1的用途，包括使用由SEQ ID NO:7的序列组成的多肽制造用于治疗外周神经病的药物。
6.权利要求1的用途，包括使用由SEQ ID NO:7的序列组成的多肽制造用于治疗神经性疼痛的药物。
7.权利要求1的用途，其中所述多肽还包含亲和标签。
8.权利要求1的用途，其中所述亲和标签是多聚组氨酸标签、GST标签、HA标签、Flag标签、C-myc标签、HSV标签、V5标签、麦芽糖结合蛋白标签、或纤维素结合域标签。
9.权利要求1的用途，其中所述载体还包含与所述核酸序列可操作连接的启动子。
10.权利要求1的用途，其中所述载体选自来自逆转录病毒科(Retroviridae)的载体，包括慢病毒，HIV，SIV，FIV，EAIV，CIV，α病毒，腺病毒，腺伴随病毒，杆状病毒，HSV，冠状病毒，牛乳头瘤病毒，和Mo-MLV。
11.权利要求1的用途，其中所述宿主细胞选自下组：永生化的视网膜色素上皮细胞，永生化的人成纤维细胞，永生化的人星形胶质细胞，人神经干细胞或前体细胞，人神经胶质干细胞或前体细胞，和非人胚胎干细胞。
12.权利要求11的用途，其中所述宿主细胞是ARPE-19细胞。
13.权利要求1的用途，其中所述装置的半透膜是免疫隔离性的。
14.权利要求1的用途，其中所述装置的半透膜是有微孔的。
15.权利要求1的用途，其中所述装置进一步包括布置在半透膜内的基质。
16.权利要求1的用途，其中所述装置还包括系绳锚。
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