JP5616888B2 - 成長因子metrnlの治療的使用 - Google Patents
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Description
る神経システムの疾患、障害、又は損傷の治療にMETRNLを使用し得る。
[実施態様1]
神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、単離されたポリペプチドであって、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド:
a) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び 12からなる群から選択されるアミノ酸配列;
b) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び 12からなる群から選択されるアミノ酸配列の配列バリアントであって、前記SEQ IDNo.に対して少なくとも70%の配列同一性を有するバリアント;
及びc) a)のいずれかの配列の少なくとも150の連続したアミノ酸である、生物学的活性を有する断片であって、選択された配列中に規定される任意のアミノ酸が、別のアミノ酸に変えられている断片;
ここで、変えられているアミノ酸の数は30以下であることを条件とする。
[実施態様2]
SEQID No. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び 12からなる群から選択される配列の、天然対立遺伝子バリアントである、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様3]
対立遺伝子バリアントが、SEQ ID No. 1, 3, 及び 5からなる群から選択される核酸配列と較べて単一ヌクレオチドにおいて異なっている核酸配列を翻訳したところのアミノ酸配列を含む、実施態様2に記載のポリペプチド。
[実施態様4]
選択された配列中で特定されるいずれかのアミノ酸が保存的置換となるように変えられたバリアント・ポリペプチドである、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様5]
シグナル・ペプチドが異種性シグナル・ペプチドに置き換えられた、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様6]
SEQID No. 2, 7, 及び 10からなる群から選択される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 2, 7, 及び 10からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様7]
SEQID No. 4, 8, 及び 11からなる群から選択される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 4, 8, 及び 11からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様8]
SEQID No. 6, 9, 及び 12からなる群から選択される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 6, 9, 及び 12からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様9]
SEQID No. 7, 8, 及び 9からなる群から選択される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 7, 8, 及び 9からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様10]
SEQID No. 2の配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 2の配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様11]
SEQID No. 7の配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 7の配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様12]
SEQID No. 10の配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 10の配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様13]
SEQID NOと比較して変化している、配列バリアント又は断片のアミノ酸が、図2において、より好ましくは図1において、非保存的であると規定されているものの中から選択されたアミノ酸である、実施態様1から12のいずれかに記載のポリペプチド。
[実施態様14]
少なくとも1つの分子内シスチン架橋を形成することができる、実施態様1から13のいずれかに記載のポリペプチド。
[実施態様15]
少なくとも1つの分子間シスチン架橋で連結された前記タンパク質のダイマーを含む、実施態様1から14のいずれかに記載のポリペプチド。
[実施態様16]
ポリhisタグ、GSTタグ、HAタグ、Flagタグ、C-mycタグ、HSVタグ、V5タグ、マルトース結合タンパク質タグ、セルロース結合ドメイン・タグのような親和性タグをさらに含む、実施態様1から15のいずれかに記載のポリペプチド。
[実施態様17]
神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、単離された核酸分子であって、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子:
a) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び12からなる群から選択されるアミノ酸配列;
b) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び12からなる群から選択されるアミノ酸配列の配列バリアント(ここで、当該バリアントは前記SEQ ID No.に対して少なくとも70%の配列同一性を有する);並びに
c) a)又はb)のいずれかの配列の少なくとも150の連続したアミノ酸である、生物学的活性を有する断片。
[実施態様18]
天然対立遺伝子核酸バリアントのヌクレオチド配列を含む、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様19]
天然のポリペプチド・バリアントのポリペプチド配列を有するバリアント・ポリペプチドをコードする、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様20]
SEQID No. 1, 3, 及び 5からなる群から選択される核酸配列と較べて単一ヌクレオチドにおいて異なっている、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様21]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 2, 7, 及び 10からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 2, 7, 及び 10からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様22]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 4, 8, 及び 11からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 4, 8及び 11からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様23]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 6, 9, 及び 12からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 6, 9, 及び 12からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様24]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 7, 8, 及び 9からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 7, 8, 及び 9からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様25]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 2に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 2の配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様26]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 7に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 7の配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様27]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 10に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 10の配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様28]
以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施態様17に記載の核酸分子:
a) SEQ IDNo. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び 18からなる群から選択されるヌクレオチド配列;
b) SEQ IDNo. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び 18からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
c) SEQ IDNo. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び 18からなる群から選択される配列の、少なくとも150の連続するヌクレオチドを有する核酸配列;
c) SEQ IDNo. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択される配列を有する核酸と、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる、核酸の相補鎖;並びに
d) 上記のいずれかものに相補的な核酸配列。
[実施態様29]
SEQID No. 1, 3 及び 5からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくはSEQ ID No.1, 3, 及び 5の配列を有する核酸である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様30]
SEQID No. 13, 14 及び 15からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくはSEQ ID No.13, 14, 及び 15の配列を有する核酸である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様31]
SEQID No. 16, 17, 及び 18からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様32]
SEQID No. 1の配列を有する核酸分子に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 1の配列を有する核酸である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様33]
SEQID No. 13の配列を有する核酸分子に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 13の配列を有する核酸である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様34]
SEQID No. 16の配列を有する核酸分子に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 16の配列を有する核酸である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様35]
大腸菌、チャイニーズハムスター、ベイビーハムスター、酵母、昆虫、及び/又は真菌類における発現のためにコドンが最適化された、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様36]
SEQID No 16と、SEQ ID NO 17 及び SEQID NO 18の少なくともいずれか1つとの間の組み混ぜバリアントである、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様37]
神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、実施態様17から36のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
[実施態様38]
当該核酸分子が発現可能になるように連結されたプロモーターをさらに含む、実施態様37に記載のベクター。
[実施態様39]
当該プロモーターが、CAG, CMV, ヒトUbiC, JeT, RSV, Tet-制御性プロモーター, Mo-MLV-LTR, Mx1, EF-1アルファからなる群から選択される、実施態様38に記載のベクター。
[実施態様40]
レンチウイルス、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIVを含むレトロウイルス・ファミリーに由来するベクターからなる群から選択される、実施態様37又は38に記載のベクター。
[実施態様41]
アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、HSV、コロナウイルス、ウシパピロマウイルス、Mo-MLVからなる群から選択され、好ましくはアデノ随伴ウイルスである、実施態様37又は38に記載のベクター。
[実施態様42]
神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、実施態様37から41のいずれかに記載のベクターで形質転換又は形質導入された、単離された宿主細胞。
[実施態様43]
大腸菌、酵母、サッカロマイセス・セレビシエ、アスペルギルス、Sf9昆虫細胞からなる群から選択される、実施態様42に記載の宿主細胞。
[実施態様44]
ヒト、ネコ、ブタ、サル、イヌ、マウス、ラット、マウス、及びウサギのような哺乳類細胞からなる群から選択される、実施態様42に記載の宿主細胞。
[実施態様45]
ARPE-19細胞のような不死化網膜色素上皮細胞、ヒト不死化線維芽細胞、及びヒト不死化星状膠細胞からなる群から選択される、実施態様44に記載の宿主細胞。
[実施態様46]
マトリックスに付着した、実施態様45に記載の宿主細胞。
[実施態様47]
ヒト神経性幹細胞又は前駆体細胞、ヒト・グリア性幹細胞又は前駆体細胞、及び胎児性の幹細胞を含む幹細胞からなる群から選択される、実施態様44に記載の宿主細胞。
[実施態様48]
CHO,CHO-K1, HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, BHK細胞からなる群から選択される、実施態様44に記載の宿主細胞。
[実施態様49]
神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、感染性ウイルス粒子を産生することができるパッケージング細胞株であって、当該ウイルス粒子は、5'レトロウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージング・シグナル、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現できるように当該ポリヌクレオチド配列に連結されたプロモーター、DNA第2鎖合成のためのオリジン、及び3'レトロウイルスLTRを含むレトロウイルス科由来ゲノムを含む、パッケージング細胞株。
[実施態様50]
当該ゲノムがレンチウイルス由来のゲノムでありLTRがレンチウイルスのものである、実施態様49に記載のパッケージング細胞株。
[実施態様51]
移植可能な生体適合性細胞装置:
i) 実施態様1から16のいずれかに記載のタンパク質及び/又はウイルス・ベクターの拡散を許容する半透膜;及びii) 実施態様42から48のいずれかに記載の細胞、又は、実施態様49若しくは50に記載のパッケージング細胞株の組成物。
[実施態様52]
半透膜が免疫隔離性である、実施態様51に記載の装置。
[実施態様53]
半透膜が微多孔性である、実施態様51に記載の装置。
[実施態様54]
半透膜の内部に配置されたマトリックスをさらに含む、実施態様51に記載の装置。
[実施態様55]
繋留アンカーをさらに含む、実施態様51に記載の装置。
[実施態様56]
標的細胞を感染させるためのウイルス・ベクターを分泌する生きたパッケージング細胞を含む中心部、及び、前記中心部を囲う外部ジャケットを含み、当該ウイルス・ベクターがレトロウイルスであって、当該ベクターは、前記ポリペプチドを発現できるように標的細胞における当該ポリペプチドの発現を制御するプロモーターが連結された実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドをコードする異種性遺伝子を含み、前記ジャケットは透過性の生体適合性材料を含み、前記材料は直径約100 nmのレトロウイルス・ベクターの透過を許容させるために選択される多孔性を有し、前記カプセルからの前記ウイルス・ベクターの放出を可能にする、実施態様51に記載の装置。
[実施態様57]
中心部がさらにマトリックスを含み、パッケージング細胞が当該マトリックスにより固定されている、実施態様56に記載の装置。
[実施態様58]
ジャケットが、ハイドロゲル又は熱可塑性の素材を含む、実施態様56に記載の装置。
[実施態様59]
好ましくは神経細胞が欠失又は損傷している、神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、実施態様56に記載の装置。
[実施態様60]
神経系の疾患、障害、又は損傷の治療のための医薬の製造における、以下のものの使用:
i) 実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチド;又は
ii) 実施態様17から36のいずれかに記載の単離された核酸配列;又は
iii) 実施態様37から41のいずれかに記載の発現ベクター;又は
iv) 実施態様42から48のいずれかに記載の宿主細胞の組成物;
v) 実施態様51から59のいずれかに記載の移植可能な生体適合性細胞装置;又は
vi) 実施態様49若しくは50に記載のパッケージング細胞株。
[実施態様61]
神経細胞が欠失又は損傷している、実施態様60に記載の使用。
[実施態様62]
前記医薬が、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、てんかん、神経障害、末梢神経障害、並びに付随の痛み及びその他の症状を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経の受傷に関わる疾患、障害、又は損傷の治療のためのものである、実施態様60に記載の使用。
[実施態様63]
神経系障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症に伴う神経損傷、及び付随の症状を含むが、これらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロン及びニューロンのプロセスの変性に関わるものである、実施態様60に記載の使用。
[実施態様64]
神経変性疾患がパーキンソン病である、実施態様63に記載の使用。
[実施態様65]
神経変性疾患がハンチントン病である、実施態様63に記載の使用。
[実施態様66]
神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である、実施態様63に記載の使用。
[実施態様67]
神経系障害が、代謝疾患、栄養障害、毒性傷、悪性病変、及び/又は遺伝的な若しくは特発性の異常(糖尿病を含むがこれに限定されない)、腎機能不全、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、及び感染により引き起こされる状態を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロンの機能異常及び/又は欠失に関わる、疾患、障害、又は損傷である、実施態様60に記載の使用。
[実施態様68]
疾患が、末梢神経障害及び付随の痛みである、実施態様61又は67に記載の使用。
[実施態様69]
神経系障害が、多発性硬化症、視神経炎、大脳硬化症、感染後脳脊髄炎、及びてんかん、並びに付随の症状を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び末梢神経系における乏突起膠細胞、星状膠細胞、及びシュワン細胞のようなグリアの変性又は硬化に関わる疾患、障害、又は損傷である、実施態様60に記載の使用。
[実施態様70]
疾患又は障害が、多発性硬化症、感覚性運動失調、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調、小脳萎縮症、及びアルコール依存症である、実施態様69に記載の使用。
[実施態様71]
神経系の障害、疾患、又は損傷が、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、及び付随の症状を含むがこれらに限定されない、網膜、光受容体、及び付随の神経に関わるものである、実施態様60に記載の使用。
[実施態様72]
神経系の障害、疾患、又は損傷が、音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、及び付随の症状を含むがこれらに限定されない、前庭聴覚複合体の感覚上皮及び付随の神経節に関わるものである、実施態様60に記載の使用。
[実施態様73]
損傷が、アブミ骨摘出術、乳突削開術、及び鼓室形成術のような内耳手術、並びに人工内耳又は中耳インプラントのようなインプラントの移植により引き起こされるものである、実施態様72に記載の使用。
[実施態様74]
対象における神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法であって、治療を必要とする個体に治療的に有効な量の以下のものを投与することを含む方法:
i) 実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチド;又は
ii) 実施態様17から36のいずれかに記載の単離された核酸配列;又は
iii) 実施態様37から41のいずれかに記載の発現ベクター;又は
iv) 実施態様42から48のいずれかに記載の宿主細胞の組成物;又は
v) 実施態様51から59のいずれかに記載の移植可能な生体適合性細胞装置;又は
vi) 実施態様49若しくは50に記載のパッケージング細胞株。
[実施態様75]
前記病態が、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、てんかん、神経障害、末梢神経障害、並びに付随の痛み及びその他の症状等の状態を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経の受傷に関わる疾患、障害、又は損傷である、実施態様74に記載の方法。
[実施態様76]
神経系障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症に伴う神経損傷、及び付随の症状を含むが、これらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロン及びニューロンのプロセスの変性に関わるものである、実施態様74に記載の方法。
[実施態様77]
神経変性疾患がパーキンソン病である、実施態様76に記載の方法。
[実施態様78]
神経変性疾患がハンチントン病である、実施態様76に記載の方法。
[実施態様79]
神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である、実施態様76に記載の方法。
[実施態様80]
神経系障害が、代謝疾患、栄養障害、毒性傷、悪性病変、及び/又は遺伝的な若しくは特発性の異常(糖尿病を含むがこれに限定されない)、腎機能不全、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、及び感染により引き起こされる状態を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロンの機能異常及び/又は欠失に関わる、疾患、障害、又は損傷である、実施態様74に記載の方法。
[実施態様81]
疾患が、末梢神経障害及び/又は付随の痛みである、実施態様80に記載の方法。
[実施態様82]
神経系障害が、多発性硬化症、視神経炎、大脳硬化症、感染後脳脊髄炎、及びてんかん、並びに付随の症状を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び末梢神経系における乏突起膠細胞、星状膠細胞、及びシュワン細胞のようなグリアの変性又は硬化に関わる疾患、障害、又は損傷である、実施態様74に記載の方法。
[実施態様83]
疾患又は障害が、多発性硬化症、感覚性運動失調、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調、小脳萎縮症、及びアルコール依存症である、実施態様82に記載の方法。
[実施態様84]
神経系の障害、疾患、又は損傷が、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、及び付随の症状を含むがこれらに限定されない、網膜、光受容体、及び付随の神経に関わるものである、実施態様74に記載の方法。
[実施態様85]
神経系の障害、疾患、又は損傷が、音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、及び付随の症状を含むがこれらに限定されない、前庭聴覚複合体の感覚上皮及び付随の神経節に関わるものである、実施態様74に記載の方法。
[実施態様86]
損傷が、アブミ骨摘出術、乳突削開術、及び鼓室形成術のような内耳手術、並びに人工内耳又は中耳インプラントのようなインプラントの移植により引き起こされるものである、実施態様85に記載の方法。
[実施態様87]
対象がヒトである、実施態様74に記載の方法。
[実施態様88]
哺乳類神経細胞のアポトーシスを防止する方法であって、前記神経細胞を、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに晒すことを含む方法。
[実施態様89]
哺乳類神経細胞の生存を増強させる方法であって、前記神経細胞を、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに晒すことを含む方法。
[実施態様90]
神経細胞を分化させる方法であって、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに神経細胞を晒すことを含む方法。
[実施態様91]
神経細胞の移動を刺激する方法であって、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに神経細胞を晒すことを含む方法。
[実施態様92]
ニューロンを発生させる方法であって、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに神経前駆体細胞又は神経幹細胞を晒すことを含む方法。
[実施態様93]
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞内で発現させることにより、前記ポリペプチドを前記細胞に送達する、実施態様88から92のいずれかに記載の方法。
[実施態様94]
神経系の疾患、障害、又は損傷の治療において使用するための、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体。
[実施態様95]
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、リコンビナント抗体からなる群から選択される、実施態様94に記載の抗体。
[実施態様96]
神経系の疾患、障害、又は損傷の治療において使用するための、実施態様94に記載の抗体と以下のものからなる群から選択される接合物とを含む免疫結合体:
化学療法剤、毒素、又は放射性同位元素のような細胞毒性剤;
アビジン又はストレプトアビジン又は抗原のような特異的結合をなす対の一員;
検出可能な産物を産生することができる酵素。
[実施態様97]
以下のものからなる群から選択される、単離されたポリペプチド:
i) SEQ IDNo 10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;
ii) SEQ IDNo 11に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;
iii) SEQID No 12に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;並びに
iv) 上記ポリペプチドのバリアントであって、選ばれた配列中のいずれかのアミノ酸が別のアミノ酸に変わっているが、当該配列中でそのように変わっているアミノ酸が20個以下であるバリアント。
[実施態様98]
変わったアミノ酸が、図2において、より好ましくは図1において、非保存的であると規定されているものの中から選択されたアミノ酸である、実施態様97に記載のポリペプチド。
[実施態様99]
以下のものを含む、単離されたポリペプチド:
-C-末端において次のものに連結された、Gln又はCysを除く天然アミノ酸からなる群から選択されるN-末端アミノ酸;
- SEQ IDNo 2、SEQ ID NO 4又はSEQ ID No 6のAA 2 からAA 311 において示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド及びそのバリアントからなる群から選択される、ポリペプチド;
ここで、当該バリアントでは、いずれかのアミノ酸が別のアミノ酸に変わっているが、当該配列中でそのように変わっているアミノ酸が20個以下である。
[実施態様100]
以下のものからなる群から選択される、単離されたポリペプチド:
i) SEQ IDNo 2、SEQ ID NO 4又はSEQ ID No 6に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、N-末端グルタミン残基の代わりにN-末端ピロリドンカルボン酸を有する、ポリペプチド;
ii)選ばれた配列中のN-末端ピロリドンカルボン酸を除くいずれかのアミノ酸が別のアミノ酸に変わっているが、当該配列中でそのように変わったアミノ酸残基が20個以下である、前記ポリペプチドのバリアント。
[実施態様101]
以下の工程を含む、リコンビナントMETRNLポリペプチドの製造方法:
i) 実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を細胞において発現させる工程;
ii) 前記ポリペプチドを精製する工程;
iii) 当該精製されたポリペプチドにおいてN-末端ピロリドンカルボン酸の存在を確認する工程。
[実施態様102]
表面の少なくとも一部分が、実施態様1から16のいずれかに記載のMETRNLタンパク質の組成物でコーティングされた、インプラント。
[実施態様103]
人工内耳、中耳インプラント、骨導補聴器、及び聴性脳幹インプラント、好ましくは人工内耳及び中耳インプラントからなる群から選択される、実施態様102に記載のインプラント。
i) 本発明のタンパク質の拡散を許容する半透膜; 及び
ii) 本発明による細胞の組成物、又は本発明によるパッケージング細胞の組成物。
i) 本発明のポリペプチド;又は
ii) 本発明の単離された核酸配列;又は
iii) 本発明の発現ベクター;又は
iv) 本発明による宿主細胞の組成物;又は
v) 本発明によるパッケージング細胞株;又は
vi) 本発明による移植可能な生体適合性カプセル。
i) 本発明のポリペプチド;又は
ii) 本発明の単離された核酸配列;又は
iii) 本発明の発現ベクター;又は
iv) 本発明による宿主細胞の組成物;又は
v) 本発明によるパッケージング細胞株;又は
vi) 本発明による移植可能な生体適合性カプセル。
i) 本発明のポリペプチド;又は
ii) 本発明の単離された核酸配列;又は
iii) 本発明の発現ベクター;又は
iv) 本発明による宿主細胞の組成物;又は
v) 本発明によるパッケージング細胞株。
にヒト、マウス、及びラットのメテオリン(SEQ ID NO 23、24、及び25)のアラインメント。シグナルペプチドを太字で示す。保存されたCys残基は囲み線で示す。アラインメントにはClustal W (1.7)を用いた。
[図3]ヒト(NP_001004431.1; SEQ ID NO 2)、マウス(NP_659046.1;SEQ ID NO 4)、ラッ
ト(NP_001014126; SEQ ID NO 6)、ウシ(XP_614019.3; SEQ ID NO 19)、ニワトリ(CR352488;SEQ ID NO 20)、ゼノパス・トロピカリス(xenopus tropicalis)(BX757299.1; SEQ ID NO 21)及びゼブラフィッシュ(NP_998150.1; SEQID NO 22)のMETRNLタンパク質配列のアラインメント。ヒト配列と同一の保存残基には陰をつけ、推測されるシグナルペプチドは太字で、10個の保存されたシステイン残基は囲み線で、成熟タンパク質配列の保存されたN-末端グルタミン(Q)は矢印にて示す。
[図4]ヒト及びマウスMETRNLは分泌性の分子である。6つの重複実験において、ヒスチジ
ン・タグをつけたヒト又はマウスMETRNLでHEK293細胞をトランスフェクトした。48時間後、馴化培地(conditioned media)を抗HISウェスタン・ブロッティングで解析した。どちらの成熟分子も推定分子量は31.2kDaである。hMETRNLは予測通りの泳動を示すが、mMETRNLはグリコシル化のためにより高い分子量に相当する泳動を示す。
[図5]リコンビナントmMETRNLの産生。A) 293F浮遊細胞をpNS1n-mMETRNL-HISでトランス
フェクトし、馴化培地を翌日回収した。抗HISウェスタン・ブロッティングは96時間に至るまで持続的な蓄積を示している。B) 精製後、リコンビナントmMETRNLをSDS-PAGEで解析し、続いて抗HISウェスタン・ブロッティング(左)及びゲルコード・ブルー染色(右)で解析した。C) 精製リコンビナントmMETRNLをさらに逆相クロマトグラフィーで分析したところ、高い純度を示した。フラクション≧31に見られる肩は、不均一にグリコシル化されたタンパク質において典型的である。D) 精製リコンビナントmMETRNLを、示されているように異なる脱グリコシル化酵素で処理し、抗HISウェスタン・ブロッティングで解析した。分子量の変化から、mMETRNLがN-グリコシル化されていることが明らかである。
[図6] METRNLは分離された後根神経節(DRGs)からの神経突起伸長を誘導する。左は神経
突起の長さの定量化を示す。右は、神経栄養性サポートがない状態(ネガティブ)、又はNGF若しくはMETRNLの存在下で増殖させた後根神経節細胞のβ-III-チューブリン染色を示す。
[図7] METRNLは、用量依存的に、SVZ由来神経芽細胞の神経細胞移動を増加させる。こ
のプロセスにおいてMETRNLに応答する細胞は、DCXマーカーの免疫反応性を有するため神経芽細胞と確認される。
[図8] METRNLは、インビトロで、SVZ由来神経芽細胞の移動を刺激する。A) P2-P5の若
いラットからの外植片を、異なる濃度(0, 20, 200,2000ng/ml)のリコンビナントMETRNLと共にマトリゲルに包埋した。METRNLの存在は、用量依存的に、細胞の移動の有意な増加を引き起こした。B) 移動している細胞は、ダブルコルチン(DCX)陽性でありグリア線維酸性タンパク質(GFAP)陰性であることから、神経芽細胞である。
[図9] METRNLはアクチン重合化を介して細胞移動を促進する。SVZの外植片及び単層培
養を、リコンビナントのマウスMETRNL又はSDF1a(ポジティブ・コントロール)で処理し、続いてアクチン結合性FITC-ファロイジンと共にインキュベートした。アクチン重合化の増加は、神経芽細胞移動促進においてMETRNLが役割を果たすことのさらなる証拠である。
[図10]ヒト・リコンビナントMETRNLは、SVZ由来神経芽細胞の移動を刺激する。
P2-P5の若いラットからの外植片を、25ng/mlのヒト・リコンビナントMETRNLと共にマトリゲルに包埋したところ、移動がコントロールと比較して2倍以上となった。A) ヒトMETRNLにより誘導された神経芽細胞移動(コントロールとの比較)の写真の例。典型的な神経芽細胞チェーン移動に注目のこと。B) 神経芽細胞の移動の定量化。
[図11] METRNLは難聴化モルモットにおいて聴力を保護する。A) 実験の設定。詳細な記
述については「方法」欄を参照のこと。B) METRNLで処置された正常聴力モルモット(○)、人工外リンパで処置された難聴化モルモット(●)、及びリコンビナント・マウスMETRNLで処置された難聴化モルモット(△)において測定された、電気的聴性脳幹反応(eABR)閾値の平均値。垂直のバーは平均値の標準誤差(SEM)を示す。METRNLによる処置は、無処置コントロール・グループと比較して、eABR閾値を有意に低下させていることに注目(*p<0.05)。
本明細書において、METRNLとは、天然、合成、半合成、又はリコンビナントに関わらず任意の供給源から得られ、任意の種、特に、チンパンジー、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳類から得られる、実質的に精製されたMETRNLのアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを指す。当該用語はまた、これらの種のいずれかから得られる、生物学的活性を有するMETRNLの断片をも指し、また、生物学的活性を有するそれらの配列バリアント、及び翻訳後修飾を受けたタンパク質も指す。生物学的活性を有するMETRNLの断片は、1つ以上の位置において野生型METRNL配列から異なっていてもよく、異なっている位置の数は好ましくは20まで、より好ましくは10まで、より好ましくは5までであり、例えば1つ、2つ、3つ、又は4つの位置において異なる。
2つの配列間のパーセント同一性の決定は数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。2つの配列を比較するために使用される数学的アルゴリズムの好ましい例(これに限定はされないが)は、KarlinとAltschul(1990) によるもの(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)をKarlinとAltschul (1993)に従って修正したもの(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)である。そのようなアルゴリズムはAltschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のBLASTN及びBLASTPプログラムに組み入れられる。
全長METRNL、実質的に全長であるMETRNL、及び切り詰め型METRNLに加えて、本発明は生物学的活性を有するこれらのポリペプチドの断片及び配列バリアントを提供する。METRNLポリペプチド、配列バリアント、又は断片は、天然のMETRNLの生物学的活性を示すならば、生物学的活性を有する。METRNLの生物学的活性を有する断片は、野生型METRNL配列に対して1つ以上の位置において異なっていてもよく、20個までの位置において、より好ましくは10個までの位置において、より好ましくは5個までの位置において異なっていてもよく、例えば1つ、2つ、3つ、又は4つの位置において異なり得る。本発明は、ここで定義されるところの実質的に精製されたMETRNLに関わることが理解されるべきである。
i) SEQ IDNo 10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;
ii) SEQ IDNo 11に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;
iii) SEQID No 12に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;;並びに
iv) 上記ポリペプチドのバリアント(そこでは、選ばれた配列中の任意のアミノ酸が別のアミノ酸に変えられる。ただし当該配列中でそのように変えられるアミノ酸が20個を超えてはならない)。
これらのMETRNLの切り詰め型は、保存されたシステインのうち1番目のものから最後のものまでに至るコア配列を含む。好ましい一実施態様においては、変えられたアミノ酸の数は15未満であり、より好ましくは10未満であり、より好ましくは5未満であり、例えば1つまたは2つのアミノ酸が変えられており、さらに好ましくはアミノ酸が1つも変えられていない。
-STA,NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW。
以下のグループ(Clustal W、「弱」保存グループ)内での置換は、本発明が意味するところにおいて半保存的置換とみなされる。
-CSA, ATV,SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY。
本発明はMETRNLをコードするcDNAの医学的使用を提供し、当該cDNAは、例えば、ヒト、マウス、及びラットのMETRNL cDNAの核酸配列(SEQ ID NO 1, 3, 及び5)、METRNLをコードする配列(SEQ ID NO 13, 14, 及び15)、並びにシグナル・ペプチドを除いたMETRNLをコードする配列(SEQ ID NO 16又はSEQ ID No 1のヌクレオチド136-936、SEQ ID NO 17又はSEQ ID No. 3のヌクレオチド136-936、及びSEQ ID NO 18又はSEQ ID No. 5のヌクレオチド136-936)を含む。
a) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び12からなる群から選択されるアミノ酸配列;
b) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び12からなる群から選択されるアミノ酸配列の配列バリアント(ここで、当該バリアントは前記SEQ ID No.に対して少なくとも70%の配列同一性を有する);並びに
c) 生物学的活性を有する、a)又はb)のいずれかのものの少なくとも50の連続したアミノ酸の断片。
d) 生物学的活性を有する、c)の断片の配列バリアント(ここで、当該配列バリアントは当該断片に対して少なくとも70%の配列同一性を有する)。
a) SEQID No. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択されるヌクレオチド配列;
b) SEQID No. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
c) SEQID No. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択される配列の少なくとも150の連続したヌクレオチドである核酸配列;
c) SEQID No. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択される配列を有する核酸と、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる、核酸の相補鎖;並びに
d) 上記のいずれかのものと相補的なものの核酸配列。
i) 不明瞭な塩基(もしあったとしたら)が最も少ない配列領域においてデザインするべきである。また、
ii) 計算上のTmが約80℃であるようにデザインするべきである(A又はT一つあたり2℃、及び、G又はC一つあたり4℃と想定する)。
一実施態様においては、天然及びバリアントのMETRNL、並びにそれらの断片、及び/又はMETRNLを含む融合タンパク質が、哺乳類神経系の障害の治療のために提供される。神経細胞が消失又は損傷した疾患の状況において、神経細胞の成長(増殖を含む)、神経の機能、神経の再生、神経の分化、神経の移動、及び/又は神経の生存を刺激することにMETRNLを使用し得る。
METRNL治療の標的となる一つの組織は、METRNLに対する応答性を維持する点に基づき選択される脳の領域である。ヒトにおいて、成体になっても成長因子に対する応答性を維持するニューロンとしては、コリン作動性前脳基底核ニューロン、嗅内皮質ニューロン、視床ニューロン、青斑核ニューロン、脊髄感覚ニューロン、脊髄運動ニューロン、黒質のニューロン、交感神経性ニューロン、後根神経節、網膜ニューロン、耳ニューロン、小脳ニューロン、及び毛様体神経節が含まれる。脳室下帯の幹細胞のような幹細胞、並びに神経及びグリアの前駆細胞もまた、成体になっても成長因子に対する応答性を維持する。ミエリン形成乏突起膠細胞もまた、成体になっても成長因子に対する応答性を維持する。
ポンプ(例えば、Annals of Pharmacotherapy, 27:912(1993); Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984)を参照のこと。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。)、
マイクロカプセル化(例えば、米国特許4,352,883; 4,353,888; 及び 5,084,350を参照のこと。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。)、
持続性放出ポリマー移植片(例えば、Sabelによる米国特許4,883,666を参照のこと。この文献は参照により本明細書に組み入れられる。)、
METRNLを発現するカプセル化細胞(セクションIXを参照のこと)、
METRNLを発現する、裸の又は非カプセル化細胞の、CNSへの移植(例えば、米国特許5,082,670及び5,618,531を参照のこと。これらの文献は各々参照により本明細書に組み入れられる。);
皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、又はその他の適切な部位への、注射;
坐薬;
吸引;及び
カプセル、液体、錠剤、ピル、又は長時間放出(prolonged release)製剤における経口投与。
本発明における遺伝子治療用METRNL組成物を形成するために、METRNLをコードする発現ウイルス・ベクターを、医薬的に許容される懸濁液、溶液又は乳濁液中に入れることができる。適切な媒体としては、食塩水及びリポソーム調製物が含まれる。
一つの重要なパラメータは、標的組織に送達されるMETRNL遺伝子治療ベクターの用量である。ウイルス・ベクターについては、当該濃度は、mlあたりの形質導入ユニットの数により定義され得る。ウイルス発現ベクターを使用した送達において、最適には、各ユニット用量は2.5から25 μLの組成物を含み、ここで、当該組成物は、医薬的に許容される液中のウイルス発現ベクターを含み、mlあたり108から1010までのMETRNL形質導入ユニットを提供する。
大まかに言って、遺伝子治療は、新たな遺伝物質を患者の細胞に導入して当該患者に治療的な利益をもたらすことを目指す。そのような利益は、広範な疾患、障害、及びその他の状態を、治療又は予防することを含む。
本発明に使用するMETRNLポリペプチドのリコンビナント発現のためのベクターの構築は、当業者には詳細に説明する必要の無い従来技術を使用して達成することができる。しかしながら、レビューが必要ならば、当業者はManiatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, (NY 1982)を参照し得る。医学的用途でMETRNLポリペプチドをリコンビナント産生するための産生細胞を作ること、及び、裸細胞の又はカプセル化治療法のためのMETRNLポリペプチドを分泌する治療用細胞を作ることに、発現ベクターは使用され得る。
カプセル化細胞治療法は、宿主への移植に先立って細胞を半透性の生体適合性材料で取り囲むことにより、レシピエント宿主の免疫系から当該細胞を隔離するという概念に基づく。本発明は、METRNLを発現及び分泌することができる細胞が免疫隔離性カプセル中に被包されている装置を含む。「免疫隔離性カプセル」とは、レシピエント宿主への移植に際して、当該装置の中心部にある細胞に対する宿主免疫系の有害作用がカプセルにより最小限化されることを意味する。細胞は、微多孔性の膜で形成された移植可能なポリマー・カプセルの中に封入されることにより、宿主から免疫的に隔離される。このアプローチにより、宿主と移植組織との間の細胞対細胞接触が防がれ、直接提示を通した抗原認識が排除される。使用される膜は、例えば抗体と補体(complement)のような分子の拡散を分子量に基づいてコントロールするように仕立ててもよい(Lysaght et al., 56 J. Cell Biochem. 196 (1996), Colton, 14 TrendsBiotechnol. 158 (1996))。カプセル化技術を使用することにより、免疫抑制剤の使用の有無に関わらず、免疫拒絶反応を受けることなく細胞を宿主に移植することができる。有用な生体適合性ポリマー・カプセルは、通常、細胞(液状媒体に懸濁されるか、又は固定化マトリックスに固定化される)を含む中心部、及び、隔離細胞を含まず、生体適合性を有し、かつ、有害な免疫的攻撃から中心部の細胞を保護するのに十分な、透過選択性マトリックス又は膜(「ジャケット」)の周囲(surrounding)又は周辺(peripheral)領域を含む。カプセル化により、免疫系の成分がカプセル内に入ることが阻止され、それによって、カプセル化された細胞を免疫的破壊から守る。当該カプセル膜の半透性の性質により、目的の生物学的活性分子が、カプセルから周囲の宿主組織へと容易に拡散することができる。
本発明はさらに、哺乳類神経系への移植に先立って、METRNL産生細胞を支持マトリックス上でインビトロで培養することを含む。移植に先立って、細胞をマイクロキャリア(microcarriers)に事前に付着させることは、移植される細胞の長期的な生存を強化させ、長期的な機能的利益を提供させるためのデザインである。
本発明は一態様において、本発明によるベクターで遺伝子改変された、単離宿主細胞に関する。
SV40T抗原の代わりに、v-myc、又はTERT (テロメラーゼ)を不死化遺伝子として使用し得る。
リン酸カルシウム沈殿技術によるプラスミド・トランスフェクションの代わりに、レトロウイルス遺伝子導入を使用し得る。
本発明のMETRNLポリペプチドは、技術水準にある原核生物又は真核生物発現系を使用して産生し得る。一つの真核生物発現系が実施例2に記述されており、実質的に精製されたhisタグMERTNLポリペプチドをもたらしている。
METRNLポリペプチド及び/又はMETRNLをコードするポリヌクレオチドを、インビトロで、成長因子又は栄養性因子として使用することができる。この使用は、METRNLは成長因子の構造的特性を有する分泌性タンパク質であるという発見、並びに、METRNLは異なるインビトロ・アッセイにおいて神経突起の成長(軸索伸長)、神経の生存、神経発生、及び神経前駆体の移動を引き起こすという本発明者による発見に基づく。当該神経栄養及び/又は神経移動及び/又は神経保護及び/又は神経発生作用は、後根神経節及び脳室下帯外植片において見出された。
本発明のMETRNLポリペプチド又はポリペプチド断片は、METRNL特異的抗体を産生するために使用し得る。本明細書において、「METRNL特異的抗体」とは、METRNLポリペプチド又はポリペプチド断片に対して免疫的反応を示す、又は、METRNLポリペプチドのエピトープに特異性をもって結合する、抗体、例えばポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。
配列一覧番号。
SEQ ID NO1: ヒト メテオリン・ライクcDNA
SEQ ID NO2: ヒト メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO3: マウス メテオリン・ライクcDNA
SEQ ID NO4: マウス メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO5: ラット メテオリン・ライクcDNA
SEQ ID NO6: ラット メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO7: ヒト 成熟メテオリン・ライク タンパク質
SEQ ID NO8: マウス 成熟メテオリン・ライク タンパク質
SEQ ID NO9: ラット 成熟メテオリン・ライク タンパク質
SEQ ID NO10: ヒト メテオリン・ライク コア断片
SEQ ID NO11: マウス メテオリン・ライク コア断片
SEQ ID NO12: ラット メテオリン・ライク コア断片
SEQ ID NO13: hMTRNL オープンリーディングフレーム
SEQ ID NO14: mMTRNL オープンリーディングフレーム
SEQ ID NO15: rMTRNL オープンリーディングフレーム
SEQ ID NO16: ヒト CDS 成熟METRNL
SEQ ID NO17: マウス CDS 成熟METRNL
SEQ ID NO18: ラット CDS 成熟METRNL
SEQ ID NO19: ウシ メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO20: ニワトリ メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO21: カエル メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO22: ゼブラフィッシュ メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO23: ヒト METRN タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO24: マウス METRN タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO25: ラット METRN タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO26: METRNLのC-末端 His-タグ
ORFは太字
ORFは太字
ORFは太字
方法
配列解析
相同性検索は、BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast/)を用い、アンサンブル・ゲノム・ブラウザー(http://www.ensembl.org/index.html) を参照することにより、行った。アミノ酸配列のアラインメントは、サイ・エド・ソフトウェア社 (ケーリー, NC)のクローン・マネージャー9・プロフェッショナル・エディション・パッケージ中のCLUSTAL W(1.7)(Thompson et al (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680) を使用して行った。シグナル・ペプチド切断部位の予測はSignalPを使用して行った(Bendtsen et al (2004), J.Mol. Biol. 340, 783-795) (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。
マウス(NM_144797)及びヒト(NM_001004431)のメテオリン・ライクのコード配列は、C-末端のヒスチジン・タグ(GSGSGSHHHHHH; SEQ ID NO 26)と共にGenScript社(NJ, USA)により合成され、pNS1nのBamHI/XhoIサイトにPCRクローニングした (Jensen et al., 2002)。全てのコンストラクトはDNA配列決定により確認された(MWGバイオテク AG, ドイツ)。
HEK293細胞は、10% FCS (セロメッド社、S 0115)で補足されたDMEM (インビトロゲン社、41965-039)中で付着性培養として培養された。トランスフェクションは、LipofectAMINE 2000(ライフ・テクノロジーズ社、11668-027)を使用して、製造会社の説明書に従って行った。細胞は、5% CO2の加湿環境下で37℃でインキュベーションした。
細胞可溶化物及び馴化培地は過去に記述されたように調製された(Fjord-Larsen et al (2005), Exp. Neurol. 195, 49-60)。サンプルは15%均一のSDS PAGEゲル(アマシャム・ファルマシア社、スウェーデン)に適用し、電気泳動して、PVDFメンブレンに電気的にブロッティングした。HISタグを有するリコンビナント・メテオリン・ライクの検出は、0.2 μg/ml の抗HIS (C-末端) (インビトロゲン社, R930-25)を一次抗体として、HRP連結抗マウスAb(ダコ社, P0260, 1:2000)を二次抗体として使用して行った。又は、ゲルを、製造会社の説明書に従ってゲルコード・ブルー染色試薬(ピアース社, 24590)で染色した。
フリースタイル(登録商標)293-F細胞(インビトロゲン社, K9000)を、LipofectAMINE 2000(ライフ・テクノロジーズ社, 11668-027)を使用してpNS1n-mMETRNL-HIS DNAでトランスフェクトした。培養物を、攪拌しながら、37℃、8% CO2の下で4日間インキュベートし、遠心分離により細胞ペレットと上清とに分けた。上清を滅菌濾過し、リコンビナントタンパク質をTALON メタル・アフィニティー・レジン(クローンテック社, 635502)で精製し、その後PD-10ゲル濾過(GEヘルスケア社, 17-0851-01)に付した。
逆相クロマトグラフィーはC4カラム(1 x 150mm, フェノメネクス・ジュピター社, C4, 5μm, 300Å)を用いて行った。溶出は、0.1% TFA中のアセトニトリルの直線的勾配(60分で0-100%)によって、フロー率50μl/minにおいて行った。検出は214nmにおいて行った。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間法(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーは過去に記述された通りである(Ylonen et al., 1999)。ペプチド質量フィンガープリント解析においては、解析に先立って、mMETRNLタンパク質を還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンで消化した。
1.2mg/mlのコラゲナーゼD(ロシュ社)及び4.8 mg/mlのディスパーゼ(ロシュ社)で補足したパパイン・ディソーシエーション・システム(ウォーシントン・バイオケミカル社, US)を用いてラットP5後根神経節を分離した。続いて、細胞を、5%熱不活性化ウマ血清(セロメッド社)を含んだDMEM/F12倍地(インビトロゲン社)中、1.5 x 104 細胞/cm2の密度で、ポリオルニチン/ラミニンでコーティングした24ウェル・プレートに蒔いた。1時間して細胞が付着したら、培地を、1%ゲンタマイシン(インビトロゲン社)を含み、リコンビナント・マウス・メテオリン・ライク又はラットNGF (R&Dシステムズ, 556-NG)を示されているように追加した、無血清DMEM/F12に置き換えた。細胞を37℃ 及び 5% CO2下で1日間インキュベートし、4% PFAで固定した。免疫細胞化学は、固定した培養物に対して、1% 正常ウマ血清及び0.1% Triton X-100を含んだPBS中で1:15,000に希釈されたβ-III-チューブリン抗体(シグマ社, T-8660)、続いてビオチン化二次抗体(ウシ抗マウス)、続いてABCエリート・キット (ベクター・ラボラトリー社)を使用して行い、その後、3'3'-ジアミノベンジジン(DAB)を色素原として呈色反応を起こさせた。細胞あたりの神経突起の長さはVisioMorph画像解析を用いて定量化した。3重実験(triplicate)のウェルからの少なくとも9個の画像を使用した。
P2-P3の新生児ラットを断頭により犠牲にした。脳を摘出し、冷したニューロベーサル培地(ギブコ‐インビトロゲン社、カールスバード、CA)中に入れ、ビブラトームを使用することによって250μm厚の脳切片を得た。SVZは、側脳室の前角の側壁から摘出し、直径150 - 200μmの小片にカットした。SVZ外植片を1:5の比率でマトリゲル(ベクトン・ディキンソン社)と混ぜ、4個のマルチウェル・プレートで培養した。37℃(25分)で重合後、B-27 (ギブコ‐インビトロゲン社)、N2因子(ギブコ‐インビトロゲン社)、及びペニシリン/ストレプトマイシン(ギブコ‐インビトロゲン社)で補足したニューロベーサル培地をコントロール培養物に加えた。他の条件においては、同じ培地を用いたが、異なる濃度のマウスMETRNLを含ませた(20 ng/ml 及び 200 ng/ml)。培養物は、加湿された5% CO2、37℃インキュベーター中で維持された。
24時間後、SVZ外植片をPBSで洗浄し、PBS中の4% PFA、0.05% Triton-X 100で15分間固定した。PBS、2%ウマ血清、1% BSA、0.1%ゼラチン、0.1%Triton X-100、及び0.05% Tween 20を含むブロッキング・バッファーと共に1時間、外植片をインキュベートした。外植片を室温で1時間、ヤギ抗DCX (1:100, サンタクルーズ社)と共にインキュベートした。外植片をPBSでリンスし、室温で1時間、Cy3コンジュゲート抗ヤギ二次抗体(1:200, ジャクソン・イミュノリサーチ社)と共にインキュベートした。切片をPBSでリンスし、スライドグラスに載せてカバーグラスをかけた。
24時間後、外植片をDIC顕微鏡でモニターし、各外植片からの移動チェーンの長さを、AxioVisionソフトウェア(ツァイス社)を使用することによって計測した。外植片の端から識別可能な移動先端までの距離の測定を行い、それを、コントロール測定で得られた値に対して標準化した。2つの独立したアッセイにおいて実験を行った。
SVZ組織をP2-P5仔ラットから単離し、前述のように培養した。外植片を20 ng/mlMETRNL又は10ng/ml SDF1aで24時間刺激し、4% PFA/0.05% Triton-Xで固定する前に1時間再び刺激した。固定後、外植片をPBSで洗浄し、1:50に希釈したFITC-ファロイジン(インビトロゲン社)で20分間染色した。染色した外植片をスライドグラスに載せ、蛍光顕微鏡を使用して可視化した。
SVZ組織をP2-P5仔ラットから単離し、細胞を剥離するために、アキュターゼ(accutase)と共に15分間インキュベートした。アキュターゼ処理後、細胞をガラスのパスツール・ピペットで分離し、数を数え、オルニチン・フィブロネクチンでコーティングされたカバーグラス上に置いた。SVZ細胞は、B-27、N2サプリメント、グルタミン、及びペニシリン-ストレプトマイシンで補足したニューロベーサル培養培地中で維持した。24時間後、細胞を、20ng/ml METRNL 又は 10 ng/ml SDF1-aで1時間刺激し、その後4% PFA/0.05% Triton-Xで固定した。固定後、細胞をPBSで洗浄し、1:50に希釈したFITC-ファロイジン(インビトロゲン社)で20分間染色した。染色した細胞をスライドグラスに載せ、蛍光顕微鏡を使用して可視化した。
フリースタイル293F細胞を、コドン最適化しHISタグを付けたヒトMETRNLを発現するpNS1nでトランスフェクトした。細胞培養及び精製は前に記述されたように行った。
メテオリン・ライク及びメテオリンは、分泌性タンパク質の新規のファミリーを構成する
ヒトMETRNL及びMETRNタンパク質は42%の同一性を有し、成熟配列中に10個存在するシステイン残基のうち10個全てが保存されている(図1及び3)。多様な生物からのEST及びゲノム配列の解析により、ゼブラフィッシュ及びカエルのゼノパス・トロピカリスを含む全ての脊椎動物にMETRNLのオーソログが存在することが示唆される一方、ショウジョウバエ(Drosophilamelanogaster)や線虫(Caenorhabditis elegans)のような無脊椎動物にはオーソログが見出されない(図3)。
METRNLの生化学的特性を研究することができるように、フリースタイル(登録商標)293-F細胞でリコンビナント・タンパク質を産生した。図5Aで明らかなように、mMETRNL-HISタンパク質は、トランスフェクション後96時間に至るまで馴化培地中に蓄積し続ける。従って、スケールアップ培養において、トランスフェクションの96時間後に馴化培地を回収し、リコンビナントmMETRNL-HISをTALONレジンへの結合により精製した。図5Bに示す精製タンパク質のSDS-PAGE解析において、抗HIS免疫反応性のバンドは一つだけであり、このバンドは、ゲルコード・ブルー染色で検出される単一バンドのサイズに相当する。ここでもやはり、mMETRNL-HISは予測される31.2 kDaよりも大きな分子量の位置で泳動する。精製されたタンパク質はさらに逆相クロマトグラフィーにより解析された。クロマトグラム(図5C)において、mMETRN-HISは単一の突出したピークとして溶出し不純物をほとんど含まないことが明らかである。フラクション≧31に見られる肩は、不均一にグリコシル化されたタンパク質においては典型的なものである。グリコシル化について調べるため、精製リコンビナント・タンパク質を異なる脱グリコシル化酵素及びそれらの組合せと共にインキュベートした。図5Dにおいて、N-グリカナーゼによる処理が分子量の低下を引き起こし、他の脱グリコシル化酵素を添加しても分子量はさらには減少しないことが明らかである。これは、mMETRNLがN結合型糖鎖のみを有する糖タンパク質であることを意味する。
mMETRNLの神経栄養性作用を調べるために、精製されたリコンビナント・タンパク質を、ラットの分離されたP5後根神経節(DRGs)の培養物に加えた。メテオリン・ライクは確かに、NGFに匹敵する強度で、神経突起伸長を刺激する(図6)。栄養性サポートが無ければDRG細胞からの神経突起伸長はごく限られているが、NGF又はmMETRNLの存在下では、β-III-チューブリン陽性のニューロンから長い神経突起が形成される。観察された効果は、神経細胞の生存の増強、神経細胞の再生の増進、及び神経細胞の分化を含み得る。
後根神経節の神経突起伸長に対して起こるMETRNLの効果(図6)は、このタンパク質が細胞膜再構築のレベルで機能を有することを示唆する。もしそうであるならば、METRNLがSVZ由来の神経芽細胞のような移動性細胞の行動に影響を与えることも考えられる(もしこれらの細胞がMETRNLの存在により誘発される信号を伝達するための機構を発現しているのであれば)。神経芽細胞移動における機能の可能性を調べるために、精製したリコンビナントMETRNLを、三次元細胞外マトリックス(マトリゲル)中で培養されたラットSVZ外植片に加えた。METRNLの存在は、細胞移動の有意な増加を用量依存的に引き起こし、そこでは、200ng/mlの濃度のMETRNLが、コントロール条件と比較して移動距離を約50%増加させた(図7)。SVZ由来の外植片は不均一な組成を有するため、どの細胞がMETRNLに応答しているのかを確認することが重要である。従って、移動性神経芽細胞で発現されるマーカーであるダブルコルチン(DCX)に対して特異的な抗体を用いて、免疫染色を行った。その結果、移動増加を示した細胞は神経芽細胞であって星状膠細胞ではないことが明らかになった(図7)。
METRNLの神経芽細胞移動に対する効果を確認するために、精製したリコンビナント・マウスMETRNLを、三次元細胞外マトリックス(マトリゲル)中で培養されたラットSVZ外植片に加えた。マウスMETRNLの存在は、用量依存的に、細胞の移動の有意な増加を引き起こした。200ng/mlのMETRNLは、コントロール条件と比較して、移動距離をほとんど2倍にした(図8A)。METRNL濃度を2000ng/mlに上げても移動はさらに増加しなかった。移動する細胞は、ダブルコルチン(DCX)陽性でグリア線維酸性タンパク質(GFAP)陰性であることから、神経芽細胞であることが確認された(図8B)。
材料及び方法
実験デザインの概要を図11Aに示す。初めに、クリック誘発聴性脳幹反応(ABR)を利用して、18匹のモルモット(アルビノ) を試験して正常な聴覚の有無を調べ、次の3つの実験グループに分けた:
1.METRNL処置を受ける、正常聴覚動物
2.METRNL処置を受ける、3週間難聴動物
3.人工外リンパ(AP)処置を受ける、3週間難聴動物
METRNLはらせん神経節の生存及び電気的応答性に対してインビボで正の作用を有する
内耳の感覚上皮及び付随の神経節の損傷(音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、並びに付随の症状群を含むがこれらに限定されない)の治療におけるMETRNLの効果を確認するために、難聴の動物モデルにおいてMETRNLを試験した。手短に言えば、モルモットを単一用量のネオマイシンで難聴化し、3週間後、タンパク質注入によりMETRNL処置を行った(図11A)。異なる処置に関係する閾値変化をモニターするために、手術の2、9及び16日後に電気的聴性脳幹反応(eABR)を記録した(図 11B)。METRNL処置された正常聴覚モルモットにおける閾値は実験全体を通して安定であり(〜50 μA)、METRNLは聴覚に対して有害な作用を有しないことが示された。難聴化された2つのグループにおいては、最初の記録時において閾値が上昇しており、重度の聴覚低下が示されていた。重要なことに、人工外リンパで処置したコントロール・グループにおいてはeABR閾値が上昇し続けたが、それと比較して、METRNLで処置したグループにおいては、16日間の処置後、統計学的に有意な(p < 0.05)、より低い閾値を示した。これは、らせん神経節ニューロンの生存及びその電気的応答性に対して、METRNLはインビボで正の作用を有することを示唆するものである。これは短期間についての実験であり、より長期に渡る処置ではさらに聴覚が改善されることが予測される(Maruyama et al., Neurobiol Dis. 2008 Jan;29(1):14-21)。従って、METRNLは、内耳の感覚上皮及び付随の神経節の損傷(音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、並びに付随の症状群を含むがこれらに限定されない)を治療するために使用され得る。
生存作用の試験は、小脳顆粒細胞の培養物をリコンビナントMETRNLで処理した後、本質的には記述されたように毒性濃度のグルタミン酸に晒すことによって行う(Daniels and Brown, 2001; J. Biol. Chem. 276: 22446-22452)。
生存作用についての試験は、本質的には記述されたとおりに(Nomura et al., 2001; Dev. Neurosci. 23: 145-152)、カリウム欠乏状態の小脳顆粒細胞の培養物を段階希釈のリコンビナントMETRNLで処置することにより行われる。
DIV3において、MTSアッセイ法を用いて生存を測定する。
手短に述べると、胎生期12.5日目(E12.5)のマウス胚の脊髄を摘出して分離する。運動ニューロンは、ニューロトロフィン受容体p75の細胞外ドメインに対する抗体を用いて免疫親和性精製し、続いて磁気性マイクロビーズを使用した細胞ソーティングをすることに基づくプロトコールを使用して精製する(Arce et al. 1999 J Neurosci Res 55: 119-126)。精製した運動ニューロンを、ポリオルニチン/ラミニンでコーティングした4-ウェル組織培養ディッシュ(ナンク社)に、ウェルあたり1000細胞の密度で蒔く。培養培地は、B27サプリメント(ライフ・テクノロジー社)、ウマ血清(2% v/v)、L-グルタミン(0.5 mM)、及び2-メルカプトエタノール(25μM)で補足したニューロベーサル培養培地(ライフ・テクノロジー社)である。
培養条件:
分離された中脳細胞の培養物は、微細な修正を加える他は過去に記述された通りに(Friedman and Mytilineou 1987 Neurosci. Lett. 79:65-72)調製する。手短に述べると、妊娠13-16日目のスプラーグドーリー・ラット胚の脳からの吻側中脳被蓋(rostralmesencephalic tegmentum)を、無菌状態で顕微鏡下で摘出し、Ca2+及びMg2+ を含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水(ギブコ社、Gaithersburg, Md.)に回収し、穏やかな研和(trituration)により分離させる。細胞を、400 μlの培地を含む直径16-mmの組織培養ウェル(ファルコン社、Lincoln Park, N.J.、24-ウェル・プレート)にウェルあたり100μl蒔き、ウェルあたりの細胞数が2.5-3.5x105という密度となるようにする。当該培養ウェルは、事前に、10 mMホウ酸ナトリウム(pH 8.4)中の0.1 mg/mlのポリL-オルニチン溶液に37℃で3時間晒し、ミリ-Q水で3回洗浄し、アールの平衡塩類溶液(ギブコ社)で1回洗浄しておく。フィーディング培地(10/10)は、グルコース(33 mM)、炭酸水素ナトリウム(24.5 mM)、グルタミン(2 mM)、HEPES (15 mM)、ペニシリンG (5 U/ml)、ストレプトマイシン(5 μg/ml)、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(ギブコ社)、及び10% 熱不活性化ウマ血清(ギブコ社)で補足した最少必須培地(MEM、ギブコ社)から成る。当該培養物は、37℃で、6.5%CO2を含む水飽和環境下に維持される。3時間後、殆どの細胞がウェルの底に付着したら、培地を500 μlの新鮮な培地と取り替える。この時点で、ドーパミン系神経栄養活性についてアッセイするためのサンプル(METRNLタンパク質の溶液)の段階希釈を、2ウェルずつ(in duplicate)に加え、プレートを37℃インキュベーター中でインキュベートする。1週間後、培養物をフルオロデオキシウリジン(13 μg/ml)及びウリジン (33μg/ml)で24時間処理してグリアの過剰な増殖を阻止し、その後、ウシ胎児血清を含まない上記培地で培養する。当該フィーディング培地を週ごとに取り替える。
中脳細胞培養においてドーパミン系神経栄養活性についてアッセイする前に、全ての馴化培地サンプルは次のように脱塩する。100μl の10/10倍地(担体として)をCentricon10(アミコン社)に加え、10分間静置する。アッセイするサンプルの一定分量をCentriconに加え、続いて1 mlのダルベッコ高グルコース修正イーグル培地(炭酸水素を含まないが10 mM HEPES, pH 7.2 を含む)(溶液A)を加え、5,000Xgで70分間、遠心する。残余分(約0.1ml)を、新鮮な溶液Aで1.1 mlに戻し、2回再濃縮化する。当該サンプルを、培養ウェルに加える前に、0.11 μmのウルトラフリーMC無菌デュラポア・ユニット(ミリポア社、マサチューセッツ州ベッドフォード)で濾過する。
微細な修正を加えたほかは過去に記述されたように(Friedman and Mytilineou (1987) Neurosci. Lett. 79:65-72)、6又は7日目の培養物においてトリチウム標識ドーパミン(3H-DA)の取り込みを行い、全ての溶液は37℃に維持する。手短に述べると、培養培地を除去し、5.6 mMグルコース、1.3 mM EDTA、0.1 mM アスコルビン酸及び0.5 mMパージリン(モノアミン酸化酵素の阻害剤である)を含むクレブス-リンゲルのリン酸緩衝液(pH 7.4)から成る0.25 mlの取り込み用緩衝液で2回リンスする。当該培養物を0.25 ml の 50 nM 3H-DA(ニューイングランド・ヌクレアー社、マサチューセッツ州ボストン。比放射能36-37 Ci/mmol)と共に15分間、37℃においてインキュベートする。インキュベーション混合物を除去することにより3H-DA取り込みを停止させ、0.5 mlの取り込み用緩衝液で2回細胞を洗浄する。細胞から3H-DAを放出させるために、当該培養物を0.5 mlの95%エタノールと共に30分間、37℃でインキュベートし、それから10 mlのエコライト (ICN社、カリフォルニア州アーヴァイン)に加え、シンチレーションカウンター上でカウントを行う。ブランク値は、取り込み用緩衝液に0.5mMのGBR-12909 (RBI社)(ドーパミン系ニューロンの高親和性取り込みポンプの特異的阻害剤である)を加えることによって得る(Heikkila et al. 1984 Euro J.Pharmacol. 103:241-48)。
VSV-G偽型(rLV)ベクターは、過去に記述されたように産生される(Zufferey et al.,1997, J. Virol, 73:2886-2892; Rosenblad et al. 2000 Mol Cell Neurosci.15(2):199-214)。手短に述べると、緑色蛍光タンパク質(GFP)又はMETRNLのcDNAを有する伝達プラスミドpHR'CMV-Wを、ヘルパー・プラスミドpMD.G及びpCMVDR8.91と共に、293T細胞に共トランスフェクトする。ウイルス粒子を含む上清を、トランスフェクションの2日後及び3日後に回収し、116 000gにおける超遠心により濃縮化する。293T細胞の濃縮化上清の段階希釈により、rLV-GFPベクター・ストックのタイターを決定する。過去に記述されたように (vonSchwedler et al. 1993 Virol. 67(8):4945-55)RNAスロット・ブロット技術を用いて、rLV-METRNL 及び rLV-GFPのウイルス・ストックについてウイルス粒子のタイターを決定し、TUとrLV-GFPについて得られたウイルス粒子タイターとの間の比から、rLV-METRNLベクターのタイターをTU/mlとして見積もる。
hNS1細胞における試験
hNS1(旧称HNSC.100)は、胚前脳由来、多分化能性の、神経幹細胞のクローン細胞株であり、過去に記述されている(Villa et al. 2000, Exp Neurol, 161(1):67-84、Villa et al 2004, Exp Cell Res. Apr 1; 294(2):559-70)。細胞は、Department of Molecular Biology, Centre of Molecular Biology SeveroOchoa, Autonomous University of Madrid-CSIC, Campus Cantoblanco, Madrid, 28049,SpainのAlberto Martinez Serrano氏から提供される。hNS1培養物は、20 ng/mlのEGF及びbFGFで補足した無血清HSC培地中で、5%CO2及び37℃の環境下で、ポリL-リジン・コートしたTCフラスコ内で増殖する。HSC培地は、N2及び1% BSAで補足したDMEM/F12 (1:1)から成る。分化実験においては、hNS1細胞は、無マイトジェンの0.5% FBS含有HSC培地中、105細胞/cm2の密度で、50 μg/mlポリ-リジンでコートしたカバーグラス上に播種する。播種の1日後、当該分化用培地を、METRNL含有培地に置き換える。コントロール培養物にはHSC培地を与える。次の日に培地の3分の2を取り替え、その後2,3日ごとに取り替える。播種の4日後、培養物を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、免疫組織化学で染色する。
10%正常ウマ血清でブロッキングした後、培養物をGFAP(pAb ウサギ抗ウシ, 1:1000, DAKO社)及びβ-チューブリン(mAb クローンSCL:3D10, 1:1000, シグマ社)に対する一次抗体と共にインキュベートする。リンスした後、それぞれ二次抗体であるビオチン化ウマ抗マウス抗体(ベクターラボラトリー社、1:200)(ストレプ-Cy3(ジャクソン・イミュノリサーチ社、1/200)の使用を後に伴う)、及び、Alexa Fluor 488-標識ヤギ抗ウサギ抗体(モレキュラープローブズ社、1:200)と共に培養物をインキュベートする。細胞核を0.2 μg/mlのHoechst33258で対比染色する(Villa et al., 2004)。解析においては、細胞(核)の数、並びにGFAP及びβ-チューブリン陽性細胞の数を、63x対物レンズを用いた共焦点顕微鏡でカウントする。
Claims (30)
- 以下の何れかを含む、神経細胞が欠失又は損傷する神経系の疾患、障害、又は損傷を治療するための医薬、
i) 以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド:
a) SEQ ID NO. 7のアミノ酸配列;及び
b) SEQ ID NO. 7のアミノ酸配列の配列バリアントであって、前記SEQ ID NO. 7に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、神経栄養性作用、神経保護作用、神経発生作用、神経再生作用、神経移動作用、及び、神経細胞の成長、増殖、生存、又は分化に対する作用からなる群から選択される生物学的活性を有する配列バリアント;
ii) 上記i)のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子、
iii) 上記ii)の単離された核酸分子を含む発現ベクター、
iv) 上記iii)の発現ベクターで形質転換又は形質導入された宿主細胞の組成物、又は、
v) 感染性ウイルス粒子を産生することができるパッケージング細胞株であって、当該ウイルス粒子は、5'レトロウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージング・シグナル、上記i)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現できるように当該ポリヌクレオチド配列に連結されたプロモーター、DNA第2鎖合成のためのオリジン、及び3'レトロウイルスLTRを含むレトロウイルス科由来ゲノムを含む、パッケージング細胞株。 - 前記ポリペプチドが、SEQ ID No. 7の配列を有するタンパク質に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載の医薬。
- 前記ポリペプチドが、SEQ ID No. 7の配列を有するタンパク質に対して、少なくとも98%の配列同一性を有する、請求項1に記載の医薬。
- SEQ ID NO. 7と比較して変化している、前記配列バリアントのアミノ酸が、以下の化1又は化2において、星印を付されていないものの中から選択されたアミノ酸である、請求項1から3のいずれかに記載の医薬。
- 前記ポリペプチドが、少なくとも1つの分子内シスチン架橋を形成することができる、請求項1から4のいずれかに記載の医薬。
- 前記核酸分子が、SEQ ID No. 16の配列を有する核酸分子に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載の医薬。
- 前記核酸分子が、SEQ ID No. 16の配列を有する核酸分子に対して、少なくとも98%の配列同一性を有する、請求項1に記載の医薬。
- 前記ベクターが、レンチウイルス、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV、又はレトロウイルス・ファミリーに由来するベクター、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、HSV、コロナウイルス、ウシパピロマウイルス、及びMo-MLVからなる群から選択される、請求項1に記載の医薬。
- 前記宿主細胞が、不死化網膜色素上皮細胞、ARPE-19細胞、ヒト不死化線維芽細胞、ヒト不死化星状膠細胞、ヒト神経性幹細胞又は前駆体細胞、ヒト・グリア性幹細胞又は前駆体細胞、及び胎児性の幹細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬。
- 以下を含む、移植可能な生体適合性細胞装置:
(i) ポリペプチド及び/又はベクターの拡散を許容する半透膜;及び
(ii) 当該半透膜の中にカプセル化された、宿主細胞の組成物又はパッケージング細胞株を含む中心部;
ここで、当該ポリペプチドは、a) SEQ ID NO. 7のアミノ酸配列、及びb) SEQ ID NO. 7のアミノ酸配列の配列バリアントであって、前記SEQ ID NO. 7に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、神経栄養性作用、神経保護作用、神経発生作用、神経再生作用、神経移動作用、及び、神経細胞の成長、増殖、生存、又は分化に対する作用からなる群から選択される生物学的活性を有する配列バリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであり、
当該ベクターは、レンチウイルス、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV、又はレトロウイルス・ファミリーに由来するベクター、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、HSV、コロナウイルス、ウシパピロマウイルス、及びMo-MLVからなる群から選択されるベクターであり、
当該宿主細胞の組成物は、当該ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含む発現ベクターで形質転換又は形質導入された宿主細胞の組成物であり、かつ、
当該パッケージング細胞株は、感染性ウイルス粒子を産生することができるパッケージング細胞株であって、当該ウイルス粒子は、5'レトロウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージング・シグナル、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現できるように当該ポリヌクレオチド配列に連結されたプロモーター、DNA第2鎖合成のためのオリジン、及び3'レトロウイルスLTRを含むレトロウイルス科由来ゲノムを含む、パッケージング細胞株である。 - 半透膜の内部に配置されたマトリックスをさらに含む、請求項10に記載の装置。
- 繋留アンカーをさらに含む、請求項10又は11に記載の装置。
- 前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経の受傷に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
- 前記疾患、障害、又は損傷が、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、てんかん、神経障害、末梢神経障害、及び神経障害性疼痛である、請求項13に記載の医薬。
- 前記疾患が、末梢神経障害である、請求項14に記載の医薬。
- 前記疾患が、神経障害性疼痛である、請求項14に記載の医薬。
- 前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロン及びニューロンのプロセスの変性に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
- 前記疾患、障害、又は損傷が、パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症に伴う神経損傷である、請求項16に記載の医薬。
- 前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロンの機能異常及び/又は欠失に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
- 前記疾患、障害、又は損傷が、代謝疾患、栄養障害、毒性傷、悪性病変、及び/又は遺伝的な若しくは特発性の異常、糖尿病、腎機能不全、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、及び感染により引き起こされる状態である、請求項19に記載の医薬。
- 前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、神経根損傷、神経根裂離、上腕神経損傷、末梢神経障害、及び神経障害性疼痛である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
- 前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、脳、脳幹、脊髄、及び末梢神経系におけるグリアの変性又は硬化に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
- 前記グリアが、乏突起膠細胞、星状膠細胞、及びシュワン細胞である、請求項22に記載の医薬。
- 前記疾患、障害、又は損傷が、多発性硬化症、視神経炎、大脳硬化症、感染後脳脊髄炎、及びてんかん、並びに付随の症状、感覚性運動失調、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調、及び小脳萎縮症である、請求項22に記載の医薬。
- 前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、網膜、光受容体、及び付随の神経に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
- 前記疾患、障害、又は損傷が、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、及び付随の症状である、請求項25に記載の医薬。
- 前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、前庭聴覚複合体の感覚上皮及び付随の神経節に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
- 前記疾患、障害、又は損傷が、音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、及びメニエール病である、請求項27に記載の医薬。
- 前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、内耳手術及びインプラントの移植により引き起こされる損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
- 前記損傷が、アブミ骨摘出術、乳突削開術、及び鼓室形成術、並びに人工内耳又は中耳インプラントの移植により引き起こされる損傷である、請求項29に記載の医薬。
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