JP3054687B2 - Ｌ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ビタミンＣ生合成
の主働酵素であるＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナー
ゼ（EC 1.3.2.3）は、Ｌ−ガラクトノラクトンを脱水素
酸化し、Ｌ−アスコルビン酸（還元型ビタミンＣ）を生
成する酵素である。本酵素は、植物細胞中でのビタミン
Ｃ合成に関わっており、本酵素の活性あるいは存在量を
増大または減少させることにより、植物細胞中のビタミ
ンＣ含量を増大または減少させることができると考えら
れる。

【０００３】ビタミンＣは種々の野菜、果実類の重要な
栄養成分であるが、レタス等の野菜では、ビタミンＣ含
量が100 グラム中５ミリグラム程度と他の野菜類に比べ
て低く、ビタミンＣ含量の高い品種の開発が強く望まれ
ている。また、トマトやオレンジ等においても、ジュー
ス等の加工品の付加価値を高めるため、ビタミンＣ含量
の一層高いものが求められている。したがって、ビタミ
ンＣ含量の増大を目的とした品種改良を行うことが重要
な目標となっている。しかしながら、従来の交雑育種法
では種を越えた形質導入が困難であり、仮に適当な野生
種等の素材が見つかっても、実用品種の育成には多大な
時間と労力を要する。

【０００４】さらに、Ｌ−アスコルビン酸は、植物体内
でストレス障害の原因である活性酸素の消去に関与して
いることが知られている [Foyer et al., Plant Cell E
nv.,17 , 507-523 (1994)] 。実際、アラビドプシスで
ビタミンＣが減少した変異株が発見され、ストレス障害
に弱いことが報告されている[Conklin et al., Proc.Na
tl. Acad. Sci., 93, 9970-9973 (1996)]。よって、従
来の交雑育種法に代えて、植物内中のＬ−ガラクトノラ
クトンデヒドロゲナーゼの活性を遺伝子工学的に制御す
ることにより、ビタミンＣ含量が高く、かつストレスに
強い植物を開発することが期待される。

【０００５】これまで動物におけるビタミンＣ合成経路
の最終反応を触媒するＬ−グロノラクトンオキシダーゼ
のｃＤＮＡがネズミ、モルモット等から既にクローニン
グされており、その配列決定がなされている [Koshizak
a et al., J. Biol. Chem.,263, 1619-1621 (1988) ; N
ishikimi et al., J. Biol. Chem., 267, 21967-21972
(1992)]。しかしながら、植物由来の当該酵素は植物に
特異的であると考えられており、これまでその遺伝子の
クローニングは行われていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、植物
由来のＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝子
をクローニングすることにある。本発明のさらなる課題
は、上記遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを植物に導
入することにより、ビタミンＣ含量が高く、また酸素障
害等のストレスに耐性のある植物を提供することにあ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、カンショ塊根よりＬ
−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝子をクロー
ニングし、その塩基配列を決定することに成功し、本発
明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の
(A) 又は(B) のタンパク質をコードする遺伝子： (A) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク
質 (B) 配列番号１記載のアミノ酸配列において１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、かつＬ−ガラクトノラクトンデヒド
ロゲナーゼ活性を有するタンパク質である。

【０００８】上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加
は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により
実施することができ、また、１若しくは数個のアミノ酸
とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換若しくは
付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。

【０００９】本発明はまた、上記遺伝子を組み込んだ発
現プラスミド、および上記遺伝子を組み込んだ発現プラ
スミドを導入した形質転換植物である。さらに、本発明
は、上記遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを植物に導
入し、植物体中のビタミンＣ含量を改変する方法であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】

【発明の実施の形態】

[1] Ｌ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝子
のクローニング 本発明のＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝
子のクローニングは、以下の各工程よりなる。 植物組織よりＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナ
ーゼを精製する。 精製酵素タンパク質の分解物の部分アミノ酸配列を
決定する。 で決定された部分アミノ酸配列をもとに設計した
各種ＤＮＡプライマーを合成する。

【００１１】 で合成したＤＮＡプライマーを用い
たＰＣＲによって、Ｌ−ガラクトノラクトンデヒドロゲ
ナーゼのｃＤＮＡ断片を増幅後クローニングし、その塩
基配列を決定する。 上記断片の塩基配列をもとにＤＮＡプライマーを合
成し、該プライマーを用いて目的遺伝子の５’−または
３’−末端側のｃＤＮＡ断片をＲＡＣＥ法により増幅後
クローニングし、その塩基配列を決定する。

【００１２】 で決定された５’−および３’−非
翻訳領域の塩基配列をもとにＤＮＡプライマーを合成
し、該プライマーを用いて再度ＰＣＲを行い目的遺伝子
を増幅し、その全塩基配列を決定する。 以下、上記工程を具体的に説明する。

【００１３】(1) ｃＤＮＡの調製 カンショ（Ipomoea batatas 、たとえば品種ベニアズ
マ）塊根よりｍＲＮＡを抽出する。まず該組織より市販
の抽出キット、例えばFast Track Kit (インビトロジェ
ン社製) を用いてポリＡ（ポリＡ＋）ＲＮＡ鎖画分を得
る。次に、得られたｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを調
製する。具体的には、ｍＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴ
をプライマーとしてｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰの存在下で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的な
単鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、ＲＮＡ分解酵素とＤＮ
Ａ合成酵素を含む反応液を加え、ＤＮＡの第２鎖（＋
鎖）を合成し、２本鎖ｃＤＮＡを得る。

【００１４】(2) 酵素の精製 Ｌ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼの精製はOba
ら, J. Biochem. Vol.117: 120-124 (1995) に従い、カ
ンショ塊根より調製したミトコンドリアを超音波処理し
て酵素を可溶化したのち、ゲル濾過、陰イオン交換体、
ヒドロキシアパタイト等の各種クロマトグラフィーによ
り高度に精製し、最終的にポリアクリルアミド電気泳動
により、単一のタンパク質に精製する。

【００１５】(3) 精製酵素分解物のアミノ酸配列の決
定 上記の単一タンパク質を市販の配列決定用タンパク分解
酵素、例えばＶ８プロテアーゼを用いてペプチド断片化
し、これを電気泳動等の方法により精製する。精製した
ペプチド断片のアミノ酸配列を市販の自動アミノ酸配列
決定機を用いて決定する。

【００１６】(4) ＰＣＲによるｃＤＮＡ部分断片のク
ローニング 決定したペプチド断片のアミノ酸配列によりコードされ
うる塩基配列を割り出し、20塩基程度の長さの数種のＤ
ＮＡプライマーを合成する。ＤＮＡプライマーの合成
は、市販の自動ＤＮＡ合成機を用いて行うことができ
る。 (1) で作成したｃＤＮＡを鋳型とし、上記合成ＤＮＡプ
ライマーを用いて常法によりＰＣＲを行い、目的とする
酵素遺伝子の部分断片を増幅し、プラスミドベクターに
クローニング後、ジデオキシ法 [Sanger. F, Science,
214, 1205-1210(1981)]等の常法によってその塩基配列
を決定する。

【００１７】(5) ＲＡＣＥ法による５’および３’末
端断片のクローニング ５’−または３’−末端断片のクローニングは、例えば
「ＰＣＲ法最前線」蛋白質核酸酵素増刊 (1996) に従っ
たＲＡＣＥ法により行う。具体的には、５’−末端領域
のｃＤＮＡについては、ｍＲＮＡを鋳型に逆転写用プラ
イマーを用いて1 本鎖ｃＤＮＡを作成し、ついでその
３’末端にターミナルデオキシヌクレオチドトランスフ
ェラーゼでポリＡを付加する。このポリＡ部分に、制限
酵素認識塩基配列が組み込まれた数塩基のヌクレオチド
配列とオリゴｄＴとからなるプライマー（オリゴｄＴプ
ライマー）をハイブリダイズさせ、(4) で配列決定した
ｃＤＮＡの塩基配列既知領域の対応する遺伝子特異的プ
ライマーとの間でＰＣＲを行う。さらに、この増幅産物
を鋳型として前記オリゴｄＴプライマーと前記遺伝子特
異的プライマーより内側のプライマーとを用いてnested
PCRを行うことによってｃＤＮＡの５’−末端領域が得
られる。

【００１８】一方、３’−末端領域のｃＤＮＡについて
は、ｍＲＮＡと先述のオリゴｄＴプライマーより合成さ
れた１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として(4) で配列決定したＤ
ＮＡ配列の３’−末端近傍の遺伝子特異的プライマー
と、制限酵素認識塩基配列が組み込まれた数塩基のヌク
レオチド配列とオリゴｄＴからなるプライマー（オリゴ
ｄＴプライマー）との間でＰＣＲ増幅を行う。さらに、
この増幅産物を鋳型としてオリゴｄＴプライマーと前記
遺伝子特異的プライマーより内側の配列に基づくプライ
マーを用いてnested PCRを行うことによってｃＤＮＡの
３’−末端領域が得られる。

【００１９】最後に、決定された５’−および３’−非
翻訳領域の配列をもとに設計した20塩基程度の長さのＤ
ＮＡプライマーを合成し、該プライマーを用いて再度Ｐ
ＣＲを行うことにより、該酵素遺伝子の全塩基配列を決
定することができる。

【００２０】[2] 植物への遺伝子導入および形質転換
植物の作出 本発明における発現プラスミドは、適当なプラスミドに
５’から３’の向きに順番に、(a) 転写プロモーター、
(b) センスまたはアンチセンス鎖の向きのＬ−ガラクト
ノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝子、および(c) 転写タ
ーミネーターを連結することにより作製される。作製方
法は、例えば文献(Molecular Cloning :A Laboratory M
anual /2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory,
1989等) に記載の方法に従って行えばよい。

【００２１】ここで用いるプラスミドとしては、植物を
宿主とする場合、植物ゲノム中に前記 (a)〜(c) の領域
を安定に移行させることができるものであればよい。例
としては、通常クローニングに用いられるプラスミド由
来の各種ベクター（ｐＵＣ、ｐＢＲ系プラスミド等）や
コインテグレートベクター、バイナリーベクター（ｐＧ
Ａ４８２、ｐＧＡ５８０、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２
１）などのＴｉプラスミド由来のベクター類、さらには
タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物由来のベク
ター類も使用出来る。

【００２２】転写プロモーターは、植物体内で必要なコ
ードを発現せしめることができるものでなければならな
い。このプロモーターとは、植物の特定の組織内あるい
は特定の発育段階において、発現を導くことのできるＤ
ＮＡであれば、植物由来のものに限られない。具体例と
しては、カリフラワーモザイクウイルス由来35S プロモ
ーター、アグロバクテリウム由来ノパリンシンターゼま
たはオクトピンシンターゼプロモーター、ジャガイモ由
来パタチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロ
モーター、タバコ由来ルビスコの小サブユニット遺伝子
プロモーター等が挙げられる。トマト、特にその果実内
で発現させるプロモーターは、構成的プロモーター、組
織特異的プロモーターのいずれでもよい。

【００２３】転写ターミネーターは、前記プロモーター
により転写された遺伝子の転写を集結できる配列であれ
よい。具体例としては、ノパリン合成酵素ターミネータ
ー、カリフラワーモザイクウイルスポリＡターミネータ
ー等が挙げられる。Ｌ−ガラクトノラクトンデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子は、形質転換しようとする植物種より単離
されたものが望ましいが、他の植物種より単離されたも
のでもよい。Ｌ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼ
遺伝子は、核遺伝子または相補的遺伝子（ｃＤＮＡ）を
使用する。

【００２４】本発明のＬ−ガラクトノラクトンデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子導入の対象となる植物はトマト、レタ
ス、ナス、ピーマン、キュウリ、キャベツ、ダイコン、
イチゴ、メロン、スイカ、ミカン、リンゴ、カンショ、
ジャガイモ、イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ等
が挙げられる。発現プラスミドを植物細胞に導入する方
法としては、植物としてトマトまたはジャガイモを使用
する場合には、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸
カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティク
ルガン法等が挙げられる。

【００２５】後者の３法は、プラスミドの種類は問わな
いが、アグロバクテリウム法の場合にはＴｉプラスミド
由来のベクターを基に作製した発現プラスミドを使用す
る必要がある。これを例えばアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンスＬＢＡ４４０４株等に導入し、本組換え微
生物を植物細胞と共存培養することにより感染させて宿
主植物細胞を形質転換することができる。なお、植物に
おいてこれらの形質転換細胞より形質転換体を再生させ
るには既知の組織培養法により器官または個体を再生さ
せればよい。以下、本発明を実施例により具体的に説明
するが、これらにより本発明の範囲が限定されるもので
はない。

【００２６】

【実施例】

〔実施例１〕 Ｌ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナー
ゼ遺伝子のクローニング (1) カンショ塊根からのｍＲＮＡ抽出 FastTrack 2.0kit（インビトロジェン社製）を用いて、
以下に示すように組織から直接ｍＲＮＡを抽出した。1
4.5g のカンショ塊根を液体窒素中で乳鉢を用いて破砕
し、これをFastTrack stock buffer (20ml) に懸濁し、
600 μl のRNasedegraderを添加した。これを50℃で30
分間保温し、遠心分離した後、上清を得た。この上清に
1/15.8容の5M NaCl を加えさらにオリゴｄＴセルロース
を加え、攪拌しながら30分室温に保った。遠心分離して
オリゴｄＴセルロースを回収し、10mlのbinding buffer
で２回洗浄した後、スピンカラムに詰め、Elution buff
erを加えてｍＲＮＡを溶出した。14.5g の組織から約５
μg のｍＲＮＡが得られた。

【００２７】(2) 酵素の精製 カンショ塊根（品種：ベニアズマ）より超音波処理によ
ってＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼを可溶化
し、精製した。精製は文献[Obaら, J. Biochem. Vol.11
7: 120-124 (1995)]に基づいて行った。この際、最終ス
テップの精製法として、原文献にあるクロマトフォーカ
シング法の代わりにヒドロキシアパタイトカラムによる
精製を用いた方が酵素活性の損失が少ない。得られた酵
素溶液は、混在するタンパク質を除くため、さらにＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルで精製した。100kg のカンシ
ョ塊根より、約１mgのＬ−ガラクトノラクトンデヒドロ
ゲナーゼが精製された。

【００２８】(3) 精製酵素分解物の部分アミノ酸配列
の決定 単一タンパクに精製された該酵素約10μg にV8プロテア
ーゼ（和光純薬製）約1.4 μg を作用させ、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によってペプチド断片を分
離した。このうち４つの断片（断片１〜４）についてア
ミノ酸配列を決定した（配列番号３〜６）。

【００２９】(4) Ｌ−ガラクトノラクトンデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子部分配列の増幅 (4-1) ｃＤＮＡ合成 (1) で得たｍＲＮＡ溶液3.4 μl(１μg ｍＲＮＡ) より
市販のｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア社製 Time Sa
ver ）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。まず、1st
strand mixに鋳型ｍＲＮＡ、(dT)_12-18 プライマー、ジ
チオスレイトールを加え37℃で1 時間保温して第１鎖を
合成した。これを2nd strand mixに加え、12℃, 30分間
放置した後、22℃, 1 時間保温し、２本鎖ｃＤＮＡを得
た。

【００３０】(4-2) ＰＣＲ反応 (4-1)のｃＤＮＡ溶液0.5 μl に、1.5unit Taq DNA pol
ymerase (宝酒造製)、10×PCR buffer (宝酒造製)2.5μ
l 、2.5mM dNTP mix 2.0μl 、配列番号７に記載するプ
ライマーS3B (5'-AA(C/T)GA (A/G)AA(A/G)A A(A/G)CA(A
/G) AAIAT-3'; 20-mer) 100pmol 、配列番号８に記載す
るプライマーA1D(5'-TC(AG)AA ICC(C/T)A AIAT(C/T) TC
(A/G)TC-3'; 20-mer) 100pmol を加え、滅菌水で総量を
25μlとし、PCR 反応液とした。これをパーキンエルマ
ー社モデル480 を用いてＰＣＲ（ＰＣＲプログラム：変
性94℃, 1 分、アニーリング49℃, 1 分、合成反応72
℃, 2 分を42サイクル）を行い、約０．８ｋｂのＤＮＡ
断片を得た。

【００３１】(4-3) ＰＣＲ産物のプラスミドＤＮＡへ
のクローニングと塩基配列決定 上記のＰＣＲ産物をTAクローニングキット（インビトロ
ジェン社製）を用いてｐＣＲ２．１プラスミドにクロー
ニングした。塩基配列の解析は、モデル373Sシーケンサ
ー（パーキンエルマー社製) で行った。該ＰＣＲ産物は
配列番号２において400 より1265番の塩基配列を有して
いた。

【００３２】(5) ＲＡＣＥ法による５’末端および
３’末端断片のクローニング ５’末端および３’末端断片のクローニングはＲＡＣＥ
法によって行った。 (5-1) ５’末端断片 カンショ塊根ｍＲＮＡより逆転写酵素を用いて相補鎖を
合成した後、ターミナルトランスフェラーゼを用いて
３’−末端にアデニン鎖を付加した。これを鋳型として
市販の NotI(dT) プライマー（ファルマシア社）と配列
番号９に記載するAsA-2 プライマー(5'-TGCTG AACCC TA
ATG CC-3': 17mer) を用いてＰＣＲ（ＰＣＲプログラ
ム：変性95℃, 1 分、アニーリング50℃, 2 分、合成反
応72℃, 2 分を30サイクル）を行い、さらに72℃, 7 分
保温した。増幅産物は単一なバンドにならなかったた
め、増幅産物を鋳型として市販の NotI adaptor(ファル
マシア社）と配列番号10に記載するAsA-4Eプライマー
(5'-CAACC GAATT CCATT CGGGG ACAGA CC-3': 27mer) を
用いて２回目のＰＣＲを第１回と同一の温度サイクル条
件で行った。増幅産物は単一なバンドとならなかった
が、ＴＡクローニングキットを用いてプラスミドpCR に
クローニングし、インサートの長いものについて塩基配
列を決定した。該断片の塩基配列から、(4) の部分配列
の約400 塩基上流に開始コドンが存在することがわか
り、該断片には開始コドンをはさんでその上流約100 塩
基の５’側非翻訳領域とその下流560 塩基の配列が含ま
れていた。

【００３３】(5-2) ３’末端断片 (4-1) で得たｃＤＮＡを鋳型として、配列番号11に記載
するAsS-1 プライマー(5'-ATGGA ACTGG TGCAA G-3': 16
mer)と先述のNotI adaptorを用いてＰＣＲを行った。増
幅産物は２本のバンドとなり、これを鋳型として配列番
号12に記載するAsS-5 プライマー(5'-AATCA ACCAA GCTG
A GGCCG-3'; 20mer)と NotI adaptor を用いて２回目の
ＰＣＲを行った。得られた２個の断片のうち、インサー
トが長い方をTAクローニングキット（インビトロジェン
社製) を用いてpCR2.1プラスミドにクローニングし約85
0 塩基の配列を決定した。配列決定した断片には配列番
号４に記載するペプチド断片２および配列番号６に記載
するペプチド断片４をコードする配列、終止コドン、約
250 塩基の３’側非翻訳領域が含まれていた。

【００３４】全長のｃＤＮＡ配列を明らかにするため、
配列番号13、14にそれぞれ記載するプライマーGLDp8(5'
-CTTTA ATCCC TCCAT AGCCA C-3'; 21mer) とプライマー
GLDp5(5'-TTGCA TAATC ATGTG AATCC-3'; 20mer) を用い
て再びカンショ塊根ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行っ
た。約２ｋｂの増幅断片が得られ、TAクローニングキッ
ト（インビトロジェン社製) を用いてpCR2.1プラスミド
にクローニングし、全塩基配列を決定した（配列番号
２）。

【００３５】〔実施例２〕 形質転換植物の作製 (1) 植物発現用プラスミドの作製 実施例１で得られたＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子の配列に、カリフラワーモザイクウイルス
35S プロモーター、ノパリン合成酵素ターミネータを連
結し、これを適当な制限酵素でβ−グルクロニダーゼ遺
伝子を除いたpBI121ベクター（クローンテック社製）に
挿入することにより植物発現用プラスミドp35S-SeGLDH
および p35S-AnGLDHを作製した。

【００３６】(2) トマトの形質転換 上記発現プラスミドp35S-SeGLDH または p35S-AnGLDHを
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４
株に凍結融解法により導入した。このアグロバクテリウ
ム菌を50mg/lカナマイシン、250mg/l ストレプトマイシ
ン、100mg/l リファンピシンを含むYEB 培地で一晩振盪
培養した後、OD _680nm =0.1 に希釈し、共存培養に供し
た。無菌播種したトマト（品種：秋玉）の子葉を5 mm幅
に裁断し、上記アグロバクテリウム懸濁液に5 分間浸漬
した。余分の懸濁液を除去した後、1mg/mlゼアチンを含
むＭＳ培地、ＺＭＳ上に滅菌した濾紙を敷き、その上に
余分な懸濁液を除去した子葉を並べ、28℃、48時間共存
培養した。

【００３７】その後、除菌のために250mg/l カルベニシ
リンを含むST-1培地上で１週間培養し、その後、50mg/m
l カナマイシンを含むST-1培地上で培養した。培養物は
２週間毎に新しい培地に継代した。再分化した不定芽は
カルスから切り離し、250mg/l カルベニシリンを含むＭ
Ｓ培地に移植し、発根を促した。発根した植物はバーミ
キュライトを満たしたポットに移植し、温室に移して栽
培した。

【００３８】(3) 遺伝子導入の確認 遺伝子導入の有無はＰＣＲにより検定した。抽出はEdwa
rds et al., Nucl.Acids.Res., 1349 (1991)に従って行
った。得られたＤＮＡを鋳型としてCaMV35S プロモータ
ー部分のセンスプライマーとNOS ターミネーター部分の
アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣ
Ｒ条件はアステックス社製PC-700を用いて変性94℃, 30
秒、アニーリング50℃, 2 分、合成反応72℃, 1.5 分を
35または45サイクル行った。得られた産物は1.5%アガロ
ースゲルで電気泳動してバンドを確認した。

【００３９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：581 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Phe Arg Ala His His Phe Arg Arg Ser Leu Arg Ser Leu Leu Ala 1 5 10 15 His Ser His Ser His Pro His Ser Asn Pro His Ile Asn Pro Arg Leu 20 25 30 Leu Cys Ser Leu Ser Ser Gln Pro Pro Ser Ser Asp Ala Glu Val Arg 35 40 45 Lys Tyr Ile Gly Tyr Thr Val Leu Val Leu Gly Cys Ala Ala Ala Thr 50 55 60 Tyr Tyr Ser Phe Pro Phe Pro Ala Asp Ala Lys His Lys Lys Ala Gln 65 70 75 80 Leu Phe Arg Tyr Ala Pro Leu Pro Asp Asp Leu His Thr Val Thr Asn 85 90 95 Trp Ser Gly Thr His Glu Val Gln Thr Arg Thr Phe Leu Gln Pro Glu 100 105 110 Ser Leu Gln Glu Leu Glu Ala Ala Val Lys Asp Ser Asn Glu Lys Lys 115 120 125 Gln Lys Ile Arg Pro Val Gly Ser Gly Leu Ser Pro Asn Gly Ile Gly 130 135 140 Leu Thr Arg Ala Gly Met Val Asn Leu Gly Leu Met Asp Lys Val Leu 145 150 155 160 Glu Val Asp Lys Glu Lys Lys Arg Val Thr Ala Gln Ala Gly Ile Arg 165 170 175 Val Gln Gln Leu Val Asp Ser Ile Lys Glu Tyr Gly Leu Thr Leu Gln 180 185 190 Asn Phe Ala Ser Ile Arg Glu Gln Gln Val Gly Gly Ile Val Gln Val 195 200 205 Gly Ala His Gly Thr Gly Ala Arg Leu Pro Pro Ile Asp Glu Gln Val 210 215 220 Ile Ser Met Lys Leu Val Thr Pro Ala Lys Gly Thr Ile Glu Ile Ser 225 230 235 240 Lys Glu Lys Asp Pro Asp Leu Phe Tyr Leu Ala Arg Cys Gly Leu Gly 245 250 255 Gly Leu Gly Val Val Ala Glu Val Thr Leu Gln Cys Val Glu Arg Gln 260 265 270 Glu Leu Val Glu His Thr Tyr Ile Ser Asn Met Lys Asp Ile Lys Lys 275 280 285 Asn His Lys Lys Leu Leu Ser Glu Asn Lys His Val Lys Tyr Leu His 290 295 300 Ile Pro Tyr Thr Asp Ala Val Val Val Val Thr Cys Asn Pro Ile Ser 305 310 315 320 Lys Trp Lys Gly Pro Pro Lys Tyr Lys Pro Lys Tyr Ser Pro Glu Glu 325 330 335 Ala Val Gly His Val Gln Asp Leu Tyr Arg Glu Ser Leu Lys Lys Tyr 340 345 350 Arg Ser Thr Glu Asn Glu Ser Glu Ile Asn Glu Leu Ser Phe Thr Glu 355 360 365 Leu Arg Asp Lys Leu Leu Ala Leu Asp Pro Leu Asn Thr Asp His Val 370 375 380 Lys Lys Ile Asn Gln Ala Glu Ala Glu Phe Trp Arg Lys Ser Glu Gly 385 390 395 400 Tyr Arg Val Gly Trp Ser Asp Glu Ile Leu Gly Phe Asp Cys Gly Gly 405 410 415 His Gln Trp Val Ser Glu Thr Cys Phe Pro Ala Gly Thr Leu Ser Lys 420 425 430 Pro Ser Met Lys Asp Leu Glu Phe Ile Glu Gln Leu Met Gln Leu Ile 435 440 445 Glu Lys Glu Ser Ile Pro Ala Pro Ala Pro Ile Glu Gln Arg Trp Thr 450 455 460 Ala Cys Ser Lys Ser Leu Met Ser Pro Ala Tyr Ser Ser Val Asp Asp 465 470 475 480 Asp Ile Phe Ser Trp Val Gly Ile Ile Met Tyr Leu Pro Thr Met Asp 485 490 495 Ala Arg Glu Arg Lys His Ile Thr Glu Glu Phe Phe His Tyr Arg His 500 505 510 Leu Thr Gln Ala His Leu Trp Asp His Tyr Ser Ala Tyr Glu His Trp 515 520 525 Ala Lys Ile Glu Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Leu Gln Ala Leu Gln 530 535 540 Ala Arg Leu Arg Lys Lys Phe Pro Val Asp Ala Tyr Asn Arg Ala Arg 545 550 555 560 Gln Glu Leu Asp Pro Asn Arg Ile Leu Ser Asn Asn Met Leu Glu Lys 565 570 575 Leu Phe Pro Ser Ser * * 580

【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：2023 配列の型：核酸 鎖の数ー：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置 ： 28 ...1770 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CTTTAATCCC TCCATAGCCA CCCAAAA 27 ATG TTC AGA GCT CAT CAC TTC CGG CGC TCC CTC CGC TCT CTC CTC GCC 75 Met Phe Arg Ala His His Phe Arg Arg Ser Leu Arg Ser Leu Leu Ala 1 5 10 15 CAC TCT CAT TCC CAC CCC CAT TCC AAC CCC CAC ATT AAC CCG CGC CTC 123 His Ser His Ser His Pro His Ser Asn Pro His Ile Asn Pro Arg Leu 20 25 30 CTC TGC TCC CTC TCC TCT CAG CCC CCG TCC TCC GAC GCC GAG GTC CGC 171 Leu Cys Ser Leu Ser Ser Gln Pro Pro Ser Ser Asp Ala Glu Val Arg 35 40 45 AAG TAC ATC GGC TAC ACC GTG CTC GTC CTC GGC TGC GCC GCC GCC ACC 219 Lys Tyr Ile Gly Tyr Thr Val Leu Val Leu Gly Cys Ala Ala Ala Thr 50 55 60 TAC TAC TCC TTC CCC TTC CCC GCC GAC GCC AAG CAC AAG AAG GCC CAG 267 Tyr Tyr Ser Phe Pro Phe Pro Ala Asp Ala Lys His Lys Lys Ala Gln 65 70 75 80 CTC TTC CGC TAT GCC CCC TTG CCC GAC GAT CTC CAC ACC GTC ACC AAT 315 Leu Phe Arg Tyr Ala Pro Leu Pro Asp Asp Leu His Thr Val Thr Asn 85 90 95 TGG AGC GGG ACC CAC GAG GTC CAG ACC CGG ACT TTC CTC CAG CCC GAG 363 Trp Ser Gly Thr His Glu Val Gln Thr Arg Thr Phe Leu Gln Pro Glu 100 105 110 TCC CTG CAA GAG CTG GAG GCC GCT GTC AAG GAT TCT AAT GAG AAG AAG 411 Ser Leu Gln Glu Leu Glu Ala Ala Val Lys Asp Ser Asn Glu Lys Lys 115 120 125 CAG AAG ATC CGA CCC GTG GGT TCG GGT CTG TCA CCG AAT GGC ATC GGG 459 Gln Lys Ile Arg Pro Val Gly Ser Gly Leu Ser Pro Asn Gly Ile Gly 130 135 140 TTG ACC CGG GCT GGG ATG GTG AAT TTG GGA TTG ATG GAT AAG GTC TTG 507 Leu Thr Arg Ala Gly Met Val Asn Leu Gly Leu Met Asp Lys Val Leu 145 150 155 160 GAA GTG GAC AAG GAG AAG AAG AGG GTC ACT GCG CAA GCC GGC ATT AGG 555 Glu Val Asp Lys Glu Lys Lys Arg Val Thr Ala Gln Ala Gly Ile Arg 165 170 175 GTT CAG CAG CTT GTG GAT TCG ATT AAG GAA TAT GGT CTC ACT CTC CAG 603 Val Gln Gln Leu Val Asp Ser Ile Lys Glu Tyr Gly Leu Thr Leu Gln 180 185 190 AAC TTT GCA TCT ATA AGG GAG CAA CAA GTT GGT GGC ATT GTT CAA GTT 651 Asn Phe Ala Ser Ile Arg Glu Gln Gln Val Gly Gly Ile Val Gln Val 195 200 205 GGT GCT CAT GGA ACT GGT GCA AGG CTG CCC CCA ATT GAC GAG CAA GTT 699 Gly Ala His Gly Thr Gly Ala Arg Leu Pro Pro Ile Asp Glu Gln Val 210 215 220 ATC AGC ATG AAA TTG GTC ACT CCT GCA AAA GGC ACA ATA GAG ATT TCG 747 Ile Ser Met Lys Leu Val Thr Pro Ala Lys Gly Thr Ile Glu Ile Ser 225 230 235 240 AAA GAG AAG GAT CCG GAT CTC TTT TAT CTA GCT CGA TGT GGA CTC GGG 795 Lys Glu Lys Asp Pro Asp Leu Phe Tyr Leu Ala Arg Cys Gly Leu Gly 245 250 255 GGC TTA GGA GTT GTT GCA GAG GTC ACA CTT CAA TGT GTG GAG CGG CAG 843 Gly Leu Gly Val Val Ala Glu Val Thr Leu Gln Cys Val Glu Arg Gln 260 265 270 GAG CTT GTT GAG CAC ACA TAT ATC TCT AAC ATG AAA GAC ATT AAG AAA 891 Glu Leu Val Glu His Thr Tyr Ile Ser Asn Met Lys Asp Ile Lys Lys 275 280 285 AAT CAC AAA AAA TTG CTA TCC GAG AAC AAG CAT GTG AAA TAT TTG CAC 939 Asn His Lys Lys Leu Leu Ser Glu Asn Lys His Val Lys Tyr Leu His 290 295 300 ATT CCA TAC ACT GAT GCG GTT GTG GTT GTA ACA TGC AAT CCT ATC TCA 987 Ile Pro Tyr Thr Asp Ala Val Val Val Val Thr Cys Asn Pro Ile Ser 305 310 315 320 AAA TGG AAG GGT CCA CCG AAA TAT AAA CCG AAA TAT TCT CCA GAA GAA 1035 Lys Trp Lys Gly Pro Pro Lys Tyr Lys Pro Lys Tyr Ser Pro Glu Glu 325 330 335 GCT GTA GGG CAT GTA CAA GAT CTC TAC CGA GAG TCA TTG AAG AAG TAC 1083 Ala Val Gly His Val Gln Asp Leu Tyr Arg Glu Ser Leu Lys Lys Tyr 340 345 350 AGA AGT ACA GAA AAT GAA TCC GAA ATA AAT GAG CTA TCA TTT ACT GAA 1131 Arg Ser Thr Glu Asn Glu Ser Glu Ile Asn Glu Leu Ser Phe Thr Glu 355 360 365 TTG AGG GAT AAA CTG CTT GCG TTG GAT CCA CTG AAC ACA GAC CAC GTC 1179 Leu Arg Asp Lys Leu Leu Ala Leu Asp Pro Leu Asn Thr Asp His Val 370 375 380 AAA AAA ATC AAC CAA GCT GAG GCC GAA TTT TGG AGA AAG TCA GAA GGG 1227 Lys Lys Ile Asn Gln Ala Glu Ala Glu Phe Trp Arg Lys Ser Glu Gly 385 390 395 400 TAC AGG GTA GGG TGG AGT GAT GAA ATT TTA GGG TTT GAT TGT GGT GGT 1275 Tyr Arg Val Gly Trp Ser Asp Glu Ile Leu Gly Phe Asp Cys Gly Gly 405 410 415 CAT CAA TGG GTC TCG GAA ACT TGT TTT CCT GCT GGT ACC CTT TCG AAA 1323 His Gln Trp Val Ser Glu Thr Cys Phe Pro Ala Gly Thr Leu Ser Lys 420 425 430 CCA AGC ATG AAA GAT CTG GAA TTC ATA GAG CAA CTA ATG CAG CTT ATA 1371 Pro Ser Met Lys Asp Leu Glu Phe Ile Glu Gln Leu Met Gln Leu Ile 435 440 445 GAG AAA GAA AGC ATA CCT GCT CCT GCA CCT ATT GAG CAG AGA TGG ACA 1419 Glu Lys Glu Ser Ile Pro Ala Pro Ala Pro Ile Glu Gln Arg Trp Thr 450 455 460 GCT TGC AGC AAG AGC CTG ATG AGT CCG GCT TAT AGT TCA GTT GAC GAT 1467 Ala Cys Ser Lys Ser Leu Met Ser Pro Ala Tyr Ser Ser Val Asp Asp 465 470 475 480 GAT ATT TTC TCA TGG GTT GGG ATA ATC ATG TAT CTT CCA ACA ATG GAT 1515 Asp Ile Phe Ser Trp Val Gly Ile Ile Met Tyr Leu Pro Thr Met Asp 485 490 495 GCT CGT GAA AGA AAA CAT ATA ACC GAG GAA TTT TTC CAC TAC AGG CAT 1563 Ala Arg Glu Arg Lys His Ile Thr Glu Glu Phe Phe His Tyr Arg His 500 505 510 TTG ACA CAA GCA CAT TTG TGG GAT CAT TAT TCT GCA TAT GAA CAT TGG 1611 Leu Thr Gln Ala His Leu Trp Asp His Tyr Ser Ala Tyr Glu His Trp 515 520 525 GCC AAG ATT GAG GTT CCA AAA GAC AAG GAA GAA CTA CAA GCA CTA CAG 1659 Ala Lys Ile Glu Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Leu Gln Ala Leu Gln 530 535 540 GCA AGA CTA AGG AAG AAA TTC CCT GTG GAT GCA TAC AAC CGA GCA CGC 1707 Ala Arg Leu Arg Lys Lys Phe Pro Val Asp Ala Tyr Asn Arg Ala Arg 545 550 555 560 CAA GAG CTG GAC CCC AAT CGC ATC CTT TCT AAT AAC ATG CTT GAA AAG 1755 Gln Glu Leu Asp Pro Asn Arg Ile Leu Ser Asn Asn Met Leu Glu Lys 565 570 575 CTG TTC CCT TCG TCG TGA TAG ACATCTATTG GTTGGTTTAT CTTTTGTGTT 1806 Leu Phe Pro Ser Ser * * 580 GTGTCCGGGT ATGCTGGTCT TTCCCTTGTT GATCTGTGAA TTTGAGGCAC AAAAGCGCAT 1866 ACTTGCCTAT AAACTTGTAT ATGATTTTGC TAGATTGTTA ACTGAAAAAT GCTACAGAAA 1926 CTCATATGAT TTGGCATTTA ATATGCTTGA AGGCTGCTTT TTCACAGGGC TAAGCCTCCA 1986 AGTTTATGAA TAAAAGTGGA TTCACATGAT TATGCAA ２０２
３

【００４１】配列番号：３ 配列の長さ：１４ 配列 Gly Tyr Arg Val Gly Xaa Ser Asp Glu Ile Leu Gly Phe Asp 5 10

【００４２】配列番号：４ 配列の長さ：15 配列 Thr Xaa Phe Pro Ala Gly Thr Leu Ser Lys Pro Ser (Ile/Met) Lys Asp 5 10 15

【００４３】配列番号：５ 配列の長さ：19 配列 Ala Ala Val Lys Asp Ser Asn Glu Lys Lys Gln (Val/Lys) Ile Arg Pro Val 5 10 15 Gly Ser Gly

【００４４】配列番号：６ 配列の長さ：16

【００４５】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列 AA(C/T)GA(A/G)AA(A/G)A A(A/G)CA(A/G)AAIAT

【００４６】配列番号：８ 配列の長さ：20 配列 TC(A/G)AAICC(C/T)A AIAT(C/T)TC(A/G)TC

【００４７】配列番号：９ 配列の長さ：17 配列 TGCTGAACCC TAATGCC

【００４８】配列番号：１０ 配列の長さ：27 配列 CAACCGAATT CCATTCGGGG ACAGACC

【００４９】配列番号：１１ 配列の長さ：16 配列 ATGGAACTGG TGCAAG

【００５０】配列番号：１２ 配列の長さ：20 配列 AATCAACCAA GCTGAGGCCG

【００５１】配列番号：１３ 配列の長さ：21 配列 CTTTAATCCC TCCATAGCCA C

【００５２】配列番号：１４ 配列の長さ：20 配列 TTGCATAATC ATGTGAATCC

【００５３】

【発明の効果】本発明によれば、植物由来のＬ−ガラク
トノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝子が提供される。本
発明の遺伝子を公知の方法に従いトマト、ジャガイモ等
の植物に導入することにより、植物体中における当該酵
素の活性を制御することが可能となって、ビタミンＣ含
量の高い新規な野菜・果実類の品種が作出される。さら
にビタミンＣは、ストレス障害の原因である活性酸素の
消去に関与していることが知られているので、よりスト
レスに強い植物の開発にも利用されうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大羽 和子 愛知県春日井市岩成台４丁目１−26 (56)参考文献 国際公開98／50558（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 A01H 5/00 C12N 9/00 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(A) 又は(B) のタンパク質をコー
   ドする遺伝子。 (A) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク
   質 (B) 配列番号１記載のアミノ酸において１若しくは数
   個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
   配列からなり、かつＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲ
   ナーゼ活性を有するタンパク質
2. 【請求項２】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   請求項１記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１〜２いずれかに記載の遺伝子を
   組み込んだ発現プラスミド。
4. 【請求項４】 請求項３記載の発現プラスミドを導入し
   た形質転換植物。