JP2003339381A - 病害抵抗性反応を制御する新規遺伝子とその利用 - Google Patents
病害抵抗性反応を制御する新規遺伝子とその利用Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 植物における病害抵抗性反応を制御し得る植
物遺伝子をコードするポリヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 植物における病害抵抗性反応を制御し得
る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、
該ポリヌクレオチドが１位のメチオニンから３６１位の
セリンまでのアミノ酸配列をコードする特定のヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチド、または該アミノ酸
配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換お
よび／もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列を有し、かつ植物における病害抵抗性反
応を制御し得る機能を有するポリヌクレオチドを含む、
ポリヌクレオチド。
物遺伝子をコードするポリヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 植物における病害抵抗性反応を制御し得
る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、
該ポリヌクレオチドが１位のメチオニンから３６１位の
セリンまでのアミノ酸配列をコードする特定のヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチド、または該アミノ酸
配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換お
よび／もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列を有し、かつ植物における病害抵抗性反
応を制御し得る機能を有するポリヌクレオチドを含む、
ポリヌクレオチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規遺伝子に関す
る。より詳細には、植物において病害抵抗性反応反応を
制御する機能を有するタンパク質をコードする新規遺伝
子に関する。
る。より詳細には、植物において病害抵抗性反応反応を
制御する機能を有するタンパク質をコードする新規遺伝
子に関する。
【０００２】
【従来の技術】イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７
が培養によって活性化され転移をする性質を利用して、
イネの多数の遺伝子破壊系統が作出されている。トラン
スポゾンは、動物、酵母、細菌および植物のゲノムに遍
在することが知られる変異誘発遺伝子である。トランス
ポゾンは、その転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）機
構により２つのクラスに分類されている。クラスＩＩに
属するトランスポゾンは、複製することなくＤＮＡの形
態で転移する。クラスＩＩに属するトランスポゾンとし
て、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）のＡｃ／Ｄｓ、
Ｓｐｍ／ｄＳｐｍおよびＭｕ要素（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ、
１９８９、Ｃｅｌｌ ５６、１８１−１９１；Ｆｅｄｏ
ｒｏｆｆら、１９８３、Ｃｅｌｌ ３５、２３５−２４
２；Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、４７
８３−４７８７）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎ
ｕｍｍａｊｕｓ）のＴａｍ要素（Ｂｏｎａｓら、１９８
４、ＥＭＢＯ Ｊ、３、１０１５−１０１９）が知られ
ている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、トラン
スポゾン・タッギングを利用する遺伝子単離に広く利用
されている。この技術は、トランスポゾンがゲノム上で
転移して、ある遺伝子中に挿入されると遺伝子の生理学
的および形態学的変異が起こり、遺伝子が制御する表現
型が変化することを利用する。この変化を検出すること
により影響を受けた遺伝子を単離する（Ｂａｎｃｒｏｆ
ｔら、１９９３、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、５、
６３１−６３８；Ｃｏｌａｓａｎｔｉら、１９９８、Ｃ
ｅｌｌ、９３、５９３−６０３；Ｇｒａｙら、１９９
７、Ｃｅｌｌ、８９、２５−３１；Ｋｅｄｄｉｅら、１
９９８、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１０、８７７
−８８７；Ｗｈｉｔｈａｍら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７
８、１１０１−１１１５）。
が培養によって活性化され転移をする性質を利用して、
イネの多数の遺伝子破壊系統が作出されている。トラン
スポゾンは、動物、酵母、細菌および植物のゲノムに遍
在することが知られる変異誘発遺伝子である。トランス
ポゾンは、その転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）機
構により２つのクラスに分類されている。クラスＩＩに
属するトランスポゾンは、複製することなくＤＮＡの形
態で転移する。クラスＩＩに属するトランスポゾンとし
て、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）のＡｃ／Ｄｓ、
Ｓｐｍ／ｄＳｐｍおよびＭｕ要素（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ、
１９８９、Ｃｅｌｌ ５６、１８１−１９１；Ｆｅｄｏ
ｒｏｆｆら、１９８３、Ｃｅｌｌ ３５、２３５−２４
２；Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、４７
８３−４７８７）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎ
ｕｍｍａｊｕｓ）のＴａｍ要素（Ｂｏｎａｓら、１９８
４、ＥＭＢＯ Ｊ、３、１０１５−１０１９）が知られ
ている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、トラン
スポゾン・タッギングを利用する遺伝子単離に広く利用
されている。この技術は、トランスポゾンがゲノム上で
転移して、ある遺伝子中に挿入されると遺伝子の生理学
的および形態学的変異が起こり、遺伝子が制御する表現
型が変化することを利用する。この変化を検出すること
により影響を受けた遺伝子を単離する（Ｂａｎｃｒｏｆ
ｔら、１９９３、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、５、
６３１−６３８；Ｃｏｌａｓａｎｔｉら、１９９８、Ｃ
ｅｌｌ、９３、５９３−６０３；Ｇｒａｙら、１９９
７、Ｃｅｌｌ、８９、２５−３１；Ｋｅｄｄｉｅら、１
９９８、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１０、８７７
−８８７；Ｗｈｉｔｈａｍら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７
８、１１０１−１１１５）。
【０００３】クラスＩに属するトランスポゾンは、レト
ロトランスポゾンとも呼ばれ、ＲＮＡ中間体を介して複
製し、転移する。クラスＩトランスポゾンは、最初、シ
ョウジョウバエおよび酵母で同定され、そして特徴付け
られたが、最近の研究により植物ゲノム中に遍在し、そ
のかなりの部分を占めていることが明らかにされている
（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏ．、４、３４７−３５３；Ｖｏｙｔａ
ｓ、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７３７−７３
８）。レトロトランスポゾンの大部分は、非移動性の組
み込みユニットであるようである。最近の研究は、これ
らのいくつかが、創傷、病原体の攻撃および細胞培養な
どのストレス条件下で活性化されることを示している
（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３、１８１−１
８７；Ｗｅｓｓｌｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏ
ｌ．６、９５９−９６１；Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９９
５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．
５、８１４−８２１。例えば、タバコではＴｎｔ１Ａお
よびＴｔｏ１（Ｐｏｕｔｅａｕら、１９９４、Ｐｌａｎ
ｔ Ｊ．、５、５３５−５４２；Ｔａｋｅｄａら、１９
８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３６、３６
５−３７６）、およびイネではＴｏｓ１７（Ｈｉｒｏｃ
ｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）につ
いて、ストレス条件下における活性化が報告されてい
る。
ロトランスポゾンとも呼ばれ、ＲＮＡ中間体を介して複
製し、転移する。クラスＩトランスポゾンは、最初、シ
ョウジョウバエおよび酵母で同定され、そして特徴付け
られたが、最近の研究により植物ゲノム中に遍在し、そ
のかなりの部分を占めていることが明らかにされている
（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏ．、４、３４７−３５３；Ｖｏｙｔａ
ｓ、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７３７−７３
８）。レトロトランスポゾンの大部分は、非移動性の組
み込みユニットであるようである。最近の研究は、これ
らのいくつかが、創傷、病原体の攻撃および細胞培養な
どのストレス条件下で活性化されることを示している
（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３、１８１−１
８７；Ｗｅｓｓｌｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏ
ｌ．６、９５９−９６１；Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９９
５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．
５、８１４−８２１。例えば、タバコではＴｎｔ１Ａお
よびＴｔｏ１（Ｐｏｕｔｅａｕら、１９９４、Ｐｌａｎ
ｔ Ｊ．、５、５３５−５４２；Ｔａｋｅｄａら、１９
８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３６、３６
５−３７６）、およびイネではＴｏｓ１７（Ｈｉｒｏｃ
ｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）につ
いて、ストレス条件下における活性化が報告されてい
る。
【０００４】イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７
は、最も良く研究されている植物中のクラスＩ要素であ
る。Ｔｏｓ１７は、Ｔｙ１−ｃｏｐｉａ群レトロ要素の
間の逆転写酵素ドメインの保存アミノ酸配列を基に作成
された縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によりク
ローン化された（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９２、Ｍ
ｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．、２３３、２０９−２
１６）。Ｔｏｓ１７は、４．３ｋｂの長さの、２つの同
じ１３８ｂｐのＬＴＲ（長鎖末端反復）および開始メチ
オニンｔＲＮＡの３’末端に相補的なＰＢＳ（プライマ
ー結合部位）を持つ（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９
６、上述）。Ｔｏｓ１７の転写は、組織培養により強く
活性化され、そして培養時間とともにＴｏｓ１７のコピ
ー数が増加する。ゲノム研究のモデルジャポニカ品種で
ある日本晴では、Ｔｏｓ１７の当初のコピー数は２であ
るが、組織培養後、再生した植物では、５〜３０コピー
に増加している（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上
述）。酵母およびショウジョウバエで特徴付けられたク
ラスＩトランスポゾンとは異なり、Ｔｏｓ１７は、染色
体中をランダムな様式で転移し、そして安定な変異を引
き起こし、そしてそれ故、イネにおける遺伝子の機能解
析の強力なツールを提供する（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、１
９９７、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５，２３１
−２４０；１９９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ｏｆ Ｒｉｃｅ（Ｋ．Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ編集、
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、４３−５８）。
は、最も良く研究されている植物中のクラスＩ要素であ
る。Ｔｏｓ１７は、Ｔｙ１−ｃｏｐｉａ群レトロ要素の
間の逆転写酵素ドメインの保存アミノ酸配列を基に作成
された縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によりク
ローン化された（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９２、Ｍ
ｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．、２３３、２０９−２
１６）。Ｔｏｓ１７は、４．３ｋｂの長さの、２つの同
じ１３８ｂｐのＬＴＲ（長鎖末端反復）および開始メチ
オニンｔＲＮＡの３’末端に相補的なＰＢＳ（プライマ
ー結合部位）を持つ（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９
６、上述）。Ｔｏｓ１７の転写は、組織培養により強く
活性化され、そして培養時間とともにＴｏｓ１７のコピ
ー数が増加する。ゲノム研究のモデルジャポニカ品種で
ある日本晴では、Ｔｏｓ１７の当初のコピー数は２であ
るが、組織培養後、再生した植物では、５〜３０コピー
に増加している（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上
述）。酵母およびショウジョウバエで特徴付けられたク
ラスＩトランスポゾンとは異なり、Ｔｏｓ１７は、染色
体中をランダムな様式で転移し、そして安定な変異を引
き起こし、そしてそれ故、イネにおける遺伝子の機能解
析の強力なツールを提供する（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、１
９９７、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５，２３１
−２４０；１９９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ｏｆ Ｒｉｃｅ（Ｋ．Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ編集、
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、４３−５８）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、Ｔ
ｏｓ１７を用いて提供される植物新規遺伝子、より詳細
には、植物における病害抵抗性反応を制御し得る植物遺
伝子、これを含むベクター、当該遺伝子で形質転換され
た植物、および当該遺伝子を植物に形質転換する工程を
包含する、植物の改良方法を提供することを目的とす
る。
ｏｓ１７を用いて提供される植物新規遺伝子、より詳細
には、植物における病害抵抗性反応を制御し得る植物遺
伝子、これを含むベクター、当該遺伝子で形質転換され
た植物、および当該遺伝子を植物に形質転換する工程を
包含する、植物の改良方法を提供することを目的とす
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、イネのレ
トロトランスポゾンＴｏｓ１７が培養によって活性化さ
れ転移をする性質を利用して作製された多数のイネ遺伝
子破壊系統の中から、擬似病斑変異体を発見した。この
変異体では、病原体に感染したかのように葉に茶色の壊
死斑が現れ、やがて葉全体に広がって枯れていく。この
形質の変化と病害抵抗性との関連を鋭意検討した結果、
この形質の変化の原因となる遺伝子が、病害抵抗性反応
に関与することを見出し、本発明を完成するに至った。
トロトランスポゾンＴｏｓ１７が培養によって活性化さ
れ転移をする性質を利用して作製された多数のイネ遺伝
子破壊系統の中から、擬似病斑変異体を発見した。この
変異体では、病原体に感染したかのように葉に茶色の壊
死斑が現れ、やがて葉全体に広がって枯れていく。この
形質の変化と病害抵抗性との関連を鋭意検討した結果、
この形質の変化の原因となる遺伝子が、病害抵抗性反応
に関与することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】１つの局面では、本発明は、植物における
病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポ
リヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列
表の配列番号２の１位のメチオニンから３６１位のセリ
ンまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列におい
て１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／もし
くは付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列を有し、かつ病害抵抗性反応を制御する機能を有す
るポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供す
る。
病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポ
リヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列
表の配列番号２の１位のメチオニンから３６１位のセリ
ンまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列におい
て１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／もし
くは付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列を有し、かつ病害抵抗性反応を制御する機能を有す
るポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供す
る。
【０００８】１つの局面では、本発明は、植物における
病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポ
リヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列
表の配列番号１の１４６位のＡから１２３１位のＡまで
に示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列
にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌ
クレオチドを提供する。
病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポ
リヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列
表の配列番号１の１４６位のＡから１２３１位のＡまで
に示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列
にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌ
クレオチドを提供する。
【０００９】１つの実施形態では、上記病害抵抗性反応
は、防御関連遺伝子の発現を誘導することにより制御さ
れる。
は、防御関連遺伝子の発現を誘導することにより制御さ
れる。
【００１０】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドは、イネ由来である。
ドは、イネ由来である。
【００１１】１つの局面では、本発明は、制御配列に作
動可能に連結された上記のポリヌクレオチドを含む、ベ
クターを提供する。
動可能に連結された上記のポリヌクレオチドを含む、ベ
クターを提供する。
【００１２】なお別の局面では、本発明は、植物におい
て病害抵抗性反応を制御する方法であって、上記のポリ
ヌクレオチドを植物に導入する工程を包含する、方法を
提供する。
て病害抵抗性反応を制御する方法であって、上記のポリ
ヌクレオチドを植物に導入する工程を包含する、方法を
提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明は、Ｔｏｓ１７を用いて単
離され、機能が解明された植物新規遺伝子を提供する。
離され、機能が解明された植物新規遺伝子を提供する。
【００１４】本明細書中で使用する用語「遺伝子」は、
遺伝情報を担う構造単位で、形質を規定する因子をい
う。遺伝子は、高分子ＤＮＡまたはＲＮＡでの一定の領
域の塩基配列により規定される遺伝の作用単位として定
義され得る。従って、遺伝子は、最終的にタンパク質に
翻訳され得る、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、物質とし
ては、ポリヌクレオチドとして理解され得る。
遺伝情報を担う構造単位で、形質を規定する因子をい
う。遺伝子は、高分子ＤＮＡまたはＲＮＡでの一定の領
域の塩基配列により規定される遺伝の作用単位として定
義され得る。従って、遺伝子は、最終的にタンパク質に
翻訳され得る、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、物質とし
ては、ポリヌクレオチドとして理解され得る。
【００１５】本発明によれば、植物において病害抵抗性
反応を制御する植物遺伝子をコードするポリヌクレオチ
ドが提供される。本願明細書で使用する用語「病害抵抗
性」とは、植物に病気を引き起こす病原体の攻撃に対し
て防御可能であることを意味する。病原体には、ウイロ
イド、ウイルス、マイコプラズマ様微生物（ファイトプ
ラズマ）、細菌、菌類、原生動物、線虫、および寄生性
植物が含まれる。本願明細書で用いる用語「病害抵抗性
反応を制御し得る」は、植物において上記の病害抵抗性
を惹起または促進し得ることをいう。
反応を制御する植物遺伝子をコードするポリヌクレオチ
ドが提供される。本願明細書で使用する用語「病害抵抗
性」とは、植物に病気を引き起こす病原体の攻撃に対し
て防御可能であることを意味する。病原体には、ウイロ
イド、ウイルス、マイコプラズマ様微生物（ファイトプ
ラズマ）、細菌、菌類、原生動物、線虫、および寄生性
植物が含まれる。本願明細書で用いる用語「病害抵抗性
反応を制御し得る」は、植物において上記の病害抵抗性
を惹起または促進し得ることをいう。
【００１６】植物における病害抵抗性の機構は、研究さ
れている。植物細胞および組織が外敵の攻撃に対して積
極的に発動する一連の防御反応としては、以下が知られ
る：ｉ）活性酸素の生成とそれに伴う過敏感反応の開
始；およびｉｉ）防御関連遺伝子の発現。この防御関連
遺伝子の発現により、フェニールアラニンアンモニアリ
アーゼ（ＰＡＬ）、カフェイン酸デヒドロゲナーゼなど
のフェニールプロパノイド合成系酵素、あるいはカルコ
ン合成酵素（ＣＨＳ)などのイソフラボノイド・ファイ
トアレキシン合成に関与する遺伝子群の発現誘導と遺伝
子産物の蓄積、また、ＨＭＧ−ＣｏＡ−還元酵素などの
テルペン系ファイトアレキシン合成に関与する遺伝子群
の発現誘導と遺伝子産物の蓄積；および侵入菌の細胞壁
を分解し、侵入菌あるいは自己細胞壁からもエリシター
分子を遊離させるPRタンパク質の合成が生じ得る。本発
明のポリヌクレオチドは、上記のｉ）とｉｉ）の反応に
関与し得る。防御関連遺伝子としては、病原関連タンパ
ク質１ｂ（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ １ｂ；ＰＲ１ｂ）およびフェニルア
ラニンアンモニアリアーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎ
ｅ ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ；ＰＡＬ）をコードす
る遺伝子が挙げられる。ファイトアレキシンとは、外敵
（寄生菌を含む）が植物体内に侵入したとき宿主である
植物細胞により合成あるいは活性化される抗菌性物質で
あり、このようなファイトアレキシンには、モミラクト
ンＡおよびサクラネチンが含まれる。
れている。植物細胞および組織が外敵の攻撃に対して積
極的に発動する一連の防御反応としては、以下が知られ
る：ｉ）活性酸素の生成とそれに伴う過敏感反応の開
始；およびｉｉ）防御関連遺伝子の発現。この防御関連
遺伝子の発現により、フェニールアラニンアンモニアリ
アーゼ（ＰＡＬ）、カフェイン酸デヒドロゲナーゼなど
のフェニールプロパノイド合成系酵素、あるいはカルコ
ン合成酵素（ＣＨＳ)などのイソフラボノイド・ファイ
トアレキシン合成に関与する遺伝子群の発現誘導と遺伝
子産物の蓄積、また、ＨＭＧ−ＣｏＡ−還元酵素などの
テルペン系ファイトアレキシン合成に関与する遺伝子群
の発現誘導と遺伝子産物の蓄積；および侵入菌の細胞壁
を分解し、侵入菌あるいは自己細胞壁からもエリシター
分子を遊離させるPRタンパク質の合成が生じ得る。本発
明のポリヌクレオチドは、上記のｉ）とｉｉ）の反応に
関与し得る。防御関連遺伝子としては、病原関連タンパ
ク質１ｂ（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ １ｂ；ＰＲ１ｂ）およびフェニルア
ラニンアンモニアリアーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎ
ｅ ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ；ＰＡＬ）をコードす
る遺伝子が挙げられる。ファイトアレキシンとは、外敵
（寄生菌を含む）が植物体内に侵入したとき宿主である
植物細胞により合成あるいは活性化される抗菌性物質で
あり、このようなファイトアレキシンには、モミラクト
ンＡおよびサクラネチンが含まれる。
【００１７】上述したような本発明のポリヌクレオチド
は、代表的には、配列表の配列番号２の１位のメチオニ
ン（Ｍｅｔ）から３６１位のセリン（Ｓｅｒ）までのア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはこの
アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠
失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを
含む、ポリヌクレオチドである。１つの実施形態では、
本発明のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１の１
４６位〜１２３１位に示されたヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、上述した領域（配列番号
２の１位のメチオニン（Ｍｅｔ）から３６１位のセリン
（Ｓｅｒ）までのアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列領域または配列番号１の１４６位〜１２３１位に
示されたヌクレオチド配列領域）の外側、すなわち、
５’末端側または３’末端側に、さらなるヌクレオチド
配列（例えば、非翻訳領域）を含み得る。より好ましく
は、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の１位〜
１３９５位に示された全長配列からなる。ここで、本願
発明のポリヌクレオチドは、配列番号１における縮重異
性体をすべて含むものである。ここで、「縮重異性体」
とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて、同一のポ
リペプチドをコードすることのできるＤＮＡを意味す
る。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡに対
して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えば
Ａｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係
にあるコドン例えばＡＡＴに変わったものを、縮重異性
体と呼ぶこととする。
は、代表的には、配列表の配列番号２の１位のメチオニ
ン（Ｍｅｔ）から３６１位のセリン（Ｓｅｒ）までのア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはこの
アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠
失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを
含む、ポリヌクレオチドである。１つの実施形態では、
本発明のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１の１
４６位〜１２３１位に示されたヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、上述した領域（配列番号
２の１位のメチオニン（Ｍｅｔ）から３６１位のセリン
（Ｓｅｒ）までのアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列領域または配列番号１の１４６位〜１２３１位に
示されたヌクレオチド配列領域）の外側、すなわち、
５’末端側または３’末端側に、さらなるヌクレオチド
配列（例えば、非翻訳領域）を含み得る。より好ましく
は、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の１位〜
１３９５位に示された全長配列からなる。ここで、本願
発明のポリヌクレオチドは、配列番号１における縮重異
性体をすべて含むものである。ここで、「縮重異性体」
とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて、同一のポ
リペプチドをコードすることのできるＤＮＡを意味す
る。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡに対
して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えば
Ａｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係
にあるコドン例えばＡＡＴに変わったものを、縮重異性
体と呼ぶこととする。
【００１８】本発明のポリヌクレオチドは、イネのレト
ロトランスポゾンＴｏｓ１７が培養によって活性化され
転移をする性質を利用して作出されたイネの遺伝子破壊
系統の擬似病斑変異体の発見から出発して、このＴｏｓ
１７を目印としてイネゲノムＤＮＡから単離されたもの
である。従って、１つの実施形態では、本発明のポリヌ
クレオチドは、イネに由来する。
ロトランスポゾンＴｏｓ１７が培養によって活性化され
転移をする性質を利用して作出されたイネの遺伝子破壊
系統の擬似病斑変異体の発見から出発して、このＴｏｓ
１７を目印としてイネゲノムＤＮＡから単離されたもの
である。従って、１つの実施形態では、本発明のポリヌ
クレオチドは、イネに由来する。
【００１９】開示されたヌクレオチド配列およびそれに
よりコードされたタンパク質のフラグメントおよび改変
体もまた、本発明により包含される。「フラグメント」
によって、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列
の一部、従って、それによってコードされるタンパク質
もまた意図される。ヌクレオチド配列のフラグメント
は、ネイティブタンパク質の機能的な生物学的活性の１
つ以上を保持するタンパク質フラグメントをコードし得
る。
よりコードされたタンパク質のフラグメントおよび改変
体もまた、本発明により包含される。「フラグメント」
によって、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列
の一部、従って、それによってコードされるタンパク質
もまた意図される。ヌクレオチド配列のフラグメント
は、ネイティブタンパク質の機能的な生物学的活性の１
つ以上を保持するタンパク質フラグメントをコードし得
る。
【００２０】本発明のポリヌクレオチドによりコードさ
れるタンパク質の改変体とは、このタンパク質のＮ末端
および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠
失（いわゆる短縮化）または付加；このタンパク質中の
１つ以上の部位のアミノ酸の欠失または付加；あるいは
このタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の置換に
よりネイティブタンパク質から誘導されたタンパク質を
意図する。このような改変体は、例えば、遺伝的多型ま
たは人為操作から生じ得る。
れるタンパク質の改変体とは、このタンパク質のＮ末端
および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠
失（いわゆる短縮化）または付加；このタンパク質中の
１つ以上の部位のアミノ酸の欠失または付加；あるいは
このタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の置換に
よりネイティブタンパク質から誘導されたタンパク質を
意図する。このような改変体は、例えば、遺伝的多型ま
たは人為操作から生じ得る。
【００２１】本発明のポリヌクレオチドによりコードさ
れるタンパク質は、種々の方法（アミノ酸置換、欠失、
短縮化、および挿入を包含する）で変化され得る。この
ような操作のための方法は、一般に、当該分野で公知で
ある。例えば、本発明の病害抵抗性反応を制御し得る植
物遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列
改変体は、ＤＮＡにおける変異生成によって調製され得
る。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法
は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１
９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８
７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：
３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗ
ａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ （ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびその中で
引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパク
質の生物学的活性に影響しない適当なアミノ酸置換に関
する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９８７）Ａｔｌａｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅ
ｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、こ
れは、参考として本明細書中に援用される）のモデルに
見出され得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を
同様の特性を有する別のものと交換する置換）が好まし
いとされ得る。このような置換としては、疎水性アミノ
酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒ
ｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）；親水性アミノ酸（Ａｒ
ｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌ
ｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）；脂肪族側鎖を
有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉ
ｌｅ、Ｐｒｏ）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ
ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）；硫黄原子含有側鎖を有するア
ミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）；カルボン酸およびアミド含
有側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇ
ｌｎ）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｉｓ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈｉ
ｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）同士の置換が挙げられ
る。
れるタンパク質は、種々の方法（アミノ酸置換、欠失、
短縮化、および挿入を包含する）で変化され得る。この
ような操作のための方法は、一般に、当該分野で公知で
ある。例えば、本発明の病害抵抗性反応を制御し得る植
物遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列
改変体は、ＤＮＡにおける変異生成によって調製され得
る。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法
は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１
９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８
７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：
３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗ
ａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ （ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびその中で
引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパク
質の生物学的活性に影響しない適当なアミノ酸置換に関
する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９８７）Ａｔｌａｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅ
ｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、こ
れは、参考として本明細書中に援用される）のモデルに
見出され得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を
同様の特性を有する別のものと交換する置換）が好まし
いとされ得る。このような置換としては、疎水性アミノ
酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒ
ｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）；親水性アミノ酸（Ａｒ
ｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌ
ｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）；脂肪族側鎖を
有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉ
ｌｅ、Ｐｒｏ）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ
ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）；硫黄原子含有側鎖を有するア
ミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）；カルボン酸およびアミド含
有側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇ
ｌｎ）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｉｓ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈｉ
ｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）同士の置換が挙げられ
る。
【００２２】従って、「１もしくは数個が欠失、置換お
よび／もしくは付加された」とは、遺伝的多型または人
為操作（上述したような周知の方法を含む）によって置
換、欠失および／もしくは付加され得る程度の数のアミ
ノ酸が置換、欠失および／もしくは付加され得ることを
意味する。「１もしくは数個が欠失、置換および／もし
くは付加された」とは、本発明のポリヌクレオチドによ
りコードされるタンパク質が有する機能を発現し得る限
り、上記アミノ酸配列においていかなる数のアミノ酸が
欠失、付加、および／もしくは置換されていてもよい。
アミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加のような改
変が活性に与える影響は、改変されるアミノ酸の位置、
程度、種類などに依存し得ることは当業者には明らかで
ある。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌク
レオチドによりコードされるタンパク質が有する機能を
発現し得る限り、例えば、上記アミノ酸配列の全長にお
いて、以下のアミノ酸配列同一性を満たす個数で欠失、
置換および／もしくは付加され得る。
よび／もしくは付加された」とは、遺伝的多型または人
為操作（上述したような周知の方法を含む）によって置
換、欠失および／もしくは付加され得る程度の数のアミ
ノ酸が置換、欠失および／もしくは付加され得ることを
意味する。「１もしくは数個が欠失、置換および／もし
くは付加された」とは、本発明のポリヌクレオチドによ
りコードされるタンパク質が有する機能を発現し得る限
り、上記アミノ酸配列においていかなる数のアミノ酸が
欠失、付加、および／もしくは置換されていてもよい。
アミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加のような改
変が活性に与える影響は、改変されるアミノ酸の位置、
程度、種類などに依存し得ることは当業者には明らかで
ある。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌク
レオチドによりコードされるタンパク質が有する機能を
発現し得る限り、例えば、上記アミノ酸配列の全長にお
いて、以下のアミノ酸配列同一性を満たす個数で欠失、
置換および／もしくは付加され得る。
【００２３】本発明の病害抵抗性反応を制御し得る植物
遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌク
レオチドと同様に植物において病害抵抗性反応を制御し
得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから３６
１位のＳｅｒまでのアミノ酸配列と、少なくとも６０％
の配列同一性、好ましくは少なくとも６５％、より好ま
しくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なく
とも７５％、なおより好ましくは少なくとも８０％、な
おより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましく
は少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％
の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌク
レオチドと同様に植物において病害抵抗性反応を制御し
得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから３６
１位のＳｅｒまでのアミノ酸配列と、少なくとも６０％
の配列同一性、好ましくは少なくとも６５％、より好ま
しくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なく
とも７５％、なおより好ましくは少なくとも８０％、な
おより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましく
は少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％
の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００２４】本発明の病害抵抗性反応を制御し得る植物
遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌク
レオチドと同様に植物において病害抵抗性反応を制御し
得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから３６
１位のＳｅｒまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列（好ましくは、配列番号１の１４６位のＡから
１２３１位のＡまでに示されるヌクレオチド配列）と、
少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より
好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、なおより好
ましくは少なくとも８５％の配列同一性、さらにより好
ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらになおよ
り好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ま
しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌク
レオチドと同様に植物において病害抵抗性反応を制御し
得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから３６
１位のＳｅｒまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列（好ましくは、配列番号１の１４６位のＡから
１２３１位のＡまでに示されるヌクレオチド配列）と、
少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より
好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、なおより好
ましくは少なくとも８５％の配列同一性、さらにより好
ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらになおよ
り好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ま
しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００２５】本明細書中で使用される場合、「参照配
列」とは、配列比較の基準として使用される規定の配列
である。参照配列は、記載された配列のサブセットまた
は全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝
子配列のセグメント、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子
配列としてである。
列」とは、配列比較の基準として使用される規定の配列
である。参照配列は、記載された配列のサブセットまた
は全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝
子配列のセグメント、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子
配列としてである。
【００２６】本明細書中で使用される場合、「比較ウィ
ンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続しかつ特定化
されたセグメントについて言及し、ここで比較ウィンド
ウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適
なアラインメントのために、参照配列（これは、付加ま
たは欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（す
なわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィン
ドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であ
り、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以
上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列
中にギャップを含むことにより、参照配列に対して高い
類似性となることを避けるために、典型的には、ギャッ
プペナルティーを導入し、そしてこれを、一致の数から
差し引くことを理解する。
ンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続しかつ特定化
されたセグメントについて言及し、ここで比較ウィンド
ウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適
なアラインメントのために、参照配列（これは、付加ま
たは欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（す
なわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィン
ドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であ
り、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以
上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列
中にギャップを含むことにより、参照配列に対して高い
類似性となることを避けるために、典型的には、ギャッ
プペナルティーを導入し、そしてこれを、一致の数から
差し引くことを理解する。
【００２７】比較のための配列のアラインメントの方法
は、当該分野において周知である。参照配列（本発明の
配列）と対象配列との間の最適な全体の整合を決定する
ための好ましい方法として、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕ
ｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解
析が用いられる。配列整列において、参照配列および対
象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、
ＵをＴに変換することによって比較され得る。上記の全
体的配列整列の結果が、同一性％である。配列アライン
メントは、上記のプログラムのデフォルトのパラメータ
ーを使用して行われ得る。
は、当該分野において周知である。参照配列（本発明の
配列）と対象配列との間の最適な全体の整合を決定する
ための好ましい方法として、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕ
ｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解
析が用いられる。配列整列において、参照配列および対
象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、
ＵをＴに変換することによって比較され得る。上記の全
体的配列整列の結果が、同一性％である。配列アライン
メントは、上記のプログラムのデフォルトのパラメータ
ーを使用して行われ得る。
【００２８】本明細書中で使用される場合、２つの核酸
配列またはポリペプチド配列の文脈において「配列同一
性」または「同一性」は、特定化された比較ウインドウ
にわたって最大に一致するように整列された場合に同一
である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパ
ク質に関して配列同一性％が使用される場合、しばし
ば、保存的アミノ酸置換によって、同一ではない残基位
置は異なることが理解される。上述したように、保存的
アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性
（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残
基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させな
い。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性
パーセントは、置換の保存的性質について矯正するよう
に上方に調整され得る。このような保存的置換によって
異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有す
るといわれる。この調整をするための手段は、当業者に
は周知である。代表的には、これは、完全なミスマッチ
ではなく、部分的なものとして保存性置換を点数付けす
ることを含み、それによって配列同一性パーセントを増
加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコ
アを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与え
られる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与
えられる。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラ
ムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）
において実行されるように計算される。
配列またはポリペプチド配列の文脈において「配列同一
性」または「同一性」は、特定化された比較ウインドウ
にわたって最大に一致するように整列された場合に同一
である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパ
ク質に関して配列同一性％が使用される場合、しばし
ば、保存的アミノ酸置換によって、同一ではない残基位
置は異なることが理解される。上述したように、保存的
アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性
（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残
基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させな
い。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性
パーセントは、置換の保存的性質について矯正するよう
に上方に調整され得る。このような保存的置換によって
異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有す
るといわれる。この調整をするための手段は、当業者に
は周知である。代表的には、これは、完全なミスマッチ
ではなく、部分的なものとして保存性置換を点数付けす
ることを含み、それによって配列同一性パーセントを増
加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコ
アを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与え
られる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与
えられる。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラ
ムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）
において実行されるように計算される。
【００２９】本明細書中で使用される場合、「配列同一
性％」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインさ
れた２つの配列を比較することによって決定された値を
意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチ
ド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントの
ために、参照配列（これは、付加または欠失を含まな
い）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャッ
プ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基ま
たはアミノ酸残基が両方の配列に存在して一致した位置
の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置
の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、
およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセン
テージを得ることによって計算される。
性％」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインさ
れた２つの配列を比較することによって決定された値を
意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチ
ド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントの
ために、参照配列（これは、付加または欠失を含まな
い）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャッ
プ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基ま
たはアミノ酸残基が両方の配列に存在して一致した位置
の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置
の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、
およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセン
テージを得ることによって計算される。
【００３０】用語、ポリヌクレオチドの「実質的な同一
性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを
使用して、記載されるアラインメントプログラムの１つ
を用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ま
しくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９
０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同
一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コ
ドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレーム
の位置などを考慮に入れることによって、２つのヌクレ
オチド配列によってコードされるタンパク質の対応する
同一性を決定するために、これらの値が適切に調整され
得ることを理解する。これらのために、アミノ酸配列の
実質的な同一性は、通常、少なくとも６０％、より好ま
しくは少なくとも７０％、８０％、９０％、および最も
好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを
使用して、記載されるアラインメントプログラムの１つ
を用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ま
しくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９
０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同
一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コ
ドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレーム
の位置などを考慮に入れることによって、２つのヌクレ
オチド配列によってコードされるタンパク質の対応する
同一性を決定するために、これらの値が適切に調整され
得ることを理解する。これらのために、アミノ酸配列の
実質的な同一性は、通常、少なくとも６０％、より好ま
しくは少なくとも７０％、８０％、９０％、および最も
好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００３１】ペプチドの文脈における用語「実質的同一
性」は、ペプチドが、特定化された比較ウィンドウにわ
たって、参照配列に対して、少なくとも７０％の配列同
一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も
好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性
を有する配列を含むことである。好ましくは、最適なア
ラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライン
メントアルゴリズムを使用して行われる。例えば、２つ
のペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、ペ
プチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実
質的に類似の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が
保存的アミノ酸変化によって異なり得るということ以外
は、上記に示したような配列を共有する。
性」は、ペプチドが、特定化された比較ウィンドウにわ
たって、参照配列に対して、少なくとも７０％の配列同
一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も
好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性
を有する配列を含むことである。好ましくは、最適なア
ラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライン
メントアルゴリズムを使用して行われる。例えば、２つ
のペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、ペ
プチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実
質的に類似の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が
保存的アミノ酸変化によって異なり得るということ以外
は、上記に示したような配列を共有する。
【００３２】本発明の病害抵抗性反応を制御し得るタン
パク質の生物学的に活性な部分をコードする、植物にお
いて病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子ヌクレオチ
ド配列のフラグメントは、少なくとも１５、２５、３
０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、
２２５の連続するアミノ酸、または本発明の全長タンパ
ク質に存在するアミノ酸の総数まで（例えば、配列番号
２の３６１アミノ酸）をコードする。ＰＣＲプライマー
についてハイブリダイゼーションプローブとして用いる
ための、病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子ヌクレ
オチド配列のフラグメントは、一般に、植物において病
害抵抗性反応を制御し得るタンパク質の生物学的に活性
な部分をコードする必要はない。
パク質の生物学的に活性な部分をコードする、植物にお
いて病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子ヌクレオチ
ド配列のフラグメントは、少なくとも１５、２５、３
０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、
２２５の連続するアミノ酸、または本発明の全長タンパ
ク質に存在するアミノ酸の総数まで（例えば、配列番号
２の３６１アミノ酸）をコードする。ＰＣＲプライマー
についてハイブリダイゼーションプローブとして用いる
ための、病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子ヌクレ
オチド配列のフラグメントは、一般に、植物において病
害抵抗性反応を制御し得るタンパク質の生物学的に活性
な部分をコードする必要はない。
【００３３】イネ以外の他の植物に由来する病害抵抗性
反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオ
チドもまた、本願発明の範囲内に含まれ得る。そのよう
なポリヌクレオチドは、例えば、開示された全長または
一部のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマー
を用いて、選択した植物のゲノミックＤＮＡを鋳型とし
てＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプ
ローブとして用いて同じ植物のゲノミックＤＮＡまたは
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより
単離され得る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイ
ゼーションなどのような方法が、本明細書中に記載の配
列に対するそれらの配列同一性に基づいてこのような配
列を同定するために使用され得る。本明細書中に記載の
配列全体に対する、またはそれらのフラグメントに対す
る、それらの配列同一性に基づいて単離された配列は、
本発明によって包含される。
反応を制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオ
チドもまた、本願発明の範囲内に含まれ得る。そのよう
なポリヌクレオチドは、例えば、開示された全長または
一部のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマー
を用いて、選択した植物のゲノミックＤＮＡを鋳型とし
てＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプ
ローブとして用いて同じ植物のゲノミックＤＮＡまたは
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより
単離され得る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイ
ゼーションなどのような方法が、本明細書中に記載の配
列に対するそれらの配列同一性に基づいてこのような配
列を同定するために使用され得る。本明細書中に記載の
配列全体に対する、またはそれらのフラグメントに対す
る、それらの配列同一性に基づいて単離された配列は、
本発明によって包含される。
【００３４】ハイブリダイゼーション技術において、公
知のヌクレオチド配列の全てまたは部分が、選択された
生物由来のクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメント
またはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノム
ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在す
る他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダ
イズするプローブとして使用される。このハイブリダイ
ゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃ
ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他の
オリゴヌクレオチドであり得、そして検出可能な基（例
えば、32Ｐ）または任意の他の検出可能なマーカーで標
識化され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーショ
ンのためのプローブは、本発明の植物において病害抵抗
性反応を制御し得る植物遺伝子のヌクレオチド配列に基
づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって
作製され得る。ハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡ
ライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築のための
プローブの調製のための方法は、一般に、当該分野で公
知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、
Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（これは、本
明細書中に参考として援用される））において開示され
る。
知のヌクレオチド配列の全てまたは部分が、選択された
生物由来のクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメント
またはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノム
ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在す
る他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダ
イズするプローブとして使用される。このハイブリダイ
ゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃ
ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他の
オリゴヌクレオチドであり得、そして検出可能な基（例
えば、32Ｐ）または任意の他の検出可能なマーカーで標
識化され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーショ
ンのためのプローブは、本発明の植物において病害抵抗
性反応を制御し得る植物遺伝子のヌクレオチド配列に基
づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって
作製され得る。ハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡ
ライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築のための
プローブの調製のための方法は、一般に、当該分野で公
知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、
Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（これは、本
明細書中に参考として援用される））において開示され
る。
【００３５】例えば、本明細書中に開示された病害抵抗
性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列全体、またはそれらの１つ以上の部分が、対応す
る病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子配列およびメ
ッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプ
ローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的なハ
イブリダイゼーションを達成するために、このようなプ
ローブは、病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子配列
間で独特であり、そして好ましくは少なくとも約１０ヌ
クレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレ
オチド長である配列を包含する。このようなプローブ
は、選択された生物から対応する病害抵抗性反応を制御
し得る植物遺伝子配列をＰＣＲによって増幅するために
使用され得る。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知で
ある（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌ
ｉｃｈ編、ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：
Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎ
ｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９
０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４９６７；Ｅｃｋｅ
ｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９
１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ １： １７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏ
ｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考
として援用する）。この技術は、所望の生物からさらな
るコード配列を単離するために、または生物中のコード
配列の存在を決定するための診断アッセイとして使用さ
れ得る。ハイブリダイゼーション技術は、プレート化し
たＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリ
ーニングを包含する（プラークまたはコロニーのいずれ
か；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 、
Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこ
と）。
性反応を制御し得る植物遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列全体、またはそれらの１つ以上の部分が、対応す
る病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子配列およびメ
ッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプ
ローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的なハ
イブリダイゼーションを達成するために、このようなプ
ローブは、病害抵抗性反応を制御し得る植物遺伝子配列
間で独特であり、そして好ましくは少なくとも約１０ヌ
クレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレ
オチド長である配列を包含する。このようなプローブ
は、選択された生物から対応する病害抵抗性反応を制御
し得る植物遺伝子配列をＰＣＲによって増幅するために
使用され得る。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知で
ある（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌ
ｉｃｈ編、ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：
Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎ
ｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９
０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４９６７；Ｅｃｋｅ
ｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９
１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ １： １７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏ
ｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考
として援用する）。この技術は、所望の生物からさらな
るコード配列を単離するために、または生物中のコード
配列の存在を決定するための診断アッセイとして使用さ
れ得る。ハイブリダイゼーション技術は、プレート化し
たＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリ
ーニングを包含する（プラークまたはコロニーのいずれ
か；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 、
Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこ
と）。
【００３６】このような配列のハイブリダイゼーション
は、ストリンジェントな条件下で実施され得る。「スト
リンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列
に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えば、
バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的
配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。スト
リンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる
環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／また
は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによ
り、プローブに対して１００％相補的である標的配列が
同定され得る。あるいは、ストリンジェンシー条件は、
より低い程度の類似性が検出され得るように、配列中に
いくらかミスマッチとなることが可能になるように調整
され得る。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチ
ド長未満であり、好ましくは５００ヌクレオチド長未満
である。
は、ストリンジェントな条件下で実施され得る。「スト
リンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列
に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えば、
バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的
配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。スト
リンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる
環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／また
は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによ
り、プローブに対して１００％相補的である標的配列が
同定され得る。あるいは、ストリンジェンシー条件は、
より低い程度の類似性が検出され得るように、配列中に
いくらかミスマッチとなることが可能になるように調整
され得る。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチ
ド長未満であり、好ましくは５００ヌクレオチド長未満
である。
【００３７】代表的には、ストリンジェントな条件は、
塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、代表的に
は約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の
塩）（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、
短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）につ
いては少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ
（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少
なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェント
な条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添
加によって達成され得る。ストリンジェントな条件とし
て、例えば、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣ
ｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液
を用いる３７℃でのハイブリダイゼーション、および１
×から２×のＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣ
ｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）を用いる５０〜５
５℃での洗浄が挙げられる。よりストリンジェントな条
件としては、例えば、４０〜４５％ホルムアミド、１．
０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリ
ダイゼーション、および０．５×から１×のＳＳＣを用
いる５５〜６０℃での洗浄が挙げられる。さらによりス
トリンジェントな条件としては、例えば、５０％ホルム
アミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃での
ハイブリダイゼーション、および０．１×のＳＳＣを用
いる６０〜６５℃での洗浄が挙げられる。
塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、代表的に
は約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の
塩）（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、
短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）につ
いては少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ
（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少
なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェント
な条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添
加によって達成され得る。ストリンジェントな条件とし
て、例えば、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣ
ｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液
を用いる３７℃でのハイブリダイゼーション、および１
×から２×のＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣ
ｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）を用いる５０〜５
５℃での洗浄が挙げられる。よりストリンジェントな条
件としては、例えば、４０〜４５％ホルムアミド、１．
０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリ
ダイゼーション、および０．５×から１×のＳＳＣを用
いる５５〜６０℃での洗浄が挙げられる。さらによりス
トリンジェントな条件としては、例えば、５０％ホルム
アミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃での
ハイブリダイゼーション、および０．１×のＳＳＣを用
いる６０〜６５℃での洗浄が挙げられる。
【００３８】特異性は、代表的には、ハイブリダイゼー
ション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗
浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリッドについては、Ｔmは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈお
よびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１３８：２６７−２８４の式：Ｔm＝８１．５℃＋１
６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１
（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭ
は、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ
中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチ
ドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダ
イゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージで
あり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さであ
る。Ｔmは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致す
るプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオ
ン強度およびｐＨで）である。Ｔmは、１％のミスマッ
チにつき約１℃低下する；従って、Ｔm、ハイブリダイ
ゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性
の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例え
ば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場
合、Ｔmは、１０低下し得る。一般的に、ストリンジェ
ントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特
定の配列およびその相補物に対する熱融解温度（Ｔm）
よりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリン
ジェントな条件は、熱融解温度（Ｔm）よりも１、２、
３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／ま
たは洗浄を利用し得；中程度のストリンジェントな条件
は、熱融解温度（Ｔm）よりも６、７、８、９、または
１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄
を利用し得；低いストリンジェントな条件は、熱融解温
度（Ｔm）よりも１１、１２、１３、１４、１５、また
は２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗
浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄組成物、ならびに所望されるＴmを使用して、当
業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー
および／または洗浄溶液におけるバリエーションが固有
に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの
程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶
液）よりも低いＴmを生じる場合、より高い温度が使用
され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好まし
い。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガ
イドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅ
ｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２
章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗ
ｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照の
こと（これらは本明細書中に参考として援用される）。
ション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗
浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリッドについては、Ｔmは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈお
よびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１３８：２６７−２８４の式：Ｔm＝８１．５℃＋１
６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１
（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭ
は、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ
中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチ
ドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダ
イゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージで
あり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さであ
る。Ｔmは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致す
るプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオ
ン強度およびｐＨで）である。Ｔmは、１％のミスマッ
チにつき約１℃低下する；従って、Ｔm、ハイブリダイ
ゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性
の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例え
ば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場
合、Ｔmは、１０低下し得る。一般的に、ストリンジェ
ントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特
定の配列およびその相補物に対する熱融解温度（Ｔm）
よりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリン
ジェントな条件は、熱融解温度（Ｔm）よりも１、２、
３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／ま
たは洗浄を利用し得；中程度のストリンジェントな条件
は、熱融解温度（Ｔm）よりも６、７、８、９、または
１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄
を利用し得；低いストリンジェントな条件は、熱融解温
度（Ｔm）よりも１１、１２、１３、１４、１５、また
は２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗
浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄組成物、ならびに所望されるＴmを使用して、当
業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー
および／または洗浄溶液におけるバリエーションが固有
に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの
程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶
液）よりも低いＴmを生じる場合、より高い温度が使用
され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好まし
い。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガ
イドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅ
ｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２
章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗ
ｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照の
こと（これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００３９】得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で
公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自
動シーケンサーにより決定し得る。
公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自
動シーケンサーにより決定し得る。
【００４０】本発明のポリヌクレオチドは、代表的に
は、本明細書に記載の方法に従って得られるが、本発明
に開示された配列を基に、化学合成によっても得られ得
る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社（ＡＢＩ）によ
り市販されるポリヌクレオチド合成機を用いて製造業者
によって提供される仕様書に従って合成され得る。
は、本明細書に記載の方法に従って得られるが、本発明
に開示された配列を基に、化学合成によっても得られ得
る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社（ＡＢＩ）によ
り市販されるポリヌクレオチド合成機を用いて製造業者
によって提供される仕様書に従って合成され得る。
【００４１】上述のようにして遺伝子工学的手法または
化学合成手法のような手順に従って生成されたポリヌク
レオチドが、所望の活性、すなわち病害抵抗性反応を制
御する作用、を有することは、例えば、当該ポリヌクレ
オチドを用いてアンチセンスＲＮＡを発現させたイネに
おいて、以下の実施例４の記載と本質的に同様に、ノー
ザンブロット分析によって、防御関連遺伝子の発現を調
べることによって確認され得る。また、このようなポリ
ヌクレオチドは、以下の実施例５の記載と本質的に同様
の手順に従って、Ｔｏｓ１７の転移により得られるよう
な擬似病斑変異体を用いる相補性検定において、変異型
の壊死斑の形成がなくなることを立証することによって
も、所望の活性を有することを確認され得る。
化学合成手法のような手順に従って生成されたポリヌク
レオチドが、所望の活性、すなわち病害抵抗性反応を制
御する作用、を有することは、例えば、当該ポリヌクレ
オチドを用いてアンチセンスＲＮＡを発現させたイネに
おいて、以下の実施例４の記載と本質的に同様に、ノー
ザンブロット分析によって、防御関連遺伝子の発現を調
べることによって確認され得る。また、このようなポリ
ヌクレオチドは、以下の実施例５の記載と本質的に同様
の手順に従って、Ｔｏｓ１７の転移により得られるよう
な擬似病斑変異体を用いる相補性検定において、変異型
の壊死斑の形成がなくなることを立証することによって
も、所望の活性を有することを確認され得る。
【００４２】本発明のポリヌクレオチドは、特定の病原
体に対してだけではなく、多種多様な病原体に対する抵
抗性を付与した植物を作出するために使用され得る。こ
の植物が農業的に有用であれば、なお好ましい。このよ
うな病害抵抗性植物の開発は、病原体の攻撃による農業
上の被害の軽減をもたらすことが期待される。
体に対してだけではなく、多種多様な病原体に対する抵
抗性を付与した植物を作出するために使用され得る。こ
の植物が農業的に有用であれば、なお好ましい。このよ
うな病害抵抗性植物の開発は、病原体の攻撃による農業
上の被害の軽減をもたらすことが期待される。
【００４３】本発明のポリヌクレオチドは、そのままで
または改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切
な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技
術により、植物細胞に導入され得る。好ましくは、本発
明のポリヌクレオチドは、内在する当該遺伝子の機能を
抑制するように導入され、病害抵抗性を有する植物を開
発することが期待される。導入された遺伝子は、植物細
胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞
中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含ま
れる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体
など）に含まれるＤＮＡを含む。
または改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切
な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技
術により、植物細胞に導入され得る。好ましくは、本発
明のポリヌクレオチドは、内在する当該遺伝子の機能を
抑制するように導入され、病害抵抗性を有する植物を開
発することが期待される。導入された遺伝子は、植物細
胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞
中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含ま
れる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体
など）に含まれるＤＮＡを含む。
【００４４】「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子
の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメ
ントが宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核
酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」
は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要
素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡ
ＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列を
いう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、
遺伝子が発現し得るように、ポリヌクレオチドが、その
発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の
調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結
されることをいう。植物発現ベクターは、好適には、植
物遺伝子プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝
子、およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタ
イプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細
胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項であ
る。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−Ｄ
ＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバ
クテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の
導入の効率を高める。
の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメ
ントが宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核
酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」
は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要
素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡ
ＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列を
いう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、
遺伝子が発現し得るように、ポリヌクレオチドが、その
発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の
調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結
されることをいう。植物発現ベクターは、好適には、植
物遺伝子プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝
子、およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタ
イプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細
胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項であ
る。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−Ｄ
ＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバ
クテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の
導入の効率を高める。
【００４５】「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発
現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組
織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向さ
せる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成
的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、
ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉ
ｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．
４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−
ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８
２，Ｃｅｌｌ ３０，７６３）、カリフラワーモザイク
ウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅ
ｌｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３，８１０）、イ
ネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，Ｐ
ｌａｎｔＣｅｌｌ ３，１１５５）、トウモロコシユビ
キチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ １９９３，Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＲＥＸφ
プロモ−タ−（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを
用いることができる。
現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組
織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向さ
せる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成
的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、
ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉ
ｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．
４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−
ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８
２，Ｃｅｌｌ ３０，７６３）、カリフラワーモザイク
ウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅ
ｌｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３，８１０）、イ
ネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，Ｐ
ｌａｎｔＣｅｌｌ ３，１１５５）、トウモロコシユビ
キチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ １９９３，Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＲＥＸφ
プロモ−タ−（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを
用いることができる。
【００４６】あるいは、植物プロモーターは、特定組織
において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得
るか、またはそうでなければ、より特異的な環境または
発達の制御下にあり得る。このようなプロモーターは、
本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。
誘導可能なプロモーターとしては、例えば、光、低温、
高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの
外因によって発現することが知られているプロモーター
などが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例
えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２
リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺
伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，２３５
８）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子
のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって誘導され
るイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター
（Ｖａｎ Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔ
ａ １９３，５７）、乾燥によって誘導されるシロイヌ
ナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄ
ｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６）、紫外線の照射によって
誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ
遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒ
ｔ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６５１）などが挙げ
られる。また、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物
ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得
るか、またはそうでなければ、より特異的な環境または
発達の制御下にあり得る。このようなプロモーターは、
本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。
誘導可能なプロモーターとしては、例えば、光、低温、
高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの
外因によって発現することが知られているプロモーター
などが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例
えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２
リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺
伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，２３５
８）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子
のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって誘導され
るイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター
（Ｖａｎ Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔ
ａ １９３，５７）、乾燥によって誘導されるシロイヌ
ナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄ
ｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６）、紫外線の照射によって
誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ
遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒ
ｔ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６５１）などが挙げ
られる。また、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物
ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００４７】「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク
質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡ
に転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加
に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの
安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼす
ことが知られている。ターミネーターの例としては、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵素
遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、
これらに限定されない。
質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡ
に転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加
に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの
安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼす
ことが知られている。ターミネーターの例としては、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵素
遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、
これらに限定されない。
【００４８】「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選
抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシ
ン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグ
ロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォ
スフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ
得るが、これらに限定されない。
抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシ
ン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグ
ロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォ
スフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ
得るが、これらに限定されない。
【００４９】「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効
率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとして
は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含
むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１
つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。
率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとして
は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含
むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１
つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。
【００５０】上記のような植物発現ベクターは、当業者
に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。実施
例で使用したベクターに加えて、植物発現ベクターの構
築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターまたはｐＵＣ系の
ベクターが好適に用いられるが、これらに限定されな
い。
に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。実施
例で使用したベクターに加えて、植物発現ベクターの構
築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターまたはｐＵＣ系の
ベクターが好適に用いられるが、これらに限定されな
い。
【００５１】ＤＮＡ導入のための植物材料としては、導
入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラス
ト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なも
のを選択することができる。「植物細胞」とは、任意の
植物細胞であり得る。「植物細胞」の例としては、葉お
よび根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養
細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、
培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよ
い。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官
であり、より好ましくは培養細胞である。
入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラス
ト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なも
のを選択することができる。「植物細胞」とは、任意の
植物細胞であり得る。「植物細胞」の例としては、葉お
よび根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養
細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、
培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよ
い。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官
であり、より好ましくは培養細胞である。
【００５２】また一般に、植物培養細胞へＤＮＡを導入
する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレ
クトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法な
どの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる
のに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料と
しては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条
原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイ
ルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方
法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法
によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウム
を介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法
（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５（１
９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、植物発
現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによっ
て）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転
換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの
周知の方法により植物組織に導入する方法である。これ
らの方法は、当該分野において周知であり、形質転換す
る植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得
る。
する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレ
クトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法な
どの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる
のに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料と
しては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条
原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイ
ルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方
法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法
によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウム
を介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法
（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５（１
９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、植物発
現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによっ
て）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転
換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの
周知の方法により植物組織に導入する方法である。これ
らの方法は、当該分野において周知であり、形質転換す
る植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得
る。
【００５３】植物発現ベクターを導入された細胞は、例
えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選
択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生
され得る。
えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選
択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生
され得る。
【００５４】本発明のポリヌクレオチドが導入された植
物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞
を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養
すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培
することにより植物体とすることができる。再生（再分
化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献
にイネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．２，７４）、
トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍ
ｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）、
ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａ
ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇ
ａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）など各
種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。
物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞
を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養
すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培
することにより植物体とすることができる。再生（再分
化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献
にイネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．２，７４）、
トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍ
ｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）、
ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａ
ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇ
ａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）など各
種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。
【００５５】再生した植物体においては、当業者に周知
の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確
認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析
を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡ
を抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメ
ンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子
の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリ
ダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを
検出し得る。
の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確
認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析
を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡ
を抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメ
ンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子
の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリ
ダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを
検出し得る。
【００５６】本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転
換され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物を
も包含する。本明細書中で使用される場合、用語「植
物」は、植物全体、植物の器官（例えば、葉、茎、根な
ど）、種子、植物の伝播体（花粉など）、および植物細
胞、ならびにそれらの子孫への言及を含む。植物細胞
は、本明細書中で使用される場合、限定されることな
く、種子懸濁培養物、胚、メリステム領域、カルス組
織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、および
小胞子を含む。「植物」は、単子葉植物および双子葉植
物の両方を包含する。このような植物には、任意の有用
植物、特に作物植物、蔬菜植物、および花卉植物が含ま
れる。好ましくは、イネ、トウモロコシ、モロコシ、オ
オムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、アワ、アスパラガ
ス、ジャガイモ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ナタ
ネ、ホウレンソウ、トマト、ペチュニアなどが挙げられ
るが、これらに限定されない。本発明が適用される最も
好ましい植物は、イネであり、特に、ジャポニカイネで
ある。
換され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物を
も包含する。本明細書中で使用される場合、用語「植
物」は、植物全体、植物の器官（例えば、葉、茎、根な
ど）、種子、植物の伝播体（花粉など）、および植物細
胞、ならびにそれらの子孫への言及を含む。植物細胞
は、本明細書中で使用される場合、限定されることな
く、種子懸濁培養物、胚、メリステム領域、カルス組
織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、および
小胞子を含む。「植物」は、単子葉植物および双子葉植
物の両方を包含する。このような植物には、任意の有用
植物、特に作物植物、蔬菜植物、および花卉植物が含ま
れる。好ましくは、イネ、トウモロコシ、モロコシ、オ
オムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、アワ、アスパラガ
ス、ジャガイモ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ナタ
ネ、ホウレンソウ、トマト、ペチュニアなどが挙げられ
るが、これらに限定されない。本発明が適用される最も
好ましい植物は、イネであり、特に、ジャポニカイネで
ある。
【００５７】本発明が使用され得る植物種の例として
は、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウ
リ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げ
られる。
は、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウ
リ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げ
られる。
【００５８】ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅ
ｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げ
られ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、ト
ウガラシ、ペチュニアなどを含む。
ａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅ
ｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げ
られ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、ト
ウガラシ、ペチュニアなどを含む。
【００５９】イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、
Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕ
ｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植
物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒ
エ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕ
ｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植
物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒ
エ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
【００６０】アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈ
ａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する
植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナ
ズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
ａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する
植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナ
ズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００６１】バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕ
ｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、また
はＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モ
モ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
ｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、また
はＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モ
モ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
【００６２】マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎ
ｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖ
ｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌ
ｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が
挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エ
ンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシ
などを含む。
ｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖ
ｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌ
ｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が
挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エ
ンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシ
などを含む。
【００６３】ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、
Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植
物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、
メロンなどを含む。
Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植
物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、
メロンなどを含む。
【００６４】シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄ
ｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する
植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソな
どを含む。
ｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する
植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソな
どを含む。
【００６５】ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌ
ｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植
物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チュー
リップなどを含む。
ｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植
物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チュー
リップなどを含む。
【００６６】アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａ
ｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウ
を含む。
ｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウ
を含む。
【００６７】セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉ
ｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、また
はＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシ
ウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
ｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、また
はＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシ
ウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
【００６８】本明細書中、以下で使用される名称、およ
び以下で記載される実験室手順は、当該分野で周知で一
般的に用いられる手順を使用する。標準的な技術は、組
換え法、ポリヌクレオチド合成、ならびに細胞培養につ
いて使用される。この技術および手順は、一般的に、当
該分野、およびこの書類を通じて提供される種々の一般
的な参考文献（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ、Ｎ．Ｙ．を参照。これらは、本明細書中で参考とし
て援用される）。
び以下で記載される実験室手順は、当該分野で周知で一
般的に用いられる手順を使用する。標準的な技術は、組
換え法、ポリヌクレオチド合成、ならびに細胞培養につ
いて使用される。この技術および手順は、一般的に、当
該分野、およびこの書類を通じて提供される種々の一般
的な参考文献（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ、Ｎ．Ｙ．を参照。これらは、本明細書中で参考とし
て援用される）。
【００６９】以下、本発明を実施例により説明するが、
本発明はこれに限定されない。実施例で使用した材料、
試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から
入手可能である。
本発明はこれに限定されない。実施例で使用した材料、
試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から
入手可能である。
【００７０】
【実施例】（実施例１：培養によるＴｏｓ１７の活性化
および得られた変異体の特徴付け）ジヤポニカ種の品種
「日本晴」の完熟種子を出発材料に用い、先に記載のよ
うに（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−
７７８８）（前述）、カルス開始培養および細胞懸濁培
養を行った。遺伝子破壊を行うために使用したＴｏｓ１
７を活性化するための培養条件は、大槻（１９９０）の
方法（イネ・プロトプラスト培養系、農林水産技術情報
協会）に従った。
および得られた変異体の特徴付け）ジヤポニカ種の品種
「日本晴」の完熟種子を出発材料に用い、先に記載のよ
うに（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−
７７８８）（前述）、カルス開始培養および細胞懸濁培
養を行った。遺伝子破壊を行うために使用したＴｏｓ１
７を活性化するための培養条件は、大槻（１９９０）の
方法（イネ・プロトプラスト培養系、農林水産技術情報
協会）に従った。
【００７１】要約すれば、イネの完熟種子を２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を添加したＭＳ培
地（大槻（１９９０）、前述）で培養し（２５℃、１ケ
月間）、カルス誘導を行った。得られたカルスを、２，
４−Ｄを添加したＮ６液体培地（大槻（１９９０）、前
述）で５ヶ月間培養したのち、再分化培地（大槻（１９
９０）、前述）に移し再分化イネ（第１世代（Ｒ１）植
物）を得た。
クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を添加したＭＳ培
地（大槻（１９９０）、前述）で培養し（２５℃、１ケ
月間）、カルス誘導を行った。得られたカルスを、２，
４−Ｄを添加したＮ６液体培地（大槻（１９９０）、前
述）で５ヶ月間培養したのち、再分化培地（大槻（１９
９０）、前述）に移し再分化イネ（第１世代（Ｒ１）植
物）を得た。
【００７２】得られたＲ１イネの各々を１株とし、それ
ぞれの株から種子を回収した。この種子を播種後圃場に
植え、第２世代（Ｒ２）植物を得て形態分析を行った。
Ｒ２集団の各植物の表現型を発芽後約５ヶ月にわたり注
意深く観察した結果、変異系統ＮＤ５００１（品種日本
晴）株は擬似病斑を示した（図１）。図１は、圃場で育
成した擬似病斑変異体および対照の野生型の草姿形態を
示す写真（Ａ）、ならびに葉の形態を示す写真（Ｂ）で
ある。（Ａ）は、左側が野生型であり、右側が変異体で
ある。（Ｂ）は、上側が野生型であり、下側が変異体で
ある。病徴様変異体は、本葉５、６枚展開した頃から葉
に茶色の斑点が現れ始めた。それ以降の葉においても順
次展開した跡に壊死斑が形成され、葉身全体に斑点が広
がり枯れた。
ぞれの株から種子を回収した。この種子を播種後圃場に
植え、第２世代（Ｒ２）植物を得て形態分析を行った。
Ｒ２集団の各植物の表現型を発芽後約５ヶ月にわたり注
意深く観察した結果、変異系統ＮＤ５００１（品種日本
晴）株は擬似病斑を示した（図１）。図１は、圃場で育
成した擬似病斑変異体および対照の野生型の草姿形態を
示す写真（Ａ）、ならびに葉の形態を示す写真（Ｂ）で
ある。（Ａ）は、左側が野生型であり、右側が変異体で
ある。（Ｂ）は、上側が野生型であり、下側が変異体で
ある。病徴様変異体は、本葉５、６枚展開した頃から葉
に茶色の斑点が現れ始めた。それ以降の葉においても順
次展開した跡に壊死斑が形成され、葉身全体に斑点が広
がり枯れた。
【００７３】（実施例２：Ｔｏｓ１７の隣接配列の単
離）実施例１で見られたような表現型を支配する遺伝子
を突き止めるために、ゲノムＤＮＡ中に転移されたＴｏ
ｓ１７の隣接配列を単離した。
離）実施例１で見られたような表現型を支配する遺伝子
を突き止めるために、ゲノムＤＮＡ中に転移されたＴｏ
ｓ１７の隣接配列を単離した。
【００７４】実施例１で得られたＲ２イネ（ＮＤ５００
１株）からＣＴＡＢ法（ＭｕｒｒａｙおよびＴｈｏｍｐ
ｓｏｎ、１９８０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．８、４３２１−４３２５）によりＤＮＡを調製し
た。Ｔｏｓ１７標的部位配列の増幅は、総ＤＮＡを用い
るＴＡＩＬ−ＰＣＲ（Ｌｉｕ Ｙ−Ｇ．ら、Ｇｅｎｏｍ
ｉｃｓ、２５、６７４−６８１、Ｌｉｕ Ｙ−Ｇ．ら、
１９９５、ＰｌａｎｔＪ．、８、４５７−４６３）によ
り実施した。
１株）からＣＴＡＢ法（ＭｕｒｒａｙおよびＴｈｏｍｐ
ｓｏｎ、１９８０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．８、４３２１−４３２５）によりＤＮＡを調製し
た。Ｔｏｓ１７標的部位配列の増幅は、総ＤＮＡを用い
るＴＡＩＬ−ＰＣＲ（Ｌｉｕ Ｙ−Ｇ．ら、Ｇｅｎｏｍ
ｉｃｓ、２５、６７４−６８１、Ｌｉｕ Ｙ−Ｇ．ら、
１９９５、ＰｌａｎｔＪ．、８、４５７−４６３）によ
り実施した。
【００７５】要約すれば、新たなＴｏｓ１７標的部位を
持つ再生植物からの総ＤＮＡを鋳型として用い、以下に
示す３セットのプライマーを用いる３回のＴＡＩＬ−Ｐ
ＣＲにより増幅反応を行った。１回目のＰＣＲでは、鋳
型ＤＮＡには、上記で抽出した総ＤＮＡを使用した。Ｔ
ｏｓ１７特異的プライマーにはＴａｉｌ ３（ＧＡＧＡ
ＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣ）をも
ちいた。以下、２回目のＰＣＲではＴａｉｌ ４（ＡＴ
ＣＣＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＧ）、３回目の
ＰＣＲではＴａｉｌ ５（ＣＡＴＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡ
ＧＴＣＣＡＴＴＧ）を用いた。１回目のＰＣＲの反応液
は全量２０μｌで行った。ＡＤプライマーの配列はＮＧ
ＴＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＧＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＡ
Ａ（ＡＤ１プライマー）である。このＡＤプライマーは
１〜３回目のＰＣＲプライマー対の一方として使用し
た。
持つ再生植物からの総ＤＮＡを鋳型として用い、以下に
示す３セットのプライマーを用いる３回のＴＡＩＬ−Ｐ
ＣＲにより増幅反応を行った。１回目のＰＣＲでは、鋳
型ＤＮＡには、上記で抽出した総ＤＮＡを使用した。Ｔ
ｏｓ１７特異的プライマーにはＴａｉｌ ３（ＧＡＧＡ
ＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣ）をも
ちいた。以下、２回目のＰＣＲではＴａｉｌ ４（ＡＴ
ＣＣＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＧ）、３回目の
ＰＣＲではＴａｉｌ ５（ＣＡＴＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡ
ＧＴＣＣＡＴＴＧ）を用いた。１回目のＰＣＲの反応液
は全量２０μｌで行った。ＡＤプライマーの配列はＮＧ
ＴＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＧＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＡ
Ａ（ＡＤ１プライマー）である。このＡＤプライマーは
１〜３回目のＰＣＲプライマー対の一方として使用し
た。
【００７６】以下に１回目のＰＣＲで用いた最終濃度、
および、サイクル数を記載する。
および、サイクル数を記載する。
【００７７】（最終濃度）鋳型ＤＮＡ；０．５ｎｇ／μ
Ｌ／ｔａｉｌ ３プライマー（Ｔｏｓ１７特異的プライ
マー）；１ｐｍｏｌ／μＬ／ＡＤプライマー；１０ｐｍ
ｏｌ／μＬ／ｄＮＴＰ ｍｉｘ；０．２ｍＭ／１０×Ｐ
ＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）；１×／Ｅｘ−Ｔａｑ；０．０２５単位／μＬ。
Ｌ／ｔａｉｌ ３プライマー（Ｔｏｓ１７特異的プライ
マー）；１ｐｍｏｌ／μＬ／ＡＤプライマー；１０ｐｍ
ｏｌ／μＬ／ｄＮＴＰ ｍｉｘ；０．２ｍＭ／１０×Ｐ
ＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）；１×／Ｅｘ−Ｔａｑ；０．０２５単位／μＬ。
【００７８】（サイクル数）９５℃・３分／１サイク
ル、９４℃・１分−６５℃・１分−７２℃・３分／５サ
イクル、９４℃・１分−２５℃・３分−７２℃・３分／
１サイクル、９４℃・３０秒−６８℃・１分−７２℃・
３分−９４℃・３０秒−６８℃・１分−７２℃・３分−
９４℃・３０秒−４３℃・１分−７２℃・３分／１５サ
イクル、７２℃・５分／１サイクル、４℃・ホールド。
ル、９４℃・１分−６５℃・１分−７２℃・３分／５サ
イクル、９４℃・１分−２５℃・３分−７２℃・３分／
１サイクル、９４℃・３０秒−６８℃・１分−７２℃・
３分−９４℃・３０秒−６８℃・１分−７２℃・３分−
９４℃・３０秒−４３℃・１分−７２℃・３分／１５サ
イクル、７２℃・５分／１サイクル、４℃・ホールド。
【００７９】２回目のＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡは１回目
のＰＣＲ液を１／５０に希釈して使用した。反応液は全
量２０μｌで行った。以下、２回目ののＰＣＲで用いた
最終濃度、および、サイクル数を記載する。
のＰＣＲ液を１／５０に希釈して使用した。反応液は全
量２０μｌで行った。以下、２回目ののＰＣＲで用いた
最終濃度、および、サイクル数を記載する。
【００８０】（最終濃度）鋳型ＤＮＡ／Ｔａｉｌ ４プ
ライマー；１ｐｍｏｌ／ｕＬ／ＡＤプライマー；１０ｐ
ｍｏｌ／μＬ／ｄＮＴＰ ｍｉｘ；０．２ｍＭ／１０×
ＰＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）；１Ｘ／Ｅｘ−Ｔａｑ；０．０２５単位／μＬ。
ライマー；１ｐｍｏｌ／ｕＬ／ＡＤプライマー；１０ｐ
ｍｏｌ／μＬ／ｄＮＴＰ ｍｉｘ；０．２ｍＭ／１０×
ＰＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）；１Ｘ／Ｅｘ−Ｔａｑ；０．０２５単位／μＬ。
【００８１】（サイクル数）９５℃・３分／１サイク
ル、９４℃・３０秒−６４℃・１分−７２℃・３分−９
４℃・３０秒−６４℃・１分−７２℃・３分−９４℃・
３０秒−４３℃・１分−７２℃・３分／１２サイクル、
７２℃・５分／１サイクル、４℃・ホールド。
ル、９４℃・３０秒−６４℃・１分−７２℃・３分−９
４℃・３０秒−６４℃・１分−７２℃・３分−９４℃・
３０秒−４３℃・１分−７２℃・３分／１２サイクル、
７２℃・５分／１サイクル、４℃・ホールド。
【００８２】３回目のＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡは２回目
のＰＣＲ液を１／１０に希釈して使用した。反応液は全
量５０μｌで行った。以下、３回目ののＰＣＲで用いた
最終濃度、および、サイクル数を記載する。
のＰＣＲ液を１／１０に希釈して使用した。反応液は全
量５０μｌで行った。以下、３回目ののＰＣＲで用いた
最終濃度、および、サイクル数を記載する。
【００８３】（最終濃度）鋳型ＤＮＡ／Ｔａｉｌ ５プ
ライマー；１ｐｍｏｌ／μＬ／ＡＤプライマー；１０ｐ
ｍｏｌ／μＬ／ｄＮＴＰ ｍｉｘ；０．２ｍＭ／１０×
ＰＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）；１Ｘ／Ｅｘ−Ｔａｑ；０．０５単位／μＬ。
ライマー；１ｐｍｏｌ／μＬ／ＡＤプライマー；１０ｐ
ｍｏｌ／μＬ／ｄＮＴＰ ｍｉｘ；０．２ｍＭ／１０×
ＰＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）；１Ｘ／Ｅｘ−Ｔａｑ；０．０５単位／μＬ。
【００８４】（サイクル数）９５℃・３分／１サイク
ル、９４℃・３０秒−６６℃・１分−７２℃・３分−９
４℃・３０秒−６８℃・１分−７２℃・３分−９４℃・
３０秒−４５℃・１分−７２℃・３分／１２サイクル、
７２℃・５分／１サイクル、４℃・ホールド。
ル、９４℃・３０秒−６６℃・１分−７２℃・３分−９
４℃・３０秒−６８℃・１分−７２℃・３分−９４℃・
３０秒−４５℃・１分−７２℃・３分／１２サイクル、
７２℃・５分／１サイクル、４℃・ホールド。
【００８５】次に、それぞれのＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物を
アガロースゲル電気泳動後に簡易カラム精製し、直接的
にシークエンサー（ＡＢＩ社、Ｍｏｄｅｌ３１００)を
用いて配列を決定した。
アガロースゲル電気泳動後に簡易カラム精製し、直接的
にシークエンサー（ＡＢＩ社、Ｍｏｄｅｌ３１００)を
用いて配列を決定した。
【００８６】（実施例３：変異体の原因遺伝子の構造解
析）土壌で１１日間生育させた野生型イネ（日本晴）の
幼苗から以下のようにＲＮＡを調製した。まず、ＩＳＯ
ＧＥＮ溶液を用いて幼苗から総ＲＮＡを抽出した。ｍＲ
ＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に含まれるオ
リゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いて、総ＲＮＡから
ポリ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。得られたポリ（Ａ）ｍＲＮ
Ａから常法に従いｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラ
リーをＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１ベクター（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）中に構築した。このｃＤＮＡライブラリー
は、５×１０5プラークの感染能力を持つ。陽性のｃＤ
ＮＡ挿入片を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの
インビボ切除は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ２株で行った。
析）土壌で１１日間生育させた野生型イネ（日本晴）の
幼苗から以下のようにＲＮＡを調製した。まず、ＩＳＯ
ＧＥＮ溶液を用いて幼苗から総ＲＮＡを抽出した。ｍＲ
ＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に含まれるオ
リゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いて、総ＲＮＡから
ポリ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。得られたポリ（Ａ）ｍＲＮ
Ａから常法に従いｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラ
リーをＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１ベクター（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）中に構築した。このｃＤＮＡライブラリー
は、５×１０5プラークの感染能力を持つ。陽性のｃＤ
ＮＡ挿入片を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの
インビボ切除は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ２株で行った。
【００８７】このｃＤＮＡライブラリーを、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記
載の方法に従って、実施例２で得たＴｏｓ１７が転移し
た隣接配列のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をプローブとして用
いてスクリーニングした。
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記
載の方法に従って、実施例２で得たＴｏｓ１７が転移し
た隣接配列のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をプローブとして用
いてスクリーニングした。
【００８８】ｃＤＮＡライブラリーから、強いハイブリ
ダイゼーションシグナルを示す５つのｃＤＮＡクローン
が得られた。
ダイゼーションシグナルを示す５つのｃＤＮＡクローン
が得られた。
【００８９】１つのクローンの中で最長の約１．４ｋｂ
サイズのｃＤＮＡを３１００シークエンサー（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社（ＡＢＩ））を用いて
その両方向について配列決定し、オープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、
１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２
５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析、およ
びＭａｃ Ｖｅｃｔｏｒ ６．０プログラム（帝人シス
テムテクノロジー（株））を用いる分析に供した。
サイズのｃＤＮＡを３１００シークエンサー（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社（ＡＢＩ））を用いて
その両方向について配列決定し、オープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、
１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２
５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析、およ
びＭａｃ Ｖｅｃｔｏｒ ６．０プログラム（帝人シス
テムテクノロジー（株））を用いる分析に供した。
【００９０】配列決定分析により、最長のｃＤＮＡクロ
ーンは１３９５ｂｐ（配列番号１）の長さを有した。Ｍ
ａｃ Ｖｅｃｔｏｒ ６．０パッケージを用いたｍＲＮ
Ａの分析により、３６１アミノ酸（配列番号２）からな
るタンパク質をコードする最長の１０８３ｂｐオープン
リーディングフレームが同定された。配列番号１に示し
た、この１３９５ｂｐのｃＤＮＡ配列を図２に示す。オ
ープンリーディングフレームは、上記ｃＤＮＡ配列の１
４６〜１２３１位に位置する。上記オープンリーディン
グフレームによりコードされるポリペプチドの推定アミ
ノ酸配列（配列番号２）を図３に示す。上記アミノ酸配
列解析の結果、このタンパク質はキナーゼドメインを有
すると推定される。このタンパク質はまた、トマトの病
害性抵抗性関連遺伝子であるＰｔｏ ｋｉｎａｓｅ ｉ
ｎｔｅｒａｃｔｏｒ １（Ｐｔｉ１）とアミノ酸配列レ
ベルで高い相同性を示した（８４％）。これら両タンパ
ク質の配列比較を図３に示す。この相同性は、ＢＬＡＳ
Ｔ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利
用した相同性解析を用いて決定した。トマトＰｔｉ１
は、Ｐｔｏ抵抗性遺伝子が介する病害抵抗性反応を促進
する機能を有することが知られている。
ーンは１３９５ｂｐ（配列番号１）の長さを有した。Ｍ
ａｃ Ｖｅｃｔｏｒ ６．０パッケージを用いたｍＲＮ
Ａの分析により、３６１アミノ酸（配列番号２）からな
るタンパク質をコードする最長の１０８３ｂｐオープン
リーディングフレームが同定された。配列番号１に示し
た、この１３９５ｂｐのｃＤＮＡ配列を図２に示す。オ
ープンリーディングフレームは、上記ｃＤＮＡ配列の１
４６〜１２３１位に位置する。上記オープンリーディン
グフレームによりコードされるポリペプチドの推定アミ
ノ酸配列（配列番号２）を図３に示す。上記アミノ酸配
列解析の結果、このタンパク質はキナーゼドメインを有
すると推定される。このタンパク質はまた、トマトの病
害性抵抗性関連遺伝子であるＰｔｏ ｋｉｎａｓｅ ｉ
ｎｔｅｒａｃｔｏｒ １（Ｐｔｉ１）とアミノ酸配列レ
ベルで高い相同性を示した（８４％）。これら両タンパ
ク質の配列比較を図３に示す。この相同性は、ＢＬＡＳ
Ｔ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利
用した相同性解析を用いて決定した。トマトＰｔｉ１
は、Ｐｔｏ抵抗性遺伝子が介する病害抵抗性反応を促進
する機能を有することが知られている。
【００９１】（実施例４：擬似病斑変異体における病害
抵抗性誘導の評価）擬似病斑変異体の原因遺伝子へのＴ
ｏｓ１７挿入により引き起こされる当該遺伝子の発現阻
害を解析するために、変異体および野生型イネからＲＮ
Ａを抽出し、ノーザン解析により発現特性を調べた。
抵抗性誘導の評価）擬似病斑変異体の原因遺伝子へのＴ
ｏｓ１７挿入により引き起こされる当該遺伝子の発現阻
害を解析するために、変異体および野生型イネからＲＮ
Ａを抽出し、ノーザン解析により発現特性を調べた。
【００９２】水中で７日間発芽させ、土壌中で２、４お
よび６週間生育させたそれぞれの植物の葉からＩＳＯＧ
ＥＮ ＲＮＡ抽出溶液（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を用い
て総ＲＮＡを抽出し、そして５％（ｖ／ｖ）ホルムアル
デヒド溶液を含む１．５％アガロースゲルで分離した。
電気泳動には、約１０μｇのＲＮＡを用いた。病害抵抗
性反応時に発現する防御関連遺伝子である病原関連タン
パク質１ｂ（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ｂ；ＰＲ１ｂ）およびフェニル
アラニンアンモニアリアーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉ
ｎｅ ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ；ＰＡＬ）をプロー
ブとして用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前述、
に記載の方法に従って、０．５ＭのＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ
2ＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、２００μｇの子
ウシ胸腺ＤＮＡを含む溶液中、６８℃で、それぞれ３お
よび１２時間行った。このプローブ配列は、以下の通り
であった： ＜ＰＡＬ＞：ＣＣＡＴＣＣＣＣＴＧＡＧＡＴＴＣＡＴＧ
ＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＴＴＡＧＣＡＡ
ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＴＡＡＡＴ
ＧＣＡＣＴＣＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴ
ＴＴＴＧＣＴＣＡＴＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＣＡＡＧＴＡ
ＣＡＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧ
ＴＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧ
ＴＧＴＡＧＴＡＴＡＴＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧ
ＣＴＣＣＡＧＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡ
ＡＡＡＣＧＧＣＣＡ ＜ＰＲ１ｂ＞：ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＴＣＣＡＡＧＴＧＣ
ＡＴＡＣＴＴＴＧＣＧＧＧＧＧＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴ
ＡＣＡＣＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＴＣＴＧＣ
ＴＡＡＧＴＴＴＴＣＧＴＧＣＣＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡ
ＴＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＡＡ
ＡＴＡＴＴＣＡＣＡＣＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴ
ＡＣＴＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＴＡＣＡＣＡＧＧ
ＴＡＧＡＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＧＴＡＡＧＴＡＧＧＴＡ
ＣＧＴＡＣＡＴＴＡＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＡＴＴＡ
ＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧ。
よび６週間生育させたそれぞれの植物の葉からＩＳＯＧ
ＥＮ ＲＮＡ抽出溶液（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を用い
て総ＲＮＡを抽出し、そして５％（ｖ／ｖ）ホルムアル
デヒド溶液を含む１．５％アガロースゲルで分離した。
電気泳動には、約１０μｇのＲＮＡを用いた。病害抵抗
性反応時に発現する防御関連遺伝子である病原関連タン
パク質１ｂ（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ｂ；ＰＲ１ｂ）およびフェニル
アラニンアンモニアリアーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉ
ｎｅ ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ；ＰＡＬ）をプロー
ブとして用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前述、
に記載の方法に従って、０．５ＭのＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ
2ＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、２００μｇの子
ウシ胸腺ＤＮＡを含む溶液中、６８℃で、それぞれ３お
よび１２時間行った。このプローブ配列は、以下の通り
であった： ＜ＰＡＬ＞：ＣＣＡＴＣＣＣＣＴＧＡＧＡＴＴＣＡＴＧ
ＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＴＴＡＧＣＡＡ
ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＴＡＡＡＴ
ＧＣＡＣＴＣＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴ
ＴＴＴＧＣＴＣＡＴＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＣＡＡＧＴＡ
ＣＡＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧ
ＴＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧ
ＴＧＴＡＧＴＡＴＡＴＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧ
ＣＴＣＣＡＧＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡ
ＡＡＡＣＧＧＣＣＡ ＜ＰＲ１ｂ＞：ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＴＣＣＡＡＧＴＧＣ
ＡＴＡＣＴＴＴＧＣＧＧＧＧＧＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴ
ＡＣＡＣＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＴＣＴＧＣ
ＴＡＡＧＴＴＴＴＣＧＴＧＣＣＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡ
ＴＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＡＡ
ＡＴＡＴＴＣＡＣＡＣＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴ
ＡＣＴＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＴＡＣＡＣＡＧＧ
ＴＡＧＡＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＧＴＡＡＧＴＡＧＧＴＡ
ＣＧＴＡＣＡＴＴＡＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＡＴＴＡ
ＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧ。
【００９３】ハイブリダイゼーション後、フィルター
を、５５℃で、０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液
中で２回、合計１時間洗浄した。
を、５５℃で、０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液
中で２回、合計１時間洗浄した。
【００９４】ノーザン解析の結果、変異体の壊死斑（ｂ
ｒｏｗｎ ｓｐｏｔ）のある葉において、ＰＲ１ｂおよ
びＰＡＬが発現していることが明らかになった。この結
果を図４に示す。上から順にＰＲ１ｂ、ＰＡＬ、リボソ
ームＲＮＡを示す。レーンは、左が野生型（ＷＴ）、中
央および右が変異型（ＭＴ）であって、中央は壊死斑が
あり（ｂｒｏｗｎ ｓｐｏｔ（＋））、右側は壊死斑が
ない（ｂｒｏｗｎ ｓｐｏｔ（−））場合である。壊死
斑がある葉で防御関連遺伝子の発現が確認された。
ｒｏｗｎ ｓｐｏｔ）のある葉において、ＰＲ１ｂおよ
びＰＡＬが発現していることが明らかになった。この結
果を図４に示す。上から順にＰＲ１ｂ、ＰＡＬ、リボソ
ームＲＮＡを示す。レーンは、左が野生型（ＷＴ）、中
央および右が変異型（ＭＴ）であって、中央は壊死斑が
あり（ｂｒｏｗｎ ｓｐｏｔ（＋））、右側は壊死斑が
ない（ｂｒｏｗｎ ｓｐｏｔ（−））場合である。壊死
斑がある葉で防御関連遺伝子の発現が確認された。
【００９５】さらに、病徴様変異体の葉において、ファ
イトアレキシン（モミラクトンＡ（ｍｏｍｉｌａｃｔｏ
ｎｅ Ａ）およびサクラネチン（ｓａｋｕｒａｎｅｔｉ
ｎ））の定量を行った。この定量は、Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．（１９９９）１７，５３５−５
４５の方法に準じて行った。要約すると、損傷スポット
（直径５ｍｍ）を含む組織を、５ｍｌの８０％メタノー
ルで抽出し、そして沸騰させた。次いで、１０ｍｌのブ
ラインをメタノール溶液に添加し、そしてファイトアレ
キシンを５ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出した（3回）。Ｎａ2
ＳＯ4で乾燥した後、ＥｔＯＡｃ層を真空中で濃縮し、
粗抽出物を得た。抽出物を３ｍｌのｎ−ヘキサン中に溶
解し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｌｉｇｈｔ Ｓｉｌｉｃａ Ｃ
ａｒｔｉｌａｇｅにロードした。２ｍｌのＭｅＯＨで希
釈した後、サンプル溶液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを
用いて分析した。ＬＣ条件：カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ
ＯＤＳ ２；溶媒、０．１％蟻酸を伴うＣＨ3ＣＮ；流
速、０．５ｍｌ／分。この分析において、標準物質とし
てモミラクトンＡ（ｍｏｍｉｌａｃｔｏｎｅＡ）および
サクラネチン（ｓａｋｕｒａｎｅｔｉｎ）を用いた。こ
の結果を表１に示す。
イトアレキシン（モミラクトンＡ（ｍｏｍｉｌａｃｔｏ
ｎｅ Ａ）およびサクラネチン（ｓａｋｕｒａｎｅｔｉ
ｎ））の定量を行った。この定量は、Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．（１９９９）１７，５３５−５
４５の方法に準じて行った。要約すると、損傷スポット
（直径５ｍｍ）を含む組織を、５ｍｌの８０％メタノー
ルで抽出し、そして沸騰させた。次いで、１０ｍｌのブ
ラインをメタノール溶液に添加し、そしてファイトアレ
キシンを５ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出した（3回）。Ｎａ2
ＳＯ4で乾燥した後、ＥｔＯＡｃ層を真空中で濃縮し、
粗抽出物を得た。抽出物を３ｍｌのｎ−ヘキサン中に溶
解し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｌｉｇｈｔ Ｓｉｌｉｃａ Ｃ
ａｒｔｉｌａｇｅにロードした。２ｍｌのＭｅＯＨで希
釈した後、サンプル溶液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを
用いて分析した。ＬＣ条件：カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ
ＯＤＳ ２；溶媒、０．１％蟻酸を伴うＣＨ3ＣＮ；流
速、０．５ｍｌ／分。この分析において、標準物質とし
てモミラクトンＡ（ｍｏｍｉｌａｃｔｏｎｅＡ）および
サクラネチン（ｓａｋｕｒａｎｅｔｉｎ）を用いた。こ
の結果を表１に示す。
【００９６】
【表１】
表１は、葉１ｇ新鮮重あたりのファイトアレキシン（モ
ミラクトンＡ（ｍｏｍｉｌａｃｔｏｎｅ Ａ）およびサ
クラネチン（ｓａｋｕｒａｎｅｔｉｎ））含量（μｇ）
を示す；ここで、Ｍｕｔａｎｔは、変異体を、Ｗｉｌｄ
Ｔｙｐｅは野生型を示す；ｎ／ｄは、検出されないこ
とを示す。
ミラクトンＡ（ｍｏｍｉｌａｃｔｏｎｅ Ａ）およびサ
クラネチン（ｓａｋｕｒａｎｅｔｉｎ））含量（μｇ）
を示す；ここで、Ｍｕｔａｎｔは、変異体を、Ｗｉｌｄ
Ｔｙｐｅは野生型を示す；ｎ／ｄは、検出されないこ
とを示す。
【００９７】表１より、変異体の茶色の壊死斑の現れた
葉で、特にモミラクトンＡが蓄積されたことが明らかに
なった。
葉で、特にモミラクトンＡが蓄積されたことが明らかに
なった。
【００９８】以上の結果より、擬似病斑変異体の原因遺
伝子は、病害抵抗性反応の誘導を負に制御していること
が明らかになり、トマトＰｔｉ１（これは、上述したよ
うに、Ｐｔｏ抵抗性遺伝子が介する病害抵抗性反応を促
進する機能を有することが知られている）とは相反する
機能を持つことが示された。
伝子は、病害抵抗性反応の誘導を負に制御していること
が明らかになり、トマトＰｔｉ１（これは、上述したよ
うに、Ｐｔｏ抵抗性遺伝子が介する病害抵抗性反応を促
進する機能を有することが知られている）とは相反する
機能を持つことが示された。
【００９９】（実施例５：擬似病斑変異の相補性検定）
相補性ベクターの構築とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる擬似病斑変異体の形質転
換 完全長の当該遺伝子のオープンリーディングフレームを
含む約１．４ｋｂのｃＤＮＡを、ＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーターの下流に連結し、ｐＰＺＰ２Ｈａ３（＋）ベクタ
ーに組み込んだ（Ｆｕｓｅら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８、２１９−２２２）。この組換
えベクターを用いて、エレクトロポーレーションによ
り、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよびハイグロマイシ
ンの選択下でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１株を形質転換した。得られた
アグロバクテリウム株は、使用するまで凍結保存した。
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる擬似病斑変異体の形質転
換 完全長の当該遺伝子のオープンリーディングフレームを
含む約１．４ｋｂのｃＤＮＡを、ＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーターの下流に連結し、ｐＰＺＰ２Ｈａ３（＋）ベクタ
ーに組み込んだ（Ｆｕｓｅら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８、２１９−２２２）。この組換
えベクターを用いて、エレクトロポーレーションによ
り、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよびハイグロマイシ
ンの選択下でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１株を形質転換した。得られた
アグロバクテリウム株は、使用するまで凍結保存した。
【０１００】当該遺伝子変異体の種子を、１％の次亜塩
素酸ナトリウムで殺菌し、そして殺菌蒸留水で５回洗浄
した。この種子を用いて田中らの方法（日本国特許第３
１４１０８４号）に従って形質転換を行った。種子を、
籾殻の除去後、無傷の状態で、２．５％次亜塩素酸ナト
リウム（ＮａＣｌＯ）溶液中で殺菌した。水での十分な
洗浄の後、イネを以下の無菌操作に供した。
素酸ナトリウムで殺菌し、そして殺菌蒸留水で５回洗浄
した。この種子を用いて田中らの方法（日本国特許第３
１４１０８４号）に従って形質転換を行った。種子を、
籾殻の除去後、無傷の状態で、２．５％次亜塩素酸ナト
リウム（ＮａＣｌＯ）溶液中で殺菌した。水での十分な
洗浄の後、イネを以下の無菌操作に供した。
【０１０１】次いで、種子を、２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ
培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ
酸、２．８ｇ／ｌプロリン、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、
４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）に播種し、５日間、
２７℃〜３２℃で保温した。この間に種子は発芽した。
培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ
酸、２．８ｇ／ｌプロリン、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、
４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）に播種し、５日間、
２７℃〜３２℃で保温した。この間に種子は発芽した。
【０１０２】形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁
液に、前培養した上記種子を浸漬した後、２Ｎ６−ＡＳ
培地（３０ｇ／ｌスクロース、１０ｇ／ｌグルコース、
０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、１
０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴン、４ｇ／ｌゲルライト、
ｐＨ５．２）に移植した。暗黒下で３日間、２８℃で保
温して共存培養した。
液に、前培養した上記種子を浸漬した後、２Ｎ６−ＡＳ
培地（３０ｇ／ｌスクロース、１０ｇ／ｌグルコース、
０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、１
０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴン、４ｇ／ｌゲルライト、
ｐＨ５．２）に移植した。暗黒下で３日間、２８℃で保
温して共存培養した。
【０１０３】共存培養の完了後、５００ｍｇ／ｌカルベ
ニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を用いて、種子から、ア
グロバクテリウムを洗い流した。次いで、形質転換され
た種子の選抜を、以下の条件で行った。
ニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を用いて、種子から、ア
グロバクテリウムを洗い流した。次いで、形質転換され
た種子の選抜を、以下の条件で行った。
【０１０４】第１回目の選抜：カルベニシリン（５００
ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を
補充した、２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上
に、種子を置き、７日間、２７℃〜３２℃で保温する。
ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を
補充した、２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上
に、種子を置き、７日間、２７℃〜３２℃で保温する。
【０１０５】第２回目の選抜：カルベニシリン（５００
ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を
補充した、２〜４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培
地上に、種子を置き、さらに７日間、２７℃〜３２℃で
保温する。
ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を
補充した、２〜４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培
地上に、種子を置き、さらに７日間、２７℃〜３２℃で
保温する。
【０１０６】選抜された形質転換種子を、以下の条件で
再分化させた。
再分化させた。
【０１０７】第１回目の再分化：再分化培地（カルベニ
シリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２
５ｍｇ／ｌ）を補充したＭＳ培地（３０ｇ／ｌスクロー
ス、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、２
ｍｇ／ｌカイネチン、０．００２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、４
ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）上に、選抜した種子を
置き、２週間、２７℃〜３２℃で保温した。
シリン（５００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２
５ｍｇ／ｌ）を補充したＭＳ培地（３０ｇ／ｌスクロー
ス、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、２
ｍｇ／ｌカイネチン、０．００２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、４
ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）上に、選抜した種子を
置き、２週間、２７℃〜３２℃で保温した。
【０１０８】第２回目の再分化：第１回目の再分化にお
いて使用したのと同じ再分化培地を使用して、さらに２
週間、２７℃〜３２℃で保温した。
いて使用したのと同じ再分化培地を使用して、さらに２
週間、２７℃〜３２℃で保温した。
【０１０９】再分化した形質転換体を、発根培地（ハイ
グロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、ホルモンを
含まないＭＳ培地）上に移して、根の発育を確認した後
に、鉢上げした。形質転換体は、壊死斑を形成せず、野
生型と同様の表現形を示した。この結果から、当該遺伝
子の変異が擬似病斑変異の原因であることが証明され
た。
グロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、ホルモンを
含まないＭＳ培地）上に移して、根の発育を確認した後
に、鉢上げした。形質転換体は、壊死斑を形成せず、野
生型と同様の表現形を示した。この結果から、当該遺伝
子の変異が擬似病斑変異の原因であることが証明され
た。
【０１１０】
【発明の効果】植物育種に利用可能な病害抵抗性反応を
制御し得る新規ポリヌクレオチドが提供される。さら
に、多種多様な病原体に対する病害抵抗性を強化した植
物の作出に有用なポリヌクレオチドが提供される。
制御し得る新規ポリヌクレオチドが提供される。さら
に、多種多様な病原体に対する病害抵抗性を強化した植
物の作出に有用なポリヌクレオチドが提供される。
【０１１１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> National Institute of Agrobiological Sciences
Institute of the Society for Techno-innovation of Agriculture, For
estry, and Fisheries
Bio-oriented Technology Research Advancement Institution
<120> A novel gene controlling disease resistance reactions and use the
reof
<130> J1-02412200
<160> 8
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<220>
<221> CDS
<222> (146)..(1231)
<223>
<400> 1
acacacgctg tgctgctgct gctgccgctg ctcctcctcctcctcttaca tcccatcctc 60
gccgcgattt ccttcgccgc cgccgccggc ttcgtcttcttccccggcgc cggggcacgc 120
gaaaagggtt tgtttctagt agaat atg tcg tgc ttt gca tgc tgt ggt gat 172
Met Ser Cys Phe Ala Cys Cys Gly Asp
1 5
gaa gat act caa gga gta cca gac aac agg aat cca tac cca ggg aac 220
Glu Asp Thr Gln Gly Val Pro Asp Asn Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Asn
10 15 20 25
cat cca gca agg agc gat gca tat cgc aca gct gat cca act cca aga 268
His Pro Ala Arg Ser Asp Ala Tyr Arg Thr Ala Asp Pro Thr Pro Arg
30 35 40
ggt cct caa cct gtg aaa gtg caa cca att gca gtc ccc atc att cct 316
Gly Pro Gln Pro Val Lys Val Gln Pro Ile Ala Val Pro Ile Ile Pro
45 50 55
gtt gat gaa att agg gaa gtg act aag aat ttt ggt gat gaa gct ttg 364
Val Asp Glu Ile Arg Glu Val Thr Lys Asn Phe Gly Asp Glu Ala Leu
60 65 70
att ggt gaa ggt tcc ttt ggc aga gtg tat ttt ggt gtt cta aga aat 412
Ile Gly Glu Gly Ser Phe Gly Arg Val Tyr Phe Gly Val Leu Arg Asn
75 80 85
ggt aga agt gca gcg gtc aaa aag cta gac tct agt aag cag cca gac 460
Gly Arg Ser Ala Ala Val Lys Lys Leu Asp Ser Ser Lys Gln Pro Asp
90 95 100 105
caa gaa ttt ttg gca cag gta tct atg gtg tcg agg ctt aag cat gaa 508
Gln Glu Phe Leu Ala Gln Val Ser Met Val Ser Arg Leu Lys His Glu
110 115 120
cat gtt gtt gag ctg ctt ggt tat tgt gtt gat gga aat ctc cgt gtc 556
His Val Val Glu Leu Leu Gly Tyr Cys Val Asp Gly Asn Leu Arg Val
125 130 135
ctt gct tat gag ttt gcg act atg ggt tct ctt cat gat atg ctt cat 604
Leu Ala Tyr Glu Phe Ala Thr Met Gly Ser Leu His Asp Met Leu His
140 145 150
gga agg aag ggt gtt aaa gga gct caa cct ggt cca gtc tta tca tgg 652
Gly Arg Lys Gly Val Lys Gly Ala Gln Pro Gly Pro Val Leu Ser Trp
155 160 165
gca caa cgt gtg aag ata gct gtt ggg gca gca aaa ggc ctg gag tat 700
Ala Gln Arg Val Lys Ile Ala Val Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Tyr
170 175 180 185
ctt cat gag aaa gca cag cct cat atc ata cac agg gac atc aag tcc 748
Leu His Glu Lys Ala Gln Pro His Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Ser
190 195 200
agc aat gtt ctc ctt ttc gat gat gat gtt gct aaa ata gct gac ttt 796
Ser Asn Val Leu Leu Phe Asp Asp Asp Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe
205 210 215
gat ttg tca aac caa gct cct gac atg gca gct cgg ctt cac tct act 844
Asp Leu Ser Asn Gln Ala Pro Asp Met Ala Ala Arg Leu His Ser Thr
220 225 230
agg gtt ctt gga acc ttt gga tat cat gca cct gag tat gca atg act 892
Arg Val Leu Gly Thr Phe Gly Tyr His Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr
235 240 245
gga cag ctt agc tcc aag agt gat gtg tac agt ttt gga gtt gtt ctt 940
Gly Gln Leu Ser Ser Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu
250 255 260 265
ctt gag cta ttg acc gga agg aaa cct gtt gac cat aca tta cca agg 988
Leu Glu Leu Leu Thr Gly Arg Lys Pro Val Asp His Thr Leu Pro Arg
270 275 280
gga cag cag agt ctt gtg act tgg gcc acc cca agg ctt agt gaa gac 1036
Gly Gln Gln Ser Leu Val Thr Trp Ala Thr Pro Arg Leu Ser Glu Asp
285 290 295
aag gtt agg caa tgt gtt gac tca aga ctt gga ggg gac tat cct cct 1084
Lys Val Arg Gln Cys Val Asp Ser Arg Leu Gly Gly Asp Tyr Pro Pro
300 305 310
aaa gct gtc gca aag ttt gca gct gtt gcg gcg tta tgc gtt cag tat 1132
Lys Ala Val Ala Lys Phe Ala Ala Val Ala Ala Leu Cys Val Gln Tyr
315 320 325
gaa gcg gac ttt cga cca aac atg agc att gtc gtg aaa gcg ctg caa 1180
Glu Ala Asp Phe Arg Pro Asn Met Ser Ile Val Val Lys Ala Leu Gln
330 335 340 345
ccc ctg ctg aat gct cgg gca act aac cct gga gaa aat gcc ggg tca 1228
Pro Leu Leu Asn Ala Arg Ala Thr Asn Pro Gly Glu Asn Ala Gly Ser
350 355 360
taa aactttggtc taccttttgt atgatagata ttaagttaag aagtatgaga 1281
catcgatatt gttcttgcgg atgtgtggct ggctggaagt gtgtacattt gtgattattc 1341
gtcccttgtt gtaatcacca aggttctagc aaccgaaaat atttgattct tcgc 1395
<210> 2
<211> 361
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 2
Met Ser Cys Phe Ala Cys Cys Gly Asp Glu Asp Thr Gln Gly Val Pro
1 5 10 15
Asp Asn Arg Asn Pro Tyr Pro Gly Asn His Pro Ala Arg Ser Asp Ala
20 25 30
Tyr Arg Thr Ala Asp Pro Thr Pro Arg Gly Pro Gln Pro Val Lys Val
35 40 45
Gln Pro Ile Ala Val Pro Ile Ile Pro Val Asp Glu Ile Arg Glu Val
50 55 60
Thr Lys Asn Phe Gly Asp Glu Ala Leu Ile Gly Glu Gly Ser Phe Gly
65 70 75 80
Arg Val Tyr Phe Gly Val Leu Arg Asn Gly Arg Ser Ala Ala Val Lys
85 90 95
Lys Leu Asp Ser Ser Lys Gln Pro Asp Gln Glu Phe Leu Ala Gln Val
100 105 110
Ser Met Val Ser Arg Leu Lys His Glu His Val Val Glu Leu Leu Gly
115 120 125
Tyr Cys Val Asp Gly Asn Leu Arg Val Leu Ala Tyr Glu Phe Ala Thr
130 135 140
Met Gly Ser Leu His Asp Met Leu His Gly Arg Lys Gly Val Lys Gly
145 150 155 160
Ala Gln Pro Gly Pro Val Leu Ser Trp Ala Gln Arg Val Lys Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Glu Lys Ala Gln Pro
180 185 190
His Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Ser Asn Val Leu Leu Phe Asp
195 200 205
Asp Asp Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Asp Leu Ser Asn Gln Ala Pro
210 215 220
Asp Met Ala Ala Arg Leu His Ser Thr Arg Val Leu Gly Thr Phe Gly
225 230 235 240
Tyr His Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Ser Ser Lys Ser
245 250 255
Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly Arg
260 265 270
Lys Pro Val Asp His Thr Leu Pro Arg Gly Gln Gln Ser Leu Val Thr
275 280 285
Trp Ala Thr Pro Arg Leu Ser Glu Asp Lys Val Arg Gln Cys Val Asp
290 295 300
Ser Arg Leu Gly Gly Asp Tyr Pro Pro Lys Ala Val Ala Lys Phe Ala
305 310 315 320
Ala Val Ala Ala Leu Cys Val Gln Tyr Glu Ala Asp Phe Arg Pro Asn
325 330 335
Met Ser Ile Val Val Lys Ala Leu Gln Pro Leu Leu Asn Ala Arg Ala
340 345 350
Thr Asn Pro Gly Glu Asn Ala Gly Ser
355 360
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Tos17 Tail3 primer
<400> 3
gagagcatca tcggttacat cttctc 26
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AD1 primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, t, c or g.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, t, c or g.
<400> 4
ngtcgaswga nawgaa 16
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Tos17 Tail4 primer
<400> 5
atccaccttg agtttgaagg g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Tos17 Tail5 primer
<400> 6
catcggatgt ccagtccatt g 21
<210> 7
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PAL probe
<400> 7
ccatcccctg agattcatgg gctgttccta ctctttatta gcaaaagaaa aaaacagaag 60
caaataaatg cactccctta ccagcatgga attttttgct catagcataa agtcaagtac 120
agcatccaag ctgtttaatt ctagtacaag ctggaaaact tgtctcatgt gtagtatata 180
caccaccagc acagctccag ttgaaaaaaa aaaagaaaaa aacggcca 228
<210> 8
<211> 240
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PR1b probe
<400> 8
aattctatgt ccaagtgcat actttgcggg ggtaaaattt tctacacgta tgttgccaaa 60
atttctgcta agttttcgtg ccaactcgag aaattcttac acagcctgca gtctataaat 120
attcacacat ttcacaaaaa aatacttgca acatcaaagc tacacaggta gaatcatcga 180
ccgtaagtag gtacgtacat taagtgtgag cttgattaac tatggaggta tccaagctgg 240
【図１】圃場で育成した擬似病斑変異体および対照の野
生型の草姿形態を示す写真（Ａ）、ならびに葉の形態を
示す写真（Ｂ）である。
生型の草姿形態を示す写真（Ａ）、ならびに葉の形態を
示す写真（Ｂ）である。
【図２】擬似病斑変異体の原因遺伝子のｃＤＮＡの塩基
配列を示す図である。
配列を示す図である。
【図３】擬似病斑変異原因遺伝子によりコードされるタ
ンパク質のアミノ酸配列とトマトPti1のアミノ酸配列の
比較を示す図である。
ンパク質のアミノ酸配列とトマトPti1のアミノ酸配列の
比較を示す図である。
【図４】擬似病斑変異体における防御関連遺伝子の発現
解析を示す電気泳動写真である。
解析を示す電気泳動写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
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(72)発明者 廣近 洋彦
茨城県つくば市観音台２−１−２ 独立行
政法人 農業生物資源研究所内
(72)発明者 宮尾 安藝雄
茨城県つくば市観音台２−１−２ 独立行
政法人 農業生物資源研究所内
(72)発明者 小野里 桂
東京都港区赤坂１−９−13 三会堂ビル７
階 社団法人 農林水産先端技術産業振興
センター内
Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17
CA19 CB02 CD03 CD07 CD09
CD13 CD17
4B024 AA08 CA02 CA04 CA12 HA08
HA11 HA12
Claims (6)
- 【請求項１】 植物における病害抵抗性反応を制御し得
る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、
該ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号２の１位のメ
チオニンから３６１位のセリンまでのアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列を有し、かつ病害抵抗
性反応を制御し得る機能を有するポリヌクレオチドを含
む、ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 植物における病害抵抗性反応を制御し得
る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、
該ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１の１４６位
のＡから１２３１位のＡまでに示されるヌクレオチド配
列または該ヌクレオチド配列にストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリ
ヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 前記病害抵抗性反応反応が、防御関連遺
伝子の発現を誘導することにより制御され得る、請求項
１または２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 イネ由来である、請求項１または２に記
載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 制御配列に作動可能に連結された請求項
１または２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクタ
ー。 - 【請求項６】 植物における病害抵抗性反応反応を制御
する方法であって、請求項１または２に記載のポリヌク
レオチドを植物に導入する工程を包含する、方法。
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|---|---|---|---|
| JP2002151627A JP3803745B2 (ja) | 2002-05-24 | 2002-05-24 | 病害抵抗性反応を制御する新規遺伝子とその利用 |
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| US10/304,339 US7067717B2 (en) | 2002-05-24 | 2002-11-26 | Isolated gene controlling disease resistance activity in plants and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002151627A JP3803745B2 (ja) | 2002-05-24 | 2002-05-24 | 病害抵抗性反応を制御する新規遺伝子とその利用 |
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|---|---|
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ID=29769140
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| JP (1) | JP3803745B2 (ja) |
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| WO2001018061A2 (en) | 1999-09-09 | 2001-03-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize polynucleotides and related polypeptides useful for enhancing disease resistance in crop plants |
-
2002
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- 2002-11-26 US US10/304,339 patent/US7067717B2/en not_active Expired - Fee Related
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| US20040003428A1 (en) | 2004-01-01 |
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