JPH05505525A - 種子特異的調節配列類を介する蛋白発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 種子特異的調節配列類を介する蛋白発現発明の分野 本発明は、植物における蛋白の調節および発現で用いる種子特異的発現カセット に関する。

発明の背景 多くの植物種では、種子貯蔵蛋白は植物発芽用の支配的なアミノ酸源および栄養 源である。貯蔵蛋白につきコードする遺伝子が厳格に調節されているのはよく知 られている。種子貯蔵蛋白は発育の所定の段階で多量に生産され；発現は組織特 異的に制御されていると共に発育的にも制御されている。これらの蛋白は、一般 に、プロティンボディーまたは蛋白貯蔵小胞と呼ばれる特別のオルガネラに局在 し、実質的にプロテアーゼフリーである。多くの植物の種子は容易にこれらの貯 蔵蛋白を大量に合成できるので、種子細胞内の生物学的マシーナリーは薬理学的 および産業的要望に対して重要な蛋白合成に使用できる。かくして、貯蔵蛋白の キャラクタライゼーションならびに蛋白合成をプロティンボディーに向ける能力 は実験的、商業的、および栄養的に継続して注目されている。

主要な穀物作物の貯蔵蛋白は特によく研究されてきた。マメ科植物では、主要種 子蛋白は糖鎖非付加１１Ｓ蛋白および糖鎖付加７Ｓ画分の２のタイプによって表 されるグロブリン類である。インゲンマメ植物ファゼオラス・ブルガリス（Ｐｈ ａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）では、全種子蛋白の約５０％が、集合的に ファゼオリンとして知られている３種ポリペプチド（α、βおよびγサブユニッ ト）群によって表される。大豆（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｗａｘ ））では、主要貯蔵蛋白はβ−コングリシニンとして知られており、そのサブユ ニット（α、α°およびβ）はその属における全種子蛋白の８０％までも占める 。

代表的な単子累植物トウモロコシ（ゼア・メイス（Ｚｅａ　ｗａｙｓ））では、 蛋白ゼインはトウモロコシ種子蛋白の約８０％を占める。ゼイン産生に関わる多 （のゼイン関連遺伝子があるが、１つのタイプβ−ｚｅｉｎはコピー数が非常に 少な（、全種子蛋白の１０％を数えるに過ぎない。

しかしながら、多（の単子葉および双子葉植物の種子はある種の必須アミノ酸が 異なり、これらの種子をヒトまたは動物の食糧での支配的蛋白源として用いる場 合には、これらのアミノ酸の添加が必要となる。研究者達は、長年、高レベル発 現の種子貯蔵蛋白を組換え工学技術と組み合わせて、高栄養価植物を得ようとし てきた。例えば、マメ科植物種子は高レベルの貯蔵蛋白を含むが、グロブリンは 含硫アミノ酸に比較的乏しいという栄養的観点より該蛋白は不十分であり、マメ 科植物種子を栄養的に不完全な食糧としている。組換え技術を用いて種子貯蔵蛋 白中の硫黄量を増大させたり、興種含硫蛋白の合成に向けることができる。単子 葉植物からの種子は動物およびヒトの食糧源として広く用いられているので、こ れらの植物種用の種子特異的プロモーター・カセットの開発もまた重要である。

かくして、同様にして、必須アミノ酸リジンを欠くゼインを栄養的に完全ならし めることができる。

産業的な規模においては、かかる技術は異種蛋白または異種酵素を貯蔵小胞へと 定方向化するのに用いることができる。種子内プロテアーゼフリー領域なので、 かかる発現は豊富で容易に精製できる蛋白源として供され得る。か（して、植物 種子は商業的および産業的用途に要望されているホルモン類および酵素類を生産 する別法を提供し得る。

遺伝子工学技術を用いることにより、遺伝子を多くの植物種に移入することは既 に可能となっている；同種（宿主にとって元来のもの）および異種（外来性）植 物遺伝子の直接的な発現は十分確立されている。多数の報告は、植物種子蛋白が 他の植物に移入され、組織特異的かつ発育的に調節されて発現され［ビーケイら （Ｂｅａｃｈｙ、　ｅｔ　ａｌ）、ＥＭＢＯ４：　３０４７−３０５０　（１９ ８５）］　、ならびにプロティンボディーへ発現されている［グリーンウッド・ アンド・クリスビールズ（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ　ａｎｄ　Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ ）、プラント・プイジオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　）　７９　： ６５−７１　（１９８５）］　ことを示す。

また、非植物遺伝子の植物における発現も成功しているが、限られたレベルに過 ぎない。非植物蛋白の発現を達成することの困難性は、非内来性の転写されたｐ ｒｅ−ｍＲＮＡに存在する（介在配列とも呼ばれる）イントロンを認識する植物 スブライシングマシーナリーが働かないことによることが示唆さている［ケイ・ ハートムスおよびエイ・バーク（Ｌ　Ｈａｒｔｍｕｔｈ　ａｎｄ　Ａ、　Ｂａｒ ｔａ）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチズ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、）１４　：　７５１３−２８　（１９８６）コ。

というのは、イントロンの除去は該ｍＲＮＡを機能発揮させるのに必要だからで ある。エム・グリーン（Ｍ、　Ｇｒｅｅｎ）、アヌ・レブ・ジェネト（Ａｎｎｕ 、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　）２０　：　６７１−７８　（１９８６）参照。

例えば、バルクら（Ｂａｒｔａ　ｅｔ　ａｔ）　［プラント・モレキュラー・バ イオロジー（Ｐｌａｎｔ　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ、　）　６　：　３ ４７−３５７（１９８６）］は、完全なヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子を、 ツバリンシンターゼ遺伝子のプロモーターおよびポリアデニル化部位をコードす るＤＮＡ断片で挟んだキメラ遺伝子の構築を報告している。該キメラ遺伝子をヒ マワリおよびタバコのカルス組織に導入すると、該遺伝子は該ｐｒｅ−ｍＲＮＡ 段階に転写される。しかしながら、該転写体は、該ｐｒｅ−ｍＲＮＡが当該植物 によってさらにｍＲＮＡヘプロセッシングされないので該植物組織において機能 しない。かくして、外来性蛋白ｈＧＨは合成されない。

外来性蛋白の発現を定方向化させる別法は、所望の蛋白をコードする遺伝子が植 物蛋白の非機能的領域内に挿入された遺伝子構築体を作製することである。欧州 特許出願第３１９３５３号は、所望のペプチドをコードするインサートにより所 定の蛋白の超可変領域を修飾することによって当該所望の蛋白を発現させる方法 を開示している。この方法では、外来性蛋白をコードするアミノ酸をその中に含 む修飾された貯蔵蛋白が発現される。次いで、該外来性蛋白を酵素消化により切 断し、単離し精製する。しかしながら、該インサートは当該インサートのいずれ か側の貯蔵蛋白の非修飾部分に適合させた解読相としなければならず、かくして 、貯蔵タンパクの超可変領域長に発現され得る外来性蛋白のサイズを効果的に制 限する。

本発明は、遺伝子と種子特異的遺伝子調節配列との融合よりなる所望蛋白の種子 特異的発現を提供することによって前記問題を解決するものである。

情報開示の陳述 本発明は米国特許第４６８３１９５号に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）法の修飾法である遺伝子増幅技術を用いる。

欧州特許出願第５５７８号は種子特異的転写調節用ヌクレオチド配列を提供する 。しかしながら、該文献は本発明の翻訳カセットを教示しない。

欧州特許出願第２９５９５９号はブラジルナツト富硫黄２８種子貯蔵蛋白の転写 用ＤＮＡ発現力セントに言及する。該文献は本発明の翻訳発現力ラットを教示も 開示もしない。

欧州特許出願第３１９３５３号はＳ２アルブミン類をコードする植物遺伝子の修 飾を介して有用な生物学的活性ポリペプチドを生産する方法に言及するものであ り、前記にて議論した。

東独特許出願ＤＤ２６３−０８１−Ａ号は植物遺伝子から単離された調節配列を 含有するベクターを介しての有用蛋白の生産方法を報告する。

バルク・エイら（Ｂａｒｔａ　Ａ、、ｅｔ　ａｌ）　［ｒ形質転換タバコおよび ヒマワリのカルス組織におけるツバリンシンターゼ−ヒト成長ホルモン・キメラ 遺伝子の発現（ＴｈｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｐａｌｉｎｅ　Ｓｙｎ ｔｈａｓｅ−Ｈｕｍａｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｉｌｌｏｒｍｏｎｅ　Ｃｈｉｍａｅｒ ｉメ@Ｇｅｎｅ　ｉｎ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ｔｏｂａｃｃｏ　ａｎｄ　Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ　Ｃａ １ｌｕｓ　Ｔｉ５ｓｕｅ）Ｊ　、プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌ ａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ、）、６　：３４７−３５７（１９８９６） ］は、ツバリンシンターゼ遺伝子のプロモーターおよびポリアデニル化部位に挟 まれた完全なヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含有するキメラ遺伝子の構築を報告 しており、前記して議論し！；。

ビーチら（Ｂｅａｃｈｙ、　ｅｔ　ａｌ）　［ｒ形質転換ペチュニア植物の種子 における大豆β−コングリシニンの蓄積および組立体（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏ ｎ　ａｎｄ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　５ｏｙｂｅａｎβ−Ｃｏｎｇｌｙｃｉｎ ｉｎ　ｉｎ　５ｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ｐｅｔｕｎｉａ　Ｐ ｌａｎｔｓ）Ｊ　、ＥＭＢｏ、　４@：　３　Ｑ ４７−３０５３　（１９８５）］は、形質転換ペチュニア細胞の種子における大 豆種子貯蔵蛋白β−コングリシニンのα゛−サブユニツト蓄積を報告している。

ビイ・ビイ・シイ−ら（Ｐ、Ｐ、Ｃｈｅｅ、　ｅｔ　ａｌ）　［ｒ外来性植物組 織における大豆貯蔵タンパク「ファゼオリンＭｉｎｉｇｅｎｅＪの発現（Ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｓｔｏｒａｇｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＰｈａｅｏｌｉｎ 　Ｍｉｎｉｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ）Ｊ　 、ジーン（Ｇｅｎｅ）、４１：４７−５７　（１９８６）］は、安定しかつ機能 的なファゼオリンｍＲＮＡは元来のイントロンを欠（突然変異体ファゼオリン遺 伝子の使用によりタバコで生産できることを報告している。

β−ｚｅｉｎ１５Ｋｄ蛋白につきコードする遺伝子および調節領域を本発明で用 いる。この富硫黄ゼイン蛋白の配列および単離はペーダーリンら（Ｐｅｔｅｒｓ ｏｎ、　ｅｔａｌ）の「分子量１５０００の高硫黄ゼイン蛋白をコードするトウ モロコシ遺伝子の配列解析およびキャラクタライゼーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｍ ａｉｚｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　Ｈｉｇｈ−３ｕｌｆｕｒ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎ@ｏｆ　３１，１５０ ００）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅ■、）２６１　：　６２７９−６２８４　（１９８６）Ｊに開示され ている。

セングブターゴバランら（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ、ｅｔ　ａｌ）　 ［ｒツバ１種子における大豆β−Ｐｈａｅｏｌｉｎ遺伝子の発育的に調節された 発現（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ　Ｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｅａｎβ−Ｐｈａｓｅｏｌｉｎ　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｔｏ ｂａｃｃｏ　５ｅｅｄ）Ｊ　、プロシーデC ングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、） ＵＳＡ、　８２　：　３３２０−３３２４　（１９８５）］は、暗暗領域ならび に当該遺伝子が正しく調節された発現に必要なフランキングＤＮＡを含有する３ 、　８　ｋ　Ｂ　Ｐｈａｅｏｌｉｎ　ＤＮＡ断片でのタバコの形質転換を報告す る。しかしながら、本発明は該文献に教示されない特異的リンケージ配列を用い る。

マメ科インゲン属種子貯蔵蛋白遺伝子Ｐｈａｅｏｌｉｎの完全なヌクレオチド配 列はスライトンら（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ、　ｅｔ　ａｌ）の［「マメ科インゲン属 貯蔵蛋白遺伝子：ファゼオリンの完全なヌクレオチド配列（Ｃｏ＋＊ｐｌｅｔｅ 　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＦｒｅｎｃｈＢｅａｎ　 Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｎｅ：Ｐｈａｅｏｌｉｎ）Ｊ　、プロシ ーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ｄ、　）ＵＳＡ、８０　：　１８９７−１９０１（１９８３）］に開示されてい る。そこに報告されている方法のいくつかを本発明で用いる。

発明の概要 本発明は、ファゼオリン、β−コングリシニンのα゛−サブユニツトまたはβ− ゼイン１５Ｋｄいずれかに由来するプロモーター：ファゼオリン、β−コングリ シニンのα゛−サブユニツトβ−ゼイン１５Ｋｄ、または動物遺伝子いずれかに 由来する翻訳開始シグナル；ブラジルナツト富硫黄種子貯蔵蛋白または動物遺伝 子に由来する遺伝子；動物遺伝子、ファゼオリン、またはβ−ゼイン１５Ｋｄい ずれかに由来する翻訳終始領域；およびファゼオリン、動物遺伝子、またはβ− ゼイン１５Ｋｄからの少なくとも１つのポリアデニル化領域を有し：該調節配列 は、該遺伝子が種子または種子貯蔵プロティンボディーで発現されるように池に 作動可能に連結している種子特異的発現カセットを提供する。さらに、本発明は 調節要素と遺伝子を連結させる配列に取り込んだ酵素制限部位を提供する。

また、本発明は同遺伝子供給源に由来するある種の調節要素を提供する。

より詳しくは、本発明はプロモーターがファゼオリンまたはβ−コングリシニン のα′−サブユニットからのものであり、動物遺伝子および残りの要素がウシ・ ソマトトロピンからのものであって、リンカ−内に含まれる該制限部位がＮｅ。

ＩおよびＨｉｎｄｎＩである発現カセットを提供する。

より詳しくは、本発明はプロモーターがファゼオリンまたはβ−コングリシニン のα′−サブユニットからのものであり、１のポリーＡジグニルがファゼオリン からのものであり、第２のポリーＡ部位を含めた残りの領域がウシ・ソマトトロ ピンからのものであって、制限部位がＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩｒである発現 カセットを提供する。

より詳しくは、本発明は種子貯蔵ボディーにおけるウシ・ソマトトロピンの発現 および調節用の発現カセットを提供する。

本発明のもう１つの具体例において、遺伝子がブラジルナツト２Ｓ貯蔵蛋白また はそのサブユニットからのものであり、プロモーターおよび翻訳開始シグナルが 同遺伝子供給源からのものであって、翻訳終始シグナルおよびポリーＡ領域がフ ァゼオリンまたはβ−ゼイン１５Ｋｄからのものである発現カセットを提供する 。

また、本発明は本明細書中で開示する発現カセットを含有する細胞、植物体、お よび種子を提供する。

発明の詳細な記載 本発明は、特定の蛋白につきコードする遺伝子が、該特定蛋白の調節および発現 が種子特異的調節配列の制御下にあるように植物ゲノムに組み込まれた植物体を 提供する。注目しかつ発現を所望する蛋白は宿生植物体に対して同種または異種 の植物蛋白であり得るか、あるいは、他方、ウィルス、微生物、または他の動物 組織で通常に産生され得る。

以下の実施例は本発明の特定の具体例を例示する。本発明者らは、ポリメラーゼ 連鎖反応技術の変法を用いて、種々の種子貯蔵蛋白遺伝子調節要素（プロモータ ー、翻訳開始部位、翻訳終始部位、および転写ポリアデニル化（ポリ−Ａ）シグ ナル）を蛋白暗号領域と組み合わせて、植物の種子における種々の修飾蛋白の生 産を定方向化しおよび制御する発現カセットを形成させた。次いで、これらの発 現カセットを用いて植物細胞を形質転換し、それから完全な植物体を得ることが できる。単子葉または双子葉植物種いずれかの宿主に挿入できる遺伝子調節要素 を用いる。宿主植物として特に興味深いのは高レベルの種子生産のために栽培さ れているものである。かかる宿主は小麦、トウモロコシ、米等（単子葉植物）お よび大豆、インゲンマメ、エントウ豆（双子葉植物）を含む。トウモロコシおよ び大豆は理想的な宿主であり、ファゼオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ 　ｖｕｌｇａｒｉｓ）（ファゼオリン遺伝子）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃ ｉｎｅ　ｗａｘ）　（β−コングリシニン遺伝子のα′−サブユニットからのプ ロモーター）およびゼア・マイス（ＺｅａＩＩｌａｙｓ）　（ゼイン１５Ｋｄペ プチド遺伝子）から単離した種子貯蔵蛋白調節領域が調節領域として好ましい。

植物種子で発現されて価値がある蛋白は栄養改善（例えば、高硫黄大豆およびイ ンゲンマメ、高リシントウモロコシ等）、薬理的重要物（酵素およびホルモン） 、および産業的価値（酵素）のために設計されたちのを包含する。本発明者らは 、高硫黄遺伝子をコードすることによって種子蛋白ミールの栄養価を改善するた めに設計した遺伝子を含有する種子特異的発現カセットを示した。また、本発明 者らは、ウシ・ソマトトロピン（Ｂｓｔ）の蛋白貯蔵小胞への生産および分離を 示した。

適当な制限部位、複製系、およびマーカーを有する多数のクローニングベクター が入手可能である。クローニングベクターとして、本発明者らは、アンピシリン 耐性マーカーを含有するｐＵｃ１８　［ノランダーら（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９８３）２６　：１０１−１０６１を選択 した。他の適当なベクターはよく知られており、本発明の発現カセットの特異的 制限部位に適合させて使用できる。

実施例に記載した遺伝子工学実験については、部位特異的突然変異、リンカ−１ および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のごとき調節領域と暗号ＤＮＡ との間の所望の配列結合の多くの異なる方法を用いることができる。本発明者ら は、ＰＣＲの変法の使用を選択し、暗号ＤＮＡへの調節領域の付加用技術として カスタム・ポリメラーゼ連鎖反応（ｃｕｓｔｏ＋＊　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃ ｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）　（ＣＰ　ＣＲ）と呼んだ。ＣＰＣＨにより、合 成されているリンケージオリゴマーに特異的酵素制限部位を直接組み込むことが できる。次いで、該オリゴマーを所望の遺伝子または調節要素のＰＣＲ増幅で用 いる。この修飾の利点は増幅された配列からの発現カセットの迅速な構築である 。

本発明者らは、以下の実施例に、転写および翻訳融合用発現カセット；２の双子 葉植物特異的種子プロモーターカセット；および１の単子葉植物特異的種子プロ モーターカセットを含ませた。当業者ならば、これらのカセットは種々の宿主で 利用できることを認識するであろう。加えて、これらのカセットの宿主植物ゲノ ムへの組み込みは種々の常法によって達成できる。かかる方法はＴｉ−ＤＮＡ（ アグロバクテリウム・チニメファンエンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、 アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ、　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）等）、プロト プラスト融合、インジェクション、エレクトロポレーション、およびマイクロプ ロジェクテイールポンパードを包含する。これらの植物種子発現カセットは単子 葉および双子葉植物双方の種子で高硫黄種子貯蔵蛋白遺伝子を発現させるのに、 および双子葉植物の種子で非植物遺伝子、ウノ・ソマトトロピン（Ｂｓｔ）を発 現させるのに使用される。

注目する異種遺伝子を含有するトランスジエニイック植物はＲ１世代を通じて得 られる。これらの植物からの種子、Ｒ２種子は蛋白貯蔵ボディー内に局在する異 種蛋白のＴＥＭ可視化につき蛋白抗体で染色される。

以下の省略を本開示を通じて用い、遺伝子調節要素を表示する。

Ｐ＝プロモーター、 ＳＰ＝翻訳開始シグナルまたはシグナルペプチド、ＴＴ＝翻訳終始シグナル、 Ｓ；ポリアデニル化（ポリ−Ａ）シグナル以下の省略を本開示を通じて用い、遺 伝子調節要素の供給源を示す。

ｂ　ｖ　ｗＢｏｖｉｎｅ属 ｂｚ＝パートレッティア・エクセルシア（Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ　ｅｘｃｅ ｌｓｉａ）　（ブラジルナツト） ｇｍ＝グリシン−マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｗａｘ）ｐｖ＝ファゼオラス・ブ ルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｆｓ）ｚｍ＝ゼア−フイス（Ｚｅ ａ　ｗａｙｓ）以下の省略を本開示を通じて用い、蛋白を示す。

ｒＢｓｔＪハウシ・ソマトトロピン蛋白を意味する。ｒＢＳＴＪはＢｓｔをコー ドする遺伝子を意味する。

ｒＢｚＪはブラジルナツト種子から単離した豊硫黄蛋白を意味する。ｒＢｚ−１ 」、ｒＢｚ−２」およびｒＢｚ−３ＪはＢｚのサブユニットである。これらの蛋 白は以下でさらに詳しく記載する。ｒＢＺＪ、ｒＢＺ−ＩＪ、ｒＢＺ−２Ｊおよ びｒＢＺ−３Ｊは各蛋白をコードする遺伝子である。

以下の用語を本開示を通じて用い、以下ごとく定義する。

「種子特異的発現カセット」とは、遺伝子の発現が遺伝子調節領域の制御下にあ るように（該領域は当該遺伝子の発現が植物種子におけるものであるように特異 的であり、向きが正しく、かつ解読枠に適合する）、植物ゲノムへの取り込みに 適したベクター中に、遺伝子調節要素および注目する蛋白をコードする遺伝子を 含有するＤＮＡ構築体を意味する。

「発現力セント」とは、注目する蛋白をコードする少なくとも１の遺伝子を欠＜ ＤＮＡ構築体を意味する。

「オリゴマーブライマー」とは、遺伝子または遺伝子調節要素のＰＣＲ増幅に必 要なヌクレオチド配列を意味する。本発明で用いるプライマーは合成して特異的 制限酵素部位を該プライマーに組み込んだ。

チャートエないし２２は本発明の構築を示す。以下の約束はプラスミドおよびＤ ＮＡ断片を説明するために使用する。

（１）単一線図は環状および線状二本鎖ＤＮＡを共に表す。

（２）星印（＊）は、表示された当該分子が環状であることを表す。星印の欠如 は当該分子が線状であることを示す。

（３）エンドヌクレアーゼ制限部位は当該線の上方に示す。

（４）遺伝子は当該線の下方に示す。

（５）遺伝子と制限部位との間の距離はスケール通りでない。チャートはその各 位置のみを示す。

本発明で用いる方法では、多くの標準的な組換えＤＮＡ手法ならびにトランスジ ェニック植物を創製する方法を使用し、それらは当業者によく知られている。

組換え実験についての標準的および実験質的技術はティ・マニアナイスら（Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ）、「モレキュラー・クローニング；ア・ラボラ トリ−・マニュアル（ｌｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；＾Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ　、：）−ルド・スプリング＋／Ｓ−バー研究所（ １９８２ＸＤＮＡ組換え実験プロトコルおよび方法）：ミラー、「分子遺伝学の 実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）Ｊ、コールド・スプリング・ハーバ−研究所（１９７２）（培養技術）；サザ ーンら（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナ５）（クローン証明）； サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ）、プロシーディングズ・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　）Ｕ　Ｓ　Ａ。

７４　：　５４６３　（１９７７）（ＤＮＡ配列決定）に見い出される。ニス・ ビイ・ゲルビンおよびアール−エイ・シルベルート（Ｓ、　Ｂ、　Ｇｅ１ｖｉｎ 　ａｎｄ　Ｒ，Ａ、　５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ）［「プラント−モレキュラー・ バイオロジー（Ｐｌｎａｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ３’）Ｊ　］は 、植物の形質転換およびクローニングで用いる技術を提供する。

暗号ＤＮＡへの転写融合のためのファゼオリン・プロモーター（ｐ　ｖ　Ｐ）お よびポリアデニル化シグナル（ｐ　ｖ　Ｓ）を含有する発現カセットの構築 ファゼオラス・ブルガリス（インゲンマメ）の主要種子貯蔵蛋白はファゼオリン として知られている。５゛および３゛調節要素を含めた完全な配列ならびにｃＤ ＮＡ片割れはスラントンら（Ｓｌｉｇｈｔｏ■ｅｔ　ａｌ）　（１９８３）によ って発表されている。ファゼオリン調節領域源として、本発明者らは、クラマー ら（ＣｒａＩｌｅｒ、　ｅｔ　ａｌ）［プロシーディングズ・オブ・ナショナル ・アカデミ−Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　）Ｕ　Ｓ　Ａ　。

８２　：　３３４−３３８　（１９８５）］によって記載されている、ゲノミッ ク暗号およびイントロン領域に代わりに無イントロンｃＤＮＡ片割れを有するク ローンｐＰｈａｓｍｉｎを用いる。ファゼオリン・プロモーター（ｐｖＰ）の増 幅用オリゴマーブライマーは（５゛プロモーターにおける）ＨｉｎｄｌｌＩおよ び（３°プロモーターにおける）ＮｃｏＩ部位を含有するように構築する。Ｘが Ｇ、Ａ、ＴまたはＣを表すＡＡＸＸＡＴＧＧ配列を含有させることによって、コ ザク（Ｋｏｚａｋ）　（１９８３）によって記載されている規則に適合すべく翻 訳開始部位を包含させるように該ＮｃｏＩ部位を設計する。増幅に用いるオリゴ マーの配列およびファゼオリン・プロモーターの作製はチャート１（ａ）に示す 。ＣＰＣＲ技術を用い、制限部位を５００ｂｐフアゼオリン・プロモーター領域 に融合させて、チャート１（ｂ）においてｐｖＰで示す断片を得る。

同様にして、オリゴマーブライマーを合成してファゼオリン・ポリアデニル化（ ポリ−Ａ）シグナルの傍らに位置させる。しかしながら、この場合、５°プライ マーはＮｃｏ１部位を取り込み、３゛プライマーはＨｉｎｄＩ［［部位を取り込 む。

これらの２のプライマーのヌクレオチド配列をチャート１（ｃ）に示す。増幅の 結果、チャート１（ｄ）においてｐｖＳで示す１１００ｂｐ断片が得られる。該 ｐｖＰおよびｐｖＳ断片をＮｃｏＩによる消化に付し、続いて断片を結ぶ（チャ ート１（ｅ））。結んだｐｖＰ＋ｐｖＳ断片（１６００ｂｐ）をＨｊｎｄｌＩｒ 消化に付し、ポリアクリロアミドゲルで精製し、Ｈｉｎｄｍ消化ｐＵｃ１８にク ローン化する。（制限酵素マツピングおよびヌクレオチド配列決定により確認し て）正しいｐｖＰ＋ｐｖＳ配列を含有するクローンをチャート１（ｆ）にてｐＵ Ｃ１８ｐｖＰｐｖＳという。この発現カセットを、それ自身の翻訳開始シグナル を含有するかか、あるいは蛋白産物の適当なターゲツティング用シグナルを必要 としないかのいずれかの暗号領域で用いる。加えて、このカセットに挿入したい ずれの暗号領域も翻訳終始シグナルを包含しなければならない。

実施例２ 翻訳融合のためのファゼオリン・プロモーター（ｐｖＰ）、シグナルペプチド（ ｐ　ｖ　Ｓ　Ｐ）、翻訳ターミネータ−（ｐｖＴＴ）、およびポリーＡシグナル （ｐｖＳ）を含有するファゼオリン発現カセットの構築本実施例では、各々、フ ァゼオリンシグナルペプチド（Ｓ　Ｐ）および翻訳終始（ＴＴ）シグナルを含有 するｐＰｈａｓｍｉｎからのプロモーターおよびターミネータ−断片の増幅用に オリゴヌクレオチドブライマーを設計する。バランら（Ｐａｒｒａｎ　ｅｔ　ａ ｌ）　［フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２６　：　３ ３５　（１９８７）］によるファゼオリン蛋白のＮ−末端解析は、切断は不完全 であってアミノ酸残基２３後であってアミノ酸２７前で起こることを示す。かく して、該カセットがシグナルペプチド切断に必要なアミノ酸を含有することを確 認するために、該カセットを残基３１を通して包含させるように設計する。ｐｖ ＰｐｖＳＰ断片のＣＰＣＲ増幅には、枠内５’Ｈ４ｎｄｍ部位および枠内３’Ｎ ｃｏＩ部位を含有するオリゴマーを設計する：これらの配列をチャート２（ａ） に示す。増幅により、チャート２（ｂ）にてｐｖＰｐｖＳＰと示す５８０ｂｐの 断片が得られる。

翻訳終始配列の完全な解読を確認するために、翻訳終始コドンから５゛側の４個 のアミノ酸を保持する。これらのグアゼオリン３°調節領域はチャート２（Ｃ） に示すプライマーを用いて得られる。再度、これらのプライマーは５′オリゴマ ーに枠内ＮｃｏＩ部位および３′オリゴマーにＨｉｎｄｌｌ［部位を含有する。

増幅ニヨリ、チ＋−ト２　（ｄ）ｌ：てｐｖＴＴｐｖｓと示す１２００ｂｐ断片 が得られる。

断片ｐｖＰｐｖＳＰおよびｐｖＴＴｐｖＳをＮｃｏＩによる消化に付し、現れた ＮｃｏＩを一緒に結んで、チャート２（ｅ）にてｐｖＰｐｖｓＰｐｖＴＴｐｖｓ と示す断片が得られる。次いで、この断片をＨｉｎｄｌｌｒで消化して、ＣＰＣ Ｒ作製の５′および３゛部位に暴露し、続いてＨｉｎｄｌ［［消化ｐＵｃ１８に クローン化する。チャート２（ｆ）にてｐＵＣ１８ｐｖＰｐｖＳＰｐｖＴＴｐｖ Ｓと示すファゼオリン発現カセットが得られ、制限酵素マツピングおよびヌクレ オチド配列決定によりチェックして正しいことを確認する。

領域を必要とする暗号領域で用いる。

実施例３ β−コングリシニンのグリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｗａｘ）種子貯蔵 蛋白α′−サブユニットのプロモーター領域（ｇｍＰ）およびファゼオリンポリ ーＡシグナル（ｐ　ｖ　Ｓ）を含有する発現カセットの構築大豆（グリシン（Ｇ ｌｙｃｉｎｅ）種）において、β−コングリシニンは主要種子貯蔵蛋白である。

発現レベルは非常に高い：２ないし４のサブユニットの各々は種子における全蛋 白の１２％および２０％の中間である。β−コングリシニンのグリシン・マック スα゛−サブユニットのプロモーター領域のヌクレオチド配列はドイルら（Ｄｏ ｙｌｅ　ｅｔ　ａｌ）　［ジャーナル・オブ・）＜イケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｔ　）　２６１　＋９９２８　（１９８６）コによって発表され ている。

ＣＰＣＨによって全グリシン・マックスＤＮＡ２５０ｎｇからプロモーター（ｇ ｍＰ）を増幅し、Ｈｉｎｄｍ部位を５゛端部ならびに翻訳開始コドン（ＡＴＧ） におけるＮｃｏＩ部位に付加する。発表された配列を用い、オリゴマーをプロモ ーターの増幅に設計する（オリゴマー配列をチャート３（ａ）に示す）。増幅さ れた６００ｂｐ遺伝子の配列（チャート３（ｂ）にてｇｍＰで示す）を正確性の ための制限酵素マツピングおよびヌクレオチド配列決定によって確認する。

断片ｇｍＰをＮｃｏＩによる消化に付し、Ｎｃｏｌ消化断片ｐｖＳ　（実施例１ に記載）に結んでチャート３（Ｃ）にてｇｍＰ　ｐ　ｖ　Ｓと示す断片が得られ る。得られた断片ｇｍＰ　ｐ　ｖ　ＳをＨｉｎｄｌ［［で消化し、Ｈｉｎｄｌｌ Ｉ消化ｐＵｃ１８に結び、クローンｐＵｃ１８ｇｍＰｐｖｓが得られる（チャー ト３（ｄ）参照）。この発現カセットは、実施例１に示したのと同様の転写融合 を要する暗号領域の種子特異的発現を定方向化させるのに用いる。しかしながら 、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）ゲノムに一体化した場合、発現レベルは、グリシ ン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）カセットについての本来的環境のため、実施例１のファゼ オラス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）発現カセットよりも幾分高い。

実施例４ β−コングリシニンプロモーターのグリシン・マックスα′−サブユニット（ｇ ｍＰ）およびシグナルペプチド（ｇｍＳＰ）領域ならびにファゼオリン翻訳ター ミネータ−（１）ＶＴＴ）シグナルおよびポリアデニル化（ｐ　ｖ　Ｓ）シグナ ルを含有する発現カセットの構築 本実施例において、本発明者らは、双子葉植物種子における修飾種子貯蔵蛋白遺 伝子または異種遺伝子の発現で用いる発現カセットおよびプラスミドの構築を記 載する。オリゴマーはグリシン・マックスのゲノミックＤＮＡからのプロモータ ーおよびシグナルペプチド領域を増幅するために用いる。５°→３゛に解読され るオリゴマーのために、実施例３に記載したのと同一の５′プライマーを用いる 。

シグナルペプチドの完全な解読を保証するために、３°オリゴマープライマーを 設計して、アミノ酸残基２５および２６の間で起こる、ドイルら（Ｄｏｙｌｅ　 ｅｔ　ａｌ）（１９８５）によって記載されているシグナルペプチド切断点を丁 度超えてハイブリダイズさせる。従って、本発明者らは、ＮｃｏＩをアミノ酸残 基２９後に添加することを選択した。この増幅に用いるプライマーをチャート４ （ａ）に示す。

チャート４（ｂ）にてｇｍＰｇｍＳＰと示すこの増幅の結果は６９０ｂｐの断片 である。この断片の真正をヌクレオチド配列決定によってチェックする。次いで 、ＮＣ０Ｉによる消化に付し、実施例２に記載したＮｃｏＩ切断断片ｐｖＴＴｐ ｖＳに結ぶ。チャート４（Ｃ）にてｇｍＰｇｍｓＰｐｖＴＴｐｖＳと示す得られ た断片をＨｉｎｄｍによる消化に付し、Ｈｉｎｄｌｌｒ消化ｐＵｃ１８にクロー ン化する。（チャート４　（ｄ）　ニてｐＵＣ１８ｇｍＰｇｍＳＰｐｖＴＴｐｖ Ｓと示す）クローンを単離し、この構造を制限酵素マツピングおよびヌクレオチ ド配列決定によってチェックする。この発現カセットは、双子葉植物種子におけ る修飾種子貯蔵蛋白遺伝子または外来性遺伝子の発現に用いる。

実施例５ ゼア・マイス１５にダルトン種子貯蔵蛋白遺伝子からのプロモーター（ｚｍＰ） およびポリアデニル化シグナル（ｚｍＳ）を含有する発現カセットの構築ゼイン 蛋白はゼア・マイス（トウモロコシ）の全種子蛋白の約８０％を占める。

しかしながら、これらのゼイン蛋白の産生に関わる多くのゼイン関連遺伝子があ る。最近、ゼイン遺伝子ファミリーの１の特定メンバーは低コピー数であるが、 合計ゼイン蛋白の約１０％の産生に関わることが判明した。これらの遺伝子をβ −ゼイン（または１５Ｋｄ）遺伝子と呼び、１のメンバーの配列はベーダーリン ら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８６）によって記載されている。

しかしながら、ぺ一ダーリンによって報告されているβ−ゼイン遺伝子のヌクレ オチド配列は翻訳開始の５′側に約２３３ｂｐ伸びているだけであり、かくして 、完全なβ−ゼインプロモーターは存在し得ない。該β−ゼインプロモーターの より多くを得るために、本発明者らは、ｐＺｅｉｎ１５にと呼ぶ第２の遺伝子を 単離し、我々のヌクレオチド配列解析（チャート５）は、このクローンが５°フ ランキングＤＮＡのさらに１１０ｂｐを含有し、翻訳開始コドンまでに約３５０ ｂｐの合計プロモーター領域を与えることを示す。多（のゼインタイプの遺伝子 の解析は、種子特異的遺伝子の発育的発現の制御に関わる配列がこれらの３５０ ｂｐ内に負荷されていることを示す（トムソンおよびラーキンズ（Ｔｈｏ＋ｌ１ ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｒｋｉｎｓ）、バイオエッセイズ（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ） 、１０　：　１０９−１１３．１９８９によるレビュー参照）。

クローンｐＺｅ　１ｎ１５Ｋ　（チャート６（ａ））はそのプロモーターおよび ポリアデニル化領域のＣＰＣＲ増幅用出発材料を与える。しかしながら、増幅に 先立ち、プロモーター領域における固有ＮｃｏＩ部位を、マングビーンヌクレア ーゼでの平滑化、続いてマニアナイスら（１９８２）の手法によって除去し、そ れにより４の塩基対（ＣＡＴＧ）の喪失を引き起こした。これらの４の塩基対は ＣＣＡＡＡＴおよびＴＡＴＡＡ要素の間に位置し、かくして、プロモーターの機 能に影響しない。この修飾されたβ−ゼイン遺伝子プロモーター領域をＣＰＣＲ を用いて増幅して、５ａＩＩ部位およびＮｃｏＩ部位を、各々、５゛および３′ プライマーに付加した。これを達成するために使用したオリゴマーの配列をチャ ート６（ｂ）に示す。増幅した産物は３５０ｂｐ断片であり、これをチャート６ （Ｃ）にてｚｍＰｓという。さらなるＣＰＣＲオリゴマーブライマーを用いてｐ Ｚｅｉｎ１５にのポリアデニル化領域を増幅し、（５°）Ｎｃ６Ｉ部位および（ ３’）Ｓａ　ｌ　Ｉ部位を付加する。オリゴマー配列をチャート６（ｄ）に示す 。増幅した産物はほぼ７００ｂｐの断片であり、これをチャート６（ｅ）にてｚ ｍＳという。２の増幅した断片ｚｍＰおよびｚｍＳをＮｃｏＩでの消化に付し、 続いて結び、断片を単離し、これをチャート６（ｆ）にてｚｍＰｚｍＳという。

ｚｍＰｚｍＳを５ａＩＩで消化し、５ａｌＩ消化ｐＵｃ１８にクローン化する。

クローンｐＵｃ１８ｚｍＰｚｍＳ　（チャーＨ（ｇ））を単離し、制限酵素マツ ピングおよびヌクレオチド配列決定によってその構造を確認する。発現カセット ｐＵＣ１８ｚｍＰｚｍＳは修飾した種子貯蔵蛋白遺伝子あるいはゼインシグナル ペプチドおよび／またはゼイン翻訳ターミネータ−を必要としない他の遺伝子用 の種子特異的発現にβ−ゼインプロモーター（ｚｍＰ）　、シグナルペプチド（ ｚｍＳＰ）　、翻訳ターミネータ−（ｚｍＴＴ）およびポリアデニル化シグナル （ｚｍＳ）を含有する単子葉植物種子特異的発現カセットの構築本発現カセット は実施例５のと同様であるが、β−ゼインシグナルペプチドと翻訳ターミネータ −シグナルをさらに付加したものである。実施例５におけるごと（、ＣＰＣＲに より５’５ａＩＩ部位および３°枠内ＮＣ０Ｉ部位を付加する。

しかしながら、この場合、シグナルペプチド切断点はアミノ酸残基２０および２ １間に位置しており、本発明者らは、残基２５までおよびそれを包含するアミノ 酸配列を含ませた。かくして、ＮｃｏＩ部位をこの残基の３°側に位置させた。

このゼインプロモーターおよびシグナルペプチド断片を作製および増幅するのに 使用したオリゴマープライマーはチャート７（ａ）に示す。この増幅の結果、チ ャート７（ｂ）にてＺｍＰｚｍＳＰという４００ｂｐの断片が得られる。

同様にして、ｐＺｅｉｎ１５にのβ−ゼイン翻訳ターミネータ−およびポリアデ ニル化シグナルのＣＰＣＲ増幅は、５°枠内Ｎｃｏ１部位および３’５ａＩＩ部 位を含有させるべく設計したリンカ−を用いて行い；配列をチャート７（Ｃ）に 示す。増幅の結果、チャート７（ｄ）にてｚｍＴＴｚｍｓという７２０ｂｐの断 片が得られる。断片ｚｍＰｚｍｓＰおよびｚｍＴＴｚｍＳをＮＣ０Ｉによる消化 に付し、−緒に結んで、チャート７（ｅ）にてｚｍＰｚｍＳＰｚｍＴＴｚｍＳと いう断片が得られる。次いで、この断片を５ａｌＩによる消化に付し、５ａｌＩ 消化ｐＵ０１８にクローン化する。得られたクローンｐＵｃ１８ｚｍＰｚｍｓＰ ｚ’ｍＴＴｚｍＳ　（チャート７（ｆ））を制限酵素マツピングおよびヌクレオ チド配列決定によって確認する。この種子特異的発現カセットｐＵｃ１８ｚｍＰ ｚｍＳＰｚｍＴＴｚｍＳは、修飾種子貯蔵蛋白遺伝子あるいは単子葉植物もしく はβ−ゼインシグナルペプチドおよび枠内翻訳ターミネータ−シグナルを必要と する他の遺伝子を調節するのに用いる。

実施例７ ブラジルナット２Ｓ富硫黄種子貯蔵蛋白遺伝子の発現用のファゼオラス・ブルガ リス、グリシン・マックス、およびゼア・マイス種子特異的発現カセット本実施 例は、実施例１．３および５で設計した種子特異的発現カセットをブラジルナツ トから単離した富硫黄（２６％メチオニン＋ンステイン）種子貯蔵蛋白の発現で 用いることを例示する。このブラジルナツト遺伝子の単離およびヌクレオチド配 列はアルテンバッハら（Ａｌｔｅｎｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ）　［プラント・モレ キュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔｌｌｏｌ、Ｂｉｏｌ、）８：２３９　２５ ０（１９８７）コによって報告されており、チャート８に示すごとく、当該ｃＤ ＮＡクローンはｐＨ５−３ｓといい、５°−非翻訳領域の２５ｂｐを除きすべて 、暗号ＤＮＡのすべておよび完全な３′−非翻訳領域を含有する。当該遺伝子は 植物種子環境に通常に見い出される蛋白をコードするので、その安定な発現およ び種子貯蔵プロティンボディーへの適当な輸送はその構造に固有で特徴的である 。しかしながら、配列の解析により、翻訳終始コドン近くに位置する第２のＮｃ ｏＩ部位が明らかにされる。かくして、作製の容易のために、本発明者らはＣＰ ＣＲを用いてこのＮｃｏＩ部位を除いて、本来のＮｃｏＩ部位を枠内ＮｃｏＩ部 位で置き換えた。この結果、Ｃヌクレオチドで置き換えられた第２のＧが生じ、 内部ＮｃｏＩ部位は除かれる。

ＣＰＣＲを介して付加されたＮｃｏＩ部位を用いてこの領域を枠内翻訳終始コド ンを有する発現カセットにクローン化する。この構築に、本発明者らは実施例１ ．３および５に記載したプロモーター領域および実施例２．４および６に記載し たポリアデニル化シグナルを用いる。

付加したブラジルナツト遺伝子のＣＰＣＲ増幅を用いてフランキングＮｃｏＩ部 位を作製し；該５’ＮｃｏＩ部位を付加して、ブラジルナツト翻訳開始コドン（ ＡＴＧ）に位置する天然に生じる部位を利用し、前記したごとく第２のＮｃｏＩ 部位を除去し、ＮｃｏＩで置き換える。さらにこの修飾を利用してアミノ酸トリ プトファンを当該遺伝子に付加する。トリプトファンもまた多（の植物種子の蛋 白に欠けており、か（して、その付加によって栄養的により完全な種子蛋白が得 られる。ブラジルナツト暗号領域の増幅用プライマーはチャーｈ９　（ａ）に示 す。

増幅の結果、チャート９（ｂ）にてＢＺと示す４２０ｂｐ断片が得られる。この 断片をＮｃｏｌでの消化に付し、前記した発現カセットに挿入する。以下のクロ ー：ｚｐＵＣ１８ｐｖＰＢＺｐｖＴＴｐｖＳ１ｐＵｃ１８ｇｍＰＢＺｐｖＴＴｐ ｖＳおよびｐＵｃ１８ｚｍＰＢＺｚｍＴＴｚｍｓを単離し、制限酵素マツピング およびヌクレオチド配列決定を用いてその構造をチェックする。これらのクロー ンの構造をチャート９（Ｃ）（ｉ）、（■）および（ｆｆｉ）に示す。次いで、 これらのカセットを取り出し、植物への移入用の適当なベクターに入れる。これ らの移入ベクターはアグロバクテリウム系または植物組織のマイクロプロジェク ティールボンバードを利用する系で使用できる。

実施例８ ファゼオラス・ブルガリス、グリシン・マックス、およびゼア・マイス種子特異 的発現カセットの合成音硫黄種子貯蔵蛋白遺伝子の発現のための使用植物からの 種子は１以上のアミノ酸を欠くので、およびこれらの種子すべてを満足する単一 の種子貯蔵蛋白遺伝子は見い出されていなので、これらの要求は合成暗号領域を 介して達成されるようである。この可能性を例示するため、ブラジルナツト暗号 ＤＮＡの部分を表す３種のオリゴマーを合成する（チャート１０に示す）。チャ ート１０（ａ）に示すごとく、第１のオリゴマーは９ｋＤサブユニツト（ＢＺ− ，１）の主要部分をコードし、これは４８個のアミノ酸ペプチドの３５％含硫ア ミノ酸を含有する。チャート１０（ｂ）は２８．５％含硫アミノ酸を含有する７ ０アミノ酸をコードする完全な９ｋＤサブユニツト（ＢＺ−２）よりなる第２の オリゴマーを示す。第３のオリゴマー（チャート１０　（ｃ））は２８％含硫ア ミノ酸を含有する９３アミノ酸をコードする完全な１２ｋＤサブユニツト（ＢＺ −３）である。ＢＺ−１は単一の１４４塩基オリゴマーとして合成し、ＢＺ−２ は２１０塩基オリゴマーとして合成し、ＢＺ−３は２７９塩基オリゴマーとして 合成した。これらのオリゴマーはＢＺ遺伝子の発表された配列を利用して合成し 、アプライド・バイオシステムズ・インコーホレイテッド（＾ｐｐｌｉｅｄＢｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、　）、モデル３８０ＡＤＮＡシンセサイザーで行 った。ブラジルナツト遺伝子断片を相補鎖作製し、精製したが、ＣＰＣＲ増幅を 用いると５°および３′端部共にに付加されたＮｃｏＩ部位を有していた。実施 例７のＢＺ遺伝子でも当て嵌まるが、各枠内ＮｃｏＩ部位により、トリプトファ ンをコードするコドンＴＧＧが生じ、得られる植物種子をより栄養的に完全な食 品とする。

ＢＺ−１の増幅に用いたプライマーをチャート１１（ａ）に示し、ＢＺ−２ｉ： 用いたのをチャート１１（ｂ）に示し、ＢＺ−３で用いたのをチャート１１（ｃ ）に示す。過剰のヌクレオチドの付加のため、増幅後に単離した断片は元の合成 断片ＢＺ−１、ＢＺ−２およびＢＺ−３よりも約１５ｂｐ大きかった。これらの 断片をＮｃｏＩでの消化に付し、実施例２．４および６に記載したＮｃｏＩ切断 発現カセットにクローン化する。以下のクローンｐＵｃ１８ｐｖＰｐｖｓＰＢＺ −１、−２、および−３ｐｖＴＴｐｖＳ　（チャー）１２　（ａ）−（ｃ））　 、ｐＵＣ１８ｇｍＰｇｍＳＰＢＺ−１、−２、および−３ｐｖＴＴｐｖＳ　（チ ャート１３（ａ）−（ｃ））　、ｐＵｃ１８ｚｍＰｚｍｓＰＢＺ−１、−２、お よび−３ｐｖＴＴｐｖＳ（チャート１４　（ａ）−（ｃ））を単離する。これら のクローンの構造を制限酵素マツピングおよびヌクレオチド配列決定によってチ ェックする。これらのプラスミド内に含有された発現カセットは取り出し、アグ ロバクテリウム系で用いるベクターに移入でき、あるいは植物組織のマイクロプ ロジェクティールボンバードで用いることができる。

実施例９ 外来性遺伝子の発現用種子特異的発現カセット本実施例では、本発明者らは、ウ シ・ソマトトロピン遺伝子（Ｂｓｔ）（この遺伝子はウシ成長ホルモン（Ｂｇｈ ）遺伝子とも呼ばれる）を発現できるベクター作製のために前記種子発現カセッ トを選択して用いる。Ｂｓｔ遺伝子の配列はウォイチックら（ｌｏｙｃｈｉｋ　 ｅｔ　ａｌ）、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（ＮＢＣ１ｅｉｃ＾ａｉｄｓ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１０　：　７１９７−７２１０　（１９８２）によって決 定されているが、この配列は本来の遺伝子における４イントロンの存在のため植 物系における発現では許容されない［バルクら（Ｂａｒｔａ　ｅｔ　ａｌ）、１ ９８６］。この問題を回避するために、本発明者らは、クリーブランド○Ｈ１ケ ースウェスタンリザーブ大学、生物学および微生物学部のフリップ・ラットマン （Ｆｒｉｔｚ　Ｒｏｔｔｍａｎ）教授から入手したＢｓｔ遺伝子の無イントロン （ｍｉｎｉｇｅｎｅ）構築体を用いる。このクローンｆ；！ｐＳＶＧＨ−１（デ ルタ■ｖＳ）といい、ＣＰ　Ｓ　Ｒ作製用（７）　Ｂ　ｓ　ｔ　暗号領域を供す る。これまでの実施例から明らかなごと（、ＣＰＳＲを使用すると、暗号領域が 実施例１ないし６に記載されたいずれの発現カセットにも許容されるように作製 することが可能となる。これらのアレンジはＢｓｔ遺伝子からの発現カセットに よってさえ供され得る異なる遺伝子調節領域の使用を包含する。

Ｂｓｔ蛋白は、２６アミノ酸シグナルペプチド、続いての１９１アミノ酸を含有 する暗号領域を含有する遺伝子内にてコードされる。また、クローンｐＳｖＧＨ −１は固有Ｂｓｔ遺伝子ポリアデニル化シグナルを含有する。活性とすべきＢｓ ｔ蛋白については、そのシグナルペプチドを除去しなければならず、かくして、 前記カセットと組み合わせてＣＰＣＲを用いることにより、本発明者らは、その シグナルペプチドと共にもしくはそれ無くして、種子蛋白シグナルペプチドと共 にまたはそれ無（して、およびそのポリアデニル化シグナルと共にもしくはそれ 無くしてそれを発現させる任意性を有する。かくして、多くの異なる構築体は植 物種子におけるＢｓｔの発現から得ることができる。本実施例はＢｓｔにつきコ ードするこれらの発現カセットのい（つかを説明する。

構築の最初のシリーズでは、実施例１．３および５に記載した種子貯蔵蛋白遺伝 子発現プロモーターを用いて、Ｂｓｔシグナルペプチドおよびポリアデニル化シ グナルを使用する転写融合遺伝子を構築する。出発材料としてクローンｐＳＶＧ Ｈ（デルタＩＶＳ）を用い、ＣＰＣＲを用いてＮｃｏＩ部位を（翻訳開始シグナ ルを保持する）その５′端部に付加し、Ｂｓｔポリアデニル化シグナルの３°側 にＨｉｎｄｍ部位を付加する。この構築体のオリゴマープライマーはチャート１ ５（ａ）に示し、ｂｖＳＰＢＳＴｂｖＴＴｂｖＳで示す８４０ｂｐ断片を増幅す るのに用いる。この断片をＮｃｏＩによる消化に付し、実施例１および３に記載 した種子プロモーター断片にクローン化する。チャート１５（ｂ）および１６（ ｂ）参照。次いで、これらの結んだ種子プロモーター−Ｂｓｔ断片をＨｉｎｄｎ ［で消化し、続いてＨｉｎｄｍ消化ｐＵｃ１８に結んで、以下のクローンｐＵｃ １８ｐｖＰｂｖＳＰＢＳＴｂｖＴＴｂｖＳおよびｐＵｃ１８ｇｍＰｂｖｓＰＢｓ ＴｂｖＴＴｂｖＳを各々チャート１５（ｃ）および１６（ｂ）に示すごとくに単 離する。

制限酵素マツピングおよびヌクレオチド配列決定を用いて正しい配列を確認する 。

これらのクローンからのインサートは取り出し、アグロノくクテリウムベクター 系または植物組織のマイクロプロジエクテイールボンノく−ドで使用するベクタ ーに移入できる。

不安定なｍＲＮＡ産物を有する可能性を回避するためには、Ｂｓｔ遺伝子を実施 例１および３に示した種子発現カセット内に位置するＮｅｏＩ部位に直接クロー ン化することができる。これを達成するには、３゛オリゴマーブライマーのをＮ ｃｏＩを包含するように変化させる必要がある。これは、チャート１７（ａ）お よびＣＰＣＲ作製で示したオリゴマープライマーの使用により行う。この増幅か ら得られるＢｓｔ遺伝子を含有する断片もまた約８４０ｂｐ長であり、チャート １７（ｂ）にてｂｖＳＰＢＳＴｂｖＴＴｂｖＳという。この断片をＮｃｏＩで消 化し、実施例１に示した植物発現カセットのＮｃｏＩ部位にクローン化する。

結び、ｐＵＣ１８ｐｖＰｂｖＳＰＢＳＴｂｖＴＴｂｖＳｐｖＳと呼ぶクローンが 得られ、チャート１７（ｃ）に示す。同様に、実施例３の発現カセットをｂｖＳ ＰＢＳＴｂｖＴＴｂｖＳ　（チ＋−ト１８（ａ））に挿入し、チャート１８（ｂ ）のプラスミドｐＵＣ１８ｇｍＰｂｖＳＰＢＳＴｂｖＴＴｂｖＳｐｖＳが得られ る。

加えて、もう１つの３°オリゴマープライマーの使用により、Ｂｓｔポリアデニ ル化シグナルを含有しない同様の構築体が得られる。そのポリアデラル化シグナ ルの無い断片のごときＢｓｔを得るのに使用する３°ブイマーをチャート１９（ ａ）に示す。増幅により、チャート１９（ｂ）にてｐｖＳＰＢｓ　ｔｂｖＴＴと 呼ぶ約６５０ｂｐの断片が得られる。これをＮＣ０Ｉによる消化に付し、実施例 １に示した植物発現ベクターにクローン化し、クローンｐＵｃ１８ｐｖＰｂｖｓ ＰＢＳＴｂｖＴＴｐｖＳ　（チャート１９（ｃ））が得られる。加えて、このＢ ｓｔ断片（チャート２０（ａ））を実施例３のベクターに結んで、チャート２０ （ｂ）に示すクローンｐＵＣ１８ｇｍＰｂｖＳＰＢＳＴｂｖＴＴｐｖＳが得られ る。

実施例１０ 外来性遺伝子の発現用種子特異的発現カセットこの活性形において、Ｂｓｔはそ の１９アミノ酸シグナルペプチドを包含せず、これは合成後まもなく切断される （ウォイチックら（Ｗｏｙｃｈｉｋ　ｅｔ　ａｌ）、１９８２）。

しかしながら、植物系においては、このシグナルペプチドが除去されるかは疑わ しく、かくして、その除去は精製手順の一部としてなされるべきであろう。加え て、前記構築はＢｓｔペプチドの正しいターゲツティングを保証するための植物 種子貯蔵蛋白遺伝子についての通常のシグナルペプチドを包含しない。以下の構 築は、Ｂｓｔ蛋白遺伝子で作製され、Ｂｓｔシグナルペプチドを包含しないが植 物種子貯蔵蛋白遺伝子からのシグナルペプチドを含有する転写融合を説明する。

これは、ＣＰＣＲを用いて、Ｂｓｔシグナルペプチドを包含しないＢｓｔ遺伝子 の一部を増幅し、それを実施例２および４に記載した発現カセットにクローン化 することによって達成される。これらの融合遺伝子からの発現より得られたポリ ペプチドは最初種子貯蔵シグナルペプチドを包含すると予測され、これは通常の 蛋白加水分解切断の結果として除去されるべきで、そのＮ−末端の２ないし４の 付加アミノ酸の存在を除いて天然に生じるペプチドと同一のＢｓｔポリペプチド が得られる。これらの付加アミノ酸はシグナルペプチド切断部位が認識されるの を保証するのに必要である（実施例２．４および６参照）。

チャート２１（ｂ）および２２（ａ）でＢＳＴｂｖＴＴと呼ぶ６００ｂｐ断片を 増幅するチャート２１（ａ）に示した２のプライマーを用い、ＣＰＣＲ増幅を使 用して適当なりｓｔ遺伝子断片を得ることができる。この断片をＮＣ０Ｉによる 消化に付し、次いで、実施例２および４に記載した種子貯蔵蛋白遺伝子カセット に結んで、クローンｐＵＣ１８ｐｖＰｐｖＳＰＢＳＴｂｖＴＴｐｖＳ　（チャー ト２１（ｃ））およびｐＵＣ１８ｇｍＰｇｍＳＰＢＳＴｂｖＴＴｐｖＳ（チャー ト２２（ｂ））が得られる。これらのクローン内に含有される作製発現カセット はＢｉｎｄｍでの消化により取り出し、続いてアグロノくクテリウムまたはマイ クロプロジエクティール遺伝子挿入系で用いるために設計したベクターへ移入す ることができる。

実施例１１ ＢＳＴの発現用カセットを含有する植物ウシ・ソマトトロピン遺伝子ＢＳＴにつ きコードする発現カセットを含有する植物を生産した。本発明者らは、Ｂｇｌｌ ｌでの制限エンドヌクレアーゼ消化および標準化技術により精製した断片によっ て、クローンｐＰｈａｓ８．８ＢｇＩＩ［ジエイ・エル・スライトンら（Ｊ、Ｌ 、Ｓｌｉｇｈｔｏ＠、ｅｔ　ａｌ）、プロシーデイングズ・オフ・ナショナル・ アカデミ−・オフ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　）　Ｕ　５Ａ８０　：１８９７−１９０１　（１９８３）コからのファゼ オリン遺伝子の調節領域を取り出すことによって開始した。次に、本発明者らは 、ウシ・ソマトトロピン（Ｂｓｔ）の相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）およびＢｓｔ ポリアデニル化領域を含有する（前記した）形質転換ＳＶ４０プラスミドｐＳＶ ｂＧＨ−１を用いた：これらはＳＶ４０プロモーターの下流に融合した。プラス ミドｐＳＶｂＧＨ−１はＳＶ４０プロモーターおよびＢＳｔ遺伝子の間にあるＢ ａｍＨＩの単一の制限部位を含有する。最後に、ｐＰｈａｓＢｓｔを、ＢａｍＨ ＩでのｐＳＶｂＧＨ−１の消化、続いての制限部位での精製プロモーター領域の 一体化によって作製する。

Ｂｓｔ遺伝子およびファゼオリン調節領域を含有するｐＰｈａｓＢｓｔプラスミ ドの領域をＫｎｐＩでの消化によって取り出し、アゲｌくクテリウムのｌくイナ リベクターのＫｎｐＩ部位に挿入してプラスミドｐＧＡ４８２Ｇ／ＰｈａｓＢｓ 　ｔが得られる。ｐＧＡ４８２Ｇ／ＰｈａｓＢｓ　ｔを用いてアグロノくクテリ ウム株０５８２７０７を形質転換する。エイ・シイ・ヘブノく−ンら（Ａ、　Ｇ 、　Ｈｅｐｂｕｒｎ、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オフ・ジェネラル・マイク ロバイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　）　１３１　：２９ ６１−２９６９　（１９８５）。最後に、得られたアグロノくクチ１ノウムを用 いて培養したタバコ葉片を感染させ、それから完全な植物が得られる。

ＰｈａｓＢｓｔ遺伝子を含有するトランスジェニックタノくコ植物＋ｔＲ１世代 を通じて得られる。これらの植物からの種子Ｒ２種子はＴＥＭ可視化用Ｂｓｔ抗 体で染色される。その結果、蛋白貯蔵ボディー内のＢｓｔ蛋白の局在を示す。

チャート１ りＵＣ１８ｐｖＰｐＳ発現カセットノ構築発現カセット−構築５°オ リゴマープライマーマー ５°オリゴマープライマー ３′オリゴマーブライマー チャート１　（続き） チャート２ ｐ［Ｊｃ１８ｐｖＰｐｖｓＰｐｖＴＴｐｖｓの構築５°オリゴマープライマー ３°オリゴマープライマー ５°オリゴマープライマー ３゛オリゴマーブライマー チャート（２）（続き） ｐｖＦ’ｐｖｓＰｐｖＴＴｐｖｓ ｐｌＪＣＬｌｌｐｖＰ’ｐｖＳＰｐｖＴＴｐｖＳチャート３ ｐＵｃ１８ｇｍＰＩ）ＶＳの横築 ５°オリゴマーブライマー ３°オリゴマーブライマー ｐＵｃＬ８ＰＰＰｖｓ チャート４ ｐＵＣ１８ｇｍＰｇｍＳＰｐｖＴＴｐｖＳの構築５オリゴマー ３°オリゴマー ｐＵＣｌｇｇａＰｇｎ５？ｐＶＴｒｐｖ５チャート５ ｐＺｅｉｎ１５にのヌクレオチド配列 ＣＣ＾τＣＣＡＡ（：ＣＣＡＣＣＴＡＡＣＡＡＣＴＡＧＣＡＣＡＡＣＡＩ了ＡＣ ＡＡＣＡＡＡＡτ＾τ丁ＧＣτＣτＡＴＡτＣτＧＣＣ１−−−・−−−−−＋ −−−−−−−−−＋−−・−−−・−−＋−−−−−−−−−◆−−−−−− −−−＋−−−−−−−−−＋　５p ＴＡＣＡＡＴＡＡＣＣτＣＡＴＣＡ（ＴＣＡＴＧにτＣＡτＣＴＣτＡＡＡＧＡ ＣＣＣＡ丁τＡＣＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴｒＣＡＣＡＡ６１　−−−−−−−−− ＋−−−−−・−−−＋−−−−−−−−〜＋−−−−−−−−−＋−−−−− −−−−＋−−−−−−−−・＋P２０ ＧＣＣ：ｒＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡτＣτＡＡＡ 　σＴＴＧＡＴＴＣＡｒＡＴにＴＡＴＡＡＧＡＡＡＧＣτ１２１　−−−−−− −−−＋−−−−−・−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−・ −−−−−−−＋−−−−−−−−−{　１１１０ ＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡτＣＡＴＣＴＡτＡＡＡταχ’ＴＮ：、ＣＴ ＣＣＣＡＣＡＴ＾τＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＣＴＡτＣＡ２（ｉＬ　−−−−−− −−−＋・−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−− −−−−−−−＋−−−−−−−−|＋３００ ＴＣＡＴＣＣＡＡＴＣＣＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣにＣＡＧＴＧＣにτＡＧ ＡＣＡＧＣＡτＣＣτＣＪ：；ＡＡＣＡＣ；ＡＡＣｋＧＣｋ３０１　−−−−− −−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−十−−−−−−−−−＋− −＝−−−−−＋−−−−−−−−−＋@３６０ に τＣ＾ＡＣＡＴＣＣτＣＡＴＣｒτＣτＣＣτＣσ江ｒｃｃｃ’ｒｃｃｃτＣτ ＣτＣＡＧσ■℃Ｃ＾ｃｃｃｃｃτＣτＧＣＡＡ３６１　−−−−−−−−−＋ −−−−−−−−−＋−−−−−−−−−十−−−−−−−−−＋−−−−−− −−−＋−−−−−−−−−{　４２０ に　ＭＶＩＶＬＶＶＣＬＡＬＳＡＡＳＡＳＡｌｌＴＯＣＡＧＡＴＩＩ；ＣＣＣＴ にＣＣＣＣＴＧＣ（、ＣｃｃｌＧｃ、ＣＴＧＣＡＧＧＧｆｌｃＧＧＣＧＣＴＣＧ ＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＡＩａ２１　−−−−−−−＝＋・−−−−−−−−＋− −−・−−・−−＋−−−・・−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−− −−{　４ｇＱ ｑ　に　ＰＣＥ’ＣｋＧＬＱにＬＹＧｋＣｋＧＬＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＧ ＣＧ（ＣＣＣＣにＧＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＴＡＣにＣＧＣＡＧＴＡ、ＣＣＴにＡ ＧＧＣＡＧＣＣＧＣＡＧτ４８Ｌ　−−−−−−−−・＋−−−−−−−−−＋ −−−−〜−−−・＋・−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−− −−−{　５４０ τ　Ｍ　に　ＣＡＣＧＬＹＰＹＡＥＹＬ　λ　Ｑｌ！ＱＣＯＣＡにＣＣＣＣ，Ｃ ＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ：ＣＣＣＴｋＣＴ人ＣＣＣＣＣＣ；ＣＴＣ：ＴＣ，ＧＣ ；ＣＡＧｋＣＣｋＣＣＣ；ＣＣＡＴ（FＴＡＣＣ ５４Ｌ　−−−−−−−−−÷−−−−−−−−・＋−−−−−−−−−＋−− −−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−{６００ ＳＰＬＡ　＾　＾　ＰＹＹＡＧＣＧＱＴＳＡ　に　ＹＱＡＧＣＣＯＣＴＣＣＣＣ ＣＡＡＣＡＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＴ（：ＡＧＩ：ＡＴＣＡＴＣＧ ＡＣ（ＴＣＣＡにτＣＣＣτＣＣ６０１−−−−−−−−−＋−−−−−−−− −＋・−−・−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−− −−−−−＋@６６０ ＰＬＲＱＱ（：ＣＱＱＱＭＲＭＭＤＶＱＳＶＡチャート５（続き） ＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴ（：ＡＴ（：ＡＴＣＣＡＧＣＴＴにＡＧＣＧ ＴにＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴ６６１　−−−−−− −−−＋−−−・−−−−−÷−−−・−−一−−◆−−−−−−−−−＋−− −−−−−−−＋−−−−−−−−−{　７２０ ＱＱＬＱ　に　に　に　ＱＬＥＲ＾　＾　＾　ＡＳＳＳＬＹＡＣＧＡにＣＣＡＧ ＣＴＣＴＧＡτＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＩＩ：ＣＡＣＴ ＣＷＣＴＣＡＡＣＣＣＣＡ７２１−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋− −−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−− −−＋V８０ ＥＰＡＬＫＱＱＱＱＱＬＬＡＬｑ（：ＬＮＰ　にτＧにＣｃＡＴＧＡＴＧＡτＣ ＣＣ（：ＣＡＧＡＡＣＡτにＣＣＣｌ：ＣＣＡＴＧＧＧＴｃｃＡｃＴＣＴＡＣＣ ＡＧＴＡＣＣＡＧＴＡＣＣ７ｇｌ　−＝−−−−−−＋−−−−−−−−−＋− −−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−− −−＋撃撃SＱ Ａににに入ＱＮＫＰＡにＣＧＬＹＱＹＱＹＱＡｃｃｒＣＣＣＣＡＧＣＴＡＣＣＧ ＣＡＣＣＡＡＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＴＣＣＣｋＴＴＣＣにＣＣ ＣＴＡＣτＡＣＴ８４１　−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−− −−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−{ 　９００ ＬＰＳＹＲＴＮＰＣＧＶＳＡＡＩＰ１’ＹＹ舎ＧＡＴＴＣＡＴにＡＴＡＴＴＴＧ Ｇに人ＡＡＴＣＴＣＣτＣτＡτＣＣＡＴＣＣＣτＣτＣτＡτＣτＡＴＡ丁Ａ ＴＣＴＡＡＴＡ＾丁９０１　−−−−−−−−−＋−ニー−−−−−＋−−−− −−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋ @９６０ ＣＯ，Ｃ丁ＡＡＧＡＣＧＡＣＡＣＡＣＡＴＴＡＴＣＡＴにτｃｒｃｃτＡ丁ｃＡ ｃｃ＾＾τ＾ＡτＡτ＾τＣＣＡτＣＡτＡＡτＡＡ９６１　−−−−−−−− −＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＊−−−−−−−−−◆−−−− −−−−−＋−−−−−−−−−{ＬＯ２０ Ａ（ＴＴＴＴ　Ｑ７０−τＡ）ＡＣ；ＡＡＴＴ）＝Ｔ０１ＡＣＣＣＴｒＣＡＴＡ ＴＣＴＡＴＣＡＴＣ；ＣＴＣＡＡＴＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣ１０２１−−−−−− −−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−− −−−−−−−＋−−−−−−−−−{ＬＯ８０ ＴＴＣＴＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴ（ＴＡＡＡτＡＴｒＴＣＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＴ ｆＴＡＧＧＣＴＣＣＡＡτＧＣＡｃＡＧｃＡＴＡＴｃ１０８１　・−−−−−− −−＋・−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−− −−−−−−＋−−−−−−−−|＋ＬＬ４Ｑ ＧＧＴＡＧＡＧＴＡ（ＴＡτ＾τ＾τＧＣＴＴＣ；ＡＡＡτＡＣＴ人ＡＣＡＡＣ ＴＡＧＣＭＡＧτＧＣＧＧＧＣＡＣＧＴｒＣＣＴＡＣ１１４１−−−−−−−− −＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−− −−−−−＋−−−−−−−−−{１２００ ＡＴＧＣＴＣＡ’ｒτＴＡτＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡｌｉＡＴＡＡＡＡＣＡ ＴＡＡＡＧＡＴＡτＡτ＾ＴσｒτＣＴＡττＧＧＣτ１２０１　−−−−−− −−−＋−−−−−・−−−◆−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−− −−−−−−−＊−−−−−−−−|＊１２６０ 丁ｃｃＴＡＡＡＣＧＴＧ（：ＡＴＡＴＡにＣτττＡＡＡにＣＣＡＡＣＡＡＣＴ Ａ　τＧＣＴτＣ（：ＡＡτＣＣτＣＡτττＡてＡτ＾τ１２６Ｌ　−−−− −−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋ −−−・−一−−一奉−−−−−−−−|＋１３２０ チャート５（続き） チャート６ ｐＵｃ１８ｚｍＰｚｍｓの構築 ｐＺａＬｎ　１５に ５′オリゴマープライマー ３°オリゴマープライマー ３５０　ｂ、ｐ。

５°オリゴマーブライマー ３°オリゴマープライマー チャート６　（続き） ７００　ｂ、ｐ。

ｚｒｄｚＴｓｓ １０５０　ｂ、ｐ。

ｐＵｃＬａｚｄｚｍｓ チャート７ ｐＵＣ１８ｚｍＰｚｍＳＰｚｍＴＴｚｍＳの構築５オリゴマーブライマー ３°オリゴマープライマー ｄｚａｓＰ ４００　ｂ、ｐ。

３°オリゴマープライマー ｚｍｌτｚＩＩＬ９ ７２０　ｂ、ｐ。

チャート７（続き） ｐυＣＬ８ｚｍＰｚＩＩＩ５Ｐｚ＋＋＋ＴＴｚｍＳチャート８ ブラジルナツト冨硫黄種子貯蔵蛋白の ヌクレオチド配列 ＸｋＧＦ嚢 チャート８（続き） ＣＴｋＴＣにＴＧ；ＴＣＴＴＣＴＣｋＣ，ＣＭＣ６０１−−−−−−−−−＋− −−−−−−−−＋−６２１チヤート９ ブラジルナツト冨硫黄種子貯蔵蛋白遺伝子を用いる発現力セントの構築（Ｂ　Ｚ ） ３°オリゴマーブライマー ４２０　ｂ、ｐ。

ｐＵｃ１８ｐｖＰＢＺｐｒゴｐｖｓ ｐＵｃＬ８ＰＰＢＺｐｖＴＴｐｖｓ ｐｌＪｃ１８ｚｄＢＺｚａ＋ＴＴｚｍｓチャート１０ （ａ）ブラジルナツト富硫黄種子貯蔵蛋白の合成９ｋＤサブユニツトのヌクレオ チド配列（ＢＺ−１） （ｂ）合成ブラジルナツト富硫黄種子貯蔵蛋白の完全な９ｋＤ遺伝子のヌクレオ チド配列（ＢＺ−２） チャート１０（続き） （ｅ）冨硫黄種子貯蔵蛋白遺伝子の合成ブラジルナツト１２ｋＤサブユニツトの ヌクレオチド配列（ＢＺ−３） チャート１１ ５°オリゴマープライマー ３°オリゴマープライマー ５゛オリゴマーブライマー ３°オリゴマープライマー ５°オリゴマープライマー ３°オリゴマープライマー チャート１２ プラノルナノド遺伝子断片を用いるファゼオリン発現カセットｐＵｃ１［１ｐｖ ＰｐｖｓＰＢＺ・１ｐｖ’１ｐｖＳｐｔＪ（：１８ｐｖＰ’ｐｖ５ＰＢＺ−２ｐ ｖ’１ｐｖＳｐＵｃＩＪｐｖ！’ｐｖｓＰＢＺ−３ｐ−ゴｐｖｓチャート１３ ブラジルナツト遺伝子断片を用いるグリ／ン発現カセットｐｌＪＣＬ８ＰＰｐａ ＳＰＢＺ４ｐｖＴＴｐｖ５ｐｌＪｃＬｌｌＰＰＰｓＰＢＺ−２ｐｖ’ｒ’Ｔｐｖ ＳｐＵｃＬｌ１ｇａＰｇｍｓＰＢＺ−３ｐｖＴＴｐｖ５チヤート１４ ブラジルナツト遺伝子断片を用いるゼイノ発現カセットρυＣＩＢｚ＋＋＋？ｚ ｍ５ＰＢＺ−１ｚ＋ｎ１ｚｔｐＬｌ（Ｊ８ｚ＋ｄｚｔＰＢＺ−２ｚ＋ｍＴＴｚｍ ＳｐＵｃ１８ｍＰｍ５ＰＢｚ−３ｚｍＴＴｚ＋ａＳチャート１５ ＢＳＴ遺伝子を用いるグアゼオ９フ発現カセットｐＵｃ１１１ｐｖＰｂｖｓＰＢ ｓＴｈｖ′ｒＴｂｖ５チャート１６ ＢＳＴ遺伝子を用いるグリフ）発現カセットｇｏ＋Ｊ’ｂｖＳ　Ｐ　Ｒ５Ｔｈｖ ＴＴｂｖＳｐｌＪｃ１８［ＰＰｂｖｓ！’悶ｉｙ１ｂ６チャート１７ ＢＳＴ遺伝子を用いるフＴゼオリン発現カセット３”オリゴマーブライマー ｂｖｓ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｔｈ　ｖＴｒｂｖｓｐＵＣＬ［ＩｐｖＰｂｖＳＰＢＳＴｏ ｖ’ＴＴｂｖＳｐ６チヤート１８ ＢＳＴ遺伝子を用いるグリシン発現カセットｂｙＳ　Ｐ　Ｂｓ　ＴｈｖＴＴｂｖ ５ ｐｌＪＣ１８ＰＰｂｖＳＰＢＳＴｏｖ’ｒＴｂｖＳｐｖＳチャート１９ ＢＳＴ遺伝子を用いるファゼオリン発現カセ、トｐｖｓＰＢｓＴｏＶＴＴ ｐＵＣ１８ｐｖＦｂｖＳＰＢＳＴｏＶＴｒｐｖＳチャート２０ ＢＳＴ遺伝子を用いるグリ／／発現カセットｐｖｓＰＢｓＴｈヤ ｐυ（ＪａＰＦｂｖＳＰＢ５ＴｈｖＴＴｐｖＳチャート２１ ＢＳＴ遺伝子を用いるファゼオリン発現カセットｐυＣＬ８ｐｖＦ’ｐｖＳＰＢ ＳＴｂｖＴｒｐｖＳチャート２２ ＢＳＴ遺伝子を用いるグリ／ン発現カセットｐＵＣ１１１ｇｍＰＰＳＰＢＳＴｈ ｖＴＴｐｖＳｔ＋ノ　□　ＧＵＳｍＲ〜Ａ 要約書 本発明は薬理学的および産業的要請で重要な蛋白を植物で調節および発現させる ための種子特異的発現カセットに関する。これらのカセットは、合成した制限酵 素部位を介して、調節部位をクローン化するために使用した増幅オリゴマーに調 節要素を結合させることによって迅速に構築できる。本発明の１の態様において 、植物ゲノムへの移入のために、ファゼオリン遺伝子のプロモーター領域を、ウ シ・ソマトトロピン（Ｂｓｔ）をコードし、ファゼオリン、Ｂｓｔ、または双方 からのポリーＡシグナルに連結した無イントロン遺伝子に結合させる。

国際調査報告 −ＩＩＩａｍａｓａｌＩａ＋　Ａｓ＊ｋａ＋ｍ＋＋　ｕｓ　ＰＣＴ／　ＩＩｓ　 Ｑ　１／　ｎｎＱＱ　７国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）ファゼオリン・プロモーター、β−コングリシニン・プロモーターのα ′−サブユニット、およびβ−ゼイン・プロモーターよりなる群から選択される プロモーター； ｂ）ファゼオリン翻訳開始シグナル、β−コングリシニン翻訳開始シグナルのα ′−サブユニット、β−ゼイン翻訳開始シグナル、および動物遺伝子翻訳開始シ グナルよりなる群から選択される翻訳開始シグナル；ｃ）動物遺伝子およびブラ ジルナット２Ｓ貯蔵蛋白からの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子； ｄ）ファゼオリン・ポリ−Ａシグナルおよび動物遺伝子ポリ−Ａシグナルよりな る群から選択されるポリ−Ａシグナル；よりなる遺伝子調節要素を有し、 該プロモーターは該開始シグナルの上流に作動可能に連結し、該開始シグナルは 該遺伝子の上流に作動可能に連結し、該遺伝子はポリ（Ａ）シグナルの上流に作 動可能に連結し； ただし、遺伝子調節要素がゲノミックまたは合成ＤＮＡから増幅される場合、該 調節領域はＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＳａｌＩよりなる群から選択され る制限酵素部位によって挟まれ； さらに、該翻訳開始シグナルがファゼオリンからのものである場合、該プロモー ターはファゼオリンからのものであり、該翻訳開始シグナルがβ−コングリシニ ンのα′−サブユニットからのものである場合、該プロモーターはβ−コングリ シニンのα′−サブユニットからのものであり、該遺伝子がブラジルナットから のものである場合、該プロモーターおよび該翻訳開始シグナルは同一ゲノムから のものであることを特徴とする種子特異的発現カセット。
2. ２．該プロモーターがファゼオリンからのものであり、残りの領域がウシ・ソマ トトロピンからのものであり、さらにファゼオリン領域の上流に作動可能に連結 したＳＶ４０プロモーターを含む請求の範囲第１項記載の種子特異的発現カセッ ト。
3. ３．該遺伝子がウシ・ソマトトロピンからの動物遺伝子であって、翻訳開始シグ ナルを包含する請求の範囲第１項記載の種子特異的発現カセット。
4. ４．該プロモーターがファゼオリンからのものであり、残りの要素がウシ・ソマ トトロピンからのものであり、該プロモーターおよび該ポリＡ−要素をプラスミ ドに結合させる領域が各々ＨｉｎｄＩＩＩについてコードし、該プロモーターを 該翻訳開始シグナルに結合させる領域がＮｃｏＩについてコードする請求の範囲 第３項記載の種子特異的発現カセット。
5. ５．該プロモーターがβ−コングリシニンのα′−サブユニットからのものであ り、残りの要素がウシ・ソマトトロピンからのものであり、プロモーターおよび ポリ−Ａ要素をプラスミドに結合させる領域が各々ＨｉｎｄＩＩＩについてコー ドし、該プロモーターを該翻訳開始シグナルに結合させる領域がＮｃｏＩについ てコードする請求の範囲第３項記載の種子特異的発現カセット。
6. ６．該プロモーターおよびポリ−Ａシグナルがファゼオリンからのものであり、 残りの要素がウシ・ソマトトロピンからのものであり、プロモーターおよびポリ −Ａ要素をプラスミドに結合させる領域が各々ＨｉｎｄＩＩＩについてコードし 、該プロモーターを該翻訳開始シグナルにおよび該遺伝子をポリ−Ａシグナルに 結合させる領域がＮｃｏＩについてコードする請求の範囲第３項記載の種子特異 的発現カセット。
7. ７．該プロモーターおよびポリ−Ａシグナルがβ−コングリシニンのα′−サブ ユニットからのものであり、残りの要素がウシ・ソマトトロピンからのものであ り、該プロモーターおよび該ポリ−Ａ要素をプラスミドに結合させる領域が各々 ＨｉｎｄＩＩＩについてコードし、該プロモーターを該翻訳開始シグナルおよび 該遺伝子を該ポリ−Ａシグナルに結合させる領域がＮｃｏＩについてコードする 請求の範囲第３項記載の種子特異的発現カセット。
8. ８．該プロモーター、翻訳開始シグナル、およびポリ−Ａシグナルがファゼオリ ンからのものであり、該プロモーターおよび該ポリ−Ａ要素をプラスミドに結合 させる領域が各々ＨｉｎｄＩＩＩについてコードし、該翻訳開始シグナルを該遺 伝子におよび該遺伝子をポリ−Ａシグナルに結合させる領域がＮｃｏＩについて コードする請求の範囲第３項記載の種子特異的発現カセット。
9. ９．該プロモーターがファゼオリンからのものであり、該翻訳開始シグナルおよ び遺伝子がウシ・ソマトトロピンからのものであり、ファゼオリンからの第２の ポリ−Ａシグナルの上流に作動可能に連結したウシ・ソマトトロピンからの第１ のポリ−Ａシグナルを有し、該プロモーターおよび該第２のポリ−Ａ要素をプラ スミドに連結させる領域が各々ＨｉｎｄＩＩＩについてコードし、該プロモータ ーを該翻訳開始シグナルにおよび該第１のポリ−Ａシグナルを該第２のポリ−Ａ シグナルに連結させる領域がＮｃｏＩについてコードする請求の範囲第３項記載 の種子特異的発現カセット。
10. １０．該プロモーターがβ−コングリシニンのα′−サブユニットからのもので あり、該翻訳開始シグナルおよび遺伝子がウシ・ソマトトロピンからのものであ り、ファゼオリンからの第２のポリ−Ａシグナルの上流に作動可能に連結したウ シ・ソマトトロピンからの第１のポリ−Ａシグナルを有し、該プロモーターおよ び該第２のポリ−Ａ要素をプラスミドに連結する領域が各々ＨｉｎｄＩＩＩにつ いてコードし、該プロモーターを該翻訳開始シグナルにおよび該第１のポリ−Ａ シグナルを該第２のポリ−Ａシグナルに連結させる領域がＮｃｏＩについてコー ドする請求の範囲第３項記載の種子特異的発現カセット。
11. １１．ａ）ファゼオリン・プロモーター、β−コングリシニン・プロモーターの α′−サブユニット、およびβ−ゼイン１５Ｋプロモーターよりなる群から選択 されるプロモーター； ｂ）ファゼオリン翻訳開始シグナル、β−コングリシニン翻訳開始シグナルのα ′−サブユニット、およびβ−ゼイン１５Ｋ翻訳開始シグナルよりなる群から選 択される翻訳開始シグナル； ｃ）ブラジルナット遺伝子およびブラジルナット遺伝子サブユニットよりなる群 から選択される遺伝子； ｄ）ファゼオリン翻訳終始シグナルおよびβ−ゼイン１５Ｋ翻訳終始シグナルよ りなる群から選択される翻訳終始シグナル；ｅ）ファゼオリン・ポリ−Ａシグナ ルおよびβ−ゼイン１５Ｋポリ−Ａシグナルよりなる群から選択されるポリ−Ａ シグナル；よりなり； 該プロモーターは該開始シグナルの上流に作動可能に連結し、該開始シグナルは 該遺伝子の上流に作動可能に連結し、該遺伝子は該翻訳終始シグナルの上流に作 動可能に連結し、該翻訳終始シグナルは該ポリ−Ａシグナルの上流に作動可能に 連結し； ただし、遺伝子調節要素はＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＳａｌＩよりなる 群から選択される制限酵素部位によって挟まれ；さらに、該プロモーターおよび 翻訳開始シグナルは同一ゲノムからのものである請求の範囲第１項記載の種子特 異的発現カセット。
12. １２．該遺伝子がＢＺである請求の範囲第１１項記載の種子特異的発現カセット 。
13. １３．該プロモーター、翻訳終始シグナル、およびポリ−Ａシグナルがファゼオ リンからのものであり、該プロモーターおよびポリ−Ａ要素をプラスミドに連結 させる領域が各々ＨｉｎｄＩＩＩについてコードし、該プロモーターを該遺伝子 におよび該遺伝子を該終始シグナルに連結させる領域がＮｃｏＩについてコード する請求の範囲第１２項記載の種子特異的発現カセット。
14. １４．該プロモーターがβ−コングリシニンのα′−サブユニットからのもので あり、該翻訳終始シグナルおよびポリ−Ａシグナルがファゼオリンからのもので あり、該プロモーターおよびポリ−Ａ要素をプラスミドに連結させる領域が各々 ＨｉｎｄＩＩＩについてコードし、該プロモーターを該遺伝子におよび該遺伝子 を該終始シグナルに連結させる領域がＮｃｏＩについてコードする請求の範囲第 １２項記載の種子特異的発現カセット。
15. １５．該プロモーター、翻訳終始シグナル、およびポリ−Ａシグナルがβ−ゼイ ン１５Ｋからのものであり、該プロモーターおよびポリ−Ａ要素をプラスミドに 連結させる領域が各々ＳａｌＩについてコードし、該プロモーターを該遺伝子に および該遺伝子を該終始シグナルに連結させる領域がＮｃｏＩについてコードす る請求の範囲第１２項記載の種子特異的発現カセット。
16. １６．該遺伝子がＢＺ−１、ＢＺ−２、およびＢＺ−３よりなる群から選択され る請求の範囲第１１項記載の種子特異的発現カセット。
17. １７．残りの要素がファゼオリンからのものであり、該プロモーターおよびポリ −Ａ要素をプラスミドに連結させる領域が各々ＨｉｎｄＩＩＩについてコードし 、該翻訳開始シグナルを該遺伝子におよび該遺伝子を該終始シグナルに連結させ る領域がＮｃｏＩについてコードする請求の範囲第１６項記載の種子特異的発現 カセット。
18. １８．該残りの要素がβ−ゼイン１５Ｋからのものであり、該プロモーターおよ びポリ−Ａ要素をプラスミドに連結させる領域が各々ＳａｌＩについてコードし 、該翻訳開始シグナルを該遺伝子におよび該遺伝子を該終始シグナルに連結させ る領域がＮｃｏＩについてコードする請求の範囲第１６項記載の種子特異的発現 カセット。
19. １９．請求の範囲第１項記載の種子特異的発現カセットよりなる細胞。
20. ２０．請求の範囲第１９項記載の細胞よりなる種子または植物体。