EA014887B1

EA014887B1 - Способ экспрессии инсулина в семенах растения, способ получения семян растений, содержащих инсулин, и растения, способные производить семена, содержащие инсулин

Info

Publication number: EA014887B1
Application number: EA200600050A
Authority: EA
Inventors: Морис М. Молони; Джозеф Бут; Ричард Кеон; Кори Найкифорук; Гейс Ван Роэйен
Original assignee: Сембайосиз Джинетикс Инк.
Priority date: 2003-06-17
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2011-02-28
Also published as: EP1959017A1; AU2004247762A1; EA200600050A1; TW200510529A; JP2011200251A; US20050039235A1; IL172469A0; IL172469A; TWI345587B; PT1633876E; CN1836047A; EP1633876B1; ES2313018T3; WO2004111244A2; KR20060052705A; US7547821B2; JP2007523611A; NZ544522A; EP1633876A2; CA2528741A1

Abstract

Описаны способы получения инсулина в растениях. В одном варианте данное изобретение относится к способу экспрессии инсулина в растениях, включающему: (а) получение конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащейся в 5'-3' направлении транскрипции в виде функционально связанных компонентов: (i) последовательности нуклеиновой кислоты, способной контролировать экспрессию в клетках семян растений; и (ii) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид инсулина; (b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и (с) выращивание клетки растений в зрелом растении, способном давать семена, где семена экспрессируют инсулин.

Description

Область техники

Данное изобретение относится к методам генной инженерии растений и получения инсулина. Более конкретно, данное изобретение относится к способам получения инсулина в семенах растений.

Уровень техники

Инсулин представляет собой важный пептидный гормон, требуемый для поддержания гомеостаза глюкозы в крови у млекопитающих, включая человека, и других позвоночных. У здоровых индивидуумов повышение уровня глюкозы в крови стимулирует β-клетки поджелудочной железы к выделению инсулина. Затем полипептид инсулина связывается со специфическими рецепторами в мышцах, печени и жировой ткани, что ведет к увеличению потребления глюкозы этими целевыми тканями, повышению метаболизма и снижению вырабатывания глюкозы печенью. Суммарный эффект этих реакций позволяет сохранить концентрации глюкозы в крови на постоянном уровне.

У индивидуумов, страдающих сахарным диабетом, аномально низкие концентрации инсулина присутствуют сами по себе в виде хронической гипергликемии. Клинические проявления хронической гипергликемии являются многообразными и включают слепоту, почечную недостаточность и, если не лечить, в конечном счете приводят к смерти. По некоторым оценкам, сахарный диабет стоит на третьем месте среди самых частых причин смерти в промышленно развитых странах после сердечно-сосудистых заболеваний и рака (ВагГоей, Н.С., 1987, С’йет. Епд. Ргод. 83: 49-54). Для достижения эффективного потребления и метаболизма глюкозы крови клетками пациентов, страдающих диабетом, можно лечить обычным введением инсулина. Приблизительно 0,7% населения мира страдает инсулинозависимым диабетом (сахарный диабет I типа) (^шкег, 1. ек а1., 2000, 1. оГ Вюкеейпо1, 84: 175-185). Кроме того, по оценкам, количество пациентов, у которых диагностирован диабет, удвоится приблизительно до 300 млн в ближайшие 25 лет (К)е1Й8еп, Т. ек а1., 2001, Вюкеейпо1. Сеп. Епд. Реу. 18: 89-121). Следовательно, возможность экономичного рентабельного производства человеческого инсулина в количествах, удовлетворяющих ожидаемую растущую мировую потребность в инсулине, крайне желательна.

1п утуо полипептид человеческого инсулина образуется в β-клетках поджелудочной железы в виде предшественника одинарной полипептидной цепи из 110 аминокислот, препроинсулина, который включает расположенные на Ν-конце 24 аминокислоты пре-последовательности, которые отщепляются сразу же после завершения биосинтеза цепи (Бкетег, И.Б., 2000. 1. Рей. Епйосгшок МекаЬ. 13: 229-239). Проинсулин состоит из цепей В и А, связанных связывающим пептидом (С-пептид). Во время упаковки гормона для секреции С-пептид отщепляется и удаляется конвертазами прогормона, РС2 и РС1/РС3 (Бкешег, И.Б., 2000. 1. Рей. Епйосгшок МекаЬ. 13: 229-239). Остается зрелый человеческий инсулин, белок из 51 аминокислоты, содержащий две полипептидные цепи, А (21 аминокислота) и В (30 аминокислот), связанные двумя межцепочечными дисульфидными связями. Кроме того, цепь А содержит одну внутрицепочечную дисульфидную связь. Человеческий инсулин получают с помощью множества различных методов. Микроорганизмы, такие как ЕксйепсШа сой (Бгаик ек а1., 1981, ш Рерййез: Ргосеейтдз оГ кйе 7^кЬАтепсап Рерййе Сйет18кгу Бутроыит (Кксй & Сго§8, ей§.), Р1егсе Сйеш1са1 Со., РоскГогй. 111, р. 729-739; Сйап ек а1., 1981, Ргос. №к1. Асай. 8ск И8А 78: 5401-5404), Зассйаготусез сегеу181ае (ТЫт ек а1., 1986, Ргос. №к1. Асай. 8ск И8А 83: 6766-6770), обычно применяют для рекомбинантного получения инсулина. У ^апд ек а1. (Вюкесйпок Вюепд., 2001, 73: 74-79) показано, что грибы, такие как РюЫа разког15, также подходят для получения инсулина. Альтернативные производственные процессы включают продуцирование в клеточных линиях млекопитающих, отличных от человека (Уападкка, М., ек а1., 1992, БЕВ8 Бекк 311: 55-59), выделение из поджелудочной железы человека, пептидный синтез или полусинтетическое превращение в человеческий инсулин свиного и бычьего инсулина. Однако все эти методы дают низкий выход и требуют более высоких затрат, чем это желательно.

Применение растений в качестве биореакторов для промышленного получения рекомбинантных белков хорошо известно, и было получено множество белков, включая человеческие терапевтические белки. Например, в патентах США 4956282, 5550038 и 5629175 описано получение γ-интерферона в растениях; в патентах США 5650307, 5716802 и 5763748 подробно описано получение сывороточного альбумина человека в растениях; в патентах США 5202422, 5639947 и 5959177 описано получение антител в растениях. Одним из значительных преимуществ систем получения рекомбинантного белка на основе растений является то, что при увеличении площади выращивания растений продукция белка может быть недорого масштабирована для получения значительно больших количеств белка. Наоборот, системы с применением ферментации и клеточных культур занимают много места, требуют большого количества оборудования и потребляют много энергии, что делает увеличение производственных мощностей очень дорогим. Однако, несмотря на то что применение растений в качестве биореакторов описано во множестве источников и несмотря на указанное выше ожидаемое увеличение потребности в больших количествах инсулина, в известном уровне техники представлено только ограниченное количество методов, которые наглядно показывают возможность получения инсулина в растениях (см. Атакама ек а1. №1киге Вюкесй., 1998, 16: 934-938; РСТ 01/72959).

У Агакага ек а1. описано получение слитого белка, содержащего инсулин, в клубнях трансгенного картофеля. Однако инсулин присутствует только в количествах не более 0,05% от общего количества

- 1 014887 растворимого белка, присутствующего в трансгенных клубнях. При уровне 0,05% от общего растворимого белка большие количества биомассы должны быть обработаны для экстрагирования белка, что не выгодно с точки зрения экономического применения картофельных клубней. Более того, у Лгакага с1 а1. не описано выделение инсулина из ткани картофельного клубня, но вместо этого предложен подход к профилактике наступления диабета I типа путем получения иммунотолерантности, который включает введение инсулина при поедании трансгенных картофельных клубней.

В заявке на патент РСТ XVО 01/72959 описано получение слитого белка, содержащего инсулин, в хлоропластах трансгенного табака. Однако, по существу, относя недостатки на счет уровней аккумуляции человеческих белков в тканях растений, изобретение, описанное в νθ 01/72959, ограничено в том, что получение в хлоропластах дает аккумуляцию инсулина в зеленых тканях, в первую очередь в листьях табака. Из-за относительно высокого содержания воды в зеленых тканях должно быть обработано большое количество биомассы. Дальнейшее получение инсулина потребует немедленного экстрагирования из биомассы сразу же после сбора, так как листья быстро высыхают при хранении.

Таким образом, с точки зрения недостатков, имеющихся в методах рекомбинантного получения инсулина в растениях известного уровня техники, в настоящее время не ясно, когда и как синтетические возможности растений могут быть использованы для достижения коммерческого получения инсулина в растениях. В данной области техники существует необходимость улучшения способов коммерческого получения инсулина в растениях.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение относится к улучшенным способам получения инсулина в растениях. В частности, данное изобретение относится к способам получения инсулина в семенах.

Следовательно, в данном изобретении представлен способ экспрессии инсулина в растениях, включающий:

(a) получение конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в виде функционально связанных компонентов:

(ί) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений; и (ίί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина;

(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и (c) выращивание клетки растений в зрелом растении, способном давать семена, где семена экспрессируют инсулин.

В предпочтительном варианте данного изобретения последовательностью нуклеиновой кислоты, способной контролировать экспрессию в семенах растений, является предпочтительный для семян промотор, такой как промотор фазеолина.

В предпочтительном варианте данного изобретения инсулин экспрессируется таким образом, который позволяет аккумулировать полипептид инсулина в мембране, окружающей внутриклеточный компартмент в клетках семян. Следовательно, в данном изобретении представлен способ экспрессии инсулина в растениях, который включает:

(ί) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений;

(й) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина; и (ΐϊϊ) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, способный удерживать полипептид инсулина в мембране, окружающей внутриклеточный компартмент;

В другом предпочтительном варианте данного изобретения мембраной, окружающей внутриклеточный компартмент, является эндоплазматическая сеть (ЕК) или ЕК-производная накопительная везикула. Следовательно, в данном изобретении представлен способ экспрессии инсулина в растениях, который включает:

(ί) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений; и (й) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина; и (ΐϊϊ) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, способный удерживать полипептид инсулина в ЕК или ЕК-производной накопительной везикуле;

- 2 014887

В другом предпочтительном варианте конструкцию химерной нуклеиновой кислоты вводят в клетку растений в условиях ядерной геномной интеграции. При таких условиях последовательность химерной нуклеиновой кислоты стабильно интегрируется в геном растения.

В еще одном предпочтительном варианте последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, оптимизирована для применения кодона растений и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающий пептид (С-пептид), укорочена. Предпочтительные последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением кодируют человеческий, бычий или свиной инсулин. В соответствии с данным изобретением последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность проинсулина, применяют, если проинсулин модифицирован путем укорачивания длины С-пептида.

В другом варианте в данном изобретении представлен способ получения семян, содержащих инсулин, из растений.

Следовательно, в данном изобретении представлен способ получения семян растений, содержащих инсулин, включающий:

(ί) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений; и (й) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина;

(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения;

(c) выращивание клетки растений в зрелом растении, способном давать семена; и (б) получение семян из указанных растений, где семена содержат инсулин.

Предпочтительно по крайней мере 0,1% от общего белка семян, присутствующего в семенах, составляет инсулин.

Семена могут применяться для получения популяции растений, каждое из которых содержит множество семян, экспрессирующих инсулин.

В данном изобретении также представлены растения, способные давать семена, экспрессирующие инсулин. В предпочтительном варианте данного изобретения растения способны дать семена, содержащие последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащую в 5'-3' направлении транскрипции:

(a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений, с которыми она функционально связана; и (b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина, где семена содержат инсулин.

В предпочтительном варианте последовательность химерной нуклеиновой кислоты интегрируют в ядерный геном растения.

В еще одном предпочтительном варианте данного изобретения применяемым растением является сафлор, лен или ЛгаЬ1бор818.

В еще одном аспекте данного изобретения представлены семена растений, экспрессирующие инсулин. В предпочтительном варианте данного изобретения семена растений содержат последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции:

(a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений, с которыми она функционально связана; и (b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина.

Предпочтительно по крайней мере 0,1% от общего белка семян, присутствующего в семенах, составляет инсулин. Семена являются источником, из которого желаемый полипептид инсулина, который синтезируется в клетках семян, может быть экстрагирован, и инсулин может применяться для лечения пациентов, страдающих диабетом.

Другие характеристики и преимущества данного изобретения становятся понятны из представленного ниже подробного описания. Должно быть понятно, что подробное описание и конкретные примеры, показывающие предпочтительные варианты, даны только для иллюстрации, так как множество изменений и модификаций в пределах объема данного изобретения становятся очевидны специалистам в данной области техники при прочтении подробного описания.

Краткое описание чертежей

Далее описаны чертежи, относящиеся к данному изобретению.

На фиг. 1 изображена нуклеотидная последовательность (8ЕО Ш N0:1) и выведенная последовательность аминокислот (8Е0 ΙΌ N0:2) слитого белка инсулина (РВ8-П98сЕу-К11р27-М1-КОЕЕ) р8В84404. Расчетная последовательность аминокислот представлена однобуквенным кодом. Выведенная последовательность аминокислот РК.8 сигнального пептида показана курсивом, выведенная последовательность аминокислот П98сЕу показана жирным шрифтом, выведенная последовательность аминокис

- 3 014887 лот Κ1ίρ27 подчеркнута, выведенная последовательность аминокислот мини-инсулина показана жирным курсивом и последовательность КОЕЬ показана жирным подчеркнутым шрифтом.

На фиг. 2 изображена нуклеотидная последовательность (8ЕО ΙΌ N0:3) и выведенная последовательность аминокислот (8Е0 ΙΌ N0:4) слитого белка инсулина (ОЬЕО-К11р8-К11р7-М1) ρ§Β§4405. Расчетная последовательность аминокислот представлена однобуквенным кодом. Выведенная последовательность аминокислот АгаЫ!ор818 (Найапа 18 кДа олеозина показана курсивом, выведенная последовательность аминокислот Κ1ίρ8 показана жирным шрифтом, выведенная последовательность аминокислот Κ1ίρ27 подчеркнута и выведенная последовательность аминокислот мини-инсулина показана жирным курсивом.

На фиг. 3 изображена нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:5) и выведенная последовательность аминокислот (8Е0 ΙΌ N0:6) слитого белка инсулина (РКБ-МЕтетраосновный линкер-Э9бсЕуКЭЕЬ) 4414. Расчетная последовательность аминокислот показана однобуквенным кодом. Выведенная последовательность аминокислот РК.8 сигнального пептида показана курсивом, выведенная последовательность аминокислот мини-инсулина (В30 тетраосновная) показана жирным шрифтом, выведенная последовательность аминокислот тетраосновного линкера подчеркнута, выведенная последовательность аминокислот Э98сЕу показана жирным курсивом и последовательность КОЕЬ показана жирным подчеркнутым шрифтом.

На фиг. 4 (А-Ό) показана рекомбинантная экспрессия слитых белков инсулина в трансформированных линиях ΑταΕίάορβίδ (Найапа (4404-2, -17, -20 и 4405-4) на основе окрашенного кумасси δΌδ-РАОЕ и вестерн-блот анализа. Стрелки указывают на положение миграции 38,5 и 34,2 кДа слитых полипептидов, РΚ.§-^98сЕν-Κ1^ρ27-МIν/Κ^Е^ и 0^Е0-Κ1^ρ8-Κ1^ρ27-МI соответственно в восстанавливающих условиях. На фиг. 4 А (окрашенный кумасси гель) и 4В (соответствующий вестерн-блот с антиинсулином Е2Е3) изображен общий белок семян дикого типа (\\1) и трансгенных семян, экспрессирующих 4404 и 4405 конструкции. На фиг. 4В (окрашенный кумасси гель) и 4Ό (соответствующий вестерн-блот с антиинсулином Е2Е3) показан белок масляного тельца, полученный из семян дикого типа и трансгенных семян, экспрессирующих 4404 и 4405 конструкции. На фиг. 4 (Е-Е) показана рекомбинантная экспрессия слитых белков инсулина в трансформированных линиях Απιόίάορδίδ (Найапа (4419-9 и 4414-20) на основе окрашенного кумасси δΌδ-РАОЕ и вестерн-блот анализа. Молекулярные массы маркеров (М) равны 10, 15, 25, 37, 50, 75, 100, 150 кДа. Контроль включает ЫИ (стандарт рекомбинантного человеческого инсулина) и НРгоШ (стандарт рекомбинантного человеческого проинсулина), выделенные в невосстанавливающих условиях.

На фиг. 5 изображены определенные уровни экспрессии в доступных линиях семян Т3 (4404-2, -17, -20, 4405-4, -13, -19) и линиях семян Т2 (4414-9 и -20). Уровни трансгена и % молярной экспрессии ΜΙ определяют на основе денситометрии.

На фиг. 6 изображен анализ окрашенного кумасси δΌδ-РАОЕ (15%) препаратов масляных телец до элюирования (-ОВ), препаратов ОВ после элюирования муравьиной кислотой (-ОВ') и концентрированного элюированного материала (-Е). Стрелки указывают положение мигрирующего слитого полипептида. Контрольная группа дикого типа практически не содержит какие-либо основные белки после элюирования, в то время как концентрированный 4404 материал содержит слитый белок, некоторое количество укороченных продуктов (возможно, гидролизованный слитый белок) и, возможно, некоторое количество альбуминов, элюированных совместно.

На фиг. 7 изображены хроматограммы, показывающие характерное время удержания стандарта человеческого инсулина по сравнению с элюированным расщепленным трипсином 4404 слитым белком на колонке С18. Стандарт НШ представляет собой стандарт рекомбинантного человеческого инсулина (0,5 мкг).

На фиг. 8 изображен масс-спектральный анализ стандарта человеческого инсулина (А) по сравнению с расщепленными трипсином и очищенными ВЭЖХ 4404 (В) фракциями, собранными через 17,017,5 мин.

На фиг. 9 изображен анализ окрашенного кумасси δΌδ-РАОЕ (15%) общего экстрагированного белка семян и белка, полученного из масляного тельца (ОВ) из колоний, экспрессирующих 4405 по сравнению с диким типом (не рекомбинантным) семян. Стрелка указывает положение мигрирующего слитого белка.

На фиг. 10 изображена хроматограмма характерного времени удержания стандарта человеческого инсулина по сравнению с расщепленным трипсином препаратом 4405 ОВ, полученная обращеннофазовой ВЭЖХ на колонке С18. Стандарт ЫН представляет собой стандарт рекомбинантного человеческого инсулина (0,5 мкг).

На фиг. 11 изображен масс-спектральный анализ стандарта человеческого инсулина (А) по сравнению с расщепленными трипсином очищенными ВЭЖХ 4405 (В) фракциями, собранными через 17,0-17,5 мин.

На фиг. 12 изображена хроматограмма расщепленного трипсином препарата 4405 масляного тельца (пунктирная линия) по сравнению со стандартом человеческого инсулина (сплошная линия). Фракции элюированного расщепленного инсулина собирают между 7-35 мС/см и концентрируют лиофилизацией

- 4 014887 для биологического исследования инсулина.

На фиг. 13 изображены изменения уровней глюкозы в сыворотке у самцов мышей В6 после инъекций отрицательного контроля (пустые круги = плацебо с физиологическим раствором, сплошные круги = расщепленные трипсином масляные тельца дикого типа), положительного контроля (пустые квадраты = Нитийи К, пустые треугольники = Косйе ЙШ) по сравнению с инсулином, полученным из растений из 4405 масляных телец (сплошные ромбы = 8Ό8 11ΙΝ Эе8В₃₀).

На фиг. 14 изображено исследование с окрашенным кумасси гелем белков масляных телец от двух характерных колоний (4409-6 и 4409-8) по сравнению с миграцией слитого белка ОкоДи-йРГЛ (показано черными стрелками) для ^трансформированного (νΤ) ЛгаЫборкй. Уровни экспрессии определяют денситометрией с получением средних значений около 0,10% от общего белка семян. Этот уровень оценивают свыше и за пределами комиграции эндогенного белка с той же молекулярной массой из нетрансформированных семян (\\1). который составляет приблизительно 0,04% от общего белка семян.

Подробное описание изобретения

Как указано выше, данное изобретение относится к улучшенному способу получения инсулина в трансгенных растениях. Авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что уровни аккумуляции инсулина, превышающие 0,1% от общего белка клетки, могут быть получены в растениях путем рекомбинантного получения инсулина в семенах растений. Такие уровни экспрессии, которые по крайней мере в десять раз больше тех, которые были получены ранее, позволяют коммерческое производство инсулина в растениях. Получение в семенах обеспечивает гибкость при хранении и транспортировке инсулина в виде сырья, так как инсулин сохраняет свою активность при экстрагировании из хранившихся семян. Более того, количество биомассы, которую необходимо подвергнуть экстрагированию, ограничено из-за относительно низкого содержания воды в семенах растений.

(а) получение конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в виде функционально связанных компонентов:

(й) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и (с) выращивание клетки растений в зрелом растении, способном давать семена, где семена экспрессируют инсулин.

В соответствии с данным изобретением было неожиданно обнаружено, что инсулин аккумулируется в семенах растений в количествах, которые ранее не достигались, если инсулин экспрессируется в семенах таким образом, который позволяет изоляцию полипептида инсулина внутри клеток семян в мембране, окружающей внутриклеточный компартмент. Следовательно, в данном изобретении представлен способ экспрессии инсулина в растениях, который включает:

(ί) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений; и (ίί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина; и (ίίί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, способный удерживать полипептид инсулина в мембране, окружающей внутриклеточный компартмент;

Термины и определения

Если не указано иначе, все технические и научные термины, применяемые в данном описании, имеют значения, общепринятые среди специалистов в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Где это можно, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, включая последовательности нуклеиновых кислот и полипептидов из СеиВаик, δνίδδΡτο и других баз данных, упомянутых в данном описании, представлены здесь в качестве ссылок во всей полноте.

Термин последовательность нуклеиновой кислоты в данном описании относится к последовательности нуклеозидных или нуклеотидных мономеров, состоящей из оснований, сахаров и межсахарных (скелетных) связей. Термин также включает модифицированные или замещенные последовательности, включающие не существующие в природе мономеры или их части. Последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением могут быть последовательностями дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или последовательностями рибонуклеиновой кислоты (РНК) и могут включать существующие в природе основания, включая аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил. Последовательности также могут содержать модифицированные основания. Примеры таких модифицированных оснований включают аза- и деаза- аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил; и ксантин и гипоксантин.

- 5 014887

Термин последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид инсулина, которые могут быть взаимозаменяемыми, относятся к любой и всем последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим полипептид инсулина, включая полипептиды инсулина, перечисленные в таблице (8ЕО Ш N0:7-145), а также любой полипептид инсулина млекопитающего, и к любым последовательностям нуклеиновых кислот, которые кодируют проинсулин и препроинсулин. В данном описании проинсулин относится к полипептиду инсулина, который включает связывающий пептид или С-пептид, связывающий А и В цепи полипептида инсулина. В природном человеческом инсулине С-пептид представляет собой цепь из 31 остатка аминокислоты, связывающую остаток В30 с остатком А1. Термин препроинсулин относится к молекуле проинсулина, дополнительно содержащей Ν-концевую сигнальную последовательность, которая направляет возникновение трансляции в ЕК рибосомах. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид инсулина, также включают любую и все последовательности нуклеиновых кислот, которые (1) кодируют полипептиды, которые практически идентичны последовательности полипептида инсулина, представленной выше; или (и) гибридизируются с любой последовательностью нуклеиновой кислоты, указанной выше, в условиях, по крайней мере, умеренно жесткой гибридизации или которые будут гибридизироваться, по крайней мере, в умеренно жестких условиях, но для применения синонимичных кодонов.

Под термином практически идентичный понимают то, что две полипептидные последовательности предпочтительно идентичны по крайней мере на 75%, более предпочтительно по крайней мере на 85% и наиболее предпочтительно идентичны по крайней мере на 95%, например идентичны на 96, 97, 98 или 99%. Для определения процента идентичности между двумя полипептидными последовательностями последовательности аминокислот двух таких последовательностей совмещают предпочтительно с применением алгоритма С1ик!а1 А (Тйотркоп, Ι.Ό., Нфщпк Ό.Ο., 01Ькоп Т.Е, 1994, Νιιοίοίο Ас1бк Кек. 22(22): 4673-4680) вместе с матрицей количественной оценки ВЬ08иМ 62 (НешкоЕЕ 8., апб НешкоЕЕ 1.О., 1992, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 89: 10915-10919) и штрафом раскрытия интервала 10 и штрафом протяженности интервала 0,1 таким образом, что совпадение высшего порядка достигается между двумя последовательностями, где по крайней мере 50% от общей длины одной из последовательностей включено в выравнивание. Другие способы, которые могут применяться для выравнивания последовательностей, включают способ выравнивания Нидльмана и Вунша (1. Мо1. Вю1., 1970, 48: 443), исправленный Смитом и Ватерманом (Α6ν. Арр1. Ма111.. 1981, 2: 482) таким образом, что совпадение высшего порядка получают между двумя последовательностями и между двумя последовательностями определяют количество идентичных аминокислот. Другие методы расчета процента совпадения между двумя аминокислотными последовательностями известны в данной области техники и включают, например, описанные Сап11о и Ыр!оп (81АМ 1. Аррйеб МаШ., 1998, 48: 1073) и описанные в Сотри1абопа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьекк, е.б. ОхЕотб иштегкбу Ргекк, №\ν Уотк, 1988, Вюсотрибпд: 1пЕогтабск ашб Оепоткк Рго)ес1к). В основном для таких расчетов применяют программное обеспечение. Программное обеспечение, которое может применяться для этой цели, включает, но не ограничено ими, ОСО (Летегеих е! а1., №.1с1е1с Ас1бк Кек., 1984, 12: 387), ВЬА8ТР, ВЕА8Т\' и ЕА8ТА (А11ксйи1 е! а1., 1. Мо1ес. Вю1., 1990: 215: 403).

Под по крайней мере, умеренно жесткими условиями гибридизации понимают условия, которые способствуют селективной гибридизации между двумя комплементарными молекулами нуклеиновой кислоты в растворе. Гибридизация может происходить со всей или с частью последовательности молекулы нуклеиновой кислоты. Гибридизируемая часть обычно содержит по крайней мере 15 (например, 20, 25, 30, 40 или 50) нуклеотидов. Специалист в данной области техники поймет, что стабильность дуплекса или гибрида нуклеиновой кислоты определяется Т_т, которая в буферах, содержащих натрий, является функцией концентрации иона натрия и температуры (Т_т=81,5°С-16,6(Еод1₀|Па⁺])+0,41(%(6+С)-600/1) или подобное уравнение). Следовательно, параметры условий промывания, которые определяют стабильность гибрида, включают концентрацию иона натрия и температуру. Для идентификации молекул, которые сходны, но не идентичны, известной молекуле нуклеиновой кислоты, приемлемо 1% несовпадение, что дает снижение около 1°С в Т_т, например, если считается, что молекулы нуклеиновой кислоты идентичны на >95%, температура конечной промывки будет снижена на около 5°С. Основываясь на этих соображениях специалист в данной области техники легко подберет подходящие условия гибридизации. В предпочтительных вариантах выбирают жесткие условия гибридизации. Например, следующие условия могут применяться для получения жесткой гибридизации: гибридизация в 5х хлориде натрия/цитрате натрия (88С)/5х раствора Денхардта/0,1% 8Ό8 при Т_т -5°С на основании представленного выше уравнения, с последующей промывкой 0,2х 88С/0,1% 8Ό8 при температуре 60°С. Умеренно жесткие условия гибридизации включают промывку 3х 88С при температуре 42°С. Однако понятно, что эквивалентные ограничения могут быть достигнуты с применением альтернативных буферов, солей и температур. Дополнительные инструкции по проведению гибридизации можно найти в Сштеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, бо11п А11еу & 8опк, Ν.Υ., 1989, 6.3.1-6.3.6 и в 8атЬтоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд, а ЬаЬотаЮгу тапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, 1989, νο1. 3.

В данном описании термины инсулин и полипептид инсулина, которые могут быть взаимозаме

- 6 014887 няемыми, относятся к любому и всем полипептидам инсулина, включая полипептиды инсулина, перечисленные в таблице (8ЕО Ш N0:7-145), а также к молекуле полипептида, содержащей последовательность остатков аминокислот, которые (1) практически идентичны последовательностям аминокислот, составляющих любой из представленных здесь полипептидов инсулина, или (и) кодированной последовательности нуклеиновой кислоты, способной гибридизироваться, по крайней мере, в умеренно жестких условиях с любой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей представленный здесь инсулин, или способной гибридизироваться, по крайней мере, в умеренно жестких условиях с любой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей представленный здесь инсулин, но для применения синонимичных кодонов. Термины инсулин и полипептид инсулина включают полипептиды проинсулина и полипептиды мини-инсулина. Полипептид инсулина предпочтительно имеет человеческое, бычье или свиное происхождение.

Термин полипептид, способный сохранять полипептид инсулина в мембране, окружающей внутриклеточный компартмент в данном описании относится к любому полипептиду, который, будучи связанным с полипептидом инсулина, способен изолировать полипептид инсулина во внутриклеточной структуре, окруженной мембраной, и располагаться во внутриклеточном пространстве клетки растения, как определено плазматической мембраной клетки растения.

Термин полипептид, способный удерживать полипептид инсулина в ЕК или ЕК-производной накопительной везикуле относится к любому полипептиду, который, будучи связанным с полипептидом инсулина, способен изолировать полипептид инсулина либо в эндоплазматической сети, либо в накопительном компартменте, который является производным из эндоплазматической сети, таком как, например, масляное тельце, в клетке растения.

Термин масляное тельце или масляные тельца относится к любой органелле, накапливающей масло или жир, в клетке семени растения (описаны, например, в Ниапд (1992), Апп. Кед. Р1ап! Μοί. ΒίοΙ., 43: 177-200).

Термин химерная, применяемый в данном описании в контексте с последовательностью нуклеиновой кислоты, относится по крайней мере к двум связанным последовательностям нуклеиновых кислот, которые не связаны в природе. Химерные последовательности нуклеиновых кислот включают связанные последовательности нуклеиновых кислот различного природного происхождения. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, содержащаяся в промоторе растения, связанная с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий инсулин, считается химерной. Химерные последовательности нуклеиновых кислот также могут содержать последовательности нуклеиновой кислоты одного и того же природного происхождения при условии, что они не связаны в природе. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, содержащаяся в промоторе, полученном из определенного типа клеток, может быть связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, полученный из того же типа клеток, но который в природе не связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащейся в промоторе. Химерные последовательности нуклеиновых кислот также включают последовательности нуклеиновых кислот, содержащие любые природные последовательности нуклеиновых кислот, связанные с любыми не существующими в природе последовательностями нуклеиновых кислот.

Получение рекомбинантных векторов экспрессии, содержащих химерные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие инсулин, и промотор, способный контролировать экспрессию в клетках семян растений

Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие инсулин, которые могут применяться в соответствии со способами и композициями, представленными в данном описании, могут включать любые последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид инсулина, включая любой проинсулин и препроинсулин.

Примеры последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих инсулин, хорошо известны в данной области техники и обычно легко доступны из множества различных источников млекопитающих, включая человека (Ве11, 0.1. е! а1., 1980, №11иге 284: 26-32), свинью (Сйапсе, К.Е. е! а1., 1968, 8с1епсе 161: 165-167), быка (П'АдоШпо. 1. е! а1., 1987, Μοί. Епйосйпо1. 1: 327-331), овцу (Ре!ег8оп, Ι.Ό. е! а1., 1972, Βίοί. Сйеш. 247: 4866-4671) и подобные, а также из растительных источников (ОНуейа, А.Е.А. е! а1., 1999, Рто!еш Рер!. Ьей. 6: 15-21).

Последовательности, кодирующие инсулин, которые могут применяться, включают кодирующие полипептидные цепи, представленные как 8Е0 Ш N0:7-145. Соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептидные цепи инсулина, могут быть легко идентифицированы с помощью номеров идентификатора 8^188 Рто!еш, представленных в таблице. Применяя эти последовательности нуклеиновых кислот, дополнительные новые последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие инсулин, могут быть легко идентифицированы с применением методик, известных специалистам в данной области техники. Например, библиотеки, такие как экспрессионные библиотеки, кДНК и геномные библиотеки, могут быть исследованы и базы данных, содержащие информацию о последовательностях из проектов, устанавливающих последовательность, могут быть проверены на предмет схожих последовательностей. Могут применяться альтернативные методы выделения дополнительных по

- 7 014887 следовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид инсулина, и новые последовательности могут быть обнаружены и использованы в соответствии с данным изобретением. В предпочтительных вариантах последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие инсулин, включают человеческий, свиной и бычий инсулин.

Множество аналогов инсулина известно в данной области техники (см., например, патенты США 5461031, 5474987, 5164366 и 5008241) и могут применяться в соответствии с данным изобретением. Аналоги, которые могут применяться, включают молекулы человеческого инсулина, в которых остаток аминокислоты 28 цепи В (В28) изменен из природного пролинового остатка на аспартат, лизин или изолейцин. В другом варианте лизиновый остаток В29 модифицирован в пролин. Далее, аспарагин А21 может быть заменен на аланин, глутамин, глутамат, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, метионин, серин, треонин, триптофан, тирозин или валин. Также аспарагин В3 может быть модифицирован в лизин. Другие примеры аналогов инсулина, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают человеческий инсулин, не содержащий остатка В30, также часто называемый йекВ30 или В(1-29); инсулин, не содержащий последние 3 аминокислотных остатка В(1-27); инсулин, не содержащий фенилаланиновый остаток В1; и аналоги, в которых А-цепь или В-цепь имеет Ν-концевое или Сконцевое удлинение, например В-цепь может быть продлена на Ν-конце путем добавления двух аргининовых остатков.

В предпочтительных вариантах последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, представляет собой проинсулин. В других предпочтительных вариантах применяют последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую инсулин, в которой С-пептид модифицирован относительно его природной формы. Остатки аминокислот в С-пептиде могут быть замещены и С-пептид может быть удлинен или укорочен. В этом случае термин мини-инсулин относится к полипептиду инсулина, который был модифицирован таким образом, что С-пептид был укорочен относительно его природной формы. В предпочтительных вариантах применяют мини-инсулин. Предпочтительно С-пептид молекулы миниинсулина короче чем 20 остатков аминокислот, более предпочтительно короче чем 15 остатков аминокислот и наиболее предпочтительно короче чем 9 остатков аминокислот, например 7, 5 или 3 остатка. Предпочтительно, как и в случае с природными молекулами инсулина, С-пептид мини-инсулина включает сайт расщепления на его С- и Ν-концах. Такие сайты расщепления могут представлять собой любые удобные сайты расщепления, известные в данной области техники, например метионин, расщепляемый бромидом цианогена, единичный основный остаток или пара основных остатков, расщепляемых трипсином или протеазами, подобными трипсину, или карбоксипептидазой. Например, С-пептид может содержать лизин на С-конце, например, А1а-А1а-Ьук (5ЕО Ш N0:146) или двухосновный сайт обработки непосредственно перед остатком О1уА1, например, Акп-Ьук-Атд (8Е0 Ш N0:147) или Атд-Агд-Еук-01п-ЕукАгд (8Е0 Ш N0:148) или тетраосновный сайт обработки непосредственно перед остатком 01уА1, например, Агд-Атд-Ьук-Агд (8Е0 Ш N0:149). Следовательно, молекулы мини-инсулина, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают

где Х₁ является аминокислотой;

Х₂ является аминокислотой;

Х₃ является Ьук или Агд;

Υ₁ является пептидной связью или 1-17 остатками аминокислот;

В(1-29/30) является В-цепью человеческого инсулина, содержащей остатки аминокислот 1-29 или 1-30; и

А(1-21) является А-цепью человеческого инсулина, содержащей остатки аминокислот 1-21.

В предпочтительном варианте Х₁ является остатком основной аминокислоты (Ьук или Агд) и Υ₁ является либо пептидной связью, либо 1-17 остатками аминокислот, где С-концевой остаток является остатком основной аминокислоты (Ьук или Агд).

Далее, молекулы мини-инсулина, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают те, которые представлены формулой

В (1-27) -Χ₂-Χ₃-Χι-Υ-Α (1-21) где Х1 является пептидом из 1-8 остатков аминокислот, включающим по крайней мере один остаток ароматической аминокислоты;

Х₂ является одним из Рго, Акр, Ьук или 11е в положении 28 В-цепи;

Х₃ является одним из Рго, Ьук, А1а, Агд или Рто-ТЬт в положении 29 В-цепи;

Υ является Ьук или Агд;

В(1-27) является В-цепью человеческого инсулина, содержащей остатки аминокислот 1-27; и

Другие примеры молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды мини-инсулина, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают описанные в Магкиккеп е1 а1., \Уа11ег йе Сгиу1ег & Со. 1987, ίη: Рерййек, р. 189-194; ТЫт е1 а1., 1989, ίη: Оепейск апй то1еси1аг Ью1оду о£ тйик1па1 тктоогдашктк, Атепсап 8оае1у £ог МютоЬю1оду, р. 322-328; и те, которые представлены в патентах США 4916212, 5324641 и 6521738. Изменения последовательности нуклеиновой кислоты, коди

- 8 014887 рующей инсулин, для получения аналогов инсулина могут быть произведены с применением множества методик модификации нуклеиновых кислот, известных специалистам в данной области техники, включая, например, сайт-направленный мутагенез, целевой мутагенез, произвольный мутагенез, добавление органических растворителей, перестановку генов или сочетание этих методов, и другие методики, известные специалистам в данной области техники (ЫпаЫи е! а1., 1988, Агсй. Вюсбет. Вюрбук., 358: 104115; Оа1кт е! а1., 1997, Рго!еш Епд. 10: 687-690; Сагидо е! а1., 1997, Рго!ешк 28: 10-28; Ниг1еу е! а1., 1996, Вюсйет., 35: 5670-5678; Но1тЬегд е! а1., 1999, Рто!ет Епд. 12: 851-856).

В соответствии с данным изобретением неожиданно было обнаружено, что инсулин аккумулируется в семенах растений в количествах, которые до сих пор не были получены, если инсулин экспрессируется в семенах, предпочтительно таким образом, что полипептид инсулина внутри клетки семени изолирован в мембране, окружающей внутриклеточный компартмент. В предпочтительных вариантах данного изобретения полипептид инсулина изолирован в ЕВ или ЕВ-производной накопительной везикуле. Для достижения такого накопления инсулина в ЕВ или ЕВ-производной накопительной везикуле в соответствии с данным изобретением полипептид, кодирующий инсулин, связан с полипептидом, который удерживает полипептид инсулина в ЕВ или ЕВ-производной накопительной везикуле, вместо транспортировки из ЕВ, например, в апопласт. Полипептиды, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением для удержания полипептида инсулина в ЕВ, включают любые полипептиды, способные изолировать инсулин в ЕВ. Такие полипептиды могут быть синтезированы или получены из любых биологических источников. В предпочтительном варианте данного изобретения полипептиды, которые способны удерживать инсулин, включают полипептиды, содержащие С-концевой мотив удержания в ЕВ. Примеры таких С-концевых мотивов удержания в ЕВ включают КОЕБ, НОЕБ, ПОЕБ, АЭЕБ и 80ЕБ последовательности (8ЕО ГО N0:150-154 соответственно). Другие примеры включают НОЕЕ (8Е0 ГО N0:155) (Е-ейтапп е! а1., 2001, Р1ап! Рбукю1. 127(2): 436-49) или два аргининовых остатка, близких к Νконцу, расположенные в положениях 2 и 3, 3 и 4 или 4 и 5 (АЬкбас! £тот Р1ап! Вю1оду 2001 Ргодгат, А8РВ, 1и1у 2001, Ргоу1бепсе, Вбобе Ыапб, И8А). Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие С-концевой мотив ЕВ удержания, предпочтительно связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид инсулина таким образом, что полипептид, способный удерживать инсулин в ЕВ, связан с С-концом полипептида инсулина.

Для достижения накопления полипептида инсулина в ЕВ-производной накопительной везикуле полипептид инсулина связан с полипептидом, который способен удерживать полипептид инсулина в ЕВпроизводной накопительной везикуле. Полипептид, способный удерживать полипептид инсулина в ЕВпроизводной накопительной везикуле, который может применяться в соответствии с данным изобретением, включает любой полипептид, способный изолировать полипептид инсулина в ЕВ-производной накопительной везикуле. Полипептиды, способные удерживать инсулин в ЕВ-производной накопительной везикуле, могут быть синтезированы или получены из любого биологического источника. В предпочтительном варианте ЕВ-производная накопительная везикула представляет собой масляное тельце, и полипептид инсулина связан с белком масляного тельца или его значительной частью, способной удерживать полипептид инсулина в ЕВ-производной накопительной везикуле. Белки масляного тельца, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают любые белки, которые естественным образом связаны с масляным тельцем. Особенно предпочтительные белки масляного тельца включают олеозины, например олеозин АгаЫборкщ (уап Вооуеп е! а1., (1991), Р1ап! Мо1 Вю1. 18: 11771179), кукурузный олеозин (Во\утап-Уапсе е! а1., 1987, 1. Вю1. Сйет. 262: 11275-11279; Он е! а1., 1990, 1. Вю1. Сйет. 265: 2238-2243), олеозин моркови (На1хорои1ок е! а1., (1990), Р1ап! Се11 2: 457) или олеозин Вгакыса (Бее е! а1., 1991, Р1ап! Рбукю1. 96: 1395-1397), калеозины (см., например, ОепЬапк, номер доступа АЕ067857) и стеролеозины (Бш е! а1., 2002, Р1ап! Рбукю1. 128(4): 1200-11). В предпочтительном варианте белком масляного тельца является растительный олеозин, который имеет сходство последовательности с другими растительными олеозинами, такими как олеозин, выделенный из АгаЫборкщ Лабала (8ЕО ГО N0:156) или Втакыса парик (8Е0 ГО N0:157). В другом варианте белком масляного тельца является калеозин или связывающий кальций белок из растительного, грибного или другого источника, который отличается гомологией последовательности с растительными калеозинами, такими как калеозин, выделенный из АтаЫборкщ Лабапа (8Е0 ГО N0:158 и 8Е0 ГО N0:159). В другом варианте белком масляного тельца является стеролеозин (8Е0 ГО N0:160), дегидрогеназа, связывающая стерин (Бт Б.-Е е! а1., (2002), Р1ап! РЬу8ю1. 128: 1200-1211). Полипептид, кодирующий инсулин, может быть связан с белком масляного тельца через №конец, так же как и через С-конец, и через фрагменты белка масляного тельца, такие как, например, центральный домен олеозина. Новые белки масляного тельца могут быть обнаружены, например, при получении масляных телец (методики получения масляных телец см., например, в патенте США 6650554) и идентификации белков в препаратах масляных телец с помощью, например, 8Ό8 электрофореза в геле. Против таких белков могут быть получены поликлональные антитела, которые применяют для скрининга библиотек кДНК для идентификации последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки масляных телец. Новые белки масляных телец также могут быть получены с применением известных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки масляных телец, с применением, например, указанных здесь последовательностей белков масляных телец, кодирующих белки

- 9 014887 масляных телец, для исследования, например, кДНК или геномных библиотек на присутствие белков масляных телец.

Полипептиды, способные удерживать инсулин в ЕК или ЕК-производной накопительной органелле, обычно не отщепляются, и инсулин может накапливаться в виде слитого белка, что, например, обычно происходит, если КЭЕЬ сигнал удержания применяется для удержания полипептида в ЕК или если белок масляного тельца применяется для удержания полипептида в ЕК-производной накопительной органелле.

Химерная последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно может содержать нуклеотидную последовательность, которая нацеливает последовательность нуклеиновой кислоты на эндомембранную систему (сигнальный пептид). В вариантах данного изобретения, в которых полипептид инсулина удерживается в ЕК с помощью последовательности, способной удерживать полипептид в ЕК, такой как КЭЕЬ, НОЕЬ или 8ЭЕЬ полипептид, особенно желательно включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид. Примеры сигнальных пептидов, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают сигнальную последовательность белка, связанного с патогенезом табака (РК-8) (8ЕО Ш N0:161) (8утопк е! а1., 1990, Вю/!есйпо1оду, 8: 217-221), сигнальную последовательность лектина (Воейп е! а1., 2000, Ттапкдешс Кек, 9(6): 477-86), сигнальную последовательность насыщенного гидроксипролином гликопротеина из Рйакео1ик мйдапк (Уап е! а1., 1997, Р1ап! РЬ.у8ю1. 115(3): 915-24 и СотЬш е! а1., 1987, Мо1. Се11 Вю1. 7(12): 4337-44), сигнальную последовательность пататина картофеля (Йитада, О. е! а1., 1989, Р1ап! Се11 1: 381-390 и Веуап е! а1., 1986, Шс. Ас14к Кек. 41: 4625-4638) и сигнальную последовательность альфа-амилазы ячменя (Кактйкеп ап4 1ойапккоп, 1992, Р1ап! Мо1. Вю1. 18(2): 423-7). Такие целевые сигналы могут быть ш у1уо отщеплены от последовательности инсулина, что обычно происходит когда применяется целевой сигнал апопласта, такой как сигнальная последовательность 8-белка, связанного с патогенезом табака (РК-8) (8утопк е! а1., 1990, Вю/!есйпо1оду, 8: 217-221). Другие сигнальные пептиды могут быть определены с помощью сервера 81дпа1Р \Уог14 \УМе \¥еЬ (ййр://^тете.сЬк.4!и.4к/кегу1сек/81дпа1Р), в котором можно определить присутствие и расположение сайтов отщепления сигнального пептида в последовательностях аминокислот различных организмов. В общем, существует незначительное сохранение первичной последовательности аминокислоты, хотя общие физико-химические свойства сохраняются до некоторого предела. Общая структура сигнальных пептидов имеет три области, короткую аминоконцевую п-область, содержащую положительно заряженные остатки, центральную гидрофобную й-область, изменяющуюся в размере от 7 до 15 аминокислот, и карбоксиконцевую с-область, содержащую полярные аминокислоты и сайт расщепления, который распознается мембранно-связанными сигнальными ферментами пептидазы (№ка1 К., 2000, Айуапсек ΐπ Рто!ет Сйет. 54: 277-344). Целевой сигнал, который также может применяться в соответствии с данным изобретением, включает природную сигнальную последовательность инсулина (длина человеческой последовательности составляет 24 аминокислоты). В предпочтительных вариантах расположенную на Ν-конце целевую последовательность апопласта, такую как указанная выше РК-8 последовательность табака, применяют в сочетании с расположенной на С-конце удерживающей в ЕК последовательностью, такой как последовательность КЭЕЬ.

В другом предпочтительном варианте последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лидерную последовательность α-фактора дрожжей, связана с Ν-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей инсулин. Лидерные последовательности дрожжей или последовательности, полученные из лидерных последовательностей дрожжей, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают последовательности, перечисленные в 8ЕО Ш N0:162-171 (К)е14кеп е! а1., 2001, Вю!есйш1оду ап4 Оепейс Епдтееппд Ке\зе\\'к 18: 89-121). Такие лидерные последовательности могут также содержать пептид спейсера, расположенный на С-конце нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерную последовательность, и на Ν-конце последовательности, кодирующей инсулин. В соответствии с данным изобретением такие последовательности спейсеров обычно имеют от 2 до 20 аминокислот в длину. Таким образом, например, могут применяться последовательности спейсеров 8Е0 Ш N0:172 и 8Е0 Ш N0:173 (К)е14кеп е! а1., 2001, Вю!есйш1оду ап4 Оепейс Епдтееппд Ке\'1е\\'к 18: 89-121). В вариантах данного изобретения, в которых применяется лидерная последовательность дрожжей, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид инсулина, предпочтительно представляет собой полипептид мини-инсулина. В соответствии с данным изобретением в особенно предпочтительном варианте применяют последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело с одной цепью, связанной с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерный пептид секреции дрожжей, как далее описано в примере 1.

Химерная последовательность нуклеиновой кислоты также может содержать полипептиды, дающие стабилизирующие удлинения белка на N и/или С-концах. Такие удлинения могут применяться для стабилизации и/или помогают свертыванию цепи полипептида инсулина и дополнительно могут применяться для облегчения очистки инсулина. Полипептидные удлинения, которые могут применяться для этой цели, включают, например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело с одной цепью, нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу АГйЬойу® (АГйЬойу АВ), последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нетоксичную В субъединицу токсина холеры (СТВ) (Атакама,

- 10 014887

Т. с1 а1., 1998, №11. Βίοίοοίιηοΐ. 16: 938) или сочетания таких полипептидов. В особенно предпочтительном варианте полипептид инсулина удерживается в мембране, окружающей компартмент, такой как ЕК, с помощью, например, последовательности КОЕБ, как описано выше, объединенной со стабилизирующим полипептидом, который позволяет объединение полипептида инсулина с масляным тельцем при нарушении целостности клетки растения, что может произойти, если полипептид инсулина выделяют из клетки растения. Примером такого стабилизирующего полипептида является антитело с одной цепью со специфичностью к масляному тельцу. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие антитела с одной цепью со специфичностью к масляному тельцу, могут быть получены из колонии клеток гибридомы, экспрессирующих моноклональные антитела, действующие против белка масляного тельца. В одном варианте антитело с одной цепью специфически связывается с олеозином, как описано в Л11шд-Мсс5 с1 а1. (2000), 1ВС'8 1п!стпа1юпа1 СопГсгспсс οη ΛηΙίόοάν Епдтссттд, Ро81ет #1. Этот вариант данного изобретения более подробно описан в примере 1 ниже.

В другом варианте сайт расщепления может быть расположен выше Ν-конца и ниже С-конца инсулина, что позволяет полипептиду инсулина отщепляться от партнера слияния, тем самым получая выделенный инсулин. Примеры таких сайтов расщепления могут быть найдены в \νϋ 98/49326 (способ расщепления слитых белков) и родственных заявках, и у ЬаУШс с! а1. (1994), Еп/утабс апб сйсш1са1 с1сауадс οΓ Гшюп ргсИспъ 1п Ситгсп! РюЮ^Е ίη ΜοΚα-ΐΕ-π Вю^ду, ρ. 16.4.5-16.4.17, 6ο1ιη \νίΚ\· апб δοηκ, 1пс.,

ΥογΕ ΝΥ. В предпочтительном варианте сайтом расщепления является тетраосновный линкер (например, Атд-Атд-Ьук-Атд - 8ЕО ГО N0:149), который расщепляется трипсином. В другом предпочтительном варианте сайтом расщепления является Κ1ίρ8 (8Е0 ГО N0:174), который расщепляется аспартат протеазой, включая химозин.

В данном изобретении также представлены способы отделения гетерологичных белков от компонентов клетки-хозяина разделением фракции масляного тельца и последующим выделением гетерологичного белка путем специфического расщепления гетерологичного белка - слиянием белка масляного тельца. Необязательно сайт расщепления может быть расположен выше Ν-конца и ниже С-конца гетерологичного полипептида, что позволяет слитому полипептиду расщепляться и отделяться путем разделения фаз на составляющие их пептиды.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, может быть изменена для дальнейшего улучшения уровней экспрессии, например, оптимизацией последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с предпочтительным применением кодона для определенного типа клетки растения, которую выбирают для экспрессии полипептида инсулина, или изменением мотивов, которые известны как дестабилизирующие мРНК (см., например, заявку на патент РСТ 97/02352). Сравнение применения кодона последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид инсулина, и применения кодона клетки растения позволяют идентификацию кодонов, которые могут быть изменены. Построение синтетических генов путем изменения применения кодона описано, например, в заявке на патент РСТ 93/07278.

В предпочтительном варианте применяемая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, представлена 5Е0 ГО N0:1, 5Е0 ГО N0:3, 8Е0 ГО N0:5 или 8Е0 ГО N0:195.

В соответствии с данным изобретением последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, связана с промотором, способным контролировать экспрессию полипептида инсулина в клетке семени растения. Следовательно, в данном изобретении также представлена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, связанная с промотором, способным контролировать экспрессию в клетке семени растения. Применяемые здесь промоторы обычно являются известными в данной области техники промоторами и включают любой промотор растительного происхождения, способный контролировать экспрессию полипептидов в растениях. В общем, промоторы, полученные из двудольных растений, применяют, если двудольное растение выбирают в соответствии с данным изобретением, а промотор однодольного растения используют, если выбирают однодольное растение. Основные промоторы, которые могут применяться, включают, например, промотор вируса мозаики цветной капусты 358 (СаМУ) (Εοΐΐΐδίαη с! а1., 1987, Оспс 53: 153-161), промотор актина риса (МсЕ1гоу с! а1., 1990, Р1ап! Сс11 2: 163-171; патент США 6429357), промотор убиквитина, такой как промотор убиквитина кукурузы (патенты США 5879903; 5273894) и промотор убиквитина петрушки (Ка^а11сск, Р. с! а1., 1993, Р1ап! Μο1. Βίο1. 21: 673-684).

В предпочтительных вариантах применяемым промотором является промотор, который дает предпочтительную экспрессию полипептида инсулина в ткани семени. Предпочтительными для семян промоторами в этом смысле являются промоторы, которые контролируют экспрессию рекомбинантного белка (а именно, инсулина) таким образом, что предпочтительно по крайней мере 80% от общего количества рекомбинантного белка, присутствующего во взрослом растении, присутствовало в семени. Более предпочтительно по крайней мере 90% от общего количества рекомбинантного белка, присутствующего во взрослом растении, должно присутствовать в семени. Наиболее предпочтительно по крайней мере 95% от общего количества рекомбинантного белка, присутствующего во взрослом растении, должно присутствовать в семени. Предпочтительные для семян промоторы, которые могут применяться в этом смысле, включают, например, промотор фазеолина бобов (§сηдиρΐа-6ορа1аη с! а1., 1985, Ргас. №111. Асаб.

- 11 014887

8с1. И8А 82: 3320-3324); промотор олеозина ЛгаЫбор818 18 кДа (патент США 5792922) или промотор олеозина льна (\УО 01/16340); промотор аккумулирующего белка (линина) семени льна, подобного легумину (\УО 01/16340); промотор аккумулирующего белка 28 льна (\УО 01/16340); предпочтительный промотор эндосперма, такой как промотор Ату32Ь (Кодегв апб МбЕтаи, 1. Вю1. СЕет., 1984, 259: 1223412240), промотор АтуЬ-4 (КигзЕееб апб Кодегв, 1. Бю1. СЕет., 1988, 263: 18953-18960), или промотор Алеураина (^ЕЕЕег е! а1., 1987, №ис1е1с Ас1бв Кез., 15: 2515-2535), или промотор арселина бобов (Баедег С.Б., е! а1., 2002, №11. Вю1есЕпо1. Бес; 20: 1265-8). Постоянно находят новые промоторы, применяемые в различных растениях. Множество примеров промоторов растений можно найти у ОЕатиго е! а1. (БюсЕет. оБ Р1аи1з., 1989, 15: 1-82).

В данном изобретении могут применяться определенные генетические элементы, способные улучшать экспрессию полипептида инсулина. Эти элементы включают нетранслированные лидерные последовательности определенных вирусов, такие как лидерная последовательность АМУ (БоЬ1шд аиб СеЕгке, 1987, №а1иге, 325: 622-625) и интрон, связанный с промотором убиквитина кукурузы (патент США 5504200). Обычно химерную последовательность нуклеиновой кислоты получают таким образом, чтобы генетические элементы, способные усиливать экспрессию, были расположены в положении 5' последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид инсулина.

В соответствии с данным изобретением химерные последовательности нуклеиновых кислот, содержащие промотор, способный контролировать экспрессию в семенах растений, связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид инсулина, могут быть интегрированы в рекомбинантный вектор экспрессии, который обеспечивает хорошую экспрессию в клетке семени. Следовательно, данное изобретение включает рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий в направлении 5'-3' транскрипции в виде функционально связанных компонентов:

(ί) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетки семени растения; и (ίί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина;

где вектор экспрессии подходит для экспрессии в клетке растения.

Термин подходящий для экспрессии в клетке растения означает, что рекомбинантный вектор экспрессии содержит химерную последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением, связанную с генетическими элементами, требуемыми для достижения экспрессии в клетке семени. Генетические элементы, которые могут быть включены в вектор экспрессии в этом смысле, включают транскрипционную область терминации, одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующую маркерные гены, одно или более начало репликации и подобные. В предпочтительных вариантах вектор экспрессии также содержит генетические элементы, требуемые для интеграции вектора или его части в ядерный геном клетки растения, например, левую и правую крайние последовательности Т-ДНК, которые способствуют интеграции в ядерный геном растения в вариантах в соответствии с данным изобретением, в которых клетки растений трансформируют с помощью АдгоЬас1епит.

Как указано выше, рекомбинантный вектор экспрессии обычно содержит транскрипционный терминатор, который, кроме того что он служит в качестве сигнала для окончания транскрипции, также может служить в качестве защитного элемента, способного продлевать период полураспада мРНК (Сиагиегов е! а1., 1982, Ргос. №И1. Асаб. 8сБ И8А, 79: 238-242). Терминатор транскрипции обычно содержит от около 200 нуклеотидов до около 1000 нуклеотидов, и вектор экспрессии получают таким образом, что терминатор транскрипции расположен в положении 3' последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей инсулин. Концевые последовательности, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают, например, конечную область нопалина (Беуаи е! а1., 1983, №ис1. Ас1бз. Кев., 11: 369-385), терминатор фазеолина (уаи бег Сеев! е! а1., 1994, Р1аи! 1. 6: 413-423), терминатор арселина (Баедег С.Б., е! а1., 2002, №11. ВюйсЕноБ Бес; 20: 1265-8), терминатор для генов октопинсинтазы АдгоЬас1епит 1итеБас1еив или других подобных функциональных элементов. Транскрипционные терминаторы могут быть получены, как описано у Аи (Аи, 1987, Ме(Еобз ш Епхут. 153: 292).

В соответствии с данным изобретением вектор экспрессии также может содержать маркерный ген. Маркерные гены, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают все гены, которые позволяют отличать трансформированные клетки от нетрансформированных клеток, включая все селектируемые и скринабельные маркерные гены. Маркерный ген может быть маркером устойчивости, таким как маркер устойчивости к антибиотикам, например канамицину (патент США 6174724), ампициллину, С418, блеомицину, гигромицину, что позволяет селекцию характерных особенностей химическими методами, или маркеры, толерантные к химическому агенту, такому как сахар манноза с обычной фитотоксичностью (№едгойо е! а1., 2000, Р1аи! Се11 Кер. 19: 798-803). Другие подходящие маркеры, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают маркеры, способные передавать устойчивость к гербицидам, таким как глифосат (патенты США 4940935; 5188642), фосфинотрицин (патент США 5879903) или сульфонилмочевины (патент США 5633437). Маркеры устойчивости, будучи тесно связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид инсулина, могут применяться для сохранения давления отбора на популяцию клеток растения или растения, которые не потеряли последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина.

- 12 014887

Скринабельные маркеры, которые могут применяться для идентификации трансформантов путем визуальной проверки, включают β-глюкуронидазу (ОИ8) (патенты США 5268463 и 5599670) и зеленый флуоресцентный белок (СЕР) (Νίοάζ е! а1., 1995, Р1ап! Се11 Кер., 14: 403).

Рекомбинантные векторы, подходящие для введения последовательностей нуклеиновых кислот в растения, включают векторы на основе АдтоЬас1етшт и Ρΐιίζοόίιιιη. такие как Τι и К1 плазмиды, включая, например, ρΒΙΝ19 (Веуаи, Νυχ Ас1б. Кек., 1984, 22: 8711-8721), рСКВ5 (Βοικίκζ е! а1., 1993, С К Асаб. 8с1. Рапк, Ь1Ее 8аепсек, 316: 1188-1193), ряд бинарных векторов ρС6N (МсВпбе апб 8иттегГе11, 1990, Р1ап! Мо1. Βίο1., 14: 269-276) и другие бинарные векторы (например, патент США 4940838).

Рекомбинантные векторы экспрессии, последовательности нуклеиновых кислот и химерные последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением могут быть получены в соответствии с методиками, хорошо известными специалистам в области молекулярной биологии. Такое получение обычно включает виды бактерий ЕксНеНсЫа со11 в качестве промежуточного клонирующего хозяина. Получение векторов Е.соН, а также векторов трансформации растений может быть осуществлено с применением известных методик, таких как рестрикционное расщепление, лигирование, гелевый электрофорез, секвенирование ДНК, полимеразная цепная реакция (РСК) и другие методики. Эти методики позволяют связывать последовательности нуклеиновых кислот и полипептиды, относящиеся к данному изобретению. Большой выбор векторов клонирования доступен для осуществления необходимых стадий, требуемых для получения рекомбинантного вектора экспрессии. Среди векторов с системой репликации, функционирующей в Е.соН, имеются векторы, такие как рВК322, ряд векторов рИС, ряд векторов М13тр, рВ1иекспр1 и т.д. Обычно такие векторы клонирования содержат маркер, позволяющий отбор трансформированных клеток. Последовательности нуклеиновых кислот могут быть введены в эти векторы и векторы могут быть введены в Е.соН, выращенную в подходящей среде. Рекомбинантные векторы экспрессии могут быть легко выделены из клеток при сборе и лизисе клеток. Общие инструкции по получению рекомбинантных векторов представлены, например, в 8атЬтоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд, а ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог БаЬогаЮгу Ргекк, 1989, уо1. 3.

Получение растений, содержащих семена, способные экспрессировать инсулин

В соответствии с данным изобретением химерную последовательность нуклеиновой кислоты вводят в клетку растения и клетки выращивают во взрослых растениях, способных давать семена, где семена экспрессируют полипептид инсулина.

В соответствии с данным изобретением может быть выбран любой вид растения или клеток растения. Конкретные клетки, применяемые в соответствии с данным изобретением, включают клетки, полученные из АтаЫборДк ЛаНапа, бразильского ореха (ВеЛо1е1На ехсе1ка); клещевины обыкновенной (Ктсстик соттишк), кокоса (Сосик писНега); кориандра (Сопаибгит каНуит); хлопка (род Ооккуршт); арахиса (АгасЫк Нуродаеа); жожоба (81ттопбк1а сЫпепык); льняного семени/льна (Ыпит икйаНкДтит); кукурузы (2еа таук); горчицы (род ВгакДса и 81пар1к а1Ьа); гвинейской масличной пальмы (Е1ае1к дшпее1к); оливы (О1еа еиграеа); рапса (вид Втаккюа); риса (Огуха каНуа); сафлора (СайНатик Нпс1отшк); сои (О1усте тах); тыквы (СисигЬНа тах1та); ячменя (Ногбеит уи1дате); пшеницы (ТтаеНсит аекНуит) и подсолнечника (НеНапЛик аппиик).

В соответствии с данным изобретением в предпочтительном варианте применяют растения или клетки растений из семян масличных растений. Масличные растения, семена которых применяются в соответствии с данным изобретением, включают арахис (АгасЫк Нуродаеа)/горчицу (род Втаккюа и 8шар1к а1Ьа); рапс (вид Втаккюа); нут (Сюет апепНпит), сою (О1усте тах); хлопок (Ооккуршт ЫгкЫит); подсолнечник (НеНапЛик аппиик); (ЬепН1 Ьепк сиНпапк); льняное семя/лен (Ьтит икйаНкЫтит); белый клевер (ТНГо1шт герепк); оливу (О1еа еиграеа); гвинейскую масличную пальму (Е1ае1к дшпееЫ); сафлор (СайНатик НпсЛгшк) и бобы нарбона (УШа патЬопепкЫ).

В соответствии с данным изобретением в особенно предпочтительном варианте применяют сафлор, АтаЫборкЫ или лен.

Методики введения растительных рекомбинантных векторов экспрессии в клетку растения, также обозначенные далее как трансформация, хорошо известны специалистам в данной области техники и обычно зависят от выбранной клетки растения. Общие методики введения рекомбинантных векторов экспрессии включают электропорацию; методики, опосредованные химическими соединениями, например поглощение нуклеиновой кислоты, опосредованное СаС12; бомбардировку частицами (биолистику); применение природных инфекционных последовательностей нуклеиновых кислот, например последовательности нуклеиновых кислот, полученные из вирусов, или последовательности, полученные из АдгоЬас1етшт или КН^ζοЬ^ит, поглощение нуклеиновой кислоты, опосредованное полиэтиленгликолем (ПЭГ), микроинъекции и применение нитевидных кристаллов карбида кремния.

В предпочтительных вариантах выбирают такую методику трансформации, которая позволяет интеграцию химерной последовательности нуклеиновой кислоты в геном клетки растения и предпочтительно ядерный геном клетки растения. В соответствии с данным изобретением это считается особенно желательным, так как применение такой методики позволяет перенос химерной последовательности нуклеиновой кислоты в растения потомства при половой репродукции. Методы трансформации, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают методы, опосредованные биолис

- 13 014887 тиками и АдгоЬас!егшт.

Методики трансформации для двудольных видов растений хорошо известны. Обычно применяют трансформацию, опосредованную АдгоЬас!егшт, благодаря ее высокой эффективности, а также общую восприимчивость большинством, если не всеми, двудольными видами растений. Трансформация с АдгоЬас!егшт обычно включает перенос бинарного вектора, такого как любой из упомянутых выше бинарных векторов, включающего химерную последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением, из Е.со11 в подходящий штамм АдгоЬас!егшт (например, ЕНА101 и ЬВА4404) с помощью, например, скрещивания трех родителей со штаммом Е.сой, содержащим рекомбинантный бинарный вектор, и штаммом Е.со11, содержащим вспомогательную плазмиду, мобилизующую бинарный вектор по отношению к целевому штамму АдгоЬас1епит. или трансформации ДНК штамма АдгоЬас1егшт (НоГдеп е1 а1., Ыис1. Ас1бк Кек., 1988, 16: 9877). Другие методики, которые могут применяться для трансформации клеток двудольных растений, включают биолистики (8апГогб, 1988, Тгепбк ίη Вю!есйп. 6: 299-302); электропорацию (Еготт е! а1., 1985, Ргос. Ыаб. Асаб. 8а. И8А, 82: 5824-5828); опосредованное ПЭГ поглощение ДНК (Ро1гукик е1 а1., 1985, Мо1. Сеп. Сепебск, 199: 169-177); микроинъекции (Кеюй е1 а1., Вю/ТесЬп., 1986, 4: 1001-1004) и нитевидные кристаллы карбида кремния (Каерр1ег е1 а1., 1990, Р1ап1 Се11 Кер., 9: 415-418) или трансформацию ш р1ап!а с применением, например, методики погружения цветка (С1оид1 апб Веп!, 1998, Р1ап! I., 16: 735-743).

Однодольные виды растений могут быть трансформированы с применением различных методик, включая бомбардировку частицами (С1пк!ои е! а1., 1991, Вю!есйп. 9: 957-962; Vеекк е! а1., Р1ап! РНукюР 1993, 102: 1077-1084; Согбоп-Катт е! а1., Р1ап! Се11, 1990, 2: 5603-618); опосредованное ПЭГ поглощение ДНК (европейские патенты 0292435; 0392225) или трансформацию, опосредованную АдгоЬас!егшт (Со!о-Еит1уик1 е! а1., 1999, №Ш1ге-Вю1ес11. 17: 282-286).

Конкретная методика трансформации растения может варьироваться в зависимости от вида растения и типа клетки растения (например, полученные из рассады типы клеток, такие как гипокотилы и котиледоны или ткань эмбриона), которые выбирают в качестве клетки-мишени для трансформации. Как указано выше, в особенно предпочтительном варианте применяют сафлор, АгаЬ1борк1к или лен. Методика получения трансформатов сафлора описана у Вакег апб Эуег (Р1ап! Се11 Кер., 1996, 16: 106-110). Другие протоколы трансформации определенных видов растений могут быть найдены в Вю!есйпо1оду ш Адпси1!иге апб Еогекбу 46: Тгапкдешс Сгорк I (У.Р.8. Ва_|а_| еб.), 8ргтдег-Уег1ад, №\ν Уогк (1999) и Вю!есйпо1оду ш Адпси1!иге апб Еогекбу 47: Тгапкдешс Сгорк II (У.Р.8. Ва|а| еб.), 8ргшдег-Уег1ад, Ыете Уогк (2001).

Для трансформации клетки растений выращивают и при появлении дифференцирующей ткани, такой как ростки и корни, взрослые растения регенерируют. Обычно регенерируют множество растений. Методики регенерации растений зависят от вида растений и типа клеток и известны специалисту в данной области техники. Дальнейшие указания по культивированию тканей растений можно найти, например, в Р1ап! Се11 апб Т1ккие Си1!иге, 1994, Уакб апб Тйогре Ебк., К1и\\'ег Асабепис РиЬбкНегк и Р1ап! Се11 Си1!иге Рго!осо1к (МеШобк ш Мо1еси1аг Вю1оду 111), 1999, На11 Ебк., Нитапа Ргекк.

В одном аспекте данное изобретение относится к способу выделения семян растений, содержащих инсулин. Следовательно, данное изобретение относится к способу получения семян растений, содержащих инсулин, который включает:

В предпочтительных вариантах множество трансформированных растений получают, выращивают и исследуют на присутствие желаемой химерной последовательности нуклеиновой кислоты, присутствие которой в предполагаемых трансформатах может быть протестировано, например, выращиванием в селективной среде, в которой применяют маркеры, устойчивые к гербицидам, путем непосредственного нанесения гербицида на растение или саузерн-блоттингом. Если определяется присутствие химерной последовательности нуклеиновой кислоты, трансформированные растения могут быть отобраны для выращивания потомства и, в конечном счете, взрослых растений, содержащих множество семян, содержащих желаемую последовательность химерной нуклеиновой кислоты. Таким семена могут применяться для выделения инсулина или они могут быть посажены для получения двух или более последующих поколений. Обычно желательно высаживать множество трансгенных семян для получения трансгенных растений, каждое из которых содержит семена, содержащие химерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую инсулин. Более того, обычно желательно удостовериться в гомозиготности растений для того, чтобы удостовериться в непрерывном наследовании рекомбинантного полипептида. Методы отбора гомозиготных растений хорошо известны специалистам в данной области техники. Методы

- 14 014887 получения гомозиготных растений, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, включают получение и трансформацию гаплоидных клеток или тканей с последующей регенерацией гаплоидных растений и последующим превращением в диплоидные растения, например, обработкой колхином или другими агентами, повреждающими микротрубочки. Растения можно выращивать в соответствии с обычной сельскохозяйственной практикой.

В другом аспекте данное изобретение относится к растениям, способным давать семена, экспрессирующие инсулин. В предпочтительном варианте данного изобретения растения, способные давать семена, содержат последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащую в 5'-3' направлении транскрипции:

В предпочтительном варианте химерная последовательность нуклеиновой кислоты стабильно интегрирована в ядерный геном растения.

В еще одном варианте данное изобретение относится к семенам растений, экспрессирующим инсулин. В предпочтительном варианте данного изобретения семена растений содержат химерную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую в 5'-3' направлении транскрипции:

В соответствии с данным изобретением получают семена, в которых предпочтительно по крайней мере 0,1% от общего растворимого белка, присутствующего в семени, составляет инсулин. В другом предпочтительном варианте данного изобретения получают семена, в которых по крайней мере 0,2, 0,3, 0,5 или 1,0% от общего растворимого белка, присутствующего в семени, составляет инсулин. Полипептид инсулина может присутствовать в различных типах клеток, включая, например, гипокотилы и ось эмбриона, включая корни эмбриона и листья эмбриона, где однодольные виды растений, включая злаки и кукурузу, применяют в ткани эндосперма.

Получение инсулина из семян растений

После получения семян растения белок инсулина может быть выделен из семян с помощью любой методики очистки белка, известной в данной области техники. Следовательно, данное изобретение относится к способу выделения инсулина из семян растений, где способ включает:

(c) выращивание клетки растений в зрелом растении, способном давать семена, где семена экспрессируют инсулин;

(ά) получение семян, экспрессирующих инсулин; и (е) выделение инсулина из семян.

Семена растений могут быть измельчены с применением любого общепринятого способа, дающего значительное разрушение мембраны клетки и стенок клетки. Могут применяться условия сухого и влажного измельчения (патент США 3971856; Ьа^йои е1 а1., 1977, 1. Ат. 011 Сйет. Бос., 63: 533-534). Подходящее оборудование для измельчения включает коллоидные мельницы, дисковые мельницы, 1КА мельницы, гомогенизаторы промышленного масштаба и подобные. Выбор оборудования для измельчения зависит от типа семян и общих требований. Твердые примеси, такие как оболочка семян, волокнистый материал, нерастворимые углеводы, белки и другие не растворимые в воде примеси, могут быть удалены из фракции семян с помощью, например, методик на основе отбора по размеру, таких как процессы на основе фильтрации или гравитации, такие как центрифугирование. В предпочтительных вариантах избегают применения органических растворителей, обычно применяемых при извлечении масла, таких как гексан, так как такие растворители могут повредить полипептид инсулина. Практически чистый инсулин может быть выделен из семян с помощью множества дополнительных методик очистки, таких как методики на основе центрифугирования; методики на основе отбора по размеру, включая, например, ультрафильтрацию через мембрану и ультрафильтрацию в поперечном потоке; и методики хроматографии, включая, например, ионообменную хроматографию, хроматографию с отбором по размеру, аффинную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), жидкостную экспрессхроматографию белком (ЖХББ), хроматографию с гидрофобным взаимодействием, и подобные. Обычно для получения практически чистого инсулина применяют совокупность таких методик.

В особенно предпочтительном варианте данного изобретения полипептид инсулина выделяют из примесей семян взаимодействием полипептида инсулина с масляными тельцами. Этот метод считается особенно преимущественным, так как он позволяет удалять примеси семян, включая белок семян осо

- 15 014887 бенно эффективным и недорогим способом. Как указано выше, взаимодействие полипептида инсулина с масляными тельцами может быть достигнуто связыванием полипептида инсулина с белком масляного тельца или связыванием полипептида инсулина с полипептидом, обладающим сродством с масляным тельцем, таким как антитело с одной цепью, обладающее сродством к масляному тельцу. В первом варианте полипептид инсулина будет изолирован в клетках масляных телец и, следовательно, очищаться совместно с масляными тельцами. Во втором варианте будучи экспрессированным в мембране, окружающей внутриклеточный компартмент, такой как ЕК, полипептид инсулина будет связываться с масляным тельцем при разрушении клеток семени во время процесса измельчения. Способ выделения масляных телец описан в патенте США 5650554.

Фармацевтические композиции инсулина могут быть получены из очищенного инсулина и такие композиции могут применяться для лечения диабета. Обычно очищенный инсулин смешивают с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем в количествах, достаточных для оказания терапевтически полезного действия при отсутствии нежелательных побочных эффектов на пациента. Для получения композиции инсулина массовую часть инсулина растворяют, суспендируют, диспергируют или смешивают другим способом в выбранном носителе или разбавителе до эффективной концентрации, позволяющей улучшить лечимое состояние. Фармацевтические композиции инсулина предпочтительно имеют вид единичных дозированных форм. Терапевтически эффективные дозы для парентерального введения человеческого инсулина известны в данной области техники. При применении аналогов инсулина или других способов введения применяемые терапевтически эффективные дозы могут быть эмпирически определены специалистом в данной области техники с применением известных протоколов тестирования, или экстраполяцией данных тестирования ίη νίνο или ίη νίίτο. Однако понятно, что концентрации и дозы могут варьироваться в соответствии с тяжестью облегчаемого состояния. Также понятно, что для любого конкретного пациента могут применяться определенные режимы дозирования во времени, определяемые лечащим или наблюдающим лечение специалистом.

Фармацевтические растворы или суспензии могут включать, например, стерильные разбавители, такие как, например, вода, лактоза, сахароза, дикальцийфосфат или карбоксиметилцеллюлоза. Применяемые носители включают воду, физиологический раствор, водную декстрозу, глицерин, гликоли, этанол и подобные, которые могут образовывать раствор или суспензию. При желании, фармацевтические композиции также могут содержать нетоксичные вспомогательные вещества, такие как смачивающие агенты; эмульгирующие агенты; солюбилизаторы; противомикробные агенты, такие как бензиловый спирт и метилпарабены; антиокислители, такие как аскорбиновая кислота и бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕИТА); рН буферные агенты, такие как ацетатные, цитратные или фосфатные буферы; и их сочетания.

Конечная композиция препаративной формы инсулина в основном зависит от способа введения инсулина. Инсулин, полученный в соответствии с данным изобретением, может вводиться любым желательным способом; однако парентеральный, пероральный, легочный, буккальный и назальный способы введения считаются наиболее часто применяемыми способами введения. Парентеральные препаративные формы могут быть в ампулах, одноразовых шприцах или флаконах, содержащих одну или несколько доз, сделанных из стекла, пластика или других подходящих материалов.

Примеры

Представленные ниже примеры приведены только для иллюстрации и не ограничивают данное изобретение.

Пример 1.

Получение белка инсулина, экспрессированного в виде слитого белка мини-инсулина (ΜΙ) с расщепляемым трипсином пропептидом.

Получение р8В84404: РК8-О95сЕу-К1|р27-М1-КОЕЕ слитого белка.

Один из изучаемых слитых белков начинается с последовательности, связанной с патогеном табака (РК8) (8утоп§ с1 а1., 1990, Вю/1сс1то1оду. 8: 217-221), которая служит в качестве сигнального пептида для целевой экспрессии в ЕК котрансляционным методом. Сразу же после нее идет последовательность, кодирующая Εν антитело с одной цепью ОсРу) со специфическим к видам сродством против 18 кДа олеозина из АгаЬ1бор818 ШаЛапа, обозначенная Ό9^Εν, далее идет расщепляемый трипсином пропептид (К11р27), полученный из ТА57 пропептида дрожжей (К)с1б5сп с1 а1., 2001, Вю1есЛпо1оду апб ОепеЛс Епдтеегтд Ке\зе\\ъ 18: 89-121). За ней следует мини-инсулин (ΜΙ), описанный у К)с1б5сп с1 а1. (2001), с добавлением сигнала ЕК-удержания КИЕЬ на С-конце полипептида.

Основная цепь этой плазмиды, р8В84055, основана на бинарном векторе растения, рР2Р200, описанном у На)бик1С\\зсх е1 а1. (Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду, 1994, 25: 989-994). Вместо описанного сайта множественного клонирования, ра! ген, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (\Уо1111еЬеп е1 а1., 1988, Оспе 70: 25-37), управляемый промотором/терминатором убиквитина из Ре1го5с1йшт сгорит (КатаЛеск е1 а1., 1993, Р1ап1 Мо1. Вю., 21: 673-684), был введен между левой и правой пограничными последовательностями.

В дополнение к этой кассете промотор/терминатор β-фазеолина из РЛа8ео1и8 уЫдагЕ (81щ1иот е1 а1., 1983, Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А 80: 1897-1901), управляющий РК8, был субклонирован. Стандартную

- 16 014887

РСК (Нойоп е1 а1., 1989, Сепе 77: 61-68) применяли для слияния синтетической РК8-кодирующей последовательности с присоединенными сайтами рестрикции 8рй1/НтбШ эндонуклеазы с З'-конца промотора фазеолина с получением р8В84011. 8рй1-Э95сЕу-Хйо1, 8^а1, ΗίηάΙΙΙ введенную последовательность генерировали РСК амплификацией Э95сЕу кДНК клона (8еап Нетттдкеп 1ай, неопубликовано) с праймерами 1325 (ССАТССТСАСАТТСТСАТСАСАСАСТС) - 8 ЕЕ) ΙΌ N0:175 и 1326 (ААССТТССАТТТАААТАСТССАСАСТСТСАСАСТССТСССТТС) - 8ЕС ΙΌ N0:176. Последующее лигирование этого фрагмента в сайтах 8рй1/Н1пбШ р8В84011 дает плазмиду р8В84055. Последовательность К11р27-М1 синтезируют из четырех частично перекрывающихся олигонуклеотидов, в которые введен кодон АгаЫборДк 1йа11апа, применяемый для повышения эффективности трансляции в системах экспрессии, основанных на растениях. Олигонуклеотиды 1324 (СААСААССАСАСССТААСТТТСТТАА ТСААСАТСТТТСТССАТСТСАТСТТСТТСАСССТСТСТАССТТС) - 8 ЕЕ) ΙΌ N0:177 и 1323 (ССТТАССАСТСТАСАААААТССТСТТТСТССАСАСАСААССТАСАСАСССТСААСА) 8 ЕЕ) ΙΌ

N0:178 гибридизируют в их комплементарном наложении 20 нуклеотидов и удлиняют с получением 5'конца К11р27-М1 слияния, то же самое проводят с олигонуклеотидами 1322 (СТААСССТССТААСССААТТС() - 8 ЕЕ) ΙΌ N0:179 и 1321 (ААССТТСАСТТССААТАСТТСТССААТТССТАААСТСАССАААТАСААСТССААСАТТСТТСААС ААТТСССТТАССАСССТТ) - 8Е0 ΙΌ N0:180 с получением 3'-конца. Две половины лигируют с последующим рестрикционным расщеплением с Вки36[ с получением полной КПр27-М[ кодирующей последовательности. РСК такого слияния гена с применением праймеров 1364 (СТССАСТСААССААТ ТСАТСАСАСТСААТС) - 8ЕЕ) ΙΌ N0:181 и 1334 (ААССТТСАААСТТСАТССТТСТТССААТАСТТСТ ССААТТС) - 8Е0 ΙΌ N0:182 присоединяют 5' сайт расщепления Хйо[ рестрикционной эндонуклеазы и 3' КОЕЬ ДНК последовательность плюс НтбШ сайт расщепления для последующего лигирования в Хйо1/НтбШ-разрыв р8В84055. Результатом является плазмида р8В84404: последовательность ДНК, кодирующая слитый белок РК8-О95сЕу-К11р27-М1-КПЕЕ, помещенный в бинарный вектор под контролем экспрессии промотором/терминатором фазеолина. Промотор фазеолина контролирует специфически временную и специфическую к тканям экспрессию трансгена во время развития семян. Полная последовательность нуклеиновой кислоты (8Е0 ΙΌ N0:1) и последовательность аминокислоты (8Е0 ΙΌ N0:2) слитого белка инсулина 4404 (РК8-О95сЕу-Кйр27-М1-КОЕЕ) показана на фиг. 1.

Получение р8В84405: 0ЕЕ0-Кйр8-Кйр27-М1 слитого белка.

Второй изучаемый слитый белок начинается с 18 кДа олеозина из АгаЫборДк Шайапа, далее продолжается расщепляемым химозином пропептидом (К11р8) - 8Е0 ΙΌ N0:175. Сразу же за ним идет последовательность, кодирующая расщепляемый трипсином пропептид (Кйр27), полученная из ТА57 пропептида дрожжей, как описано выше (К)е1б8еп е1 а1., 2001, Вю1есйпо1оду апб СепеПс Епдтееппд Кеу1е\\ъ 18: 89-121). Она слита с мини-инсулином (ΜΙ), описанным выше (К)е1б8еп е1 а1. 2001). Экспрессия этого слитого белка нацелена на новые масляные тельца, образующиеся в процессе развития эмбриона.

Основная цепь этой плазмиды, р8В84055, основана на бинарном векторе растения, рР2Р200, описанном у На)йик1е\\зсх е1 а1. (Р1ай Мо1еси1аг Вю1оду, 1994, 25: 989-994). Вместо описанного сайта множественного клонирования, ра! ген, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (^оййейеп е1 а1., 1988, Сепе 70: 25-37), управляемый промотором/терминатором убиквитина из Ре1гокейпит сгйрит (Ка\уа11еск е1 а1., 1993, Р1ап1 Мо1. Вю., 21: 673-684), был введен между левой и правой пограничными последовательностями. В дополнение к этой кассете промотор/терминатор β-фазеолина из Рйа§ео1и8 уи1дап8 (8йдйЮт е1 а1., 1983, Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 80: 1897-1901), управляющий слиянием геномной последовательности-Кйр8 АгаЫборДк 18 кДа олеозина, был субклонирован. Стандартную РСК (Нойоп е1 а1., 1989, Сепе 77: 61-68) применяли для слияния последовательности ген олеозинаКйр8 с сайтами Хйо1/НтбШ рестрикционной эндонуклеазы с 3'-конца промотора фазеолина с получением р8В84010.

Последовательность К11р27-М1 синтезируют из четырех частично перекрывающихся олигонуклеотидов, в которые введен кодон АгаЫборДк ййайапа, применяемый для повышения эффективности трансляции в системах экспрессии, основанных на растениях. Олигонуклеотиды 1324 (СААСААСС АСАСССТААСТТТСТТААТСААСАТСТТТСТССАТСТСАТСТТСТТСАСССТСТСТАССТТС) - 8 ЕЕ) ΙΌ N0:177 и 1323 (ССТТАССАСТСТАСАААААТССТСТТТСТССАСАСАСААССТАСАСАССС ТСААСА) 8Е0 ΙΌ N0:178 гибридизируют в их комплементарном наложении 20 нуклеотидов и продлевают с получением 5'-конца К11р27-М1 слияния, то же самое проводят с олигонуклеотидами 1322 (СТААСССТССТААСССААТТС) - 8 ЕЕ) ΙΌ N0:179 и 1321 (ААССТТСАСТТССААТАСТТСТССААТТССТАААСТСАССАААТАСААСТССААСАТТСТТСАА СААТТСССТТАССАСССТТ) - 8Е0 ΙΌ N0:180 с получением 3'-конца. Две половины лигируют с последующим рестрикционным расщеплением с В§и361 с получением полной К11р27-М1 кодирующей последовательности. РСК такого слияния гена с применением праймеров 1364 (СТССАСТСААССААТ ТСАТСАСАСТСААТС) - 8ЕЕ) ΙΌ N0:181 и 1329 (ААССТТСАСТТССААТАСТТС) - 8ЕЕ) ΙΌ N0:183 присоединяют 5' сайт расщепления Хйо1 рестрикционной эндонуклеазы и 3' НтбШ сайт расщепления соответственно для последующего лигирования в Хйо1/НтбШ-разрыв р8В84010. Результатом является плазмид р8В84405: последовательность ДНК, кодирующая слитый белок 0ЬЕ0-Кйр8-Кйр27-М1, поме

- 17 014887 щенный в бинарный вектор под контролем экспрессии промотором/терминатором фазеолина. Промотор фазеолина контролирует специфически временную и специфическую к тканям экспрессию трансгена во время развития семян. Полная последовательность нуклеиновой кислоты (8Е0 ΙΌ N0:3) и последовательность аминокислоты (8Е0 ΙΌ N0:4) слитого белка инсулина 4405 (0ЬЕ0-К11р8-К11р27-М1) показана на фиг. 2.

Получение р8В84414: РК8-М1-тетраосновный линкер-О98сБу-КЭЕЬ слитого белка.

Другой из изучаемых слитых белков начинается с последовательности, связанной с патогеном табака (РВ8) (8утоп§ ек а1., 1990, Вю/кесНпокду, 8: 217-221), которая служит в качестве сигнального пептида для целевой экспрессии в ЕВ котрансляционным методом. Сразу же после нее идет последовательность, кодирующая мини-инсулин (М1), описанный у К)е1й5еп ек а1. (2001), за исключением того, что область мини-С пептида (ААК-8Е0 ΙΌ N0:146) заменяют промежуточным В₃₀ треонин-тетраосновным сайтом (В₃₀-Т-ВВКВ) (8Е0 ΙΌ N0:149), последовательностью между В(_!-29)- и А(1_-2!)-цепями человеческого инсулина. Затем сразу же следует последовательность, кодирующая второй тетраосновный линкер, а затем Бу антитело с одной цепью (ксБу) с видоспецифичным сродством против 18 кДа олеозина из АгаЫйорык ккайапа, обозначенная Э95сБу. На С-конце полипептида добавлен сигнал ЕВ-удержания КЭЕЬ.

Основная цепь этой плазмиды, р8В84055, основана на бинарном векторе растения, рР2Р200, описанном у На)йик1е\\зс/ ек а1. (Р1апк Мо1еси1аг Вю1оду, 1994, 25: 989-994). Вместо описанного сайта множественного клонирования, рак ген, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (^ой11еЬеп ек а1., 1988, Сепе 70: 25-37), управляемый промотором/терминатором убиквитина из Рекго5е1йшт сгорит (Ка\\'а11еск ек а1., 1993, Р1апк Мо1. Вю., 21: 673-684), был введен между левой и правой пограничными последовательностями. В дополнение к этой кассете промотор/терминатор βфазеолина из Рйа8ео1и8 уЫдаШ (811дккот ек а1., 1983, Ргос. №к1. Асай. 8ск И8А 80: 1897-1901), управляющий РВ8, был субклонирован. Стандартную РСВ (Ногкоп ек а1., 1989, Сепе 77: 61-68) применяли для слияния синтетической РВ8-кодирующей последовательности с присоединенными сайтами 8рЫ/НтйШ рестрикционной эндонуклеазы с 3'-конца промотора фазеолина с получением р8В84011.

Последовательность К11р27-М1 синтезируют из четырех частично перекрывающихся олигонуклеотидов, в которые введен кодон АгаЫйорык ШаНаиа, применяемый для повышения эффективности трансляции в системах экспрессии, основанных на растениях. Олигонуклеотиды 1324 (СААСААССАСАСССТААСТТТСТТААТСААСАТСТТТСТССАТСТСАТСТТСТТСАСССТСТСТА ССТТС) - 8 ЕС) ΙΌ N0:177 и 1323 (ССТТАССАСТСТАСАААААТССТСТТТСТССАСАСАСААССТ АСАСАСССТСААСА) - 8Е0 ΙΌ N0:178 гибридизируют в их комплементарном наложении 20 нуклеотидов и продлевают с получением 5'-конца КНр27-М[ слияния, то же самое проводят с олигонуклеотидами 1322 (СТААСССТССТААСССААТТС) - 8 ЕС) ΙΌ N0:179 и 1321 (ААССТТСАСТТССААТАСТТСТССААТТССТАААСТСАССАААТАСААСТССААСАТТСТТСАА СААТТСССТТАССАСССТТ) - 8Е0 ΙΌ N0:180 с получением 3'-конца. Две половины лигируют с последующим рестрикционным расщеплением с ВыПСй с получением полной К1^р27-МI кодирующей последовательности. РСВ такого слияния гена с применением праймеров 1363 (ССАТССССААССААТ ТСАТСАСАСТС) - 8 ЕС) ΙΌ N0:184 и 1334 (ААССТТСАААСТТСАТССТТСТТССААТАСТТСТ ССААТТС) - 8Е0 ΙΌ N0:182 присоединяют 5' сайт расщепления 8рЫ рестрикционной эндонуклеазы и 3' КОЕЬ ДНК последовательность плюс НтйШ сайт расщепления для последующего лигирования в 8рЫ/НтйШ-разрыв р8В84011. Результатом является плазмида р8В84402: последовательность ДНК, кодирующая слитый белок РВ8-К1^р27-МI-К^Е^, помещенный в бинарный вектор под контролем экспрессии промотором/терминатором фазеолина. Промотор фазеолина контролирует специфически временную и специфическую к тканям экспрессию трансгена во время развития семян. Вектор экспрессии растения, р8В84402, служит в качестве образца введения сайта между В- и А-цепями инсулина и между МI и П9§сБу.

Промежуточный тетраосновный сайт (В₃₀-Т-ВВКВ) помещают между настоящими В(1_-29)- и Л(₁.₂₁)цепями человеческого инсулина с помощью РСВ с применением праймеров 1515 (ССАТССАТСССТТТСТТААТСААСАТСТТТСТСС) 8 ЕС) ΙΌ N0:185 и 1518 (АСАТТСТТСААСААТТССТСТСТТТСТТСТАСТСТТАССАСТСТАСАААААТСС) 8 ЕС) ΙΌ N0:186 с применением р8В84402 в качестве образца. Полученный 124 п.н. фрагмент применяют в сочетании с праймером 1517 (ССАТААССТТСАААССТСАТССТТТСАСС) 8ЕС) ΙΌ N0:187 с применением р8В83400 в качестве образца. Необходимо отметить, что р8В83400 представляет собой плазмиду, которая содержит П98сБу-КЭЕЕ фрагмент с сайтом рестрикции НтйШ. Реакция РСВ дает 955 п.н. продукт, который вводит тетраосновный (ВВКВ)-О98сБу-КОЕЕ-НтйШ в 124 п.н. 8рЫ-МI фрагмент. Фрагмент 955 п.н. затем лигируют и субклонируют в рСЕМ-Т (Рготеда) с получением р8В83403. Весь 8рЫ-МI (с В₃₀-Т-ВВКВ модифицированным С пропептидом)-ВВКВ-П98сБу-КОЕЕ-НтйШ фрагмент вводят в предварительно разрезанный (8рЫ/НтйШ) р8В84402 с получением р8В84414. Полная последовательность нуклеиновой кислоты (8Е0 ΙΌ N0:5) и последовательность аминокислоты (8Е0 ΙΌ N0:6) слитого белка инсулина 4414 (РВ8-МI-тетраосновный линкер-П98сБу-КЭЕЕ) показаны на фиг. 3.

- 18 014887

Трансформация и выращивание рекомбинантной Е.сой и Адгойас!егшт с р8В84404, р8В84405 или р8В84414

После подтверждения целостности кДНК кодирования для слитого белка анализом последовательности плазмиды р8В84404, р8В84405 и р8В84414 трансформируют в штамм Е.сой ΌΗ5α для получения высокого уровня экспрессии. Выделенную плазмиду ДНК (100 нг) смешивают на льду со 100 мкл компетентных клеток ΌΗ5α в течение 20 мин. Затем клетки подвергают тепловому удару при температуре 42°С в течение 45 с и возвращают на лед на 2 мин. Затем добавляют 1 мл среды 8ОС и клетки инкубируют при температуре 37°С на энвиро-шейкере при 225 об/мин в течение 1 ч перед помещением трансформированных клеток на планшеты с ЬВ-спектиномицином (10 г/л триптона, 5 г/л экстракта дрожжей, 5 г/л №С1, 15 г/л агара) и инкубированием в течение ночи при температуре 37°С. Одну колонию используют для инокулирования 5 мл ЬВ-спектиномицинового бульона. Эти культуры выращивают в течение ночи при температуре 37°С. Рекомбинантную плазмиду выделяют из 1 мл среды, выстаиваемой в течение ночи, с применением набора О1Аргер®8рт М1шртер (01адеп). Выделенную плазмиду затем применяют для трансформации компетентного штамма Адгойас!ейцт ЕН101 (Ноой е! а1., 1986; 1. Вас!ейо1. 144: 732-743) электропорацией (25 мкФ, 2,5 кВ, 200 Ом). Рекомбинантные Адгойас!егшт помещают на планшеты с АВ-спектиномицином/канамицином (20х АВ соли, 2М глюкозы, 0,25 мг/мл Ее8О₄-7Н₂О, 1М Мд8О₄, 1М СаС1₂) и одну колонию применяют для инокулирования 5 мл АВспектиномицинового/канамицинового бульона. Эти культуры выращивают в течение ночи при температуре 28°С. Рекомбинантные Адгойас!егшт затем применяют для трансформации растений АгаЫйорйк 1йайапа методом погружения цветков (С1оидй е! а1., 1998, Р1ап! 1.. 16: 735-743). Вид АтаЫйорйк 1йайапа (С24) применяют для всех экспериментов. Семена высевают на поверхности смеси почв (две трети земли Кей1 и одна треть перлита с рН 6,7) или смеси почв для АгаЫйорйк от Ьей1е 8еей§ (перлит, вермикулит, торф, терра-грин с рН 5,5) в 4-дюймовые горшки. Саженцы выращивают до стадии розеток из 6-8 листьев диаметром приблизительно 2,5 см. Горшки помещают внутрь купола при температуре 4°С на четыре дня для холодной обработки и затем переносят в комнату для выращивания с температурой 24°С с постоянным светом около 150 мкЕ и относительной влажностью 60-70%. Растения орошают с интервалом 2-3 дня и еженедельно подкармливают удобрением 1% Ре!ег§ 20-19-18. Каждый горшок содержит от пяти до шести растений. Когда растения достигают около 2 см в высоту, первые стрелки срезают для стимулирования роста вторых и третьих стрелок. Через 4-5 дней после среза первичных стрелок растения готовы к заражению Адгойас!ейит. Горшки с растениями АгаЫйорщк опрокидывают для заражения растений АгаЫйорйк в 500 мл ресуспензии культуры АдтоЬас!ейит, выращенной в течение ночи, содержащей целевой вектор трансформации растения, в течение 20 с. Важно, чтобы культура Адгойас!ейит содержала 5% сахарозы и 0,05% поверхностно-активного вещества 8П\\'е1 й-77 (Ьей1е 8еей§). Далее горшки накрывают прозрачными пластиковыми крышками на 24 ч для поддержания более высокой влажности. Растения выращивают до взрослого состояния и собирают смесь семян, трансформированных и нетрансформированных. Для выбора трансгенных линий предполагаемые трансформированные семена стерилизуют быстрым промыванием 70% этанолом, затем 20% коммерческим отбеливателем в течение 15 мин и затем ополаскивают по крайней мере четыре раза ййН₂О. Около 1000 стерилизованных семян смешивают с 0,6% расплавленным агаром и равномерно распределяют на М8 планшете с половинной силой (Мига8Й1де апй 8коод, 1962, Рйу8ю1оща Р1ап1агит 15: 473-497), содержащем 0,3% сахарозы и 80 мкМ гербицида фосфинотрицина (РРТ) Эй. Затем планшеты помещают в комнату для выращивания с режимом освещения 8 ч темноты и 16 ч света при температуре 24°С. Через 7-10 дней предполагаемые трансгенные саженцы остаются зелеными и растут, в то время как нетрансформированные саженцы бледнеют. После появления корней предполагаемые трансгенные саженцы индивидуально переносят в горшки (отдельные растения орошают с интервалом 3 дня и подкармливают удобрениями 1% Ре!ег§ 20-19-18 с интервалом 7 дней) и выращивают до взрослого состояния. Горшки накрывают прозрачными пластиковыми крышками на 3 дня для защиты чувствительных саженцев. Через 7 дней саженцы накрывают системой сбора семян от Ьей1е 8еей§ для предотвращения потери семян из-за рассеивания. Семена трансгенных растений собирают отдельно и готовят для анализа.

Пример 2.

Уровни экспрессии инсулина у АгаЫйорйк 1йайапа.

Во втором примере определяют уровни экспрессии слитого белка Э95сЕу-Кйр27-М1 КОЕЙ (4404), ОйЕО-Кйр8-К11р27-М1 (4405) и РК8-М1-КККк-О98сЕу-КОЕЙ (4414) в трансгенных зрелых семенах АтаЫйорйк !йайапа. Показано, что трансгенный продукт присутствует в клеточных экстрактах зрелых семян. Приблизительно 40 трансгенных семян АтаЫйорйк 1йайапа измельчают в ступе пестиком в 50 мкл 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0. Затем к суспензии добавляют восстанавливающий 8Э8-РАОЕ образцовый буфер (6х 8Ό8 образцовый буфер, 0,35М Трис-НС1, рН 6,8, 30% глицерин, 10% 8Ό8, 0,012% голубого бромфенола, 5% β-меркаптоэтанола) и перемешивают короткими завихрениями. Затем образец быстро центрифугируют и выдерживают при температуре 99°С в течение 10 мин. После охлаждения на льду в течение 2 мин образец быстро центрифугируют. Образцы помещают (10 мкл - эквивалент приблизительно 7 семенам) в условия восстановления.

- 19 014887

Для подготовленных образцов масляных телец трансгенные и дикие семена (20 мг) измельчают в 250 мкл буфера экстрагирования масляных телец (0,4М сахарозы, 0,5М №С1, 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0). Образцы микроцентрифугируют при 10000 д в течение 10 мин. Растворимые водные фракции удаляют с помощью 26 С 5/8 1 мл шприца и жирный слой повторно суспендируют в 100 мкл фосфатного буфера с добавлением соли (20 мМ №₂НР0₄, рН 8,0, 0,5М №1С1). Повторно суспендированный жирный слой переносят в чистую пробирку микроцентрифуги и снова центрифугируют при 10000 д в течение 10 мин. Процедуру повторяют еще 3 раза с последним повторным суспендированием жирного слоя в 100 мкл фосфатном буфере без соли (20 мМ Nа₂НР0₄, рН 8,0). Два дополнительных промывания в фосфатном буфере без соли проводят поочередно с центрифугированием, как описано выше. Конечную жирную лепешку повторно суспендируют в 10 мкл фосфатного буфера (20 мМ Nа₂НР0₄, рН 8,0). Берут 5 мкл аликвоту и белок масляного тельца солюбилизируют кипячением в 1/10 (об./об.) 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0 с 2% БЭБ. Образец охлаждают на льду в течение 2 мин и центрифугируют при 10000 д в течение 5 мин. Содержание белка в подосадочной жидкости определяют ИСФ анализом белка (Р1егсе, КоскГог!, ГБ). Для анализа окрашенных кумасси гелей и вестерн-блоттинга 20 мкг общего белка отделяют на 15% БЭБРАСЕ гелях в условиях восстановления с применением БЭБ-РАСЕ образцового буфера.

Затем образцы загружают в дискретные 15% БЭБ-РАСЕ гели и разделяют при 150 В в течение приблизительно 1,5 ч. Затем гели либо окрашивают кумасси, либо наносят на РУЭЕ мембрану ([ттοЬ^1οη-Р. Μί11ίροΐΌ Сο^ρο^а(^οп. Ве!Гог!, МА) для вестерн-блоттинга. Нанесенные образцы исследуют с. помощью моноклональных антител, направленных против инсулина (С1опе Е2-Е3; Ко(Н е( а1., 1992) от АЬсаш (СашЬг1!де, ИК). Полосы инсулина определяют с применением вторичного БНее]э X ЦС мыши Е(аЬ')₂АР-конъюгата (СНешюоп Шетайопаф Тетеси1а, СА) и проявляют с помощью МВЕ-ВОР в САКАР буфере (Трис-НС1, рН 9,5, 100 мМ №С1, 5 мМ МдС1₂). Иммунореакционноспособная полоса соответствует полипептидной полосе, мигрируя при расчетном молекулярном весе слитого белка, как показано на фиг. 4А-4Е. На фиг. 4А-4Е показана рекомбинантная экспрессия слитых белков инсулина в трансформированных линиях Α^аЬ^άορ8^8 (Найапа (4404-2, -17, -20, 4405-4, 4414-19 и 4414-20) на основе окрашенного кумасси БЭБ-РАСЕ и вестерн-блоттинга. Стрелки указывают на положение мигрирующих 38,5 кДа, 34,2 кДа и 34,2 кДа слитых белков, РКБ-^98сЕν-Κ1^ρ27-ΜIν/Κ^Е^ (4404), 0^Е0-Κ1^ρ8-Κ1^ρ27-ΜI (4405) и РКБ-ΜI-ККΚК-^98сЕν-Κ^Е^ (4414) соответственно в условиях восстановления. Необходимо отметить, что слитый белок 4414 имеет ожидаемый молекулярный вес 34,2 кДа, но имеет более высокий реальный молекулярный вес на БЭБ-РАСЕ геле. На фиг. 4А (окрашенный кумасси гель) и 4В (соответствующий вестерн-блоттинг, исследованный с антиинсулином Е2Е3) показан общий белок семян из диких (\\1) и трансгенных линий семян, экспрессирующих 4404 и 4405 конструкции. На фиг. 4С (окрашенный кумасси гель) и 4Ό (соответствующий вестерн-блоттинг, исследованный с антиинсулином Е2Е3) показан белок масляных телец, полученный из диких и трансгенных семян, экспрессирующих те же самые 4404 и 4405 конструкции. На фиг. 4Ό (окрашенный кумасси гель) и 4Е (соответствующий вестерн-блоттинг, исследованный с антиинсулином Е2Е3) показан белок масляных телец, полученный из диких и трансгенных семян, экспрессирующих ту же самую 4414 конструкцию. Маркеры молекулярного веса (М) равны 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250 кДа. Контрольные группы включают НШ (стандарт рекомбинантного человеческого инсулина) и НРгоШ (стандарт рекомбинантного человеческого проинсулина), выделенные в невосстанавливающих условиях. Различия в уровнях экспрессии являются результатом клональных вариаций между трансформантами. Приблизительные уровни белка трансгенов в экспрессии ΜI показаны на фиг. 5. Уровни экспрессии определяют с применением ленты 18 кДа олеозина в качестве внутреннего стандарта (эквивалентно 1,5% общего белка семян) денситометрией ленты трансгена. Средний уровень экспрессии для РКБ-^98сЕν-Κ1^ρ27-ΜIν/Κ^Е^ (4404), 0^Е0-Κ1^ρ8-Κ1^ρ27-ΜI (4405) и РКБΜI-ККΚК-^98сЕν-Κ^Е^ (4414) конструкций составляет 0,21% от общего белка семени, 0,12% от общего белка семени и 0,79% от общего белка семени соответственно.

Пример 3.

Расщепление ρБΒБ4404 и очистка ВЭЖХ.

Элюирование из масляного тельца.

В третьем примере 1 г трансгенных семян гомогенизируют в 12 мл буфера экстрагирования (0,4М сахарозы, 0,5М №С1, 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0) и центрифугируют при 10000 д в течение 10 мин, жирные слои удаляют и помещают в 1 мл 20 мМ Nа₂НР0₄, 0,5М №1С1 и повторно центрифугируют, как описано выше. Процедуру повторяют дважды перед промыванием и центрифугированием жирного слоя дважды в 750 мкл 20 мМ Nа₂НР0₄. Слитый белок 4404 элюируют из масляного тельца в подосадочную жидкость промыванием конечного жирного слоя 5 раз в 750 мкл 20 мМ муравьиной кислоты, рН 4,1, при центрифугировании при 10000 д между каждой промывкой. Собранные элюированные фракции (подосадочные жидкости) объединяют и нейтрализуют 2н. №10Н до рН 8,0. Весь раствор охлаждают до температуры -80°С до замерзания и лиофилизируют в течение ночи для концентрации слитого белка. Лиофилизированный образец повторно суспендируют в 500 мкл 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0. Повторно суспендированный слитый белок 4404 затем опресняют на колонке NΑР-5 (АтегкНат РНагтааа Вю(есН АЬ, υρρ8а1а, Б\уе!еп) и повторно заменяют буфером (50 мМ Трис-НС1, рН 8,0). Опресненную фракцию затем снова замораживают и лиофилизируют в течение ночи для концентрации. Конечный концентрированный обра

- 20 014887 зец повторно суспендируют в конечном объеме 105 мкл дважды дистиллированной Н₂О. Результаты элюирования представлены на фиг. 6. На фиг. 6 изображен анализ окрашенного кумасси БЭБ-РАСЕ (15%) препаратов масляных телец до элюирования (-ОВ), препаратов ОВ после элюирования муравьиной кислотой (-ОВ') и концентрированного элюированного материала (-Е). Стрелки указывают на положение миграции слитого полипептида. Контрольная группа дикого типа практически не содержит какие-либо основные белки после элюирования, в то время как концентрированный материал 4404 содержит слитый белок, некоторое количество укороченных продуктов (возможно, гидролизованный слитый белок) и, возможно, некоторые коэлюированные альбумины.

Расщепление и ВЭЖХ анализ 4404, экспрессируемого семенами АгаЬ1Порз13.

Концентрированный образец повторно суспендируют в 105 мкл дважды дистиллированной воды и содержание белка оценивают с помощью теста для белка ВСА согласно инструкции производителя (Р1егсе, ИоскГогй. 1Ь, ИБА). Затем образцы расщепляют трипсином (1:300 трипсин:общий белок, в 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0, на льду в течение 90 мин). Реакции останавливают добавлением 10-кратного молярного избытка ТЬСК (Ν-п-тозил-Ь-лизин хлорметилкетона). Затем все реакционные смеси фильтруют через 0,2 мкм фильтры (АегоП1зс®, 13 мм фильтр для шприца с 0,2 мкм мембраной БироГ®, Ра11 СогрогаПоп, Апп АгЬог, ΜΙ, ИБА) и анализируют ВЭЖХ с обратимой фазой (ОФ) с применением С18 колонки (2огЬах 300БВ-С18, АдПеп! ТесЬпо1од1ез, ^аИЬгопп, Сегтапу). Образцы загружают в колонку и элюируют со скоростью 1,0 мл/мин с применением 19-минутного линейного градиента 5-50% (об./об.) ацетонитрила в 0,1% (об./об.) ТЕА. Хроматограмма этого анализа представлена на фиг. 7. Следы показывают расщепленный трипсином продукт из слитого белка 4404 со свойствами на колонке, практически идентичными стандарту человеческого инсулина (время удержания 17,011 и 17,179 мин соответственно). ВЭЖХ фракцию собирают на 17,0-17,5 мин и анализируют масс-спектрометрией РБЭ ΜΛΕΌΙ/Τ0Ε с применением масс-спектрометра Уоуадег-ЭЕ БТК (АррНеП Вюзуз!етз). МС анализ, проведенный с помощью услуги Биоаналитической спектроскопии, предлагаемой ΝΚ€-Ρ13πΐ Вю!есЬпо1оду 1п511(и(е, Базка!ооп, Базка!сПетеап, Сапаба. Повторное растворение расщепленного продукта 4404, очищенного ВЭЖХ, как описано выше, показано на фиг. 8В по сравнению со стандартом человеческого инсулина, показанного на фиг. 8А. Полученная масса расщепленного слитого белка 4404 с трипсином составляет 6191,51 Да. Расхождение между стандартом человеческого инсулина (фиг. 8А) и расщепленным продуктом 4404 (фиг. 8В) соответствует Оез-В₃₀ инсулину с КОЕЬ сигналом, удерживаемым на цепи А расщепленного продукта (Пез-В₃₀инсулин-КОЕЬ).

Пример 4.

Расщепление рБВБ4405 и очистка ВЭЖХ.

Элюирование из масляного тельца.

Слитый белок (0ЬЕ0-КНр8-К11р27-М1) может быть частично очищен получением препаратов масляных телец, как описано выше. Приблизительно 1 г трансгенных семян гомогенизируют в 12 мл в буфере экстрагирования (0,4М сахарозы, 0,5М №С1, 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0) и центрифугируют при 10000 д в течение 10 мин, жирные слои удаляют и помещают в 1 мл 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0, 0,5М №1С1 и повторно центрифугируют, как описано выше. Процедуру повторяют дважды, перед промыванием и центрифугированием жирного слоя дважды в 750 мкл 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0. Препарирование масляных телец в результате дает удаление большинства фоновых белков. Типовой профиль белков препарата масляных телец из трансгенных семян АгаЬ1Порз13, экспрессирующих 4405 конструкцию, показан на фиг. 9.

Расщепление и ВЭЖХ анализ 4405, экспрессируемого семенами АгаЬИорз13.

Общее содержание белка из повторно суспендированных масляных телец оценивают путем солюбилизации фракции препаратов (5 мкл), разбавленной в 10 раз в 2% БОБ, 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0, кипяченой в течение 5 мин и центрифугированной в течение 3 мин при 10000 д. Затем содержание белка оценивают с помощью теста для белка ВСА согласно инструкции производителя (Р1егсе, КоскГогП, 1Ь, ИБА). Затем образцы расщепляют трипсином (1:300 трипсин: общий белок, в 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0, на льду в течение 90 мин) для выделения К11р27-М1 фрагмента из слитого белка. Реакции останавливают добавлением 10-кратного молярного избытка ТЬСК (Ν-п-тозил-Ь-лизин хлорметилкетона). Образцы центрифугируют при 10000 д в течение 10 мин и подосадочные жидкости всех реакционных смесей фильтруют через 0,2 мкм фильтры (АегоФзс®, 13 мм фильтр для шприца с 0,2 мкм мембраной БироГ®, Ра11 Согрога!1оп, Апп АгЬог, ΜΙ, ИБА). На фиг. 9 изображен анализ окрашенного кумасси БЭБ-РАСЕ (15%) общего экстрагируемого белка семян и белка, полученного из масляных телец (ОВ) из колоний клеток, экспрессирующих 4405, по сравнению с диким типом (нерекомбинантным) семян. Стрелки указывают на положение миграции слитого полипептида. Подосадочные жидкости затем анализируют ВЭЖХ с обратимой фазой (ОФ) с применением С18 колонки (2огЬах 300 БВ-С18, АдПеп! ТесЬпо1од1ез, ^а1ПЬгопп, Сегтапу). Образцы загружают в колонку и элюируют со скоростью 1,0 мл/мин с применением 19-минутного линейного градиента 5-50% (об./об.) ацетонитрила в 0,1% (об./об.) ТЕА. Хроматограмма этого анализа представлена на фиг. 10. Следы показывают расщепленный трипсином продукт из слитого белка 4405 со свойствами на колонке, практически идентичными стандарту человеческого инсулина (время удержания 17,220 и 17,179 мин соответственно). ВЭЖХ фракцию собирают на 17,0-17,5 мин и анализируют масс

- 21 014887 спектрометрией Ρ8Ό ΜΆΕΌΙ/ΤΘΕ с применением масс-спектрометра Уоуадег-ΏΕ 8ТВ (Лррйеб Вюкук1сш5). МС-анализ, проведенный с помощью услуги биоаналитической спектроскопии, предлагаемой ΝΒί’-ΡΙαηΙ Вю!ескпо1оду 1ик1йи1е, 8акка!ооп, 8акка!ске^ап, Сапаба. Как показано на фиг. 11, полученная масса расщепленного слитого белка 4405 с трипсином составляет 5706,30 Да. Расхождение между стандартом человеческого инсулина (фиг. 8А) и расщепленным продуктом 4405 (фиг. 11) соответствует ЭекВ₃₀инсулину (Пек-В₃₀инсулин). Оек-В₃₀инсулин представляет собой продукт, ожидаемый при коррекции созревания трипсина слияния 4405.

Пример 5.

Очистка расщепленного трипсином ΜΙ с применением АКТА Ехр1огег (ЕРЬС).

Очистка отщепленного ΜΙ от 4405 также обеспечивает частичную очистку от реакций расщепления более высокого уровня анионным обменом (Мопо О ЕЕ 1 мл, Атегккат Ркагтааа) на АКТА Ехр1огег (Атегккат Ркагтааа). Реакции расщепления проводят с масляными тельцами 4405, как описано выше, полученными из 30 г трансгенных семян. Подосадочные жидкости из реакций расщепления либо фильтруют через 0,2 мкм фильтры, либо концентрируют лиофилизацией на 8ауап! 8рееб Уас. Фильтрованные реакционные смеси образцов могут быть нанесены на колонку непосредственно, но концентрированные образцы требуют удаления солей для эффективного связывания колонки. Концентрированные образцы могут быть опреснены пропусканием расщепленного материала через колонку ΡΌ-10 (Атегккат Ркагтааа), диализом или разбавлением до концентрации соли, эквивалентной или менее чем 5 мС/см. Опресненные образцы уравновешивают 20 мМ Трис-НС1, рН 6,5. Образцы отделяют с применением пошагового градиента с Ν;·ιΟ1 0-40% Ν;·ιΟ1 со скоростью потока 1 мл/мин. Определение проводят при 214 нм (определение при 280 нм относительно слабое из-за низкого содержания ароматических аминокислот в инсулине). Растворитель А состоит из 20 мМ Трис-НС1, рН 6,5, а растворитель В состоит из 20 мМ ТрисНС1, рН 6,5, 1,0М №101. Фракции (1 мл), элюированные при той же проводимости, что и стандарт инсулина Воске, между 7-35 мС/см, собирают (см. фиг. 12). На фиг. 12 представлена хроматограмма расщепленных трипсином препаратов масляных телец 4405 (пунктирная линия) по сравнению со стандартом человеческого инсулина (сплошная линия). Присутствие инсулина подтверждается в собранных фракциях с помощью ВЭЖХ, ЕЫ8А или вестерн-блоттинга (данные не показаны). Собранные образцы концентрируют лиофилизацией и применяют для биотестирования инсулина, описанного в примере 6.

Пример 6.

Тестирование переносимости инсулина: биотестирование на самцах мышей С57В1/6 (В6).

Это биотестирование проводят для определения ίη угуо действия рекомбинантного, полученного в растениях (ПекВ₃₀ ΙΝ) из расщепленного трипсином 4405, по сравнению с человеческим инсулином. Уровни глюкозы в плазме мышей В6 определяют до и после внутрибрюшинной инъекции стандартов инсулина, отрицательного контроля и 8В8 инсулина. Пятнадцать мышей С57В1/6 (В6) возрастом приблизительно 2 месяца приобретают у 1асккоп ЬаЬота1от1ек (Ваг НагЬог, МЕ). Уровни глюкозы в плазме определяют автоматическим глюкометром (ОпеТоиск И1!га, □ Гексан 1окпкоп апб 1окпкоп). Положительный контроль включает НитиНпВ® (Е11 ЬШу) и дрожжевой рекомбинантный стандарт человеческого инсулина от Воске. В качестве плацебо применяют физиологический раствор. Отрицательный контроль включает расщепленные трипсином масляные тельца, очищенные из дикого типа (нерекомбинантных) семян АтаЬ1бор818, которые обрабатывают идентично рекомбинантным препаратам расщепленных трипсином масляных телец 4405.

Мышей В6 помещают в клетки и кормят аб ЬЬйит при 12-часовом цикле день-ночь. Для проведения тестов на переносимость инсулина мышам вводят внутрибрюшинные инъекции (ВБ) инсулина (1 Ед/кг массы тела) и уровни глюкозы определяют через 0, 15, 30 и 60 мин с применением автоматического глюкометра. Все тесты на переносимость инсулина проводят с одинаковым интервалом каждый день (9:00). Тесты на переносимость инсулина проводят по крайней мере в течение 2 дней с промежутками времени перед введением очередного теста. Результаты тестов переносимости инсулина представлены на фиг. 13. 8В8 ПекВ₃₀ инсулин, полученный из семян 4405 (закрашенные ромбы), действует практически идентично (статистически не отличается, р<0,05) с НитикпВ® (пустые квадраты) и инсулином от Воске (пустые треугольники) после введения всего курса исследования. Все тестированные инсулины значительно снижают уровни глюкозы в плазме (р<0,05) по сравнению с плацебо физиологическим раствором (пустые круги) и расщепленных трипсином масляных телец из семян дикого типа АгаЬ1борк1к (закрашенные круги) (отрицательный контроль).

Пример 7.

Получение р8В84401: РВ8-Ккр27-М1 слитого белка.

Один из изучаемых слитых белков начинается с последовательности, связанной с патогеном табака (РВ8) (8утопк е! а1., 1990, Вю/!ескпо1оду, 8: 217-221), которая служит в качестве сигнального пептида для целевой экспрессии в ЕВ котрансляционным методом. Сразу же после нее идет расщепляемый трипсином пропептид (К11р27), полученный из ТА57 пропептида дрожжей (К)е1бкеп е! а1., 2001, Вю!ескпо1оду апб Семекс Епдшееппд Веу1е^8 18: 89-121). Затем идет мини-инсулин (ΜΙ), описанный у К)е1б8еп е! а1. (2001).

- 22 014887

Основная цепь этой плазмиды, р8В84055, основана на бинарном векторе растения, рР2Р200, описанном у На)йик1е\\зсх ек а1. (Р1апк Мо1еси1аг Вю1оду, 1994, 25: 989-994). Вместо описанного сайта множественного клонирования, рак ген, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (^оЬ11еЬеп ек а1., 1988, Сепе 70: 25-37), управляемый промотором/терминатором убиквитина из Рекгокейпит спкрит (Ка\уа11еск ек а1., 1993, Р1апк Мо1. Вю., 21: 673-684), был введен между левой и правой пограничными последовательностями. В дополнение к этой кассете промотор/терминатор β-фазеолина из Рйакео1ик уи1дапк (811дйкот ек а1., 1983, Ргос. №к1. Асай. 8ск И8А 80: 1897-1901), управляющий РК8, был субклонирован. Стандартную РСК (Ногкоп ек а1., 1989, Сепе 77: 61-68) применяли для слияния синтетической РК8-кодирующей последовательности с присоединенными сайтами 8рЫ/НшйШ рестрикционной эндонуклеазы с 3'-конца промотора фазеолина с получением р8В84011.

Последовательность К11р27-М1 синтезируют из четырех частично перекрывающихся олигонуклеотидов, в которые введен кодон АгаЬ1йорк1к кЪаНапа, применяемый для повышения эффективности трансляции в системах экспрессии, основанных на растениях. Олигонуклеотиды 1324 (СААСААССАСАСССТААСТТТСТТААТСААСАТСТТТСТССАТСТСАТСТТСТТСАСССТСТСТА ССТТС) - 8 ЕС) ГО N0:177 и 1323 (ССТТАССАСТСТАСАААААТССТСТТТСТССАСАСАСААССТ АСАСАСССТСААСА) - 8Е0 ГО N0:178 гибридизируют в их комплементарном наложении 20 нуклеотидов и продлевают с получением 5'-конца К11р27-М1 слияния, то же самое проводят с олигонуклеотидами 1322 (СТААСССТССТААСССААТТС) - 8 ЕС) ГО N0:179 и 1321 (ААССТТСАСТТССААТАСТТСТССААТТССТАААСТСАССАААТАСААСТССААСАТТСТТСАА СААТТСССТТАССАСССТТ) - 8Е0 ГО N0:180 с получением 3'-конца. Две половины лигируют с последующим рестрикционным расщеплением с Вки361 с получением полной К11р27-М1 кодирующей последовательности. РСК такого слияния гена с применением праймеров 1363 (ССАТССССААССААТ ТСАТСАСАСТС) - 8ЕС) ГО N0:184 и 1329 (ААССТТСАСТТССААТАСТТС) - 8ЕС) ГО N0:183 присоединяют 5' сайт расщепления 8рЫ и 3' НшйШ рестрикционной эндонуклеазы для последующего лигирования в 8рЫ/НшйШ-разрыв р8В84011 (как описано выше). Результатом является плазмида р8В 84401: последовательность ДНК (8Е0 ГО N0:188), кодирующая слитый белок РК8-К11р27-М1 (8Е0 ГО N0:189), помещенный в бинарный вектор под контролем экспрессии промотором/терминатором фазеолина. Промотор фазеолина контролирует специфически временную и специфическую к тканям экспрессию трансгена во время развития семян.

Трансформация и выращивание рекомбинантной Е.сой и АдгоЬаскегшт с р8В84401

После подтверждения целостности кДНК кодирования для слитого белка анализом последовательности плазмиду р8В 84401 трансформируют в штамм Е.сок ЭН5а для получения высокого уровня экспрессии. Выделенную плазмиду ДНК (100 нг) смешивают на льду со 100 мкл компетентных клеток ЭН5(/. в течение 20 мин. Затем клетки подвергают тепловому удару при температуре 42°С в течение 45 с и возвращают в лед на 2 мин. Затем добавляют 1 мл среды 80С и клетки инкубируют при температуре 37°С на энвиро-шейкере при 225 об/мин в течение 1 ч перед помещением трансформированных клеток на планшеты с ЬВ-спектиномицином (10 г/л триптона, 5 г/л экстракта дрожжей, 5 г/л №С1, 15 г/л агара) и инкубированием в течение ночи при температуре 37°С. Одну колонию используют для инокулирования 5 мл ЬВ-спектиномицинового бульона. Эти культуры выращивают в течение ночи при температуре 37°С. Рекомбинантную плазмиду выделяют из 1 мл среды, выстаиваемой в течение ночи, согласно получению мини-препаратов 01адеп. Выделенную плазмиду затем применяют для трансформации компетентного штамма АдгоЬаскегшт ЕН101 (Ноой ек а1., 1986; I. Васкегю1. 144: 732-743) электропорацией (25 мкФ, 2,5 кВ, 200 Ом). Рекомбинантные АдгоЬаскегшт помещают на планшеты с АВспектиномицином/канамицином (20х АВ соли, 2М глюкозы, 0,25 мг/мл Ре80₄-7Н₂0, 1М Мд80₄, 1М СаС12) и одну колонию применяют для инокулирования 5 мл АВ-спектиномицинового/канамицинового бульона. Эти культуры выращивают в течение ночи при температуре 28°С. Рекомбинантные АдгоЬаскегшт затем применяют для трансформации растений АгаЬ1йорк1к кйайапа методом погружения цветков (С1оидй ек а1., 1998, Р1апк I., 16: 735-743), как описано в примере 1.

Уровни экспрессии инсулина в АгаЬ1йорк1к кйайапа

Уровни экспрессии слитого белка К11р27-М1 (4401) определяют в трансгенных созревших семенах АгаЬ1йорк1к кйайапа с применением методики примера 2 выше. Трансгенный продукт не был найден в клеточных экстрактах зрелых семян.

Пример 8.

Получение р8В84409: 0ЬЕ0-человеческнй проинсулин (0ЬЕ0-йРЕ№) слитого белка.

Этот слитый белок начинается с 18 кДа олеозина из АгаЬ1йорк1к кйайапа, далее продолжается геном, кодирующим человеческий проинсулин (ЬРГО). Экспрессия этого слитого белка нацелена на новые масляные тельца, образующиеся в процессе развития эмбриона.

Основная цепь этой плазмиды, р8В84008, основана на бинарном векторе растения, рР2Р200, описанном у На)йик1е\\зсх ек а1. (Р1апк Мо1еси1аг Вю1оду, 1994, 25: 989-994). Вместо описанного сайта множественного клонирования, рак ген, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (^оЬ11еЬеп ек а1., 1988, Сепе 70: 25-37), управляемый промотором/терминатором убиквитина из Рек

- 23 014887 гоке1шит спкрит (Ка\\'а11еск е! а1., 1993, Р1ап! Мо1. Вю., 21: 673-684), был введен между левой и правой пограничными последовательностями. В дополнение к этой кассете промотор/терминатор β-фазеолина из Р1акео1ик \т11дапк (81щ1Иот е! а1., 1983, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 80: 1897-1901), управляющий геномной последовательностью АгаЬ1борк1к 18 кДа олеозина, был субклонирован. Стандартную РСК (Нойоп е! а1., 1989, Сепе 77: 61-68) применяли для слияния последовательности гена олеозина (минус стоп-кодон) с присоединенными сайтами №о1 и НтбШ рестрикционной эндонуклеазы с 3'-конца промотора фазеолина с получением р8В84008.

Ген-НшбШ №о1-человеческого препроинсулина синтезируют в виде одинарного 335 п.н. куска с помощью аптагена с применением предпочтительного использования кодона растения. Последующее лигирование в №о1/НшбШ-разрыв р8В84008 дает плазмиду р8В84400: последовательность ДНК, кодирующая слитый белок олеозин-человеческий препроинсулин, помещенный в бинарный вектор под контролем экспрессии промотором/терминатором фазеолина. Плазмида р8В84400 служит в качестве образца для получения человеческого проинсулина (№ΙΝ) стандартной РСК с применением р£и ДНК полимеразы с праймерами, направленными против 5'-конца (1457 олиго ТТССТСААССААСАСТТС - 8ЕО ΙΌ N0:190) и 3'-конца (1458 олиго АЛССТТТСАСТТАСАСТАСТ - 8ЕС ΙΌ N0:191), включая сайт НтбШ существующей области проинсулина вектора. Второй фрагмент увеличивают с применением р£и ДНК полимеразы с праймером, направленным против доступного сайта 8рЫ (олиго 1455 ССАТССАТСТСТТСАСС - 8Е0 ΙΌ N0:192) к 3'-концу гена олеозина АгаЬ1борк1к (олиго 1456 ССТАСТСТССТССССА - 8Е0 ΙΌ N0:193) в векторе р8В84400. После РСК продукты разделяют на агарозном геле и полосы, соответствующие 267 п.н. (ЬРШ-НшбШ) и 360 п.н. (8рЫ-0ЬЕ0 (3'-конец)) фрагменты очищают на геле с применением набора для экстрагирования геля (01адеп). Два фрагмента сливают по второму кругу увеличения РСК с применением Тад ДНК полимеразы с праймерами 1455 (8Е0 ΙΌ N0:192) и 1458 (8Е0 ΙΌ N0:193) в сочетании с 0,01 мкМ перекрывающего мостикового РСК праймера (олиго 1459 ССТССССАССАСАСТАССТТССТСААССААСАСТТСТС - 8ЕС ΙΌ N0:194) для двух циклов с температурой отжига 58°С с последующим 31 циклом при температуре 52°С для увеличения 627 п.н. 8рЫ-0ьЕ0 (3'-конец)-йРIN-Н^ηбШ фрагмента. 627 п.н. 8рЫ-0ЬЕ0 (3'-конец)-йРIN-Н^ηбIII фрагмент затем лигируют в Т/А выступ рСЕМТ Еаку УесЮг 8ук!ет™ (Рготеда) и применяют для трансформации бактерий ЭН5</. с получением р8В83409 (рСЕМТ-8рЫ-0ЬЕ0 (3'-конец)-йРIN-Н^ηбШ).

Фрагмент 8рЫ/НтбШ из р8В83409 заменяют фрагментом 8рЫ/НтбШ из р8В84400. Стандартное ограничение гидролизатов в обоих р8В83409 и р8В84400 проводят с применением 8рЫ/НшбШ (№\ν Епд1апб Вю1аЬк). Фрагменты разделяют на 1,5% агарозном геле и очищают с применением набора для экстрагирования геля (01адеп). 617 п.н. 8рЫ/НтбШ фрагмент освобождают из р8В83409 и затем лигируют в акцепторный сайт 8рЫ/НшбШ в предварительно разорванной основной цепи вектора р8В84400 (удален внутренний фрагмент 8рЫ/НшбШ) с применением Т4 ДНК лигазы (№В) в течение ночи при температуре 15°С.

Результатом является плазмида р8В84409: последовательность ДНК (8Е0 ΙΌ N0:195, кодирующая слитый белок 0ЕЕ08!№11РШ (8Е0 ΙΌ N0:196), помещенный в бинарный вектор под контролем экспрессии промотором/терминатором фазеолина. Промотор фазеолина контролирует специфически временную и специфическую к тканям экспрессию трансгена во время развития семян.

Трансформация и выращивание рекомбинантной Е.соН и АдгоЬас1егшт с р8В84409

После подтверждения целостности кДНК кодирования для слитого белка анализом последовательности плазмиду р8В 84409 трансформируют в штамм Е.сой ЭН5а для получения высокого уровня экспрессии. Выделенную плазмиду ДНК (100 нг) смешивают на льду со 100 мкл компетентных клеток ЭН5</. в течение 20 мин. Затем клетки подвергают тепловому удару при температуре 42°С в течение 45 с и возвращают на лед на 2 мин. Затем добавляют 1 мл среды 80С и клетки инкубируют при температуре 37°С на энвиро-шейкере при 225 об/мин в течение 1 ч перед помещением трансформированных клеток на планшеты с ЬВ-спектиномицином (10 г/л триптона, 5 г/л экстракта дрожжей, 5 г/л №С1, 15 г/л агара) и инкубированием в течение ночи при температуре 37°С. Одну колонию используют для инокулирования 5 мл ЬВ-спектиномицинового бульона. Эти культуры выращивают в течение ночи при температуре 37°С. Рекомбинантную плазмиду выделяют из 1 мл среды, выстаиваемой в течение ночи, согласно получению мини-препаратов 01адеп. Выделенную плазмиду затем применяют для трансформации компетентного штамма АдгоЬас1егшт ЕН101 (Нооб е! а1., 1986; Е Вас1епо1. 144: 732-743) электропорацией (25 мкФ, 2,5 кВ, 200 Ом). Рекомбинантные АдгоЬас1егшт помещают на планшеты с АВспектиномицином/канамицином (20х АВ соли, 2М глюкозы, 0,25 мг/мл Ее80₄-7Н₂0, 1М Мд80₄, 1М СаС12) и одну колонию применяют для инокулирования 5 мл АВ-спектиномицинового/канамицинового бульона. Эти культуры выращивают в течение ночи при температуре 28°С. Рекомбинантные АдгоЬас1егшт затем применяют для трансформации растений АгаЬ1борк1к кйайапа методом погружения цветков (С1оид1 е! а1., 1998, Р1ап! I., 16: 735-743), как описано в примере 1.

- 24 014887

Уровни экспрессии инсулина в ΑηΝ6ορ5ί5 ШаПапа

Уровни экспрессии слитого белка 0ЬЕ0-йРШ (4409) определяют в трансгенных созревших семенах ΑπιΝ6ορ5ί5 1йа11апа с применением методики примера 2 выше. Белки масляных телец, меченные окрашенным кумасси гелем, из двух характерных колоний (4409-6 и 4409-8) сравнивают с миграцией слитого белка олеозин-ЬРГО (как показано черной стрелкой) у ^трансформированных (χνΐ) ΑηΝ6ορ5ί5 (фиг. 14). Уровень экспрессии определяют денситометрией с получением в среднем 0,10% от общего белка семян. Этот уровень рассчитывают выше и ниже комиграции эндогенного белка с такой же молекулярной массой в нетрансформированных семенах который составляет приблизительно 0,04% от общего белка семян.

Пример 9.

Трансформация сафлора.

Представленный протокол трансформации схож с описанным у 0Γ1ίΕο\ν81<3 Т.К., с! а1. ((1995), Р1ап! Сс11, Т188ис апб 0гдап СиНигс 40: 85-91), но с модификациями и улучшениями как для трансформации 8317, так и для применения фосфинотрицина в качестве выбранного маркера. Дезинфицируют семена вида сафлора 8-317 Са1^Γο^η^а, которые не повреждены, поцарапаны или больны, в 0,1% НС1₂ в течение 12 мин, затем 4-5 раз ополаскивают стерильной дистиллированной водой. Проращивают стерильные семена в темноте в среде М8 (МигазЫдс Т. & 8кοοд Е. (1962), Рйу8ю1. Р1ап! 15: 473-497) с 1% сахарозой и 0,25% СсгШс. Инициируют культуры АдгоЬас1сгшт из замороженного сырья в глицерине в 5 мл АВ минимальной жидкой среды с выбранным антибиотиком, и выращивают в течение 48 ч при температуре 28°С. Выращивают аликвоту этой культуры, выращенной в течение ночи в 5 мл бульона Била с выбором для трансформации. Дважды промывают 6-8 мл бактериальных клеток средой АВ и доводят до конечной плотности клеток 0,4-0,5 (0И₆₀₀).

Удаляют двухдневные семядоли из проращенных семян, погружают в полученные клетки АдгоЬас!сгшт и помещают в среду М8 с 3% сахарозой, 4 мкМ Ж>-бензиладенина (ВА) и 0,8 мкМ нафталинуксусной кислоты ^АА). Инкубируют планшеты при температуре 21°С в темноте. Через 3 дня переносят в ту же среду с 300 мг/л тиментина. Через еще 4 дня все культуры переносят на свет. Через 3 дня помещают эксплантаты в среду выбора с добавлением 0,5 мг/л фосфинотрицина. Для длительного вытягивания почек эксплантаты еженедельно переносят в среду М8 без фитогормонов, но с увеличенным в два раза количеством ΚN0з. Срезают ростки, которые вытянулись более чем на 10 мм от исходного уровня, и отдельно выращивают для селекции. Для образования корней помещают зеленые ростки, представляющие предполагаемую трансгенную ткань, в среду М8 с 2% сахарозой, 10 мкМ индолмасляной кислоты и 0,5 мкМ NАА. Переносят укоренившиеся ростки в хорошо увлажненную смесь почв и выращивают в условиях высокой влажности и 12-часового света.

Пример 10.

Протокол трансформации льна.

Указанная методика трансформации близка к методике, описанной у Οοη§ I. и МсНидсп А. (Р1ап! Сс11 Κ^ροήδ (1991). 10: 555-560), Ωοπβ I. и МсНидсп А. (Р1ап! 8с1спсс5 (1993). 88: 61-71) и М1упагоуа с! а1. (Р1ап! Сс11 Κ^ροήδ (1994). 13: 282-285). Дезинфицируют семена льна, которые не повреждены, поцарапаны или больны, в 70% этаноле в течение 5-7 мин, затем в течение 25 мин в 50% отбеливающем растворе с Тетссп 20 (3-4 капли на 100 мл) при непрерывном перемешивании. Семена 5-7 раз ополаскивают стерильной дистиллированной водой. Проращивают стерильные семена на свету в среде М8 (МигазЫдс Т. & 8кοοд Е. (1962). РЬ.у8ю1. Р1ап! 15: 473-497) с 2% сахарозой и 0,3% СсгНю в сосудах Мадсп!а. Для трансформации выращивают культуры АдгоЬас!сгшт в течение ночи в бульоне АВ с добавлением подходящего антибиотика для селекции. Дважды промывают 6-8 мл выдержанных в течение ночи клеток и повторно суспендируют в 5 мл АВ бульона; добавляют 2 мл этого сырья к 98 мл индукционной среды (основная среда М8 с 3% сахарозой, 5 мкМ 6-бензиламинопурина (ВА) и 0,25 мкМ альфанафталинуксусной кислоты ^АА)) и доводят до конечной 0И₆₀₀ 1,0.

Отсекают гипокотильные эксплантаты и инокулируют в полученном растворе клеток АдгоЬас!сгшт в течение около 4 ч (осторожно перемешивают планшеты 1-2 раза во время этого периода). После периода заражения удаляют эксплантаты из жидкой инокуляционной среды и наносят на стерильную фильтровальную бумагу. Помещают 15-20 эксплантатов в 0,7% отвержденную агаром индукционную среду в планшет для культивирования тканей. Герметично закрывают планшеты пластиковыми крышками и совместно культивируют эксплантаты в течение 48 ч при освещении (23-24°С). Через 2 дня переносят зеленые меристематические эксплантаты в ту же среду, содержащую 300 мг/л Тиментина (среда для предварительной селекции), и закрывают пластиковыми крышками. Через 3 дня переносят культуры в указанную выше среду, содержащую 10 мг/л ИБ РРТ (селекция 1). Закрывают планшеты РагаГПт® и инкубируют при температуре 24°С при освещении. Переносят культуры каждые две недели и хранят в этой среде в течение одного месяца. Для удлинения ростков переносят культуры каждые две недели в среду для селекции II (основная среда М8, содержащая 2% сахарозы, 500 мг/л буфера МЕ8, 300 мг/л Тиментина и 10 мг/л ИБ РРТ) в сосудах Мадсп!а. Предполагаемые трансформированные ростки, которые выживают после селекции, являются темно-зелеными и образуют значительное количество корней через 7-10 дней при отдельном высаживании в среду для селекции II. Переносят ростки с корнями в стерилизован

- 25 014887 ную тепличную почву в небольших горшках и накрывают растения прозрачными пластиковыми крышками для акклиматизации. Для созревания переносят активно растущие растения в одногаллоновые горшки с хорошо увлажненной смесью почв в тепличных условиях.

Хотя данное изобретение описано с помощью четко определенных предпочтительных примеров, должно быть понятно, что данное изобретение не ограничено описанными примерами. Наоборот, данное изобретение включает различные модификации и эквивалентные структуры, входящие в сущность и объем представленной формулы изобретения.

Все публикации, патенты и заявки на патенты включены сюда в качестве ссылок полностью, в том же объеме, в котором каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент определенно и индивидуально включена сюда в качестве ссылки.

Примеры известных последовательностей инсулина

ЗЕО Ю ΝΟ	Мотив инсулина (идентификатор последовательности аминокислоты) {идентификатор последовательности нуклеиновой кислоты}
Природный человеческий инсулин
7	(Р01308) человеческий препроинсулин {содержит гены У00565, М10039, Л00265, Х70.508, Ы5440, ВС005255 и АП009655}
Природный не человеческий инсулин
Млекопитающие
8	(ΑΆΒ25818) Проинсулин С-пептид Едииз рг2ема1зкИ (лошади, зебры, носороги и тапир (Рег1зао(1ас1:у1а) )
9	(Р01310) Препроинсулин Едииз саЬаНиз (лошадь)
10	(Р01311) Препроинсулин {включает гены 003610 и М61153} Огусбо1адиз сип1си1из (домашний кролик)
11	(Р01312) Инсулин Ва1аепорбега рЬуза1из (полосатик)
12	(Р01314) Инсулин ВаХаепорбега ЬогеаНз (ивасевый полосатик)
13	(Р01315) Препроинсулин {включает гены ΑΕΌ64555 и ΆΥ044828} Зиз зсгоРа (свинья)
14	(Р01316) Инсулин Е1ерЬаз шахгтиз (азиатский слон)
15	(Р01317) Препроинсулин (ген М54979} Воз Таигиз (корова)

- 26 014887

16	(Р01318) Препроинсулин {ген 000659} ΟνίΞ аг!ез (овца)
17	(Р01320) Инсулин Сате1из ЗготеЗагФиэ (дромадер)
18	(Р01321) Препроинсулин {ген У00179} виды Сапдз (собака)
19	(Р01328) Инсулин НузбгФх сгФзбаба (хохлатый дикобраз)
20	(Р10604) Препроинсулин {ген 0Г02989} АсЕиз £ΐ·ΐνίθ\|Ί73.ΐΣΌ.ί3 (трехполосная дурукули)
21	(Р30406) Препроинсулин {ген ДООЗЗб) Масаса Фазс1си1аг1з (макак-крабоед)
22	(Р30407) Препроинсулин {ген Х61092} СегсорЗХЬесиз аебЫорз (африканская зеленая мартышка)
23	(Р30410) Препроинсулин {ген Х61089} Рап £год1о0у£ез (шимпанзе)
24	(29ΤΦΥ7) Инсулин Огпг^ЬогЬупсЪиз апаЫпие (утконос)
25	(ААМ76641) Инсулин {ген ΑΥ092024} Ропдо рудтаеиз (орангутанг)
26	(ΑΑΝ06935) Препроинсулин {ген АН011815 содержащий ΑΥ137498, ΑΥ137499 и ΑΥ137Ξ00)} ВогШа догШа (горилла)
27	(1ЫМК30) Инсулин Зад-пи-г! зсгигеиз (беличий саймири)
28	(Р01313) Препроинсулин {ген М26328} Сг1себи1из 1опдд.саис1а1:иэ (длиннохвостый хомяк)
29	(Р01322) Предшественник инсулина 1 {включает гены У01242, У01242 и М25584} Наббиз погчедфсиз (норвежская крыса)
30	(Р01323) Предшественник инсулина 2 {включает гены У01243, И00748, М25583 и М25585} РабРиз погчедгсиз (норвежская крыса)
31	(Р01324) Инсулин Асотуз саЫггпиз (иглистая мышь)
32	(Р01325) Предшественник инсулина 1 {включает гены Х04725 и АК007482) Миз тизси1из (домовая мышь)

- 27 014887

33	(Р01326) Предшественник инсулина 2 {ген Х04724} Миз тизси1из (домовая мышь)
34	(Р01327) Инсулин СНпсМНа Ъгеч1саи£аСа (шиншилла)
35	(Р01329) Препроинсулин (включает гены К02233 и М11713} рогсеНиз (домашняя морская свинка)
36	(Р17715) Препроинсулин {ген М57671) Осбобоп йедиз (дегу)
37	(Р18109) Инсулин 010е1рИ13 У1гд1п±апа (североамериканский опоссум)
38	(Р21563) Препроинсулин (виды Κοάβηίίа)
39	(6)62587) Препроинсулин {ген Х98241) Рзаттотуз оЬезиз (дневная песчанка)
40	(091X13) Препроинсулин {ген ΑΥ038604} 8регторЫ1из РггйесетИпеаР (тринадцатиполосный суслик)
41	(740063А) Инсулин С пептид Οανία рогсеНиз (домашняя морская свинка)
Птицы
42	(Р1332) Препроинсулин {содержит гены АН002454 (содержащий 500872, 500873 и 500874), У00416, У00418 и Х58993) 6а11из да11из (курица)
43	(Р01333) Препроинсулин Апаз Р1а£угЬупсЬоз (кряква)
44	(Р07454) Инсулин Апзег апзег апзег (серый гусь)
45	(51463) Препроинсулин {гены ΆΗ006925 (содержащий 566611 и 566612)} ЗеЗазрЬогиз ги£из (рыжая колибри)
Рыбы
46	(073727) Препроинсулин {ген АР036326} Оапго гегхо (полосатый данио)
47	(Р01335) Препроинсулин {ген Х00989} Сург1пиз саргхо (обычный карп)
48	(Р01337) Инсулин виды Ва£гасНо1с11с1ае (жабовидные рыбы)

- 28 014887

49	(Р01339) Инсулин ТЬиппиз ОЪуппиз (синий тунец)
50	(Р01340) Инсулин Какзииопиз ре1ат1з (полосатый тунец)
51	(Р01341) Препроинсулин {ген У00634} ЬорЫиз рдзсабогхиз (морской черт)
52	(Р01342) Препроинсулин {ген У00649} Мух±пе д1иЫпоза (атлантическая миксина)
53	(Р04667) Препроинсулин {включает гены Х00148, 300936, К01655 и Х13559} ОпсогЬупсЬиз кеба (кета)
54	(Р07453) Муохосер11а1из зсограиз (гренландский бычок-крючкорог)
55	(Р09476) Инсулин ЪергзозЬеиз зраби1а (панцирная щука)
55	(Р09477) Инсулин РЗаСтсНсНуз £1ееиз (европейская камбала)
57	(Р09536) Инсулин Ну<3го1адиз οοΐΐίεί (пятнистая химера)
58	(Р12704) Инсулин 8диа1из асапЪМаз (обыкновенная колючая акула)
59	(Р12705) Препроинсулин Тогредо тагтогаЪа (мраморный электрический скат)
60	(Р13190) Проинсулин {ген 082395} СаНогЫпсЪиз πιίΐϋ (химера)
61	(Р14806) Инсулин РеЪгошугоп тагтпиз (морская минога}
62	(Р23187) Инсулин ОпсогЬупсЪиз догЬизсЪа (горбуша)
63	(Р29335) Инсулин Атта са!ча (амия)
64	(Р42 633) Инсулин АпдиШа гозбгаба (американский угорь)
65	(Р81025) Препроинсулин [ген АЕ038123} ОгеосНготтз пИоМсиз (нильская тилапия)
66	(Р81423) Инсулин Асхрепаег диеЩепзЬаеШИ (осетр)
67	(Р81881) Инсулин Рхагасбиз тезороОашхсиз (паку)

- 29 014887

68	(09И7К2) Препроинсулин {ген АВ029318} Уегазрег тоеег! (камбала)
69	(1603264А) Инсулин С пептид АпдиШа апдиШа (европейский угорь)
Амфибии
70	(Р12706) Предшественник инсулина 1 {ген М24443} Хепорие 1аеу1а (африканская шпорцевая лягушка)
71	(Р12707) Предшественник инсулина 2 [ген М24442} Хепориа Ι^θνϊε (африканская шпорцевая лягушка)
Рептилии
72	(Р31887) Инсулин ТгасНетуз зсгхрЪа (красноухая черепаха)
73	(Р12703) Инсулин АШдаСог т!зз1зз1рр1епз1з (американский аллигатор)
74	(Р12708) Инсулин гассуз йЪитпайез (змея)
75	(Р01334) Инсулин СгоПа1из абгох (техасский гремучник)
Генноинженерный инсулин
76	(ААА72172) Синтетический препроинсулин {ген 002547}
77	(ААА72916) Альфа цепь 3'-конца синтетического инсулина {гены АН003171 или М38610)
78	(ΆΆΑ72917) Бета цепь 3'-конца синтетического инсулина (гены АН003171 или М38611}
79	(САА00712) Синтетический инсулин {ген А07755)
80	(САА00713) Синтетический инсулин {ген А07758)
81	(САА00714) Синтетический инсулин {ген АО7761}
82	(САА00715) Белковый продукт без названия {ген А07764}
83	(САА00736) Синтетический проинсулин {ген А08012} (ЕР 0367163-А)
84	(САА00783) Синтетический инсулин {ген А08468} (ЕР 0376156-А)
85	(САА01581) Модифицированный предшественник инсулина (ген А21951) (ИО 9011299)

- 30 014887

86	(САА01254) Синтетический инсулин {ген А15938} (ЕР 0214826-Ά)
87	(САА01799) Синтетическая конструкция инсулина Азр(В1), Азр(В4), Азр(ВЮ), Азр(В1б), 61и(В27) {ген А26317}
88	(САА01798) Синтетическая конструкция предшественника инсулина С1и(В9), Б1и (А12) {ген А26314}
89	(САА23424) Синтетический проинсулин {ген ν00082}
90	(САА24707) С-цепь синтетического инсулина {ген У01461}
91	(САА25151) В-цепь синтетического инсулина (ген Х00462}
92	(САГ60056) Синтетический белковый продукт без названия {ген АХ573757] (пат, ИО 02/079250)
93	(ген М31026) В- и мини-С-цепи синтетического человеческого инсулина с применением хроматографии на дезактивированном силикагеле
94	(1В2УА) Цепь А [с1-А1аЬ26]-Оез (В27-В30) -инсулин- В26-амид А супермощного аналога инсулина с одним замещением
95	(ΙΒΖνΒ) Цепь Б [0-А1аЬ26]-Оез(Б27-В30)-инсулин- В26-амид А супермощного аналога инсулина с одним замещением
96	(1НЦ1А) Цепь А мутанта инсулина (В1, ΒΙΟ, В16, В27)д1и, Цез-ВЗО, Мгпг
97	(ΙΗϋΙΒ) Цепь В мутанта инсулина (В1, В10, В16, В27)д1и, Цез-ВЗО, Ытг
98	(1НБ5А) Цепь А мутанта человеческого инсулина- Ηΐ3(В16)
99	(1НЬ$В) Цепь В мутанта человеческого инсулина- ΗΪ3(В16)
100	<иСАА) Цепь А нестандартного дизайна нестабильных аналогов инсулина с улучшенной активностью

- 31 014887

101	(иСАВ) Цепь В нестандартного дизайна нестабильных аналогов инсулина с улучшенной активностью
102	(иСАС) Цепь С нестандартного дизайна нестабильных аналогов инсулина с улучшенной активностью
103	(υΟΑϋ) Цепь ϋ нестандартного дизайна нестабильных аналогов инсулина с улучшенной активностью
104	(Ы73А) Цепь А нестабильного аналога инсулина с природной активностью
105	(и73В) Цепь В нестабильного аналога инсулина с природной активностью
106	(и73С) Цепь С нестабильного аналога инсулина с природной активностью
107	(υ73ϋ) Цепь Ώ нестабильного аналога инсулина с природной активностью
108	(1КМЕА) Цепь А мутанта человеческого инсулина Не-А2-А11о-11е, Н13-В10-Аяр, Рго-В28-Ьуз, Ьуз- В29-РГО
109	(1КМЕВ) Цепь В мутанта человеческого инсулина 11е-А2-А11О-11е, Ηίθ-ΒΙΟ-Азр, Рго-В28-Ьуз, Ьуз- В29-РГО
110	(1КЗМА) Цепь А мутанта человеческого инсулина 11е-А2-А1а, н1з-В10-Азр, Рго-В28-Ьуз, Ьуз-В29-₽го
111	(1КЗМВ) Цепь В мутанта человеческого инсулина Не-А2-А1а, Н18-В10-Азр, Рго-В28-Ьуз, Ьуз-В29-Рго
112	(11ДО8А) Цепь А А11о-11еа2-инсулина, неактивного хирального аналога
113	(1ΣΜ8Β) Цепь В А11о-11еа2-инсулина_т неактивного хирального аналога
114	(1ЬИ8С) Цепь С А11о-11еа2-инсулина, неактивного хирального аналога
115	(1ЬИ8О) Цепь 0 А11о-11еа2-инсулина, неактивного хирального аналога

- 32 014887

Д* >Х	(1ЬК0А) Цепь А мутанта человеческого инсулина 11е-А2-(31у, Уа1-АЗ-<31у, Ηίβ-ΒΙΟ-Аяр, Рго-В28-Ьу8, Ьуз-В29-Рго
117	(1ЬКфВ) Цепь В мутанта человеческого инсулина 11е-А2-С1у, Уа1-АЗ-<31у, Ηΐβ-ΒΙΟ-Азр, Рго-В28-Ьуз, Ьуз-В29-Рго
118	(1ΜΗΙΑ) Цепь А В9(Азр) мутанта
119	(1ΜΗΙΒ) Цепь В В9(Азр) мутанта
120	(1МНДА) Цепь А В25(рЬе) мутанта
121	(1МНЙВ) Цепь В В25(рЬе) мутанта
122	(1УКТА) Цепь А, человеческий инсулин, модель с двумя дисульфидами
123	(ΐνκΤΒ) Цепь В, человеческий инсулин, модель с двумя дисульфидами
124	(ААС59607) Синтетический альбебетин инсулин {ген ΑΥ017185}
12 5	(АДС59606) Синтетический альбеферон инсулин {ген ΑΥ017184}
Слитые белки инсулина
Человеческие
125	(ΑΆΒ27046) Ν-конец слитого белка интерлейкин 2- инсулина
12 7	{ААВ27047) Ν-конец слитого белка бета- галактозидаза-ин сулин
12 8	(РС7082) Слитый белок фактора роста эпидермиса/Вез-В30 предшественника человеческого инсулина с одной цепью
Не человеческие
129	(ААА72177) Слитый белок Е.соН пенициллинаэы/инсулин I крысы 5'-конца (ген АН003149 или Ц02553)
130	(ΆΑΑ72178) Слитый белок Е.соН . пенициллинаэы/инсулин I крысы 3'-конца {ген АН003149 или .702554)

- 33 014887

131	(ААА72179) Слитый белок сигнальной последовательности инсулина крысы/Е.со11 бетагалактозидазы {ген 702555}
132	(ААА72181) Слитый белок обезьяньего вируса 40 (ЗУ40)/препроинсулина I крысы {ген Д02559}
Мини-инсулин
Человеческий
133	(ΙΕΡΕΑ) Цепь А активного мини-проинсулина, Μ2ρί
134	(17САА) Цепь А нестандартного дизайна ' нестабильных аналогов инсулина с улучшенной активностью
135	(иСАВ) Цепь В нестандартного дизайна нестабильных аналогов инсулина с улучшенной активностью
136	(1ДСАС) Цепь С нестандартного дизайна нестабильных аналогов инсулина с улучшенной активностью
13 7	(иСАЦ) Цепь ϋ нестандартного дизайна нестабильных аналогов инсулина с улучшенной активностью
138	(икбС) Цепь С пептида человеческого инсулинакомплекс
139	(1Д73А) Цепь А нестабильного аналога инсулина с природной активностью
140	(Ы73В) Цепь В нестабильного аналога инсулина с природной активностью
141	(Ы73С) Цепь С нестабильного аналога инсулина с природной активностью
142	(Ы73Б) Цепь ϋ нестабильного аналога инсулина с природной активностью
143	(13ЛА) Цепь А мини-проинсулина, мутант аналога инсулина с двумя цепями: Оеэ ВЗО, Н1з{В10)азр, Рго(В28)азр

144	(15ЛВ) Цепь В мини-проинсулина, мутант аналога инсулина с двумя цепями: Оез ВЗО, Н1з(В10)азр, Рго(В28)азр
145	(1370) Мини-проинсулин, мутант аналога инсулина с одной цепью: ВЗО, Н1з(В10)азр, Рго(В28)азр и пептидная связь между Ьуз В29 и (31у А1

Список последовательностей

8Е0 ΙΌ N0:1 и 2 являются нуклеотидной последовательностью и выведенной последовательностью аминокислот соответственно РК8-О9ксЕу-К11р27-М1-КЭЕЬ слитого белка в плазмиде р8В84404.

8Е0 ΙΌ N0:3 и 4 являются нуклеотидной последовательностью и выведенной последовательностью аминокислот соответственно 0ЬЕ0-Кйр8-К11р27-М1 слитого белка в плазмиде р8В84405.

8Е0 ΙΌ N0:5 и 6 являются нуклеотидной последовательностью и выведенной последовательностью аминокислот соответственно РК8-М1-тетраосновный линкер-09ксЕу-К0ЕЬ слитого белка в плазмиде р8В84414.

8Е0 ΙΌ N0:7-145 являются известными последовательностями инсулина, которые описаны в таблице.

- 34 014887

БЕр ΙΌ N0:146-148 являются последовательностями аминокислот фрагментов С-пептида инсулина.

БЕР ΙΌ N0:149 является последовательностью аминокислот тетраосновного процессингового пептида.

БЕр ΙΌ N0:150-155 являются последовательностями аминокислот полипептидов, способных удерживать полипептид инсулина в ЕК.

БЕр ΙΌ N0:156-160 являются последовательностями аминокислот полипептидов, способных удерживать полипептид инсулина в ЕК-производной накопительной органелле.

БЕр ΙΌ N0:161 является последовательностью аминокислот РКБ сигнальной последовательности.

БЕр ΙΌ N0:162-171 являются последовательностями аминокислот лидерных последовательностей дрожжей и производных от них последовательностей.

БЕр ΙΌ N0:172-173 являются последовательностями аминокислот промежуточных пептидов.

БЕр ΙΌ N0:174 является последовательностью аминокислот последовательности К11р8.

БЕр ΙΌ N0:175 является последовательностью аминокислот прямого праймера 1325, который является комплементарным к 5'-области Э95сЕу кДНК клона и существует для добавления сайта БрЫ к 5'области для способствования последующему лигированию.

БЕр ΙΌ N0:176 является последовательностью аминокислот обратного праймера 1326, который является комплементарным к 3'-области Э95сЕу кДНК клона и существует для добавления сайта Х1о[ к 3'области для способствования последующему лигированию.

БЕр ΙΌ N0:177 является последовательностью аминокислот прямого праймера 1324, который является комплементарным к области 20 нуклеотида обратного праймера 1323 и существует для образования 5'-конца слитого К11р27-М1.

БЕр ΙΌ N0:178 является последовательностью аминокислот обратного праймера 1323, который является комплементарным к области 20 нуклеотида прямого праймера 1324 и существует для образования 5'-конца слитого К11р27-М1.

БЕр ΙΌ N0:179 является последовательностью аминокислот прямого праймера 1322, который является комплементарным к области 19 нуклеотида обратного праймера 1321 и существует для образования 3'-конца слитого К11р27-М1.

БЕр ΙΌ N0:180 является последовательностью аминокислот обратного праймера 1321, который является комплементарным к области 19 нуклеотида прямого праймера 1322 и существует для образования 3'-конца слитого К11р27-М1.

БЕр ΙΌ N0:181 является последовательностью аминокислот прямого праймера 1364, который является комплементарным к 5'-области К11р27-М1 последовательности и существует для добавления сайта Х1о[ к 5'-области для способствования последующему лигированию.

БЕр ΙΌ N0:182 является последовательностью аминокислот прямого праймера 1334, который является комплементарным к 3'-области К11р27-М1 последовательности и существует для добавления сайта НшП1 к 3'-области для способствования последующему лигированию.

БЕр ΙΌ N0:183 является последовательностью аминокислот прямого праймера 1329, который является комплементарным к 3'-области К11р27-М1 последовательности и существует для добавления сайта НшПШ к 3'-области для способствования последующему лигированию.

БЕр ΙΌ N0:184 является последовательностью аминокислот прямого праймера 1363, который является комплементарным к 5'-области К11р27-М1 последовательности и существует для добавления сайта БрЫ к 5'-области для способствования последующему лигированию.

БЕр ΙΌ N0:185 является последовательностью аминокислот прямого праймера 1515, который является комплементарным к 5'-области цепи В последовательности инсулина и существует для введения промежуточного тетраосновного сайта между исходными А- и В-цепями человеческого инсулина в сочетании с обратным праймером 1518.

БЕр ΙΌ N0:186 является последовательностью аминокислот обратного праймера 1518, который является комплементарным к 3'-области цепи В инсулина и 5'-области цепи А с промежуточной последовательностью тетраосновного мини-с-пептида и существует для введения промежуточного тетраосновного сайта между исходными А- и В-цепями человеческого инсулина.

БЕр ΙΌ N0:187 является последовательностью аминокислот обратного праймера 1517, который является комплементарным к 3'-области П95сЕу-КЭЕЬ последовательности и существует для увеличения всего М1-тетраосновный линкер-П95сЕу-КЭЕЬ с получением вставки рБВБ4414.

БЕр ΙΌ N0:188 и 189 являются нуклеотидной последовательностью и выведенной последовательностью аминокислот соответственно РКБ-К11р27-М1 слитого белка в плазмиде рБВБ4 401.

БЕр ΙΌ N0:190 является последовательностью аминокислот прямого праймера 1457, который является комплементарным к 5'-области В цепи последовательности инсулина и существует для получения фрагмента человеческого проинсулина (ИРГИ) в сочетании с обратным праймером 1591.

БЕр ΙΌ N0:191 является последовательностью аминокислот обратного праймера 1458, который является комплементарным к 3'-области человеческого проинсулина (ИРГИ) и существует для получения человеческого про(йРГЫ) и добавления 3' НтПШ сайта клонирования.

БЕр ΙΌ N0:192 является последовательностью аминокислот прямого праймера 1455, который явля

- 35 014887 ется комплементарным к 5'-области сайта БρЫ ρБΒБ4404 и существует для увеличения гена олеозина АгаЫ!о]Э515 в сочетании с обратным праймером 1456.

БЕО ΙΌ N0:193 является последовательностью аминокислот обратного праймера 1456, который является комплементарным к 3'-области сайта гена олеозина Α^аЬ^άορ8^8 и существует для увеличения гена олеозина АгаЫ!о]Э515 в сочетании с прямым праймером 1455.

БЕО ΙΌ N0:194 является последовательностью аминокислот перекрывающего мостикового РСК праймера, который является комплементарным к 3'-области сайта гена олеозина Α^аЬ^άορ8^8 и 5'-конца гена человеческого проинсулина и существует для получения вставки ρБΒБ4409 в сочетании с прямым праймером 1455 и обратным праймером 1456.

БЕС ΙΌ N0:195 и 196 являются нуклеотидной последовательностью и выведенной последовательностью аминокислот соответственно 0^Е0-НР[N слитого белка в плазмиде ρБΒБ4409.

8Е<2 Ιϋ N0:1 абдаасббссЬЬаадЬсбббсссььъсЕасдсСЕЬссЬЕЕдььесддЬсааьасСЬсдЬЬдсЕ дбСасдсаЬдсЬдасаЬбдЬдабдасасадбсбссакссбсссбддсЬабдбсадЬдддасад сдддбсасЬабдсдсбдсаадкссадЬсададссЕЬЬЬааааадЕассааЕсаааадаасЕаЕ Ы:ддсс1:ддЬассадсадааассаддасад1:с1:сс1:ааас!:(:с1:дд6а6ас1:1:1:дса6ссас1: адддааЕсЕддддбсссбдаЕсдсббсаЬаддсадбддабсбдддасадабббсасбсббасс абсадсадЬдСдсаддсЬдаадассбддсадаеЬасЬЬсбдЬсадсаасабЬаЬаасасЬссЬ сссасдЪбсддЬдсбдддассаадсбддадсбСаадсддбсЕссдаасддбдсббсЕсабадс ддббсбдсассаддсасЬадсбсбдсаксЪддаЪсЬсаддЬдсассЪдсадсадбсбддадсЬ дадсбдаЬдаадссЕддддссЕсаабдаадабаЬссбдсааддсбасбддсбасасаббсадЬ адсбасбддабададбдддбааадсададдссбддасабддссббдадбддаббддададабЬ ЬЕассСддсадбддЕадбасбассбасаабдадаадббсаадддсааддссасаЕбсасбдса дабасабссбссаасасадссбасаЬдсаасбсадсадсседасабсбдаддасбсбдссдбс ЬаббасЬдСдсаадаСбддаЬдббдасСссбддддссааддсассасбсбсасадЬсбсдадЬ саассааббдаЕдасасбдааЬсссадассасдЬсадЬдаассЬсаЬддссдаЬдаЬасЬдад адсдсдбббдсЬасасааасаааббсдддаддбсббдасдЬбдСсддабСдаСсбссабддс!: аадададаадааддададссЬаадбЪЬдСбааЪсаасаРсбЬЪдбддаЬсбсабсббдббдад дсбсбсбассСбдбдбдбддадааададдаЬЁЬббсЬасасбссСааддсбдсЬаадддааСЬ дббдаасааСдкЪдсасЬбсЬайбЬдсбсасбЬбассааббддадаасбабЬдсаасааддаб даасбббда

ЗЕО ΙΏ N0:2

ΜΝΡΒΚ3ΡΡΡΥΑΡΕσΡ00ΥΡνΑνΤΗΑΟΐνΜΤ08Ρδ8ΒΑΜ5να0ΚνΤΜΚΟΚ680βυ.Κ8ΤΚΓ0ΚΝΎ

1ЛНУООКРа08РКЪЬУУРА8ТЕЕЗОТРОРР1(ЗЗС8СТПРТЬТ138УОАЕОЬАОУРСОйНУИТР РТРОАСТКЪЕЬКЕЗРИОАЗНЗОЗАРОТ83АЗС307НЬООЗОАЕЬМКРСАЗМК13СКАТОУТРЗ ЗУН1ЕИУК0КР<ЗНСЬЕИ1БЕ1ЬРСЗСЗТТУИЕКГКОКАТГТАОТЗЗЫТАУМ0ЬЗЗЬТЗЕОЗАУ ууаиилэуозисоетгьтуззорιпотезоттзуиемаоетезаратотцбооьеуусызма ККЕЕСЕРКРУВДНЬСеЗНЬУЕАЬУЬУСЕЕКСРРУТРКААКО! ЧЕ0ССТ81С8ЬУ<2ЬЕЫУСШП ЕЬ

ЗЕО Ю N0:3 абддсддабасадсбададдаасссабсасдаЬабсабсддсададассадЪасссдабд аЕдддссдадассдадассадбассадабдбссддасдаддабсбдасбасбссаадбсб аддсадаббдсбааадсбдсаасбдсбдСсасадсЕддПддЬбсссбссбСдббсбсбсс адссббасссббдббддаасЁдЬсаЬадсЕЬЬдасбдббдсаасассбсбдсбсдбЬабс ЬЬсадсссааСссЬЬдЕсссддсЕсЬсаЕсасадббдсасЕссЕсаЕсассддЕбббсЕЕ бссксЬддадддкббддсаЕЬдссдсЕаЪаассдкЕЕЕсбсЕЪддаЕЬЕасдсаасддда дадсасссасадддабсадасаадббддасадСдсааддабдаадЬЬдддаадсааадсб саддабсЕдааадасададсбсадЬасЕасддасадсаасаЪасбддЬддддаасаРдас сдкдассдбасЬсдбддбддссадсасасЕассабддссдадаЪсасссдсаЕЕссбсбс 6асаааддЬаадС.сЪс6ссдЕааддсдс6дааддааса6ддас66с6адаадас66с66д садааасаасадЬабддсабсЬсдадсаадббссаассаабСдабдасасбдаабсссад ассасдбсадбдаассЬсабддссдаЬдабасбдададсдсдбббдсбасасааасаааб ЪсдддаддесСбдасдСЬдбсддаЬбдаЬсЬссаЬддсСаадададаадааддададссЪ аадббЪдббааЬсаасабсЬЫгдЬддабсбсаЬсЬбдЪЪдаддсЬсбсбассбСдЪдЬдЬ ддадааададдаЪЕЕЕСсЬасасбссЬааддсбдсЕаадддаабЪдкбдаасаабдЕЬдс асбЬсЕабЬЬдсЬсасСЬЬассааЕЕддадаасбабСдсаасбда

ЗЕО Ιϋ N0:4

ΜΑΠΤΑΚΟΤΗΗΟΙΙΟΗϋΟΥΡΜΜ<3ΕΟΕϋΟΥΟΜ8αΗΘ5ΠΥ3Κ3&ΟΙΑΚΑΑΤΑνΤΑΟ03ΕΕνΕ33ΕΤ ЬУБТ71АЬТ7АТРЪЬУ1Р8Р1ЬЧРАЫТУАЬЫТ(ЗРЬЗЗБВР<31АА1ТЧР8К1УАТа ΕΗΡ0Ο8ΟΚΕϋ3 АЕМКЬСЗ КАфОЬКОКАО Υ ϊ ЗуОНТССЕНПР ГЖТ-ΑΧ-φΗΤΤΜΑΕ IΤΕΙР1. УКО К5ЬЕКАЬКЕНСЬЬЕОГЬ0К00У6188КР0Р:1ООТЕ80ТТ8™ЬМАОЕТЕ8АГАТ<ЭтаГ

- 36 014887

ЗСОЬОУУСЬГОМАКРЕЕСЕРКРУНбНЬССЗНЬУЕАЪУЬУССЕКбЕРУТРКААКОТУЕбССТЗ! СЗЬУОЬЕМУСЫ

ЗЕб ГО N0:5 абдаасЬЬссбЬаадбсЫзЬсссЬЬЪсбасдсЬ ЫзссСЬЬдбЬбсддбсааЬасбЬсдббдсб дЪбасдсабдссбббд'ЬЬааЬсаасабсббсдбддабсЬсабсЬбдЪЪдаддсЬсЬсЬассЬб дбдСдбддадааададдаЬЬЬЬЬсЬасасбссбаадасСадаадааадададдааЬЬдбьдаа сааЪдЫгдсасббсбаСЬЬдсЬсасбббассаабСддадаасЬаЪбдсаасадаадааадада дасаЕбдЬдабдасасадЬсЬссабссбсссбддсЬаЬдСсадЬдддасадсдддЬсасЬаЬд сдсбдсаадбссадбсададссЬЬЬбааааадбассааЬсаааадаасбаЬЁбддссбддбас садсадааассаддасадЬсЬссЬааасЬСсбддеабасбЬбдсабссасЬадддааЪсЬддд дбсссКдаЬсдсбЬсаЬаддсадьддаЬсбдддасадаееЬсасбсЬЬассаЬсадсадбдбд саддсбдаадассбддсадаЬСасЬЪсбдбсадсаасаЬбаЬаасасбссЬсссасдбЬсддЬ дсЪдддассаадЬбддадсЬСаадсддбсбссдаасддЪдсЬбсбсабадсддЬЬсЬдсасса ддсасбадсбсбдсабсЬддаЁсСсаддЪдсассЬдсадсадЬсЪддадсЬдадсЬдабдаад ^сс6ддддссЬсааЕдаадаСаЕссСдсааддсЕасьддсбасаса56сад1:адсЕасбддаЬа дадедддЬааадсададдссбддасабддссбЬдадбддаееддададаСеЁЁассЬддсад!: ддеадбасСассбасаа1:дадаадЬСсаадддсааддссасаЬЬсас1₇дсада1заса6ссСсс аасасадссбасабдсаасЕсадсадссбдасабсбдаддасбседссдЪсеаЬЬасСдСдса адаеЬддаЬдббдасбсседдддссааддсассасЬсесасадедадсЬсаааддаЬдадсеь Еда

ЗЕб ГО N0:6

МНРЬКЗРРРУАЕЬСРОбУРУАУТНАРУНбНЬССБНЬУЕАЬУЬУСЕЕКСРРУТРКТККККаГЕУЕ бССТЗТСЗЪУбЬЕЫУСИКаККОТУМТбЗРЗЗЬАМЗУебаУТМКСКЗЗбЗЪБКЗТЫбКЫУЬАЙУ

ООК₽С6БРКЬЬУУРАЗТКЕБСУРОКР1В8650ТОЕТЬТ135УС1АЕО1АО¥РС6СНУЫТРРТР13

АСТКЪЕЬКЕЗРЦСАЗН8СЗАРСТ88АЗа80УНЬ00БСАНЬМКРаА8МК1БСКАТеУТРЗЗУИ1 ЕИУКбКРСНОЬЕИГОЕГОРОЗОБТТУЫЕКГКбКАТЕТАПТЗБНТАУМбЬЗЗЬТЗЕОБАУУУСА кшуебвдзооттьтуз з кпеь

ЗЕб ГО N0:7

МАЬИМКЬЬРЬЬАЬЬАЬИСРОРАААРУИбНЬСОЗНЬУЕАЬУЬУССЕЕЕРРУТРКТЕКЕАЕОЬбУ О07ЕБССе₽ОАО8Ьб₽ЬАБЕСЗБ0КЕ(ЗТУЕбССТ31СЗЬУбЬВИУСЫ

ЗЕб ГО N0:8

ЕАЕОРбУСЕУЕЬССаРаЫЗаЬбРЬАЬАаРбб

ЗЕб ГО N0:9

РУЫбНЬССЗНЬУЕАЕУЬУСОЕЕСРРУТРКАХХЕАЕОРбУСЕУЕЬаСОРеъОСЬбРЬАЬАСРбб ХХС1УЕбССте1СЗЬУбЬЕНУСН

ЗЕб ю N0:10

МАЗЬААЬЬРЬЬАЬЬУЬСЕЬОРАбАРУНбНЬСаЗНЪУЕАЬУЬУССЕЕСРРУТРКЗЕЕЕУЕЕЬбУ ебАЕЬСаСРаАаСЬбРЗАБЕЬАЬбКЕ01УЕбССТ31С8ЬУбЬЕПУСН

ЗЕб 10 N0:11

61УЕ6ССТ51СЗЬУ6ЪЕНУСИ

ЗЕб ГО N0:12

6ΐνΕ600Α5Τ03ΕΥ6ΕΕΝΥ0Ν

ЗЕб ГО N0:13

МАЪИТЕЬЬРБЬАЬЬАЬтаАРАРАбАРУМбНЬССЗНЬУЕАЬУЕУСаЕЕСРРУТРКАЕЕЕАЕЫРбА <ЗАУЕЬаааЫЮЬОАЬАЬЕСРРбКК01УЕбССТ81СБЬ¥бБЕЫУСЫ

- 37 014887

ЗЕф Ю N0:14

С1УЕфССТЗУСЗЪУфЬЕЫУСЫ

ЗЕф 10 N0:15

МАЪИТЕЬЕРЪЪАЪЬАЬИР РР РАЕАРУЫфНЬ С03НЬУЕАЬУЬУССЕК0Е ГУТРКАЕЕЕУЕСРфV ОАЬЕЕАООРОАОСЬЕОРРфКЕаТУЕфССАЗУСЗЬУфЬЕЫУСЫ

ЗЕф Ю N0:16

МАЬИТЕЪУРЬЬАЬЬАЬИАРАРАНАРУКфНЬССЗНЬУЕАЪУЬУССЕЕСГЕУТРКАЕЕЕУЕеРфУ САЪЕЬАООРОАаСЬЕОРР0Кйа1УЕ0ССАСУСЗЪУ0ЬЕЫУСЫ

ЗЕф ΙΡ N0:17 .

01УЕфССАЗУСЗЬУфЬЕЫУСЫ

ЗЕф 10 N0:18

МАЬИМЕЬЬРЬЬАЫАЬНАРАРТКАЕУЫфНЪСОЗНЪУЕАЬУЬУССЕЕЕГГУТРКАЕВЕУЕОЬфУ

КОУЕЬА0АР0Е0ОЬфРЪАЬЕ0АЬфКЕ0IУЕфССТЗIСЗЕУфЬЕМЕСП

8Еф Ю N0:19

С1уоосстеусзьуфьоыусн

5Еф Ю N0:20

МАЬИМНЫРЬЬАЬЪАЬИ0РЕРАРАРУ№НЪССРНЬУЕАЬУЬУС0ЕЕЙРЕУАРКТКЕЕАЕОЬОУ СфУЕЪСС03IТ08ЪРРЬЕ0₽МфККСУУОфССТЗIСЗЪ СфЬфЫУСН

ЗЕф Ю N0:21

МАЬИМКЬЬРЬЬАЬЬАЬНСРОРАРАРУЫфНЬСОЗНЪУЕАЪУЬУСеЕКаРЕУТРКТККЕАЕОРфУ афУЕЬОа0РаАОЗЪфРЬАЬЕаЗЬфКЕС1УЕфССТ31СЗЬУфЬЕИ¥СН

ЗЕф 10 N0:22

МАЪНМКЬЬРЫАЬЪАЬИСРОРУРАРУЫфНЪССЗНЬУЕАЪУЬУССЕКОРРУТРКТЕЕЕАЕОРфУ

Йф V ЕЗЗСЙ Р0А68 Ьф РРАРЕ'ЗЗ ЪфКЙЙ1УЕфССТЗIС8ЪУфЪЕЫУСЫ

ЗЕф 10 N0:23

МАЪИМЕЬЪРЬЬУЬЬАЬЖЗРОРАЗАЕУЫфНЬССЗНЬУЕАЬУЬУССЕЕаГРУТРКТЕЕЕАЕОЬфУ <3фУЕЪЙЙЙ Р0А03 Ьф РЬАТ.,ЕЙЗ ЬфКЕО I УЕфССТЗIСЗЬ ΥφΕΕΝ УСЫ

ЗЕф Ю N0:24 (ЛУУЕССКСУС'ЗМУфЬЕЬУСЫ

ЗЕф Ю N0:25

СОЗНЬУЕАЪ УЬУССЕЕЗРГУТ РКТЕЕЕАЕОЬфУОфУЕ ЕССЙРСАЗЗ ЬфРЬАЬЕС-3 Еф ХР.СЛ УЕ ФС

ЗЕф Ю N0:26

МАЬИМЕЪЬРЬЬАЬЬАЬИ0РОРАААРУНфНЬС03НЬУЕАЪУЬУССЕЕСРРУТРКТЕЕЕАЕОЬфУ

СфУЕЬОССРОАСЗЬф РЬАЬЕОЗ ЬфКЕС1УЕфССТЗIСЗЬУфЬЕЫУСМ

ЗЕф Ю N0:27

ГУЫфНЬССРНЬУЕАЬУЪУСеЕКСГЕУАРКтеУТОФССТЗ I СЗЪУФ1,ф1ТУСЫ

ЗЕф 10 N0:23

МТЬНМКЫРЬЬТЬЬУЬИЕРТОАфАРУЦфНЬСОЗНЪУЕАЬУЪУСеЕЕЙГРУТРКЗВЕФУЕОРфУ

АфЬЕЬОССРСАООЬфТЬАЬЕУАффКЕ01УОфССТ81СЗЬУф1,ЕНУСЫ

- 38 014887

3Ξ0 ΙΟ N0:29

МАЪИМКРЬРЫаАЕЬУЬЙЕРКРАОАРУКОНЬСбРНЬУЕАЬУЬУСбЕКбРРУТРКЗЕНЕУЕОРОУ РОЬЕ ЬОСЙРЕАЙЦЕОТЬАЬЕ УАРфХЕЮ! УЕ'ОССТЗ IСЙЦ УфЬЕИУСН

ЗЕО ΙΌ N0:30

МАЕИ1ВРЬРЬЬАЬЬ1ЕИЕРКРА0АРУК0НЬС63НЬУЕАЪУЬУС6ЕВ6РГУТРМЗККЕУЕОР0У .А0ЬЕЕ6(36Р6АС-ОЬ0ТЬАЪЕУАР.0К?.31УЕ2ССТ31СЗЬУаЬЕМУСН

ЗЕО ΙΌ N0:31

ТОфССТЗ IСЗ ΒΥβΙ,ΕΝΥΟΝ

ЗЕф ΙΌ N0:32

МАЬЬУНРЬРЫЛЕЬАЬИЕРКРТОАРУКОНЬССРНЬУЕАЬУЬУССЕРбРРУТРКЗЙКЕУЕОРСУ

Е0ЪЕЬ663РСОЬ0ТЬАЬЕУАЕфКК61ТО0ССТ31СЗЬУ0ЕЕНУСЫ

5Е0 Ιϋ N0:33

МАЕНМЕРЬРЬЪАЬЬРЬНЕЗНРТОАРУКОНЬССЗНЬУЕАЬУЬУСаЕКбРРУТРМЙНКЕУЕПРОУ

АОЬЕЬС66Р6А60ЕОТ1АЬЕУАОО№61ТООССТЙ1СЗЬУОЬЕЫУСК

3Ξ0 ΙΏ N0:34 οιцпасстзIСТЬУОЬЕЫУСИ

5Е<2 ΙΌ N0:35

МАЬИМНЬЬТУЕАЬЬАЬИ6РНТ60АГУЗРНЬС63^УЕТЬУЗУС0ОО6ГГУ1РКОКВЕЬЕОР0У

Е0ТЕЕ6М6Ь6А66Ь0РЬАЪЕМАЬ0КВ61УП0ССТОТСТКН0Ь03УСМ

ЗЕ<Э ΙΏ N0:36

МАРИМНЬЬТУЬАЪЬАЪИ6РЙЗУ0АУ350НЬС63ЫЬУЕАЬУМТС6К36РУКРНОЕКЕЬЕОЬ0УЕ <ЭАЕШЬЕА66Ь£)РЗАЬЕМ1ЬОКК61УООСС№Л1СТРЫОЬОНУС№/Р

ЗЕО Ιϋ N0:37

61УЕОСС№1СЗЬУОЬЕТУСЫ .

ЗЕО ΙΏ N0:38

МАЕИ1ЬЬРЫЛЪЫЬК6РОРА0АРУЫ0НЬС63НЬУЕАЬУ1ЬУС6ЕК6РРУТ₽М8ККЕУЕОРйУ

60УЕЬСА6Р6А63ЕОТЬАЬЕУАКОАР1УООСТЗС1СЗЬУОЕНУСЫ

ЗЕО Ιϋ N0:39

МАЬИМРЬЬРЬЬАЕЬ1ЬИЕР8РАНАЕУЫОНЬССЗНЬУЕАЬУЬУС6ЕР6РЕУТРКРКВ6УООРОМ

РОЬЕЬ663РОА60ЬКАЬАЬЕУАКОКР61УЕОССТ61С5ЬУОЬЕЫУСМ

ЗЕО Ιϋ N0:40

МАЬИТЕЬЬРЬЬАЕЕАЬЬОРПРАОАРУЫОНЬССЗНЬУЕАЬУЬУССВЕбРГУТРКЗКНЕУЕЕООб 60УЕЬ666РОА6ЬРОРЬАЬЕМАЬОКК61УЕОССТ31СЗЬУОЬЕМУСК

ЗЕГ) Ιϋ N0:41

ЕЬЕОРСУЕ0ТЕЬ6М6Ь6А66Ь0₽Ь06АЬ0

ЗЕО Ιϋ N0:42

МАЬК1РЗЬРЫАЬЬУРЗСРСТЗУАААНСНЬС63НЬУЕАЪУЬУС6ЕЕСРРУЗРКАККОУЕ0РЕУ

ЗЗРЪКОЕАСУЬРРООЕЕУЕКУККСЗУЕОССНМТСЗЬУОЬЕЫУСН

ЗЕу ΙΌ N0:43

ААН0НЬС63НЬУВАЬУЬУС6ЕР6РРУЗРКТХХПУЕ0РЬУМ6РЬНСЕУ6ЕЕРР0НЕЕУ0ХХ61У

ЕОССЕЫРСЗЬУОЬЕИУСЫ

- 39 014887

ЗЕф ΙΟ N0:44 (ЗТУЕОССЕЫРСЗЬУОЬЕЫУСЫ

ЗЕф ΙΟ N0:45

ЮЗЬРЬЬАЬЬАЬЗСРОТЗНААТадНЬСаЗНЬУЕАЪУЬУССЕКСГГУЗРКАКЕОАЕНРЬУИеРЬ НОЕУСОЬРГООЕЕГЕКУККЗТУЕОССНЫТСЗЬУОЬЕЫУСЫ

ЗЕф Ю N0:46

МАУИЬОАСАЪЪУЕЬУУЗЗУЗТдаСТРОНЬСОЗНЬТОАЪУЬУСОРТОГГУНРККПУЕРЬЬОГЬР

ΡΚ8ΑΟΕΤΕνΑΟΡΑΡΚΟΗΑΕΟΙΒΚΚ<3ΐνΕΟΟΟΗΚΡ05ΙΡΕΟ<2ΝΥΟΝ

ЗЕГ) Ю N0:47

МАтеЮАаАЬЪРЬЬАУЗЗУНАНАСАРОНЬСОЗНЬУОАЬУЬУССРТаРРУЫРККОУОРРЬОРЪР

РКЗА0ЕТЕУАОРАРКОНАЕУ1ККК31УЕ0ССНКРС81РЕЬ0ЫУСЫ

ЗЕ<Э Ю N0:48

ΟΐνΕςθΟΗΕ₽ΟΌΙΡΠΕ03ΥΟΝ

ЗЕ<Э Ю N0:49 (3Γν ЕОССНКРСКIРОЬЗЫУСМ

3Εζ) 10 N0:50

ΘΙΗΣΖΟΟΗΚΡΟΒΙΡΖΟΖΒΥΟΝ

ЗЕ<2 Ю N0:51

МААЬИЬ23РЗОЬУЬЬУУЗИРаЗОАУАРАОНЬСОЗНЬ¥ОАЬУЬУСООКОРРУЫРКК.ОУООЬЬСР

ΟΡΡΚ5(3Ο.ΑΑΑΑ(3ΑΟΝΞνΑ.ΕΡΑ.ΡΚΒ0ΜΕΜΜνΚΡΟΐνΕ200ΗΡ.ΡΟΝΙΡΟΟ0ΝΥΟΝ

ЗЕО Ю N0:52

МАЬЗРР0ААУ1Р0УЪЬЬЗКАРРЗАОТКТТ6НЬС13КО07НАЬУ1АС<ЗтабРРУОРТКМКК0ТСА

ЬААРЫ-'ЬАУАЕОМЕЗС®ОЕ 313 П-ТЕУЬКЗКР.З Т ΥΕΟ ССЕКРСЗI ΥΟΙ.ΕΜ ϊ СМ

ЗЕО Ю N0:53

МЛЕКЬС)ЛУ15ЬО7ЬЬАЪ5РЗ\Т>АМЛА0НЬСОеНЬ'/САОУЬ’7СЗЕКСГРУ7РКР.ОЧОРЫаРСЙР

ΚΒΑΚΕΝΕΕΥΡΡΚΟΟΤΕΜΜνΚΕΰΐνΕΟΟΟΗΚΡΟΝΙΓΟΟΟΝΥΟΝ

ЗЕО Ю N0:54

ΟίνΞΟΟΟΗΒΡΟΝΙΚνΟΕΝΥΟΝ

ЗЕО 10 N0:55

ΟίνΕΟΟΟΗΚΡΟΤΙΥΕΟΕΝΥΟΝ

ЗЕО ΙΟ N0:56 <31УЕОССНКРСЫI ΡΟΜ^ΝΥΜΝ

ЗЕО Ю N0:57 <31УЕ0ССНЫТСЗЬАНЬЕЗУСИ

ЗЕф Ю N0:58

31УЕПССН1ТТСЗЬУБЕЕС1СМ0

8Е<2 Ю N0:59 'ИСЕНС'СНМТСЗЬРОЬЕЗУСМ

- 40 014887

ЗЕб Ιϋ N0:60 7РТСйЛ,СеЗНЬ₄Т1Л1,1Т'/^тСОЕ№7РУ.5₽К01Р.ОУСРЬ.ЗА1?кПЬЕР₽ЬОТЕМЕОАЕР¥КОЙ№3 ЗКМККО1УЕ6ССНЫТС5ЬХШЬЕ(ЗУСЫ

ЗЕб Ιϋ N0:61

ΟίνΕΟ^ΗΕΚΟείΥΏΜΕΝΥΟΝ

ЗЕб Ю N0:62

ΟΐνΕ6ΟΟΗΚΡΟΝΙΕΤ>Ε6ΝΥΟΝ

ЗЕб Ю N0:63

61УЕ6ССЬКРСТ1УЁМЕКУСЙ

ЗЕб Ю N0:64

61УЕбССНКРСЗIРПЬбМУСУ

ЗЕб Ιϋ N0:65

МААШЬбАРЗЬЪ'7ЬММЕЗКРСЗбАЧСеРОНЬСЗЗНЬ7ПАЬ¥Ы'СООР.ОГРУ’1РККОРВР1.,1,СР

ЬРРКА66АУУ6ССЕИЕУТРКО6МЕММУККО1УЕЕССНКРСТ1РОЪ6ИУСИ

ЗЕб Ю N0:66 бГУЕбССНЗРСЗЬУОЬЕПУСЫ

ЗЕб 10 N0:67

ΟίνΕΟΟΟΗΚΡΟΘΙΡϋΕΟΝΥΟΝ

ЗЕб Ю N0:68

МААЬИЬбЗ УЗЬЕХтМЕУЗ^ЗбЗбАУЬРРбНЬСОАНЬУОАЪУЬУСОЕКбГ РУТРКЕОУОРЬЪСР

ЬРАК866АААаОЕ№УАЕРАРКОбМЕММУКВС1УЕбССНКРСЫ1РОЬ0ИУСЫ

ЗЕб 10 N0:69

0УЕРЬЬ6РЬ5РК36бЕИЕУ00РРУК6б6ЕЬ

ЗЕб 10 N0:70

МАЬНМбСЪРЬУЬУЬРГЗТРМТЕАЬУКбНЬСбЗНЬУЕАЬУЬУСбОКаРРУУРКУКЕОМЕбАЪУЗ еРбОЦЕЬО6МбЬ0РбЕУбКМКК61УЕбССНЗТСЗЬРбЬЕеУСЫ

ЗЕб ю N0:71

МАЬНМбСЬРЬУЬУЬЬРЗТРЫТЕА1хАЦбНЬС63НЬУЕА1УЬУС60К6РРУУРК1КР01ЕбАбУЦ СРб0ЫЕЬ0СМбРб₽бЕУбКМКК61УЕбССНЗТС5ЬРбЬЕЫУСЫ

ЗЕб Ю N0:72

61УЕ6ССШТС5ЬУ6ЬЕЫУСЦ

ЗЕб 10 N0:73

С1УЕ6ССННТСЗЬУ6ЬЕЦУСЫ

ЗЕб Ю N0:74

61УЕ6ССЕНТСЗЬУЕЬЕЫУСЫ

ЗЕб Ю N0:75

6ΐνΕ600ΕΝΤ031·Υ6ΕΕΝΥΟΝ

ЗЕб Ю N0:76

М6ЬН1ЕЬЬРЫАЬЫЬК6РОРАААЕРНМРУ№НЬС68НЬУЕАЪУАУС6ЕВБРР¥ТРКТККЕАЕ

- 41 014887

ПЬ0УС0УЕЬССОРСДС8Ь0РЬАЬЕС810КНС1УЕ0ССТ31С8Ь¥06ЕМУСМ

ЗЕО ΙΌ N0:77 <31УЕ0ССТ31С5ЬУ0ЬЕЫУСЫ

ЗЕО ΙΌ N0:78

РУЫОНЬСЗЗНЬУЕАЬУЬУСОЕКСРРУТРКТ

ЗЕО 10 N0:79

РУО0НЬССЗНЬУЕАЬУЬУССЕЕОГ₽УТРКААКа1УЕ0ССТ81С8ЬУЕЬЕОУСИ

ЗЕО Ю N0:80

РУЕ0НЬС63ОЬУЕАЬУЬУСЗЕКСРРУТРКААКС1УЕ0ССТ31СЗЬУ0ЬЕЕУСЫ

ЗЕО Ю N0:81

РУ00НЬСС8НЬУЕАЪУЬУСЗЕНОРРУТРКААКС1УЕ0ССТ81С8ЬУ0ЬЕЫУСС

ЗЕО 10 N0:82

РУТОНЬСОЗН^ЕАЕУЬУСОЕКОРРУТРКААКШУЕОССТЗТСЗЕУСаЕНУСЗ

ЗЕО Ю N0:83

ЫЗМСКРУЕОНЕС’СЗНЕУЕАЬУЕ’/СаЕЕОРГ'гТРКТКб! УЕОССТЗЮБЬУОЬЕЫУСЫ

ЗЕО Ю N0:84

ΝΞΝΘΚΡνΝΟΗΣ ССЗНЬУЕАЬУЪУаЗЕКСРРУТРКТККЗ IУЕОССТЗIСЗЬУОЬЕЫУСЫ

ЗЕО Ю N0:85

Рта0НЬСбЗНЬУЕАЬУЬУСаЕ1«ЗРРУТРКС1УЕ0ССТ31С8ЬУ0ЬЕЫУСЫ

ЗЕО Ю N0:86

РРУИОНЬССЗНЬУЕАЪУЬУССЕРеРРУТРКААКОХУЕОССТЗТСЗЬУОЪЕЫУСЫ

ЗЕО Ιϋ N0:87

КЕТЬТ1ТСАУРТИЬКЬКТИРАУКЕУ85ТЫЬКЬЬКУЪЗ№[АУРРЗАРСТЫИКТТАТК&ЗР0А

ЗЕО Ю N0:88

КОЗЬТЫТСАУЗТКЬКЬСТИРАУКЕУЗЗТЬЬ.РЬЬКУЬЗтАУРРЗАЫУТКККТТАТКЕЗРОА

ЗЕО Ю N0:89

МртаОНЬСЗЗНЕУЕАЬУЕУСаЕЙОГГУТРКТКРЕАЕОЬОтеОУЕЬеССРСАаЗЪОРЬАЬЕОЗЬ

Окка1УЕОССтз1С8ЪУОЬЕ»геая

ЗЕО 10 N0:90

ЕЕЕАЕЕЬОУЗОУЕЬООЗРСАОЗЬОРЬАЬЕ'ЗЗЬОКК

ЗЕО Ю N0:91 (ЗРЕТЬ ССАЕЬТОАЬОРУССВЕСР

ЗЕО Ш N0:92

МКЬКТУЕ£А7Г.ЗЙЬГАЗОУЫЗОРЗЬОТЕ£ОТТ£.'Л’Ы4.чООТЕЗЛРА1^,ОТА.^с;СОЬО'7СЫЗМА

ККЕЕОЕРКРУЫОНЬСаЗНЬУЕАЬУЬУССЕЕСРРУТРКААКС1УЕОССТ31СЗЬУОЬЕЫУСМ

ЗЕО Ю N0:93

ЬЬЬдЬсааЪсадсассЪДЬдьддЬСсЪсассЬддЪддаддсьсЬдЬассьддЬдьдЬддддаа сдЬддЬЬЬсЬЬсСасасасссаадасссдЬсдЬаадсЬЬаадсдЬддсаЫдЬддадсадЬдс

- 42 014887 бдсассадсабсбдсбсссбсбассаасЬддадаасЬасбдсаас

ЗЕ2 ΙΌ N0:94

ОIУЕфССТЗIСЗЬУОЪЕЫУСЫ

ЗЕО ΙΌ N0:95

РтаОНЬССЗНШЕАЬУЬУССЕЕСРГХ

ЗЕО 10 N0:96

О1УЕбССТ81С5ЪУ<2ЬЕ№гаЯ

ЗЕО Ю N0:97

ЕУМОНЬСОЗЕЬУЕАЬЕЬУСеЕКОРРУЕРК

5Е0 10 N0:98

01УЕОССТЗIСЗЪΥΟΟΕΝΥΟΝ

8Е0 10 N0:99

РУЫОНОСОЗНЬУЕАОНЬУСОЕЕОРРУТРКТ

ЗЕО Ю N0:100

С1УЕ<2ССК31СЗЪУ6ЬЕЫУСЫ

ЗЕО Ю N0:101

КтаОНЬСОЗНЬУЕАЪУЬУССЕКОГГУТРКТ

ЗЕО Ю N0:102

016Е-дССК31СоЕУ0ЬЕЫХСМ

3Ξ0 Ю N0:103

РУМбНЬССЗНЬУЕАЪУЪУСаЕЕОРРУТРКТ

3Ξ0 Ю N0:104

С1УЕ<ЭССХ81СЗЬУОЬЕЫУСЫ

ЗЕО Ю N0:105

РУМОНЬССЗНЬУЕАЬУЪУССЕЕОРРУТРКТ

ЗЕО Ю N0:106

О1УЕ0ССХ31С8ЬУ0ЛЕЫУСЫ

ЗЕО ΙΏ N0:107

РУЙОНЬСОЗНЬУЕАЬУЬУСОЕЕаРРУТРКТ

ЗЕО Ю N0:108

ОХУЕ ОССТЗIСЗЬУОЬЕИУСЫ

ЗЕО Ю N0:109

РУ№НЬССЗОЬУЕАЪУЪУССЕЕСРГУТКРТ

ЗЕО Ю N0:110

ОАУЕОССТЗ ЮЗЬУОЬЕЫУСЫ

ЗЕб Ю N0:111

РУЫОНЬСОЗВЬУЕАЪУЬУСОЕЕСГРУТКРТ

- 43 014887

5Ε£ Ιϋ N0:112

СХУЕОССТЗIСЗЬ ΥφΙιΕΝΥΟΝ

ЗЕО Ю N0:113

ГУНОНЬСаЗНЬУЕАЪУЬУСОЕКОРРУТРКТ

ЗЕО Ю N0:114

СХУЕОССТЗIСЗЬУОЪЕКУСИ

ЗЕО Ιϋ N0:115

РУЫОНЬССЗНЪУЕАЬУЪУССЕЕОРЕУТРКТ

ЗЕО Ю N0:116

ОСОЕОССТЗIΟΕΕΥΟΕΕΝΥΟΝ

ЗЕО Ю N0:117

ЕУЫОНЬССЗОЬУЕАЪУЪУССЕРОГЕУТКРТ

ЗЕО 10 N0:118

Х1УЕ0ССТ31С£ЬУ0ЬЕИУСЫ

ЗЕО Ιϋ N0:119

ХУЫОНЬСООНЬУЕАЪУЬУСОЕКаГРУТРКТ

ЗЕО 10 N0:120

31УЕОССТЗIСЗЪУОЬЕЫУСИ

ЗЕО Ю N0:121

ЕУКОНЕССЗНЬУЕАЬУЕУСОЕЕСЕУТРКТ

5Е0 10 N0:122

О1УЕ03СТ3133ЬУ0ЪЕЦУСЫ

8Ξ0 Ю N0:123

РУЫСНЬССЗОЬУЕАЬУЬУССЕЖЗГЕУТКРТ

8Е0 10 N0:124

МОРООРЕСЬЕОЬЬНЕЪОСЗУЕУЕУТСОТУНУЕУЗРЕОРООРЕСЪЕОЬЫЖЬСОЗУЕУЕУТООТ νΗνΕν3Ρ0ΕΚ0ΡΕΥ0Ν

ЗЕО Ιϋ N0:125

МЬКЕККУЗРОРООРЕСЪЕОЬЬКРЕСОЗУЕУЕУТСОТУНУЕУЗРЕОРООРЕСЕЕОЬЬКЕЬОЗЗУ ΕνΕνΤΟΟΤνΗνΞνΞΡΟΕΕΟΓΡΥΟΝ

ЗЕО Ιϋ N0:126

МАТЗХЗТККТОЬОЬЕНЪХЬОЬОМ

ЗЕО 10 N0:127

ТМ1ТО5ЬАУУЬ0КХОМХРОУТ0Ъ

ЗЕО Ю N0:128

Ы8УЬА8АЬАЬТУАРМАРА^ОЗЕ8РЬЗНООУ5ЕНОаУ8МУ1ЕАЬОКРУИ0НЕСО8НЬУЕАЕУЪ УССЕК0ГЕУТРК01УЕ£ССТ51С£ЬУ0ЬЕМУСК

ЗЕО Ю N0:129

- 44 014887

ОТТМРАООООЗООНЬСОРНЪУЕАЪУ

ЗЕО Ю N0:130

ЬЕИУСЫ

ЗЕО Ю N0:131

ΜΤΜΙТОЗЬЕРОАМОССОСММНР

ЗЕО 10 N0:132

МУЬЕГЬРЬЬАЬЬУЪГОЕРКРАОА

ЗЕО Ю N0:133

ΕνΝΟΗΝΟΟΞΗΐνΕΆΝΥΝνσαΕΚΟΕΡΥΤΡΚΤΚΚΎΡαθνΚΡαΐνΞΟΟΟΤΞΙ05ΝΥςΝΕΝΥΟΝ

8Е£ 10 N0:134

О1УЕ0ССК81СЗЬУ0ЬЕИУСЫ

ΞΕΟ 10 N0:135

РУЫОНЪСЗЗНЕУЕАЬУЬУСОЕКОРЕУТРКТ

ЗЕО ΙΟ N0:136

СТУЕОССКЗIСЗЬУОЬЕЫУСМ

8Е0 10 N0:137

ΡνΝ0Η1Ο63ΗΕνΞΑΕΥΕνθ2ΞΚ0ΡΡΥΤΡΚΤ

ЗЕО 10 N0:133

ЬУЕАЪУЬУСОЕЕОС

ЗЕО 10 N0:139

О1УЕ0ССХ81С8ЬУ0ЬЕЫХСЫ

ЗЕО Ю N0:140

РТМОНЬСОЗНЪУЕАЬУЬУССЕВОРРУТРКТ

ЗЕО Ю N0:141

О1УЕ0ССХ31С8ЬУ0ЬЕЫУСЫ

ΞΞΟ Ю N0:142

ЕУМОНЪССЗНЬУЕАЬУЕУСОЕКСЕЕУТРКТ

ЗЕО Ю N0:143

01УЕОССТЗ ЮЗЪУОХэЕЫУСЫ

ЕЕС Ю N0:144

ЕтаОНЪСОЗОЬУЕАЬУЬУСОЕКСРРУТОК

ЗЕО Ю N0:145

ЕУМ0НЪСОЗОЬУЕАЬУЕУСаЕРСЕЕУТОКО1¥Е0ССТ31СЗЕУ0ЬЕНУСЫ

5Е0 ΙΌ N0:146

ААК

ЗЕО Ю N0:147

ΝΚΗ

- 45 014887

3Εζ) Ιϋ N0:148 ВККОКК

ЗЕО Ю N0:149 ЕЖКК

ЗЕО Ю N0:150 КОЕЬ

ЗЕО 10 N0:151

НОЕЬ

8Εζ> ΙΌ N0:152 ϋϋΕΕ

ЗЕО ΙΟ N0:153 АОБЬ

5Е<2 ΙΟ N0:154 ΞϋΕΙ,

5Е<2 Ю N0:155

ΗϋΕΡ

ЗЕО Ю N0:156

Мек 1

А1а

АЁР

Ткг

А1а 5

Агд

<31у

Ткг

ΗΪ3

ΗΪ3 10

Лер

11е

Не

С1у

Агд 15

Аер

αΐη

Тух

Рго

мег 20

мег

С1у

Агд

Азр

Агд 25

Азр

С1П

Туг

<31п

Мек 30

Зег

С1у

Агд

С1у

Зег 35

Азр

Туг

Зех

Ьуа

Зег 40

Агд

<31п

Не

А1а

Ьуэ 45

А1а

Ткг

А1а

ναΐ 50

Ткг

А1а

<31у

<51у

Зег 55

Ьеи

Уа1

Ьеи

Зег 60

Зег

Ьеи

Ткг

Ьеи

Уа1 65

01у

ТЬг

Уа1

Не

А1а 70

Ьеи

Ткг

Уа1

А1а

Ткг 75

Рго

Ьеи

ν&ι

11е во

РНе

Зег

Рго

Не

Ьеи 85

Уа1

РГО

А1а

Ьеи

11е 90

Ткг

Уа1

Ака

Ьеи

Ьеи 95

11е

Ткг

<31у

РЪе

Ьеи 100

Зег

<31у

Рке 105

01у

11е

А1а

Ака

Не 110

Ткг

ν&1

Рке

Зег

Тгр 115

Не

Туг

Ьуз

5Е0

ΙΟ

N0

: 157

мег I

А1а

Аар

Ткг

А1а 5

Агд

Ткг

ΗΪ8

Н1з

Авр 10

Уа1

Ткх

Зег

Агд

Авр 15

δΐη

Туг

Рго

Агд Азр

Агд

Амр

61а

Тух

Зег

Мек

11е

<31у

Агд

Авр

Агд

Авр

25 30

- 46 014887

61п Туг Вег Мек.

Мек

<31у

Агд

Авр Агд Авр 6111 Туг Айп

Мек

Туг

01у

35

40

45

Агд Авр

Тух

Вех

Був

Вех

Агд

01п

Не

А1а

Ьуз

А1а

Уа1

ТЫ

А1а

νβΐ

50

55

60

ТЫ

А1а

31у

Э1у

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи

Вех

Зег

Ьеи

ТЫ

Ьеи

Уа1

61у

65

70

75

80

ТЫ

Уа1

На

А1а

Ьеи

ТЬг

Уа1

А1а

ТЫ

Рго

Беи

Ьеи

νβΐ

Не

Рке

вег

85

90

95

Рго

Не

Ьеи

7а1

Рхо

А1а

Ьеи

Х1е

ТЫ

Уа1

711а

Ьеи

11е

ТЫ

С1у

100

105

НО

РЬе

Беи

Зег

Вех

С1у

е1у

Рке

А1а

11а

А1а

11е

ТЫ

Уа1

Рке

Вех

115

120

125

Тгр

Не

тух

Ьуз

Тух

А1а

ТЫ

01у

01и

Н1з

Рхо

С1п

<31у

Вех

Азр

Ьуз

130

135

140

Беи

Авр

Вег

А1а

Агд

Мек

Ьуз

Ьеи

е1у

ТЫ

Ьуз

А1а

31п

Авр

11а

Ьуз

145

150

155

160

Авр

Агд

А1а

<31п

Тух

Туг

М1у

01п

С1П

Н1в

ТЫ

С1у

01у

<31и

Н1з

Авр

165

170

175

Агд

Лер

Агд

ТЫ

Агд

<31у

С1у

С1П

ΗΪΒ

ТЫ

180 185

3ΕΏ ΙΟ N0:158

касоакдддд	ксааадасдд	адакдакдда	дададасдса	акддакасдд	кддскссска	60
кдсдосддкс	асккассако	дссдкдсксд	кдккдаоккд	дакдакадас	кксскааасс	120
ккакакдсса	ададсаккдс	аадсассада	сададаасас	ссдкасддаа	екссаддсса	180
каадааккас	ддасккадкд	ккскксааса	дсакдкокос	ккскксдака	кддакдакаа	240
кддсаксакк	кассоккддд	адасскаскс	кддаскдсда	акдсккддкк	ксаакаксак	300
кдддксдскк	акаакадссд	скдккаксаа	сскдассскк	адокакдсса	сксккасддд	360
дкддккасск	ксасскккск	кссскакака	сакасаоаас	акасасаадк	сааадсакдд	420
аадкдаккса	аааасакакд	асаакдаадд	ааддкккакд	ссддкдаако	ккдадккдак	480
акккадсааа	какдсдаааа	ссккдссада	саадккдадк	сккддадаао	какдддадак	540
дасадаадда	ааосдкдаод	сккдддасак	ккккддакдд	аксдсаддса	ааакададкд	600
дддаскдккд	касккдскад	саадддакда	адаадддккк	ккдксаааад	аадскаккад	660
доддкдкккс	дакддаадск	кдкксдадка	окдкдссааа	акскасдскд	дкакоадкда	720
адасаадаса	дсакаскасд	ссакддак				748
ЗЕО ΙΌ N0:159
акддддксаа адаоддадак	дакддадада	дасдсаакдд	скасддкддс	кссскакдсд	60
саддЪсасЫ:	ассассдссд	кдсксдкдкк	дасккддакд	акадасккос	кааассккак	120

- 47 014887

аЪдссаадад	саЪЬдсаадс	ассадасада	даасасссдЬ	асддаасЬсс	аддссаЬаад	1В0
ааббасддас	Ь-ЪадЬдЫхЬ ЪсаасадсаЪ	дЦсбссМсЦ	Ьсда-ЬаСсда	ЬдаЪааЪддс	240
а^саЪЪЬасс	с-Ь-едддадас	сЬасЬсбдда	сбдсдааЪдс	£±дд“11:саа	ЕаЪсаЬЬддд	300
Ьсдс-Ыа-Ьаа	Ьадссдсбд!	ЪаЕсаасскд	асссЬ'ЬадсЪ	аЕдссасЕсЪ	ЬссддддЕдд	360
Нассббсас	СЬ-ЬбсбеОСС	Ъа^а'ЬаоаЪа	сасаасаЪас	асаадЪсааа	дсаЪддаадб	420
да-ЬЪсааааа	саЪаЪдасаа Едааддаадд	ЬЬ-Ьа-Ьдссдд	ЕдааЬсЫда	дЬЪдаЪа'Ь'Ь'Ь	480
адсаавкабд	сдаааасс-Ы	дссадасаад	ЫздадЪсЪбд	дадаасбаЪд	ддадабдаса	540
дааддааасс	д-Ьдасдсб-Ьд	ддасаЪУЛ-Ь	ддабддабсд	саддсааааЪ	адад-Ьдддда	600
сЬд^Цд^асЬ	ЪдсЬадсаад	ддаЬдаадаа	дддЪЪеЛЬдЪ	саааадаадс	ЪаЫ:аддсдд	660
ЕдЕЕ-ЬсдаЕд	даадсбЦд'Ы:	сдадЪас-ЬдЪ	дссааааЬсЬ	асдс-ЬддЬаЬ	садЕдаадас	720
аадасадсаб	асбасЪаа					738

3Εζ) ΙΌ N0:160

АТООАТСТААТССАСАСТТТССТСААСТТААТАОСТСССССТТТСАССТТСТТСТТССТТСТС ТТТТТСТТОССАСССТТССАОАТТТТСААОТТСТТССТТТСААТСТТООССАСССТТТТСАОС ОАОСАтеТСОСТООААААаТССТССТСАТСАССаОССССТССТССООСАТССОСОАААаТСТТ СгСТТАСОАОТАТССТААОАОАСОООССТаСТТССТОСТТССТОСААСААССаАААССАСТСТТ сААаААетаассеАААооасссосоАтттосоотс&ссо&АсотсатоотоатссаоассоАТ ОТТТСОААООСООАаОАСТаСАОаААОбТТОТТОАТСАОАСТАТОААТСОСТТТООААОАТТа ОАТСАССТООТСААТААСОСТОаААТТАТОТСАОТТТСААТОСТСаААОААОТТОААОАТАТТ АСТООТТАСАСАОАААСТАТООАТАТСААСТТСТОООаСТАТОТОТАТАТОАСССОАТТТОСС ОССССАТАССТТАООААТАОСАОАОЗССОААТТСТТОТАСТТТСТТСАТССАОТТСТТСОАТа ССТАСТССОАСЗ(ЗАТаАОТТТТТАСААТаСААаСААА6Са<5С<ЗАТТТСАСААТТТТТТаА<ЗАСА СТСССОЙТОаААТТСаСССССаАТАТАОЗСАТААСССТТСТСАСТССАООАТТСАТАСААТСТ ОААСТТАСССААеОСАААТТСТАСААТаСТООСОААСОТОТААТТСАТСАаСАСАТОАСАОАТ аТАСААОТСАССАСеАСТССААТССтеАО(АЗТООАААатаСООСААС10ТСААТССТОАОСА<ЗС аСОАТССаТСОАОАААОАТАСаТОАСАОАОСССОССТаОТТТАООСТТАСТТАТТОетООААа СТАТТСТаСССТОАОСТОАТОСАОТСООТАТТТАОАСТСАТаТАСТТСОССАОССССОаТОАа СССОАОААОЗАААСОТТТОССААаААОаТТТТООАТТАСАСАООАеТОААОТССТТССТТТАС СССОАААССаТОСААОТТССОаАССССААаААТСАТТАА

5Е<2 ΙΌ N0:161

ΜΝΕ1Κ5ГРЕУАГЬСЕОфУГУАУТНА

5Е<2 Ю N0:162

ΆΡνΝΤΤΕΒΕΤΑΟΑΕΑνίΟΥδΟΒΕΟΟΓΌνΑνΒΡΓβΝΞΤΝΝΟΙΛΓΙΒΤΤΙΑδΙΑΑΚΕΕΟνδΙ,ΜΑΚ К

ЗЕО Ю N0:163

АР7НТТЕОЕТА0АЕА710УЗОЪЕ0ПРПУАУЬРР5Н5Т№7ОЬЪГ1ВТТ1А£1ААКЕЕ0У£МАК1?

ЗЕО ΙΌ N0:164

ОРЮЕОЫБТЗЗМАКЯ

5Е0 ΙΌ N0:165 □РΙΌ0ΤΕ5ΝΤΤ3νΝΕΜΑϋΌΤΕΌΚΓΑΤΝΤΤΕΑΒ0ννΝΜЗНАКЕ

ЗЕО Ю N0:166

0₽1 □ОТЕ50ТТЗУТТЬМАВОТЗБГ<РАТ0ТТЬА1О’Л⁷1'1Ы ЗМАКВ

- 48 014887

ЗЕО Ю N0:167

О РIϋϋΤΕ30ΤΤ3ЧГЖМАООТЕПК РАТОТТЬЛЬОУУЧЬIЗМААА

ЗЕО Ю N0:168 др ГО0ТЕ8ЫТТЗ ’ЛЛЖПОТЕОР.Е ΑΤΝΤΤΡ,ΑΤ.,ΕΡΤΤΙΡ I ЗМААА

ЗЕО ГО N0:169

ОР100ТЕ 5ΝΤΤ3 ^ЛИАООТЕОАРАТЯТ'ГЪАСОЬЗ'ЛЫь IЗМАКЕ

ЗЕО ГО N0:170

ОРЮОТЕ ЗОТТБ ’ЛЛМА ОРТЕ БАЕАТОТЫЗССЬОЧУСЬI ЗМАКЕ

ЗЕО Ю N0:171 о Р ЮОТЕЗОТТЗЧЫЬМАООТЕ 5АРАТОТЫЗ(За1ЛЭТ7УСЬ1 ЗМААА

ЗЕО ГО N0:172

ΕΕΑΞΑΕΑΕΡΚ

ЗЕО ГО N0:173

ЕЕОЕРК

ЗЕО ГО N0:174

МАЕ1ТК1РЬУКСКЗЬККАЬКЕН<ЗЬЬЕОРЬ0К00¥а155КЕ

ЗЕО ГО N0:175

ССАТОСТОАСАТТЗТСАТОАСАСАСТС

ЗЕО Ю N0:176

ААССТТССАТТТАААТАСТСаАСАСТСТаАСАСТООТСССТТб

ЗЕО ГО N0:177

ОААОААСЮАОАСССТААаТТТОТТААТСААСАТСТТТОТССАТСТСАТСТТаттеАСбСТСТС ТАССТТС

ЗЕО Ιϋ N0:178

ССТТАССАатСТАОАААААТССТСТТТСТССАСАСАСААООТАСАСАСССТСААСА

ЗЕО ГО N0:179

СТААСССТССТААОССААТТС

ЗЕО ГО N0:180

ААССТТСАЗТТеСААТАСТТСТССААТТССТАААОТаАОСАТкАТАСААСТаСААСАТТеТТСА

АСААТТСССТТАОСАСССТТ

ЗЕО ГО N0:181

СТСОАОТСААССААТТСАТОАСАСТСААТС

ЗЕО ΙΌ N0:182

ААССТТСАААОТТСАТССТТСТТССААТАеТТСТССААТТО

ЗЕО ГО N0:183

ААОСТТСАОТТОСААТАОТТС

ЗЕО ГО N0:184

ОСАТОСССААССААТТОАТСАСАСте

- 49 014887

5ЕС Ю N0:165

ОСАТССАТСССТТТСТТААТСААСАТСТТТаТОа

БЕО Ю N0:186

АСАТТСТТСААСААТТССТСТСТТТСТТСТАОТСТТАОСАСТаТАСАААААТСС

БЕО Ю N0:187

ОСАТААОСТТСАААОСТСАТССТТТСАСС £Еф Ιϋ N0: 188

ДтеААСТТССТТААОТСТТТСССТТТСТАСССТТТССТТТетТТСССТСААТАСТТСОТТССТ СТТАСССАТОСССААССААТТСАТОАСАСТСААТСССАСАССАСаТСАСТСААССТСАТСаСС САТеАТАСТОАОАССасаТТТССТАСАСАААСАААТТССССАСЙТСТТОАСаТТСТСаОАТТО АТСТССАТ6(ЗСТАА<ЗАСА(ЗАА(ЗАА<3(ЗА(ЗА<ЗССТААЗТТТЗТТААТСААСАТСТТТ13ТС<ЗАТСТ САТСТТСТТОАОССТСТСТАССТТСТОТОТООАОАААСАСОАТТТТТСТАСАСТССТААСССТ аСТААООСААТТСТТСААСААТСТТССАСТТСТАТТТССТСАСТТТАССААТТОЗАСААСТАТ ТССААСТСА

5Е<2 Ю N0: 189

ΜΝΕΣ КЗ Р РРУАРЬСРОСУРУД7ТНА0₽I ЗЕТЕ 3 ОТТЗУРШЩУЕЕТЕ £ΆΡΑΤ·φΤΜ£Ο3ΕΕ'Γ,/3Α 13МАККЕЕОЕРКР7№НЪСеБНЬ7ЕАЬУЬУС<ЗЕРаРРУТРКААКе1УЕ0ССТ31СЗЬУ0ЬЕНУ 0Ν

8Е0 10 N0: 190

ТТССТСААССААСАСТТО

3ΕΏ 10 N0: 191

ААССТТТСАСТТАСАСТАСТ

ЗЕО 10 N0: 192

ССАТОСАТСТСТТОАОС

ЗЕО Ю N0:193

СЗТАСТОТССТЗЗССА

8Е0 10 N0: 194 сатЗОССАОСАСАСТАССТТСатеААССААСАСТТОТа

ЗЕу ю N0:195

АТСаССЗАТАСАаСТАОАЗСААСССАТСАСЗАТАТСАТСОЗСАСАОАССАСТАСССОАТаАТО ОЗССОАСАССеАСАССАСТАССАЗАТСТССОСАССАСОАТСТОАСТАСТССААеТСТАСЗСАО АТТаСТААДаСТОСААСТаСТСТСАСАССТОСТОСТТСССТССТТОТТСТСТССАСССТТАСС СТТОТТССААСТОТСАТАССТТТСДСТаТТОСААСАССТСТССТССТТАТСТТСАОСССААТС СТтетСССбОСТСТСАТСАСАСТТОСАСТССТСАТСАССОаТТТТСТТТССТСТОЗАОСОТТТ СССАТТеССССТАТААСССТТТТСТСТТССАТТТАСААЗТААЗСАСАСАТТТАТСАТСТТАСТ ТСАТААТТТТСтеСААТАТЗтеСАТССАТСТаТТСАЗССАЗТАОСТТТСОАТСААТТТТТТТС СТАОААТААСАААТОТААСААТААСАААТТЗСАААТТСТАаОЗААСАТТТОЗТТААСТАААТА СОАААТТТОАССТАССТАЗСТТСААТСТЗТСТОТСТАТАТСАТСТАТАТАаЗТААААТССТТС СТАТОАТАССТАТТЗАТТСТСААТАСОТАСЗСААСЗОЗАСАОСАСССАСАССЗСАТСАСАСААО ТТССАСАОТССААООАТСААСТТСССААССАААаСТСАССАТСТСАААСАСАСАССТСАСТАС ТАССЗАСАОСААСАТАСТеСТООеОААСАТОАСССТОАСССТАСТССТОСТЙСССАОСАСАСТ АССТТССТеААССААСАСТТСТетССАТСТСАТСТССТТСААаСТСТСТАСТТЗСТТТСТЗСТ аАОАСАОСАТТСТТСТАСАСТССТААОАССАСААССОАДССТСДССАСТТОСАОСТСССАСАА ОТТСАСТТОС(ЗТС(ЗАСОТССТЗСАОСАЗЗАТСТТТССААССТСТСаСТТТе(ЗААССТТСТТТ(3

САОААСАаАСОААТСОТТеААСААТаТТССАСТТСААТСТСТТСТТТСТАТСАСТТСОдаААС ТАСТСТААСТСА

ЗЕО ΙΟ N0: 196

МАОТАКОТННО11СКО0УРММСКОК00У0М36КОЗОУЗКЗК01АКААТАУТАе<ЗЗЬЬ7Ь58ЪТ ЕУСТУ1АЪТУАТРЬЕУ1РЗР1ЕУРАЫТУАЬЫТаЕЬЗЗСОЕС1АА1ТУРЗН1¥АТОЕНР0СЗ ОКЬОЗАКМКЬСЗКДООЕКОКАОУУСООНТООЕНОКОКТКОЗОНТТРЦНОНЬССЗНЕУЕАЬУЪУ С<ЗЕК.аРР¥ТРКТККЕАЕОЕСУССУЕЕО(ЗСРСАСЗЕ0РЬАЕЕаЗЬ0ККС1УЕ0ССТ31СЗЕУ0Ь ЕЫУСЫ

- 50 014887

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> 5етВ1оЗуэ БепетЛсз 1пс.

Мо1опеу, Маигхсе М.

ВооГЬе, бозерк

Кеоп, ВтсЬагб

Ыук1£огик, Согу

Уап Κοοί^βη, <120> Способы получения инсулина в растениях <130> 9369-296 <150> 60/478,818 <151> 2003-06-17 <150> 60/549,539 <151> 2004-03-04 <160> 196 <170> РабепЫп версия 3.1 <210> 1 <211> 1143 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты слитого белка инсулина

- 51 014887 <400> 1

аСдаасССсс	ССаадСсССС	сссСССсСас	дсСССссССС	дСССсддСса	аСасССсдСС	60
дсСдССасдс	аСдсСдасаС	СдСдаСдаса	садСсСссаС	ссСсссСддс	СаСдСсадСд	120
ддасадсддд	СсасСаСдсд	сСдсаадСсс	адСсададсс	ССССааааад	СассааСсаа	180
аадаасДасс	СддссСддСа	ссадсадааа	ссаддасадб	сСссСааасС	СсСддСаСас	240
СССдсаСсса	сСадддааСс	СддддСсссС	даСсдсССса	СаддсадСдд	аСсСдддаса	300
да1ССсасСс	ССассаСсад	садСдСдсад	дсСдаадасс	СддсадаССа	сССсСдСсад	360
саасаССаСа	асасСссСсс	сасдССсддС	дсСдддасса	адсСддадсС	СаадсддСсС	420
ссдаасддСд	сССсСсаСад	сддССсСдса	ссаддсасСа	дсСсСдсаСс	СддаСсСсад	480
дСдсассСдс	адсадСсСдд	адсСдадсСд	аСдаадссСд	дддссСсааС	даадаСаСсс	540
СдсааддсСа	сСддсСасас	аССсадСадс	СасСддаСад	адСдддСааа	дсададдссС	600
ддасаСддсс	ССдадСддаС	СддададаСС	ССассСддса	дСддСадСас	СассСасааС	660
дадаадССса	адддсааддс	сасаССсасС	дсадаСасаС	ссСссаасас	адссСасаСд	720
саасСсадса	дссСдасаСс	СдаддасСсС	дссдСсСаСС	асСдСдсаад	аССддаСдСС	780
дасСссСддд	дссааддсас	сасСсСсаса	дЬсСсдадСс	аассааССда	СдасасСдаа	940
Ссссадасса	сдСсадСдаа	ссСсаСддсс	даСдаСасСд	ададсдсдСС	СдсСасасаа	900
асаааССсдд	даддСсССда	сдССдСсдда	ССдаСсСсса	СддсСаадад	адаадаадда	960
дадссСаадС	ССдССааСса	асаСсСССдС	ддаСсСсаСс	ССдССдаддс	СсСсСассСС	1020
дСдСдСддад	ааададдаСС	СССсСасасС	ссСааддсСд	сСаадддааС	СдССдаасаа	1080
СдССдсасСС	сСаСССдсСс	асСССассаа	ССддадаасС	аССдсаасаа	ддабдаасСС	1140

Сда 1143 <210> 2 <211> 380 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Слитый белок инсулина <400> 2

- 52 014887

МеЬ 1

Азп

РЬе

Ьеи

Ьуз 5

Зег

РЬе

Рго

РЬе

Туг 10

А1а

РЬе

Ьеи

Суз

РНе 15

С1у

С1п

Туг

РЬе

Уа1

А1а

Уа1

ТЬг

Нгз

А1а

Азр

11е

Уа1

Меб

ТНг

С1п

Зег

20

25

30

Рго

Зег

Ьеи

А1а

МеЬ

Зег

Уа1

С1у

С1п

Агд

Уа1

ТНг

Меб

Агд

Суз

35

40

45

Ьуз

Зег

61п

Зег

ьеи

Ьеи

Ьуз

Зег

ТЬг

Азп

С1п

Ьуз

Азп

Туг

Ьеи

50

55

60

А1а

Тгр

Туг

С1п

31п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Уа1

Туг

65

70

75

80

РЬе

А1а

Зег

ТЬг

Агд

С1и

Зег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

11е

С1у

Зег

85

90

95

Б1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Уа1

С1п

А1а

61и

100

105

но

Азр

Ьеи

А1а

Азр

Туг

РЬе

Суз

61п

О1Г1

Н1з

Туг

Азп

ТЬг

Рго

ТЬг

115

120

125

РЬе

С1у

А1а

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

Агд

Зег

Рго

Азп

С1у

А1а

130

135

140

Зег

ΗΪ3

Зег

С1у

Зег

А1а

Рго

Й1у

ТЬг

Зег

А1а

Зег

с1у

Зег

С1п

145

150

155

160

Уа1

Н1е

Ьеи

С1п

Зег

61у

А1а

С1и

Ьеи

МеТ

Ьуз

Рго

С1у

А1а

Зег

165

170

175

МеТ

Ьуз

11е

Зег

Суз

Ьуз

А1а

ТЬг

С1у

Туг

ТЬг

РНе

Зег

Туг

Тгр

180

185

190

Не

С1и

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Агд

Рго

С1у

Ηίδ

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

11е

С51у

195

200

205

61и

Не

Ьеи

Рго

С1у

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Туг

Азп

С1и

Ьуз

РЬе

Ьуз

210

215

220

- 53 014887

51 у 225

Ьуз

А1а

ТЬг

РЬе

ТЬг 230

А1а

Азр

ТЬг

Зег

Зег 235

Азп

ТЬг

А1а

Туг

Меб 240

01П

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЫ

Зег

5111

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Суз

А1а

245

250

255

Агд

Ьеи

Азр

Уа1

Азр

Зег

Тгр

51у

С1п

С1у

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

260

265

270

Зег

С1п

Рго

Не

Азр

ТЬг

Б1и

Зег

61п

ТЬг

Зег

Уа1

Азп

Ьеи

275

280

285

Меб

Аба

Азр

ТЬг

С1и

Зег

А1а

РЬе

А1а

ТЬг

51п

ТЬг

Азп

Зег

С1у

290

295

300

С1у

Ьеи

Азр

7а1

Уа1

61у

Ьеи

Не

Зег

Меб

А1а

Ьуз

Агд

51 и

С1и

С1у

305

310

315

320

51и

Рго

Ьуз

РНе

Уа1

Азп

С1п

ΗΪ3

Ьеи

Суз

51у

Зег

Н13

Ьеи

Уа1

С1и

325

330

335

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

61у

С1и

Агд

51у

РЬе

Туг

ТНг

Рго

Ьуз

340

345

350

А1а

Ьуз

С1у

Не

Уа1

5111

С1п

Суз

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

355

360

365

Туг

С1П

Ьеи

Е1и

Азп

Туг

Суз

Азп

Ьуз

Азр

51и

Ьеи

370

375

380

<210> 3 <211> 945 <2125 ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты слитого белка инсулина <400>3 абддсддаба садсбададд аасссабсас дабабсабсд дсададасса дбасссдабд60 абдддссдад ассдадасса дбассадабд бссддасдад дабсбдасба сбссаадбсб120

- 54 014887

аддсадаббд	сбааадсбдс	аасбдсбдбс	асадсбддбд	дббсссбссб	бдббсбсбсс	160
адссббассс	ббдббддаас	бдбсабадсб	ббдасбдббд	саасассбсб	дебед!ба!с	240
ббсадсссаа	бссббдбссс	ддсбсбсабс	асадббдсас	бссбсабсас	еддббббебб	300
бссбсбддад	ддбббддсаб	бдссдсбаба	ассдббббсб	еббддаббба	сдсаасддда	360
дадсасссас	адддабсада	саадббддас	адбдсаадда	бдаадббддд	аадсааадсб	420
саддабсбда	аадасададс	ЬсадбасЬас	ддасадсаас	абаебддбдд	ддаасабдас	480
сдбдассдба	сбсдбддбдд	ссадсасасб	ассабддсбд	адабсасссд	саббссбсбс	540
басаааддба	адбсбсбссд	бааддсдсбд	ааддаасабд	дасббсбада	адаеббеббд	600
садааасаас	адбабддсаб	сбсдадсаад	ббссаассаа	ббдабдасас	бдаабсссад	660
ассасдбсад	бдаассбсаб	ддссдабдаб	асбдададсд	сдбббдсбас	асааасаааб	720
бсдддаддбс	ббдасдббдб	сддаЫдабс	беса!ддс!а	адададаада	аддададссб	780
аадбббдбба	абсаасабсб	ббдбддабсб	сабсббдббд	аддсбсбсба	ссббдбдбдб	840
ддадааадад	дабббббсба	сасбссбаад	дебдебаадд	дааббдббда	асаабдббде	900
асйскаШ:	дсбсасббба	ссааббддад	аасбаббдса	аебда		945

<210> 4 <211> 314 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Слитый белок инсулина <400> 4

Меб А1а Азр ТЬг 1

А1а Агд 5

С1у ТНг

Н1з

ΗΪ3 10

Азр

Не

11е

С1у

Агд 15

Азр

С1п

Туг

Рго

Меб

Й1У

Агд

Азр

Агд

Азр

С1п

Туг

С1п

Меб

Зег

С1у

20

25

30

Агд

С1у

Зег

Азр

Туг

5ег

Ьуз

Зег

Агд

С1п

Т1е

А1а

Ьуз

А1а

ТЬг

35

40

45

- 55 014887

А1а Уа1

ТЬг А1а 61у

61у Зег 55

Ьеи Ьеи

Уа1

Ьеи

Зег 60

Зег

Ьеи

ТЬг

Ьеи

50

Уа1

61у

ТЬг

Уа1

Не

А1а

Ьеи

ТЬг

Уа1

А1а

ТЬг

Рго

Ьеи

Уа1

Не

65

70

75

80

РЬе

Зег

Рго

Не

Ьеи

Уа1

Рго

А1а

Ьеи

Не

ТЬг

Уа1

А1а

Ьеи

11е

85

90

95

ТЬг

61у

РЬе

Ьеи

Зег

61у

РЬе

61у

Не

А1а

Не

ТЬг

Уа1

100

105

но

РЬе

Зег

Тгр

Не

Туг

А1а

ТЬг

61у

61и

Ηί3

Рго

61п

С1у

Зег

Азр

Ьуз

115

120

125

Ьеи

Азр

Зег

А1а

Агд

Мер

Ьуз

Ьеи

С1у

Зег

Ьуз

А1а

61п

Азр

Ьеи

Ьуз

130

135

140

Азр

Агд

А1а

61п

Туг

С1у

61п

Н1з

ТЬг

61у

61и

Ηί3

Азр

145

150

155

160

Агд

Азр

Агд

ТЬг

Агд

С1у

61 у

С1п

Н15

ТЬг

Меб

А1а

61и

Не

ТЬг

165

170

175

Агд

Не

Рго

Ьеи

Туг

Ьуз

61у

Ьуз

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

А1а

Ьеи

Ьуз

61и

180

185

190

Н1з

С1у

Ьеи

61и

Азр

РЬе

Ьеи

61п

Ьуз

61п

Туг

61у

Не

Зег

195

200

205

Зег

Ьуз

РЬе

61п

Рго

Не

Азр

ТЬг

С1и

Зег

61п

ТЬг

Зег

Уа1

210

215

220

Азп

Ьеи

Меб

А1а

Азр

ТЬг

61и

Зег

А1а

РЬе

А1а

ТЬг

61п

ТЬг

Азп

225

230

235

240

Зег

61 у

61у

Ьеи

Азр

Уа1

61у

Ьеи

11е

Зег

Меб

А1а

Ьуз

Агд

61 и

245

250

255

61и

С1у

С1и

Рго

Ьуз

РЬе

Уа1

Азп

61п

Н1з

Ьеи

Суз

61у

Зег

Ηί з

Ьеи

260

265

270

Уа1

61и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

61у

61и

Агд

61у

РЬе

Туг

ТЫ

275

280

285

- 56 014887

Рго Ьуз А1а А1а Ьуз С1у Не Уа1 С1ц 61п Суз Суз ТНг Зег Не Суз

290 295300

Зег Ьеи Туг С1п Ьеи С1и Азп Туг Суз Азп

305310 <210>5 <211> 1011 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты слитого белка инсулина <400> 5

абдаасЫсс	11аад1с111	ссс111с1ас	дсШссШ	д£М:сдд11са	аЬасЫсд! 6	60
дсбдЫасдс	а!дсс!11д1	1аа1сааса1	С161д1дда6	с±саЪс£Лд1:	1даддс1с6с	120
1ассГ1д6д1	д!ддадааад	аддабббИс	6асас1сс1а	адас£адаад	ааадададда	180
аЫдЫдаас	аа!д!1дсас	11с1а111дс	6сас161асс	аа££ддадаа	с!а11дсаас	240
адаадааада	дадасаЫдб	дабдасасад	6с1сса6сс1	ссс1:ддс£а£	д!сад!ддда	300
садсдддбса	с1а1дсдс6д	саад1ссад!	сададссИ!	1:ааааад1:ас	саа!саааад	360
3301366149	ссбддбасса	дсадааасса	ддасад6с!с	с£ааас£1:с1;	ддбабасбЫ	420
дса!ссас1а	дддаабсбдд	ддбсссбда.1	сдсЫсаЬад	дсад£дда£с	1дддасада1	480
ббсасбсбба	ссабсадсад	1д1дсаддс1	даадасс!дд	садаЁЪас^Ъ	с1д!садсаа	540
саббаЬааса	сбссбсссас	дЫсддбдс!	дддассаад!	ЪддадсЪ^аа	дсдд!с!ссд	600
аасдд1дс61	С1са6адодд	Исбдсасса	ддсас1адс!	с£дса£с£дд	а1с1саддбд	660
сасс1дсадс	адбсбддадс	1дадс6да1д	аадссбдддд	сс'Ьсаа'Ьдаа	да!а6сс1дс	720
ааддс!ас1д	дс1асаса11	сад!адс6ас	1дда1адад1	ддд^ааадса	даддссбдда	780
сабддссббд	адбддаНдд	ададаНЫа	сс6ддсад1д	дЪадЁасЪас	с!асаа1дад	840
аадббсаадд	дсааддссас	аббсасбдса	дабаса!ссб	ссаасасадс	с!асабдсаа	900
сбсадсадсс	бдасабсбда	ддас6с1дсс	дЬсбаЫасб	д^дсаадаЦ	ддабдИдас	960
1сс6ддддсс	ааддсассас	1с1сасад1д	адсбсааадд	а£дадс£Ъ£д	а	1011

- 57 014887 <210> 6 <211> 336 <212> РНТ <213> Искусственная последовательность <220 <223> Слитый белок инсулина <400> 6

МеЬ 1

АЗП

РЬе

Ьеи

Ьуз 5

Зег

РНе

Рго

РЬе Туг 10

А1а

РЬе Ьеи

Суз

РЬе 15

С1у

61п

Туг

РЬе

Уа1

А1а

Уа1

ТЬг

ΗΪ3

А1а

РЬе

Уа1

Азп

С1п

ΗΪ3

Ьеи

Суз

20

25

30

61у

8ег

Ηί з

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

35

40

45

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

ТЬг

Агд

Ьуз

Агд

С1у

11е

Уа1

С1и

С1п

50

55

60

Суз

ТЬг

8ег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

65

70

75

80

Агд

Ьуз

Агд

Азр

11е

Уа1

Ме£

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Зег

Ьеи

А1а

85

90

95

Ме1

8ег

Уа1

01 у

С1п

Агд

Уа1

ТЫ

МеЬ

Агд

Суз

Ьуз

Зег

С1п

Зег

100

105

110

Ьеи

Ьуз

8ег

ТЬг

Азп

С1п

Ьуз

Азп

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

Б1п

С1п

115

120

125

Ьуз

Рго

С1у

81п

8ег

Рго

Ьуз

Ьеи

Уа1

Туг

РЬе

А1а

Зег

ТЬг

Агд

130

135

140

61и

Зег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Т1е

С1у

Зег

Й1у

Зег

61у

ТЬг

Азр

145

150

155

160

- 58 014887

РНе

ТАг

Ьеи

ТНг

Не 165

Зег

7а1

С1п

А1а 170

С1и Азр

Ьеи А1а

Азр 175

Туг

РНе

Суз

61п

С1п

ΗΪ3

Туг

Азп

ТНг

Рго

ТНг

РНе

61у

А1а

61у

ТНг

180

185

190

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

Агд

Зег

Рго

Азп

61у

А1а

Зег

Нгз

Зег

61у

Вег

195

200

205

А1а

Рго

С1у

ТНг

Зег

А1а

Зег

С1у

Зег

61п

Уа1

Н13

Ьеи

С1п

210

215

220

Зег

С1у

А1а

С1и

Ьеи

Мер

Ьуз

Рго

61у

А1а

Зег

МеС

Ьуз

11е

Зег

Суз

225

230

235

240

Ьуз

А1а

ТНг

С1у

Туг

ТАг

РНе

Зег

Туг

Тгр

11е

61 и

Тгр

Уа1

Ьуз

245

250

255

С1п

Агд

Рго

С1у

Низ

61у

Ьеи

С1и

Тгр

11е

С1у

61и

11е

Ьеи

Рго

61у

260

265

270

Зег

б1у

Зет

ТНг

Туг

Азп

С1и

Ьуз

РНе

Ьуз

61 у

Ьуз

А1а

ТНг

РНе

275

280

285

ТНг

А1а

Азр

ТНг

Зег

Азп

ТАГ

А1а

Туг

МеС

С1п

Ьеи

Зег

Ьеи

290

295

300

ТНг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

Ьеи

Азр

Уа1

Азр

305

310

315

320

Зег

Тгр

61у

С1п

С1у

ТАг

Ьеи

ТНг

Уа1

Зег

Ьуз

Азр

61и

Ьеи

325

330

335

<210>	7
<211>	110
<212>	РНТ
<213>	Ното
<400	7

МеЕ А1а Ьеи Тгр МеЕ Агд Ьеи Ьеи Рго Ьеи Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Ьеи

10 15

- 59 014887

Тгр 61у

Рго

Азр 20

Рго

А1а

РНе 25

Уа1

Азп

31п

Низ

Ьеи 30

Суз

С1у

Зег Н1з

Ьеи 35

Уа1

611Л

А1а

Ьеи

Туг 40

Ьеи

Уа1

Суз

31у

61и 45

Агд

61у

РНе

РНе Туг 50

ТЬг

Рго

Ьуз

ТЬг

Агд 55

Агд

С1и

А1а

С1и

Азр 60

Ьеи

С1п

Уа1

С1у

С1п Уа1 65

61и

Ьеи

61у

С1у 70

С1у

Рго

С1у

А1а

С1у 75

Зег

Ьеи

01 п

Рго

Ьеи 80

А1а Ьеи

61и

С1у

Зег 85

Ьеи

С1П

Ьуз

Агд

С1у 90

Не

Уа1

С1и

С1п

Суз 95

Суз

ТЬг Зег

Не

Суз 100

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи 105

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп 110

<210?

8

<211>

31

<212>

РК.Т

<213>

Едииз рг2еиа1зкН

<400>

8

31и А1а 1

61и

Азр

Рго 5

61п

ν&ι

61у

61и

Уа1 10

61и

Ьеи

31 у

61у

31у 15

Рго

Б1у Ьеи

С1у

С1у 20

Ьеи

С1п

Рго

Ьеи

А1а 25

Ьеи

А1а

С1у

Рго

31П 30

С1п

<210> 9 <211> 86 <212> ₽КТ <213> Едииз саЬа11из <220>

- 60 014887 <221> ΜΙ3Ο_ΡΕΑΤ0ΡΕ <222> (31).,(32) <223> X = любая аминокислота <220>

<221> М13С_ЕЕАТСКЕ <222> (64)..(65) <223> X = любая аминокислота <400> 9

РЬе 1

Уа1

Азп

С1п

Н13 5

Ьей

Су5

С1у

Зег

ΗΪ3 10

Ьей Уа1

С1и

А1а

Ъеи 15

Туг

Ьеч

Уа1

Суз

61у

С1и

Агд

С1у

РЬе

РНе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

А1а

Хаа

20

25

30

31и

А1а

Е1и

Азр

Рго

С1п

Ча1

С1у

С1и

Ча!

С111

Ьей

С1у

Рго

35

4 2

45

СИ у

Ьей

61 у

С1у

Ьей

61п

Рго

Ьей

А1а

Ьей

А1а

С1у

Рго

С1п

Хаа

50

55

60

Хаа

61у

Не

Уа1

С1и

С1п

Суз

ТЬг

С1у

Не

Суз

Зег

Ьей

Туг

С1п

65

70

75

80

Ьей

С1и

Азп

Туг

Суз

Аэп

<210>	10
<211>	110
<212>	РЯТ
<213>	0гус£о1ади5 сип1си1из
<400>	10

МеЬ А1а Зет Ьей А1а А1а Ьей Ьей Рго Ьеи Ьей А1а Ьей Ьей Уа1 Ьей

10 15

- 61 014887

Суз

Агд

Ьеи

Азр 20

Рго

А1а 51п А1а

РНе Уа1 Азп 25

С1п

Н13

Ьеи 30

Суз

51у

Зег

Н1з

Ьеи

Уа1

61ц

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

51у

РНе

35

40

45

РНе

Туг

ТНг

Рго

Ьуз

Зег

Агд

С1и

Уа1

С1и

Ьеи

61п

Уа1

С1у

50

55

60

С1п

А1а

С1и

Ьеи

С1у

Рго

С1у

А1а

61у

Ьеи

61п

Рго

Зег

65

70

75

80

А1а

Ъеи

51и

Ьеи

А1а

Ьеи

С1 п

Ьуз

Агд

51 у

11е

Уа1

61и

51п

Суз

85

90

95

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

51п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

110

<210> 11 ' ' <211> 21 <212> РЕТ <213> Ва1аепорОега рИуза1из <400> 11

С1у 11е Уа1 С1и С1п Суз Суз ТНг 5ег 11е Суз 8ег Ьеи Туг С1п Ьеи 1 5 10 15

61и Азп Туг Суз Азп <210> 12 <211> 21 <212> РЕТ <213> Ва1аепор1.ега Ьогеа11з <400 12

- 62 014887

С1у Не Уа1 С1и С1п Суз Суз А1а Зег ТЬг

5 10

Суз Зег Ьеи Туг С1п Ьеи

С1и Азп Туг Суз Азп 20 <210> 13 <211> 108 <212> РЕТ <213> Зиз зсго£а <400> 13

Мее 1

А1а

Ъеи

Тгр

ТЬг 5

Агд

Ьеи Ьеи

Рго

Ьеи 10

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а 15

Ьеи

Тгр

А1а

Рго

А1а

Рго

А1а

31п

А1а

РЬе

Уа1

Азп

С1п

Н1з

Ьеи

Суз

С1у

20

25

30

Зег

Н1з

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

61у

С1и

Агд

С1у

РНе

35

40

45

РНе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

А1а

Агд

С1и

А1а

С1и

Азп

Рго

С1п

А1а

С1у

50

55

60

А1а

Уа1

С1и

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

61у

Ьеи

С1п

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

65

70

75

80

С1и

61у

Рго

С1п

Ьуз

Агд

С1у

11е

Уа1

С1и

51п

Суз

ТНг

Зег

85

90

95

11е

Суз

Зег

Ьеи

Туг

б1п

Ьеи

Е1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

<210>	14
<211>	21
<212>	РЕТ
<213>	Е1ерНаз таххтиз

- 63 014887 <400>14

С1у Не Уа1 01и С1п Суз Суз ТЬг С1у Уа1 Суз Зег 1еи 1 510

Туг С1П. Ьеи

61и. Азп Туг Суз Азп <210>15 <211>105 <212> РКТ <213> Воз Саигиз <400> 15

МеС 1

А1а

Ьеи Тгр

ТЬг 5

Агд Ьеи

Агд

Рго Ьеи 10

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а 15

Ьеи

Тгр

Рго

А1 а

Агд

А1а

РЬе

Уа1

Азп

61п

Н1з

Ьеи

Суз

С1у

20

25

30

Зег

Н1з

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Реи

Туг

Реи

Уа1

Суз

С1у

61 и

Агд

61у

РЬе

35

40

45

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ъуз

А1а

Агд

С1и

Уа1

С1и

С1у

Рго

61п

Уа1

С1у

50

55

60

А1а

Ьеи

С1и

Ьеи

А1а

61у

С1у

Рго

С1у

А1а

С1у

61у

Ьеи

С1и

61у

Рго

65

70

75

80

Рго

61п

Вуз

Агд

С1у

11е

Уа1

61и

С1п

Суз

А1а

Зег

Уа1

Суз

Зег

85

90

95

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100 105

<210>	16
<211>	105
<212>	РВ.Т
<213>	Ονί.5

аггез

- 64 014887 <400> 16

Меб 1

Аба

Ьеи

Тгр

ТНг 5

Агд

Ьеи Уаб

Рго

Ьеи 10

Ьеи

Аба

Ьеи Ьеи

Аба 15

Ьеи

Тгр

Аба

Рго

Аба

Рго

Аба

Нбз

Аба

РНе

Уаб

Азп

Сбп

Нбз

Ьеи

Суз

Сбу

20

25

30

Зег

Нбз

Ьеи

Уаб

Сби

Аба

Ьеи

Туг

Ьеи

Уаб

Суз

Сбу

Сби

Агд

Сбу

РЬе

35

40

45

РЬе

Туг

ТНг

Рго

Ьуз

Аба

Агд

Сби

Уаб

Сби

Сбу

Рго

Сбп

Уаб

С1у

50

55

60

Аба

Ьеи

Сби

Ьеи

Аба

Сбу

Рго

Сбу

Аба

Сбу

Ьеи

Сби

Сбу

Рго

65

70

75

80

Рго

Сбп

Ьуз

Агд

Сбу

I бе

Уаб

Сби

Сбп

Суз

Аба

Сбу

Уаб

Суз

Зег

85

90

95

Ьеи

Туг

Сбп

Ьеи

Сби

Азп

Туг

Суз

Азп

100

605

<210>17 <211> 21 <212> РКТ <213> Сагаебиз РгогаесЗагбез <400>17

Сбу 11е Уаб Сби Сбп Суз Суз Аба Зег Уаб Суз Зег Ьеи Туг Сбп Ьеи

1015

Сби Азп Туг Суз Азп

<210>	18
<211>	110
<212>	РРТ

- 65 014887 <213> СапЬз зр.

<400> 18

Меб 1

А1а

Ьеи

Тгр

Меб 5

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи Ьеи 10

А1а

Ьеи

А1а 15

Ьеи

Тгр

А1а

Рго

А1а

Рго

ТНг

Агд

А1а

РНе

Уа1

Азп

С1п

Н1з

Ьеи

Суз

С1у

20

25

30

Зег

Н1з

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Тух

Ьеи

Уа1

Суз

61у

С1и

Агд

С1у

РНе

35

40

45

Рбе

Туг

ТНг

Рго

Ьуз

А1а

Агд

С1 и

Уа1

С1и

Азр

Ьеи

61п

Уа1

Агд

50

55

60

Азр

Уа1

С1и

Ьеи

А1а

С1у

А1а

Рго

С1у

С1и

61 у

61у

Ьеи

С1п

Рго

Ьеи

65

70

75

Й0

А1а

Ьеи

С1и

С1у

А1а

Ьеи

61п

Ьуз

Агд

<31у

11е

Уа1

61и

С1п

Суз

35

90

95

ТЬх

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

61 и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

110

<210>	19
<211>	21
<212>	РНТ
<213>	Нузбгхх сгЬзбаба

<400> 19
Й1у 11е Уа1	Азр С1п Суз Суз	ТНг 61у Уа1	Суз Зех Ьеи Туг С1п Ьеи
1	5	10	15

61л Азп Туг Суз Азп <210> 20 <211> 108

- 66 014887 <212> РКТ <213> Ао£из СгхдЬгдабиз <400> 20

Мео 1

А1а

Ьеи

Тгр

МеО 5

Ηίδ

Ьеи

Рго

Ьеи Ьеи 10

А1а

Ьеи

А1а 15

Ьеи

Тгр

61у

Рго

С1и

Рго

А1а

Рго

А1а

РЬе

7а1

Азп

С1п

Н1з

Ьеи

Суз

61у

20

25

30

Рго

Ηίδ

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

61у

РЬе

35

40

45

РЬе

Туг

А1а

Рго

Ьуз

ТЬг

Агд

С1и

А1а

С1и

Азр

Ьеи

С1п

Уа1

61 у

50

55

60

61п

Уа1

С1и

Ьеи

61у

С1у

61у

Зег

Не

ТЬг

С1у

Зег

Ьеи

Рго

Ьеи

65

70

75

80

С1и

61у

Рго

Не!

С1п

Ьуз

Агд

61у

УаЬ

Уа1

Азр

С1п

Суз

ТЬг

Зег

85

90

95

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

51п

Ьеи

αΐη

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

<210>

21

<211>

НО

<212>

РЕТ

<213>

Масаса £аз1си1аг!з

<400>

21

МеО

А1а

Ьеи

Тгр

МеЬ

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

1

5

10

15

Тгр

61у

Рго

Азр

Рго

А1а

Рго

А1а

РНе

Уа1

Азп

С1п

Ыз

Ьеи

Суз

С1у

20

25

30

Зег

ΗΪ3

Ьеи

Уа1

61и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

61и

Агд

С1у

РЬе

35

40

45

- 67 014887

РЬе

Туг 50

ТЬг Рго

Ьуз

ТЬг

Агд 55

Агд

61и

А1а

61и

Азр 60

Рго

Й1п

Уа1

61у

51η

Уа1

С1и

Ьеи

С1у

61у

Рго

61у

А1а

61у

Зег

Ьеи

61п

Рго

Ьеи

65

70

75

80

А1а

Ьеи

С1и

61у

Вег

Ьеи

С1п

Ьуз

Агд

<31у

11е

Уа1

61и

61п

Суз

85

90

95

ТЬг

Зег

Не

Суэ

Зег

Ьеи

Туг

61п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

110

<2Ю> :

22

<211>

110

<212> 1

РКТ

<213> (

?егсорлЛЪ.есиз ае^Ыорз

<4оо> :

22

Мер

А1а

Ьеи

Тгр

МеЬ

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

1

5

10

15

Тгр

еьу

Рго

Азр

Рго

Уа1

Рго

А1а

РЬе

Уа1

Азп

С1п

Н1з

Ьеи

Суз

51 у

20

25

30

Зег

Ηΐδ

Ьеи

Уа1

61и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

51у

С1и

Агд

б1у

РЬе

35

40

45

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

ТЬг

Агд

61и

А1а

61и

Азр

Рго

61п

Уа1

61у

50

55

60

С1п

Уа1

С1и

Ьеи

С1у

61 у

Рго

С1у

А1а

61у

Зег

Ьеи

61п

Рго

Ьеи

65

70

75

80

А1а

Ьеи

61и

С1у

Вег

Ьеи

С1п

Ьуз

Агд

С1у

11е

Уа1

61и

С1п

Суз

85

90

95

ТЬг

Зег

11е

Суз

Зег

Ьеи

Туг

61 η

Ьеи

61и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

110

- 68 014887

<210>	23
<211>	110
<212>	РКТ
<213>	Рап бгсд1ойубез

<400> 23

Меб 1

А1а

Ьеи

Тгр

Меб 5

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи 10

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а 15

Ьеи

Тгр

С1у

Рго

Азр

Рго

А1а

Зег

А1а

РЬе

νβΐ

Азп

СТп

Низ

Ьеи

Суз

С1у

20

25

30

5ег

Низ

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

РЬе

35

40

45

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

ТЬг

Агд

С1и

А1а

С1и

Авр

Ьеи

С1п

Уа1

.С1у

50

55

60

С1п

Уа1

61и

Ьеи

61у

С1у

Рго

С1у

А1а

С1у

5ег

Ьеи

С1п

Рго

Ьеи

65

70

75

80

А1а

Ьеи

С1и

С1у

Зег

Ьеи

61п

Ьуз

Агд

С1у

Не

Уа1

61и

С1п

Суз

85

90

95

ТЬг

Зег

11е

Суз'

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

110

<210>24 <211> 21 <212> РЕТ <213> ОгпгбЬогЬупсЬиз апаНлиз <400>24

С1у Не Уа1 С1и С1и Суз Суз Ьуз С1у Уа1 Суз Зег Меб 1 510

Туг С1п Ьеи

С1и Азп Туг Суз Азп

<210>	25
<211>	65
<212>	РКТ
<213>	Ропдо рудтаеиз
<400>	25

Суз С1у 1

Зег

Н1з

Ьеи 5

Уа1

61и

А1а

Ьеи

Туг 10

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и 15

Агд

С1у РЬе

РЬе

Туг 20

ТЬг

Рго

Ьув

ТЬг

Агд 25

Агд

Б1ц

А1а

С1и

Авр 30

Ьеи

С1п

Ча1 61у

С1п 35

Уа1

С1и

Ьеи

С1у

С1у 40

Б1у

Рго

С1у

А1а

С1у 45

8ег

Ьеи

С1п

Рго Ьеи 50

А1а

Ьеи

61и

Б1у

Зег 55

Ьеи

61п

Ьуз

Агд

Е1у 60

Не

Уа1

Б1и

Б1п

Су5 65

<210>

26

<211>

110

<212>

РКТ

<213>

ЕогШа догШа

<400>

26

Мер А1а 1

Ьеи

Тгр

МеЪ 5

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи 10

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а 15

Ьеи

Тгр С1у

Рго

Азр 20

Рго

А1а

РЬе 25

Уа1

Азп

Б1п

Н1з

Ьеи 30

Суз

С1у

5ег Нхз

Ьеи 35

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг 40

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и 45

Агд

С1у

РЬе

- 70 014887

РЬе

Туг 50

ТЬг

Рго Ьуз

ТЬг

Агд Агд 55

СЬи А1а

61и Азр 60

Ьеи

61п

Уа1

С1у

С1п

Уа1

61и

Ьеи

С1у

(31у

61у

Рго

(Ну

А1а

61у

Зег

Ьеи

61П

Рго

Ьеи

65

70

75

80

А1а

Ьеи

<31и

С1у

Зег

Ьеи

С1п

Ьуз

Агд

61 у

Не

Уа1

С1и

С1п

Суе

Суз

85

90

95

ТЬг

Зег

Не

Суя

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

61и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

НО

<210>

27

<211>

51

<212>

РКТ

<213>

За1п>1г1 :

зсиигеиз

<400>

27

РЬе

Уа1

Азп

(31п

Ηίε

Ьеи

Суз

61у

Рго

Н13

Ьеи

Уа1

61и

А1а

Ьеи

Туг

1

5

10

15

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

(Ни

Агд

(Ну

РЬе

Туг

А1а

Рго

Ьуз

ТЬг

61у

Уа1

20

25

30

Уа1

Азр

С1п

Суз

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

С1п

Азп

40 45

Туг Сув Азп

<210>	2Θ
<211>	но
<212>	РКТ
<213>	Сг1себи1из 1опд1саи<5.абиз
<400>	23

Меб ТЬг Ьеи Тгр Меб Агд Ьеи Ьеи Рго Ьеи Ьеи ТЬг Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи 15 10 15

- 71 014887

Тгр 61α Рго

Азп 20

Рго

А1а С1п А1а

РНе 25

Уа1

Азп

С1п

Н13

Ьеи 30

Суз

С1у

Зег

ΗΪ3

Ъеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

61у

61и

Агд

С1у

РНе

35

40

45

РНе

Туг

ТНг

Рго

Ьуз

Зег

Агд

С1у

Уа1

61и

Азр

Рго

61п

Уа1

А1а

50

55

60

61п

Ъеи

С1и

Ьеи

31у

С1у

Рго

С1у

А1а

Азр

Ьеи

С1п

ТНг

Ьеи

65

70

75

80

А1а

Ьеи

С1и

Уа1

А1а

С1п

Ьуз

Агд

С1у

11е

Уа1

Азр

С1п

Суз

85

90

95

ТНг

Зег

11е

Суе

Зег

Ьеи

Туг

Б1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

110

<210>

29

<211>

110

<212>

РКТ

<213>

КаЫ;1Дз пог^д!сиз

<400>

29

МеН

А1а

Ьеи

Тгр

Мер

Агд

РНе

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

Ъеи

Уа1

Ьеи

1

5

10

15

Тгр

С1и

Рго

Ьуз

Рго

А1а

С1п

А1а

РНе

Уа1

Ьуз

Б1п

ΗΪ3

Ьеи

Суз

С1у

20

25

30

Рго

ΗΪ3

Ьеи

Уа1

31и

А1а

Ьеи

Туг

Ъеи

Уа1

Суз

С1у

61и

Агд

61у

РНе

35

40

45

РЬе

Туг

ТНг

Рго

Ьуз

Зег

Агд

С1и

Уа1

С1и

Азр

Рго

С1п

Уа1

Рго

50

55

60

61п

Ъеи

<31и

Ьеи

61у

Рго

С1и

А1а

61у

Азр

Ъеи

С1п

ТНг

Ьеи

65

70

75

80

- 72 014887

А1а Ьеи С1и Уа1 А1а Агд С1п Ьуз Агд 61у Не Уа1 Азр Б1п Суз Суз

9095

ТЬг Зег Не Суз Зег Ьеи Туг 61п Ьеи С1и Азп Туг Суз Азп

100 105110 <210>30 <211> 110 <212> РК.Т <213> КаЬЬиз погуедхсиэ <400> 30

МеЬ 1

А1а

Ьеи Тгр

11е Агд 5

РЬе

Ьеи

Рго

Ьеи Ьеи 10

А1а

Ьеи

Не 15

Ьеи

Тгр

61и

Рго

Агд

Рго

А1а

С1п

А1а

РЬе

Уа1

Ьуз

С1п

Н1з

Ъеи

Суз

С1у

20

25

30

Зег

Н1з

Ьеи

Уа1

61и

АЬа

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

61у

РЬе

35

40

45

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

МеЬ

Зег

Агд

С1и

Уа1

61и

Азр

Рго

61п

Уа1

А1а

50

55

60

С1п

Ьеи

С1и

Ьеи

С1у

Рто

61у

АЬа

С1у

Азр

Ьеи

61п

ТЬг

Ьеи

65

ТО

75

80

А1а

Ьеи

С1и

Уа1

АЬа

Агд

С1п

Ьуз

Агд

61у

Не

Уа1

Азр

61п

Суз

85

90

95

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

но

<210>	31
<211>	21
<212>	РКТ
<213>	Асогпуз саМгЬпиз

- 73 014887

<400>	31
С1у 11е 1	Уа1	Азр	Е1п 5	Суз	Суз	ТЬг
Е1и Азп	Туг	Суз 20	Азп
<210>	32
<211>	108
<212>	РКТ
<213>	Миз тизси1из
<400>	32
Ме! А1а 1	Ьеи	Ьеи	Уа1 5	Н1з	РНе	Ьеи
Тгр С1и	Рго	Ьуз 20	Рго	ТНг	61п	А1а
Рго Низ	Ьеи 35	Уа1	С1и	А1а	Ьеи	Туг 40
РНе Туг 50	ТНг	Рго	Ьуз	Зег	Агд 55	Агд
С1п Ьеи 65	Е1и	Ьеи	61у	Е1у 70	Зег	Рго
61и Уа1	А1а	Агд	61 п 85	Ьуз	Агд	61у
Не Суз	Зег	Ьеи 100	Туг	Е1п	Ьеи	С1и
<210>	33
<211>	но
<212>	РКТ
<213>	Миз ι	тизси1из

Зег Не Суз Зег Ьеи Туг Е1п Ьеи

15

Рго Ьеи Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Ьеи

15

РНе Уа1 Ьуз С1п Ηίε Ьеи Суз Е1у

30

Ьеи Уа1 Суз С1у 61и Агд Е1у РНе

С1и Уа1 С1и Азр Рго С1п Уа1 Е1и ео

Б1у Азр Ьеи Е1п ТЬг Ьеи А1а Ьеи

80

Не Уа1 Азр 61п Суз Суз ТНг Зег

95

Азп Туг Суз Азп

105

- 74 014887 <400> 33

МеЬ 1

А1а

Ьей

Тгр

МеЬ 5

Агд

РНе

Ъеи

Рго

Ъеи 10

Ъеи

А1а

Ъеи

РЬе 15

Ъеи

Тгр

61и

Зег

ΗΪ3

Рго

ТЬг

61п

А1а

РНе

Уа1

Ъуз

С1п

Н15

Ьей

Суз

61 у

20

25

30

Зег

Ηί 5

Ьей

Уа1

61и

А1а

Ьей

Туг

Ьей

Уа1

Суз

С1у

61и

Агд

61 у

РНе

35

40

45

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

МеЬ

Зег

Агд

С1и

Уа1

61и

Азр

Рго

С1п

Уа1

А1а

50

55

60

С1п

Ьей

С1и

Ьей

С1у

61 у

61у

Рго

С1у

А1а

С1у

Азр

Ъеи

С1п

ТЬг

Ъеи

65

70

75

80

А1а

Ьей

61и

Уа1

А1а

С1п

Ъуз

Агд

С1у

Не

Уа1

Азр

61п

Суз

85

90

95

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ъеи

Туг

С1п

Ъеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

НО

<210>34 <211> 21 <212> РЙ.Т <213> СЫпсЬШа ЬгечисаиИаЬа <400>34

С1у Не Уа1 Азр й1п Суз Суз ТЬг Зег

Не Суз ТЬг Ьей Туг

61п Ьей й!и Азп Туг Суз Азп

<210>	35
<211>	110
<212>	Р8Т

- 75 014887 <213> Сауга рогсе11из <400> 35

Мер

А1а

Ьеи

Тгр

Меб

НЬз

Ьеи

ТНг

Уа,1

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

1

5

10

15

Тгр

С1у

Рго

Азп

ТНг

С1у

С1п

А1а

Рке

Уа1

Зег

Агд

Н1з

Ьеи

Суз

С1у

20

25

30

Зег

АЗП

Ьеи

Уа1

С1и

ткг

Ьеи

Туп

Зег

Уа1

Суз

С1п

Азр

С1у

РНе

35

40

45

РНе

Туг

11е

Рго

Ьуз

Азр

Агд

С1и

Ьеи

С1и

Азр

Рго

С1п

Уа1

С1и

50

55

60

61п

Ткг

61и

Ьеи

С1у

Мек

С1у

Ьеи

С1у

А1а

С1у

Ьеи

С1п

Рго

Ьеи

65

70

75

80

А1а

Ьеи

С1и

Мер

А1а

Ьеи

С1п

Ьуз

Агд

Б1у

11е

Уа1

Азр

С1п

Суз

85

90

95

Ткг

61 у

ТЬг

Суз

ТНг

Агд

Низ

С1п

Ьеи

61п

Зег

Туг

Суз

Азп

100

105

110

<210>

36

<21:

1>

109

<212>

ркт

<21:

3>

ОсОобоп <

Зедиз

<4 0!

э>

36

Мек

А1а

Рго

Тгр

Меб

ΗΪ3

Ьеи

Ткг

Уа1

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

1

5

10

15

Тгр

С1у

Рго

Азп

Зег

Уа1

С1п

А1а

Туг

Зег

61П

Н1з

Ьеи

Суз

61у

20

25

30

Зег

Азп

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

Меб

Ткг

Суз

С1у

Агд

Зег

С1у

Рке

35

40

45

- 76 014887

Туг Агд 50

Рго

Нбз

Азр

Агд

Агд 55

Сби

Ьеи

Сби

Азр

Ьеи 60

Сбп

Уаб

Сби

Сбп

Аба С1и 65

Ьеи

Сбу

Ьеи

61и 70

Аба

Сбу

Ьеи

Сбп 75

Рго

Зег

Аба

Ьеи

Сби 80

Меб 11е

Ьеи

Сбп

Ьуз 85

Агд

Сбу

1бе

Уаб

Азр 90

Сбп

Суз

Азп

Азп 95

Не

Суз ТЬг

РЬе

Азп 100

Сбп

Ьеи

Сбп

Азп

Туг 105

Суз

Азп

Уа1

Рго

<210>

37

<211>

21

<212>

РКТ

<213>

ОЫебрЬбз убгдбпбапа

<4 С0>

37

Сбу Не 1

Уаб

Сби

Сбп 5

Суз

Азп

Зег

Не 10

Суз

Зег

Ьеи

Туг

Сбп 15

Ьеи

Сби ТЬг

Туг

Суз 20

Азп

<210>

38

<211>

108

<212>

РНТ

<213>

КобепЫа

зр.

<400>

38

Меи Аба 1

Ьеи

Тгр

Не 5

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьеи 10

А1а

Ьеи

Не

Ьеи 15

Тгр

Сбу Рго

Азр

Рго 20

Аба

Сбп

Аба

РЬе

Уаб 25

Азп

Сбп

Нбз

Ьеи

Суз 30

Сбу

Зег

Нбз Ьеи

1 Уаб 35

Сби

Аба

Ьеи

Туг

11е 40

Ьеи

Уаб

Суз

Сбу

Сби 45

Агд

Сбу

РЬе

- 77 014887

РЬе

Туг ТЬг 50

Рго

Мер

Зег Агд 55

Агд

С1и Уа1

61и

Азр 60

Рго

61п

Уа1

61у

61η

Уа1

61и

Ьеи

С1у

А1а

61у

Рго

61у

А1а

61у

Зег

61и

С1п

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

А1а

Ьеи

61и

Уа1

А1а

Агд

61п

А1а

Агд

11е

Уа1

61п

С1п

Суз

ТЬг

Зег

85

90

95

61у

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

61п

61и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

<2ΐο> :

39

<211>

110

<212> :

РКТ

<213>

Рзаггшюгпуэ оЬезиз

<400>

39

Мек

А1а

Ьеи

Тгр

Мек

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

РЬе

Ьеи

11е

Ьеи

1

5

10

15

Тгр

61и

Рго

Зег

Рго'

А1а

Н1з

А1а

РЬе

Уа1

Азп

С1п

Н1з

Ьеи

Суз

61у

20

25

30

Зег

Ηί.3

Ьеи

νβΐ

Ши

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

61у

61 и

Агд

С1у

РЬе

35

40

45

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

РЬе

Агд

С1у

7а1

Азр

Рго

61П

МеЬ

Рго

50

55

60

С1п

Ьеи

61и

Ьеи

С1у

Зег

Рго

61у

А1а

61у

Азр

Ьеи

Агд

А1а

Ьеи

65

70

75

80

А1а

Ьеи

61и

УаЬ

А1а

Агд

Θΐη

Ьуз

Агд

61у

Не

Уа1

61и

61п

Суз

85

90

95

ТЬг

С1у

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

61и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

НО

- 78 014887 <210> 40 <211> 110 <212> РКТ <213> ЗрегторННиз бг1с1есега11пеаСин <400> 40

Меб 1

А1а

Ьеи

Тгр

ТЬг 5

Агд

Ьеи Ьеи

Рго

Ьеи 10

Ьеи А1а

Ьеи

А1а 15

Ьеи

С1у

Рго

Азр

Рго

А1 а

СЬп

А1а

РЬе

Уа1

Азп

С1п

Н13

Ьеи

Суз

61у

20

25

30

Зег

НЬз

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

УаЬ

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

РЬе

35

40

45

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

Зег

Агд

С1и

Уа1

С1и

61и

61п

Й1п

С1у

50

55

60

61п

Уа1

С1и

Ьеи

С1у

Е1у

51у

Рго

61у

АЬа

61у

Ьеи

Рго

61п

Рго

Ьеи

65

70

75

80

А1а

Ьеи

31и

Меб

А1а

Ьеи

С1п

Ьуз

Агд

С1у

Не

Уа1

С1и

61п

Суз

85

90

95

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

но

<210>

41

<211>

29

<212>

РЕТ

<213>

Са^1а рогсе11из

<400>

41

С1и

Ьеи

С1и

Азр

Рго

61п

Уа1

С1и

С1п

ТЬг

С1и

Ьеи

С1у

Меб

С1у

Ьеи

1

5

10

15

С1у А1а

С1у

61у

Ьеи

С1п

Рго

Ьеи

С1п

С1у

А1а

Ьеи

С1п

25

<210>	42
<211>	107
<212>	РЕТ
<213>	Ва11из да11из
<400>	42

Меб А1а 1

Ьеи

Тгр

Не 5

Агд

Зег Ьеи

Рго

Ьеи 10

Ьеи А1а

Ьеи

Уа1 15

РНе

Зег

С1у

Рго

С1у

ТНг

Зег

Туг

А1а

Азп

С1п

Шз

Ьеи

Суз

С1у

20

25

30

Зег

Н1з

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

РНе

35

40

45

РНе

Туг

Зег

Рго

Ьуз

А1а

Агд

Азр

Уа1

'61 и

С1п

Рго

Ьеи

Уа1

Зег

50

55

60

Зег

Рго

Ьеи

Агд

С1у

С1и

А1а

61у

Ца1

Ьеи

Рго

РНе

С1п

С1и

Е1и

65

70

75

80

Туг

С1и

Ьуз

Уа1

Ьуз

Агд

51у

Не

Уа1

С1и

С1П

Суз

Н18

Азп

ТНг

85

90

95

Суз

Зег

Ьеи

Туг

Е1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

<210> 43 <211> 81 <212> РЕТ <213> Апаз р1абугЬупсЬое <220>

<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <222> (31)..(32)

- 80 014887 <223> X = любая аминокислота <220>

<221> М13С_ГЕАТ0КЕ <222> (59)..(60) <223> X = любая аминокислота <400> 43

А1а А1а 1

Азп

61п

Н1з 5

Ьеи

Суз

61 у

Зег

НЬз 10

Ьеи Уа1

С1и

А1а

Ьеи 15

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

51у

С1и

Агд

С1у

РНе

РЬе

Туг

Зег

Рго

Ьуз

ТНг

Хаа

20

25

30

Азр

Уа1

С1и

С1п

Рго

Ьеи

Уа1

Азп

С1у

Рго

Ьеи

НЬз

61у

С1и

Уа1

61у

35

40

45

61и

Ьеи

Рго

РНе

61п

Н1з

С1и

Туг

С1п

Хаа

С1у

11е

Уа1

С1и

50

55

60

С1п

Суз

С1и

Азп

Рго

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

61и

Азп

Туг

Суз

65

70

75

80

Азп <210>44 <211> 21 <212> РЕТ <213> Апэег апзег <400>44

61у 11е Уа1 С1и 61п Суз Суз С1и Азп Рго Суз Зег Ьеи Туг 61п Ьеи 15 1015

С1и Азп Туг Суз Азп

- 81 014887

<210>	45
<211>	103
<212>	РЙТ
<213>	8е1азрЬогиз гиРиз
<400>	45

11е 1

С1п

Зег

Леи

Рго 5

Леи

А1а

Леи

Леи 10

А1а

Леи

Зег

61 у

Рго 15

61у

ТЬг

Зег

Н1з

А1а

Уа1

Азп

61п

ΗΪ3

Леи

Суз

61у

Зег

Ηίδ

Леи

Уа1

20

25

30

С1и

А1а

Леи

Туг

Леи

Уа1

Суз

С1у

61и

Агд

61у

РЬе

Туг

Зег

Рго

35

40

45

Луз

А1а

Агд

Азр

А1а

61и

Н15

Рго

Леи

Уа1

Азп

61у

Рго

Леи

НЛз

50

55

60

е1у

61 и

νβΐ

61у

Азр

Леи

Рго

РЬе

61п

С1и

61 и

РЬе

61 и

Луз

Уа1

65

70

75

80

Луз

Агд

61у

11е

Уа1

61и

61П

Суз

Н18

Азп

ТЬг

Суз

Зег

Леи

Туг

85

90

95

С1п

Леи

61и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

<210>	46
<211>	108
<212>	РКТ
<213>	ЭапЛо гегЛо
<4 00>	46

МеС А1а Уа1 Тгр Леи С1п А1а С1у А1а Леи Леи Уа1 Леи Леи Уа1 Уа1

10 15

- 82 014887

Зег

Уа1

Зег 20

ТНг

Азп

Рго

61у

Ткг 25

Рго

51п

Ηΐδ

Ьеи

Суз 30

С1у

Зег

Ηίε

Ьеи

Уа1

Азр

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

61у

Рго

Ткг

61у

Рке

35

40

45

Туг

Азп

Рго

Ьуз

Агд

Азр

Уа1

61и

Рго

Ьеи

С1у

Рке

Ьеи

Рго

50

55

60

Ьуз

Зег

А1а

61п

61и

ТНг

61и

Уа1

А1а

Азр

Рке

А1а

Рке

Ьуз

Азр

Низ

65

70

75

30

А1а

С1и

Ьеи

11е

Агд

Ьуз

Агд

С1у

Ые

Уа1

61и

С1п

Суз

ΗΪ3

Ьуз

85

90

95

Рго

Суз

Зег

Не

РНе

С1и

Ьеи

С1п

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

<210>

47

<211>

108

<212>

РЕТ

<213> <

СургЬпиз

сагрд.о

<4 00>

47

Меб

А1а

Уа1

Тгр

11е

61п

А1а

61у

А1а

Ьеи

Рке

Ьеи

А1а

Уа1

1

5

10

15

Зег

Уа1

Азп

А1а

Азп

А1а

Е1у

А1а

Рго

61п

ΗΪ3

Ьеи

Суз

61у

Зег

20

25

30

Н1з

Ьеи

νβΐ

Азр

А1а

1.еи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

РгО

Ткг

61 у

Рке

35

40

45

Туг

Азп

Рго

Ьуз

Агд

Азр

Уа1

Азр

Рго

Ьеи

61у

Рке

Ьеи

Рго

50

55

60

Ьуз

Зег

А1а

С1п

С1и

Ткг

61и

Уа1

А1а

Азр

Рке

А1а

Рке

Ьуз

Азр

Н1з

65

70

75

80

А1а

С1и

Уа1

Не

Агд

Ьуз

Агд

С1у

Пе

Уа1

С1и

61п

Суз

Н1з

Ьуз

35

90

95

- 83 014887

Рго Суз

8ег

11е 100

РЬе 61и

Ьеи

С1п

Αδη 105

Туг

Суз

Азп

<210>

48

<211>

21

<212>

РКТ

<213>

ВабгасЬоЬсНбае деп. .

эр.

<400>

46

С1у Не 1

Уа1

С1и

С1п Суз 5

Суз

ΗΪ5

Агд

Рго 10

Суз

Азр

Не

РЬе

Азр 15

Ьеи

С1п Зег

Туг

Суз 20

Азп

<210>

49

<211>

21

<212>

РКТ

<213>

ТЬиппиз

ЬЬуппиз

<400>

49

С1у 11е 1

Уа1

С1и

С1п Суз 5

Суз

Ηίδ

Ьуз

Рго 10

Суз

Азп

Не

РЬе

Азр 15

Ьеи

С1п Азп Туг Суз Αδη

<210>	50
<211>	21
<212>	РКТ
<213>	Кабзинопиз ре1ат!з
<400>	50

- 84 014887

61у 11е ΗίΞ С1х С1х Суз Суз Низ Ьуз

5

Рго Суз Азх 11е РЬе С1х Ьеи

15

С1х Азх Туг Суз Азп <210 51 <211> 116 <212> РЕТ <213> ЬорЫиз рЬзсаЬогииз <400> 51

МеТ 1

А1а

Ьеи

Тгр 5

Ьеи

С1п

Зег

РЬе

Зег 10

Ьеи

Уа1

Ьеи

Ьеи 15

Ца1

Уа1

Зег

Тгр

Рго

С1у

8ег

С1п

А1 а

Уа1

А1а

Рго

А1 а

С1п

Н1з

Ьеи

Суз

20

25

30

С1у

Зег

Н13

Ьеи

Уа1

Азр

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

Й1у

Азр

Агд

С1у

35

40

45

РЬе

Туг

Азп

Рго

Ьуз

Агд

Азр

Уа1

Азр

61п

Ьеи

61у

РЬе

Ьеи

50

55

60

Рго

Ьуз

Зег

С1у

А1а

С1у

А1а

Азр

Азп

С1и

Уа1

65

70

75

80

А1а

С1и

РЬе

А1а

РЬе

Ьуз

Азр

С1п

Мер

С1и

Мер

МеТ

Уа1

Ьуз

Агд

С1у

85

90

95

11е

Уа1

С1и

С1п

Суз

Н1 з

Агд

Рго

Суз

Азп

11е

РНе

Азр

Ьеи

С1п

100

105

110

Азп

Туг

Суз

Азп

115

<210	52
<211>	115
<212>	РЕТ

- 85 014887 <213> Мух1пе д1иЫпоза <400> 52

Мед 1

А1а

Ьеи

Зег

Рго 5

РЬе

Ьеи

А1а

Уа1 10

11е

Рго

Ьеи

Уа1

Ьеи 15

Ьеи

Зег

Агд

А1а

Рго

Зег

А1а

Азр

ТЬг

Агд

ТЬг

61у

Н1з

Ьеи

20

25

30

Суз

С1у

Ьуз

Азр

Ьеи

Уа1

Азп

А1а

Ьеи

Туг

Не

А1а

Суз

61у

Уа1

Агд

35

40

45

61у

РЬе

Туг

Азр

Рго

ТЬг

Ьуз

МеЬ

Ьуз

Агд

Азр

ТЬг

С1у

А1а

Ьеи

50

55

60

А1а

РЬе

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

Туг

А1а

С1и

Азр

Азп

Й1и

Зег

С1п

Азр

65

70

75

80

Азр

61и

Зег

Не

С1у

11е

Азп

61и

Уа1

Ьеи

Ьуз

5ег

Ьуз

Агд

61у

11е

85

90

95

Уа1

С1и

С1п

Суз

Н15

Ьув

Агд

Суз

Зег

Не

Туг

Азр

Ьеи

С1и

Азп

100

105

НО

Туг

Суз

Азп

115

<210

53

<211 >

105

<212>

РКТ

<213>

ОпсогЬупсЬиз

Ье£а

<400>

53

Мер

А1а

РЬе

Тгр

Ьеи

С1п

А1а

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

Ьеи

1

5

10

15

Зег

Рго

С1у

Уа1

Азр

А1а

С1п

Н1з

Ьеи

Суз

С1у

Зег

Н1з

20

25

30

- 86 014887

Ьеи

Уа1 Азр 35

А1а Ьеи

Туг

Ьеи Уа1 Суз 40

С1у

С1и

Ьуз

С1у 45

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

Агд

Азр

Уа1

Азр

Рго

Ьеи

11е

С1у

РЬе

Ьеи

Зег

Рго

Ьуз

50

55

60

Бег

А1а

Ьуз

С1и

Азп

31и

61и

Туг

Рго

РЬе

Ьуз

Азр

С1п

ТЬг

С1и

Меб

65

70

75

80

Меб

Уа1

Ьуз

Агд

61у

Не

Уа1

Й1и

С1п

Суз

ΗΪ3

Ьуз

Рго

Суз

Азп

85

90

95

Не

РЬе

Азр

Ьеи

С1п

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

<210>54 <211> 21 <212> РЕТ <213> МуохосерЬа1из зсогрииз

<400>	54
61у Не	7а1	61и	61п Суз Суз	Низ Агд Рго Суз Азп	Не Агд Уа1 Ьеи
1			5	10	15
С1и Азп	Туг	Суз	Азп
		20

<210>	55
<211>	21
<212>	РКТ
<213>	Ьеризозбеиз зраби1а

<400>55

С1у Не Уа1 С1и С1п Суз Суз Н1з Ьуз

Рго Суз ТЬг 11е Туг

С1и Ьеи

С1и АЗП Туг Суз Азп

- 87 014887

<210>	56
<211>	21
<212>	ркт
<213>	рбаббсЬбЬуз ббезиз
<400>	56

С1у Не 1	Уаб Сби Сбп Суз Суз 5	Нбз	буз	Рго 10	Суз	Азп	11е	РНе	Азр 15	беи
С1п Азп	Туг Суз Азп 20
<210>	57
<211>	21
<212>	РРТ
<213>	Нусбгобадиз εοΐΐίεί
<400>	57
Сбу Не 1	Уаб Сби Сбп Суз Суз 5	Нбз	Азп	Ткг 10	Суз	Зег	беи	Аба	Азп 15	беи
Сби Сбу	Туг Суз Азп 20
<2б0>	58
<2б1>	22
<212>	РНТ
<213>	Здиабиз асапбЬбаз
<400>	58
Сбу ббе 1	Уаб Сби Нбз Суз Суз 5	Нбз	Азп	ТЬг 10	Суз	Зег	Ьеи	Туг	Азр 15	беи

- 88 014887

С1и 61у Туг Суз Азп С1п

<210>	59
<211>	21
<212>	РКТ
<213>	Тогрейо шагтогаба

<400>59

С1у Не Уа1 С1и Ηίε Суз Суз Н1з Азп ТЬг Суз Зег Ъеи РЬе Азр Ьеи 15 1015

С1и С1у Туг Суз Азп <210> 60 <211>89 <212> РКТ <213> СаНогИйпсЬиз тНИ <400> 60

Уа1 1

Рго

ТЬг С1п

Агд 5

Ьеи Суз

С1у

Зег Н1з 10

Ьеи

Уа1

Азр

А1а

Ьеи 15

Туг

РЬе

Уа1

Суз

С1у

Й1и

Агд

61 у

РЬе

Туг

5ег

Рго

Ьуз

С1п

11е

Агд

20

25

30

Азр

Уа1

С1у

Рго

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

Агд

Азр

Ьеи

С1и

Рго

Ьеи

Азр

35

40

45

ТЬг

С1и

Меб

С1и

Азр

Агд

РЬе

Рго

Туг

Агд

С1п

Ьеи

А1а

С1у

Зег

50

55

60

Ьуз

МеЬ

Ьуз

Агд

С1у

11е

Уа1

С1и

С1п

Суз

Н1з

Азп

ТЬг

Суз

Зег

65

70

75

80

Ьеи

Уа1

Азп

Ьеи

С1и

С1у

Туг

Суз

Азп

35

- 89 014887

<210>	61
<211>	21
<212>	РЕТ
<213>	Ребготуаоп тагЬпиз
<400>	61

С1у Не 1

Уа1

61и

61 п 5

Суз

(Из

Агд

Ьуз 10

Суз

5ег

Не

Туг

Азр 15

МеЬ

С1и Азп

Туг

Суз 20

Азп

<210>

62

<211>

21

<212>

РЕТ

<213>

ОпсогЬупсЬиз

догЬизсЬа

<400>

62

С1у Не 1

Уа1

С1и

С1п 5

Суз

Η1Ξ

Ьуз

Рго 10

Суз

Азп

11е

РЬе

Азр 15

Ьеи

С1п Азп

Туг

Суз 20

Азп

<210>

63

<211>

21

<212>

РЕТ

<213>

Ат1а

са1ца

<400>

63

С1у Не 1

_; Уа1

С1 и

С1п 5

Суз

Ьеи

Ьуз

Рго 10

Суз

ТЬг

11е

Туг

С1и 15

МеЬ

- 90 014887

С1и Ьуз Туг Суз Азп
	20
<210>	64
<211>	21
<212>	РЕТ
<213>	Апди111а	гозбгаба
<400>	64
С1у Т1е 1	Уа1 61и	С1п Суз Суз Н1з 5	Ьуз Рго Суз Зег Не 10	РЬе Азр Ьеи 15

61п Азп Туг Суз Азп

<210>	65
<211>	113
<212>	РКТ
<213>	ОгеосЬгошхз п11об1сиз

<400> 65

Меб 1

А1а

Ьеи

Тгр 5

Ьеи

С1п

А1а

РЬе

Зег 10

Ьеи

Уа1

Ьеи

Меб 15

Меб

Уа1

Зег

Тгр

Рго

С1у

Зег

61п

А1а

Уа1

С1у

Рго

61п

Ηί3

Ьеи

Суз

20

25

30

С1у

Зег

Н1з

Ьеи

Уа1

Азр

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

Азр

Агд

61у

35

40

45

РНе

РЬе

Туг

Азп

Рго

Агд

Азр

Уа1

Азр

Рго

Ьеи

61у

РЬе

Ьеи

50

55

60

Рго

Ьуз

А1а

С1у

61у

А1а

Уа1

С1п

61у

С1у

61и

Азп

С1и

Уа1

65

70

75

80

ТЬг

РЬе

Ьуз

Азр

61п

Меб

С1и

Меб

Уа1

Ьуз

Агд

С1у

Не

Уа1

С1и

85

90

95

- 91 014887

61и Суз	Суз	ΗΪ3 Ьуз Рго Суз ТЬг 100	Не 1С5	РЬе	Азр	Ьеи	С1п	Азп 110	Туг	Суз
Азп
<2 10>	66
<211>	21
<212>	РКТ
<213>	Асхрепзег диеХбепзЬаеббЬ
<400>	66
б!у 11е 1	Уа1	С1и С1п Суз Суз НЬз 5	Зег	Рго 10	Суз	Зег	Ьеи	Туг	Азр 15	Ьеи
С1и Азп	1 Туг	Суз Азп 20
<210>	67
<211>	21
<212>	РКТ
<213>	Рпагасбиз тезоробатпьсиз
<400>	67
С1у 11е Уа1 1	С1и С1п Суз Суз Н1з 5	Ьуз	Рго 10	Суз	Зег	11е	РЬе	Азр 15	Ьеи

С1п Азп Туг Суз Азп

<210>	68
<211>	115
<212>	РКТ
<213>	Уегазрег тозегп

- 92 014887 <400> 68

Ме1 1

А1а А1а

Ъеи Тгр 5

Ъеи

<31п

Зег

νβΐ

Зег 10

Ъеи

νβΐ

Ъеи

Ме1 15

Ъеи

Уа1

Зег

Тгр

Зег

61у

Зег

61п

А1а

νβΐ

Ьей

Рго

С1п

Η15

Ъеи

Суз

20

25

30

61 у

А1а

ΗΪΞ

Ъеи

Уа1

Азр

А1а

Ъеи

Туг

Ъеи

Уа1

Суз

С1у

61и

Агд

61у

35

40

45

РНе

РЬе

Туг

ТНг

Рго

Ъуз

Агд

Азр

Уа1

Азр

Рго

Ъеи

С1у

РЬе

Ъеи

50

55

60

Рго

А1а

Ъуз

Зег

61у

А1а

61у

С1у

61и

Азп

61и

Уа1

А1а

65

70

75

80

С1и

РНе

А1а

РНе

Ьуз

Азр

61п

Ме1

С1и

МеЪ

Уа1

Ъуз

Агд

61у

Ие

85

>

90

95

Уа1

С1и

61п

Суз

Н1з

Ъуз

Рго

Суз

Азп

11е

РЬе

Азр

Ъеи

61п

Азп

1 пп X V

1 ПС х м ·>

1 1 П и_ х V

Туг Суз Азп

115 <210>69 <211>30 <212> РКТ <213> ЛпдиШа апдиШа <400>69

Азр Уа1 С1и Рго Ъеи Ъеи С1у РЬе Ъеи Зег Рго Ъуз

1510

Зег 61у С1п С1и

<210> 70

- 93 014887

<211>	106
<212>	РЕТ
<213>	Хепориз 1аеу1з
<400>	70

Меб 1

А1а

Ьеи

Тгр Меб 5

С1п

Суз

Ьеи

Рго

Ьеи 10

Уа1

Ьеи

Уа1

Ьеи

РНе 15

РНе

Зег

ТНг

Рго

Азп

ТНг

С1и

А1а

Ьеи

7а1

Азп

61 п

Низ

Ьеи

Суз

61у

Зег

20

25

30

Нгз

Ьеи

Уа1

61и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

61у

Азр

Агд

61у

РНе

35

40

45

Туг

Рго

Ьуз

Уа1

Ьуз

Агд

Азр

Меб

Н1и

61п

А1а

Ьеи

Уа1

Зег

С1у

50

55

60

Рго

<31 η

Азр

Азп

С1и

Ьеи

Азр

С1у

Меб

61п

Ьеи

С1п

Рго

61п

С1и

Туг

65

70

75

80

61п

Ьуз

Меб

Ьуз

Агд

С1у

11е

Уа1

С1и

С1п

Суз

Н1з

Зег

ТНг

Суз

85

90

95

Зег

Ьеи

РНе

<31п

Ьеи

С1и

Зег

Туг

Суз

Азп

100

105

<210>

71

<211>

106

<212>

РЕТ

<213>

Хепориз

1аеу1з

<400>

71

Меб

А1а

Ьеи

Тгр

Ыеб

С1п

Суз

Ьеи

Рго

Ьеи

Уа1

Ьеи

Ча1

Ьеи

РНе

1

5

10

15

Зег

ТНг

Рго

Азп

ТНг

С1и

А1а

Ьеи

А1а

Азп

61п

Н1з

Ьеи

Суз

61у

Зег

20

25

30

- 94 014887

НЬз

Ьеи

Уа1 35

61и А1а

Ьеи

Туг

Ьеи Уа1 40

Суз

С1у

Азр

Агд 45

С1у

РЬе

Туг

Рго

Ьуз

11е

Ьуз

Агд

Азр

11е

С1и

Й1п

А1а

С1п

Уа1

Азп

С1у

50

55

60

Рго

εΐη

Азр

Азп

С1и

Ьеи

Азр

С1у

МеЬ

С1п

РЬе

С1п

Рго

61 п

С1и

Туг

65

70

75

80

С1п

Ьуз

МеЪ

Ьуз

Агд

С1у

11е

Уа1

С1и

С1п

Суз

Н1з

Зег

ТНг

Суз

85

90

95

Зег

Ьеи

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

100

105

<210>72 <211> 21 <212> ΓΈΤ <213> ТгасЬетуз зсгхрЬа <400>72

С1у Не 1	Уа1	С1и	С1п Суз Суз Н1з Азп ТЬг Суз Зег	Ьеи Туг С1п Ьеи 15
5	10
С1и Азп	Туг	Суз 20	Азп
<210>	73
<211>	21
<212>	РКТ
<213>	А111да1ог т1зз1зэ1рр1епз1з

<400>73

С1у 11е Уа1 61и С1п Суз Суз Н1з Азп ТНг Суз 8ег Ьеи Туг 51п Ьеи

1015

61и Азп Туг Суз Азп

- 95 014887

<210>	74
<211>	21
<212>	РКТ
<213>	йаосуз бНитпабез
<400>	74

61у 11е Уа1 С1и 61п Суз Суз С1и Азп ТНг Суз Зег Ьеи Туг С1и Ьеи

5 ' 1015

01и Азп Туг Суз Азп

	20
<210>	75
<211>	21
<212>	РЕТ
<213>	Сгоба1из
<400>	75

С1у 11е Уа1 61и С1п Суз Суз С1и Азп ТНг Суз Зег Ьеи Туг С1п Ьеи

1015

С1и Азп Туг Суз Азп <210>76 <211>114 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Препроинсулин <400> 76

- 96 014887

МеС 1

С1у Леи

Тгр

Не 5

Агд

Леи

Леи Рго

Леи 10

Не А1а

Леи

Не 15

Леи

Тгр

С!у

Рго

Азр

Рго

А1а

61и

РЬе

Агд

МеС

РЬе

Уа!

Азп

С1п

20

25

30

ΗΪ3

Леи

Суз

61у

Зег

Н!з

Леи

Уа1

61и

А1а

Леи

Туг

Леи

Уа1

Суз

С1у

35

40

45

61и

Агд

61 у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Луз

ТЬг

Агд

61и

А1а

61и

Азр

50

55

60

Леи

61п

Уа1

61у

С1п

Уа1

61и

Леи

61у

Рго

61у

А1а

61у

Зег

65

70

75

80

Леи

61п

Рго

Леи

А1а

Леи

61и

61у

Зег

Леи

61п

Луз

Агд

61у

Не

Уа1

Θ5

90

95

61и

С1п

Суз

ТЬг

Зег

11е

Суз

Зег

Леи

Туг

61п

Леи

61и

Азп

Туг

100

105

НО

Суз Азп <210> 77 <211> 21 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин <400>77

С1у 11е Уа1 С1и 61п Суз Суз ТЬг Зег Не Суз Еег Леи Туг С1п Леи

1015

61и Азп Туг Суз Азп <210>78

- 97 014887 <211> 30 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Инсулин <400> 78

РЬе Уа1 1

Азп С1п

Низ 5

Ьеи

Суз

61у

Зег

НЬз 10

Ьеи Уа1

С1 и

А1а

Ьеи 15

Туг

Ьеи Уа1

Суз

С1у

51и

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

ТЬг

20

25

30

<210>

79

<211>

53

<212>

РВТ

<213>

;ппал ί. х с

<220>

<223>

Инсулин

<400>

79

РЬе Уа1

Азр

С1п

Н1з

Ьеи

Суз

61у

Зег

Ыз

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

1

5

10

15

Ьеи Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

А1а

Ьуз

20

25

30

С1у Не

Уа1

С1и

С1п

Суз

ТЬг

Зег

11е

Суз

5ег

Ьеи

Туг

61и

Ьеи

35

40

45

С1и Азр Туг Суз Азп 50 <210> 80 <211> 53

- 98 014887 <212>

<213>

<220>

<223>

<400>

РКТ

Искусственная последовательность

Инсулин

РНе 1

Уаб

Сби

Сбп

Ηΐε 5

беи

Суз Сбу

Зег

Азр 60

беи

Уаб

Сби

Аба

беи 15

Туг

беи

Уаб

Суз

Сбу

Сби

Агд

Сбу

РЬе

Туг-

ТЬг

Рго

буз

Аба

буз

20

25

30

Сбу

1бе

Уаб

Сби

Сбп

Суз

ТЬг

Зег

ббе

Суз

Зег

беи

Туг

Сбп

беи

35

40

45

Сби

Туг

Суз

Азп

50

<2б0>

86

<21 б>

53

<212>

РКТ

<2бЗ>

Искусственная последовательность

<220>

<223>

Инсулин

<400>

81

РЬе

Уаб

Сбп

Нбз

беи

Суз

Сбу

Зег

Нбз

беи

Уаб

Сби

Аба

беи

Туг

1

5

60

15

беи

Уаб

Суз

Сбу

Сби

Агд

Сбу

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

буз

Аба

буз

20

25

30

Сбу

Т1е

Уаб

Сби

Сбп

Суз

ТЬг

Зег

ббе

Суз

Зег

беи

Туг

Сбп

беи

35

40

45

Сби Азп Туг Суз Сбу

- 99 014887 <210> 82 <211> 53 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Белковый продукт без названия с гомологией инсулина <400>82

РЬе Уа1 1

ТЬг

С1п

ΗΪ3 5

Ьеи

Суз

С1у

Зег

Ηϊβ 10

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи 15

Туг

Ьеи

Уа1

Сув

С1у

С1и

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

А1а

Ьуз

20

25

30

С1у

Не

Уа1

С1и

С1п

Суз

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

35

40

45

С1и ΗΪ3 Туг Суз Зег <210>83 <211> 57 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Проинсулин <400>83

Азп. Зег Азп С1у Ьуз РЬе Уа1 Азп 31п Ηΐε Ьеи Суз 61у Зег Н1з Ьеи 15 1015

Уа1 С1и А1а Ьеи Туг Ьеи Уа1 Суз С1у С1и Агд С1у РЬе РЬе Туг ТЬг

2530

- 100 014887

Рго Ьуз ТЬг Ьуз С1у Не 7а1 61и С1п Суз Суз ТНг Зег Не Суз Зег

4045

Ьеи Туг С1п Ьеи С1и Азп Туг Суз Азп

5055

<210>	84
<211>	58
<212>	РЙ.Т
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223> Инсулин <400>84

Азп 1

Зег Азп С1у Ьуз 5

РЬе

Уа1

Азп

<31п

Нтз 10

Ьеи

Суз

С1у

Зег

Нтз 15

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

20

25

30

Рго

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Агд

С1у

11е

Уа1

С1и

С1п

Суз

ТЬг

5ег

Не

Суз

35

40

45

5ег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

50

55

<210>85 <211>50 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин <400> 85

РНе Уа1 Азп С1п Нтз Ьеи Суз С1у Зег Нтз Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи Туг

10 15

- 101 014887

Ьеи Уа1	Суз	С1у 20	С1и	Агд	С1у	РЬе
С1и	С1п	Суз	Суз	ТЬг	Зег	11е	Суз
		35					40

РЬе 25	Туг	ТЫ	Рго	Ьуз	С1у 30	11е	Уа1
Зег	Ьеи	Туг	С1п	Ьеи 45	С1и	Азп	Туг

Суз Азп <210> 36 <211> 54 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин <400> 86

Агд 1

РЬе

Уа1

Азп

С1п 5

Н1з

Ьеи Суз

С1у Зег 10

Н13

Ьеи

Уа1

С1и

А1а 15

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

А1а

20

25

30

Ьуз

С1у

11е

Уа1

С1и

61п

Суз

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

35

40

45

Ьеи С1и Азп Туг Суз Азп 50 <210> 87 <211> 61 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

- 102 014887 <223> Инсулин <400> 87

Ьуз 1

С1и

ТЬг

Ьеи

ТЬг 5

11е

ТЬг

Суз

А1а

Уа1 10

Рго

ТЬг

Тгр

Ьеи

Ьуз 15

Ьеи

Тгр

ТЬг

Тгр

РЬе

А1а

Уа1

Ьуз

С1и

νβΐ

Зег

ТЬг

Азп

Ьеи

Агд

Ьеи

20

25

30

Ьеи

Агд

Уа1

Ьеи

Зег

Азп

А1а

Уа1

Рго

Зег

А1а

Рго

Суз

ТЬг

35

40

45

Азп

Тгр

Ьуз

ТЬг

А1а

ТЬг

Агд

Зег

Рго

61п

А1а

55 60 <210> 88 <211> 61 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Препроинсулин <400> 88

Ьуз 1

Азр

Зег

Ьеи

ТЬг 5

Азп

ТЬг

Суз

А1а

Уа1 10

Зег

ТЬг

Тгр

Ьеи

Ьуз 15

Ьеи

Суз

ТЬг

Тгр

РЬе

А1а

Уа1

Ьуз

С1и

Уа1

Зег

ТЬг

Ьеи

Агд

Ьеи

20

25

30

Ьеи

Агд

Уа1

Ьеи

Зег

Азп

А1а

Уа1

Рго

Зег

А1а

Азп

Туг

ТЬг

35

40

45

Азп

Тгр

Ьуз

ТЬг

А1а

ТЬг

Агд

Зег

Рго

С1п

А1а

50

55

60

<210>	89
<211>	87
<212>	РЕТ

- 103 014887 <213> Искусственная последовательность <2.20>

<223> Проинсулин <400>89

Меб 1

РЬе

Уа1

Азп

С1п 5

ΗΪ3

Ьеи Суз

С1у

Зег 10

Н±з

Ьеи Уа1

61и

А1а 15

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

<31и

Агд

31у

РЬе

Туг

ТЬГ

Рго

Ьуэ

ТЬг

Агд

20

25

30

Агд

61и

А1а

С1и

Азр

Ьеи

С1п

Уа1

С1у

С1П

Уа1

С1и

Ьеи

01 у

С1у

35

40

45

Рго

С1у

А1а

С1у

Зег

Ьеи

С1п

Рго

Ьеи

А1а

Ьеи

С1и

С1у

Зег

Ьеи

С1п

50

55

60

Ьуз

Агд

С1у

11е

Уа1

С1и

С1п

Суз

ТЬг

Зег

11е

Суз

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

<210>90 <211>35 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин <400> 90

Агд 1

Агд

С1и

А1а

С1и Азр 5

Ьеи С1п Уа1

С1у 10

<31п

Уа1

С1и

Ьеи

С1у 15

С1у

Рго

С1у

А1а

61У

Зег

Ьеи

С1п

Рго

Ьеи

А1а

Ьеи

С1и

С1у

Зег

Ьеи

25 30

- 104 014887

С1п Ьуз Агд <210> 91 <211> 23 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин <400>91

С1у Рго С1и ТЬг Ьеи Суз С1у А1а С1и Ьеи Уа1 Азр А1а Ьеи С1п РЬе

1015

Уа1 Суз 51у Азр Агд С1у РЬе <210>92 <211>124 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин <400> 92

МеЬ 1

Ьуз

Ьеи

Ьуз

ТЬг 5

Уа1

Агд

Зег

АЬа

Уа1 10

Ьеи

Зег

Ьеи

РЬе 15

А1а

Зег

<31п

Уа1

Ьеи

61у

С1п

Рго

11е

Азр

ТЬг

61и

Зег

С1п

ТЬг

20

25

30

Зег

Уа1

Азп

Ьеи

МеЬ

А1а

Азр

ТЬг

С1и

Зег

А1а

РЬе

АЬа

ТЬг

С1п

35

40

45

ТЬг

Азп

Зег

С1у

Ьеи

Азр

Уа1

С1у

Ьеи

11е

Зег

МеЬ

АЬа

Ьуз

50

55

60

- 105 014887

Агд 65

С1и

С1у

С1и

Рго 70

Ьуз

РНе

Уа1

Азп

С1п 75

Н1з

Ьеи

Суз

С1у

Зег 80

Низ

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

Й1и

Агд

61у

РЬе

85

90

95

Туг

ТЬГ

РГО

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

Не

Уа1

С1и

С1П

Суз

ТЬг

Зег

100

105

но

11е

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

115

120

<210> 93 <211> 171 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин <400> 93

бббдьсаабс адсассбббд	бддббсбсас	сбддбддадд	сбсЬдЬассб	ддьдьд-ьддд	60
даасдбддЬб	ЬсбЬсбасас	асссаадасс	сдбсдбаадс	ббаадсдбдд	саббдбддад	120
садЬдсбдса	ссадсабсбд	сЬсссбсЬас	саасбддада	асбасЬдсаа	с	171

<210> 94 <211> 21 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аналог инсулина <400> 94

С1у Не Уа1 С1и <31п Суз Суз ТЬг Зег 11е Суз Зег Ьеи Туг 61п Ьеи

10 15

- 106 014887

Е1и Азп Туг Суз Азп <210> 95 <211> 26 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аналог инсулина <220>

<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <222> (26)..(26) <223> X = любая аминокислота <400> 95

РНе Уа1 1

Азп

61п

Н15 5

Ьеи

Суз

С1у

8ег

ΗΪ3 10

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи 15

Туг

Ьеи Уа1

Суз

С1у 20

С1и

Агд

С1у

РНе

РЬе 25

Хаа

<210>

96

<2 11>

21

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зархепз

<400>

96

61у 11е 1

Уа1

С1и

С1п 5

Суз

ТНг

Зег

11е 10

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п 15

Ьеи

С1и Азп

Туг

Суз 20

АЗП

- 107 014887

<210>	97
<211>	29
<212>	РКТ
<213>	Ното
<400>	97

Сби Уа1

Азп

Сбп

Нбз

Ьеи

Суз

Сбу

Зег

Сби

Ьеи

Уаб

Сби

Аба

Ьеи

Сби

1

5

10

15

Ьеи Уаб

Суз

Сбу

Сби

Агд

Сбу

РЬе

РНе

Туг

Сби

Рго

Ьуз

20

25

<210>

93

<211 >

21

<212>

РВТ

<213>

Ното

зарбепз

<400>

98

Сбу 11е

Уаб

Сби

Сбп

Суз

ТЬг

Зег

11е

Суз

Зег

Ьеи

Туг

Сбп

Ьеи

1

5

10

15

Сби Азп Туг Суз Азп 20 <210> 99 <211> 30 <212> РКТ

<213>	Ното зарбепз
<400>	99
РЬе Уаб	Азп	Сбп Нбз	Ьеи Суз Сбу 5ег Нбз Ьеи Уаб	Сби Аба Ьеи Нбз
1		5	10	15

- 108 014887

Ьеи Уа1

Суз

51у С1и 20

Агд

61у

РЬе

РЬе 25

Туг

ТНг

Рго

Ьуз

ТНг 30

<210>

100

<211>

21

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарпепз

<4 00>

100

С1у Т1е

Уа1

С1и С1п

Суз

Ьуз

Зег

11е

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

1 '

5

10

15

С1и Азп

Туг

Суз Азп 20

<210

101

<211>

30

<212>

РКТ

<213>

Ното

зарЬепз

<400>

101

РЬе Уа1

Азп

С1п Н1з

Ьеи

Суз

С1у

Зег

Н1з

Ьеи

Уа1

61и

А1а

Ьеи

Туг

1 .

5

10

15

Ьеи ν&1

Суз

С1у С1и

Агд

С1 у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

ТНг

20

25

30

<210>

102

<211>

21

<212>

РКТ

<213>

Ното

зар!епз

<4 00>

102

61у Не

; 7а1

С1и С1п

Суз

Ьуз

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

1

5

10

15

- 109 014887

С1и Азп Туг Суз Азп <210>103 <211>30 <212> РКТ <213> Ното зариепз <400>103

РЬе Уа1 1

Азп

Й1п ΗΪ3 5

Ьеи

Суз

С1у

Зег

ΗΪ3 10

Ьеи

Уа1

31 и

А1а

Ьеи 15

Туг

Ьеи Уа1

Суз

С1у С1и 20

Агд

С1у

РЬе

РЬе 25

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

ТЬг 30

<210>

104

<211>

21

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зартепз

<220>

<221>

М15С

__РЕАТСКЕ

<222>

(3) -

(8)

<223>

X =

любая аминокислота

<4 00>

104

С1у 11е 1

; Уа1

С1и 61п 5

Суз

Хаа

Зег

11е 10

Суз

Зег

Ьеи

Туг

61п 15

Ьеи

Б1и Азп Туг Суз Азп <210>105

- 110 014887

<211>	30
<212>	РЕТ
<213>	Ното
<4 00>	105

РЬе Уа1 1

Азп

61п Н1з 5

Леи

Суз

61у

Зег

ΗΪ5 10

Леи

Уа1

С1и

А1а

Леи 15

Туг

Леи Уа1

Суз

С1у С1и 20

Агд

61у

РЬе

РЬе 25

Туг

ТЬг

Рго

Луз

ТЬг 30

<210>

106

<211>

21

<212>

РКТ

<213>

Ното

зартепз

<220>

<221>

М13С

_ΕΈΑΤΟΚΕ

<222>

(8) .

- (8)

<223>

X = .

любая аминокислота

<400>

106

61у 11е 1

! Уа1

С1и 61п 5

Суз

Хаа

Зег

Не 10

Суз

Зег

Леи

Туг

61п 15

Леи

С1и Азп Туг Суз Азп

<210>	107
<211>	30
<212>	РКТ
<213>	Ното

- 111 014887 <400>107

РНе Уа1 Азп С1п Нхз Ьеи Суз С1у Зег НЬз Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи Туг

1015

Ьеи Уа1 Суз С1у С1и Агд С1у РЬе РНе Туг ТНг Рго Ьуз ТНг 20 2530 <210> 108 <211> 21 <212> РКТ <213> Ното зархепз <220>

<221>	М13С_ГЕАтиКЕ
<222>	(2) . . (2)
<223>	X = любая аммнокислотаз

<400> 108

61у Хаа 1

Уа1

С1и

31п 5

Суз

ТНг

Зег

11е 10

Суз

5ег

Ьеи

Туг

С1п 15

Ьеи

С1и Азп.

Туг

Суз 20

Азп

<210>

109

<211>

30

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зархепз

<400>

109

РЬе Уа1 1

Азп

С1п

Шз 5

Ьеи

Суз

61у

Зег

Азр 10

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи 15

Туг

Ьеи Уа1

Суз

С1у 20

С1и

Агд

С1у

РЬе

РЬе 25

Туг

ТЬг

Ьуз

Рго

ТЬг 30

- 112 014887

<210>	но
<211>	21
<212>	РЕТ
<213>	Ното
<4О0>	но

С1у А1а 1

Уа1

61и

С1п 5

Суз

ТЬг

Зег

11е 10

Суз

5ег

Ьеи

Туг

С1п 15

Ьеи

С1и Азп

Туг

Суз 20

Азп

<210>

111

<211>

30

<212>

РЕТ

<213>

Ното

заргепз

<400>

111

РНе Уа1 1

Азп

С1п

Н15 5

Ьеи

Суз

С1у

Зег

Азр 10

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи 15

Туг

Ьеи Уа1

Суз

С1у 20

(31 и

Агд

С1у

РНе

РЬе 25

Туг

ТНг

Ьуз

Рго

ТЬг 30

<210> 112 <211> 21 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аналог инсулина <220>

- 113 014887 <221> М13С_ГЕАТ0КЕ <222> (2)..(2) <223> X = любая аминокислота

<400>	112
СЬу Хаа 1	Уа1	С1и	С1п Суз Суз 5	ТЬг Зег Не Суз 10	Зег Ьеи Туг С1п Ьеи 15
С1и Азп	Туг	Суз 20	Азп
<210>	113
<211>	30
<212>	РВ.Т

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аналог инсулина

<4 00>

113

РЬе Уа1

Азп

С1п

Н13

Ьеи

Суз

С1у

Зег

Нтз

Ьеи

Уа1

б1и

А1а

Ьеи Туг

1

5

10

15

Ьеи Уа1

Суз

СЬу

С1и

Агд

61у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

ТЬг

20

25

30

<210>

114

<211>

21

<212>

РКТ

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аналог инсулина <22ΰ>

- 114 014887 <221> М15С_ГЕАТиНЕ <222> (2)..(2} <223> X = любая аминокислота

<400>	114
С1у Хаа 1	Уа1	С1и	61п Суз Суз 5	ТЬг Зег 11е Суз 10	Зег Ъеи Туг С1п Ьей 15
б1и Азп	Туг	Суз 20	Азп
<210>	115
<211>	30
<212>	РВ.Т

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аналог инсулина <400> 115

РЬе Уа1 1

Азп

Е1п

Н1з 5

Ъеи

Суз

61 у

Зег

Н1з 10

Ъеи

Уа1

61и А1а

Ъеи 15

Туг

Ьей Уа1

Суз

Е1у

С1и

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ъуз

ТЬг

20

25

30

<210>

116

<211>

21

<212>

РКТ

<213>

Ногао

аархепе

<400>

116

Е1у С1у

С1у

С1и

С1П

Суз

ТЬг

Зег

11е

Суз

Зег

Ъеи

Туг

С1п

Ъеи

1

5

10

15

- 115 014887

61и Азп Туг Суз Азп <210>117 <211>30 <212> РЕТ <213> Ното зартепз <400>117

РЬе Уа1 Азп 1	С1п	Н1е Ьеи Суз 5	С1у Зег	Азр 10	Ьеи	Уа1	С1и	А1а	Ьеи 15	Туг
Ьеи Уа.1	Суз	С1у 20	С1и Агд С1у	РЬе РЬе 25	Туг	ТЬг	Ьуз	Рго	ТЬг 30
<210>	118
<211>	21
<212>	РЕТ
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Мутант инсулина Ното	зар1еп5
<220
<221>	М13С	_КЕАТиВЕ
<222>	(1) -	- (1)
<223>	X = ,	любая аминокислота
<400>	118
Хаа 11е 1	: Уа1	С1и	С1п Суз Суз 5	ТЬг Зег	11е 10	Суз	Зег	Ьеи	Туг	С1п 15	Ьеи

С1и Азп Туг Суз Азп

- 116 014887 <210> 113 <211> 30 <212> РК.Т <213> Искусственная последовательность <220>

<223>

Мутант инсулина Ното зарЬепз

<220>

<221>	М13С_ГЕАТиКЕ '
<222>	(1)-(1)
<223>	X = любая аминокислота

<4 00>

119

Хаа

Уа1

Азп

61п

Н1з

Ьеи

Суз

С1у

Азр

Н1з

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи Туг

1

5

10

15

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

РНе

Туг

Ткг

Рго

Ьуз

Ткг

20

25

30

<210> 120 ' <211> 21 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутант инсулина Ното зариепз

<400>	120
С1у Ые 1	Уа1	С1и	С1п Суз Суз 5	Ткг Зег Не Суз Зег 10	Ьеи Туг С1п Ьеи 15
С1и Азп	Туг	Суз 20	Азп

- 117 014887 <210> 121 <211> 29 <212> РК.Т <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутант инсулина Ното зарбепз <400>121

РЬе Уаб 1

Азп

Сбп

Нбз 5

Ьеи Суз

Сбу

Зег

Нбз 10

Ьеи

Уаб

Сби

Аба

Ьеи 15

Туг

Ьеи Уаб

Суз

Сбу 20

Сби

Агд Сбу

РЬе

Туг 25

ТЬг

Рго

Ьуз

ТЬг

<210>

122

<211>

21

<212>

РК.Т

<213>

Искусственная последовательность

<220>

<223>

Инсулин

Ното

зархепз

<400>

122 '

Сбу Не 1

‘ Уаб

Сби

Сбп 5

8ег Суз

ТЬг

Зег

11е 10

Зег

Ьеи

Туг

Сбп 15

Ьеи

Сби Азп Туг Суз Азп <210> 123' <211>30 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность

- 118 014887 <220>

<223> Инсулин Ното	зархепз
<400> 123
РНе Ча1 Аеп	С1п	Н1з	Ьеи Суз	С1у	Зег	Азр	Ьеи	Ча1	С1и	А1а	Ьеи Туг
1		5				10					15
Ьеи 7а1 Суз	С1у	С1и	Агд С1у	РНе	РНе	Туг	ТНг	Ьуз	Рго	ТНг
	20				25					30

<210> 124 <211> 79 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин <400>124

Меб 1

Азр

Рго

С1у

Азр 5

Рго

С1и

Суз

Ьеи

61и 10

ст

Ьеи

Агд

Агд 15

Ьеи

С1у

Зег

Ча1

С1и

Ча1

С1и

Ча1

ТНг

С1у

ТНг

Ча1

ΗΪ3

Ча1

С1и

20

25

30

Ча1

Зег

Рго

61и

Азр

Рго

С1у

Азр

Рго

С1и

Суз

Ьеи

С1и

С1п

Ьеи

35

40

45

Агд

Ьеи

С1у

Зег

Ча1

С1и

Ча1

61 и

Ча1

ТНг

С1у

61 у

ТНг

Ча1

50

55

60

ΗΪ3

Ча1

51и

Ча1

Зег

Рго

С1у

С1и

Агд

51 у

РНе

Туг

Суз

Азп

65

70

75

<210>125 <211>87 <212> РВ.Т <213> Искусственная последовательность

- 119 014887 <220 <223> Инсулин <400125

Мес 1

Ьеи

Ьуз

С1и

Ьуз 5

Ьуз

Туг

Зег

Рго

Азр 10

Рго

С1у

Азр

Рго

С1и 15

Суз

Ьеи

С1и

С1п

Ьеи

Агд

Ьеи

С1у

Зег

Уа1

С1и

Уа1

С1и

Уа1

20

25

30

ТЬг

С1у

ТЬг

Уа1

ΗΪ3

Уа1

С1и

Уа1

Зег

Рго

61и

Азр

Рго

61 у

Азр

35

40

45

Рго

С1и

Суз

Ьеи

С1и

С1п

Ьеи

Агд

Ьеи

С1у

Зег

Уа1

С1и

50

55

60

Уа1

С1и

Уа1

ТЬг

С1у

ТЬг

Уа1

Н13

Уа1

С1и

Уа1

Зег

Рго

С1у

С1и

65

70

75

80

Агд С1у РЬе РЬе Туг Суз Азп

85' <210 126 <211>23 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Слитый белок инсулина <220 <221> М15С_ЕЕАТиЕЕ <222> (5)..(5) <223> X = любая аминокислота <220

- 120 014887

<221>	М13С	_ГЕАТОКЕ
<222>	(18)	• . (18)
<223>	X =	любая аминокислота
<400>	126

Меб А1а ТЬг Зег Хаа Зег ТЬг Ьуз Ьуз ТЬг С1п Ьеи С1п Ьеи С1и Н1з 15 1015

Ьеи Хаа Ьеи Азр Ьеи С1п Меб .

<210>127 <211>23 <212> РЙТ <213> ЕзсЬегисЫа соН <220 <221? М13С_РЕАТЦЕЕ <222> (14)..(14} <223> X = любая аминокислота <220 <221> М13С_ГЕАТиК.Е <222> (17)..(17) <223> X = любая аминокислота <400> 127

ТЬг Меб Не ТЬг Азр Зег Ьеи А1а Уа1 Уа1 Ьеи С1п Агд Хаа Азр Тгр 15 10 15

Хаа Рго С1у Уа1 ТЬг С1п Ьеи

- 121 014887

<210>	128
<211>	96
<212>	РЕТ
<213>	ВгеУ1ЬасН1из ЬгеУ13
<400>	128

Азп 1

£ег

Уа1

Ьеи А1а 5

5ег А1а

Ьеи

А1а

Ьеи 10

ТЬг

Уа1

А1а

Рго

МеЬ 15

А1а

РЬе

А1а

Азп

Зег

Азр

Зег

С1и

Зег

Рго-

Ьеи

Зег

Шз

Азр

С1у

Туг

Зег

20

25

30

Ьеи

Н1з

Азр

С1у

Уа1

Зег

МеЬ

Туг

11е

С1и

А1а

Ьеи

Азр

Ьуз

РЬе

Уа1

35

40

45

Азп

С1п

ΗΪ3

Ьеи

Суз

61у

Зег

Низ

Ьеи

\7а1

С1и

АЬа

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

50

55

60

Суз

61у

С1и

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

С1у

Не

Уа1

С1и

С1п

65

70

75

80

Суз

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

Суз

Азп

90 95 <210> 129 <211> 25 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Слитый белок инсулина <400>129

Азр ТЬг ТЬг МеЬ Рго А1а С1у С1у С1у С1у С1у С1у С1п Н1з Ьеи Суз

5' 1015

31у Рго Ηίδ Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи Туг

25'

- 122 014887 <210> 130 <211> 6 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Слитый белок инсулина <400>130

Ьеи С1и Азп Туг Суз Азп <210>131 <211> 22 .

<212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Слитый белок инсулина

<400>	131
Меб ТЬг	Меб	Не	ТЬг	Азр 5ег	Ьеи С1и РЬе	С1п А1с1 Τιτρ С1у С1у СТу
1			5		10	15
С1у С1у	Тгр	Меб	Агд	РЬе
		20
<210>	132
<211>	22
<212>	РКТ

<213> Искусственная последовательность <220>

- 123 014887 <223> Слитый белок инсулина

<400>	132
МеД Уа1 Леи 1	Агд	РЬе 5	Леи Рго	Леи Леи А1а 10	Леи Леи Уа1 Леи Тгр 61и 15
Рго Луз Рго	А1а 20	61п	А1а
<210>	133
<211>	60
<212>	РКТ

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мини-проинсулин <400> 133

РЬе 1

Уа1

Азп

С1п

ΗΪ3 5

Леи

Суз

С1у 8ег

Н1з 10

Леи Уа!

С1и

А1а

Леи 15

Туг

Леи

Уа1

Суз

С1у

51и

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Луз

ТЬг

Агд

20

25

30

Туг

Рго

С1у

Азр

Уа!

Луз

Агд

61у

Не

Уа!

С1и

С1П

Суз

ТЬг

Зег

40 45

Не Суз Зег Леи Туг С1п Леи С1и Азп Туг Суз Азп

50
<210>	134
<211>	21
<212>	РКТ
<213>	Ното
<400>	134

С1у Не Уа! С1и С1п Суз Суз Луз Зег 11е Суз	Зег Леи Туг 61п Леи
1	5	10	15

- 124 014887

С1и Азп Туг Суз Азп <210>135 <211>30 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400>135

Рке Уа1 1

Азп

С1п

ΗΪ5 5

Ьеи

Суз

СЬу

Зег

Н12 10

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи 15

Туп

Ьеи Уа1

Суз

СЬу

С1и

Агд

СЬу

Рке

Туг

Ткг

Рго

Ьуз

Ткг

20

25

30

<210>

136

<211>

21

<212>

РКТ

<213>

Ното

еархепз

<400>

136

СЬу Не

Уа1

(31 и

С1п

Суз

Ьуз

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

1

5

10

15

61и Азп Туг Суз Азп <210>137 <211>30 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400>137

- 125 014887

РЬе Уа1

Азп

С1п

Ηιξ

Ьеи

Суз

С1у

Зег

Н1з

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи Туг

1

5

10

15

Ьеи Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

РЬе

РНе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

ТЙГ

20

25

30

<210>

138

<211>

14

<212>

РЕТ

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин Ното зартепз <400>133

Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи Туг Ьеи Уа1 Суз С1у <31и Агд С1у С1у 1510 <210>139 <211> 21 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <220>

<221> М13С_ГЕАТиКЕ <222> (8)..(8) <223> X = любая аминокислота

<400>	139
С1у 11е 1	Уа1	С1и	С1п Суз Суз Хаа 5	Зег Не Суз Зег 10	Ьеи Туг С1П Ьеи 15
С1и Азп	Туг	Суз 20	Азп

126 014887 <210> 140 <211> 30 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223>

Инсулин 1

Ното

зархепз

<400>

140

РЬе Уа1

Азп

С1п

НЬз

Ьеи Суз

61У

Зег

Н15

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи Туг

1

5

10

15

Ьеи Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд Й1у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

ТЬг

20

25

30

<210> 141 <211> 21 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин Ното зарЬепз <220>

<221> М13С_РЕАТиВЕ <222> (8)..(8) <223> X = любая аминокислота

<400>	141
С1у Не	Уа1	С1и	С1п Суз Суз Хаа	Зег Не Суз	Зег Ьеи Туг С1п Ьеи
1			5	10	15
51и Азп	Туг	Суз	Азп
		20

- 127 014887 <210> 142 <211> 30 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Инсулин Ното зарбепз <400>142

РЬе Уаб	АЗП	Сбп	Нбз Ьеи Суз Сбу	Зег	Нбз	Ьеи	Уаб	Сби	Аба	Ьеи	Туг
1			5		10					65
Ьеи Уаб	Суз	Сбу	Сби Агд Сбу РЬе	РЬе	Туг	ТЬг	Рго	Ьуз	ТЬг
		20		25					30
<210>	143
<211>	21
<212>	РЕТ
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Мутант мини-проинсулина
<400>	143
Сбу 11е	: Уаб	Сби	Сбп Суз Суз ТЬг	Зег	Не	Суз	Зег	Ьеи	Туг	Сбп	Ьеи
1			5		10					15

Сби Азп Туг Суз Азп <210>144 <211>29 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность

- 128 014887 <220>

<223> Мутант мини-проинсулина

<400>

144

РЬе Уа1

Азп

С1п

ΗΪ3

Ьеи

Суз

С1у

Зег

Азр

Ьеи

Уа1

С1и А1а

Ьеи Тух

1

5

10

15

Ьеи Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Азр

Ьуз

20

25

<210>

145

<211>

50

<212>

РКТ

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутант мини-проинсулина <400>145

РЬе 1

Уа1

Азп С1п

Н1з 5

Ьеи

Суз

С1у

Зег

Азр 10

Ьеи

Уа1

С1и

А1а

Ьеи 15

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Азр

Ьуз

С1у

11е

Уа1

20

25

30

С1и

С1п

Суз

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

С1п

Ьеи

С1и

Азп

Туг

35

40

45

Суз Азп <210>146 <211>3 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220

- 129 014887

<223>	С-лептид инсулина
<400>	146

А1а А1а Ьуз

<210>	147
<211>	3
<212>	РЕТ
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>	С-пептид инсулина
<400>	147

Азп Ьуз Агд

<210>	148
<211>	6
<212>	РЕТ
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>	С-пептид инсулина
<400>	148

Агд Агд Ьув С1п Ьуз Агд

1	5
<210>	149
<211>	4
<212>	РЕТ
<213>	Искусственная последовательность

- 130 014887 <220>

<223>	Сайт расщепления
<400>	149

Агд Агд Ьуз Агд

<210>	150
<211>	4
<212>	РКТ
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>	Последовательность, удерживающая ЕК
<400>	150

Ьуз Азр С1и Ьеи

<210>	151 . .
<211>	4
<212>	РКТ '
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>	Последовательность, удерживающая ЕВ
<400>	151

Н1з Азр С1и Ьеи

<210>	152
<211>	4
<212>	РКТ
<213>	Искусственная последовательность.

- 131 014887 <220>

<223>	Последовательность, удерживающая ЕК
<4 00>	152

Азр Азр С1и Ьеи

<210>	153
<211>	4
<212>	РКТ
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>	Последовательность, удерживающая ЕК
<400>	153

А1а Азр С1и Ьеи

<210>	154
<211>	4
<212>	РКТ
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>	Последовательность, удерживающая ЕК
<400>	154

5ег Азр С1и Ьеи

<210>	155
<211>	4
<212>	РНТ

- 132 014887 <213> Ьусорегзюоп езсиЬепбиш М111.

<400>155

Ηί3 Азр С1и РЬе <210>156 <211>113 <212> РЕТ <213> АгаЫборзгз бЬаНапа <400>156

Меб 1	А1а	Азр	ТЬг	А1а 5	Агд	С1у	ТЬг
61п	Туг	Рго	Меб 20	Меб	61 у	Агд	Азр
Агд	61 у	Зег 35	Азр	Туг	Зег	Ьуз	Зег 40
А1а	Уа1 50	ТЬг	А1а	С1у	С1у	Зег 55	Ьеи
Уа1 65	61у	ТЬг	Уа1	11е	А1а 70	Ьеи	ТЬг
РЬе	Зег	Рго	11е	Ьеи 85	Уа1	Рго	А1а
ТЬг	С1у	РЬе	Ьеи 100	Зег	Зег	б1у	61у
РЬе	Зег	Тгр 115	11е	Туг	Ьуз
<210>	157
<211>	187

Н1з	Н1з 10	Азр	11е	11е	61у	Агд 15	Азр
Агд 25	Азр	61п	Туг	61п	Меб 30	Зег	61у
Агд	61п	11е	А1а	Ьуз 45	А1а	А1а	ТЬг
Ьеи	Уа1	Ьеи	Зег 60	Зег	Ьеи	ТЬг	Ьеи
Уа1	А1а	ТЬг 75	Рго	Ьеи	Ьеи	Уа1	11е 80
Ьеи	11е 90	ТЬг	Уа1	А1а	Ьеи	Ьеи 95	11е
РЬе 105	61у	11е	А1а	А1а	11е 110	ТЬг	Уа1

- 133 014887 <212> РКТ <213> Вгаззгса париз <400> 157

Мер 1

А1а

Азр

ТЬг А1а 5

Агд

ТЬг

Н1з

ΗΪΞ Азр 10

Уа1

ТЬг

Зег

Агд

Азр 15

С1п

Туг

Рго

Агд

Азр

Агд

Азр

61п

Туг

Зег

МеЬ

Не

61у

Агд

Азр

Агд

Азр

20

25

30

61п

Туг

Зег

Мер

МеЬ

61у

Агд

Азр

Агд

Азр

61 η

Туг

Азп

Мер

Туг

61у

35

40

45

Агд

Азр

Туг

Зег

Ьуз

Зег

Агд

С1п

11е

А1а

Ьуз

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

Уа1

50

55

60

ТЬг

А1а

61у

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Уа1

С1у

65

70

75

80

ТЬг

Уа1

11е

А1а

Ьеи

ТЬг

Уа1

А1а

ТЬг

Рго

Ьеи

Уа1

11е

РЬе

Зег

85

90

95

Рго

Не

Ьеи

Уа1

Рго

А1а

Ьеи

11е

ТЬг

Уа1

А1а

Ьеи

11е

ТЬг

61у

100

105

110

РЬе

Ьеи

Зег

С1у

РЬе

А1а

11е

А1а

11е

ТЬг

Уа1

РЬе

Зег

115

120

125

Тгр

11е

Туг

Ьуз

Туг

А1а

ТЬг

61у

61и

Н1з

Рго

61п

С1у

Зег

Азр

Ьуз

130

135

140

Ьеи

Азр

Зег

А1а

Агд

МеЬ

Ьуз

Ьеи

61у

ТЬг

Ьуз

А1а

61 п

Азр

11е

Ьуз

145

150

155

160

Азр

Агд

А1а

61п

Туг

61у

С1п

61 η

Н1з

ТЬг

61у

61 у

61и

Η13

Азр

165

170

175

Агд

Азр

Агд

ТЬг

Агд

61у

61п

ΗΪ5

ТЬг

180

185

<210> 158

- 134 014887

<211>	748
<212>	ДНК
<213>	АгаЫЛорзде ЬНаПапа
<400>	158

ЬассаЬдддд	1сааадасдд	ада!да!дда	дададасдса	аЬддс1асдд	1ддсГссс1а	60
Ьдсдссдд!с	ас11асса1с	дссд1дс1сд	1дЫдас11д	даРдаЬадас	11сс1ааасс	120
11а1а1дсса	ададсаИдс	аадсассада	сададаасас	ссдОасддаа	сЬссаддсса	180
РаадааНас	ддасИадкд	11с1Осааса	дсаОд!с!сс	11с11сда1а	1сда1да1аа	240
	ЬасссИддд	адассЪасЬс	1ддас1дсда	аЬдсЫдд! 1	1саа!а1са1	300
ДдддОсдсИ	абааНадссд	с!д11а1саа	ссЬдасссИ	адс1а1дсса	с1с11ссддд	360
д!дд11ассО	1сасс111с!	1ссс1а1а1а	сабасасаас	аЪасасаадр	сааадса!дд	420
аадЬдаЫса	ааааса!а1д	асаабдаадд	ааддИЬаЬд	ссдд!даа1с	МдадИдаЬ	480
аНГадсааа	РаЬдсдаааа	ссИдссада	саадЫдад!	сИддадаас	1а1дддада1	540
дасадаадда	аассдЪдасд	сООдддасаО	ЫЫддаЬдд	абсдсаддса	аааДададбд	600
дддасОдИд	1ас11дс1ад	сааддда1да	адаадддИ!	11д1саааад	аадс! аЫад	660
дсддкдЬИс	даОддаадс!	1д11сдад1а	сЬдЪдссааа	а1с1асдс1д	дЪаЬсадрда	720
адасаадаса	дсабасТасд	ссаЬддаЬ				748

<210>	159
<211 >	738
<212>	ДНК
<213>	АгаЫФорзхз НЬа11ап.а
<4 00>	159

аЬддддЬсаа	адасддада!	даоддадада	дасдсаа!дд	с!асддрддс	1ссс1а1дсд	60
ссддРсасИ	ассассдссд	1дс1сд1д61	дасРРддаОд	аРадасЮсс	1ааасс11а1	120
а!дссаадад	саИдсаадс	ассадасада	даасасссд!	асддаас!сс	аддсса!аад	180
ааНасддас	11ад1д11с1	1саасадса1	д1с1сс11с1	Ьсдаба1сда	ЬдаОааРддс	240
а!саЫ1асс	сИдддадас	сРасРсРдда	с! дсдааЬдс	11дд161саа	ЬаЪсаИддд	300
Нсдс1Ьа1аа	Радссдсбд!	1а1саасс1д	асссИадс!	а1дссас1с1	1ссдддд1дд	360

- 135 014887

ССассССсас	сШсйссс	СабаСасаСа	сасаасабас	асаадСсааа	дсаСддаадб	420
даССсааааа	саСаСдасаа	Сдааддаадд	СССаСдссдд	СдаабсССда	дССдабаССС	480
адсаааСаСд	сдаааассбб	дссадасаад	ССдадСсССд	дадаасСаСд	ддадабдаса	540
дааддааасс	дСдасдсССд	ддасаССССС	ддаСддаСсд	саддсааааС	ададСдддда	600
сбдССдСасС	СдсСадсаад	ддаСдаадаа	дддСССССдС	саааадаадс	СаССаддсдд	660
СдбССсдаСд	даадсССдСС	сдадбасСдС	дссааааСсС	асдсбддСаб	садбдаадас	720
аадасадсаб	асСасбаа					738

<210> 160 <211> 1047 <212> ДНК <213> Зезашит ίηάίουιπ <400> 160

абддаСсСаа	СссасасССС	ссбсаасССа	аСадсСсссс	сСССсассСС	сССсССссСС	60
сСсСССССсС	СдссасссСС	ссадаССССс	аадССсССсс	СССсааСсСС	дддсасссСС	120
ССсадсдадд	абдбсдсСдд	аааадСсдбс	дСсабсассд	дсдссСсссс	сддсаСсддс	160
дааадСсССд	сССасдадба	Сдсбаадада	ддддсдСдсС	СддСдсССдс	Сдсаадаадд	240
даааддадбс	Сбсаадаадб	ддссдааадд	дсдсдсдаСС	СддддЬсдсс	ддасдбсдбд	300
дбддбссддд	ссдабдССбс	дааддсддад	дасбдсадда	аддССдССда	СсадасСаСд	360
ааСсдсСССд	даадаССдда	СсассСддСс	ааСаасдсСд	дааССаСдСс	адСССсаабд	420
сбддаадаад	ССдаадабаС	СасСддССас	ададааасба	СддаСабсаа	сССсбддддс	480
СаСдСдСаба	СдасссдаСС	Сдссдсссса	СассССадда	абадсададд	ссдааССдС С	540
дбасСССсСС	сабссадССс	ССддаСдссС	асбссдадда	СдадСССССа	саабдсаадс	600
ааадсддсда	СССсасааСС	ССССдадаса	сСдсдддСдд	аасссддссс	сдаСаСаддс	660
аСаасссССд	СдасСссадд	аССсаСадаа	СсСдаасССа	сссааддсаа	аССсСасааС	720
дсбддсдаас	дбдСааССда	СсаддасаСд	ададабдСас	аадСдадсас	дасСссааС с	780
сСдадддбдд	ааадбдсддс	ааддСсаабс	дСдаддадсд	сдаСссдСдд	адааадаСас	840
дСдасададс	сддссбддСС	СадддССасС	ЬаЪ£ддбдда	адсСаССсСд	сссСдаддб д	900
аСддадСддд	СаСССадасС	даСдбасбсд	дссадсссдд	дСдадссдда	дааддааасд	960

- 136 014887 бббддсаада аддббббдда ббасасадда дбдаадбссб бдсбббассс ддааассдбд 1020 саадббссдд адсссаадаа бдаббаа 1047 <210> 161 <211> 25 <212> РКТ <213> Табак, сигнальная последовательность белка, родственного патогенезу (РК-3)

<400>	161
Меб Азп. 1	РЬе	Леи	Ьуз 5	Зег	РЬе	Рго	РЬе	Туг А1а 10	РЬе Ьеи Суз РЬе 61у 15
61п Туг	РЬе	Уа1 20	А1а	Уа1	ТЬг	Н1з	А1а 25
<210>	162
<211>	64
<212>	РВТ

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Лидерная последовательность альфа-фактора <400> 162

А1а 1

Рго Уа1

Азп

ТЬг 5

ТЬг С1и

Авр

61и

ТЬг 10

А1а

С1п

С1и

А1а 15

Уа1

11е

С1у

Туг

Зег

Азр

Ьеи

С1и

31 у

Азр

РЬе

Азр

Уа1

А1а

7а1

Ьеи

Рго

20

25

30

РЬе

Зег

Азп

Зег

ТЬг

Азп

01 у

Ьеи

РЬе

Не

Азх

ТЬг

11е

35

40

45

А1а

Зег

Не

А1а

Ьуз

С1и

С1у

Уа1

Зег

Ьеи

Меб

А1а

Ьуз

Агд

50

55

60

- 137 014887 <210> 163 <211> 63 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220> .

<223> Лидерная последовательность альфа-фактора <400> 163

А1а 1

Рго

Уа1 Азп

ТЬг 5

ТЬг

С1 и

Азр

С1и

ТЬг 10

А1а

С1п

А1а

51и

А1а 15

Уа1

Не

С1у

Туг

Зег 20

Азр

Ьеи

С1и

С1у

Азр 25

РЬе

Азр

Уа1

А1а

Уа1 30

Ьеи

Рго

РЬе

Зег

Азп 35

Зег

ТЬг

Азп

аьу 40

Ьеи

РЬе

11е

Азх 45

ТЬг

11е

А1а

Зег

11е

А1а

Ьуз

С1и

С1у

Уа1

Зег

МеЬ

А1а

Ьуз

Агд

55 60 <210>164 <211>15 <212> РВ.Т <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Лидерная последовательность альфа-фактора <400> 164

С1п Рго 11е Азр С1и Азр Азп Азр ТЬг Зег Зег МеЬ А1а Ьуз Агд

1
<210>	165
<211>	43
<212>	РКТ

- 138 014887 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Лидерная последовательность альфа-фактора <400> 165

С1п 1

Рго

Не

Азр

Азр 5

Ткг

61и

Зег

Азп

Ткг 10

Ткг

Зег

Уа1

Азп

Ьеи 15

Мер

А1а

Азр

Ткг 20

С1и

Азр

Агд

Рке

А1а 25

Ткг

Азп

Ткг

Ьеи 30

А1а

Ьеи

Азр

Уа1

Уа1 35

Азп

Ьеи

11е

Зег

Мек 40

А1а

Ьуз

Агд

<210> 166 <211> 43 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Лидерная последовательность альфа-фактора <400>166

С1п 1

Рго

11е

Азр

Азр 5

Ткг

С1и

Зег

С1п

Ткг 10

Ткг

Зег

Уа1

Азп

Ьеи 15

Мек

А1а

Азр

Ткг 20

С1и

Азр

Агд

Рке

А1а 25

Ткг

С1п

Ткг

Ьеи 30

А1а

Ьеи

Азр

Уа1

Уа1 35

Азп

Ьеи

11е

Зег

Мек 40

А1а

Ьуз

Агд

<210>167 <211>43 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность

- 139 014887 <220>

<223> Лидерная последовательность альфа-фактора <400> 167

Сбп 1

Рго

Не

Азр

Азр 5

ТЬг

Сби

Зег

Сбп

ТЬг 10

ТЬг

Зег

Уаб

Азп

Ьеи 15

Меб

Аба

Азр

ТЬг 20

Сби

Азр

Агд

РЬе

Аба 25

ТЬг

Сбп

ТЬг

Ьеи 30

Аба

Ьеи

Азр

Уаб

Уаб 35

Азп

Ьеи

ббе

Зег

Меб 40

Аба

<210> 168 <211> 43 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Лидерная последовательность альфа-фактора <400>168

Сбп 6

Рго

1бе

Азр

Азр 5

ТЬг

Сби

Зег

Азп

ТНг 60

ТЬг

Зег

Уаб

Азп

Ьеи 15

Меб

Аба

Азр

ТЬг 20

С1и

Азр

Агд

РЬе

Аба 25

ТЬг

Азп

ТЬг

Ьеи 30

Аба

Ьеи

Азр

Уаб

Уаб 35

Азп

Ьеи

Не

Зег

Меб 40

Аба

<210>169 <211>45 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность

- 140 014887 <220>

<223> Лидерная последовательность альфа-фактора <400>169

61п 1

Рго

Не

Азр

Азр 5

ТНг

61и

Зег

Азп

ТЬг 10

ТЬг

Зег

Уа1

Азп

Ьеи 15

МеЬ

А1а

Азр

ТЬг

01и

Азр

Агд

РЬе

А1а

ТЬг

Азп

ТЬг

Ьеи

А1а

Е1у

20

25

30

С1у

Ьеи

Азр

Уа1

Азп

Ьеи

11е

Зег

МеЬ

А1а

Ьуз

Агд

35

40

45

<210>170 <211>44 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Лидерная последовательность альфа-фактора <400>170

С1п 1

Рго

11е

Азр Азр 5

ТЬг

С1и

Зег

С1п

ТЬг 10

ТЬг

Бег Уа!

Азп

Ьеи 15

Меф

А1а

Азр

ТЬг

61и

Зег

А1а

РЬе

А1а

ТЬг

С1п

ТЬг

Азп

Бег

61у

С1у

20

25

30

Ьеи

Азр

Уа1

е1у

Ьеи

Не

Зег

Мел

А1а

Ьуз

Агд

35

40

<210>171 <211>44 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

- 141 014887 <223> Лидерная последовательность альфа-фактора <400> 171

С1п Рго 1	Не	Азр	Азр 5	ТЬг	61и	Зег
А1а Азр	Азр	ТНг 20	61ц	Зег	А1а	РНе
Ьеи Азр	Уа1 35	Уа1	61у	Ьеи	11е	Зег 40
<210>	172
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Пептид разделителя
<400>	172
,, гэ ,, 'ищи ^д_1_ и	А1а	й1и.	А1а	С 1'3	А1а	31 ц
1			5
<210>	173
<211>	6
<212>	РКТ
<213>	Искусственная по·	□лед-	оват

61п	Тпг 10	ТНг	Зег	Уа1	Азп	Ьеи 15	Меб
А1а	ТНг	С1п	ТЬг	Азп	Зег	61у	61 у
25					30
МеЬ	А1а	А1а	А1а

<220>

<223>	Пептид разделителя
<400>	173

61и 6111 С1у 61и Рго Ьуз

1	5
<210>	174
<211>	40
<212>	РКТ

- 142 014887 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сайт расщепления <400>174

МеД 1

А1а

С1и

Не ТЬг 5

Агд 11е

Рго Леи Туг 10

Луе

С1у Луз

Зег

Леи 15

Агд

Луз

А1а

Пей

Ьуз

С1и

Н1з

С1у

Пей

С1и

Азр

РЬе

Леи.

С1п

Луз

С1п

20

25

30

С1п

Туг

С1у

Не

Зег

Луз

РЬе

35

40

<210>175 <211>27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400>175 дсаЬдсЬдас аЬДдРдаДда· сасадЬс27 <210>176 <211>43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400> 176 аадсНдсаД ЬДаааЬасДс дадасДдЬда дадДддДдсс ЬЬд

- 143 014887

<210>	177
<211>	70
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>	Праймер
<400>	177

даадааддад адссРаадРЬ ЬдЬЬааЬсаа саЬсМРдОд даЬсЬсаЬсД Рд-Ь-ЬдаддсР 60 сОсОассРЪд70

<210>	17Θ
<211>	56
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

Праймер

<400>178 ссЫаддадЬ. дРадаааааб ссЬсЬЬкоЬс сасасасаад дбадададсс Ьсааса56

<210>	179
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

Праймер

<400>179 сбааддсОдс Оаадддаа'Ы; д21

<210>

180

- 144 014887 <211> 83 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400>180 аадсббсадб бдсаабадбб сбссааббдд Ъааадбдадс ааабадаадб дсаасаббдб60 бсаасааббс ссббадсадс сбб83 <210> 181 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Праймер <400>181 сбсдадбсаа ссааббдабд асасбдаабс30 <210> 182 <211>41 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400>182 аадсббсааа дМсабссб! дррдсаабад ббсбссаабб д41 <210>183 <211> 21

- 145 014887 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Праймер <400183 аадсбЬсадЬ ЬдсаабадЫ с21 <210>184 <211> 26 <212> ДНК '' <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400>184 дсабдсссаа ссааббдабд асасбд26 <210185 <211> 34 .

<212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400>185 дсабдсабдс сбббдббааб саасаЬсбЫ: дбдд34 <210> 186 <211>54 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 146 014887 <220>

<223> Праймер <400>186 асаббдббса асааббссбс бсбббсббсб адбсббадда дбдбадаааа абсс54 <210>187 <211>29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400>187 дсабаадсбб сааадсбсаб ссбббдадс29 <210> 188 <211>387 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты слитого белка инсулина <400> 188

абдаасббсс	ббаадбсббб	сссбМсбас	дс! сСссСУ	дбббсддбса	абасббсдбб	60
дсбдббасдс	абдсссаасс	ааббдабдас	асбдаабссс	адассасдбс	адбдаассбс	120
абддссдабд	абасбдадад	сдсдбббдсб	асасааасаа	аббсдддадд	бсббдасдбб	180
дбсддаббда	бсбссабддс	баадададаа	дааддададс	сбаадбббдб	баабсаасаб	240
сбббдбддаб	сбсабсббдб	бдаддсбсбс	бассббдбдб	дбддадааад	аддабббббс	300
басасбссба	аддсбдсбаа	дддааббдбб	даасаабдбб	дсасббсбаб	ббдсбсасбб	360
бассааббдд	адаасбаббд	саасбда				387

- 147 014887 <210> 189 <211> 128 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Белок фактора инсулина <400>189

Меб 1

Азп

РЬе

Ьеи

Ьуз 5

Зег

РЬе

Рго

РЬе

Туг 10

Аба

РЬе

Ьеи

Суз

РЬе 15

С1у

С1п

Туг

РЬе

Уаб

А1 а

Уа1

ТЬг

Н15

Аба

Сбп

Рго

Не

Азр

ТЬг

Сби

20

25

30

Зег

Сбп

ТЬг

Зег

Уаб

Азп

Ьеи

Меб

Аба

Азр

ТЬг

Сби

Зег

Аба

35

40

45

РЬе

Аба

ТЬг

Сбп

ТЬг

Азп

Зег

Сбу

Ьеи

Азр

Уаб

Сбу

Ьеи

1бе

50

55

60

Зег

Меб

Аба

Ьуз

Агд

Сби

Сбу

Сби

Рго

Ьуз

РЬе

Уаб

Азп

Сбп

Н1з

65

70 '

75

80

Ьеи

Суз

Сбу

Зег

Н13

Ьеи

Уаб

Сби

Аба

Ьеи

Туг

Ьеи

Уаб

Суз

Сбу

Сби

85

90

95

Агд

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

Аба

Ьуз

Сбу

11е

Уаб

Сби

Сбп

100

105

110

Суз

ТЬг

Зег

Не

Суз

Зег

Ьеи

Туг

Сбп

Ьеи

Сби

Азп

Туг

Суз

Азп

115

120

125

<210>190 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 148 014887 <220>

<223> Праймер <400>190 ббсдбдаасс аасасббд18 <210>191 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400>191 аадсбббсад ЫасадбадЬ20 <210>192 <211>17 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400>192 дсабдсабдО дЫдадс17 <210>193 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22 0 <223> Праймер

- 149 014887 <400>193 ддкадкдкдс кддсса16 <210>194 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер <400>194 ддкддссадс асаскасскк сдкдаассаа сасккдкд38 <210>195 <211> 1020 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты слитого белка инсулина <400> 195

акддсддака	садскададд	аасссаксас	да!акеа!од	дсададасса	дкасссдакд	60
акдддссдад	ассдадасса	дкассадакд	кссддасдад	дакскдаска	скссаадкск.	120
аддсадаккд	скааадскдс	ааскдскдкс	асадскддкд	дкксссксск	кдкксксксс	180
адссккассс	ккдккддаас	кдксакадск	ккдаскдккд	саасасскск	дсксдккакс	240
кГсадсссаа	кссккдкссс	ддсксксакс	асадккдсас	кссксаксас	еддккккекк	300
ксскскддад	ддкккддсаб	кдссдскака	ассдккккск	сккддаккка	саадкаадса	360
сасаНкакс	аксккасккс	акааккккдк	дсаакакдкд	сакдсакдкд	ккдадссадк	420
адсШдда!	сааккккккк	ддкадаакаа	сааакдкаас	аакаадааак	кдсаааккск	480
адддаасакк	кддккааска	аакасдааак	ккдасскадс	кадеккдаак	дкдкекдкдк	540
акаксакска	какаддкааа	акдсккддка	кдакасскак	кдаккдкдаа	каддкасдса	600

- 150 014887

асдддададс	асссасаддд	абсадасаад	Ыддасадбд	сааддабдаа	дббдддаадс	660
ааадсбсадд	абсбдааада	сададсбсад	басбасддас	адсаасабас	бддбддддаа	720
сабдассдбд	ассдбасбсд	бддбддссад	сасасбассб	бсдбдаасса	асасббдбдб	780
ддабсбсабс	бсдббдаадс	1 сб сбасббд	дбббдбддбд	адададдабб	сЫсбасасб	840
ссбаадасса	даадддаадс	бдаддасббд	саддбдддас	аадббдадбб	дддбддаддб	900
ссбддадсад	дабсбббдса	ассбсбсдсб	ббддааддбб	сбббдсадаа	дададдаабс	960
дббдаасааб	дббдсасббс	аабсбдббсб	ббдбабсадб	бддадаасба	сбдбаасбда	1020

<210> 196 <211> 257 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Слитый белок инсулина <400> 196

Меб 1

А1а

Азр

ТЬг

А1а Агд 5

С1у

ТЬг

Ηίδ

Низ 10

Азр

11е

С1у

Агд 15

Азр

С1п

Туг

Рго

Меб

С1у

Агд

Азр

Агд

Азр

С1п

Туг

С1п

Меб

Зег

Й1у

20

25

30

Агд

61у

Зег

Азр

Туг

Зег

Ьуе

Зег

Агд

61п

Не

А1а

Ьуз

А1а

ТЬг

35

40

45

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

С1у

31у

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Ьеи

50

55

60

Уа1

С1у

ТНг

Уа1

11е

А1а

Ьеи

ТЬг

νβΐ

А1а

ТЬг

Рго

Ьеи

Уа1

11е

65

70

75

80

РЬе

Зег

Рго

Не

Ьеи

Уа1

Рго

А1а

Ьеи

11е

ТЬг

Уа1

А1а

Ьеи

11е

85

90

95

ТЬг

С1у

РЬе

Ьеи.

Зег

С1у

РЬе

С1у

11е

А1а

11е

ТЬг

Уа1

100

105

110

- 151 014887

РЬе

Зег

Тгр 115

Не

Туг

А1а

ТЬг

С1у С1и ΗΪ3 120

Рго

61п

С1у 125

Зег

Азр

Ьуз

Ьеи

Азр

Зег

А1а

Агд

Меб

Ьуз

Ьеи

С1у

Зег

Ьуз

А1а

61п

Азр

Ьеи

Ьуз

130

135

140

Азр

Агд

А1а

61п

Туг

61 у

С1п

61η.

ΗΪ3

ТЬг

61 у

61у

61и

Шз

Азр

145

150

155

160

Агд

Азр

Агд

ТЬг

Агд

61у

С1у

61п

Ηίε

ТЬг

РЬе

νβΐ

Азп

61п

Н1з

165

170

175

Ьеи

Суз

61у

Зег

ΗΪ3

Ьеи

Уа1

61и

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

Уа1

Суз

61у

61и

180

185

190

Агд

61у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Ьуз

ТНг

Агд

Е1и

А1а

61и

Азр

Ьеи

195

200

205

С1п

Уа1

61 у

61п

Уа1

С1и

Ьеи

61у

Рго

С1у

А1а

61 у

Зег

Ьеи

210

215

220

Е1п

Рго

Ьеи

А1а

Ьеи

61и

<31у

Зег

Ьеи

61п

Ьуз

Агд

61у

11е

Уа1

С1и

225

230

235

240

61п

Суз

ТЬг

Зег

11е

Суз

Зег

Ьеи

Туг

61п

Ьеи

61и

Азп

Туг

Суз

245

250

255

Αεη

- 152 014887

Claims

1. Способ экспрессии инсулина в семенах растения, включающий:

(ί) последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит предпочтительный для семян промотор; и (ίί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина;

(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и (c) регенерацию клетки растения в зрелое растение, способное давать семена, экспрессирующие инсулин, где указанный полипептид инсулина аккумулируется в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте в клетке растения, причем указанный окруженный мембраной внутриклеточный компартмент представляет собой эндоплазматический ретикулюм (ЕК) или масляное тельце, и по меньшей мере 0,1% общего белка семени, присутствующего в семени, представляет собой инсулин;

(й) получение, по существу, чистого инсулина из указанных семян.

2. Способ по п.1, в котором указанная химерная нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность, кодирующую пептид или полипептид, который способен удерживать полипептид инсулина в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте, где указанный окруженный мембраной внутриклеточный компартмент представляет собой эндоплазматический ретикулюм (ЕК) или масляное тельце.

3. Способ по п.2, в котором указанный пептид, удерживающий полипептид инсулина в ЕК, выбран из группы, состоящей из КИЕЬ, НИЕЬ, ΌΌΕΕ, АЭЕЬ и БИЕЬ.

4. Способ по п.1, где последовательность (и) дополнительно содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид.

5. Способ по п.4, в котором указанным сигнальным пептидом является сигнальный пептид, связанный с патогенезом табака (РК-Б).

6. Способ по п.5, в котором указанный сигнальный пептид имеет последовательность БЕР ΙΌ N0:161.

7. Способ по п.2, в котором указанным полипептидом, удерживающим полипептид инсулина в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте, является белок масляного тельца.

8. Способ по п.7, в котором указанный белок масляного тельца выбран из группы белков масляного тельца, состоящей из олеозина, калеозина и стеролеозина.

9. Способ по п.8, в котором указанные белки имеют последовательности, выбранные из группы, состоящей из БЕР ΙΌ N0:156, БЕр ΙΌ N0:157 и БЕр ΙΌ N0:158, БЕр ΙΌ N0:159 и БЕр ΙΌ N0:160.

10. Способ по п.2, в котором указанная химерная нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность, кодирующую стабилизирующий белок, слитую в рамке считывания с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей инсулин.

11. Способ по п.10, в котором указанная химерная нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид, слитую в рамке считывания с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей инсулин.

12. Способ по п.11, в котором указанный сигнальный пептид является сигнальным пептидом, связанным с патогенезом табака (РК-Б).

13. Способ по п.12, в котором указанный сигнальный пептид имеет последовательность БЕр ΙΌ N0:161.

14. Способ по п.10, в котором стабилизирующий белок обеспечивает объединение полипептида инсулина с масляным тельцем при сборе и измельчении семян.

15. Способ по п.14, в котором указанный стабилизирующий белок представляет собой одноцепочечное антитело со специфичностью к масляному тельцу.

16. Способ по п.10, в котором указанный стабилизирующий белок выбран из группы, состоящей из одноцепочечного антитела со специфичностью к масляному тельцу и В-субъединицы токсина холеры.

17. Способ по п.1, в котором химерную последовательность нуклеиновой кислоты вводят в клетку растения в условиях ядерной геномной интеграции.

18. Способ по п.1, в котором предпочтительным для семян промотором является промотор фазеолина.

19. Способ по любому из пп.1-18, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, выбрана из группы, включающей последовательности, кодирующие человеческий инсулин, свиной инсулин и бычий инсулин.

20. Способ по любому из пп.1-19, в котором последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей инсулин, является последовательность, кодирующая мини-инсулин.

21. Способ по любому из пп.1-20, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, оптимизирована в отношении кодонов растения.

- 153 014887

22. Способ получения семян растений, содержащих инсулин, включающий:

(c) регенерацию клетки растения в зрелое растение, способное давать семена; и (ά) получение семян из указанного растения, содержащих инсулин, где указанный полипептид инсулина аккумулируется в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте в клетке растения, причем указанный окруженный мембраной внутриклеточный компартмент представляет собой эндоплазматический ретикулюм (ЕК) или масляное тельце, и по меньшей мере 0,1% общего белка семени, присутствующего в семени, представляет собой инсулин.

23. Растение, способное производить семена, содержащие инсулин, который экспрессируется последовательностью химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции:

(a) последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит предпочтительный для семян промотор, и (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина, где указанный полипептид инсулина аккумулируется в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте в клетке растения, причем указанный окруженный мембраной внутриклеточный компартмент представляет собой эндоплазматический ретикулюм (ЕК) или масляное тельце, и где по меньшей мере 0,1% общего белка семени, присутствующего в семени, представляет собой инсулин.

24. Семя растения по п.23, содержащее последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции (а) первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит предпочтительный для семян промотор, функционально связанный со (Ь) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид инсулина, и последовательностью, кодирующей полипептид, который способен удерживать полипептид инсулина в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте.

25. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, связанная с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей предпочтительный для семян промотор, и содержащая последовательность, кодирующую полипептид, который способен удерживать полипептид инсулина в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте, для использования в способе по любому из пп.2-21.