DE102016204700A1

DE102016204700A1 - Rekombinante Herstellung von Subfatin

Info

Publication number: DE102016204700A1
Application number: DE102016204700.0A
Authority: DE
Inventors: Inge Broer; Hsuan-Wu Hou; Jana Huckauf; Udo Meyer
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 2016-03-22
Filing date: 2016-03-22
Publication date: 2017-09-28

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Subfatin (meteorin-like protein/Metrnl) in einer Pflanzenzelle oder Hefezelle. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Pflanzenzelle oder Hefezelle, die ein für Subfatin kodierendes Polynukleotid umfasst, sowie deren Verwendung zur Herstellung von Subfatin. Die Erfindung umfasst zudem ein Polynukleotid, welches für Subfatin kodiert und einen Promotor enthält, der die Expression von Subfatin in Pflanzenzellen oder Hefezellen veranlasst, sowie die Verwendung von Subfatin, welches gemäß dem beschriebenen Verfahren aus Pflanzenzellen oder Hefezellen erhältlich ist, zur Behandlung einer Krankheit.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Subfatin (meteorin-like protein/Metrnl) in einer Pflanzenzelle oder Hefezelle. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Pflanzenzelle oder Hefezelle, die ein für Subfatin kodierendes Polynukleotid umfasst, sowie deren Verwendung zur Herstellung von Subfatin. Die Erfindung umfasst zudem ein Polynukleotid, welches für Subfatin kodiert und einen Promotor enthält, der die Expression von Subfatin in Pflanzenzellen oder Hefezellen veranlasst, sowie die Verwendung von Subfatin, welches gemäß dem beschriebenen Verfahren aus Pflanzenzellen oder Hefezellen erhältlich ist, zur Behandlung einer Krankheit.
Subfatin (oder meteorin-ähnliches Protein (Metrnl)) ist ein Adipokin, welches das Potenzial besitzt, Körpergewicht zu reduzieren. Es ist ein zirkulierender Faktor, der normalerweise nach körperlichem Training oder bei Kälte im Muskel gebildet wird (Li et al., 2014, CNS Neurosci. Ther. 20, 344–354; Rao et al, 2014). Bisher konnte Subfatin als neues Adipokin nur in gentechnisch veränderten E. coli und in menschlichen Nierenzelllinien (HEK) produziert werden.
Ein Anstieg von Subfatin sorgt für eine Steigerung des Gesamtkörperenergieaufwandes, was mit einer Umwandlung von weißen (fettspeichernde Zellen) in braune Fettzellen (fettverbrennende Zellen), einer verbesserten Glucosetoleranz in adipösen Mäusen, dem Anstieg der Expression Fettverwertungs-spezifischer Gene und der Produktion anti-entzündlicher Cytokine verbunden ist (Li et al., 2014, CNS Neurosci. Ther. 20, 344–354; Rao et al., 2014, Cell 157, 1279–1291; Sidossis et al., 2015, J. Clin. Invest. 125, 478–486).
Zudem wurde gezeigt, dass Subfatin eine eosinophil-abhängige Erhöhung der IL-4-Expression bewirkt und so die Aktivierung von Makrophagen in adipösen Geweben fördert. Subfatin scheint zudem nicht durch eine direkte Wirkung auf Adipozyten zu wirken, sondern über die Stimulation verschiedener Immunzelltypen, die in adipöse Zellen einzudringen und deren Umwandlung indizieren (Rao et al., 2014, Cell 157, 1279–1291).
Subfatin (Metrnl) ist zudem als Überlebens- und Wachstumsfaktor für Nervenzellen bekannt ( US9068015 B2 ) und wurde als diagnostischer Marker für Darmkrebs vorgeschlagen ( CN104808004 A ).
Eine Behandlung von metabolischen Störungen durch Verwendung von Metrnl bzw. der Modulation der Expression oder Aktivität von Metrnl (Subfatin) wurde ebenfalls vorgeschlagen ( US2015322460 A1 , WO2014183207 A1 , WO2015062167 A1 ).
Bis heute konnten die positiven Effekte von Subfatin als Adipokin allerdings nur gezeigt werden, wenn dieses direkt im Zielorganismus produziert wurde. Dies kann im Menschen nur durch körperliches Training oder Kälteexposition erfolgen. Für eine Therapie von adipösen Menschen wäre eine orale Gabe von Subfatin, vorzugsweise durch eine direkte Aufnahme von Subfatin-enthaltenden Nahrungsmitteln, erstrebenswert. Diese konnte bisher allerdings nicht gezeigt werden.
In den letzten Jahren hat sich der Anteil an fettleibigen Menschen stark erhöht und die damit verbundenen Begleiterkrankungen, beispielsweise reduzierte Insulinempfindlichkeit, Typ-II-Diabetes oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen, ebenso. Menschen verbringen zunehmend mehr Zeit in sitzenden Tätigkeiten, oftmals in Kombination mit ungesunder Ernährung, was zu Fettleibigkeit (Adipositas) und entsprechenden Änderungen im Körperstoffwechsel, beispielsweise zu einer vermehrten Ausschüttung von Adipokinen, führen kann. Nach gängiger WHO-Definition liegt eine Adipositas ab einem Körpermasseindex (BMI) von 30 kg/m² vor.
Ursprünglich als Problem der entwickelten Nationen angesehen, hat Adipositas sich zu einer globalen Epidemie entwickelt. Folglich nehmen auch die Kosten für die Behandlung von Übergewicht und Adipositas weltweit zu (Patel, 2015, Metab. doi: 10.1016/j.metabol.2015.08.001). Daher ist die langfristige Behandlung von Fettleibigkeit ein erklärtes Ziel zur Verbesserung der allgemeinen Gesundheit und zur Reduktion von Folgekosten. Eine Vielzahl von Therapieoptionen für die Behandlung von Fettleibigkeit, beispielsweise eine Veränderungen der Lebensgewohnheiten, Adipositaschirurgie oder Pharmakotherapie, sind bekannt. Vor allem bei Patienten, die durch eine Veränderung der Lebensgewohnheiten keinen Gewichtsverlust erreichen konnten, wird oftmals eine pharmakologische Behandlung vorgeschlagen (Apovian et al., 2015, J. Clin. Endocrinol. Metab. 2, 342–62).
Derzeit werden drei Hauptgruppen von Medikamenten verwendet, um Fettleibigkeit zu behandeln: 1) zentral wirkende Medikamente, die die Nahrungsaufnahme direkt beeinflussen; 2) Medikamente, die peripher wirken und die Nahrungsaufnahme beeinträchtigen; 3) Medikamente, die den Energieverbrauch erhöhen. Bisher wurden nur wenige Medikamente für langfristiges Gewichtsmanagement von der FDA (Food and Drug Administration) zugelassen, beispielsweise Orlistat, Lorcaserin, Phentermine/Topiramat, Naltrexon/Bupropion und Liraglutid (Rodgers et al, 2012, Dis. Model. Mech. 5, 621–626). Diese führen in erster Linie zu einer Regulation des Appetits oder hemmen Pankreaslipasen, wodurch die Fettaufnahme aus dem Darm reduziert wird (Borgstrom, 1988, Biochim. Biophys. Acta. 962, 308–316). Alle gängigen Therapien zur Behandlung von Adipositas sind für den Patienten allerdings meist sehr unangenehm, da entweder muss gehungert werden muss, der Magen durch einen chirurgischen Eingriff verkleinert oder oftmals unerwünschte Nebenwirkungen der eingesetzten Medikamente auftreten.
Das Potential von Wirkstoffen, welche direkt in die Stoffwechselwege von Geweben, beispielsweise Fett- oder Leberzellen, eingreifen, konnte bisher nur in präklinischen Studien gezeigt werden (Rodgers et al, 2012, Dis. Model. Mech. 5, 621–626). Subfatin konnte kürzlich als neues Adipokin identifiziert werden, welches ein Potenzial als Medikament zur Behandlung von Adipositas besitzt. Positive Effekte von Subfatin (z.B eine Reduktion des Körpergewichts) konnten allerdings nur gezeigt werden, wenn Subfatin direkt im Zielorganismus produziert wurde. Um Subfatin für den Menschen (oral) verfügbar zu machen, muss es in alternativen Zellsystemen produziert bzw. bereitgestellt werden.
Da Subfatin glykosyliert sein muss, um seine Wirksamkeit als Adipokin zu entfalten, ist die Produktion eines aktiven Wirkstoffes in prokaryotischen Zellsystemen, beispielsweise in E.coli, nicht möglich. Eine Expression von Subfatin bzw. dessen Aufreinigung mittels C-terminalen His-Tag konnte zwar in menschlichen Nierenzelllinien (HEK293) gezeigt werden. Nachteile einer Produktion in Säugetier-Zellen (z.B. HEK293 oder COS-7), sind beispielsweise hohe Produktionskosten, geringe Ausbeute, eingeschränkte Skalierbarkeit (z.B. Inkubator-Platz, da Produktion nur bei 37°C erfolgen kann), komplizierte und teure Aufreinigung, sowie eventuell erzeugte oder im Isolat enthaltene, für den Menschen toxische, Stoffe.
Die Verwendung von (isolierten) Proteinen als orale Applikation hat sich zudem bereits oft als nicht praktikabel erwiesen (Muheem et al, 2014, Saudi Pharm. J. doi: 10.1016/j.jsps.2014.06.004). Problematisch ist vor allem die Magen-Darm Passage und die Resorption. Viele Proteine haben eine sehr kurze biologische Halbwertszeit in vivo, was vor allem dem schnellen Abbau in der Leber und anderen Körpergeweben durch proteolytische Enzyme zuzuordnen ist (Muheem et al, 2014, Saudi Pharm. J. doi: 10.1016/j.jsps.2014.06.004).
Als zu lösende Aufgabe kann deshalb die Bereitstellung eines alternativen Verfahrens zur Produktion von Subfatin, insbesondere in einer für die orale Verabreichung geeigneten Formulierung, angesehen werden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Subfatin (meteorin-like protein/Metrnl) umfassend das Bereitstellen einer Pflanzenzelle oder Hefezelle, die ein Polynukleotid umfasst und exprimiert, das für Subfatin kodiert.
Der Begriff „Herstellung“ wie hier verwendet umfasst die Biosynthese von Subfatin einschließlich der in den produzierenden Zellen stattfindenden post-translationalen Modifikationen. Insbesondere ist hier die in den produzierenden Zellen durchgeführte Glykosylierung eingeschlossen. Die Herstellung im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jedoch auch einen oder mehrere weitere Schritte mit einschließen. Diese Schritte können sein: Das Herstellen von Pflanzen- oder Hefezellen, die Polynukleotide enthalten, die die Expression von Subfatin erlauben, durch molekularbiologische Verfahren, wie Rekombinationstechnologien. Die Kultivierung und Vermehrung dieser Zellen unter geeigneten Bedingungen, die die Expression von Subfatin erlauben. Im Fall von Pflanzenzellen, das Herstellen von Pflanzen, die die Pflanzenzellen umfassen. Das Ernten der Zellen, der Pflanzen oder Pflanzenteile einschließlich von daraus erhältlichem Saatgut. Eine mögliche teilweise oder komplette Reinigung des Subfatins aus den geernteten Zellen, den Pflanzen oder den Pflanzenteilen. Die galenische Formulierung, falls gewünscht, des gewonnenen Subfatins für ein Präparat für die orale Verabreichung, z.B. eine Tablette, Kapsel, Pulver, Lösung, Gel oder ähnliches.
Der Begriff „Subfatin“, auch bekannt als meteorin-like protein (Metrnl), steht für ein Protein aus Säugetieren, das in die Klasse der Adiponektine gehört. Es ist ein zirkulierender Faktor, der im Muskel nach dem Training und im Fettgewebe nach der Kälteaussetzung induziert und von den entsprechenden Geweben sezerniert wird. In HEK produziertes Subfatin führt nach Verabreichung zu einem Anstieg des Gesamtkörperenergieaufwand mit der Bräunung der weißen Fettdepots, verbessert die Glukosetoleranz bei übergewichtigen und/oder diabetischen Mäusen und vermittelt die Expression von Genen der Fettthermogenese und die Expression von anti-inflammatorischen Zytokinen. Subfatin stimuliert eine Eosinophilen-abhängige Erhöhung der IL-4-Expression und fördert die alternative Aktivierung von Fettgewebe-Makrophagen, die für die erhöhte Expression der thermogenetische und entzündungshemmende Genprogramme im Fettgewebe erforderlich sind. Interessanterweise scheint Subfatin nicht direkt auf Adipozyten zu wirken, sondern stimuliert viel mehr verschiedene Immunzelltypen, die prothermogene Aktivität auf das Fettgewebe ausüben.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Subfatin ist bevorzugt murines oder humanes Subfatin. Besonders bevorzugt ist das im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Subfatin humanes Subfatin. Eine Polynukleotidsequenz kodierend für humanes Subfatin ist in der Datenbank GenBank unter der Hinterlegungsnummer NP_001004431.1 und GI:52345387 hinterlegt. Diese Sequenz weist 936 Nukleotide auf und ist ebenfalls in SEQ ID NR: 1 des beiliegenden Sequenzprotokolls gezeigt. Die dazugehörige Aminosäuresequenz ist ebenfalls unter der Hinterlegungsnummer Q641Q3 in der Datenbank UniProtKB hinterlegt. Sie weist 311 Aminosäuren auf und ist als SEQ ID NR: 2 gezeigt. Murine DNA Sequenzen kodierend für Subfatin der Spezies Mus Musculus bzw. Rattus Norvegicus sind unter der Hinterlegungsnummer NM_144797.3 (CCD S25781.1) bzw. NM_001014104.1 (coding sequence 197..1132) in der Datenbank GenBank zu finden und ebenfalls in SEQ ID NR: 3 bzw. SEQ ID NR: 5 des beiliegenden Sequenzprotokolls gezeigt. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen sind unter der Hinterlegungsnummer Q8VE43 (Mus Musculus) bzw. Q5RJL6 (Rattus Norvegicus) in der Datenbank UniProtKB hinterlegt und ebenfalls in SEQ ID NR: 4 bzw. SEQ ID NR: 6 des beiliegenden Sequenzprotokolls gezeigt. Weitere Informationen zur Struktur und Funktion von Subfatin sind erhältlich in Li et al., 2014, CNS Neurosci. Ther. 20, 344–354, 2014 und Rao et al., 2014, Cell 157, 1279–1291.
Funktionelle Varianten der zuvor genannten Polynukleotide und Polypeptide sind ebenfalls als Subfatine im Sinne der Erfindung anzusehen. Hierbei kann es sich um natürliche oder nicht-natürlich auftretende Varianten von Subfatin handeln, bei denen die biologische Aktivität, beispielsweise die Fähigkeit den Energieaufwand zu steigern, weiße Fettzellen in braune Fettzellen umzuwandeln oder die Glucosetoleranz zu verbessern, erhalten bleibt. Funktionelle Varianten von Subfatin können vorzugsweise mindestens eine Aminosäure-Substitution, -Addition oder Deletion enthalten. Die Varianten müssen hierbei nicht exakt die gleiche Aktivität aufweisen. Es muss jedoch genug Aktivität vorhanden sein, um die biologische Funktion auszuüben. Vorzugsweise sollen die Varianten noch mindestens 25%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95% der biologischen Aktivität des oben beschrieben Subfatins mit SEQ ID NR: 2 aufweisen. Die biologische Aktivität kann hierbei bevorzugt gemessen werden wie bei Li et al., 2014, CNS Neurosci. Ther. 20, 344–354, Rao et al., 2014, Cell 157, 1279–1291 oder Sidossis et al., 2015, J. Clin. Invest. 125, 478–486 beschrieben.
Besonders bevorzugt werden die Varianten kodiert von einer Nukleinsäuresequenz, die zumindest 40%, zumindest 50%, zumindest 60%, zumindest 70%, zumindest 80%, zumindest 90%, zumindest 95%, zumindest 96%, zumindest 97%, zumindest 98% oder zumindest 99% identisch ist mit einer der spezifischen Nukleinsäuresequenz für Subfatin gemäß SEQ ID NR: 1 wie oben beschrieben. Die Nukleinsäuresequenzidentität wird hierbei typischerweise mit einem Sequenzvergleichsalgorithmus bestimmt. Hierzu werden zwei Sequenzen miteinander entweder über ihre gesamte Länge oder über die Länge eines zuvor definierten Segmentes verglichen, das mindestens die Hälfte der Nukleotide einer der beiden Sequenzen ausmacht. Innerhalb des Vergleichsfensters, d.h. des Bereiches der beiden Sequenzen, der verglichen werden soll, wird die Zahl an identischen Nukleotiden an identischen oder vergleichbaren Positionen bestimmt. Hierzu kann es nötig sein, Lücken in eine Sequenz einzuführen. Im Rahmen der Erfindung soll ein Aminosäuresequenz besonders bevorzugt mit einem im Stand der Technik bekannten Algorithmus durchgeführt werden, insbesondere mit einem der folgenden Algorithmen, die auf der Homepage des NCBI zur Verfügung gestellt werden: BLASTn, megablast oder discontiguous blast (siehe Johnson 2008, Nucleic Acids Res. 1; 36 (Web Server issue): W5–9). Bevorzugt sind hierbei die vorgegebenen Standard-Einstellungen zu verwenden.
Besonders bevorzugt weisen die Varianten eine Aminosäuresequenz auf, die zumindest 40%, zumindest 50%, zumindest 60%, zumindest 70%, zumindest 80%, zumindest 90%, zumindest 95%, zumindest 96%, zumindest 97%, zumindest 98% oder zumindest 99% identisch ist mit einer der spezifischen Aminosäuresequenzen für Subfatin aus SEQ ID NR: 2 wie oben beschrieben. Die Aminosäuresequenzidentität wird hierbei typischerweise mit einem Sequenzvergleichsalgorithmus bestimmt. Hierzu werden zwei Sequenzen miteinander entweder über ihre gesamte Länge oder über die Länge eines zuvor definierten Segmentes verglichen, das mindestens die Hälfte der Aminosäuren einer der beiden Sequenzen ausmacht. Innerhalb des Vergleichsfensters, d.h. des Bereiches der beiden Sequenzen, der verglichen werden soll, wird die Zahl an identischen Aminosäuren an identischen oder vergleichbaren Positionen bestimmt. Hierzu kann es nötig sein, Lücken in eine Sequenz einzuführen. Im Rahmen der Erfindung soll ein Aminosäuresequenz besonders bevorzugt mit einem im Stand der Technik bekannten Algorithmus durchgeführt werden, insbesondere mit einem der folgenden Algorithmen, die auf der Homepage des NCBI zur Verfügung gestellt werden: BLASTp, PSI-BLAST, PHI-BLAST oder DELTA-BLAST (siehe auch Johnson 2008, Nucleic Acids Res 36 (Web Server issue): W5–9; Boratyn 2012, Biol Direct. 17(7): 12; Ye 2012, BMC Bioinformatics 13: 134; Ye 2013, Nucleic Acids Res 41: (Web Server issue): W34–40; Marchler-Bauer 2009, Nucleic Acids Res 37 (Database issue): D205–10; und Papadopoulos 2007, Bioinformatics 23(9): 1073–9.) Bevorzugt sind hierbei die vorgegebenen Standard-Einstellungen zu verwenden.
Besonders bevorzugt werden die Varianten im Sinne der Erfindung durch Nukleinsäuresequenzen kodiert, die mit der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz oder mit den für die spezifischen Aminosäuresequenzen, also bevorzugt der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz, kodierenden Nukleinsäuresequenzen in der Lage sind, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren. Stringente Hybridisierungsbedingungen im Sinne der vorliegenden Erfindungen sind beschrieben in Southern 1975, J. Mol. Biol. 98(3): 503–517.
Ebenfalls vom als Subfatin im Sinne der Erfindung umfasst sind Fusionsproteine. Bevorzugt umfassen diese Fusionsproteine neben der Aminosäuresequenz des Subfatins noch zusätzliche Aminosäuresequenzen, die beispielsweise Proteinfragmente aus anderen Proteinen, sogenannte Peptide mit funktionellen Domänen, darstellen und die zusätzliche biologische Aktivitäten vermitteln können. Bevorzugt dienen diese zusätzlichen Proteinsegmente der Reinigung oder der Stabilisierung des Subfatin Fusionsproteins oder verbessern dessen Resorption oder immunogene Eigenschaften. Geeignete Domänen sind im Stand der Technik bekannt und der Fachmann kann entsprechende Fusionsproteine durch Fusion der jeweiligen Proteine oder Proteinfragmente an entweder N- oder C-terminus des Subfatins generieren.
Bevorzugt weist das für das Subfatin im erfindungsgemäßen Verfahren kodierende Polynukleotid daher mindestens eine weitere Polynukleotidsequenz auf, die für ein immunstimulierendes und/oder stabilisierendes Peptid kodiert oder für eine Fett-bindende Domäne und/oder Stärke-bindende Domäne kodiert.
Immunstimulierend bedeutet hierbei, dass die Peptidsequenz im Körper eine Immunantwort hervorruft. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die hervorgerufene Immunantwort durch verschiedene Peptide bzw. in verschiedenen Individuen unterschiedlich stark sein kann. Zudem ist bekannt, dass eine Immunantwort nicht unbedingt in allen Individuen messbar ist, jedoch eine signifikante Menge an Individuen eine messbare Immunantwort aufweisen. Methoden, um eine Immunantwort zu bestimmen bzw. die Signifikanz gemessener Werte zu beurteilen, sind dem Fachmann bekannt. Solche Methoden umfassen beispielsweise molekularbiologische Methoden, beispielsweise die Messung von ausgeschütteter inflammatorischer Zytokine. Immunstimulierende Peptide oder Proteine sind im Stand der Technik bekannt.
Stabilisierend bedeutet hierbei, dass die Peptidsequenz die Stabilität eines Polypeptides erhöht. Dies kann beispielsweise eine längere Lebensdauer des Polypeptides im Körper eines Säugetiers (in vivo), z.B. während der Magenpassage oder in der Blutbahn, oder eine geringere Degradation bzw. höhere Resistenz gegenüber bestimmten Stoffen/Chemikalien, beispielsweise während eines Aufreinigungsverfahrens (in vitro), sein. Methoden, um die Stabilität eines Polypeptides zu bestimmen sind dem Fachmann bekannt, und beinhalten beispielsweise spektroskopische Verfahren, Elektrophorese-Verfahren (SDS-Page) oder Aktivitätsmessungen. Stabilisierende Peptide oder Proteine sind im Stand der Technik bekannt.
Eine Fett-bindende Domäne im Rahmen der Erfindung bezeichnet ein Peptid, welches in der Lage ist an ein Lipid bzw. eine Fettsäure zu binden. Umfasst sind dabei sämtliche Fettsäuren, beispielsweise verzweigte, unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren. Solche Fett-bindenden Domänen sind im Stand der Technik bekannt.
Eine Stärke-bindende Domäne bezeichnet ein Peptid, welches in der Lage ist an Stärke bzw. Bestandteile davon zu binden. Stärkemoleküle bestehen aus D-Glucose-Einheiten, die über glykosidische Bindungen miteinander verknüpft sind. Stärke besteht meist zu 20–30 % aus Amylose und zu 70–80 % aus Amylopektin. Stärke kann durch bestimmte Enzyme (α-, β-Amylasen) gespalten werden, wodurch Dextrine bzw. Disaccharide entstehen. Stärke-bindende Domänen können aus solchen Enzymen abgeleitet werden. Sie sind zudem im Stand der Technik bekannt.
Besonders bevorzugt sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung Fusionsproteine mit stabilisierenden Proteinen oder Fragmenten davon eingesetzt werden. Als stabilisierendes Protein oder Fragment davon kommt insbesondere die nicht-toxische B Untereinheit des Choleratoxins (CTB) in Betracht und/oder Transferrin. CTB wird als nicht toxische Untereinheit des Choleratoxins von den GM1-Rezeptoren der Darmschleimhaut erkannt und vermittelt den Transfer ins Blut. Transferrin vermittelt die Aufnahme durch die Darmepithelzellen, den sog. Enterozyten, sowie anschließend den Transport in die Blutbahn. Beide Fusionspartner kommen alleine oder in Kombination bevorzugt für eine Fusion am N-Terminus des ZP Proteins oder Peptids in Betracht. Ebenso sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung Fusionsproteine mit Proteinen oder Fragmenten davon eingesetzt werden, die die Resorption verbessern. Hierzu soll vorzugsweise am C-Terminus eine Fusion mit einer Fett-bindenden Domäne vorgenommen werden. Das Subfatin Protein oder Peptid soll durch eine Formulierung für die orale Applikation bevorzugt vor dem sauren Milieu im Magen geschützt werden, so dass es erst im Dünndarm freigesetzt wird. Durch die Fusion von Oleosin an den C-Terminus erfolgt Formulierung bereits während der Reinigung durch die Bindung der Fusionsproteine an Fette.
Der Begriff „Pflanzenzelle“ bezeichnet eine eukaryotische Zelle aus der Lebewesen-Gruppe der Pflanzen (Embryophyta). Charakteristische Merkmale von Pflanzenzellen, wie beispielsweise das Vorhandensein eines zentralen Zellsaftraums (Vakuole) oder der Besitz von Plastiden (z.B. Chloroplasten, Chromoplasten), sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Pflanzenzellen sind solche aus Nutzpflanzen, besonders bevorzugt Nutzpflanzen, die Eiweiß- oder Öl-reiche Samen produzieren. Zu den Pflanzen mit Eiweiß-reichen Samen gehören Leguminosen, wie Erbsen, Bohnen, Kichererbsen, Linsen, Sojabohnen, Erdnüsse oder Lupinen. Zu den Pflanzen mit Öl-reichen Samen gehören Raps, Soja, Sonnenblumen, Erdnuss, Canola, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Borretsch oder Bäume wie Ölpalme oder Kokosnuss. Daneben können aber auch weitere Nutzpflanzen wie Tabak verwendet werden. Besonders bevorzugt sind Pflanzenzellen aus Leguminosen und ganz besonders bevorzugt Erbsen, wie Pisum sativum.
Die erfindungsgemäß verwendete Pflanzenzelle kann in Zellkultur vorliegen oder im Organismus, das heißt in einer entsprechenden Pflanze oder eines Teils davon. Pflanzenteile können sein Blätter, Stängel, Früchte, Wurzeln oder Saatgut der Pflanzen (Samen).
Die Pflanzenzelle soll im erfindungsgemäßen Verfahren ein Polynukleotid umfassen und exprimieren, das für Subfatin kodiert. Polynukleotide, die für Subfatin kodieren und erfindungsgemäß eingesetzt werden können wurden bereits ausführlich andernorts hierin beschrieben. Damit die Pflanzenzelle Subfatin exprimieren kann, müssen diese Polynukleotide mit Expressionskontrollsequenzen verbunden werden. Dies kann entweder durch Integration in das Genom der Pflanzenzelle an eine Stelle geschehen, an der das für Subfatin kodierende Polynukleotid von endogenen Expressionskotrollsequenzen der Pflanzenzelle exprimiert werden kann. Hierzu ist üblicherweise eine gerichtete Integration nötig. Geeignete molekularbiologische Techniken, wie homologe Rekombination, sind dem Fachmann bekannt. Alternativ muss das Subfatin kodierende Polynukleotid mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen z.B. in einem geeigneten Expressionsplasmid, welches anschließend in die Pflanzenzelle eingebracht wird, versehen werden. Im Rahmen der Bereitstellung von Zellen im erfindungsgemäßen Verfahren werden solche Pflanzenzellen zunächst hergestellt.
Erfolgt die Expression in einer Pflanzenzelle in einer Pflanze, kann die Expression des Subfatins mittels Gewebe-spezifischer Promotoren gezielt in bestimmten Geweben der Pflanze, z.B. im Samen, erfolgen. Das produzierte Subfatin kann dann durch Ernten der Pflanzen und anschließende Abtrennung des Subfatin-produzierenden Gewebes erfolgen, z.B. durch Ernten der Blätter, Früchte oder der Samen.
Sofern Subfatin Fusionsproteine hergestellt werden sollen, können diese im produzierenden Gewebe vorteilhafterweise über ihre Fett- oder Stärke-bindenden Domänen gezielt mit den Fetten oder Polysachariden im Gewebe, z.B. im Samen, interagieren und an diese gebunden werden können. Alternativ kann das Subfatin auch unter der Kontrolle eines ubiquitär exprimierenden Promotors exprimiert werden. Geeignete Promotore sind dem Fachmann bekannt, ebenso wie Plasmide oder andere Vektoren, die zur Herstellung transgener Pflanzen eingesetzt werden können. Geeignete Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen sind dem Fachmann ebenfalls hinlänglich bekannt.
Geeignete Klonierungsvektoren sind insbesondere Vektoren, die in mikrobiellen Systemen replizierbar sind, also vor allem Vektoren, die eine effiziente Klonierung in Hefen oder Pilze gewährleisten, und die stabile Transformation von Pflanzen ermöglichen. Zu nennen sind insbesondere verschiedene für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignete, binäre und kointegrierte Vektorsysteme. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakterium-vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit denen entsprechend transformierte Organismen identifiziert werden können. Während bei kointegrierten Vektor-Systemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Dadurch sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium zu replizieren. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV, pCAMBIA und pLH9000 sowie pLH7000. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens 2000, Trends in Plant Science 5: 446–451. Die Vektoren mit den für die erfindungsgemäß eingesetzten ZP Proteine oder Peptide kodierenden Nukleinsäuren lassen sich in Mikroorganismen, insbesondere E. coli und Agrobacterium tumefaciens, unter selektiven Bedingungen stabil propagieren und ermöglichen einen Transfer von heterologer DNA in Pflanzen oder Mikroorganismen. Mittels der Klonierungsvektoren können die zu exprimierenden Polynukleotide in Organismen wie Mikroorganismen oder Pflanzen eingebracht werden und damit zur Pflanzentransformation verwendet werden. Geeignete Vektoren dafür sind veröffentlicht in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225)).
Bevorzugt handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressionsvektor. Diese können neben Promotoren auch noch weitere Expressionskontrollsequenzen enthalten, z.B. Enhancer, RNA stabilisierende Elemente oder Polyadenylierungselemente. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, einschließlich der Literaturstellen darin.
Besonders vorteilhaft können als samenspezifische Promotoren Promotoren wie der USP Promotor aber auch andere Promotoren wie der LeB4-, Bce4-, DC3, Phaseolin-, Oleosin- oder Napin-Promotor verwendet werden (siehe z.B. US 5,608,152 , WO98/45461 , US 5,504,200 , WO91/13980 ).
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erreichen, z.B. chemisch induzierbare Promotoren wie ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor ( WO 95/19443 ), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz 1992, Plant J. 2, 397–404) oder ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Besonders bevorzugt kann Subfatin im erfindungsgemäßen Verfahren stabil in transgenen Pflanzen exprimiert werden. Um eine stabile Integration des Subfatin kodierenden Polynukleotids in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollten sich wiederholende Sequenzmotive, die zur Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen führen können, vermieden werden. Die Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle zur Insertion der zu exprimierenden Polynukleotids folgt (vorteilhaft in einem Polylinker), und anschließend gegebenenfalls ein Terminator hinter dem Polylinker liegt. Diese Abfolge wiederholt sich mehrfach bevorzugt drei-, vier- oder fünfmal, so dass bis zu fünf Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und so zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt sich die Abfolge bis zu dreimal. Die Polynukleotide werden zur Expression über die geeignete Schnittstelle, beispielsweise im Polylinker, hinter den Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jedes Subfatin-kodierende Polynukleotid einen eigenen Promotor und gegebenenfalls eigenen Terminator.
Derartige vorteilhafte Konstrukte werden beispielsweise in DE 10102337 oder DE 10102338 offenbart. Es ist aber auch möglich mehrere Polynukleotide hinter einem Promotor und ggf. vor einem Terminator zu inserieren. Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Polynukleotide in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das heißt eine Polynukleotid kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass dadurch die Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der USP-, LegB4 oder DC3-Promotor und unterschiedliche Terminatoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich nur einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden.
Besonders bevorzugt werden Erbsensamen als Produktionssystem eingesetzt. Pflanzensamen erlauben nämlich ohne Trocknung und Kühlung eine stabile Lagerung des produzierten Subfatins. Die Erbse hat sich hier als besonders geeignet erwiesen.
Der Begriff „Hefezelle“ bezeichnet Zelle aus der Mikroorganismen-Gruppe der Hefen (einzellige Pilze). Hefen besitzen typische Zellstrukturen der Eukaryoten wie beispielsweise komplexe Membranstrukturen, Chromosomen und eine Vielzahl von Organellen einschließlich der Mitochondrien und des endoplasmatischen Retikulums. Bevorzugt gehört die Hefezelle der Gattung der Zuckerhefen (Saccharomyces) oder der Gattung der Pichia (Hansenula) an, besonders bevorzugt der Art Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris. Saccharomyces cerevisiae nutzt als Nährstoffquelle bevorzugt Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Saccharose, Maltose, Maltotriose oder Raffinose, während Pichia pastoris die Fähigkeit besitzt, Methanol als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle verwerten zu können.
Die Hefezelle soll im erfindungsgemäßen Verfahren ein Polynukleotid umfassen und exprimieren, das für Subfatin kodiert. Polynukleotide, die für Subfatin kodieren und erfindungsgemäß eingesetzt werden können, wurden bereits ausführlich andernorts beschrieben. Damit die Hefezelle Subfatin exprimieren kann, müssen diese Polynukleotide mit Expressionskontrollsequenzen verbunden werden. Dies kann entweder durch Integration in das Genom der Hefezelle an eine Stelle geschehen, an der das für Subfatin kodierende Polynukleotid von endogenen Expressionskotrollsequenzen der Hefezelle exprimiert werden kann. Hierzu ist üblicherweise eine gerichtete Integration nötig. Geeignete molekularbiologische Techniken, wie homologe Rekombination, sind dem Fachmann bekannt. Alternativ muss das Subfatin kodierende Polynukleotid mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen z.B. in einem geeigneten Expressionsplasmid, welches anschließend in die Hefezelle eingebracht wird, versehen werden. Im Rahmen der Bereitstellung von Zellen im erfindungsgemäßen Verfahren werden solche Hefezellen zunächst hergestellt.
Verfahren zur Generierung einer gentechnisch veränderten bzw. transgenen Hefezelle sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise die Klonierung von DNA und die transiente Transfektion oder stabile Integration von entsprechenden Vektoren. Geeignete Verfahren zur Transfektion von Hefen sind dem Fachmann bekannt und umfassen sowohl Elektroporation, als auch chemische Methoden. Promotoren können sowohl ein konstitutiv aktive als auch induzierbare Promotoren sein. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise pETF2 (konstitutiver Promotor des Gens TEF2), pGAL1 (Galaktose-induzierbarer Promotor) oder Aox1 und Aox2 (speziell für Pichia pastoris, induzierbar mit Methanol).
Im Fall von Subfatin Fusionsproteinen kann in allen Herstellungssystemen die Reinigung und Formulierung des hergestellten Subfatins über Fett oder Stärke als Bindematrix in einem Prozessschritt erfolgen. Bei einer sehr hohen Proteinexpression kann das Zellmaterial nach einem kurzen Zellaufschluss und Fettzusatz ohne Reinigung des Fusionsproteins direkt zu gewonnen werden. Grundsätzlich kann das Subfatin jedoch auch durch andere Reinigungsverfahren ganz oder teilweise gereinigt werden, wie Ionenaustausch-Chromatographie, Molekularsieb-Chromatographie, Affinitätschromatographie oder Kombinationen davon. Subfatin, das nicht als Fusionsprotein vorliegt, kann auch durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gereinigt werden. Hierbei kann ebenfalls eines oder mehrere der zuvor genannten Verfahren eingesetzt werden.
Die galenische Formulierung des gewonnenen Subfatins für ein Arzneimittel kann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren erfolgen. Je nach geplanter Verabreichung, kann das Arzneimittel eine Lösung sein, die Subfatin enthält, oder eine Trockensubstanz. Abhängig von der geplanten Darreichungsform kann ein Subfatin enthaltendes Arzneimittel Zusatzstoffe enthalten. Hierbei kann es sich um pharmazeutische Hilfsstoffe handeln, z.B. um feste, flüssige oder Gel-artige Trägerstoffe (z.B. Laktose, Sukrose, Terra alba, Gelatine, Agar, Pektin, Magnesiumstearat, Stearinsäure usw.), Stabilisatoren, Lösungsmittel (z.B. Wasser, Alkohole, Pufferlösungen, Salzlösungen usw.), Benetzungsmittel, die Freisetzung kontrollierende Substanzen usw., aber auch um weitere Wirkstoffe, insbesondere solche, die geeignete sind die in der Beschreibung andernorts genannten Erkrankungen zu behandeln oder deren Symptome zu lindern. Alle verwendeten Zusatzstoffe müssen pharmazeutisch verträglich sein und dürfen mit der Wirkung des Subfatins nicht interferieren. Weitere Details zur Arzneimittelformulierung sind beschrieben in der pharmazeutischen Standardliteratur, z.B. in Remington´s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Bevorzugt wird das Subfatin, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, als Präparat für die orale Verabreichung formuliert, z.B. als eine Tablette, Kapsel, Pulver, Lösung, Gel oder ähnliches.
Sofern im erfindungsgemäßen Verfahren Pflanzen oder Pflanzenteile zur Herstellung des Subfatins eingesetzt wurde, kann auf eine galenische Formulierung auch gänzlich verzichtet werden. Das in der Pflanze oder dem Pflanzenteil vorliegende Subfatin wird dann zusammen mit der Pflanze oder dem Pflanzenteil verabreicht. Als Hilfsstoffe dienen dann die weiteren Pflanzeninhaltsstoffe, z.B. Fette, Proteine, Stärke etc., die mit dem Subfatin beim Verzehr der Pflanze oder dem Pflanzenteil aufgenommen werden. Wie bereits dargestellt, eignen sich Hülsenfrüchte besonders für die Herstellung von Subfatin und auch die Aufnahme in Form von Pflanzenteilen, nämlich den Hülsenfrüchten. Ganz besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß die Erbse, Pisum sativum, verwendet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass Subfatin, das in Pflanzenzellen hergestellt wird, eine zur oralen Verabreichung geeignete Glykosylierung aufweist. Eine Produktion des Subfatins in Pflanzen oder Pflanzenteilen macht zudem eine weitere Reinigung es Subfatins überflüssig. Dieses kann vielmehr direkt in Form der produzierenden Pflanze oder eines Pflanzenteils davon verzehrt werden. Besonders geeignet sind hierbei Erbsen, da Erbsensamen keine in normalen Verzehrmengen toxischen Stoffe enthalten. Erbsen können im Ganzen oder vermahlenes Erbsenpulver direkt oral verabreicht werden. Die erfindungsgemäß zur Herstellung von Subfatin eingesetzten Pflanzen enthalten üblicherweise auch keine Krankheitserreger, die schädlich für den Menschen sind. Eine weitere galenische Formulierung des in Pflanzen hergestellten Subfatins als Präparat für die orale Verabreichung ist daher in der Regel vorteilhafterweise entbehrlich.
Alternativ kann das in Pflanzen produzierte Subfatin zusätzlich mit einer der Fett-bindenden Domäne und/oder Stärke-bindenden Domäne versehen werden und über diese Domäne(n) kostengünstig isoliert und beispielsweise in Fetttopfen verpackt verabreicht werden. Eine ähnliche Glykosylierung tritt auch in Hefezellen auf.
Die Expression von Subfatin ist im Stand der Technik bereits in E. coli oder Säugetierzellen (z.B. HEK293 Zellen) beschrieben. E. coli als Expressionssystem hat den Nachteil, dass das Subfatin nicht glykosyliert werden kann, bei Säugerzellen bestehen Bedenken hinsichtlich Krankheitserreger. Zudem ist die Produktion teuer und in beiden Fällen wäre eine Reinigung des produzierten Subfatins und eine galenische Formulierung insbesondere zur oralen Verabreichung zwingend. Diese Nachteile können bei den erfindungsgemäß eingesetzten Pflanzenzellen oder Hefezellen als Herstellungssystemen umgangen werden.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind nachfolgend genaue beschrieben. Die Erklärungen der Begriffe sowie ihre Definitionen, die zuvor gemacht wurden, geltend entsprechend.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Polynukleotid, das für Subfatin kodiert, eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) eine Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NR: 1;
b) eine Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit SEQ ID NR: 2 kodiert;
c) eine Polynukleotidsequenz, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Polynukleotidsequenz nach a) oder b) hybridisiert; und
d) eine Polynukleotidsequenz, die zumindest 70% identisch ist zu einer Polynukleotidsequenz nach a) oder b).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Polynukleotid mindestens eine weitere Polynukleotidsequenz, die für ein immunstimulierendes und/oder stabilisierendes Peptid kodiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Polynukleotid mindestens eine weitere Polynukleotidsequenz, die für eine Fett-bindende Domäne und/oder Stärke-bindende Domaine kodiert.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält das Polynukleotid mindestens einen Promotor, der die Expression von Subfatin in Pflanzenzellen oder Hefezellen veranlasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stammt die Pflanzelle aus einer Pflanze, die der Familie der Hülsenfrüchte (Fabaceae) angehört, bevorzugt der Klasse Pisum, besonders bevorzugt der Spezies Pisum sativum oder wobei die Hefezelle bevorzugt der Gattung der Zuckerhefen (Saccharomyces), besonders bevorzugt der Art Saccharomyces cerevisiae und/oder bevorzugt der Gattung der Pichia (Hansenula), besonders bevorzugt der Art Pichia pastoris angehören.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst dieses das Gewinnen von Subfatin aus der Pflanzenzelle oder Hefezelle.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Pflanzenzelle von einer Pflanze umfasst.
Die Erfindung betrifft auch eine Pflanzenzelle oder Hefezelle umfassend ein Polynukleotid, das für Subfatin kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Pflanzenzelle oder Hefezelle ist die Pflanzen- oder Hefezelle eine Pflanzen- oder Hefezelle wie zuvor definiert ist.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine Pflanze, Samen oder Pflanzenteil, umfassend die erfindungsgemäße Pflanzenzelle.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Pflanzenzelle oder einer Pflanze, eines Samens oder eines Pflanzenteils zur Herstellung von Subfatin.
Die Erfindung betrifft ein Polynukleotid umfassend ein Polynukleotid, das für Subfatin kodiert und einen Promotor, der die Expression von Subfatin in Pflanzenzellen oder Hefezellen veranlasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Polynukleotids das Polynukleotid das für Subfatin kodiert, eine Polynukleotidsequenz wie zuvor definiert.
Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung umfassend Subfatin, das durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist.
Besonders bevorzugt liegt das Subfatin hierbei in für die orale Verabreichung geeigneter Form vor, bevorzugt in einer Pflanze oder einem Pflanzenteil oder als entsprechendes Präparat.
Schließlich betrifft die Erfindung Subfatin zur Verwendung für die Behandlung einer Krankheit, wobei das Subfatin durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist. Bevorzugt ist die Krankheit Adipositas oder Diabetes Typ II.
Der Begriff „Krankheit“ im Sinne der Erfindung betrifft jegliche Störung der Funktion eines Organs oder eines gesamten Organismus. Bevorzugt ist dieser Organismus ein Säugetier, besonders bevorzugt ein Mensch. Bevorzugte Krankheiten im Sinne der Erfindung sind Krankheiten, die mit einer Veränderung und/oder Störung des Metabolismus einhergehen, beispielsweise Insulinresistenz, Adipositas, Typ II Diabetes, Metabolisches Syndrom, sowie entsprechende Begleiterkrankungen, beispielsweise Herz-Kreislauf Erkrankungen aufgrund eines zu hohen Cholesterinspiegels oder Übergewichts. Besonders bevorzugt ist hierbei Adipositas oder Typ II Diabetes.
Unter Behandlung wird im Sinne der Erfindung jegliche Therapie angesehen, die zu einer Verlangsamung des Fortschreitens, Linderung, Vorbeugung oder Heilung der Krankheit führt. Es versteht sich, dass ein Behandlungserfolg nicht in allen Fällen eintreten muss. Vielmehr angedacht ist, dass ein statistisch signifikanter Anteil von Probanden mit Subfatin wirksam behandelt werden kann. Ob ein Anteil statistisch signifikant ist, kann durch im Stand der Technik bekannte statistische Methoden ermittelt werden, z.B. p-Wert Bestimmungen, Student´s t-Test, Mann-Whitney Test, etc., siehe Standartliteratur, z.B. Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983 für weitere Details.
Besonders bevorzugt liegt das Subfatin zur erfindungsgemäßen Verwendung hierbei in für die orale Verabreichung geeigneter Form vor, bevorzugt in einer Pflanze oder einem Pflanzenteil oder als entsprechendes Präparat.
Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen ist hiermit durch Bezugnahme auf den jeweiligen speziellen Offenbarungsgehalt und in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
BEISPIELE
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung. Sie dürfen im Hinblick auf den Schutzumfang nicht in einschränkender Weise ausgelegt werden.
Beispiel 1: Klonierung des Subfatin Fusionsproteins CHB::subfatin::FABD in Expressionsvektoren zur Expression eines Fusionspeptids in Erbsen
Subfatin wird N-Terminal mit Transferrin oder CTB über eine geeignete Linkersequenz fusioniert sowie am C-Terminus mit der entsprechenden Öl bindenden Domäne. Anschließend wird die digital erstellte Nukleotidsequenz an die Kodonnutzung der jeweiligen Kulturpflanze (bspw. Erbse) angepasst und das Fusionsgen synthetisch durch eine Firma hergestellt. Bei der Synthese werden geeignete Restriktionsstellen am 5‘ und 3‘-Ende der Nukleotidsequenz angehängt um die Klonierung hinter einen samenspezifischen Promotor (bspw. phas oder arc) und vor einen geeigneten Terminator vornehmen zu können. Als geeigneter Transformationsvektor kann z.B. der pLH9000 oder pLH7000 dienen.
Beispiel 2: Herstellung transgener Erbsenpflanzen
Die Transformation der Erbsen sowie die Regeneration transgener Erbsensprosse erfolgt nach einem modifizierten Protokoll von Polowick (Polowick et al., 2000, Plant Science 153.2, 161–170). Zunächst wird der Expressionsvektor in einen geeigneten Agrobakterienstamm gebracht z.B. EHA105. Getrocknete Samen der zu transformierenden Erbsensorte werden für 24 h über Nacht in ausreichen Wasser vorgequollen. Zur Oberflächensterilisation der Samen wird das restliche Wasser entfernt und die gequollenen Samen mit 70 %igem Alkohol für 5 min vollständig bedeckt. Zur weiteren Sterilisation der Samen wird der Alkohol abgegossen, die Erbsen mit einer 2 % Hypochloridlösung bedeckt und für 20 min bei 150 rpm geschüttelt. Die Hypochloridlösung wird anschließend verworfen und die Erbsen sechs Mal mit autoklaviertem A.dest. gewaschen. Die Erbsen verbleiben bis zur Tansformation im Wasser. Transformiert werden bei der Erbse Stücke (Scheiben des Embryos). Hierzu wird unter dem Binokular die Testa des Samen mit Pinzette und Skalpell abpräpariert, ein Kotyledone entfernt und die Wurzelspitze des freiliegenden Embryos mit dem Skalpell gekappt. Der verbleibende Embryo wird nun in dünne Scheiben zerlegt (3–5), die anschließend auf das B5H-Medium aufgelegt werden. Jede Embryoscheiben wird mit 2–5 µl Agrobokteriensuspension (OD = 0,06) überschichtet und für vier Tage bei 21 °C im Licht/Dunkel Rhythmus für vier Tage im Pflanzenschrank kokultiviert. Die Agrobakterien tragen auf ihrer t-DNA das synthetische Gen zur samenspezifischen Expression sowie den Selektionsmarker. Nach vier Tagen werden die Explantate vom B5H-Medium abgenommen und 45 min in Timentin gespült und auf Kallusinduktionsmedium (P1) überführt. Nach 14 Tagen werden diese Explantate auf Sprossinduktionsmedium (P2) überführt und sich entwickelnde Sprosse bei einer Länge von ca. 1 cm abgeschnitten und auf Wurzelinduktionsmedium gesteckt. Dass Sprossinduktionsmedium wird nach vier Wochen erneuert. Bewurzelte Sprosse werden analysiert, in vitro vermehrt und in Erde in das Gewächshaus überführt.
Beispiel 3: Herstellung eines pharmazeutischen Präparats aus transgenen Erbsen
1. Isolierung von Subfatin zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats /Nahrungsergänzungsmittels durch permanente Fixierung an eine mobile Matrix
Die Aufreinigung von Proteinen u. a. zur Immunisierung in einer hohen Reinheit ist sehr oft mit vielen Teilschritten verbunden, die in der Summe nicht nur zeit- und kostenintensiv sind, sondern auch zu Verlusten bei der Ausbeute des Produktes im Vergleich zur vorhandenen Ausgangsmenge führen. Zur Minimierung dieser Verluste und zur beschleunigten Gewinnung des Zielproteins bindet man auf biogredabierbare Beads GM1-Rezeptoren und gibt diese in die fragmentierte Suspension von Subfatin-produzierenden GVO/Zellen. In diese Organismen/Zellen werden mittels Genvektoren die Gensequenz für das Fusions-protein (bestehend aus Choleratoxin und dem Zielprotein) einkloniert, damit die gentechnisch modifizierten Organismen/Zellen das Fusionsprotein expremieren. Die Zugabe von den mit GM1-Rezeptoren beschichteten Beads führt zur Bildung von Komplexen, bestehend aus (biodegradierbaren) Beads + GM1-Rezeptoren + Subfatin, die sich mit wenigen Waschschritten zuverlässig, einfach und schnell von anderen, unerwünschten Proteinen separieren lassen. Dieser Komplex kann dann als pharmazeutisches Präparat bzw. Nahrungsergänzungs-produkt eingesetzt werden.
2. Isolierung von Subfatin ohne permanente Fixierung an eine Matrix
Die Aufreinigung bzw. Isolierung des Subfatins erfolgt genauso wie oberhalb beschrieben. Eine Erweiterung dieser Methode besteht darin, dass nach Bindung des GM1-Rezeptors an das Fusionsprotein der gesamte Komplex von der Matrix wieder abgelöst wird. Somit kann der gesamte Komplex wieder in Lösung aufgenommen werden. Dazu werden Reagenzien eingesetzt, die die Abspaltung des Rezeptors von der Matrix bewirken. Realisiert wird diese Ablösung durch Verwendung von biotinylierten GM1-Rezeptoren und magnetischen, Streptavidin-beschichteten Beads. Diese binden dann Das Fusionsprotein Subfatin über die gekoppelte Choleratoxin-Domäne. Nach Separation der magnetischen, Streptavidin-beschichteten Beads mit den daran gebundenen (biotinylierten) GM1-Subfatin-Komplexen von den restlichen Proteinen, kann nun die Trennung von der Matrix (den Beads) durch Hitzeeinwirkung erfolgen, indem die Bindung zwischen Biotin und Streptavidin gebrochen wird. Um die Zeit der Hitzeeinwirkung auf das Subfatin möglichst gering zu halten (Schutz vor möglicher Denaturierung durch thermische Effekte) durchströmen die Beads mit den daran gekoppelten GM1-Rezeptor-Subfatin-Komplexen in einem wässrigen Milieu eine dünne Kapillare/Röhre. Durch diesen geringen Durchmesser kann punktuell die Lösung sehr schnell erhitzt und danach wieder abgekühlt werden. Die Energiezufuhr kann beispielsweise durch einen Infrarotlaser erfolgen bzw. kann als Energiequelle ein elektromagnetisches Wechselfeld (Induktionsfeld) verwendet werden. Dabei werden durch das Induktionsfeld nur die magnetischen Beads erhitzt, so dass die Gefahr der Denaturierung des Subfatin weiter minimiert werden kann, weil weniger das wässrige Medium sondern in erster Linie die Matrix (magnetische Beads) erwärmt wird. Nach der Trennung der magnetischen (Streptavidinbeschichteten) Beads von den biotynilierten GM1-Rezeptoren muss eine erneute Wiederherstellung der Streptavidin-Biotin-Bindung verhindert werden. Das kann durch eine starke Erweiterung des Kapillar-/Rohrquerschnitts zusammen mit einer Ummantelung der erweiterten/vergrößerten Kapillare/Röhre mit einem Ringmagneten unmittelbar im Anschluss an die Stelle erfolgen, an der in der Kapillare die Energiezufuhr zur Wärmeerzeugung erfolgt. Es ergibt sich folgender Effekt: Während die abgetrennten GM1-Rezeptoren mit den gebundenen Subfatinkomplexen mit dem Flüssigkeitsstrom weiter transportiert werden, verbleiben die Beads an den Innenseiten der von den Magneten ummantelten Kapillarwände. Die freien GM1-Subfatin-Komplexe werden in Emulsion für pharmazeutische bzw. diätetische verwendet.
3. Isolierung von Subfatin mittels einer Proteaseschnittstelle
Dazu wird nachträglich zur Isolierung des GM1-Subfatin-CTB-Komplexes eine Abtrennung der CTB-Domäne vom restlichen Teil des Fusionsproteins (Subfatin) vorgenommen. Dazu wird vor der Einklonierung des Subfatin-Gens in den Expressionsvektor eine Gensequenz für eine Proteaseschnittstelle zwischen der für das Choleratoxin und dem „angehängten“ Zielprotein kodierende Sequenz eingefügt. Nach Synthese des Subfatins mit der Proteaseschnittstelle in einem entsprechenden Expressionssystem erfolgt wie im Anwendungsbeispiel 1 die Abtrennung von den anderen Proteinen bzw. Stoffgemischen. Durch Zugabe einer für die Schnittstelle passenden Protease kann von dem auf der Matrix fixierten Komplex (bestehend aus GM1-Rezeptor + Choleratoxindomäne + Proteaseschnittstelle + Zielproteindomäne) das Subfatin abgetrennt werden. Wird zuvor die eingesetzte Protease biotinyliert, kann mittels Streptavidin-gecoateter Beads die Protease wieder entfernt werden. Das sich nach Abtrennung in der Lösung befindende Subfatin wird nachfolgend mit Molekularsieben eingeengt bzw. aufkonzentriert und steht nun als reines Protein für pharmazeutische bzw. diätetische Zwecke zur Verfügung.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Herstellung von Subfatin (meteorin-like protein/Metrnl) umfassend das Bereitstellen einer Pflanzenzelle oder Hefezelle, die ein Polynukleotid umfasst und exprimiert, das für Subfatin kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid, das für Subfatin kodiert, eine Polynukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) eine Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NR: 1; b) eine Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit SEQ ID NR: 2 kodiert; c) eine Polynukleotidsequenz, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Polynukleotidsequenz nach a) oder b) hybridisiert; und d) eine Polynukleotidsequenz, die zumindest 70% identisch ist zu einer Polynukleotidsequenz nach a) oder b).
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid mindestens eine weitere Polynukleotidsequenz umfasst, die für ein immunstimulierendes und/oder stabilisierendes Peptid kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polynukleotid mindestens eine weitere Polynukleotidsequenz umfasst, die für eine Fett-bindende Domäne und/oder Stärke-bindende Domäne kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polynukleotid mindestens einen Promotor enthält, der die Expression von Subfatin in Pflanzenzellen oder Hefezellen veranlasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzelle aus einer Pflanze stammt, die der Familie der Hülsenfrüchte (Fabaceae) angehört, bevorzugt der Klasse Pisum, besonders bevorzugt der Spezies Pisum sativum oder wobei die Hefezelle bevorzugt der Gattung der Zuckerhefen (Saccharomyces), besonders bevorzugt der Art Saccharomyces cerevisiae und/oder bevorzugt der Gattung der Pichia (Hansenula), besonders bevorzugt der Art Pichia pastoris angehören.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend das Gewinnen von Subfatin aus der Pflanzenzelle oder Hefezelle.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Pflanzenzelle von einer Pflanze umfasst ist.
Pflanzenzelle oder Hefezelle umfassend ein Polynukleotid, das für Subfatin kodiert.
Pflanzen oder Hefezelle nach Anspruch 9, wobei die Pflanzen- oder Hefezelle eine Pflanzen- oder Hefezelle wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert ist.
Pflanze, Samen oder Pflanzenteil, umfassend die Pflanzenzelle nach Anspruch 9 oder 10.
Verwendung einer Pflanzenzelle nach Anspruch 9 oder 10 oder einer Pflanze, eines Samens oder eines Pflanzenteils nach Anspruch 11 zur Herstellung von Subfatin.
Polynukleotid umfassend ein Polynukleotid, das für Subfatin kodiert und einen Promotor, der die Expression von Subfatin in Pflanzenzellen oder Hefezellen veranlasst.
Polynukleotid nach Anspruch 13, wobei das Polynukleotid das für Subfatin kodiert, eine Polynukleotidsequenz wie in Anspruch 2 definiert umfasst.
Zusammensetzung umfassend Subfatin, das durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältlich ist.
Subfatin zur Verwendung für die Behandlung einer Krankheit, wobei das Subfatin durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältlich ist.
Subfatin zur Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Krankheit Adipositas oder Diabetes Typ II ist.