MX2011004216A - Gen at1g67330 novedoso en la eficiencia de captacion de nitrato alterada. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona ácidos nucleicos asociados con la captación de nitrato aislados y sus proteínas codificadas para modular la eficiencia de captación de nitrógeno en plantas. La invención incluye métodos y composiciones relacionados con la alteración de la utilización y/o captación de nitrógeno en plantas. La invención además proporciona casetes de expresión recombinantes, células hospederas y plantas transgénicas.

Description

GEN Atlg67330 NOVEDOSO EN LA EFICIENCIA DE CAPTACIÓN DE NITRATO ALTERADA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona generalmente al campo de biología molecular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La domesticación de muchas plantas se ha correlacionado con incrementos notables en el rendimiento. La mayoría de la variación fenotípica que ocurre en poblaciones naturales es continua y se efectúa por múltiples influencias génicas. La identificación de genes específicos responsables para las diferencias notables en el rendimiento, en plantas domesticadas, ha llegado a ser un enfoque importante de la investigación agrícola.

Un grupo de genes que efectúan el rendimiento son los genes de eficiencia de utilización de nitrógeno (NUE) . Estos genes tienen utilidad para mejorar el uso de nitrógeno en plantas de cultivo, especialmente en maíz. La eficiencia de uso de nitrógeno incrementada puede resultar de la captación aumentada y la asimilación del fertilizante de nitrógeno y/o la remobilización subsecuente y la reutilización de las reservas de nitrógeno acumuladas. Los genes se pueden utilizar para alterar la composición genética de las plantas que las vuelven más productivas con estándares de aplicación de fertilizante actuales, o al mantener sus tasas productivas con entrada de fertilizante significativamente reducida. Las plantas que contienen estos genes por lo tanto se pueden utilizar para el aumento dél rendimiento. La mejora de la NÜE en el maíz incrementaría el rendimiento cosechable del maíz por unidad de fertilizante de nitrógeno de entrada, tanto en las naciones en desarrollo donde el acceso al fertilizante de nitrógeno está limitado y en naciones desarrolladas donde el nivel de uso de nitrógeno permanece alto. La mejora de la utilización de nitrógeno también permite disminuciones en los costos de entrada en la granja, uso disminuido y dependencia de las fuentes de energía no renovables requeridas para la producción de fertilizante de nitrógeno, y disminuye el impacto ambiental de la manufactura de fertilizante de nitrógeno y el uso agrícola.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona polinucleótidos, polipéptidos relacionados y todas las variantes conservativamente modificadas de un gen novedoso, Atlg67330 que se ha mostrado que está involucrado en la captación de nitrógeno en plantas.

La presente invención presenta métodos para alterar la composición genética de plantas de cultivo, especialmente maíz, de modo que tales cultivos pueden ser más productivos con aplicaciones de fertilizantes actuales y tan productivos con la entrada de fertilizantes significativamente reducida. La utilidad de esta clase de invención por lo tanto es tanto el aumento de rendimiento y los costos de fertilizante reducidos con impacto reducido correspondiente al medio ambiente. El mejoramiento genético de la genética intrínseca de la planta de cultivo con el fin de aumentar el NUE no se ha logrado por los científicos en el pasado en cualquier sentido comercialmente viable. Esta invención involucra el descubrimiento y caracterización de un gen de captación de nitrógeno novedoso en plantas. De acuerdo con la invención, los solicitantes han identificado un gen, Atlg67330, que se ha mostrado que incrementa la eficiencia de captación de nitrato mediante un tinte indicador de pH y ensayos de captación de nitrato. El gen se ha mostrado que incrementa el peso fresco de las plantas en bajos niveles de nitrógeno e incrementa la masa de la raíz y hoja en la presencia de sacarosa. Asi, el gen ofrece la habilidad para afectar la captación de nitrógeno y la eficiencia de uso de nitrógeno concomitante. El gen codifica una proteína que contiene un dominio de transmembrana predicho, una secuencia inducible de nitrato putativa en el 5'ÜTR y 3'UTR (Rastogi y colaboradores. Plant Molecular Biology, Vol. 34(3), 465-476, June 1997) y de preferencia se expresa en raíces en la zona del pelillo de la raíz, región de raíz lateral y zona de alargamiento (Zimmermann y colaboradores. Plant Physiology, Vol. 136, 2621-2632, September 2004).

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se relaciona a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótido aislada que codifica un gen asociado con la captación de nitrato. Una modalidad de la invención es un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 1; (b) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2 y (c) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 70% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 1, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que afecta la actividad de NUE.

Las · composiciones de la invención incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2 y (b) la secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 70% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 en donde el polipéptido tiene efectos sobre la NUE.

Tabla 1 SEQ ID NO: Polinucleótido/polipéptido Identidad SEQ ID NO: 1 polinucleótido Atlg67330 SEQ ID NO: 2 polipéptido Atlg7330 SEQ ID NO: 3 Polipéptido Dicot At Atlg27930.1 SEQ ID NO: 4 Polipéptido Dicot_Bs_PBRl10841 SEQ ID NO: 5 polipéptido Dicot_Bs_PBR117871 SEQ ID NO: 6 polipéptido Monocot_Os_Osllg29780 .1 SEQ ID NO: 7 polipéptido Monocot_Sb_Sb05gl0648 0 SEQ ID NO: 8 polipéptido onocot_Zm_pco639489 SEQ ID NO: 9 polipéptido Dicot_Mt_CT377180 SEQ ID NO: 10 polipéptido Dicot_Pt_548026 SEQ ID NO: 11 polipéptido Dicot_Pt_554785 SEQ ID NO: 12 polipéptido Dicot_Vv_CAN63149 SEQ ID NO: 13 polipéptido Dicot_Vv_CAO66163.1 SEQ ID NO: 14 polipéptido Dicot Vv_CAO49019.1 SEQ ID NO: 15 polipéptido Secuencia consensual SEQ ID NO: 16 polinucleótido Monocot Zm pco639489 En otro aspecto, la presente invención se relaciona a un cásete de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico como es descrito. Adicionalmente, la presente invención se relaciona a un vector que contiene el cásete de expresión recombinante. Además, el vector que contiene cásete de expresión recombinante puede facilitar la transcripción y traducción del ácido nucleico en una célula hospedera. La presente invención también se relaciona a las células hospederas capaces de expresar el polinucleótido de la presente invención. Un número de células hospederas podría ser utilizado, tal como pero no limitado a microbianas mamíferas, de plantas o de insectos.

En todavía otra modalidad, la presente invención se dirige a una planta transgénica o células de planta, que contienen los ácidos nucleicos de la presente invención. Las plantas preferidas que contienen los polinucleótidos de la presente invención incluyen pero no están limitadas a maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, tomate y mijo. En otra modalidad, la planta transgénica es una planta de maíz o células de planta. Otra modalidad es las semillas transgénicas del polipéptido asociado con la captación de nitrato transgénico de la invención operablemente enlazado a un promotor induce la expresión en la planta. Las plantas de la invención pueden tener NUE alterada como es comparada con una planta de control. En algunas plantas, la NUE se altera en un tejido vegetativo, un tejido reproductor, un tejido vegetativo y un tejido reproductor. Las plantas de la invención pueden tener por lo menos uno de los siguientes fenotipos incluyendo pero no limitados a: masa de raíz incrementada, longitud de raíz incrementada, tamaño de hoja incrementado, tamaño de mazorca incrementado, tamaño de semilla incrementado, color verde incrementado, tamaño de endosperma incrementado, alteraciones en el tamaño relativo de embriones y endospermas que conducen a cambios en los niveles relativos de proteína, aceite y/o almidón en la semillas, ausencia de espiguillas, ausencia de espiguillas que llevan polen funcionales o tamaño de planta incrementado .

Otra modalidad de la invención seria en plantas que se han modificado genéticamente en una posición genómica, en donde la posición genómica codifica un polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención.

Se proporcionan métodos para incrementar la actividad de un polipéptido asociado con la captación de nitrato en una planta. El método puede comprender introducir en la planta un polinucleótido asociado con la captación de nitrato de la invención.

Se proporcionan métodos para producir o eliminar el nivel de un polipéptido asociado con la captación de nitrato en la planta. El nivel de actividad del polipéptido también podría ser reducido o eliminado en tejidos específicos, causando alteración en la tasa de crecimiento de la planta.

La reducción del nivel y/o actividad del polipéptido asociado con la captación de nitrato puede conducir a estatura más pequeña o crecimiento más lento de las plantas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS El archivo de esta patente contiene por lo menos un dibujo ejecutado en color. Copias de esta patente con dibujos a color serán proporcionadas por la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos en la petición y pago de los derechos necesarios.

La Figura 1 representa una alineación de dendrograma Clustal W de 10 relativos de longitud completa a Atlg67330 (SEQ ID NO: 2). El Osllg29780.1 de arroz, Sb05gl06480 de sorgo y PC0639489 de maíz aparecen para ser una agrupamiento ortólogo de monocotiledónea, probablemente representando un solo gen de cada especie.

Las Figuras 2A y 2B muestran una alineación Clustal W de secuencia de un grupo de ortólogos de Atlg67330.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la . cual esta invención pertenece. A menos que se mencione de otra manera, las técnicas empleadas o contempladas en la presente son metodologías estándares bien conocidas para uno de habilidad ordinaria en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no limitantes. Lo siguiente se presenta a manera de ilustración y no se propone para limitar el alcance de la invención.

Las presentes invenciones ahora serán descritas más completamente después en la presente con referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales algunas, pero no todas las modalidades de la invención son mostradas. En realidad, estas invenciones se pueden incorporar en muchas formas diferentes y no deben ser consideradas como limitadas a las modalidades expuestas en la presente; más bien, estas modalidades se proporcionan de modo que esta descripción satisfacerá los requerimientos legales aplicables. Números similares se refieren a elementos similares por toda esta.

Muchas modificaciones y otras modalidades de las invenciones expuestas en la presente vendrán a la mente para un experto en la técnica a la cual estas invenciones pertenecen teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos asociados. Por lo tanto, se va a entender que las invenciones no van a estar limitadas a las modalidades especificas divulgadas y que modificaciones y otras modalidades se proponen para ser incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque términos específicos se emplean en la presente, ellos se utilizan en un sentido genérico y descriptivo solamente y no para propósitos de limitación .

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de botánica, microbiología, cultivo de tejido, biología molecular, química, bioquímica y tecnología de DNA recombinante, que están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura.

Ver, por ejemplo, Langenheim y Thimann, (1982) Botany: Plant Biology and Its Relation to Human Affairs, John Wiley Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, vol. 1, Vasil, ed. (1984); Stanier, y colaboradores, (1986) The Microbial World, 5th ed., Prentice-Hall ; Dhringra and Sinclair, (1985) Basic Plant Pathology Methods, CRC Press; Maniatis, y colaboradores, (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning, vols. I y II, Glover, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgins, eds . (1984); y la serie Methods in Enzymology, Colowick and Kaplan, eds, Academic Press, Inc., San Diego, CA.

Las unidades, prefijos y símbolos se puede denotar en su forma aceptada SI. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3' ; las secuencias de aminoácidos están escritas de izquierda a derecha y la orientación amino a carboxi, específicamente. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. Los términos definidos enseguida son más completamente definidos por referencia a la especificación como un conjunto.

En la descripción de la presente invención, los siguientes términos serán empleados, y se proponen para ser definidos como es indicado enseguida.

Por "microbio" se propone cualquier microorganismo (incluyendo microorganismos tanto eucarióticos como procarióticos ) , tales como hongos, levadura, bacterias, actinomicetes, algas y protozoarios, asi como otras estructuras unicelulares.

Por "amplificado" se propone la construcción de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico o múltiples copias complementarias a la secuencia de ácido nucleico utilizando por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico como una plantilla. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena polimerasa (PCR) , sistemas de reacción en cadena de ligasa (LCR) , amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, Cangene, ississauga, Ontario), sistema de Q-Beta Replicasa, sistema de amplificación basado en transcripción (TAS) y amplificación de desplazamiento (SDA) . Ver por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, Persing, y colaboradores, eds, American Society for Microbiology, Washington, DC (1993) . El producto de la amplificación es llamado un amplicón.

El término "variantes conservativamente modificadas" aplica a ambas de las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleico. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes conservativamente modificadas se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o conservativamente modificadas de la secuencia de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, un número grande de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteina dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. Asi, en cada posición donde una alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación conservativamente modificada. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Uno de habilidad ordinaria reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina; una excepción es Micrococcus rubens, para el cual GTG es el codón de metionina (Ishizuka, y colaboradores, (1993) J. Gen. Microbiol. 139:425-32) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido de la presente invención, está implícito en cada secuencia de polipéptido descrita e incorporada en la presente por referencia.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, uno de habilidad reconocerá- que sustituciones, supresiones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altera, adiciona o suprime un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la · secuencia codificada es una "variante conservativamente modificada" cuando la alteración da por resultado la sustitución de un aminoácido o un aminoácido químicamente similar. Así, cualquier número de residuos de aminoácidos seleccionado del grupo de números enteros que consiste de 1 a 15 puede ser así alterado. Así, por ejemplo, se pueden hacer 1, 2, 3, 4, 5, 7 o 10 alteraciones. Las variantes conservativamente modificadas típicamente proporcionan actividad biológica similar como la secuencia de polipéptido no modificada de la cual se derivan. Por ejemplo, la especificidad de sustrato, actividad de enzima o enlace de ligando/receptor es generalmente por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, de preferencia 60-90% de la proteína nativa para su sustrato nativo. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica.

Los siguientes seis grupos cada uno contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas del uno para el otro: 1) Alanina (A), Serina (S) , Treonina (T) ; , 2) Ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W) .

Ver también, Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Co. (1984) .

Como se utiliza en la presente, "que consiste esencialmente de" significa la inclusión de secuencias adicionales a un polinucleótido objetivo donde la secuencias adicionales no hibridan selectivamente, bajo condiciones de hibridación severas, al mismo cDNA como el polinucleótido y donde las condiciones de hibridación incluyen una etapa de lavado en 0.1 X SSC y dodecil sulfato de sodio de 0.1% a 65°C.

Por "codificación" o "codificado", con respecto a un ácido nucleico especificado, se propone que comprende la información para la traducción en la proteina especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteina puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dependiendo de regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de tales secuencias no traducidas de intervención, (por ejemplo, en cDNA) . La información mediante la cual una proteina es codificada se especifica por el uso de codones típicamente, la secuencia de aminoácidos es codificada por el ácido nucleico utilizando el código genético "universal". Sin embargo, las variantes del código universal, tal como se presenta en alguna planta, animal y mitocondrias fúngales, la bacteria Mycoplasma capricolum (Yamao, y colaboradores, (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. UÉA 82:2306-9), o el ciliado Macronucleus, se puede utilizar cuando el ácido nucleico se expresa utilizando estos organismos.

Cuando el ácido nucleico se prepara o se altera sintéticamente, la ventaja se puede tomar de las preferencias de codón conocidas del hospedero propuesto donde el ácido nucleico va a ser expresado. Por ejemplo, aunque la secuencia de ácido nucleico de la presente invención se pueden expresar en especies de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias se pueden modificar para tener en cuenta las preferencias de codón específicas y las preferencias de contenido de GC de plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas ya que estas preferencias se han mostrado que difieren (Murray, y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-98 e incorporado en la presente por referencia) . Así, el codón preferido de maíz para un aminoácido particular podría ser derivado de secuencias génicas conocidas del maíz. La utilización de codón de maiz para 28 genes de plantas de maiz se lista en la Tabla 4 de Murray, y colaboradores, supra.

Como se utiliza en la presente, "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina de una especie foránea, o, si es de la misma especie, sustancialmente es modificado de su forma nativa en composición y/o posición genómica mediante la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor operablemente enlazado a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente de aquella de la cual se derivó el gen estructural o, si es de la misma especie, uno o ambos son sustancialmente modificados de su forma original. Una proteina heteróloga puede originarse de una especie foránea o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma original mediante la intervención humana deliberada.

Por "célula hospedera" se propone una célula, que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga de la invención, que contiene un vector y soporta la replicación y/o expresión del vector de expresión. Las células hospederas pueden ser células . procarióticas tales como E. coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, de insecto de planta, de anfibio o mamiferas. De preferencia las células hospederas son células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, incluyendo pero no limitadas a maíz, sorgo, girasol, soja, trigo, alfalfa, arroz, algodón, cañóla, cebada, mijo y tomate. Una célula hospedera monocotiledónea particularmente preferida es una célula hospedera de maíz.

El término "complejo de hibridación" incluye la referencia a una estructura de ácido nucleico dúplex formada por dos secuencias de ácido nucleico de una sola hebra selectivamente hibridadas entre si.

El término "introducido" en el contexto de insertar un ácido nucleico en una célula, significa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye la' referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica donde el ácido nucleico puede ser incorporado en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástida o DNA mitocondrial ) , convertida en un replicón autónomo, o transientemente expresado (por ejemplo, mRNA transfectados ) .

Los términos "aislado" se refieren al material, tal como un ácido nucleico o una proteina, que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con este como se encuentra en su ambiente que ocurre naturalmente. El material aislado opcionalmente comprende material no encontrado con el material en su ambiente natural. Los ácidos nucleicos, que son "aislados" como se define en la presente, también se refieren como ácidos nucleicos "heterólogos" . A menos que se establezca de otra manera, el término "ácido nucleico asociado con la captación de nitrato" significa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ("polinucleótido asociado con la captación de nitrato") que codifica un polipéptido asociado con la captación de nitrato de longitud completa o longitud, parcial .

Como se utiliza en la presente, "ácido nucleico" incluye la referencia a deoxiribonucleótido o polímeros de ribonucleótido en forma de ya sea una sola o doble hebra, y a menos que se limite de otra manera, abarca análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales en que hibridan a ácidos nucleicos de una sola hebra de una manera similar a los nucleótidos que ocurren naturalmente (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptidos) .

Por "librería de ácido nucleico" se propone una colección de moléculas de DNA o RNA aisladas, que comprenden y sustancialmente representan la fracción transcrita completa de un genoma de un organismo especificado. La construcción de librerías de ácido nucleico ejemplares, tales como librerías genómicas y de cDNA, se enseña en las referencias de biología molecular estándares tales como Berger and Kimmel, (1987) Guide To Molecular Cloning Techniques, from the series Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook, y colaboradores, (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd ed., vols. 1-3; and Current Protocole in Molecular Biology, Ausubel, y colaboradores, eds, Current Protocols, una asociación conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. and John iley & Sons, Inc. (1994 Supplement ) .

Como se utiliza en la presente "operablemente enlazado" incluye la referencia a un enlace funcional entre una primera secuencia, tal como un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia de promotor inicia y media la transcripción del DNA correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operablemente enlazado significa que las secuencias de ácido nucleico que son enlazadas están contiguas, y donde es necesario unen dos regiones de codificación de proteina, contiguas y en la misma estructura de lectura.

Como se utiliza en la presente, el término "planta" incluye la referencia a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc.), semillas y células de planta y progenies de las mismas. La célula de planta, como se utiliza en la presente incluye, sin limitación, semillas, cultivos de suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raices, retoños, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. La clase de plantas, que pueden ser utilizadas en los métodos de la invención como es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores disponibles para las técnicas de transformación, incluyendo plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas que incluyen especies de los géneros: Cucúrbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana , Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Sécale, Allium y Triticum . Una planta particularmente preferida es Zea mays.

Como se utiliza en la presente, "rendimiento" puede incluir la referencia a medidas por acre de un cultivo de grano en cosecha, como se ajusta para la humedad del grano (15% típicamente para maíz, por ejemplo) y el volumen de biomasa generado (para cultivos de forraje tal como alfalfa, y el tamaño de raíz de planta para múltiples cultivos) . La humedad del grano, se mide en el grano en la cosecha. El peso de prueba ajustado del grano se determina que es peso en libras por medida, ajustado por el nivel de humedad del grano en la cosecha. La biomasa se mide como el peso de materia de planta cosechable generado.

Como se utiliza en la presente, "polinucleótido" incluye la referencia a un deoxiribopolinucleótido, ribopolinucleótido o análogos de los mismos que tiene la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en que híbrida, bajo condiciones de hibridación severas, a sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos como nucleótidos que ocurren naturalmente y permiten la transducción en el mismo aminoácido ( s ) como el nucleótido ( s ) que ocurre naturalmente. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen nativo o estructural heterólogo o regulador. A menos que se indique de otra manera, el término incluye la referencia de la secuencia especificada así como la secuencia complementaria de la misma. Asi, DNAs o RNAs con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" como el término se propone en la presente. Por otra parte, DNAs o RNAs que comprenden bases inusuales, tal como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por mencionar solamente dos ejemplos, son polinucleótidos como el término se utiliza en la presente. Será apreciado que una gran variedad de modificaciones se han hecho al DNA y RNA que sirven para muchos propósitos útiles conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. El término polinucleótido como se emplea en la presente abarca formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de polinucleótidos, así como las formas químicas de DNA y RNA características de virus y células. Incluyendo ir¡ter alia, células simples y complejas.

Los términos "polipéptido" "péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a · un polímero de residuos de aminoácido. Los términos aplican a polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido es un análogo químico artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente, así como polímeros de aminoácidos que ocurren naturalmente.

Como se utiliza en la presente "promotor" incluye la referencia a una región de DNA corriente arriba del inicio de transcripción e involucrada en el reconocimiento y enlace de RNA polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor de plantas" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células de planta. Los promotores de planta ejemplares incluyen, pero no está limitados a, aquellos que son obtenidos de plantas, virus de planta y bacterias que comprenden genes expresados en células de planta tal como Agrobacterium o Rhizobium. Ejemplos son promotores que preferencialmente inician la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, semillas, fibras, vasos de xilema, traqueidas o esclerenquima . Tales promotores son referidos como "preferidos de tejido". Un "tipo de célula" específico de promotor principalmente induce la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raices u hojas. Un promotor inducible" a "regulable" es un promotor, que está bajo el control ambiental. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas' en la presencia de luz. Otro tipo de promotor es un promotor desarrolladamente regulado, por ejemplo, un promotor que induce la expresión durante el desarrollo del polen. Los promotores preferidos de tejido, específicos de tipo de célula, desarrolladamente regulados e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor, que es activo bajo la mayoría de las condiciones ambientales.

El término "polipéptido asociado con la captación de nitrato" se refiere a una o más secuencias de aminoácidos. El término también es inclusivo de fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, preproproteínas o proproteínas) de los mismos. Una "proteína asociada con la captación de nitrato" comprende un polipéptido asociado con la captación de nitrato. A menos que se establezca de otra manera, el término "ácido nucleico asociado con la captación de nitrato" significa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ( "polinucleótido asociado con la captación de nitrato") que codifica un polipéptido asociado con la captación de nitrato.

Como se utiliza en la presente "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector, que se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o que la célula se deriva de una célula asi modificada. Asi, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante de la célula) o expresan genes nativos que son de otra manera anormalmente expresados, subexpresados o no expresados en todo como un resultado de la intervención humana deliberada; o pueden tener expresión reducida o eliminada de un gen nativo. El término "recombinante" como se utiliza en la presente no abarca la alteración de la célula o vector por eventos que ocurren naturalmente (por ejemplo, mutación espontánea, transíormación/transducción/transposición natural) tales como aquellos que ocurren sin la intervención humana deliberada.

Como se utiliza en la presente, un "cásete de expresión recombinante" es un constructo de ácido nucleico, generado recombinaritemente sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados, que permite la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. El cásete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, DNA mitocóndrico, DNA de plástida, virus o fragmento de ácido nucleico.

Típicamente, la porción de cásete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico que es transcrito, y un promotor.

Los términos "residuo" o "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un aminoácido que es incorporado en una proteína, polipéptido o péptido (colectivamente "proteína"). El aminoácido puede ser un aminoácido que ocurre naturalmente y, a menos que sea limitado de otra manera, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar como los aminoácidos que ocurren naturalmente.

El término "selectivamente híbrida" incluye la referencia a hibridación, bajo condiciones de hibridación severas, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia objetivo de ácido nucleico especificada a un grado detectablemente más grande (por ejemplo, por lo menos 2-veces sobre el antecedente) que su hibridación a la secuencia de ácido nucleico no objetivo y la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no objetivo. La secuencia selectivamente hibridante típicamente tienen aproximadamente por lo menos 40% de identidad de secuencia, de preferencia 60-90% de identidad de secuencia y mucho más de preferencia 100% de identidad de secuencia (es decir, complementaria) entre si.

Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" incluyen la referencia a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo, a un grado detectable más grande que otra secuencia (por ejemplo, por lo menos 2-veces sobre el antecedente) . Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la severidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, la secuencia objetivo se puede identificar que puede ser hasta 100% complementaria a la sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad se pueden ajustar para permitir alguna desigualación en la secuencia de modo que se detectan grados menores de similitud (sondeo heterólogo) . Óptimamente, la sonda es de aproximadamente 500 nucleótidos en longitud, pero puede variar grandemente en longitud desde menor que 500 nucleótidos a igual a la longitud completa de la secuencia objetivo.

Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de ión de Na, de manera típica aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ión Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes de estabilizantes tal como formamida o Denhardt's. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen hibridación con una solución reguladora de formamida al 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato de sodio) al 1% a 37°C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de sodio 0.3 M) en 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderada ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX SSC en 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0.1 X SSC en 60 a 65°C. La especificidad es típicamente la función de los lavados de post-hibridización, los factores críticos que son la concentración iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de DNA-DNA, la Tm puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth y Wahl, (1984) Anal. Biochem, 138:267-84: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el DNA, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo concentración iónica y pH definidos) en el cual 50% de una secuencia objetivo complementaria híbrida a una sonda perfectamente igualada. La Tm se reduce por aproximadamente 1°C para cada 1% de desigualación; asi, Tm las condiciones de hibridación y/o lavado se pueden ajustar para hibridar la secuencia de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm puede ser disminuida 10°C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menor que punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia especifica y su complemento en la concentración iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 1, 2, 3 o 4°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar un hibridación y/o lavado en 6, 7, 8, 9 o 10 °C menor que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C menor que el punto de fusión térmicos (Tm) . Utilizando la ecuación, las condiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada aquellos de habilidad ordinaria entenderán que las variaciones en la severidad de hibridación y/o soluciones de lavado son inherentemente descritas. Si el grado deseado de desigualación da por resultado una Tm de menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) se prefieren incrementar la concentración de SSC de modo que se pueda utilizar a una temperatura más alta. Una guia extensiva para la hibridación de ácido nucleico se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays," Elsevier, New York (1993); and Current Protocols in Molecular Biology, chapter 2, Ausubel, y colaboradores, eds, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) . A menos que se establezca de otra manera, en la presente solicitud alta severidad se define como la hibridación en 4X SSC, 5X Denhardt' s (5 g Ficoll, 5 g polivinipirrolidona, 5 g de albúmina de suero bovina en 500ml de agua), 0.1 mg/ml de DNA de esperma de salmón hervido, y fosfato de Na 25 mM a 65°C y un lavado de 0.1 X SSC, SDS al 0.1% a 65°C.

Como se utiliza en la presente, "planta transgénica" incluye la referencia a una planta, que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo se integra establemente dentro del genoma tal que el polinucleótido se pasa sobre generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede ser integrado en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante . "Transgénico" se utiliza en la presente para incluir cualquier célula, linea de célula, callo, tejido, parte de planta o planta, el genotipo de cual se ha alterado por la presencia del ácido nucleico heterólogo que incluye aquellos transgénicos inicialmente asi alterados asi como aquellos creados por cruzas sexuales o propagación asexual del transgénico inicial. El término "transgénico" como se utiliza en la presente no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extra-cromosómico) por lo métodos de reproducción de plantas convencionales o por eventos que ocurren naturalmente tal como la fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

Como se utiliza en la presente, "vector" incluye la referencia a un ácido nucleico utilizado en la transfección de una célula hospedera y en el cual se puede insertar un polinucleótido . Los vectores son frecuentemente de replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado en el mismo.

Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos o polipéptidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia" (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial".

Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de una secuencia de cDNA o génica de longitud completa, o la secuencia de cDNA o génica completa.

Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" significa que incluye la referencia a un segmento contiguo o especificado en una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido puede ser comparado a una secuencia de referencia y en la posición de la secuencia de polinucleótido en. la ventana de comparación puede comprender . adiciones o supresiones (es decir espacios) comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es por lo menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser 30, 40, 50, 100 o más larga. Aquellos de habilidad en la técnica entienden que para evitar una alta similitud en una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótido una sanción de espacio típicamente se introduce y se sustrae del número de igualaciones.

Métodos de alineación de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para comparación son bien conocidos en la técnica. El algoritmo de homología local (BESTFIT) de Smith y Waterman, (1981) Adv. Appl . Math 2:482, puede conducir a la alineación óptima de secuencias para la comparación; mediante el algoritmo de alineación de homologías (GAP) de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443-53; por la búsqueda para método de similitud (Tfasta y Fasta) de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444; por implementaciones computarizadas de estos algoritmos, incluyendo, pero no limitados a: CLUSTAL en el programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de Software de Genética de Wisconsin; Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group (programas GCG® (Accelrys, Inc., San Diego, CA) . ) . El programa CLUSTAL es bien descrito por Higgins y Sharp, (1988) Gene 73:237-44; Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet, y colaboradores, (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang, y colaboradores, (1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155-65, y Pearson, y colaboradores, (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31. El programa preferido para el uso para la alineación global óptima de múltiples secuencias es PileUp (Feng and Doolittle, (1987) J. Mol. Evol, 25:351-60 que es similar al método descrito por Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-53 e incorporada en la presente por referencia) . La familia BLAST de programas que se pueden utilizar para búsquedas de similitud de bases de datos incluyen: BLASTN para secuencias interrogantes de nucleótidos contra secuencia de bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias interrogantes de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de proteína; BLASTP para secuencias interrogantes de proteína contra secuencias de base de datos de proteína; TBLASTN para secuencias interrogantes de proteína contra secuencias de bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias interrogantes de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de nucleótidos. Ver, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel y colaboradores, eds . , Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).

GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch, supra, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximizan el número de igualaciones y se minimiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y posiciones de espacio y crea la alineación con el número más grande de bases igualadas y los menores espacios. Esto permite la provisión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de base igualadas. GAP debe hacer un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de igualaciones para cada espacio que este inserta. Si se elige una sanción de extensión de espacio mayor que cero, GAP además debe hacer un aprovechamiento para cada espacio insertado de la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de sanción de extensión de espacio en la Versión 10 del Paquete de Software de Genética de Wisconsin son 8 y 2, respectivamente. Las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacio se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consisten de 0 a 100. Así, por ejemplo, las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacio pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más grande .

GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP exhibe cuatro Figuras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear la secuencia. La relación es la calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. El Por Ciento de Identidad es el por ciento de los símbolos que realmente se igualan. El Por Ciento de Similitud es el por ciento de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud se registra cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. La matriz de registro utilizada en la Versión 10 del Paquete de Software de Genética de Wisconsin es BLOSUM62 (ver, Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci USA 89:10915).

A menos que se establezca de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando el sitio de BLAST 2.0 de programas utilizando parámetros de error (Altschul, y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402) .

Como aquellos de habilidad ordinaria en la técnica entenderán, las búsquedas de BLAST asumen que las proteínas pueden ser modeladas como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias, que pueden ser tractos homopoliméricos , repeticiones de período corto o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad se pueden alinear entre proteínas no relacionadas aunque otras regiones de la proteína son completamente distintas. Un número de programas de filtro de baja complejidad se pueden emplear para reducir tales alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros · de baja complejidad SEG (Wooten y Federhen, (1993) Comput. Chem. 17:149-63) y XNU (Claverie and States, (1993) Comput. Chem. 17:191-201) se pueden emplear solos o en combinación.

Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o de polipéptido incluye la referencia a los residuos de las dos secuencias, que son los mismos cuando se alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a proteínas se reconocen que las posiciones de residuo que no son idénticas frecuentemente difieren por sustituciones de aminoácido conservativas, donde los residuos de aminoácidos son sustituidos por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Donde las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el , por ciento de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren por tales sustituciones conservativas, se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. Típicamente esto involucra registrar una sustitución conservativa como una desigualación parcial antes que completa, para de esta manera incrementar el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, donde a un aminoácido idéntico se le da un registro de 1 y a una sustitución no conservativa se le da un registro de cero, una sustitución conservativa se le da un registro entre cero y 1. El registro de sustituciones conservativas se calcula, de acuerdo con el algoritmo de Meyers y Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17, como es implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA) .

Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas cobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido y la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica o residuo de aminoácidos ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótido significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene entre 50-100% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 50% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 60% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 70%, más de preferencia por lo menos 80%, más de preferencia por lo menos 90%, y mucho más de preferencia por lo menos 95%, comparado con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos utilizando parámetros estándares. Uno ' de habilidad reconocerá que estos valores pueden ser apropiadamente ajustados para determinar la identidad correspondiente a proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tomar en cuenta la degeneración del codón, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento de la estructura de lectura y los similares. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos propósitos normalmente significa la identidad de secuencia de entre 55-100%, de preferencia por lo menos 55%, de preferencia por lo menos 60%, más de preferencia por lo menos 70%, 80%, 90%, y mucho más de preferencia por lo menos 95%.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas hibridan entre si bajo condiciones severas. La degeneración del código genético permite muchas sustituciones de aminoácidos que conducen a una variedad en la secuencia de nucleótidos que codifican para el mismo aminoácido, por consiguiente es posible que la secuencia de DNA podría codificar el mismo polipéptido pero no hibridar entre si bajo condiciones severas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando una copia de ácido nucleico se crea utilizando la regeneración de codón máxima permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que el polipéptido, el cual el primer ácido nucleico codifica, es inmunológicamente reactivo cruzadamente con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

Los términos "identidad sustancial" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con entre 55-100% de identidad de secuencia a una secuencia de referencia de preferencia por lo menos 55% de identidad de secuencia, de preferencia 60%, de preferencia 70%, más de preferencia 80%, mucho más de preferencia por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia a la secuencia de referencia sobre una ventana de comparación especificada. De preferencia, la alineación óptima se conduce utilizando el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, supra. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos cultivados contra el segundo péptido. Así, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren solamente por una sustitución conservativa. Además, un péptido puede ser sustancialmente idéntico a un segundo péptido cuando ellos difieren por un cambio no conservativo si el epítope que el anticuerpo reconoce es sustancialmente idéntico. Los péptidos, que son "sustancialmente similares" comparten secuencias, como es mencionado en lo anterior excepto que las posiciones de residuo, que no son idénticas, pueden diferir por cambios de aminoácido conservativos.

La invención divulga polinucleótidos asociados con la captación de nitrato y polipéptidos . Lo nucleótidos y proteínas novedosas de la invención tienen un patrón de expresión que indican que ellos aumentan la captación de nitrógeno y la utilización y así desempeñan una función importante en el desarrollo de la planta. Los polinucleótidos se expresan en varios tejidos de planta. Los polinucleótidos y polipéptidos de esta manera proporcionan una oportunidad para manipular el desarrollo de la planta para alterar el desarrollo del tejido, sincronización o composición. Esto se puede utilizar para crear una planta con rendimiento aumentado bajo suministro de nitrógeno limitado. Ácidos Nucleicos La presente invención proporciona, ínter alia, ácidos nucleicos aislados de RNA, DNA, homólogos, parálogos y ortólogos y/o quimeras de los mismos, que comprenden un polinucleótido asociado con la captación de nitrato. Este incluye variantes que ocurren naturalmente así como sintéticas y homólogos de la secuencias.

Los homólogos de secuencias, es decir que comparten identidad o similitud de secuencia significante, a aquellos proporcionados en la presente derivados de maiz, Arabidopsis thaliana o de otras plantas de elección, también son un aspecto de la invención. Las secuencias homologas pueden ser derivadas de cualquier planta que incluye monocotiledoneas y dicotiledóneas y en particular especies de plantas agricolamente importantes, incluyendo pero no limitadas a, cultivos tales como soja, trigo, cereal (maiz), papa, algodón, arroz, colza, aceite de semilla de colza (incluyendo cañóla) girasol, alfalfa, trébol, caña de azúcar y césped; o frutos y vegetales, tal como plátano, zarzamora, arándano, fresa y frambuesa, cantalupo, zanahoria, coliflor, café, pepino, berenjena, uvas, ligamaza, lechuga, mango, melón, cebolla, papaya, guisantes, pimientos, piña, zapallo, espinaca, calabaza, maiz dulce, tabaco, tomate, tomatillo, sandia, frutas rosáceas (tal como manzana, durazno, pera, cereza y ciruela) y brassicas vegetales (tal como brócoli, col, coliflor, col de Bruselas y colinabo) . Otros cultivos, incluyendo frutas y vegetales, cuyo fenotipo se puede cambiar y que comprende secuencias homologas incluyen cebada; centeno; mijo; sorgo; grosella; aguacate; fruto cítricos tales como naranjas, limones, toronja y tangerinas, alcachofas, bayas; nueces tal como el nogal y cacahuate; escarola; puerro; raíces tales como maranta, betabel, mandioca, ajo, rábano, ñame y camote; y frijoles. Las secuencias homologas también se pueden derivar de especies leñosas, tal como pino, álamo y eucalipto, o menta u otros labiados. Además, las secuencias homologas se pueden derivar de plantas que son evolucionariamente relacionadas con plantas de cultivo, pero que no pueden todavía haber sido utilizadas como plantas de cultivo. Ejemplos incluyen belladona (Atropa belladona) , relacionada con tomate; estramonio (Datura strommium) , relacionado con peyote y teosinte (Zea species), relacionado con cereal (maíz).

Ortólogos y Parálogos Las secuencias homologas como es descrito en lo anterior pueden comprender frecuencias ortólogas o parálogas. Varios métodos diferentes son bien conocidos por aquellos de habilidad en la técnica para identificar y definir estas secuencias funcionalmente homologas. Tales métodos generales para definir ortólogos y parálogos son descritos; un ortólogo, parálogo u homólogo puede ser identificado por uno o más de los métodos descritos enseguida.

Los ortólogos y parálogos son genes evolucionariamente relacionados que tienen secuencia similar y funciones similares. Los ortólogos son genes estructuralmente relacionados en diferentes especies que se derivan por un evento de especiación. Los paráloqos son genes estructuralmente relacionados dentro de una sola especie que son derivados por un evento de duplicación.

Dentro de una sola especie de planta, la duplicación génica puede causar dos copias de un gen particular, dando origen a dos o más genes con secuencia similar y frecuentemente función similar conocidos como parálogos. Un parálogo es por lo tanto un gen similar formado por la duplicación dentro de la misma especie. Los parálogos típicamente se agrupan conjuntamente o en la misma clase (un grupo de genes similares) cuando una filogenia de familia génica se analiza utilizando programas tal como CLUSTAL (Thompson y colaboradores. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680; Higgins y colaboradores. (1996) ethods Enzymol. 266: 383-402). Grupos de genes similares también se pueden identificar con el análisis BLAST emparejado (Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 25: 351-360).

Por ejemplo, una clase de factores de transcripción de dominio MADS muy similares de Arabidopsis todos comparten una función común en el tiempo de florecimiento (Ratcliffe y colaboradores. (2001) Plant Physiol. 126: 122-132) y un grupo de factores de transcripción de dominio AP2 muy similares de Arabidopsis están involucrados en la tolerancia de plantas a la congelación (Gilmour y colaboradores. (1998) Plant J. 16: 433-442) . Análisis de grupos de genes similares con función similar que caen dentro de una clase pueden producir sub-secuencias que son particulares a la clase. Estas sub--secuencias, conocidas como secuencias consensúales, solamente pueden ser utilizadas para definir la secuencia dentro de cada clase, pero definen las funciones de estos genes; los genes dentro de una clase pueden contener secuencias parálogas, o secuencias ortólogas que comparten la misma función, (ver también, por ejemplo, Mount (2001), in Bioinformatics : Sequence y Genome Analysis Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., page 543.)· La especiación, la producción de nuevas especies de una especie parental, también puede dar origen a dos o más genes con secuencia similar o función similar. Estos genes, llamados ortólogos, frecuentemente tienen una función idéntica dentro de sus plantas hospederas y son frecuentemente intercambiables entre las especies sin pérdida de función. Debido a que las plantas tienen ancestros comunes, muchos genes en cualquier especie de planta tendrían un gen ortólogo correspondiente en otra especie de planta. Una vez que un árbol filogénico de una familia génica de una especie se ha construido utilizando un programa tal como CLUSTAL (Thompson y colaboradores. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680; Higgins y colaboradores. (1996) supra) secuencias ortólogas potenciales se pueden colocar en el árbol filogenético y su relación a los genes de la especie de interés se puede determinar. Las secuencias ortólogas también se pueden identificar mediante una estrategia BLAST recíproca. Una vez que se ha identificado una secuencia ortóloga, la función del ortólogo se puede deducir de la función identificada de la secuencia de referencia.

Los genes ortólogos de diferentes organismos tienen funciones altamente conservadas, y muy frecuentemente funciones esencialmente idénticas (Lee y colaboradores. (2002) Genome Res. 12: 493-502; Remm y colaboradores. (2001) J. Mol. Biol. 314: 10 1-1052),. Los genes parálogos, que han divergido a través de la duplicación génica, pueden retener funciones similares de las proteínas codificadas. En tales casos, los parálogos se pueden utilizar intercambiablemente con respecto a ciertas modalidades de la presente invención (por ejemplo, expresión transgénica de una secuencia de codificación) .

Secuencias de Nucleótidos Variantes en las Regiones de no codificación Las secuencias de nucleótidos asociadas con la captación de nitrato se utilizan para generar secuencias de' nucleótidos variantes que tienen la secuencia de nucleótidos de la región no traducida 5' , región no traducida 3' o región de promotor que es aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos original de la SEQ ID NO: 1. correspondiente. Estas variantes luego se asocian con la variación natural en el plasma germinal para atributos componentes relacionados con la NUE. Las variantes asociadas se utilizan como haplotipos marcadores para seleccionar los atributos deseables.

Secuencias de Aminoácidos Variantes de Polipéptidos Asociados con la Captación de Nitrato.

Las secuencias de aminoácidos variantes de los polipéptidos asociados con la captación de nitrato son generadas. En este ejemplo, se altera un aminoácido. Específicamente, las estructuras de lectura abierta se revisan para determinar la alteración de aminoácidos apropiada. La selección del aminoácido para el cambio se hace al consultar la alineación de proteínas (con los otros ortólogos y otros miembros de la familia génica de varias especies) . Un aminoácido se selecciona que se considera que no está bajo alta presión de selección (no altamente conservado) y que es más bien fácilmente sustituido por un aminoácido con características químicas similares (es decir cadena lateral funcional similar) . Utilizando una alineación de proteína, se puede cambiar un aminoácido apropiado. Una vez que se identifica el aminoácido dirigido, el procedimiento resumido en la presente es seguido. Las variantes que tienen aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de secuencia de ácido nucleico se generan utilizando este método. Estas variantes luego se asocian con la variación natural en el plasma germinal para los atributos componentes relacionados con la NUE. Los variantes asociadas se utilizan como haplotipos marcadores para seleccionar los atributos deseables.

La presente invención también incluye polinucleótidos optimizados para la expresión en organismos diferentes. Por ejemplo, tal expresión del polinucleótido en una planta de maíz, las secuencias se puede alterar para tener en cuenta las preferencias de codón especificas y para alterar el contenido de GC de acuerdo con urray, y colaboradores, supra. La utilización de codón de maiz para 28 genes de plantas de maiz se lista en la Tabla 4 de Murray, y colaboradores, supra.

Los ácidos nucleicos asociados con la captación de nitrato de la presente invención comprenden polinucleótidos asociados con la captación de nitrato aislados que son inclusivos de: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido asociado con la captación de nitrato y variantes conservativamente modificadas y polimórficas del mismo; (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con los polinucleótidos de (a) o (b) ; (c) secuencias complementarais de polinucleótidos de (a) o (b) .

Construcción de Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden hacer utilizando (a) métodos recombinantes estándares, (b) técnicas sintéticas o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, los polinucleótidos . de la presente invención serán clonados, amplificados o de otra manera construidos de un hongo o bacteria .

Los ácidos nucleicos pueden comprender convenientemente secuencias además de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, un sitio de multiclonación que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasa se puede insertar en el ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido. También, secuencias traducibles se puede insertar para ayudar en el aislamiento de polinucleótido traducido en la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un medio convenientemente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención - excluyendo la secuencia de polinucleótido - es opcionalmente un vector, adaptador, o enlazador para clonar y/o expresar un polinucleótido de la presente invención. Las secuencias adicionales se pueden adicionar a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido, o para mejorar la introducción del polinucleótido de una célula. Típicamente, la longitud de un ácido nucleico de la presente invención menos la longitud de polinucleótido de la presente invención es menor que 20 pares de kilobase, frecuentemente menor que 15 kb, y frecuentemente menor que 10 kb. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y enlazadores es bien conocido en la técnica. Los ácidos nucleicos ejemplares incluyen tales vectores como: M13, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda gtlO, lambda gtll, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, lambda DASH II, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, p E15, SuperCos 1, SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pBS+/-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'SS, pGEM, pSK+/-, pGEX, pSPORTI y II, pOPRSVI CAT, pOPl3 CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pOG44, pOG45, pFRT GAL, pNE0 GAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSlox y lambda OSElox. Los vectores opcionales para la presente invención, incluyen pero no están limitados a, lambda ZAP II y pGEX. Para una descripción de varios ácidos nucleicos ver, por ejemplo, Stratagene Clgoning Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA) ; y, Amersham Life Sciences, Inc, Catalog ? 97 (Arlingto Heights, IL) .

Métodos Sintéticos Para Construir ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden preparar mediante la síntesis clínica directa por métodos tal como el método de fosfotriéster de Narang, y colaboradores, (1979) Meth. Enzymol. 68:90-9; el método de fosfodiéster de Brown, y colaboradores, (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-51; el método de dietilfosforamidita de Beaucage, y colaboradores, (1981) Tetra. Letts. 22 (20) : 1859-62; el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage, y colaboradores, supra, utilizando un sintetizador automatizado, por ejemplo como es descrito en Needham-VanDevanter, y colaboradores, (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-68; y el método de soporte sólido de la Patente Norteamericana No. 4,458,066. La síntesis química generalmente produce un oligonucleótido de una sola hebra. Esto se puede convertir en un DNA de doble hebra mediante la hibridación con una secuencia complementaria o mediante la polimerización con una DNA polimerasa utilizando la única hebra como una plantilla. Uno de habilidad reconocerá que mientras que la síntesis química de DNA está limitada a secuencias de aproximadamente 100 bases, secuencias más largas se pueden obtener mediante la ligación de secuencias más cortas.

UTRs y Preferencia de Codón En general, la eficiencia traduccional se ha encontrado que es regulada por elementos de secuencia específicos en la región de no codificación no traducida 5' (5' UTR) del RNA. Las porciones de secuencia positivas incluyen la secuencias consensúales de iniciación traduccional (Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15:8125) y la estructura de extremo de RNA GpppG metilo 5<G> 7 (Drummond, y colaboradores, (1985) Nucleic Acids Res. 13:7375). Los elementos negativos incluyen al estructura de tallo-vuelta 5' UTR intramoleculares estables (Muesing, y colaboradores, (1987) Cell 48:691) y las secuencias AUG o estructuras de lectura abierta corta preservidas por AUG apropiado en el 5' UTR (Kozak, supra, Rao, y colaboradores, (1988) Mol. and Cell. Biol. 8:284). Por consiguiente, la presente invención proporciona región 5' y/o 3' UTR para la modulación de la traducción de secuencia de codificación heterólogas.

Además, los segmentos que codifican el polipéptido de los polinucleótidos de la presente invención se pueden modificar para alterar la utilización de codón. La utilización de codón alterada se puede emplear para alterar la eficiencia traduccional y/o para optimizar la secuencia de codificación para la expresión en un hospedero deseado o para optimizar la utilización de codón en una secuencia heteróloga para la expresión en maíz. La utilización de codón en las regiones de codificación de los polinucleótidos de la presente invención se pueden analizar estadísticamente utilizado paquetes de software comercialmente disponibles tal como "Preferencia de Codón" Disponible del Grupo de Computadora Genética de la Universidad de isconsin. Ver, Devereaux, y colaboradores, (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395); or acVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). Asi, la presente invención proporciona una característica de frecuencia de utilización de codón de la región de codificación de por lo menos uno de los polinucleótidos de la presente invención. El número de los polinucleótidos (3 nucleótidos por aminoácido) que se pueden utilizar para determinar una frecuencia de utilización de codón puede ser cualquier número entero de 3 al número de polinucleótidos de la presente invención como es proporcionado en la presente. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias de longitud completa. Un número ejemplar de secuencias para el análisis estadístico puede ser por lo menos 1, 5, 10, 20, 50 o 100.

Entremezclado de Secuencia La presente invención proporciona métodos para el entremezclado de secuencia utilizando polinucleótidos de la presente invención, y composiciones que resultan de los mismos. El entremezclado de secuencia es descrito en la publicación de PCT No. 96/19256. Ver también, Zhang, y colaboradores, (1997) Proc. Nati. Acad. Sci USA 94:4504-9; and Zhao, y colaboradores., (1998) Nature Biotech 16:258-61. Generalmente, el entremezclado de secuencia proporciona un medio para generar librerías de polinucleótidos que tienen una característica deseada, que puede ser seleccionada o clasificada. Las librerías de polinucleótidos recombinantes se generan de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada, que comprenden regiones de secuencia, que tienen identidad de secuencia sustancial y pueden ser recombinados homólogamente in vitro o in vivo. La población de polinucleótidos recombinados de secuencia comprende una subpoblación de polinucleótidos que poseen características deseadas o ventajosas y que se pueden seleccionar mediante un método de selección o clasificación apropiado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo capaz de ser seleccionado o detectado en este sistema de clasificación, y pueden incluir propiedades de: una proteína codificada, un elemento transcripcional , una transcripción de control de secuencia, procesamiento de RNA, estabilidad de RNA, conformación de cromatina, traducción u otra propiedad de expresión de un gen o transgén, un elemento replicativo, un elemento de enlace de proteína o los similares, tal como cualquier característica que confiere una propiedad seleccionable o detectable. En algunas modalidades, la característica seleccionada será un Km y/o Kcat alterado sobre la proteína de tipo silvestre como es proporcionado en la presente. En otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado del entremezclado de secuencia tendrá una afinidad de enlace de ligando mayor que el polinucleótido de tipo silvestre no entremezclado. En todavía otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado del entremezclado de secuencia tendrá un pH alterado óptimo como es comparado con el polinucleótido de tipo silvestre no entremezclado. El incremento en tales propiedades puede ser por lo menos 110%, 120%, 130%, 140% o mayor que 150% de valor de tipo silvestre. Casetes de Expresión Recombinantes La presente invención además proporciona casetes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de presente invención. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polinucleótido deseado de la presente invención, por ejemplo un cDNA o una secuencia genómica que codifica un polipéptido bastante largo para codificar una proteina activa de la presente invención, se puede utilizar para construir un cásete de expresión recombinante que puede ser introducido en la célula hospedera deseada. Un cásete de expresión recombinante típicamente comprenderá un polinucleótido en la presente invención operablemente enlazado a secuencias reguladoras de iniciación transcripcional que dirigirá la transcripción del polinucleótido en la célula hospedera propuesta, tales como tejidos de una planta transformada.

Por ejemplo, los vectores de expresión de planta pueden incluir (1) un gen de planta clonado bajo el control transcripcional de la secuencia reguladora 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Tales vectores de expresión de planta también pueden contener si es deseado una región reguladora de promotores (por ejemplo, una que confiere expresión inducible o constitutiva, ambientalmente o desarrolladamente regulada o específica/selectiva de célula o tejido), un sitio de inicio de iniciación de transcripción como un sitio de enlace de ribosoma, una señal de procesamiento de RNA, un sitio de alineación transcripción y/o una señal de poliadenilacion.

Un fragmento de promotor de planta se puede emplear el cual dirigirá la expresión de un polinucleótido de la presente invención en todos los tejidos de una planta regenerada. Tales promotores son referidos en la presente como promotores "constitutivos" y son activos bajo la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen el 1'- o 2'- promotor derivado de T-DNA de Agrobacterium turnefaciens, el promotor Smas, el promotor de cinamil alcohol deshidrogenasa (Patente Norteamericana No. 5,683,439), el promotor Nos, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, el promotor 35S de virus de mosaico de coliflor (CaMV) , como es descrito en Odell, y colaboradores, (1985) Nature 313:810-2; actina de arroz (McElroy, y colaboradores, (1990) Plant Cell 163-171); ubicuitina . (Christensen, y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 12:619-632 and Christensen, y colaboradores, (1992) Plant Mol Biol. 18:675-89); pE U (Last, y colaboradores, (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-8); MAS (Velten, y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2723-30); histona H3 de maíz (Lepetit, ,y colaboradores, (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-85; and Atanassvoa, y colaboradores, (1992) Plant Journal 2 (3) :291-300) ; promotor ALS , como es descrito en la Solicitud de PCT No. WO 96/30530; y otras regiones de iniciación de transcripción de varios genes de plantas conocidos para aquellos de habilidad. Para la presente invención la ubicuitina es el promotor preferido para la expresión en plantas monocotiledóneas .

Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente invención en un tejido especifico o de otra manera puede estar bajo el control ambiental o de desarrollo más preciso. Tales promotores son referidos aqui como promotores "inducibles". Las condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción mediante los promotores inducibles incluyen ataque por patógenos, condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adhl, que es inducible por hipoxia o estrés de frío, el promotor Hsp70, que es inducible por estrés de calor, y el promotor PPDK, que es inducible por luz.

Ejemplos de promotores bajo control de desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción solamente, o preferencialmente en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, frutos, semillas o flores. La operación de un promotor también puede variar dependiendo de su ubicación en el genoma. Así, un promotor inducible puede llegar a ser completamente o parcialmente constitutivo en ciertas ubicaciones .

Si se desea la expresión de polipéptido, es generalmente deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región de codificación de polinucleótido . La región de poliadenilación puede ser derivada en una variedad de genes de planta, o de T-DNA. La secuencia de extremo 3' que es adicionada puede ser derivada de, por ejemplo, los genes nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente otro gen de planta, o menos de preferencia de cualquier otro gen eucariótico. Ejemplos de tales elementos reguladores incluyen, pero no están limitados a, regiones de terminación 3' y/o poliadenilación tales como aquellos del gen nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan, y colaboradores, (1983) Nucleic Acids Res. 12:369-85); el gen inhibidor de proteinasa de papa II (PINII) (Keil, y colaboradores, (1986) Nucleic Acids Res. 14:5641-50; y An, y colaboradores, (1989) Plant Cell 1 :115-22); y el gen 19S de CaMV (Mogen, y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:1261-72).

Una secuencia de intrón se puede adicionar a la región no traducida 5' o la secuencia de codificación de la secuencia de codificación parcial para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción en las constructos de expresión tanto de plantas como de animales se ha mostrado que incrementa la expresión génica en ambos de los niveles de mRNA de proteina hasta 1000 veces (Buchman and Berg, (1988) Mol. Cell Biol. 8:4395-4405; Callis, y colaboradores, (1987) Genes Dev. 1:1183-200). Tal mejoramiento del intrón de la expresión génica es típicamente más grande cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de intrones de maíz intrón 1, 2 y 6 Adhl-S el intrón de Bronce-1 son conocidos en la técnica. Ver generalmente The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, eds., Springer, New York (1994).

Las secuencias de señal de planta, que incluyen, pero no limitadas a secuencias de DNA/RNA de codificación de péptido de señal que dirigen las proteínas a la matriz extracelular de la célula de planta ( Dratewka-Kos, y colaboradores, (1989) J. Biol. Chem. 264:4896-900), tal como el gen de extensión de Nicotiana plumbagínifolia (DeLoose, y colaboradores., (1991) Gene 99:95-100); con proteínas objetivo a la vacuola, tal como el gen esporamina de camote ( atsuka, y colaboradores., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:834) y el gen lectina de cebada ( ilkins, y colaboradores, (1990) Plant Cell, 2:301-13); péptido de señal que causan que las proteínas sean secretadas, tal como aquella de PRIb (Lind, y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 18:47-53) o la alfa amilasa de cebada (BAA) (Rahmatullah, y colaboradores., (1989) Plant Mol. Biol. 12:119, incorporado en la presente por referencia), o péptidos de señal que dirigen las proteínas en las plastidas tal como la enoil-Acp reductasa de semilla de colza (Verwaert, y colaboradores, (1994) Plant Mol. Biol. 26:189-202) son útiles en la invención.

El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente invención típicamente comprenderá un gen marcador, que contiene un fenotipo seleccionable en células de planta. Usualmente, el gen marcador seleccionable, codificará la resistencia a antibiótico, con genes adecuados que incluyen genes que codifican la resistencia al antibiótico espectinomicina (por ejemplo, el gen aada) , el gen estreptomicina fosfotransferasa (SPT) que codifica para la resistencia a estreptomicina, el gen neomicina fosfotransferasa (NPTII) que codifica la resistencia a canamicina o geneticina, el gen higromicina fosfotransferasa (HPT) que codifica la resistencia a higromicina, los genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de acetoláctato sintasa (ALS) , en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen acetoláctato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a tal resistencia en particular las mutaciones S4 y/o Hra) , genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibi la acción de glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) , u otros de tales genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia de herbicida basta, y el gen ALS codifica la resistencia de herbicida clorsulfurón .

Vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e •incluyen vectores derivados del plásmido de inducción de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers, y colaboradores. (1987), Meth. Enzymol. 153:253-77. Estos vectores son vectores de integración de la planta en que en la transformación, los vectores se integran a una porción de vector de DNA en el genoma de la planta hospedera. Los vectores de A. tumefaciens ejemplares útiles en la presente son los plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl, y colaboradores, (1987) Gene 61:1-11, and Berger, y colaboradores, (1989) Proc. Nati Acad. Sci USA, 86:8402-6. Otro vector útil en la presente es el plásmido pBI101.2 que es disponible de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) . Expresión de Proteínas en Células Hospederas Utilizando los ácidos nucleicos de la presente invención, se puede expresar una proteína en la presente invención en una célula recombinantemente diseñada tal como bacteria, levadura, insecto, mamífero de preferencia células de planta. Las células producen la proteína en una condición no natural (por ejemplo, en cantidad, composición, ubicación y/o tiempo) , debido a que se han alterado genéticamente a través de la intervención humana para hacerlo asi.

Se espera que aquellos de habilidad en la técnica estén conscientes de los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteina de la presente "invención. No será hecho el intento para describir en detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas.

En breve resumen, la expresión de ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína de la presente invención típicamente será logrado al enlazar operablemente, por ejemplo el DNA o cDNA a un promotor (que es ya sea constitutivo o inducible) , seguido por la incorporación en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en ya sea procariotas o eucariotas. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de la transcripción y la transducción, secuencias de iniciación, y promotores útiles para la regulación de la expresión del DNA que codifica una proteína de la presente invención. Parea obtener alto nivel de expresión de un gen clonado, es deseable construir vectores de expresión que contienen, en lo mínimo, un promotor fuete, tal como ubicuitina, para dirigir la transcripción, un sitio de enlace de un ribosoma para la iniciación transcripcional y un terminador de transcripción/traducción. Los promotores constitutivos se clasifican como que proporcionan una gama de expresión constitutiva. Asi, algunos son promotores constitutivos débiles, y otros son promotores constitutivos fuertes. Generalmente, por "promotor débil" se propone un promotor que induce la expresión de una secuencia de codificación a un bajo nivel. Por "bajo en nivel" se proponen niveles de aproximadamente 1/10,000 transcriptos y aproximadamente 1/100,000 transcriptos a aproximadamente 1/500,000 transcriptos. A la inversa, un "promotor fuerte" induce la expresión de una secuencia de codificación en un "alto nivel" a aproximadamente 1/10 transcriptos a aproximadamente 1/100 transcriptos a aproximadamente 1/1,000 transcriptos.

Uno de habilidad reconocerla que las modificaciones podrían ser hechas a una proteína de la presente invención sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones se pueden hacer para facilitar la clonación, expresión, o incorporación de la molécula de dirección en una proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas para aquellos de habilidad en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina adicionada en el amino terminal para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) colocado en cualquier terminal para crear sitios de restricción convenientemente localizados o codones de terminación o secuencias de purificación.

Expresión en Procariotas Las células procarióticas se pueden utilizar como hospederos para la expresión. Los procariotas más frecuentemente se representan por varias cepas de E. coli; sin embargo, también se puede utilizar otras cepas microbianas. Las secuencias de control procarióticas comúnmente utilizadas que se definen en la presente incluyen promotores para la iniciación de transcripción, opcionalmente con un operador, junto con la secuencia del sitio de enlace de ribosoma, incluyen tales promotores comúnmente utilizados tal como beta lactamasa (penicilinasa) y sistemas de promotor de lactosa (lac) (Chang, et ah, (1977) Nature 198:1056), el sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, et ah, (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) y el promotor PL derivado de lamda y el sitio de enlace de ribosoma del gen N (Shimatake, y colaboradores., (1981) Nature 292:128). La inclusión de marcadores de selección en vectores de DNA transfectados en E. coli también es útil. Ejemplos de tales marcadores incluyen genes que especifican la resistencia a ampicilina, tetraciclina o cloramfenicol .

El vector se selecciona para permitir la introducción del gen de interés en la célula hospedera apropiada. Los vectores bacterianos son típicamente de origen de plásmido o fago. Las células bacterianas apropiadas se infectan con partículas de vector de fago o se transfectan con el DNA de vector de fago desnudo. Si se utiliza un vector de plásmido, las células bacterianas se transfectan con el DNA del vector de plásmido. Los sistemas de expresión para expresar una proteína de la presente invención están disponibles utilizando Bacillus sp. y Salmonella (Palva, y colaboradores, (1983) Gene 22:229-35; Mosbach, y colaboradores, (1983) Nature 302:543-5). El vector de plásmido pGEX-4T-l de Pharmacia es el vector de expresión de E. coli preferido para la presente invención.

Expresión en Eucariotas Una variedad de sistemas de expresión eucarióticos tales como levadura, líneas de células de insecto, células de plantas y mamíferas, son conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Como es explicado brevemente enseguida, la presente invención se puede expresar en estos sistemas eucarióticos. En algunas modalidades, las células de plantas transformadas/transfectadas, como es discutido infra, se emplean como sistemas de expresión para la producción de las proteínas de la presente invención.

La síntesis de proteínas heterólogas en levadura es bien conocida. Sherman, y colaboradores, (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory es un trabajo bien reconocido que describe los diversos métodos disponibles para producir la proteína de levadura. Dos levaduras ampliamente utilizadas para la producción de proteínas eucarióticas son Saccharo yces cerevisiae y Pichia pastoris. Los vectores, cepas y protocolos para la expresión en Saccharomyces y Pichia con conocidos en la técnica y disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen) . Los vectores adecuados usualmente tienen secuencias de control de expresión, tales como promotores, que incluyen 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de determinación y los similares como sea deseado.

Una proteína de la presente invención, una vez expresada, puede ser aislada de la levadura al lisar las células y al aplicar técnicas de aislamiento de proteína estándares a los lisados o las pelotillas. El monitoreo del proceso de purificación se puede realizar al utilizar técnicas de manchado de Western o radioinmunoensayo de otras técnicas de inmunoensayo estándares.

Las secuencias que codifican proteínas de la presente invención también se pueden ligar a varios vectores de expresión para el uso en la transfección de cultivos de células de, por ejemplo, origen mamífero, de insecto o de planta. Los sistemas de células mamíferas frecuentemente estarán en la forma de monocapas de células auque también se pueden utilizar suspensiones de células mamíferas. Un número de lineas de células hospederas adecuadas capaces de expresar proteínas .intactas se han desarrollado en la técnica, e incluyen- las líneas de células HEK293, BHK21 y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tal como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, el promotor CMV, un promotor HSV tk o promotor pgk ( fosfoglicerato quinasa) promotor) , un aumentador (Queen, y colaboradores, (1986) Immunol. Rev. 89:49) y sitios de información de procesamiento necesarios, tal como los sitios de enlace de ribosoma, sitios de empalme de RNA, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición de poli A Ag T SV40), y secuencias terminadoras transcripcionales . Otras células animales útiles para la producción de proteínas de la presente invención están disponibles, por ejemplo, del catálogo de la Colección Americana de Cultivos Tipo de Líneas de Células e Hibridomas (7th edición, 1992) .

Vectores apropiados para expresar proteínas de la presente invención en células de insecto son usualmente derivados de baculovirus SF9. Las líneas de células de insectos adecuadas incluyen larvas de mosquito, gusano de seda, gusano devastador, polilla y líneas de células de Drosophila tal como la línea de células Schneider (ver, por ejemplo, Schneider, (1987) J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353- Como con la levadura, cuando se emplean células hospederas de animales o plantas superiores, las secuencias terminadoras de poliadenilación o transcripción son típicamente incorporadas en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de hormona de crecimiento bovino. Las secuencias para el empalme preciso del transcripto también se pueden incluir. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón de VP1 SV40 (Sprague y colaboradores, J. Virol. 45:773-81 (1983)). Adicionalmente, secuencias de gen par controlar la replicación en la célula hospedera se pueden incorporar en el vector tal como aquellos encontrados en los vectores del tipo virus del papiloma bovino (Saveria-Campo, "Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector", in DNA Cloning: A Practical Approach, vol. II, Glover, ed., IRL Press, Arlington, VA, pp. 213-38 (1985)).

Además, el gen asociado con la captación de nitrato colocado en el vector de expresión de planta apropiado se puede utilizar para transformar células de planta. El polipéptido luego se puede aislar del callo de planta o las células transformadas se pueden utilizar para regenerar plantas transgénicas . Tales plantas transgénicas pueden ser cosechadas, y los tejidos apropiados (semilla u hojas, por ejemplo) se pueden someter a las técnicas de extracción y purificación de proteína a gran escala.

Métodos de Transformación de Plantas Numerosos métodos para introducir genes foráneos en plantas son conocidos y se pueden utilizar para insertar un polinucleótido asociado con la captación de nitrato en un hospedero de planta, incluyendo protocolos de transformación de plantas biológicos y físicos. Ver, por ejemplo iki y colaboradores, "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds, CRC Press, Inc., Boca Ratón, pp. 67-88 (1993). Los métodos elegidos varían con la planta hospedera, e incluyen métodos de transfección química tal como la transferencia génica mediada por el microorganismo, con fosfato de calcio tal como Agrojbacterium (Horsch y colaboradores., Science 227: 1229-31 (1985)), electroporación, microinyeccion y bombardeo biolistico.

Los casetes de expresión y vectores y los métodos de cultivo in vitro para la transformación de la célula de planta o tejido y regeneración de plantas son conocidos y disponibles. Ver, por ejemplo, Gruber y colaboradores, "Vectors for Plant Transíormation", in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, supra , pp. 89-119.

Los polinucleótidos o polipéptidos aislados se pueden introducir en la planta mediante una o más técnicas típicamente utilizadas para dirigir el suministro en células. Tales protocolos pueden variar dependiendo del tipo de organismo, célula, planta o célula de planta, es decir monocotiledónea o dicotiledónea dirigida para la modificación génica. Los métodos adecuados para transformar células de planta incluyen microinyección (Crossway, y colaboradores, (1986) Biotechniques 4:320-334; y la Patente Norteamericana 6,300,543), electroporación (Riggs, y colaboradores, (1986) Proc. Nati. Acad. Sci USA 83:5602-5606, transferencia génica directa (Paszkowski y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración de partículas balísticas (ver, por ejemplo, Sanford, y colaboradores, Patente Norteamericana No. 4,945,050; WO 91/10725; and McCabe, y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:923-926). También ver, Tomes, y colaboradores, "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment" , pp. 197-213 in Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods , eds. O. L. Gamborg & G.C. Phillips. Springer-Verlag Berlín Heidelberg New York, 1995; Patente Norteamericana 5,736,369 (cebolla); Weissinger, y colaboradores, (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, y colaboradores, (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (soja); Christou, y colaboradores, (1988) Plant Physiol 87:671-674 (arroz); Datta, y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:736-740 (maíz); Klein, y colaboradores, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maiz) ; Klein, y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:559-563 (maiz); WO 91/10725 (maiz); Klein, y colaboradores, (1988) Plant Physiol 91:440-444 (maíz); Fromm, y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:833-839; and Gordon-Kamm, y colaboradores, (19¾0) Plant Cell 2:603-618 (maíz); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (London) 311:763-764; Bytebierm, y colaboradores, (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliáceas); De Wet, y colaboradores, (1985) In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman, y colaboradores, pp. 197-209. Longman, NY (polen); Kaeppler, y colaboradores, (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; and Kaeppler, y colaboradores, (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (tranformación mediada por whisker) ; Patente Norteamericana No. 5,693,512 (sonicación) ; D'Halluin, -y colaboradores, (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (electroporación) ; Li, y colaboradores, (1993) Plant Cell Reports 12:250-255; and Christou and Ford, (1995) Annals of Botany 75:407-413 (rice); Osjoda, y colaboradores, (1996) Nature Biotech. 14:745-750; transformación mediada de maiz mediada por Agrobacterium (Patente Norteamericana 5,981,840); sonicación; métodos de whisker de carburo de silicio (Frame, y colaboradores, (1994) Plant J. 6:941-948); métodos de láser (Guo, y colaboradores, (1995) Physiologia Plantarum 93:19-24); métodos de sonicación (Bao, y colaboradores, (1997) Ultrasound in Medicine & Biology 23 : 953-959; Finer and Finer, (2000) Lett Appl Microbiol. 30:406-10; Amoah, y colaboradores, (2001) J Exp Bot 52: 1135- 42) ; métodos de polietilenglicol (Krens, y colaboradores, (1982) Nature 296:72-77); protoplastos de células monocotiledóneas y dicotiledóneas se pueden transformar utilizando la electroporación (Fromm, y colaboradores, (1985) Proc. Nati. Acad. Sci USA 82:5824-5828) y la microinyección (Cross ay, y colaboradores., (1986) Mol Gen. Genet . 202:179- 185) ; todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia .

Transformación mediada por Agrobacterium El método mucho más ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión en plantas está basado en el sistema de transformación natural de Agrobacterium. A. turnefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo patogénicas de plantas, que genéticamente transforman células de plantas. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, llevan genes responsables para la transformación genética de plantas Ver, por ejemplo, Kado, (1991) Crit. Rev. Plant Sci 10:1. La descripción de los sistemas de vector de Agrobacterium y métodos para transferencia génica mediada por Agrobacterium se proporcionan en Gruber, y colaboradores, supra; Miki, y colaboradores, supra; and Moloney, y colaboradores, (1989) Plant Cell Reports 8:238.

De manera similar, el gen se pueden insertar en la región de T-DNA de un plásmido Ti o Ri derivado de A. tumefacíens o A. rhizogenes, respectivamente. Asi, los casetes de expresión se pueden construir como en lo anterior, utilizando estos plásmidos. Muchas secuencias de control son conocidas las cuales cuando se acoplan a una secuencia de codificación heteróloga y se transforma en un organismo hospedero muestran fidelidad en la expresión génica con respecto a la especificidad de tejido/órgano de la secuencia de codificación original. Ver, por ejemplo, Benfey and Chua, (1989) Science 244: 174-81. Las secuencias de control particularmente adecuadas para el uso en estos plásmidos son promotores para la expresión especifica de hoja constitutiva del gen en varias plantas objetivo. Otras secuencias de control útiles incluyen un promotor y terminador del gen nopalina sintasa (NOS) . El promotor y terminador NOS están presentes en el plásmido pARC2, disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo y designada ATCC 67238. Si se utiliza tal sistema, el gen de virulencia (vir) de ya sea el plásmido Ti o Ri también debe estar presente, ya sea junto con la porción de T-DNA, o por la vía de un sistema binario donde el gen vir está presente en un vector separado. Tales sistemas, vectores para el uso en los mismos, y métodos para transformar células de plantas se describen en la Patente Norteamericana No. 4,658,082; Solicitud de Patente Norteamericana No. 913,914, presentada en 1 de Octubre de 1986, como es referenciada en la Patente Norteamericana No. 5,262,306, expedida el 16 de Noviembre de 1993; y Simpson, y colaboradores, (1986) Plant Mol. Biol. 6:403-15 (también referenciada en la patente '306); todos incorporados por referencia en su totalidad.

Una vez construidos, estos plásmidos se pueden colocar en A. rhizogenes o A. turnefaciens y estos vectores utilizar para transformar células de especies de plantas, que son ordinariamente susceptibles a la infección de Fusarium o Alternaría. Varias de otras plantas transgénicas también se contemplan con la presente invención incluyendo pero no limitadas a soja, maíz, sorgo, alfalfa, arroz, trébol, col, plátano, café, apio, tabaco, caupi, algodón, melón y pimiento. La selección de ya sea A. tumefaciens o A. rhizogenes dependerá de la planta que es transformada de esta manera. En general A. tumefaciens es el organismo preferido para la transformación. La mayoría de plantas dicotiledóneas, algunas gimnospermas, y unas pocas plantas monocotiledóneas (por ejemplo, ciertos miembros de la Liliales y Arales) son susceptibles a la infección con A tumefaciens . A. rhizogenes también tiene una amplia gama de hospederos, abarcando la mayoría de dicotiledónea y algunas gimnospermas, que incluyen miembros de Leguminosae, Compositae, y Chenopodiaceae. Las plantas monocotiledóneas ahora se pueden transformar con algo de éxito. La Solicitud de Patente Europea No. 604 662 Al divulga un método para transformar monocotiledónea utilizando Agrobacterium. La Solicitud Europea No. 672 752 Al divulga un método para transformar monocotiledónea con Agrobacterium utilizando el escutelo de embriones inmaduros. Ishida, y colaboradores, discuten método para transformar el maiz al exponer embriones inmaduros a A. tumefaciens (Nature Biotechnology 14 : 745-50 (1996)).

Una vez transformadas, estas células se pueden utilizar para regenerar plantas transgénicas. Por ejemplo, las plantas completas se pueden infectar con estos vectores al lesionar la planta luego al introducir el vector en el sitio lesionado. Cualquier parte de la planta puede ser lesionada, incluyendo hojas, tallos y raices. Alternativamente, el tejido de planta, en la forma de una explanta, tal como tejido cotiledonario, o discos de hoja, se pueden inocular con estos vectores y cultivar bajo condiciones, que promueven la regeneración de la planta. Las raices o retoños transformados por la inoculación del tejido de planta con A. rhizogenes o A. tumefaciens, que contienen el gen que codifica . para la enzima de degradación de fumonisina, se puede utilizar como una fuente de tejido de planta para regenerar plantas transgénicas resistentes a fumonisina, ya sea por la via de embriogénesis somática u organogénesis. Ejemplos de tales métodos para regenerar tejido de planta se divulgan en Shahin, (1985) Theor. Appl . Genet. 69:235-40; Patente Norteamericana No. 4,658,082; Simpson*, y colaboradores, supra; y las Solicitudes de Patentes Norteamericanas Ros. 913,913 y 913,914, ambas presentadas el 1 de Octubre de 1986, como es referenciado en la Patente Norteamericana No. 5,262,306, expedida el 16 de Noviembre de 1993, la descripciones completas de las mismas incorporadas en la presente por referencia.

Transferencia Génica Directa A pesar del hecho de que el intervalo de hospederos para la transformación mediada por Agrobacterium es amplio, algunas especies de cultivo de cereal mayores y gimnospermas generalmente han sido recalcitrantes a este modo de transferencia génica, auque algo de éxito se ha logrado recientemente en el arroz (Hiei, y colaboradores, (1994) The Plant Journal 6:271-82). Varios métodos de transformación de plantas, colectivamente referidos como transferencia génica directa, se han desarrollado como una alternativa a la transformación mediada por Agrobacterium.

Un método generalmente aplicable de transformación de plantas y la transformación mediada por microproyectiles, donde el DNA es portado en la superficie de microproyectiles que miden aproximadamente 1 a 4 µ??. El vector de expresión se introduce en tejidos de planta con un dispositivo biolistico que acelera los microproyectiles a velocidades de 300 a 600 m/s que es suficiente para penetrar las paredes de la célula planta y las membranas (Sanford, y colaboradores, (1987) Part. Sci Technol. 5:27; Sanford, (1988) Trends Biotech 6:299; Sanford, (1990) Physiol. Plant 79:206; and Klein, y colaboradores, (1992) Biotechnology 10:268).

Otro método para el suministro de DNA a las plantas es la sonicación de células objetivo como es descrito en Zang, y colaboradores, (1991) Bio Technology 9:996. Alternativamene, el liposoma o fusiones de esferoplasto se han utilizado para introducir vectores de expresión en las plantas. Ver, por ejemplo, Deshayes, y colaboradores, (1985)· EMBO J. 4:2731; and Christou, y colaboradores, (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3962. La captación directa de DNA de amplios protoplastos utilizando la precipitación de CaCl2, alcohol polivinilico, o poli-L-ornitina también se reportaron. Ver, por ejemplo, Hain, y colaboradores, (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161; and Draper, y colaboradores, (1982) Plant Cell Physiol. 23:451.

La electroporación de protoplastos y células completas y tejido también se ha descrito. Ver, por ejemplo, • Donn, y colaboradores, (1990) Abstracts of the VIIth Int'l. Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53; D'Halluin, y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:1495-505; y Spencer, y colaboradores, (1994) Plant Mol. Biol. 24:51- 61.

Incremento de la actividad y/o nivel de un polipéptido asociado con la captación de nitrato Se proporcionan métodos para incrementar la actividad y/o nivel del polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención. Un incremento de nivel y/o la actividad del polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención se puede lograr al proporcionar a la planta un polipéptido asociado con la captación de nitrate. El polipéptido asociado con la captación de nitrato se puede proporcionar al introducir la secuencia de aminoácidos que codifica el polipéptido asociado con la captación de nitrato en la planta, al introducir en la planta una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido asociado con la captación de nitrato o alternativamente al modificar una posición genómica que codifica el polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención.

Como se discute en otra parte en la presente, muchos métodos con conocidos en la técnica para proporcionar un polipéptido a una planta que incluyen pero no limitados a, introducción directa del polipéptido en la planta, introducción en la plana (transientemente o establemente) de un constructo de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la actividad de utilización de nitrógeno aumentada. También se reconoce que los métodos de la invención pueden emplear un polinucleótido que no es capaz de dirigir, en la planta transformada, y la expresión de una proteina o RNA. Asi, el nivel y/o actividad de un polipéptido asociado con la captación de nitrato se puede incrementar al alterar el gen que codifica el polipéptido asociado con la captación de nitrato o su promotor. Ver, por ejemplo, Kmiec, Patente Norteamericana No. 5,565,350; Zarling, y colaboradores, PCT/US93/03868. Por lo tanto, las plantas mutagenizadas que llevan mutación en los genes asociados con la captación de nitrato, donde las mutaciones incrementan la expresión del gen asociado con la captación de nitrato o incrementan la actividad asociada con la captación de nitrato del polipéptido asociado con la captación de nitrato codificado son proporcionadas.

Reducción de la actividad y/o nivel de un polipéptido asociado con la captación de nitrato Se proporcionan métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención al transformar una célula de planta con un cásete de expresión que expresa un polinucleótido que inhibe la expresión del polipéptido asociado con la captación de nitrato. El polinucleótido puede inhibir la expresión del polipéptido asociado con la captación de nitrato directamente, al prevenir la transcripción o traducción del RNA mensajero asociado con la captación de nitrato, o indirectamente, al codificar un polipéptido que inhibe la transcripción o traducción de un gen asociado con la captación de nitrato que codifica el polipéptido asociado con la captación de nitrato. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son bien conocidos en la técnica, y cualquier método tal se puede utilizar en la presente invención para inhibir la expresión del polipéptido asociado con la captación de nitrato. Muchos métodos se pueden utilizar para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido asociado con la captación de nitrato. Además, más de un método se puede utilizar para reducir la actividad de un solo péptido asociado con la captación de nitrato. 1. Métodos Basados en Polinucleótidos : En algunas modalidades de la presente invención, una planta se transforma con un cásete de expresión que es capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de un polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención. El término "expresión" como se utiliza en la presente se refiere a la biosintesis de un producto génico, que incluye la transcripción y/o traducción del producto génico. Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención, un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de por los menos un polipéptido asociado con la captación de nitrato es un cásete de expresión capaz de producir una molécula de RNA que lleve al transcripción y/o traducción de por lo menos un polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención. La "expresión" o "producción" de una proteina o polipéptido a partir de una molécula de DNA se refiere a la transcripción y traducción de la secuencia de codificación para producir la proteina o polipéptido, mientras que la "expresión" o "producción" de una proteina o polipéptido a partir de una molécula de RNA se refiere a la traducción de la secuencia de codificación de RNA para producir la proteina polipéptido .

Ejemplos de polinucleótidos que inhiben la expresión de un polipéptido asociado con la captación de nitrato se dan enseguida. i. Supresión/'Cosupresión de Sentido En algunas modalidades de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido asociado con captación de nitrato que se puede obtener mediante la supresión o cosupresión de sentido. Para la cosupresión, un cásete de expresión se diseña para expresar una molécula de RNA correspondientes a todo o parte de una RNA mensajero que codifica un polipéptido asociado con la captación de nitrato y la orientación de "sentido". La sobrexpresión de la molécula de RNA puede dar por resultado la expresión reducida de gen nativo. Por consiguiente, múltiples lineas de plantas transformadas con cásete de expresión de cosupresión se clasifican para identificar aquellas que muestran la inhibición más grande de la expresión de polipéptido asociado con la captación de nitrato.

El polinucleótido utilizado para la construcción puede corresponder a toda o parte de la secuencia que codifica al polipéptido asociado con la captación de nitrato, toda o parte de la región no traducida 5' y/o 3' de un transcripto de polipéptido asociado con la captación de nitrato, o toda o parte de tanto la secuencia de codificación como la región no traducida de un transcripto que codifica un polipéptido asociado con la captación de nitrato. En algunas modalidades en donde el polinucleótido comprende toda o parte la región de codificación para el polipéptido asociado con la captación de nitrato, el cásete de expresión se diseña para eliminar el codón de inicio del polinucleótido de modo que nada de producto de proteina será traducido.

La cosupresión se puede utilizar para inhibir la expresión de genes de plantas para producir plantas que tienen niveles de proteina indetectables para las proteínas codificadas por estos genes. Ver, por ejemplo, Broin, y colaboradores, (2002) Plant Cell 14:1417-1432. La cosupresión también se puede utilizar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,942,657. Métodos para utilizar la cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en planta se describen en Flavell, y colaboradores, (1994) Proc. Nati. Acad. Sd. USA 91:3490-3496; Jorgensen, y colaboradores, (1996) Plant Mol Biol. 31:957-973; Johansen and Carrington, (2001) Plant Physiol 126:930-938; Broin, y colaboradores, (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdi k, y colaboradores, (2002) Plant Physiol 129:1723-1731; Yu, y colaboradores, (2003) Phytochemistry 63:753-763 y Patente Norteamericanas Nos. 5,034,323, 5,283,184 and 5,942,657; cada una de las cuales se incorporan en la presente por referencia. La eficiencia de cosupresion se puede incrementar al incluir una región poli-dT en el cásete de expresión en la posición 3' a la secuencia de sentido y 5' de la señal de poliadenilación . Ver, la Publicación de Patente Norteamericana No. 2002/0048814, incorporada en la presente por referencia. Típicamente, tal secuencia de nucleótidos tiene identidad de secuencia sustancial a la secuencia del transcripto de gen endógeno, óptimamente más grande que aproximadamente 65% de identidad de secuencia, más óptimamente, más grande que aproximadamente 85% de identidad de secuencia, mucho más óptimamente mayor que aproximadamente 95% de identidad de secuencia. Ver las Patentes Norteamericanas Nos. 5,283,184 y 5,034,323; incorporadas en al presente por referencia. ii. Supresión de Antisentido En algunas modalidades de la invención, la inhibición de la expresión del polipéptido asociado con la captación de nitrato se puede obtener mediante la supresión de antisentido. Para la supresión de antisentido, el cásete de expresión se diseña para expresar una molécula RNA complementaria a todo o parte de un RNA mensajero que codifica al polipéptido asociado con la captación de nitrato. La sobreexpresion de la molécula de RNA de antisentido puede dar por resultado la expresión reducida de un gen nativo. Por consiguiente, múltiples lineas de plantas transformadas con el cásete de expresión de supresión antisentido se clasifican para identificar aquellas que muestran la inhibición más grande de la expresión de polipéptido asociado con la captación de nitrato.

Los polinucleótidos para el uso en la supresión de antisentido puede corresponder a todo o parte del complemento de la secuencia que codifica el polipéptido asociado con la captación de nitrato, todo o parte del complemento de la región no traducida 5' y/o 3' del transcripto asociado con la captación de nitrato, o todo o parte del complemento de tanto secuencia de codificación, la región no traducida de un transcripto que codifica e¿L polipéptido asociado con la captación de nitrato. Además, el polinucleótido antisentido puede ser completamente complementario (es decir, 100% idéntico al complemento de la secuencia objetivo) o parcialmente complementaria (es decir, menor que 100% idéntico al complemento de la secuencia objetivo) a la secuencia objetivo. La supresión de antisentido se puede utilizar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,942,657. Además, porciones de los nucleótidos de antisentido se puede utilizar para interrumpir la expresión del gen objetivo. Generalmente, la secuencia de por lo menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550, o más grandes se pueden, utilizar. Los métodos para usar la supresión antisentido para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen, por ejemplo, en Liu, y colaboradores, (2002) Plant Physiol. 129: 1732-1743 y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,759,829 y 5,942,657, cada una de la's cuales es incorporada en al presente por referencia. La eficiencia de supresión de antisentido se puede incrementar al incluir una región poli-dT en el cásete de expresión en la posición 3' a la secuencia de antisentido y 5' de la señal de poliadenilación . Ver, la Publicación de Patente Norteamericana No. 2002/0048814, incorporada en la presente por referencia. iii. Interferencia de RNA de Doble Hebra En algunas modalidades de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido asociado con la captación de nitrato se puede obtener mediante la interferencia de RNA de doble hebra (dsRNA) . Para la interferencia de dsRNA, una molécula de RNA de sentido similar a aquella descrita en lo anterior para la cosupresión y una molécula de RNA de antisentido que es completamente o parcialmente complementaria en la molécula de RNA de sentido se expresa en la misma célula, dando por resultado la inhibición de la expresión del RNA mensajero endógeno correspondiente.

La expresión de las moléculas de sentido y de antisentido se puede realizar al diseñar el cásete de expresión para comprender tanto una secuencia de sentido como una secuencia de antisentido. Alternativamente, los casetes de expresión separados se pueden utilizar para la secuencia de sentido y de antisentido. Múltiples lineas de plantas transformadas con el cásete de expresión de interferencia de dsRNA o cásete de expresión y luego se clasifican para identificar lineas de plantas que muestran la inhibición más grande de la expresión de polipéptidos asociado con la captación de nitrato. Métodos para usar la interferencia de dsRNA para inhibir la expresión de genes de planta endógenos se describen en Waterhouse, y colaboradores, (1998) Proc. Nati. Acad. Sci USA 95:13959-13964, Liu, y colaboradores, (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743, y WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631, y WO 00/49035; y cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. iv. Interferencia de RNA de Horquilla e Interferencia de RNA de Horquilla que contiene Intrón En alguna modalidad de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido asociado con la captación de nitrato se puede obtener mediante la interferencia de RNA de horquilla (hpRNA) o de interferencia de RNA de horquilla que contiene intrón (ihpRNA) . Estos métodos son altamente eficientes en inhibir la expresión de genes endógenos. Ver, Waterhouse and Helli ell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38 y las referencias citadas en la misma.

Para la interferencia de hpRNA, el cásete de expresión se diseña para expresar una molécula de RNA que se híbrida consigo misma para formar una estructura de horquilla que comprende una región de vuelta y una sola hebra y un tallo emparejado de bases. La región de tallo emparejado de bases comprende una secuencia de sentido correspondiente a todo o parte de RNA mensajero endógeno que codifica el gen cuya expresión va a ser inhibida, y una secuencia de antisentido que es completamente o parcialmente complementaria a la secuencia de sentido. Alternativamente, la región de tallo emparejada de bases puede corresponder a una porción de una secuencia de promotor que controla la expresión del gen que es inhibido. Así, la región de tallo emparejado de bases de la molécula generalmente determina la especificidad de la interferencia de RNA. Las moléculas de hpRNA son altamente eficientes en inhibir la expresión de genes endógenos, y la interferencia de RNA que las inducen es heredada por la generación subsecuente de plantas. Ver, por ejemplo, Chuang and Meyerowitz, (2000) Proc. Nati. ñcad. Sci USA 97:4985-4990; Stoutj esdij k, y colaboradores, (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; and Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Métodos para utilizar la interferencia de hpRNA para inhibir o silenciar la expresión de genes se describen, por ejemplo en Chuang and Meyerowitz, (2000) Proc. Nati. Acad. Sd. USA 97:4985-4990; Stout esdi k, y colaboradores, (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini y colaboradores, BMC Biotechnology 3:7, y la Publicación de Patente Norteamericana No. 2003/0175965; cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. Un ensayo transiente para la eficiencia constructos de hpRNA para silenciar la expresión génica in vivo se ha descrito por Panstruga, y colaboradores, (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, incorporada en la presente por referencia .

Para ihpRNA, las moléculas de interferencia tiene la misma estructura general como para hpRNA, pero la molécula de RNA adicionalmente comprende un intrón que es capaz de ser empalmado en la célula en la cual se expresa el ihpRNA. El uso de un intrón minimiza el tamaño de la vuelta en la molécula de RNA de horquilla después del empalme, y esto incrementa la eficiencia de interferencia. Ver, por ejemplo, Smith, y colaboradores, (2000) Nature 407:319-320. De hecho, Smith, y colaboradores, muestran 100% de supresión de la expresión de gen endógeno que usa la interferencia mediada por ihpRNA. Métodos para utilizar la interferencia de ihpRNA para inhibir la expresión de genes en planta endógenos son descritos, por ejemplo, en Smith, y colaboradores, (2000) Nature 407:319-320; Wesley, y colaboradores, (2001) Plant J. 27:581-590; Wang and Waterhouse, (2001) Curr. Opin. Plant Biol 5:146-150; Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. £ev. Genet. 4:29-38; Helliwell and Waterhouse, (2003) Methods 30:289-295, y la Publicación de Patente Norteamericana No. 2003/0180945, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia.

El cásete de expresión para la interferencia de hpRNA también se puede diseñar tal que la secuencia de sentido y la secuencia de antisentido no corresponden a un RNA endógeno. En esta modalidad, la secuencia de sentido y antisentido flanquea una secuencia de vuelta que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a todo o parte del RNA mensajero endógeno del gen objetivo. Asi, es la región devuelta que determina la especificidad de la interferencia de RNA. Ver, por ejemplo, WO 02/00904; Mette, y colaboradores, (2000) EMBO J 19:5194-5201; Matzke, y colaboradores, (2001) Curr. Opin. Genet. Devel. 11:221-227; Scheid, y colaboradores, (2002) Proc. Nati. Acad. Sci, USA 99:13659-13662; Aufsaftz, y colaboradores, (2002) Proc. Nat'l Acad. Sd. 99 ( 4 ): 16499-16506; Sijen, y colaboradores, Curr.

Biol. (2001) 11:436-440), incorporadas en la presente por referencia. / v. Interferencia Mediada por Amplicón Los casetes de expresión de amplicón comprenden una secuencia derivada de virus de planta que contiene todo o parte del gen objetivo pero generalmente no todos los genes del virus nativo. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción de cásete de expresión permiten al producto de transcripción dirigir- su propia replicación. Los transcriptos producidos por el amplicón puede ser ya sea de sentido o de antisentido con relación a la secuencia objetivo, (es decir, el RNA mensajero para el polipéptido asociado con la captación de nitrato) . Métodos para utilizar amplicones para inhibir la expresión de genes de planta endógenos son descritos, por ejemplo, en Angelí and Baulcombe, (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angelí and Baulcombe, (1999) Plant J. 20:357-362, y la Patente Norteamericana No. 6,646,805, cada una de las cuales s incorporada en la presente por referencia. vi. Ribozimas En algunas modalidades, el polinucleótido expresado por el cásete de expresión de la invención es RNA catalítico o tiene actividad de ribozima específica para el RNA mensajero del polipéptido asociado con la captación de nitrato. Así, el polinucleótido causa la degradación del RNA mensajero endógeno, dando por resultado la expresión reducida del polipéptido asociado con la captación de nitrato. Este método es descrito, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 4,987,071, incorporada en la presente por referencia. vii. RNA de Interferencia Pequeña o Micro RNA En algunas modalidades de la invención, la inhibición de expresión de un polipéptido asociado con la captación de nitrato se puede obtener mediante la interferencia de RNA mediante la expresión de un gen que codifica un micro de RNA (miRNA) . Los miRNAs son agentes reguladores que consisten de aproximadamente 22 ribonucleótidos . El miRNA son altamente eficientes en inhibir la expresión de genes endógenos. Ver, por ejemplo Javier, y colaboradores, (2003) Nature 425:257-263, incorporada en la presente por referencia.

Para la interferencia de miRNA, el cásete de expresión se diseña para expresar una molécula de RNA que es modelada sobre un gen de miRNA endógeno. El gen de miRNA codifica un RNA que forma una estructura de horquilla que contiene una secuencia de 22-nucleótidos que es complementaria a otro gen endógeno (secuencia objetivo) . Para la supresión de la expresión asociada con la captación de nitrato, la secuencia de 22-nucleótidos se selecciona de una secuencia de transcripto asociado con la captación de nitrato y contiene 22 nucleótidos de la secuencia asociada con la captación de nitrato en la orientación de sentido y 21 nucleótidos de una secuencia de antisentido correspondiente que es complementaria a la secuencia de sentido. Las moléculas de miRNA son altamente eficientes en inhibir la expresión de genes endógenos, la interferencia de RNA que ellos inducen es heredada por generaciones subsecuentes de plantas. 2. Inhibición Basada en Polipéptido de la Expresión Génica En una modalidad, el polinucleótido codifica una proteína de dedo de zinc que enlaza un gen que codifica un polipéptido asociado con la captación de nitrato, que da por resultado la expresión reducida del gen. En modalidades particulares, la proteína de dedo de zinc enlaza una región reguladora de un gen asociado con la captación de nitrato. En otra modalidad, la proteína de dedo de zinc enlaza un RNA mensajero que codifica un polipéptido asociado con la captación de nitrato y previene su traducción. Métodos para seleccionar sitio para la dirección por las proteínas de dedo de zinc - se han descrito, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 6,453,242, y métodos para utilizar las proteínas de dedo de zinc para inhibir la supresión de' genes en plantas son descritos, por ejemplo, en la Publicación de Patente Norteamericana No. 2003/0037355; cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. 3. Inhibición Basada en Polipéptido de la Actividad de Proteína En algunas modalidades de la invención, el polinucleótido codifica un anticuerpo que enlaza a por los menos un polipéptido asociado con la captación de nitrato, y reduce la actividad de utilización de nitrógeno aumentada del polipéptido asociado con la captación de nitrato. En otra modalidad, el enlace del anticuerpo da por resultado un intercambio incrementado del complejo asociado con la captación de nitrato-anticuerpo mediante mecanismos de control de calidad celulares. La expresión de anticuerpos en células de plantas y de inhibición de rutas moleculares mediante la expresión y el enlace de anticuerpos a proteínas en células de planta son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Conrad and Sonnewald, (2003) Nature Biotech. 21:35-36, incorporada en la presente por referencia. 4. Interrupción Génica En alguna modalidad de la presente invención, la actividad de un polipéptido asociado con la captación de nitrato se reduce o se elimina al interrumpir el gen que codifica el polipéptido asociado con la captación de nitrato. El gen que codifica el polipéptido asociado con la captación de nitrato se puede interrumpir por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, el gen es interrumpido mediante la etiquetación de transposón. En otra modalidad, el gen es interrumpido al mutagenizar plantas utilizando la mutagénesis aleatoria dirigida, y al seleccionar plantas que tienen actividad de utilización de nitrógeno reducida. i. Etiquetacion de Transposón En una modalidad de la invención, la etiquetacion de transposón se utiliza para reducir o eliminar la actividad asociada con la captación de nitrato de uno o más polipéptidos asociados con la captación de nitrato. La etiquetacion de transposón comprende insertar un transposón dentro de un gen asociado con la captación de nitrato endógeno para reducir o eliminar la expresión del polipéptido asociado con la captación de nitrato, "gen asociado con la captación de nitrato" se propone para dar a entender el gen que codifica un polipéptido asociado con la captación de nitrato de acuerdo con la invención.

En esta modalidad, la expresión de uno o más polipéptidos asociados con la captación de nitrato se reduce o se elimina al insertar un transposón con una región reguladora o región de codificación del gen que codifica el polipéptido asociado con la captación de nitrato. Un transposón que esta dentro de un exón, intrón, secuencia no traducida 5' o 3' como un promotor, o cualquier otra secuencia reguladora de un gen asociado con la captación de nitrato se puede utilizar para reducir o eliminar la expresión y/o actividad del polipéptido asociado con la captación de nitrato codificado.

Métodos para la etiquetacion de transposón de genes específicos en plantas son bien conocidos en la técnica, Ver, por ejemplo, Maes, y colaboradores, (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri and Sonti, (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; eissner, y colaboradores, (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat, y colaboradores, (200O) J Biosci. 25:57-63; Walbot, (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai, y colaboradores, (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, y colaboradores., (1999) Genetics 153:1919-1928) . Además, el proceso TUSC para seleccionar inserciones Mu en genes seleccionados se 'ha descrito en Bensen, y colaboradores, (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, y colaboradores, (1996) Science 274:1537-1540; y la Patente Norteamericana No. 5, 962,764; cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. ii. Plantas Mutantes con Actividad Reducida Métodos adicionales para disminuir o eliminar la expresión de genes endógenos en plantas también son conocidos en la técnica y de manera similar se pueden aplicar a la presente invención. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tal como la mutagénesis inducida por metanosulfonato de etilo, mutagénesis de supresión, y mutagénesis de supresión neutrónica rápida' utilizada en sentido de genética inversa (con PCR) para identificar lineas de plantas en las cuales se ha suprimido el gen endógeno. Para ejemplos de estos métodos ver, Ohshima, y colaboradores, (1998) Virology 243:472-481; Okubara, y colaboradores, (1994) Genetics 137:867-874; and Quesada, y colaboradores, (2000) Genetics 154:421-436; cada uno de los cuales se incorporaron en la presente por referencia. Además, un método rápido y automatizable para clasificar 1 mutaciones químicamente inducidas TILLING (Lesiones Locales Inducidas de Dirección en Genoma) , utilizando HPLC desnaturalizante o digestión de endonucleasa selectiva de productos de PCR seleccionados también es aplicable a la presente invención. Ver, McCallum, y colaboradores, (2000) Wat. Biotechnol. 18:455-457, incorporada en la presente por referencia.

Las mutaciones que impactan la expresión génica que interfieren con la función (actividad de utilización de nitrógeno aumentada) de la proteína codificadas son bien conocidas en la técnica. Las mutaciones insercionales en exones génicos usualmente dan por resultado mutante nulos. Las mutaciones en residuos conservados son particularmente efectivas en nivel de la proteína codificada. Los residuos conservados de polipéptidos asociados con la captación de nitrato de plantas adecuados para mutagénesis con el objetivo para eliminar la actividad asociada con la captación de nitrato se han descrito. Tales mutantes se puede aislar de acuerdo con procedimientos bien conocidos, y mutaciones en diferentes posiciones asociadas con la captación de nitrato se pueden apilar mediante cruzamiento genético. Ver, por ejemplo, Gruís, y colaboradores', (2002) Plant Cell 14:2863-2882.

En otra modalidad de esta invención, los mutantes dominantes se pueden utilizar para activar el silenciamiento de RNA debido a la inversión génica y recombinación de una posición génica duplicada. Ver, por ejemplo, Kusaba, y colaboradores, (2003) Plant Cell 15:1455-1467.

La invención abarca métodos adicionales para reducir o eliminar la actividad de uno o más polipéptidos asociados con la captación de nitrato. Ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótidos genómica en una planta son conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, el uso de vectores de RNA:DNA, vectores mutacionales RNA : DNA , vectores de reparación de RNA : DNA , oligonucleótidos de dúplex mezclados, oligonucleótidos. de RNA : DNA autocomplementarios y oligonucleobases recombinogénicas . Tales vectores y métodos de uso son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, patentes norteamericanas Nos. 5,565,350; 5,731,181; 5,756,325; 5,760,012; 5,795,972; y 5,871,984; cada una de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Ver también, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, y Beetham, y colaboradores, (1999) Proc. Nati. Acad. Sd. USA 96:8774-8778; cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia . iii. Modulación de la actividad de utilización de nitrógeno En métodos específicos, el nivel y/o actividad de un regulador asociado con la captación de nitrato en una planta se disminuye al incrementar el nivel o actividad del polipéptido asociado con la captación de nitrato en la planta. La expresión incrementada de una molécula reguladora negativa puede disminuir el nivel de expresión de corriente debajo de uno o más genes responsables para un fenotipo asociado con la captación de nitrato mejorado.

Métodos para incrementar el nivel y/o actividad de polipéptidos asociados con la captación de nitrato en una planta se discute en otra parte en la presente.

Como se discutió en lo anterior, uno de habilidad reconocerá el promotor apropiado para usar para modular el nivel/actividad de un asociado con la captación de nitrato en la planta. Promotores ejemplares para esta modalidad se han divulgado en otra parte en la presente.

En otras modalidades, tales plantas han incorporado establemente en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos asociada con la captación de nitrato de la invención operablemente enlazada a un promotor que induce la expresión en la célula de planta. iv. Modulación del Desarrollo de Raíz Se proporcionan métodos para modular el desarrollo de raíz en una planta. Por "modulación de desarrollo de raíz" se propone cualquier alteración de desarrollo de la raíz de la planta cuando se compara con una planta de control. Tales alteraciones en el desarrollo de la raíz incluyen, pero no están limitados a, alteraciones en la tasa de crecimiento de la raíz primaria, el peso de raíz fresco, el grado de formación de raíz lateral y adventicia, el sistema de vasculatura, desarrollo de meristema o expansión radial.

Se proporcionan métodos para modular el desarrollo de raíz en una planta. Los métodos comprenden modular el nivel y/o actividad del polipéptido asociado con la captación de nitrato en la planta. En un método, una secuencia asociada con la captación de nitrato de la invención se proporciona a la planta. En otro método, la secuencia de nucleotidos asociada con la captación , de nitrato se proporciona al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleotidos asociada con la -captación de nitrato de la invención, expresar la secuencia asociada con la captación de nitrato, y de otra manera modificar el desarrollo de raíz. En todavía otros métodos, el constructo de nucleotidos asociado con la captación de nitrato introducido en la planta se incorpora establemente en el genoma de la planta.

En otros métodos, el desarrollo de raíz se modula al alterar el nivel o actividad del polipéptido asociado con la captación de nitrato en la planta. Un cambio en la actividad asociada con la captación de nitrato puede dar por resultado por lo menos una o más de las siguientes alteraciones para el desarrollo de raíz, incluyendo, pero no limitado a, alteraciones en la biomasa y longitud de la raíz.

Como se utiliza en la presente, "crecimiento de raíz" abarca todos los aspectos de crecimiento de las diferentes partes que constituyen el sistema de raíz en diferentes etapas de su desarrollo en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se va a entender que el crecimiento de raíz aumentado puede resultar del crecimiento aumentado de una o más de sus partes incluyendo la raíz primaria, raíces laterales, raíces adventicias, etc.

Métodos para medir tales alteraciones de desarrollo en el sistema de raíz son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la solicitud norteamericana No. 2003/0074698 y Werner, y colaboradores, (2001) PNAS 18:10487-10492, ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia.

Como se discute en lo anterior, uno de habilidad reconocerá el promotor apropiado para usar para modular el desarrollo de raíz en la planta. Promotores ejemplares para esta modalidad incluyen promotores constitutivos y promotores preferidos de raíz. Los promotores preferidos de raíz ejemplares se han divulgado en otra parte en la presente.

La estimulación del crecimiento de la raíz y el incremento de masa de la raíz al disminuir la actividad y/o nivel del polipéptido asociado con la captación de nitrato también encuentra uso en mejorar la erectibilidad de una planta. El término "resistencia a la fijación" o "erectibilidad" se refiere en la habilidad de una planta para fijarse por si misma al suelo. Para las plantas con un hábito de crecimiento erecto o semierecto, este término también se refiere a la habilidad para mantener una posición vertical bajo condiciones adversas (ambientales) . Este atributo se relaciona a tamaño, profundidad y morfología del sistema de raíz. Además, la estimulación del crecimiento de la raíz y el incremento de la masa de la raíz al alterar el nivel y/o actividad del polipéptido asociado con la captación de nitrato también encuentra uso en la promoción de propagación in vitro de explantas.

Además, la producción de biomasa de raíz más alta debido a la actividad asociada con la captación de nitrato tiene un efecto directo sobre el rendimiento y un efecto indirecto de la producción de compuestos producidos por células de raíz o células de raíz transgénicas o cultivos de células de las células de raíz transgénicas. Un ejemplo de un compuesto interesante producido en los cultivos de raíz es shikonina, el rendimiento del cual se puede aumentar ventajosamente mediante los métodos.

Por consiguiente, la presente invención además proporciona plantas que tienen desarrollo de raiz modulado cuando se compara con el desarrollo de raiz de una planta de control. En las mismas modalidades, la planta de la invención tiene un nivel/actividad incrementado del polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención y tiene crecimiento de raiz aumentado y/o biomasa de raiz. En otras modalidades, tales plantas han incorporado establemente en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos asociada con la captación de nitrato de la invención operablemente enlazado a un promotor que induce la expresión en la célula de planta. v. Modulación del Desarrollo de Retoño y Hoja También se proporcionan métodos para modular el desarrollo de retoño y hoja en una planta. Por "modulación del desarrollo de retoño y/u hoja" se propone cualquier alteración en el desarrollo del retoño y/u hoja de la planta. Tales alteraciones en el desarrollo del retoño y/u hoja incluyen, pero no están limitados a, alteraciones en el desarrollo del meristema de retoño, en el número de hojas, tamaño de hoja, vasculatura de la hoja y tallo, longitud de internodo y senescencia de la hoja. Como se utiliza en la presente "desarrollo de la hoja" y "desarrollo del retoño" abarca todos los aspectos de crecimiento de las diferentes partes que constituyen el sistema de hoja y el sistema de retoño, respectivamente, en diferentes etapas de su desarrollo, en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas- Los métodos para medir tales alteraciones de desarrollo en el sistema de retoño y hoja son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Werner, y colaboradores, (2001) PNAS 98:10487-10492 y la publicación norteamericana No. 2003/0074698, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia.

El método para modular el desarrollo de retoño y/u hoja en una planta comprende modular la actividad y/o nivel de un polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención. En 'una modalidad, una secuencia asociada con la captación de nitrato de la invención se proporciona. En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos asociada con la captación de nitrato se puede proporcionar al introducir en una planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos asociada con la captación de nitrato de la invención, expresar la secuencia asociada con la captación de nitrato, y de esta manera modificar el desarrollo del retoño y/u hoja. En otras modalidades, el constructo de nucleótido asociado con la captación de nitrato introducido en la planta se incorpora establemente en el genoma de la planta.

En modalidades especificas, el desarrollo de retoño u hoja se modula al alterar el nivel y/o actividad del péptido asociado con la captación de nitrato en la planta. Un cambio en la actividad asociada con la captación de nitrato puede dar por resultado una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo de retoño y/u hoja, incluyendo, pero no limitado a, cambios en el número de hojas, superficie de hoja alterada, vasculatura alterada, internodos y crecimiento de la planta, y alteraciones en la senescencia de la hoja, cuando se compara con una planta de control.

Como se discute en lo anterior, uno de habilidad reconocerá el promotor apropiado para usar para modular el desarrollo de retoño y hoja de la planta. Promotores ejemplares para esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores preferidos del retoño, promotores preferidos de meristema de retoño y promotores preferidos de hoja. Promotores ejemplares se han divulgado en otra parte en la presente.

El incremento de la actividad asociada con la captación de nitrato y/o el nivel en una planta da por resultado internodos alterados y crecimiento. Asi, los métodos de la invención encuentran uso en producir plantas modificadas. Además, como es discutido en lo anterior, la actividad asociada con la captación de nitrato en la planta modula el crecimiento tanto de la raíz como del retoño. Asi, la presente invención además proporciona métodos para alterar la relación de raiz/retoño. El desarrollo de retoño u hoja puede ser además ser modulado al alterar el nivel/actividad del polipéptido asociado con la captación de nitrato en la planta.

Por consiguiente, la presente invención además proporciona plantas que tienen desarrollo de retoño y/u hoja modulado cuando se compara con una planta de control. En algunas modalidades, la planta de la invención tiene nivel/actividad incrementada del polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención. En otras modalidades, la planta de la invención tiene un nivel/actividad disminuida del polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención. vi. Modulación del Desarrollo del Tejido Reproductor Se proporcionan métodos para modular el desarrollo del tejido reproductor. En una modalidad, se proporcionan métodos para modular el desarrollo floral en una planta. Por "modulación del desarrollo floral" se propone cualquier alteración en una estructura de un tejido reproductor de la planta como es comparado con una planta de control en la cual no se ha modulado la actividad o nivel del polipéptido asociado con la captación de nitrato. "Modulación del desarrollo floral" además incluye cualquier alteración en la sincronización del desarrollo de un tejido reproductor de la planta (es decir, sincronización retardada o acelerada del desarrollo floral) cuando se compara con una planta de control en la cual no se ha modulado la actividad o nivel del polipéptido asociado con la captación de nitrato. Las alteraciones macroscópicas pueden incluir cambios en el tamaño, forma, número o ubicación de los órganos reproductores. El periodo de tiempo de desarrollo que estas estructuras forman o la habilidad para mantener o proceder a través del proceso de florecimiento en tiempos de estrés ambiental. Las alteraciones microscópicas pueden incluir cambios a los tipos o formas de células que constituyen los órganos reproductores.

El método para modular el desarrollo floral en una planta comprende modular la actividad asociada con la captación de nitrato en una planta. En un método, se proporciona una secuencia asociada con la captación de nitrato de la invención. Una secuencia de nucleótido asociada con la captación de nitrato se puede proporciona al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos asociada con la captación de nitrato de la invención, expresar la secuencia asociada con la captación de nitrato, y de esta manera modificar el desarrollo floral. En otras modalidades, el constructo de nucleótidos asociado con la captación de nitrato introducido en la planta se incorpora establemente en la planta.

En métodos específicos, el desarrollo floral se modula al incrementar o disminuir la actividad del polipéptido asociado con la captación de nitrato en la planta. Un cambio en la actividad asociada con la captación de nitrato puede dar por resultado una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo floral, incluyendo, pero no limitado a, florecimiento alterado, número cambiado de flores, esterilidad masculina modificada y ajuste de semilla alterado, cuando se compara con una planta de control. La inducción de florecimiento de talado o inhibición de florecimiento se puede utilizar para aumentar el rendimiento en cultivos de forraje tal como alfalfa. Métodos para medir tales alteraciones de desarrollo en el desarrollo floral son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Mouradov, y colaboradores, (2002) The Plant Cell S111-S130, incorporada en la presente por referencia.

Como es discutido en lo anterior, uno de habilidad reconocerá el promotor apropiado para usar para modular el desarrollo floral de la planta. Los promotores ejemplares para esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores preferidos de retoño y promotores preferidos de florescencia.

En otros métodos, el desarrollo floral se modula al alterar el nivel y/o actividad de la secuencia asociada con la captación de nitrato de la invención. Tales métodos pueden comprender la introducción de una secuencia de nucleótidos asociada con la captación de nitrato en la planta y al cambiar la actividad del polipéptido asociado con la captación de nitrato. En otros métodos, el constructo de nucleótidos asociado con la captación de nitrato introducido en la planta se incorpora establemente en el genoma de la planta. La alteración de la expresión de la secuencia asociada con la captación de nitrato de la invención puede modular el desarrollo floral durante periodos de estrés. Tales métodos se describen en otra parte en la presente. Por consiguiente, la presente invención además proporciona plantas que tienen desarrollo floral modulado cuando se compara con el desarrollo floral de una planta de control. Las composiciones incluyen plantas que tienen un nivel/actividad alterada del polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención y que tiene un desarrollo floral alterado. Las composiciones. también incluyen plantas que tienen un nivel/actividad codificada del polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención en donde la planta mantiene o procede a través del proceso de florecimiento en tiempos de estrés.

También se proporcionan métodos para el uso de las secuencias asociadas con la captación de nitrato de la invención para incrementar el tamaño y/o peso de la semilla. El método comprende incrementar la actividad de las secuencias asociadas con la captación de nitrato en una planta o parte de planta, tal como la semilla. Un incremento en el tamaño y/o peso de la semilla comprende un tamaño o peso incrementado de la semilla y/o un incremento en el tamaño o peso de una o más partes de la semilla que incluye, por ejemplo, el embrión, endosperma, recubrimiento de semilla, aleurona o cotiledón.

Como es discutido en lo anterior, uno de habilidad reconocerá el promotor apropiado para usar para incrementar el tamaño de la semilla y/o peso de la semilla. Los promotores ejemplares de esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores preferidos de semilla, promotores preferidos de embrión y promotores preferidos de endosperma.

El método para alterar el tamaño de la semilla y/o peso de la semilla en una planta comprende incrementar la actividad asociada con la captación de nitrato en la planta. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos asociada con la captación de nitrato se puede proporcionar al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos asociada con la captación de nitrato de la invención, expresar la secuencia asociada con la captación de nitrato, y de esta manera incrementar el peso y/o tamaño de la semilla. En otra modalidad, el constructo de nucleótidos asociado con la captación de nitrato introducido en la planta se incorpora establemente en el genoma de la planta.

Además se reconoce que el incremento del tamaño y/o peso de la semilla también puede estar acompañado por un incremento en la velocidad de crecimiento de plántulas o un incremento en vigor temprano. Como se utiliza en la presente, el término "vigor temprano" se refiere a la habilidad de una planta para crecer rápidamente durante el desarrollo temprano, y se relaciona al establecimiento exitoso, después de la germinación, de un sistema de raíz bien desarrollado y un aparato fotosintético bien desarrollado. Además, un incremento en el tamaño y/o peso de la semilla también puede dar por resultado un incremento en el rendimiento de la planta cuando se compara con un control.

Por consiguiente, la presente invención además proporciona plantas que tienen un peso de semilla y/o tamaño de semilla incrementado cuando se compara con una planta de control. En otras modalidades, también se proporcionan plantas que tienen un vigor incrementado y rendimiento de la planta. En algunas modalidades, la planta de la invención tiene un nivel/actividad modificada del polipéptido asociado con la captación de nitrato de la invención y tiene un peso de semilla y/o tamaño de semilla incrementado. En otras modalidades, tales plantas tienen establemente incorporado en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos asociada con la captación de nitrato de la invención operablemente enlazado a un promotor que induce la expresión en la célula de planta. vii . Método de uso para el polinucleótido asociado con la captación de nitrato, cásete de expresión y polinucleotidos adicionales Los nucleótidos, casetes de expresión y métodos divulgados en la presente son útiles en divulgar la expresión de cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta hospedera con el fin de variar el fenotipo de una planta. Varios cambios en el fenotipo son de interés incluyendo la composición de ácido graso en una planta, alteración del contenido de aminoácido de una planta, alteración de un mecanismo de defensa a patógenos de la planta y los similares. Estos resultados se pueden lograr al proporcionar la expresión de productos heterólogos de expresión incrementada de productos endógenos en plantas. Alternativamente, los resultados se pueden lograr al proporcionar una reducción de expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios dan por resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Los genes de interés son reflectivos de los mercados comerciales e intereses de aquellos involucrados en el desarrollo de cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian, y conforme las naciones en desarrollo se abren a mercados mundiales, nuevos cultivos y tecnologías también surgirán. Además, para el entendimiento de los inventores de atributos agronómicos y características tal como el rendimiento e incremento de esclerosis, la elección de genes para la transformación cambiará por consiguiente. Las categorías generadas de genes de interés incluyen, por ejemplo, aquellos genes involucrados en la conservación, tales proteínas de choque térmico. Categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyendo genes que codifican atributos importantes para la agronomía, resistencia a insectos, resistencia a enfermedad, resistencia a herbicida, esterilidad, características del grano y productos comerciales. Genes de interés incluyen, generalmente, aquellos involucrados en el metabolismo del aceite, almidón, carbohidratos nutrientes así como aquellos que afectan el tamaño del núcleo, carga- de sacarosa y los similares.

En ciertas modalidades las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar en combinación "apilada" con otras secuencias de polinucleótido de interés con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de cualquiera de uno o más de los polinucleótidos de interés. Polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con cualquier gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de atributos deseados, incluyendo pero no limitados a atributos deseables para alimento para animales, tales como genes de alto contenido de aceite (por ejemplo, patente norteamericana No. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (patentes norteamericanas Nos. 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; y 5,703,409); cebada de alto contenido de lisina (Williamson, y colaboradores, (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122); y proteínas de alto contenido de metionina (Pedersen, y colaboradores, (1986) J. BioJ. Chem. 261:6279; Kirihara, y colaboradores, (1988) Gene 71:359; y Musumura, y colaboradores, (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestabilidad incrementada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificado (solicitud norteamericana No. de serie 10/053,410, presentada el 7 de Noviembre del 2001); y tioredoxinas (solicitud norteamericana No. de serie 10/005,429, presentada el 3 de Diciembre del 2001)), las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden apilar con atributos deseables para resistencia a insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes norteamericanas Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5723,756; 5,593,881; Geiser, y colaboradores, (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme, y colaboradores, (1994) Plant Mol Biol 24:825); genes de destoxificación de fumonisina (patente norteamericana No. 5,792,931); genes de resistencia a avirulencia y enfermedad (Jones, y colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin, y colaboradores, (1993) Science 262:1432'; Mindrinos, y colaboradores, (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a la resistencia a herbicida tales como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar) ; y resistencia a glifosato (gen EPSPS) ) ; y atributos deseables para el procesamiento o productos de proceso tal como de alto contenido de aceite (por ejemplo, patente norteamericana No. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácido graso desaturasa (patente norteamericana No. 5,952,544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasa (AGPasa) , sintasas de almidón (SS) , enzimas de ramificación de almidón (SBE) y enzimas de desramificación de almidón (SDBE) ) ; y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, patente norteamericana No. 5.602,321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert, y colaboradores, (1988) J. Bacterid. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs)), las descripciones ' de las cuales son incorporadas en la' presente por referencia.

También se podrían combinar los polinucleótidos de la presente invención con polinucleótidos que afectan atributos agronómicos tal como la esterilidad masculina (por ejemplo, ver la patente norteamericana No. 5.583,210), resistencia del tallo, tiempo de florecimiento o atributos de tecnología de transformación tal como la regulación del ciclo celular o la dirección del gen (por ejemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; O 99/25821) , las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia.

En una modalidad, las secuencias de interés mejoran el crecimiento de la planta y/o rendimientos del cultivo. Por ejemplo, las secuencias de interés incluyen genes agronómicamente importantes que dan por resultado sistemas de raíz primarios o laterales mejorados. Tales genes incluyen, pero no están limitados a, transportadores de nutriente/agua e inductores de crecimiento. Ejemplos de tales genes, incluyen, pero no están limitados a, H+-ATPasa de membrana de plasma de maíz (MHA2) (Frías, y colaboradores, (1996) Plant Cell 5":1533-44); AKT1, un componente del aparato de captación de potasio en Arabidopsis, (Spalding, y colaboradores, (1999) J Gen Physiol 113:909-18); genes RML que activan el ciclo de división celular en las células apicales de la raíz (Cheng, y colaboradores, (1995) Plant Physiol 108:881); genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya, y colaboradores, (1994) Plant Mol Biol 26:1935-46) y hemoglobina (Duff, y colaboradores, (1997) J. Biol. Chem 27:16749-16752, Arredondo-Peter, y colaboradores, (1997) Plant Physiol. 115:1259-1266; Arredondo-Peter, y colaboradores, (1997) Plant Physiol 114:493-500 y las referencias citadas en las mismas). La secuencia de interés también puede ser útil al expresar secuencias de nucleótidos de antisentido de genes que afectan :5 negativamente el desarrollo de la raíz.

Adicionalmente, los atributos agronómicamente importantes tal como el contenido de aceite, almidón y proteína pueden ser genéticamente alterados además de utilizar los métodos de reproducción tradicionales. Las 0 modificaciones incluyen contenido incrementado de ácido oleico, a aceites saturados e insaturados, niveles incrementados de lisina y azufre, provisión de aminoácidos esenciales y también modificación de almidón. Las modificaciones de proteína hordotionina se describen en las 5 pa'tentes norteamericanas Nos. 5, 703, 049, 5,885,801, 5,885,802, y 5,990,389, incorporadas en la presente por referencia. Otro ejemplo es la proteína de semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina 2S de soja descrito en la patente norteamericana No. 5,850,016, y el 0 inhibidor de quimotripsina de cebada descrito en Williamson, y colaboradores, (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente ' por referencia.

Los derivados de las secuencias de codificación se 5 pueden hacer mediante la mutagénesis dirigida el sitio para incrementar el nivel de aminoácidos preseleccionadas en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido de alto contenido de lisina de cebada (BHL) se deriva del inhibidor de quimotripsina de cebada, solicitud norteamericana No. de serie 08/740,682, presentada el 1 de Noviembre de 1996, y WO 98/20133, la descripción de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Otras proteínas incluyen proteínas de plantas ricas en metionina tal como de semilla de girasol (Lilley, y colaboradores, (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utílization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), pp. 497-502; incorporada en la presente por referencia); maíz (Pedersen, y colaboradores, (1986) J. Biol. Chem. 261 :6279; Kirihara, y colaboradores, (1988) Gene 71:359; ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia); y arroz (Musumura, y colaboradores, (1989) Plant Mol. Biol. 12:123, incorporada en la presente por referencia) . Otros genes agronómicamente importantes codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento de semilla y factores de transcripción.

Los genes de resistencia a insectos pueden codificar la resistencia a pestes que tienen gran arrastre de rendimiento tal como el gusano de raíz, gusano cortador, Barrenillo de Maíz Europeo y los similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, los genes de proteína tóxica de Bacillus thu ngiensis (patentes norteamericanas Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; y Geiser, y colaboradores, (1986) Gene 48:109); y los similares .

Los genes que codifican los atributos de resistencia a enfermedad incluyen genes de destoxificación, tal como contra fumonosina (patente norteamericana No. 5,792,931); genes de resistencia a avirulencia (avr) y enfermedad (R) (Jones, y. colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin, y colaboradores, (1993) Science 262:1432; y Mindrinos, y colaboradores, (1994) Cell 78:1089); y los similares .

Los atributos de resistencia a herbicida pueden incluir genes que codifican la resistencia a herbicida que actúan para inhibir la acción de acetolactato sintasa (ALS) , en particular herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a tal resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra) , genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) , u otros de tales genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica la resistencia a los antibióticos canamicina y geneticina, y los mutantes del gen ALS codifican la resistencia al herbicida clorsulfurón .

Los genes de esterilidad también se pueden codificar en un cásete de expresión y proporcionar una alternativa para el desespigamiento físico. Ejemplos de genes utilizados en tales maneras incluyen genes preferidos de tejido masculino y genes con fenotipos de esterilidad masculina tal como Qm, descrito en la patente norteamericana No. 5,583,210. Otros genes incluyen quinasas y aquellos compuestos de codificación tóxicos al desarrollo gametofítico masculino o femenino.

La calidad del grano se refleja en atributos tales como tipos y niveles de aceites, saturados e insaturados, calidad y cantidad de aminoácidos esenciales, y niveles de celulosa. En el maíz, las proteínas de hordotionina modificadas se describen en las patentes norteamericanas Nos. 5,703,049, 5,885,801, 5,885,802, y 5,990,389.

Los atributos comerciales también se pueden codificar sobre un gen o genes que podrían incrementar por ejemplo, almidón para producción de etanol, o proporcionar expresión de proteínas. Otros uso comercial importante de plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos tal como es descrito en la patente norteamericana No. 5,602,321. Los genes tales como ß-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxibutirato sintasa) , y acetoacetil-CoA reductasa (ver, Schubert, y colaboradores, (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs).

Los productos exógenos incluyen enzimas de plantas y productos asi como aquellos de otras fuentes que incluyen procariotas y otras eucariotas. Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y los similares. El nivel de proteínas, particularmente proteínas modificadas que tienen distribución de aminoácido mejorada para mejorar el valor de nutrientes de la planta, se puede incrementar. Esto se lograr mediante la expresión de tales proteínas que tienen contenido de aminoácido aumentado.

Esta invención se puede entender mejor por referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que otras modalidades de la invención se pueden practicar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como es divulgado y reclamado en la presente.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 - Creación de una Población de Arabidopsis Se creó un constructo binario basado en T-DNA, que contiene cuatro elementos aumentadores multimerizados derivados del promotor 35S de virus de Mosaico de Coliflor, correspondientes a las secuencias -341 a -64, como es definido por Odell y colaboradores. (1985) Nature 3/3:810- 812. El constructo también contiene secuencias de vector (pUC9) para permitir el rescate de plásmido, secuencias de transposón (Ds) para removilizar el T-DNA, y el gen bar para permitir la selección de glufosinato de plantas transgénicas. Solamente el segmento de 10.8 kb del borde derecho (RB) al borde izquierdo (LB) inclusive será transferido en el genoma de la planta hospedera. Puesto que los elementos aumentadores están localizados cerca del RB, ellos pueden inducir activación cis de las posiciones genómicas después de la integración de T-DNA.

El constructo resultante se transformó en la cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens, cultivada en LB a 25 °C a OD600 ~1.0. Las células luego se formaron en pelotillas mediante centrifugación y se resuspendieron en un volumen igual de sacarosa al 5%/Silwet L-77 al 0.05% (OSI Specialties, Inc) . en el cernido temprano, el ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana cultivado en el suelo se rociaron en la parte superior con la suspensión de Agrobacterium. Una semana después, las mismas · plantas se rociaron en la parte superior nuevamente con la misma cepa de Agrojacterium en sacarosa/Silwet . Las' plantas luego se dejaron endurecer la semilla como normal. La semilla i resultante se sembró en el suelo, y las plántulas transgénicas se seleccionaron mediante el rociado con glufosinato (Finale®; AgrEvo; Bayer Environmental Science) . La semilla T2 se recolectó de aproximadamente 35,000 plantas Ti resistentes a glufosinato individuales. Las plantas T2 se cultivaron y volúmenes iguales de semilla T3 de 96 lineas T2 separado se acumularon. Esto constituyó 360 subpoblaciones.

Un total de 100,000 plántulas i resistentes a glufosinato se seleccionaron. Las semillas T2 de cada linea se mantuvieron separadas.

EJEMPLO 2 - Clasificaciones para Identificar Lineas con Arquitectura de Raíz Alterada Las plántulas de Arabidopsis etiquetadas de activación, cultivadas bajo condiciones de nitrógeno no limitantes, se analizaron para la arquitectura del sistema de raíz alterado cuando se compara con las plántulas de control durante el desarrollo temprano para la población descrita en el Ejemplo 1.

Hojas validadas de la clasificación en casa se sometieron a un ensayo de placa vertical para evaluar el crecimiento de raiz aumentado. Los resultados se validaron utilizando WinRHIZO® como es descrito enseguida. Las semillas T2 se esterilizaron utilizando5 blanqueador doméstico al 50%, solución tritón X-100 al .01% y se colocaron sobre cajas de petri que contienen el siguiente medio: 0.5x N-Libre Hoagland's, KN03 60 Mm, sacarosa al 0.1%, MES 1 mM y Phytagel™ al 1% a una densidad de 4 semillas/placa. Las placas se mantuvieron durante tres días a 4°C para estratificar las semillas y luego se mantuvieron verticalmente durante 11 días a 22°C de luz y 20°C de oscuridad. El fotoperiodo fue 16 h; 8 h de oscuridad y la intensidad de luz promedio fue ~160 Las placas se colocaron verticalmente en las ocho posiciones centrales de una instalación de 10 placas con la primera y la última posición que sostiene las placas objetivo. Las instalaciones y las placas dentro de una instalación se rotaron un dia si y otro no. Dos conjuntos de fotografías se tomaron para cada placa. El primer conjunto que toma lugar en el día 14-16 cuando las raíces primarias para la mayorías de las líneas ha alcanzado el fondo de la placa, el segundo conjunto de fotografías dos días después de que se han desarrollado la mayoría de raíces laterales. Este último conjunto de fotografías usualmente se utilizó para el análisis de datos. Estas plántulas cultivadas en placas verticales se analizaron para el crecimiento de la raíz con el software WinRHIZO® (Regent Instruments Inc) , un sistema de análisis de imagen específicamente diseñado para la medición de raíz. WinRHIZO® usa el contraste en pixeles para distinguir la raíz clara del fondo más oscuro. Para identificar la cantidad máxima de raíces sin r5ecolectar el fondo, la clasificación de pixel fue 150-170 y la característica de filtros se utilizó para remover los objetivos que tienen una relación de longitud/ancho menor que 10.0. El área de las placas analizada fue desde el borde de las hojas de la planta a aproximadamente 1 cm del fondo de la placa. Los mismos conjuntos WinRHIZO® exactos y el área de análisis se utilizaron para analizar todas las placas dentro de un lote. :5 El registro de longitud de raíz total dado por WinRHIZO® para una placa se dividió entre el número de plantas que han germinado y han crecido a la mitad hacia abajo de la placa. Ocho placas para cada linea se cultivaron y sus registros se ; promediaron. Este promedio luego se comparó con el promedio 0 de ocho placas que contienen semilla de tipo silvestre que se cultivaron al mismo tiempo.

Las lineas con características de crecimiento de raíz aumentadas se esperaron que se encuentren en el extremo superior de las distribuciones de área de raíz. Un 5 procedimiento de ventana deslizante se utilizó para estimar la variación en el área de raíz para una instalación dada con la suposición de que podría haber hasta dos depósitos en la instalación. Las variaciones ambientales en varios factores incluyendo el medio de crecimiento, temperatura y humedad 0 pueden causar variación significante en el crecimiento de la raíz, especialmente entre fechas de siembra. Por lo tanto las líneas se agruparon por fecha de siembra y se mantuvieron para el análisis de datos. Las instalaciones en un grupo de fecha de siembra/anaquel particular luego se clasificaron 5 mediante el área de raíz media. Las distribuciones de área de raíz para las ventanas deslizantes se realizaron al combinar los datos para una instalación, ri, con los datos de la instalación con el siguiente más bajo ( (ri_i, y el área de raíz medio más alto siguiente, ri+1. La variación de la distribución combinada luego se analizó para identificar ausentismo en ri utilizando un procedimiento de tipo Grubbs (Barnett y colaboradores, Outliers in Statistical Data, John Wiley & Sons, 3rd edition (1994) .

Ejemplo 3 - Ensayo de Tinte Indicador de pH para Identificar Genes Involucrados en la Captación de Nitrato El análisis se realizó utilizando el siguiente ensayo de tinte indicador de pH para identificar los genes involucrados con la captación de nitrato como es detallado en la solicitud de patente, norteamericana No. 12/166,473, presentada el 3 de Julio del 2007. Utilizando el protocolo detallado en la solicitud de patente norteamericana No. 12/166,473, presentada el 3 de Julio del 2007, las líneas de Arabidopsis que se sobreexpresan Atlg67330 con el promotor 35S de CaMV o el promotor de tubulina tuvieron significativamente menos (p<0.05) nitrato que permanece en el medio que los controles de tipo silvestre. Las líneas de Arabidopsis que sobreexpresan pco639489 de maíz con el promotor de ubicuitina de maíz tuvieron significativamente menos (p<0.05) nitrato que permanece en el- medio que los controles de tipo silvestre.

EJEMPLO 4 - Clasificación de Genes Candidato bajo Condiciones Limitantes de Nitrógeno La semilla transgénica seleccionada por la presencia del marcador fluorescente YFP también se puede clasificar para su tolerancia para crecer bajo condiciones limitantes de nitrógeno. Los individuos transgénicos que expresan el gen Candidato de Arabidopsis se colocaron en el medio Bajo de N (0.5x N-Libre Hoagland's, nitrato de potasio 0.4 mM, sacarosa al 0.1%, MES 1 mM y Phytagel™ al 0.25%), tal que 32 individuos transgénicos se cultivaron próximos a los 32 individuos de tipo silvestre en una placa. Las plantas se evaluaron en 10, 11, 12 y 13 días. Si una linea muestra una diferencia estadísticamente significante de los controles, la línea se considera una línea tolerante de deficiencia de nitrógeno validada. Después de enmascarar la imagen de placa para remover el color de fondo, dos diferentes mediciones se recolectaron para cada individuo: área de roseta total, y el porcentaje de color que cae en un cajón de color verde. Usando el matiz, los datos de saturación e intensidad (HIS) , el cajón de color verde consiste de los matices 50-66. El área de roseta total se utiliza como una medición de la biomasa de planta, mientras que el cajón de color verde se ha mostrado mediante estudios de dosis-respuesta que es un indicador de la asimilación de nitrógeno.

EJEMPLO 5 - Identificación de los Genes Etiquetados con Activación Los genes que flanquean el inserto T-DNA en líneas con captación de nitrato mejorada se identifican utilizando uno, o ambos, de los siguientes dos procedimientos estándares: (1) PCR entralazada (TAIL) asimétrica térmica (Liu y colaboradores, (1995), Plant J. 5:457-63); y (2) SAIFF PCR (Siebert y colaboradores, (1995) Nucleic Acids Res. 23:1087-1088). En líneas con insertos de T-DNA multimerizados complejos, TAIL PCR y SAIFF PCR ambos se prueban insuficientemente para identificar genes candidatos. En estos casos, otros procedimientos, incluyendo la PCR inversa, rescate de plásmido y/o construcción de librería genómica, se pueden emplear.

Un resultado exitoso es donde un solo fragmento de TAIL o SAIFF PCR contiene una secuencia de borde de T-DNA y la secuencia genómica de Arabidopsis .

Una vez que se obtiene una etiquetación de la secuencia genómica que flanquea un T-DNA, los genes candidatos se identifican mediante la alineación en la secuencia de genoma de Arabidopsis públicamente disponible.

Específicamente, el gen anotado más ' cerca de los elementos aumentadores 35S/T-DNA RB son candidatos para genes que son activados.

Para verificar que un gen identificado está verdaderamente cerca de un T-DÑA y para excluir la posibilidad de que el fragmento TAIL/SAIFF es un artefacto de clonación quimérico, una PCR de diagnóstico sobre el DNA genómico se hace con un oligo en el T-DNA y un oligo especifico para el gen candidato. Las muestras de DNA genómicas que dan un producto de PCR se interpretan como que representan una inserción de T-DNA. Este análisis también verifica una situación en la cual más de un evento de inserción ocurre en la misma linea, por ejemplo, si múltiples fragmentos genómicos diferentes se identifican en los análisis de TAIL y/o SAIFF PCR.

EJEMPLO 6 - Validación de un Gen Candidato para su Habilidad para Aumentar la Captación de Nitrato en Plantas por la vía de la Transformación en Arabidopsis Los genes candidatos se pueden transformar en Arabidopsis y sobreexpresar bajo un promotor tal como los promotores 35S o Ubicuitina de maiz. En el mismo o similar fenotipo si el mismo similar fenotipo se observa en la linea transgénica como en la linea etiquetada con activación de origen, entonces el gen candidato se considera que es un "gen de guia" validado en Arabidopsis. El gen AT1G67330 de Arabidopsis se puede probar directamente por su habilidad para aumentar la captación de nitrato de Arabidopsis .

Un constructo de gen 35S-AT1G67330 se introdujo en el ecotipo Col-0 de Arabidopsis de tipo silvestre, utilizando los procedimientos de transformación · mediados por Agrobacterium estándares.

Las semillas T2 transgénicas de múltiples lineas TI ¦ independientes se pueden seleccionar por la presencia del marcador YFP fluorescente. Las semillas fluorescentes se sometieron al pH y los ensayos de captación de nitrato siguiendo los procedimientos descritos en la presente. Las semillas T2 transgénicas se reclasificaron utilizando 3 o 4 placas por constructo. Cada placa contuvo semilla Columbia no transformada descartada de la clasificación de semilla fluorescente para servir como un control.

Ejemplo 7 - Crecimiento de Planta con Ensayo de NUE Semillas de Arabidopsis thaliana (lineas de control y transgénica) , ecotipo Columbia, se esterilizaron en la superficie (Sánchez y colaboradores, 2002) y luego se colocaron sobre el medio de Murashige y Skoog (MS) que contiene Bacto-Agar al 0.8% (p/v) (Difco) . Las placas se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 4°C para romper el estado latente (estratificación) y se transfirieron después a cámaras de crecimiento (Conviron, Manitoba, Canadá) a una temperatura de 20°C bajo un ciclo de 16-h de luz/8-h de oscuridad. La intensidad de luz promedio fue 120 pE/m2/s. Las plántulas se cultivaron durante 12 días y luego se transfirieron a macetas con base de tierra. Las plantas en maceta se cultivaron en una tierra libre de nutrientes SunGro® LB2 Metro-Mix 200 (Scott's Sierra Horticultural Products, Marysville, OH, USA) en macetas de 1.5 pulgadas individuales {Arabidopsis system; Lehle Verds, Round Rock, TX, USA) en las cámaras de crecimiento, como es descrito en lo anterior. Las plantas se rociaron con 0.6 o 6.5 mM de nitrato de potasio en la solución de nutrientes basado en el medio de Murashige y Skoog (Nitrógeno libre de MS) . La humedad relativa se mantuvo alrededor de 70%. 16-18 días después los retoños de planta se recolectaron para la evaluación de la biomasa y lecturas de SPAD. Las plantas que mejoran el NUE pueden tener biomasa incrementada en concentraciones de nitrato ya sea altas o bajas.

Ejemplo 8 - Ensayo de Crecimiento con Sacarosa La linea Columbia de Arabidopsis thaliana se obtuvo del Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis (Columbus, OH) . Para el análisis temprano (lineas Columbia y transgénicas T3), las semillas se esterilizaron en la superficie con etanol al 70% seguido por Clorox® 40% y se enjuagaron con agua desionizada estéril. Las semillas esterilizadas en la superficie se sembraron sobre placas Petri cuadradas (25 cm) que contienen 95 mL del medio estéril que consiste de 0.5 X de sales Murashige y Skoog (1962) (Life Technologies) y fitagel al 4% (p/v) (Sigma) . El medio no contuvo sacarosa suplemental. La sacarosa se adicionó al medio en concentración de 0.1%, 0.5% y 1.5%. Las placas se arreglaron verticalmente en rejillas de plástico y se colocaron en un cuarto frío durante 3 días a 4°C para sincronizar la germinación. Las rejillas con semilla estratificada fría luego se transfirieron a las cámaras de crecimiento (Conviron, anitoba, Canadá) con temperaturas de día y de noche de 22 y 20°C, respectivamente. La intensidad de luz promedio al nivel de la roseta se mantuvo en 10 mol/m2/segl durante un ciclo de luz de 16 hr de desarrollo que comienza en la remoción del cuarto frío (día 3 después del sembrado) hasta que las plántulas se cosecharon en el día 14. Las imágenes se tomaron y se midieron el peso fresco total de la raíz y retoño. Dos experimentos serán realizados. Si la sobreexpresión de At2g36295 altera el balance de carbono y nitrógeno, entonces los datos pueden mostrar que la sobreexpresión de At2g36295 de las plantas transgénicas ha incrementado o disminuido la biomasa de la raíz y/o biomasa de la hoja en diferentes concentraciones de sacarosa cuando se compara con Arabidopsis de tipo silvestre.

Ejemplo 9 - Protocolo de Ensayo de Plántula de NUE Semilla de eventos transgénicos se separan en la semilla transgénica (heterocigota) y nula utilizando un marcador de color de semilla. Dos diferentes asignaciones aleatorias de tratamiento se hicieron para cada bloque de 54 macetas arregladas en 6 hileras de 9 columnas utilizando 9 replicados de todos los tratamientos. En un caso la semilla nula de 5 eventos del mismo constructo se mezclaron y se utilizaron como control para la comparación de los 5 eventos positivos en este bloque que constituyen 6 combinaciones de tratamiento en cada bloque. En el segundo caso, 3 tratamientos positivos transgénicos y sus nulos correspondientes se asignaron aleatoriamente a las 54 macetas del bloque, haciendo 6 combinaciones de tratamiento para cada bloque, que contiene 9 replicados para todas las combinaciones del tratamiento. En el primer caso los parámetros transgénicos se compararon con un nulo de constructo en volumen y en el segundo caso los parámetros transgénicos se compararon con el nulo de evento correspondiente. En casos donde hubo 10, 15 o 20 eventos en el constructo los eventos se asignaron en grupos de 5 eventos, las variaciones calculadas para cada bloque de 54 macetas pero el nulo de bloque significa acumulado a través de los bloques antes de que se hicieran las comparaciones medias.

Dos semillas de cada tratamiento se plantaron en macetas cuadradas de 4 pulgadas, que contienen TURFACE®-MVP en centros escalonados de 8 pulgadas, y rociaron cuatro veces cada día con una solución que contiene los siguientes nutrientes: CaC12 1 mM gS04 2 mM KH2P04 0.5 mM 83 ppm Sprint330 KC1 3 mM KN03 1 mM ZnS04 1 uM MnC12 1 uM H3B04 3 uM MnC12 1 uM CuS04 0.1 uM 0.1 uM NaMo04 Después de la emergencia las plantas se seleccionaron a una semilla por maceta. Los tratamientos rutinariamente se plantan en el Lunes, emergen el siguiente Viernes y se cosechan 18 dias después de la plantación. En la cosecha, las planta se remueven de las macetas y el Turface se lava desde las raices. Las raices se separan del retoño, se colocan en una bolsa de papel y se secan a 70°C durante 70 hr. Las partes de planta secas (raices y retoños) se pesan y se colocan en un tubo cónico de 50 mi con aproximadamente 20 bolas de acero de/32 pulgada y se muelen al agitar en un agitador de pintura. Aproximadamente, 30 mg del tejido molido (peso registrado para el ajuste posterior) se hidroliza en 2ml de H202 al 20% y H2S04 6 M durante 30 min a 170 °C. Después del enfriamiento, agua se adiciona a 20 mi, se mezcla completamente, y una alícuota de 50 µ? se remueve y se adiciona a 950 µ? de Na2C03 1 M. el amoniaco en esta solución se utiliza para estimar el nitrógeno de planta reducido total al colocar 100 µ? de esta solución en cavidades individuales de una placa de 96 cavidades seguido por la adición de 50 µ? de solución OPA. La florescencia, excitación = 360 nM/emisión = 530 nM, se determina y se compara con los estándares de NH4C1 disueltos en una solución similar y tratados con solución OPA.

Solución OPA - ercaptoetanol 5ul + 1 mi de solución de extracto de OPA (se hace fresco, diariamente) Extracto OPA - 50 mg de o-ftadialdehido (OPA - Sigma #P0657) disuelto en 1.5 mi de metanol + 4.4 mi de solución reguladora de Borato I M pH 9.5 (3.09 g de H3B04 + Ig de NaOH en 50 mi de agua) + 0.55 mi de SDS al 20% se hace fresco semanalmente) .

Utilizando estos datos los siguientes parámetros se midieron y las medias se compararon con la Biomasa de Planta Total Biomasa de Raíz Biomasa de Retoño Relación de Raíz/Retoño Concentración de N de la Planta N de Planta Total La variación se calcula con cada bloque utilizando un cálculo de vecino más cercano asi como mediante el Análisis de Variación (ANOV) utilizando un modelo de diseño completamente aleatorio (CRD) . Un efecto de tratamiento total para cada bloque se calcula utilizando una estadística F al dividir el cuadrado medio del tratamiento del bloque total entre el cuadrado medio del error de bloque total.

Cuando el homólogo de maíz de At2g36295 (SEQ ID NO: 8) se sobreexpresa en el maíz, una guía validada mostrará una mejora significante en la biomasa de raíz y de retoño y/o un incremento significante en la concentración de N de la planta en este ensayo de plántula híbrida en KNO3 1 mM.

Ejemplo 10 - Interrelación de las Proteínas Relacionadas La Figura 1 es un dendrograma de los resultados Clustal para Atlg67330 y proteínas relacionadas. Atlg67330 ',5 forma una agrupación con un número de otras especies de \ Arabidopsis y dicotiledóneas. La Figura 2 muestra la alineación de secuencia de Atlg67330 y proteínas relacionadas que incluyen una secuencia consensual. El Osllg29780.1 de arroz, Sb05gl06480 de Sorgo y PC0639489 de Maíz forman un 0 agrupamiento ortólogo de monocotiledónea aparente. Este agrupamiento representa un solo gen de cada especie del conjunto ortólogo de Atlg67330 de monocotiledóneas . Muchos de las otras especies dicotiledóneas, ya sea Brassica (Bs) , Vitis vinifera (Vv) , o Populus trichocarpa (Pt) , exhiben dos 5 miembros en esta subagrupación que contiene Atlg67330.

EJEMPLO 11 - Composición de Librerías de cDNA; Aislamiento y Secuenciación de Clones de cDNA Librerías de cDNA que representan mRNAs de varios tejidos de Canna edulis (Canna) , Momordica charantia (pera 0 balsámica) , Brassica (mostaza) , Cyamopsis tetragonoloba (guar) , Zea mays (maíz), Oryza , sativa (arroz), Glycine max (soja) , Helianthus annuus (girasol) y Triticum aestivum (trigo) se prepararon. Las librerías de cDNA se pueden preparar mediante cualquiera de muchos métodos disponibles. 5 Por ejemplo, los cDNAs se pueden introducir en vectores de plásmido al primero preparar las librerías de cDNA en vectores Uni-ZAP™ XR de acuerdo con el protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) .

Los datos de la secuencia de inserto completa (FIS) se generan utilizando un protocolo de transposición modificado. Los clones identificados para FIS se recuperan de extractos de glicerol archivados como colonias únicas, y los DNAs de plásmido se aislan por la vía de la lisis alcalina. Las plantillas de DNA aisladas se hacen reaccionar con los oligonucleótidos delantero y trasero M13 cebados de vector en una reacción de secuenciación basado en PCR y se cargan en secuenciadores automatizados. La confirmación de la identificación del clon se realiza mediante la alineación de secuencia a la secuencia de EST original de la cual se hace la petición de FIS.

Las plantillas confirmadas se transponen por la vía del equipo de transposición Primer Island (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) que está basado en el elemento transposable Tyl de Saccharomyces cerevisiae (Devine and Boeke (1994) Nucleic Acids Res. 22:3765-3772). El sistema de transposición in vitro coloca sitios de enlace únicos aleatoriamente por toda una población de molécula de DNA grandes. Múltiples subclones se seleccionan aleatoriamente para cada reacción de transposición, los DNAs de plásmido se preparan por la vía de la lisis alcalina y las plantillas se secuencian (mezcla ReadyReaction terminadora de tinte ABI Prism) hacia afuera del sitio de evento de transposición, utilizando cebadores únicos específicos para los sitios de enlace dentro del transposón.

Los datos de secuencia se recolectan (ABI Prism Collections) y se ensamblan utilizando Phred y Phrap (Ewing y colaboradores. (1998) Genome Res. 5:175-185; Ewing y Green (1998) Genome Res. 8:186-194. El fragmento de DNA resultante se liga en un vector de pBluescript utilizando un equipo comercial y siguiendo el protocolo del fabricante. Este equipo se selecciona de muchos disponibles de varios vendedores incluyendo Invitrogen™ (Carlsbad, CA) , Promega Biotech (Madison, WI), y Gibco-BRL (Gaithersburg, MD) . El DNA de plásmido se aisla mediante el método de lisis alcalina y se envía para la secuenciación y ensamble utilizando Phred/Phrap, como en lo anterior.

EJEMPLO 12 - Identificación de Clones de cDNA Clones de cDNA que codifican polipéptidos similares a asociados con la captación de nitrato se identificaron al conducir BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul y colaboradores. (1993) J. Mol. Biol. 275:403-410; ver también la explicación del algoritmo BLAST del sitio de la red mundial para el Centro Nacional para Información de Biotecnología en la Biblioteca Nacional de Medicina de los Institutos Nacionales de Salud) búsquedas para similitud de secuencias contenidas en la base de datos "nr" de BLAST (que comprenden todas las traducciones de CDS de GenBank no redundantes, secuencias derivadas de el Banco de Datos de Proteina de Brookhaven de estructura tridimensional, la última mayor liberación de la base de secuencia de proteina S ISS-PROT, bases de datos EMBL, y DDBJ) . Las secuencias de cDNA obtenidas como es descrito en el Ejemplo 11 se analizaron para la similitud a todas las secuencias de DNA públicamente disponibles contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTN proporcionado por el Centro nacional para la Información de Biotecnología (NCBI). Las secuencias de DNA se tradujeron en todas las estructuras de lectura y se compararon para la similitud a todas las secuencias de proteína públicamente disponibles contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTX (Gish ay States (1993) Nat. Genet. 3:266-272) proporcionada por el NCBI. Por conveniencia, el valor P (probabilidad) de observar una igualación de una secuencia de cDNA o una secuencia contenida en las bases de datos buscadas meramente por oportunidad como es calculado por BLAST se reportan en la presente como valores "pLog", que representan el negativo de logaritmo del valor P reportado. Por consiguiente, entre más grande es el valor de pLog, más grande es la probabilidad de que la secuencia de cDNA y el "acierto" de BLAST represente proteínas homologas.

ESTs enviados para el análisis se comparan con la base de datos de Genbank como es descrito en lo anterior. Los ESTs que contienen secuencia más 5- o 3-cebador se pueden encontrar al utilizar el algoritmo BLASTn (Altschul y colaboradores (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) contra la base de datos patentada de Du Pont que comprende secuencias de nucleótidos que comparten regiones comunes o sobrepuestas de homología de secuencia. Donde existen secuencias comunes sobrepuestas entre dos o más fragmentos de ácido nucleico, las secuencias se pueden ensamblar en una sola secuencia de nucleótidos contigua, asi extendiendo el fragmento original en ya sea la dirección de cebado 5 o 3. Una vez que se identifica el EST más cebado 5, su secuencia completa se puede determinar mediante la secuenciación de inserto completo como es descrito en el Ejemplo 6. Los genes homólogos que pertenecen a diferentes especies se pueden encontrar al comparar la secuencia de aminoácidos de un gen conocido (ya sea de una fuente patentada o una base de datos pública) contra una base de datos de EST utilizando el algoritmo tBLASTn. El algoritmo tBLASTn busca una interrogante de aminoácidos contra una base de datos de un nucleótido que es traducida en todas las 6 estructuras de lectura. Esta búsqueda permite diferencias en la utilización de codón de nucleótido entre diferentes especies, y para la degeneración de codón.

EJEMPLO 13 - Preparación de un Vector de Expresión de Planta Un producto de PCR obtenido utilizando los métodos que son conocidos por un experto en la técnica se puede combinar con el vector donador Gateway®, tal como pDONR™/Zeo (Invitrogen™) . Utilizando la tecnología Invitrogen™ Gateway® Clonase™, el gen Atlg67330 homólogo del clon de entrada luego puede ser transferido a un vector de destino adecuado para obtener un vector de expresión de planta para el uso con Arabidopsis y maíz. Por ejemplo, un vector de expresión que contiene Atlg67330 expresado por el promotor de ubicuitina de maíz, un cásete de resistencia a herbicida y un cásete de clasificación de semilla.

EJEMPLO 14 - Transformación Mediada por AgroJacterium en el Maí Plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar un gen de guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes de varias especies con el fin de examinar el fenotipo resultante.

La transformación mediada por Agrobacterium del maíz se realiza esencialmente como es descrito por Zhao y colaboradores, in Meth. Mol. Biol. 318:315-323 (2006) (ver también Zhao y colaboradores, Mol. Breed. 8:323-333 (2001) y la patente norteamericana No. 5,981,840 expedida el 9 de Noviembre de 1999, incorporada en la presente por referencia) . En proceso de transformación involucra la inoculación de la bacteria, co-cultivación, 5eposo, selección y generación de planta. 1. Preparación del Embrión Inmaduro Embriones inmaduros se disectan de la cariopsis y se colocan en un microtubo de 2 mL que contiene 2 mL del medio PHI-A. 2. Infección con Agrobacterium y Co-Cultivación de Embriones 2.1 Etapa de Infección El medio pHI-A se remueve con una micropipeta de 1 mL y se adiciona 1 mL de suspensión de Agrobacterium. El tubo se invierte levemente para el mezclado. La mezcla se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. 2.2 Etapa de Co-Cultivo La suspensión de Agrobacterium sé remueve de la etapa de infección con una micropipeta de 1 mL. Utilizando una espátula estéril los embriones se raspan del tubo y se transfieren a una placa del medio PHI-B en una placa Petri de 100x15 mm. Los embriones se orientan con el eje embriónico hacia abajo sobre la superficie del medio. Las placas con los embriones se cultivan a 20 °C, en la oscuridad, durante 3 días. L-Cisteina se puede utilizar en la fase de co-cultivación. Con el vector binario estándar, el medio de co-cultivación suministrado con 100-400 mg/L de L-cisteina es critico para recuperar eventos transgénicos estables. 3. Selección de Eventos Transgénicos Putativos A cada placa del medio de PHI-D en una placa de Petri de 100x15 mm, 10 embriones se transfieren, manteniendo la orientación y los discos se sellan con Parafilm. Las placas se incuban en la oscuridad a 28 °C. Los eventos putativos activamente creciendo, como tejido embriónico amarillo pálido se espera que sean visibles en 6-8 semanas. Los embriones que no producen eventos pueden ser cafés y necróticos, y poco crecimiento de tejido friable es evidente. El tejido embriónico transgénico putativo se subcultiva a placas de PHI-D frescas en intervalos de 2-3 semanas, dependiendo de la tasa de crecimiento. Los eventos se registran . 4. Regeneración de plantas T0 El tejido embriónico propagado en el medio PHI-D se subcultiva al medio PHI-E (medio de maduración de embrión somático) ; en cajas de Petri de 10.0x25 mm y se incuban a 28 °C, en la oscuridad, hasta que los embriones somáticos maduran, durante aproximadamente 10-18 días. Los embriones somáticos maduros, individuales con el escutelo y coleóptilo bien definido se transfieren al medio de germinación de embrión PHI-F y se incuban a 28 °C en la luz (aproximadamente 80 µ? de lámparas fluorescentes blancas frías o equivalentes) en 7-10 días, las plantas regeneradas, de aproximadamente 10 cm de alto, se colocan en maceta en la mezcla hortícola y se cultivan utilizando métodos hortícolas estándares.

Medios para la Transformación de Planta PHI-A: 4g/L de sales básales CHU, 1.0 mL/L de mezcla de vitamina de Eriksson 1000 X, 0.5 mg/L de tianamina HCL, 1.5 mg/L de 2,4-D, 0.69 g/L de L-prolina, 58.5 g/L de sacarosa, 36 g/L de glucosa, pH 5.2. Adición de acetosiringona 100 µ?, se esteriliza en el filtro antes del uso.

PHI-B: PHI-A sin glugosa, 2,4-D incrementado a 2 mg/L, sacarosa reducida al 30 g/L y suplementada con 0.85 mg/L de nitrato de plata (esterilizado en filtro), 3.0 g/L de gelrite, acetosiringona 100 µ? (esterilizada en filtro), 5.8.

PHI-C: PHI-B sin gelrite y acetosiringona, 2,4-D reducido a 1.5 mg/L y suplementario con 8.0 g/L de agar, 0.5 g/L de ácido MS-morfolino etano sulfónico (MES) solución reguladora, 100 mg/L de carbenicilina (esterilizada en filtro) .

PHI-D: PHI-C suplementado con 3 mg/L de bialafos (esterilizada en filtro) .

PHI-E: 4.3 g/L de sales de Murashige y Skoog (MS) (Gibco, BRL 11117- 074), 0.5 mg/L de ácido nicotinico, 0.1 mg/L de tiamina HC1, 0.5 mg/L de piridoxina HC1, 2.0 mg/L de glicina, 0.1 g/L de mío inositol, 0.5 mg/L de zeatina (Sigma, cat.no. Z-0164), 1 mg/L de ácido indolo acético (IAA), 26.4 g/L de ácido abscisico (ABA) , 60 g/L de sacarosa, 3 mg/L de bialafos (esterilizada en filtro) , 100 mg/L de carbenicilina (essterilizada en filtro) , 8 g/L de agar, pH 5.6. 6. PHI-F: PHI-E sin zeatina, IAA, ABA; sacarosa reducida a 40 g/L; reemplazo de agar con 1.5 g/L de gelrite; pH 5.6.

Las plantas se pueden regenerar del callo transgénico al primero transferir agrupaciones de tejido al medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,'4-D. Después de dos semanas el tejido se transfirió al medio de regeneración (Fromm y colaboradores. (1990) Bio/Technology 5:833-839). Se puede realizar el análisis fenotipico de las plantas T0 transgénicas y plantas TI.

Las plantas TI se pueden analizar para cambios fenotipicos. Utilizando el análisis de imagen las plantas TI se pueden analizar para cambios fenotipicos en el área de la planta, volumen, tasa de crecimiento y análisis de color se puede tomar en múltiples tiempos durante el crecimiento de las plantas. La . alteración en la arquitectura de la raíz se puede ensayar como es descrito en la presente.

El análisis de alteraciones en características agronómicas se puede hace r para determinar si las plantas que contiene el gen de guia de Arabidopsis validado tiene una mejora de por lo menos una característica agronómica, cuando se compara con las plantas de control (o de referencia) que no contiene el gen de guía de Arabidopsis validado. Las alteraciones también se pueden estudiar bajo varias condiciones ambientales.

Los constructos de expresión que contienen Atlg67330 que dan por resultado una alteración significante en la biomasa de la raíz y/o retoño, color verde mejorado, mazorca más grande en ántesis o rendimiento será evidencia considerada de que el gen de Arabidopsis funciona en el maíz para alterar la eficiencia de uso de nitrógeno.

EJEMPLO 15 - Transformación del Maíz con los Genes de Guía de Arabidopsis Validados Utilizando Bombardeo de Partículas Las plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar un gen de guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes de varias especies con el fin de examinar el fenotipo resultante.

Los clones de entrada Gateway® descritos en el Ejemplo 13 se pueden utilizar para clonar direccionalmente cada gen en un vector de transformación de maíz. La expresión del gen en el maíz puede estar bajo el control de un promotor constitutivo tal como el promotor de ubicuitina de maíz (Christensen y colaboradores, Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) y Christensen y colaboradores, Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)).

El constructo de DNA recombinante descrito en lo anterior luego se puede introducir en células de maíz por el siguiente procedimiento. Embriones de maíz inmaduros se pueden disectar de la cariopsis en desarrollo derivado de cruzas de las líneas de maíz endogámicas H99 y LH132. Los embriones se aislan 10 a 11 días después de la polinización cuando están de 1.0 a 1.5 mm de largo. Los embriones luego se colocan con el lado del eje enfrentado hacia abajo y en contacto con el medio N6 solidificado de agarosa (Chu y colaboradores, Sci. Sin. Peking 18:659-668 (1975)). Los embriones se conservan en la oscuridad a 27°C. El callo embriogénico friable que consiste de masas no diferenciadas de células con proembriones somáticos y embriones portados en estructuras suspensoras proliferan del escutelo de estos embriones inmaduros. El callo embriogénico aislado de la explanta primaria se puede cultivar en el 'medio N6 y subcultivar en este medio cada dos o tres semanas.

El plásmido, p35S/Ac (obtenido de Dr. Peter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) se puede utilizar en experimentos de transformación con el fin de proporcionar un marcador seleccionable . Este plásmido contiene el gen PAT (ver la publicación de patente Europea 0 242 236) que codifica fosfinotricina acetil transferasa (PAT) . La enzima PAT confiere Resistencia a los inhibidores de glutamina sintetasa herbicida tal como fosfinotricina . El gen pat en '' p35S/Ac está bajo el control del promotor 35S del virus de mosaico de coliflor (Odell y colaboradores, Nature 313:810- '5 812 (1985) ) y la región 3' del gen de nopalina sintasa del T- DNA del plásmido Ti de Agrobacterium turnefaciens .

El método de bombardeo de partículas (Klein y colaboradores, Nature 327:70-73 (1987)) puede ser utilizado para transferir genes a las células de cultivo de callo. De 0 acuerdo .con este método, partículas de oro (1 µ?a en diámetro) o recubren con DNA utilizando la siguiente técnica. Diez µg de DNAs de plásmido se adiciona a 50 µ?, de una suspensión de partículas de oro (60 mg por mL) . Cloruro de calcio (50 pL de una solución de 2.5 M) y base libre de espermidina (20 pL de 15 una solución de 1.0 M) se adicionaron a las partículas. La suspensión se somete a vórtices durante la adición de estas soluciones. Después de diez minutos, los tubos se centrifugan brevemente (5 seg en 15,000 rpm) y el sobrenadante se remueve. Las partículas se resuspenden en 200 ]iL de etanol 0 puro, se centrifugan nuevamente y el sobrenadante se remueve.

El enjuague de etanol se realiza nuevamente y las partículas se resuspenden en un volumen final de 30 pL de etanol. Una alícuota (5 pL) de la partícula de oro recubierta de DNA se puede colocar en el centro de un disco volante Kapton™ (Bio- 5 Rad Labs) . Las partículas luego se aceleran en el tejido de maiz con un Biolistic® PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA) , utilizando una presión de helio de 1000 psi, una distancia de espacio de 0.5 citi y una distancia volante de 1.0 cm.

Para el bombardeo, el tejido embriónico se coloca sobre papel filtro en medio N6 solidificado de agarosa. El tejido se arregla como una capa delgada y se cubre un área circular de aproximadamente 5 cm en diámetro. La placa petri que contiene el tejido se puede colocar en la cámara del PDS-1000/He aproximadamente 8 cm desde la criba de detención. El aire en la cámara luego se evacúa a un vacio de 28 pulgadas de Hg. El macroportador se acelera con una onda de choque de helio utilizando una membrana de ruptura que estalla cuando la presión de He en el tubo de choque alcanza 1000 psi.

Siete días después del bombardeo el tejido se puede transferir al medio N6 que contiene bialafos (5 mg por litro) y carece de caseína o prolina. El tejido continua creciendo lentamente en este medio. Después de dos semanas adicionales el tejido se puede transferir al medio N6 fresco que contiene bialafos. Después de seis semanas, áreas de aproximadamente 1 cm en diámetro de callo activamente creciendo se puede identificar en algunas de las placas que contienen el medio suplementado de bialafos. Estos callos pueden continuar creciendo cuando sub-cultivan en el medio selectivo.

Las plantas se pueden regenerar del callo transgénico al primero transferir agrupaciones de tejido al medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido se puede transferir al medio de regeneración (Fromm y colaboradores, Bio/Technology 8:833-839 (1990)) . Las plantas T0 transgénicas se pueden regenerar y su fenotipo determinar siguiendo procedimientos de HTP. La semilla TI se puede recolectar.

Las plantas TI se pueden cultivar y analizar para cambios fenotipicos. Los siguientes parámetros se pueden cuantificar utilizando el análisis de imagen: área de planta, volumen, tasa de crecimiento y análisis de color se pueden recolectar y cuantificar. Los constructos de expresión que dan por resultado una alteración de la arquitectura de raíz o cualquiera de las características agronómicas listadas en lo anterior comparadas con las plantas de control adecuadas, se pueden considerar evidencia de que el gen guía de Arabidopsis funcione en el maíz para alterar la arquitectura de la raíz o la arquitectura de la planta.

Además, un constructo de DNA recombinante que contiene un gen de Arabidopsis validado se puede introducir en una línea de maíz ya sea mediante la transformación directa o introgresión de una línea separadamente transformada.

Las plantas transgénicas, ya sea endogámicas o híbridas, pueden someterse a experimentos basados en campos más vigorosos para estudiar la arquitectura de la raiz o de la planta, el aumento de rendimiento y/o resistencia a la fijación de la raíz bajo varias condiciones ambientales (por ejemplo, variaciones en disponibilidad de nutrientes y agua) . 5 El análisis de rendimiento subsecuente también se puede hacer para determinar si las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado tiene una mejora en el desempeño . del rendimiento, cuando se compara con las plantas ! de control (o de referencia) que no contienen el gen de guía 0 de Arabidopsis validado. Las plantas que contienen el gen de guía de Arabidopsis validado mejorarían el rendimiento con relación a las plantas de control, de preferencia 50% menos pérdida de rendimiento bajo condiciones ambientales adversas o tendrían rendimiento incrementado con relación a las 5 plantas de control bajo condiciones ambientales variantes.

EJEMPLO 16 - Electroporación de LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens Células competentes de electroporación (40 µ?) , tales como LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (que contiene-0 PHP10523), se congelan en hielo (20-30 min) . PHP10523 contiene genes VIR para la transferencia de T-DNA, un origen de replicación de plásmido del número de copias bajo de Agrobacterium, un gen de resistencia a tetraciclina, y un ; sitio eos para una recombinación biomolecular de DNA in vivo. 5 Mientras tanto la probeta de electroporación se enfría en hielo. Los ajustes del electroporador se ajustan a 2.1 kV.

Una alícuota de DNA (0.5 yL JT (US 7,087, 812) DNA parental a una concentración de 0.2 \ig - 1.0 \ig en solución reguladora de bajo contenido de sal o H20 destilado dos veces) se mezcla con las células de Agrobacteriu congeladas mientras que están todavía en hielo. La mezcla se transfiere al fondo de la probeta de electroporacion y se mantiene en reposo en hielo durante 1 - 2 min. Las células se electroporan (electroporador 2510 de Eppendorf) al empujar el botón de "Pulso" dos veces (idealmente logrando' un pulso de 4.0 mseg) . Subsecuentemente 0.5 mi del medio 2xYT (o medio SOC) se encierra en la probeta y se transfieren a un tubo Falcon de 15 mi. Las células se incuban a 28-30°C, 200-250 rpm durante 3 h.

Alícuotas de 250 yl se dispersan en placas #3ÓB (YM + 50 g/mL de Espectinomicina) y se incuban 3 días a 28-30°C. Para incrementar el número de transformantes se puede realizar una de dos etapas opcionales: Opción 1: sobreponer las placas con 30 µ? de 15 mg/ml de Rifampicina. LBA4404 tiene un gen de resistencia cromosómico para Rifampicina. Esta selección adicional elimina algunas colonias contaminantes observadas cuando se utilizan preparaciones más deficientes de células competentes de LBA4404.

Opción 2: Realizar dos replicados de la electroporacion para compensar las células electrocompetentes más deficientes.

Identificación de Transformantes: Cuatro colonias independientes se colectan y se colocan en el medio mínimo AB más 50 mg/mL de placas de ;5 Espectinomicina (medio #12S) para el aislamiento de codones individuales. Las placas se incuban a 28 °C durante 2-3 días.

; Una sola colonia para cada co-integrado putativo se recolecta y se inocula con 4 mi de #60A con 50 mg/1 de Espectinomicina. La mezcla se incuba durante 24 h a 28 °C con 0 · agitación. El DNA de plásmido de 4 mi de cultivo se aisla utilizando el lavado de Qiagen Miniprep más PB opcional. El DNA se eluye en 30 µ?. Las alícuotas de 2 µ? se utilizan para electroporar 20 µ? de DHlOb + 20 µ? de ddH20 según lo anterior. 5 Opcionalmente una alícuota de 15 µ? se puede ' utilizar para transformar 75-100 µ? de Invitrogen™-DH5 Deficiencia de Librería. Las células se dispersan en el medio LB más 50 mg/mL de placas de Espectinomicina (medio #34T) y se incuban a 37 °C durante la noche. 0 Tres a cuatro colonias independientes se recolectan para cada co-integrado putativo y se inoculan 4 mi de 2xYT (#60A) con 50 µg/ml de Espectinomicina. Las células se incuban a 37 °C durante la noche con agitación.

El DNA de plásmido se aisla de 4 mi de cultivo 5 utilizando QIAprep® Miniprep con lavado de PB opcional (eluido en 50 µ?) y 8 µ? se utilizan para la digestión con Salí (utilizando JT parent y PHP 10523 como controles) .

Tres digestiones más utilizando las enzimas de restricción BamHI, EcoRI, y HindIII se realizan para 4 plásmidos que representan 2 co-integrados putativos que corrigen el patrón de digestión de Salí (utilizando DNA parental y PHP10523 como controles) . Geles electrónicos se recomiendan para comparación.

EJEMPLO 17 - Transformación del Grano Duro Gaspe Bay Derivado de Lineas de Maíz con Genes de Guia de Arabidopsis Validados y Homólogos Correspondientes de Otras Especies Plantas de maíz se pueden transformar como es descrito en el Ejemplo 14-16 que sobreexpresan el gen AT1G67330 de Arabidopsis y los homólogos correspondientes de otras especies, tal como aquellos listados en la Tabla 1, con el fin de examinar el fenotipo resultante. Los promotores que incluyen pero no limitados al promotor S2B, el promotor R00TMET2 de maiz, el Ciclo de maíz, el CR1BIO, el CRWAQ81 y otros son útiles para dirigir la expresión de homólogos de Atlg67330 en el maiz. Además, una variedad de terminadores , tales como, pero no limitados al terminador PINII se puede utilizar para agregar la expresión del gen de interés en Grano Duro Gaspe Bay Derivado de Lineas de Maiz.

Plantas Recipientes Las células de planta recipiente pueden ser de una linea de maiz uniforme que tiene un ciclo de vida corto ("ciclado rápido") , un tamaño reducido, y alto potencial de transformación. Típico de estas células de plantas para maíz son células de plantas de cualquiera de las variedades de línea de grano duro Gaspe Bay (GBF) públicamente disponibles. Una variedad de líneas de plantas candidata posible es el híbrido Fl de GBF x QTM (Quick Turnaround Maíz, Una forma públicamente disponible del grano duro Gaspe Bay seleccionado para el crecimiento bajo condiciones de invernadero) divulgada en Tomes y colaboradores de la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 2003/0221212. Las plantas transgénicas obtenidas de esta línea son tales que un tamaño reducido que puede ser cultivado en macetas de cuatro pulgadas (1/4 el espacio necesario para una planta de maíz de tamaño normal) y madura en menos de 2.5 meses. (Tradicionalmente en 3.5 meses se requiere para obtener semilla T0 transgénica una vez que las plantas transgénicas se aclimatan al invernadero) . Otra línea adecuada es una línea haploide doble de GS3 (una línea altamente transformable) Grano Duro X Gaspe. Todavía otra línea adecuada es una línea endogámica de élite transformable que lleva un transgén que causa florecimiento temprano, estatura reducida, o ambos.

Protocolo de Transformación Cualquier método adecuado se puede utilizar para introducir los transgenes en las células de maíz, incluyendo pero no limitados a procedimientos de tipo de inoculación utilizando vectores basados en Agrobacterium como es descrito en el Ejemplo 14 y 15. La transformación se puede realizar en embriones inmaduros de la planta recipiente (objetivo) .

Rastreo del Crecimiento de Precisión y la Planta La población de eventos de plantas transgénicas (TO) que resultan de embriones de maíz transformados se cultivan en un ambiente de invernadero controlado utilizando un diseño de bloque aleatorizado modificado para, reducir o eliminar el error ambiental. Un diseño de bloque aleatorizado es un arreglo de planta en el cual las plantas experimentales se dividen en grupos (por ejemplo, treinta plantas por grupo) , referidos como bloques, y cada planta se asigna aleatoriamente a una ubicación con el bloque.

Para un grupo de treinta plantas, veinticuatro plantas experimentales, transformadas y seis plantas de control (plantas con un fenotipo de ajuste) (colectivamente, un "grupo replicado") se colocan en macetas que están arregladas en un arreglo (es decir un grupo replicado o bloque) sobre una mesa ubicada dentro de un invernadero. Cada planta, control o experimental, se asigna aleatoriamente a una ubicación con el bloque que es mapeado a una ubicación de invernadero física, única, asi como al grupo replicado. Múltiples grupos replicados de treinta plantas cada una se puede cultivar en el mismo invernadero en un solo experimento. La disposición (arreglo) de los grupos replicados debe ser determinado para minimizar los requerimientos de espacios asi como los efectos ambientales dentro del invernadero. Tal disposición puede ser referida como una disposición del invernadero comprimida.

Una alternativa a la adición de un grupo de control especifico es para identificar aquellas plantas transgénicas que no expresión el gen de interés. Una variedad de técnicas tal como RT-PCR se puede aplicar para estimar cuantitativamente el nivel de expresión del gen introducido. Las plantas TO que no expresan el transgén se pueden comparar con aquellas que lo hacen.

Cada planta en la población de evento se identifica y se rastrea a través del proceso de evaluación, y los datos se recolectan de esa planta que es automáticamente asociado con aquella planta de modo que los datos recolectados pueden ser asociados con el transgén portado por la planta. Por ejemplo, cada recipiente de planta puede tener una etiqueta leíble en máquina (tal como un código de barras de Código de Producto Universal (UPC) ) que incluye información acerca de la identidad de la planta. Que a su vez se correlaciona con la ubicación del invernadero de modo que los datos obtenidos de la planta pueden ser asociados automáticamente con esa planta.

Alternativamente cualquier sistema de identificación de planta, leíble en máquina, eficiente se puede utilizar, tal como códigos de matriz bidimensionales o aun etiquetas de identificación de frecuencia (RFID) en el ;5 cual los datos se reciben y se interpretan por un receptor/procesador de radiofrecuencia. Ver la solicitud de patente publicada norteamericana No. 2004/0122592, incorporada en la presente por referencia.

Análisis Fenotípico Utilizando la Formación de 10 Imagen Tridimensional Cada planta de invernadero en la población del evento T0, que incluye cualquiera de las plantas de control, se analiza para las características agronómicas de interés, y los datos agronómicos para cada planta se registran o se ?5 almacenan de una manera de modo que es asociada con los datos de identificación (ver lo anterior) para esa planta. La confirmación de un fenotipo (efecto de gen) se puede realizar en la generación TI con un diseño experimental similar a aquel descrito en lo anterior. 20 Las plantas T0 se analizan en el nivel fenotípico utilizando la tecnología de formación de imagen no destructiva, cuantitativa por todo el ciclo del invernadero completo de la planta para estimar los atributos de interés. De preferencia, un analizador de imagen digital se utiliza 25 para el análisis multidimensional automático de las plantas totales. La formación de imagen se puede hacer dentro del invernadero. Dos sistemas de cámara, localizadas en la parte superior y lateral, y un aparato para girar la planta, se utilizan para visualizar y formar en imagen las plantas de todos los lados. Las imágenes se adquieren de la parte superior, frente y ' lado de cada planta. Todas las tres imágenes conjuntamente proporcionan información suficiente para evaluar la biomasa, tamaño y morfología de cada planta.

Debido al cambio del tamaño de las plantas desde el tiempo en que aparece la primera hoja del suelo al tiempo en que las plantas están al final de su desarrollo, las etapas tempranas del desarrollo de la planta se documentan mejor con un aumento más alto desde la parte superior. Esto se puede realizar al usar un sistema de lente de zoom motorizado que se controla completamente mediante el software de formación de imagen.

En una sola operación de análisis de formación de imagen, los siguientes eventos ocurren: (1) la planta se transporta dentro del área analizadora, se gira a 360 grados de modo que su etiqueta adherible a la máquina puede ser leída, y se deja en reposo hasta que se detiene el movimiento; (2) la imagen lateral se toma y se introduce en una base de datos; (3) la planta se gira 90 grados y nuevamente se deja en reposo hasta que se deja de tener en movimiento, y (4) la planta se transporta fuera del analizador.

Las plantas se dejan por lo menos seis horas de oscuridad por periodo de veinticuatro horas con el fin de tener un ciclo de dia/noche normal.

Instrumentación de la Formación de Imagen Cualquier instrumentación de la formación de imagen adecuada se puede utilizar, incluyendo pero no limitada a la instrumentación en la formación de imagen digital de espectro de luz comercialmente disponible de una LemnaTec GmbH de Wurselen, Alemania. Las imágenes se toman y se analizar con un LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 que tiene un dispositivo de formación de imagen de CCD de IEE de Exploración Progresiva 1/2" IT. Las cámaras de formación de imagen se pueden equipar con un zoom motorizado, abertura motorizada y enfoque motorizado. Todos los arreglos de cámara se pueden hacer utilizando el software LemnaTec. De preferencia, la variación instrumental del analizador de formación de imagen es menor que aproximadamente 5% para componentes mayores y menor que aproximadamente 10% para componentes menores.

Software El sistema de análisis de formación de imagen comprende un programa de software LemmaTec HTS Bonit para el análisis de color y arquitectura y una base de datos de servidor para almacenar datos de aproximadamente 500,000, incluyendo los datos de análisis. Las imágenes originales y las imágenes analizadas se analizan conjuntamente para permitir al usuario hacer el reanálisis como sea deseado. Las bases de datos se pueden conectar al hardware de formación de imagen para la recolección de datos automática y el , 5 almacenamiento. Una variedad de sistemas de software , comercialmente disponible (por ejemplo Matlab, otros) se ' puede utilizar para la interpretación cuantitativa de los datos de formación de imagen, y cualquiera de estos sistemas de software se puede aplicar al conjunto de datos de imagen. 0 Sistema Transportador Un sistema transportador con un dispositivo de rotación de planta se puede utilizar para transportar las plantas al área de formación de imagen y rotarla durante la formación de imagen. Por ejemplo, hasta cuatro plantas, cada 5 una con una altura máxima de 1.5 m, se cargan en carros que 1 viajan sobre el sistema transportador circulante y a través del área de medición de formación de imagen. En este caso la ! impresión total de la unidad (analizador de imagen y vuelta al transportador) es aproximadamente 5 m x 5 m. 0 El sistema transportador puede ser agrandado para ajusfar más plantas a la vez. Las plantas se transportan a lo largo de la vuelta del transportador al área de formación de imagen y se analizan por hasta 50 segundos por planta. Tres vistas de la planta son tomadas. El sistema transportador, 5 asi como el equipo de formación de imagen, deben ser capaces de ser utilizados en condiciones ambientales del invernadero. ' Iluminación ' Cualquier modo de iluminación adecuado se puede utilizar para la adquisición de imagen. Por ejemplo, una luz 5 superior arriba de un fondo negro se puede utilizar.

Alternativamente, una combinación de luz superior y posterior utilizando un fondo blanco se puede utilizar. El área iluminada debe ser alojada para asegurar las condiciones de iluminación constantes. El alojamiento debe ser bastante 0 largo que el área de medición de modo que las condiciones de luz constantes prevalezcan sin requerir la abertura y cierre de las puertas. Alternativamente, la iluminación se puede variar para causar excitación de ya sea el transgén (por ejemplo proteina fluorescente verde (GFP) , proteina 5 fluorescente roja (RFP) ) o fluoróforos endógenos (por ejemplo, Clorofila).

Estimación de Biomasa Basado en la Formación de Imagen Tridimensional Para mejor estimación de la biomasa las imágenes de 0 planta que deben ser tomadas de por lo menos tres ejes, de preferencia la parte superior y las vistas de dos lados (lados 1 y 2) . Estas imágenes luego se analizan para separar la planta desde el fondo, la maceta y la bolsa de control de polen (si es aplicable) . El volumen de la planta se puede 5 estimar mediante el cálculo: volumen (vosels) =Área Superior (pixeles JxÁrea de Lado 1 (pixeles) (Área de Lado 2 (pixeles) En la ecuación arriba de las unidades de volumen y área son "unidades arbitrarias". Las unidades arbitrarias son completamente suficientes para detectar efectos del gen sobre ,5 el tamaño de la planta en crecimiento en este sistema debido a que lo que se desea- es detectar diferencias (tanto más grandes positivas y más pequeñas negativas) de la media experimental o media de control. Las unidades arbitrarias de tamaño (por ejemplo área) se pueden convertir trivialmente a 0 mediciones físicas mediante la adición de una referencia física al proceso de formación de imagen. Por ejemplo, una referencia física del área conocida se puede incluir en los procesos de formación de imagen de la parte superior y ; lateral. Basado en el área de estas referencias físicas un 5 factor de conversión se puede determinar para permitir la conversión de pixeles a una unidad diaria tal como centímetros cuadrados (cm2) . La referencia física puede o no puede ser una muestra independiente. Por ejemplo, la maceta, con un diámetro y altura conocidos, podría servir como una 0 referencia física adecuada.

Clasificación de Color La tecnología de formación de imagen también se puede utilizar para determinar el color de la planta y asignar colores de planta a varias clases de color. La 5 asignación de colores de imagen a clases de color es una característica inherente del software LemnaTec. Con otros sistemas de software de análisis de imagen la clasificación de color se puede determinar por una variedad de procedimientos computacionales .

Para la determinación del tamaño de la planta y los parámetros de crecimiento, un esquema de clasificación útil es definir un esquema de color simple que incluye dos o tres matices de verde y, además una clase de color para clorosis, necrosis y blanqueamiento, si estas condiciones ocurren. Una clase de color de fondo que incluye nada de color de planta en imagen (por ejemplo, colores de la maceta y el suelo) también se utilizan y estos pixeles se excluyen específicamente de la determinación de tamaño. Las plantas se analizan bajo la iluminación constante controlada de modo que cualquier cambio dentro de una planta a través del tiempo, o entre las plantas o diferentes lotes de plantas (por ejemplo, diferencias estacionales) se pueden cuantificar.

Además de su utilidad en determinar el crecimiento de tamaño de la planta, la clasificación de color se puede utilizar para estimar otros atributos del componente al rendimiento. Para estos otros atributos del componente al rendimiento se pueden utilizar esquemas de clasificación de color adicionales. Por ejemplo, el atributo conocido como "siempre verde" que se ha asociado con mejoras en el rendimiento, se puede estimar mediante una clasificación de color que separa los matices de verde de los matices de amarillo y cafés (que son indicativos de tejido senescentes). Al aplicar esta clasificación de color las imágenes tomadas hacia el final del ciclo de vida de las plantas TO o TI, las ;5 plantas que tienen cantidades incrementadas de color verde con relación a los colores amarillo y café (expresados, por ejemplo, con Relación de Verde/Amarillo) se puede identificar. Las plantas con una diferencia significante en esta relación de Verde/Amarillo se pueden identificar como 0 que llevan transgenes que impactan este atributo agronómico , importante.

El biólogo experto en plantas reconocerá que otros colores de plantas surgen los cuales pueden indicar respuesta de salud o estrés de la planta /por ejemplo, antocianinas) , y 15 que otros esquemas de clasificación de color pueden proporcionar medidas adicionales de la acción del gen en atributos relacionados con estas respuestas.

Análisis de Arquitectura de la Planta Los transgenes que modifican los parámetros de 0 arquitectura de la planta también se pueden identificar utilizando la presente invención, incluyendo tales parámetros como altura y ancho máximo, distancia internodales, ángulo entre las hojas y el tallo, número de hojas que comienzan en los nodos y longitud de la hoja. El software del sistema 5 LemnaTec se puede utilizar para determinar la arquitectura de la planta como sigue. La planta se reduce a su arquitectura geométrica principal en una primera etapa de formación de imagen y luego, basado en esta imagen, se pueden realizar la identificación parametrizada de los diferentes parámetros de 5 arquitectura. Los transgenes que modifican cualquiera de estos parámetros de arquitectura ya sea individualmente o en combinación se pueden identificar al aplicar los procedimientos estadísticos previamente descritos.

Fecha de Caída de Polen 0 La fecha de caída de polen es un. parámetro importante que es analizado en una planta transformada, y se puede determinar por la primera aparición de la planta de una i flor masculina activa. Para encontrar el objetivo de flor masculina, el extremo superior del tallo se clasifica por 15 color para detectar anteras de color amarillo violeta. Este análisis de clasificación de color luego se utiliza para definir una flor activa, y a su vez se puede utilizar para calcular la fecha de caída de polen.

Alternativamente, la fecha de caída de polen y 0 otros atributos de la planta visualmente detectados de manera fácil (por ejemplo, fecha de polinización, fecha de la primera extensión sedosa) se puede registrar por el personal responsable para realizar el cuidado de la planta. Para maximizar la integridad de los datos y eficiencia del proceso 5 estos datos son rastreados al utilizar los mismos códigos de barras utilizados por el dispositivo de análisis digital de espectro de luz LeranaTec. Una computadora con un lector de ¡ código de barras, un dispositivo de palma, o una PC notebook se puede utilizar para la facilidad de captura de datos que 5 registran el tiempo de observación, identificación de la planta y el operador quien capturó los datos.

Orientación de las Plantas Las plantas de maíz maduras cultivadas en , densidades que se aproximan a plantación comercial 0 frecuentemente una arquitectura planta. Esto es, la planta tiene un lado amplio claramente discernible, y un lado angosto. La imagen de la planta del lado amplio se determina. A cada planta una orientación básica bien definida se asigna para obtener la diferencia máxima entre las imágenes del lado 5 amplio y delgado. La imagen superior se utiliza para determinar el eje principal de la planta, y un dispositivo de rotación adicional se utiliza para girar la planta a la orientación apropiada antes de iniciar la adquisición de imagen principal. 0 EJEMPLO 18 - Clasificación del Grano Duro Gaspe Bay Derivado de Líneas de Maíz Bajo Condiciones Limitantes de Nitrógeno Las plantas transgénicas contendrán dos o tres dosis de Gaspe Flint-3 con una dosis de GS3 (GS3/ (Gaspe-3 ) 2X o GS3/ (Gaspe-3) 3X) y segregarán 1:1 para un transgén 5 dominante. Las plantas serán plantadas en TURFACE®, un medio de maceta comercial, y se rociarán cuatro veces cada día con el medio de crecimiento de KNO3 1 mM y con KN03 2 mM, o más alto, del medio de crecimiento. Las plantas de control cultivadas en el medio de KN03 1 mM será menos verde, producen menos biomasa y tienen una mazorca más pequeña en la antesis. El análisis estadístico se utiliza para decidir si las diferencias observadas entre los tratamientos son realmente diferentes.

La expresión de un transgén dará por resultado plantas con crecimiento de planta mejorada en KNO3 1 mM, cuando se compara con un nulo transgénico. Así la biomasa y verdocidad serán monitoreadas durante el crecimiento y comparado con un nulo transgénico. Las mejoras en el crecimiento, verdocidad y tamaño de la mazorca de la ántesis serán indicaciones de tolerancia al nitrógeno incrementado. Ejemplo 19 - Plantas de Maíz Transgénicas Se generaron plantas de maíz transgénicas T0 que contienen el constructo asociado con la captación de nitrato bajo el control de un promotor. Estas plantas se cultivaron en condiciones de invernadero bajo el sistema FASTCORN, como es detallado en la publicación de solicitud de patente norteamericana 2003/0221212, solicitud de patente norteamericana No. 10/367,417.

Cada una de las plantas se analizó para la alteración medible en una o más de las siguientes características de la siguiente manera: La progenie Ti derivada de la autofertilización de cada planta ?? que contiene una sola copia de cada constructo asociado con la captación de nitrato que se encontraron que segregan 1:1 para el evento transgénico se analizaron para la tasa de crecimiento mejorada en bajo KN03. El crecimiento se monitoreó hasta la antesis cuando el crecimiento de planta acumulativo, tasa de crecimiento y peso de la mazorca se determinaron para el transgén positivo, transgén nulo y eventos de controles no transformados. La distribución del fenotipo de plantas individuales se comparó con la distribución de un conjunto de control y a la distribución de todos los tratamientos restantes. La variaciones de cada conjunto se calcularon y se compararon utilizando una prueba F, que compara la variación de evento a una variación de evento de control no transgénico y a la variación acumulada de los eventos restantes del experimento. Entre más grande es la respuesta a KN03, más grande es la variación dentro de un conjunto de eventos y más grande es el valor F. Los resultados positivos serán comparados con la distribución del transgén dentro del evento para asegurarse que la respuesta de los segregados con el transgén.

Ejemplo 20 - Estudios en Invernadero Plantas transgénicas de maíz que expresan Atlg67330 inducidas por el promotor de ubicuitina de maíz se analizaron para diferentes parámetros incluyendo pero no limitados a color, área de superficie total, tasa de crecimiento, ! mediciones de mazorca y peso fresco del retoño como es descrito en el Ejemplo 17, 18 y 19. .5 Las plantas transgénicas de maíz que contienen ! Atlg67330 inducidas por el promotor de ubicuitina de maíz mostraron diferencias en el color. Bajo condiciones de nitrato limitantes, los segregantes nulos muestran una disminución en el verde y un incremento en el verde claro. 0 Los segregantes positivos demostraron mejoras significantes para el % de verde bajo condiciones de bajo contenido de nitrógeno. Los eventos que tuvieron los niveles más altos de expresión mostraron una disminución significante en el verde claro bajo condiciones de bajo contenido de nitrógeno. 5 Algunas plantas aparecen para crecer más lentamente que los segregantes nulos como se observa en SGR, el área de superficie total y el peso fresco del retoño; sin embargo, el crecimiento de la mazorca fue significativamente más grande bajo las condiciones de bajo contenido de nitrógeno. Bajo las 0 condiciones de nitrógeno óptimas algunas plantas demostraron una reducción significante en el crecimiento de la mazorca. Aunque algunas plantas transgénicas exhibieron una reducción en el crecimiento de la mazorca, los segregantes positivos mostraron desempeño mejorado para SGR, área de superficie 5 total y peso fresco del retoño bajo condiciones de nitrógeno óptimas.

Ejemplo 21 - Análisis del evento transgénico de lotes en campo Los eventos transgénicos se evaluaron en lotes en '5 campo donde el rendimiento es limitado por la reducción de la 1 aplicación de fertilizante por 30% o más. Las mejoras en el ¦ rendimiento, componentes del rendimiento, u otros atributos ' agronómicos entre las plantas transgénicas y no transgénicas en estos lotes de fertilidad de nitrógeno reducido se utiliza 0 para estimar mejoras en la utilización de nitrógeno construido por la expresión de eventos transgénicos. Comparaciones similares se hacen en lotes suplementados con proporciones de fertilidad de nitrógeno recomendadas. Los eventos transgénicos efectivos son aquellos que logran 5 rendimientos similares en los experimentos limitados de nitrógeno y de nitrógeno normal.

Ejemplo 22 - Estudios en el Campo Bajo condiciones de nitrógeno normales, las plantas transgénicas de maiz que expresan Atlg67330 inducido por el 0 promotor de ubicuitina de maiz mostraron un incremento significante en el rendimiento cuando se comparan con los controles. Los transgénicos de maiz que expresan pco639489, es inducido por el promotor de ubicuitina de maiz mostraron un incremento significante en el rendimiento cuando se 5 comparan con los controles bajo condiciones de nitrógeno reducidos .

En un segundo año de evaluación en campo las plantas de maíz transgénicas que expresan pco639489 de maíz inducido por el promotor de ubicuitina de maíz mostraron un .5 incremento significante en el rendimiento cuando se compara con los controles bajo condiciones de nitrógeno reducidas. Sin embargo, también hubo una disminución significante en el rendimiento de un ensayo cuando se compara con los controles i bajo condiciones de nitrógeno reducidas. 0 EJEMPLO 23 - Ensayos para Determinar las Alteraciones de la ; Arquitectura de Raíz en el Maíz Plantas de maíz transgénicas se ensayaron para cambios en la arquitectura de la raíz en la etapa de plántula, tiempo de florecimiento o madurez. Los ensayos para 5 medir las alteraciones de la arquitectura de la raíz de las plantas de maíz incluyen, pero no están limitados a los métodos resumidos enseguida. Para facilitar los ensayos manuales o automatizados de las alteraciones de arquitectura de raíz, plantas de maíz se pueden cultivar en macetas 0 claras. 1) Masa de raíz (peso seco) . Las plantas se cultivan en Turface®, un medio de crecimiento que permite la separación fácil de las raíces. El retoño secado en el horno y los tejidos de raíz se pesan 5 en una relación de raíz/retoño calculada. 2) Niveles de ramificación de raíz lateral. El grado de ramificación de raíz lateral (por ejemplo, número de raices laterales, longitud de raíz lateral) se determina al submuestrear un sistema de raíz completo, formar imagen con un explorador de lecho plano o una cámara digital y al analizar con el software WinRHIZO™ (Regent Instruments Inc. ) . 3) Mediciones del ancho de banda de raíz. La banda 0 de raíz es la banda o masa de raices que se forman en el fondo de las macetas de invernadero a medida que maduran las plantas. El espesor de ' la banda de raíz se mide en mm en la madurez como un estimado aproximado de la masa de raíz. 5 4) Conteo de raices nodales. El número de raices ' coronadas que provienen de los nodos superiores se pueden determinar después de separar la raíz del medio de soporte (por ejemplo, mezcla de maceta) . Además el ángulo de las raices coronadas 0 y/o raices enterradas se puede medir. El análisis digital de las raices nodales en la cantidad de ramificación de raices nodales de otra extensión al método manual mencionado en lo anterior.

Todos los datos tomados en el fenotipo de raíz se 5 someten al análisis estadístico, normalmente una prueba t i para las raíces transgénicas con aquellas de plantas hijas no transgénicas . La ANOVA de una vía también se puede utilizar en casos donde múltiples eventos y/o constructos involucrados en el análisis. 5 Ejemplo 24 - Transformación del Embrión de Soja , Embriones de soja se bombardean con un plásmido que contiene secuencias asociadas con la captación de nitrato de ; antisentido operablemente enlazadas a un promotor de ubicuitina como sigue. Para inducir embriones somáticos, 0 cotiledones, 3-5 mm en longitud disectados de semillas inmaduras esterilizadas en la superficie de la variedad de cultivos de soja A2872, se cultivan en la luz u oscuridad a 26°C en un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas. Los embriones somáticos que producen embriones 5 secundarios luego se extirpan y se colocan en un medio líquido adecuado. Después de la selección repetida para . ' agrupaciones de embriones somáticos que se multiplicaron tan tempranamente, embriones de etapa globular, las suspensiones se mantienen como es descrito enseguida. 0 Los cultivos de suspensión embriogénica de soja se pueden mantener en 35 mi de medio líquido en un agitador rotatorio, 150 rpm a 26°C con luces fluorescentes en un programa de día/noche de 16:8 horas. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas al inocular aproximadamente 35 5 mg de tejido en 35 mi del medio líquido.

Los cultivos de suspensión embriogénicos de soja luego se pueden transformar mediante el método de bombardeo con pistola de partículas (Klein, y colaboradores, (1987) Nature (London) 327:70-73, patente norteamericana No. '5 4,945,050). Un instrumento Du Pont Biolistic PDS1000/HE (retroajuste de helio) se pueden utilizar para estas transformaciones .

Un gen marcador seleccionable que se puede utilizar para facilitar la transformación de soja es un transgén 0 compuesto de promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor (Odell, y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812), el gen higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; ' Gritz, y colaboradores, (1983) Gene 25:179-188), y la región 3' del gen nopalina sintasa del T-DNA del plásmido Ti de 5 Agrobacterium tumefaciens . El cásete de expresión que comprende una secuencia asociada con la captación de nitrato de antisentido operablemente enlazada al promotor de ubicuitina se puede aislar como un fragmento de restricción. Este fragmento luego se puede insertar en un sitio de 0 restricción único del vector que lleva el gen marcador.

A 50 µ? de una suspensión de partículas de oro de 1 µt de 60 mg/ml se adiciona (en orden): 5 µ? de DNA (1 g/µl) , 20 µ? de espermidina (0.1 M) , y 50 µ? de CaCl2 (2.5 M) . La preparación de partículas luego se agita durante tres 5 minutos, se gira en una microcentrífuga durante 10 segundos y el sobrenadante se remueve. Las partículas de cubierta de DNA luego se lavan una vez en 400 µ? de etanol al 70% y se resuspenden en 40 µ? de etanol anhidro. La suspensión de 1 DNA/partícula se puede sonicar tres veces durante un segundo ¦5 cada uno. Cinco microlitros de las partículas de oro ; recubiertas de DNA luego se cargan en cada disco macroportador .

Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo de ' suspensión de dos semanas de edad se coloca en una placa 0 petri de 60x15 mm vacía y el líquido residual se remueve restringido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, aproximadamente 5-10 placas de tejido se bombardean normalmente. La presión de ruptura de membrana se ajusta en 1100 psi, y la cámara se evacúa a un vacío de 28 5 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente 3.5 pulgadas lejos de la criba de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se puede dividir a la mitad y colocar nuevamente en líquido y cultivar como es descrito en lo anterior. 0 Cinco a siete días después del bombardeo, el medio líquido se puede intercambiar con medio fresco, y once a doce días después del bombardeo con medio fresco que contiene 50 mg/ml de higromicina. Este medio selectivo se puede renovar semanalmente . Siete a ocho semanas de post-bombardeo, tejido 5 transformado verde se puede observar creciendo de las ' agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado se remueve y se inocula en matraces ' individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados, clonalmente propagados. Cada 5 nueva linea se puede tratar como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones luego se pueden subcultivar y mantener como agrupaciones de embriones inmaduros o regenerar en plantas completas mediante la maduración y 1 germinación de embriones somáticos individuales.

O Ejemplo 25 - Transformación del Tejido de eristema de Girasol 1 Tejidos de meristema de girasol se transforma con un cásete de expresión que contiene una secuencia asociada con la captación de nitrato de antisentido operablemente 5 enlazado a un promotor de ubicuitina como sigue (ver también, la patente europea Número EP 0 486233, incorporada en la presente por referencia y Malone-Schoneberg, y colaboradores, (1994) Plant Science 103:199-207). La semilla de girasol madura {Helianthus annuus L.) se desvainan utilizando un 0 desvainador de cabeza de trigo individual. Las semillas se esterilizan en la superficie durante 30 minutos en una solución blanqueadora de Clorox al 20% con la adición de dos gotas de Tween 20 por 50 mi de solución. Las semillas se enjuagan dos veces con agua destilada estéril. 5 Las explantas del eje embriónico dividido se preparan mediante la modificación de los procedimientos descritos por Schrammeij er, y colaboradores (Schrammei er, y colaboradores, (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Las semillas se incrustan en agua destilada durante 60 minutos después del 5 procedimiento de esterilización de la superficie. Los i cotiledones para cada semilla luego se rompen, produciendo una fractura limpia en el plano del eje embriónico. Después de la excisión de la punta de raíz, las explantas se disectan longitudinalmente entre las hojas primordiales. Las dos 0 mitades se colocan, la superficie se corta hacia arriba, en el medio GBA que consiste de elementos minerales de Murashige y Skoog (Murashige, y colaboradores, (1962) Physiol Plant, 15:473-497), adiciones de vitamina de Shepard (Shepard, (1980) in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of 5 Crops (University of Minnesota Press, St . Paul, Minnesota), 40 mg/1 de sulfato de adenina, 30 g/1 de sacarosa, 0.5 mg/1 ß-bencil-aminopurina (BAP) , 0.25 mg/1 de ácido indol-3- acético (IAA), 0.1 mg/1 de ácido giberélico (GA3) , pH 5.6, y 8 g/1 de Phytagar. 0 Las explantas se someten al bombardeo de microproyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium (Bidney, y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 18:301- ; 313) . Treinta a cuarenta explantas se colocan en un círculo en el centro de una placa de 60 X 20 mm para este 5 tratamiento. Aproximadamente 4.7 mg de micropoyectil de tungsteno de 1.8 mm se resuspenden en 25 mi de solución reguladora de TE estéril (Tris HC1 10 mM, EDTA 1 m , pH 8.0) y alícuotas de 1.5 mi se utilizan por bombardeo. Cada placa se bombardeo dos veces a través de una criba de nytex de 150 mm colocado 2 cm arriba de las muestras en un dispositivo de aceleración de partículas PDS 1000®.

La cepa EHA105 de Agrobacterium turnefaciens desarmada se utiliza en todos los experimentos de transformación. Un vector de plásmido binario que comprende el cásete de expresión que contiene el gen asociado con la captación de nitrato operablemente enlazado al promotor de ubicuitina se introduce en la cepa EHA105 de Agrobacterium por la vía de congelación-descongelación como es descrito por Holsters, y colaboradores, (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187. Este plásmido además comprende un gen marcador seleccionado de canamicina (es decir, nptll) . Las bacterias para los experimentos de transformación en plantas se cultivan durante la noche (28 °C y 100 RP de agitación continua) en el medio YE P líquido (10 gm/1 extracto de levadura, 10 gm/1 de Bactopeptona, y 5 gm/1 de NaCl, pH 7.0) con los antibióticos apropiados requeridos para la cepa bacteriana y el mantenimiento del plásmido binario. La suspensión se utiliza cuando alcanza un OD6oo de aproximadamente 0.4 a 0.8. Las células de Agrobacterium se forman en pelotillas y se resuspenden a una OD6oo final de 0.5 ' de inoculación comprendido de MES 12.5 mM pH 5.7, 1 gm/1 de 1 NH4C1, y 0.3 gm/1 de MgS04.

Las explantas recientemente bombardeadas se colocan en una suspensión de Agrobacterium, se mezclan y se dejan sin '5 alterar durante 30 minutos. Las explantas luego se transfieren al medio GBA y se co-cultivan, la superficie del corte hacia abajo, a 26°C y días de 18 horas. Después de tres días de co-cultivación, las explantas se transfieren a 374B (medio GBA que carece de reguladores de crecimiento y un 0 nivel de sacarosa reducido de 1%) suplementado con 250 mg/1 de cefotaxime y 50 mg/1 de sulfato de canamicina. Las explantas se cultivan durante dos a cinco semanas en la selección y luego se transfieren al medio 374B fresco que carece de canamicina durante una a dos semanas de desarrollo 5 continuo. Las explantas con áreas resistentes a antibióticos, diferenciantes de crecimiento que no han producido aleatorios adecuados para la excisión se transfieren al medio GBA que contiene 250 mg/1 de cefotaxime para un segundo tratamiento de fitohormona de 3 días. Las muestras de ho an de los 0 retoños resistentes a canamicina verde se ensayan para la presencia de NPTII mediante ELISA y la presencia de la expresión transgénica mediante el ensayo para una modulación de desarrollo de meristema (es decir, una alteración del tamaño y la aparición de retoño y meristemas florales) . 5 Los retoños positivos de NPTII se injertan al híbrido 6440 de Pioneer® del extracto de raíz de plántula de girasol cultivado in vitro. Las semillas esterilizadas en la superficie se germinan en el medio 48-0 (sales de Murashige y Skoog de mediana concentración, sacarosa al 0.5%, gelrite al ¦5 0.3%, pH 5.6) y se cultivan bajo condiciones descritas para el cultivo de explantas. La porción superior de la plántula ¡ se remueve, se hace una ranura vertical de 1 cm en el hipocótilo, y el retoño transformado se inserta en el corte. El área completa se envuelve con parafilm para asegurar el 0 retoño. Las plantas se injertadas se pueden transferir al suelo después de una semana de cultivo in vitro. Los injertos en el suelo se mantienen bajo condiciones de alta humedad seguida por una aclimatización lenta al ambiente de invernadero. Los sectores transformados de plantas ?? 5 (generación parental) que maduran en invernadero se i identifican mediante ELISA de NPTII y/o por el análisis de actividad asociado con la captación de nitrato de extractos de hoja mientras que las semillas transgénicas cosechadas de plantas T0 positivas de NPTII se identifican mediante el 0 análisis de actividad asociado con la captación de nitrato de porciones pequeñas de cotiledón de semilla . seca .

Un protocolo de transformación de girasol alternativo permite la recuperación de progenie transgénica sin el uso de la presión de selección química. Las semillas 5 se desvainan y se esteriliza la superficie durante 20 minutos en una solución blanqueadora de Clorox al 20% con la adición i de dos a tres gotas de Tween 20 por 100 mi de solución, luego se enjuagan tres veces con agua destilada. Las semillas esterilizadas se ponen en la oscuridad a 26°C durante 20 5 horas sobre papel filtro humedecido con agua. Los cotiledones y el radical de raíz se remueven, y las explantas de meristema se cultivan en 374E (medio GBA que consiste de sales S, vitaminas Shepard, 40 mg/1 de sulfato de adenina, ' sacarosa al 3%, 0.5 mg/1 de 6-BAP, 0.25 mg/1 de IAA, 0.1 mg/1 0 de GA, y Phytagar al 0.8% a pH 5.6) durante 24 horas bajo la ! oscuridad. Las hojas primarias se remueven para exponer el meristema apical, alrededor de 40 explantas se colocan con el domo apical enfrentado hacia arriba en un circulo de 2 cm en el centro de 374M (medio GBA Phytagar al 1.2%), y luego se 5 cultivan en el medio durante 24 horas en la oscuridad.

Aproximadamente 18.8 mg de partículas de tungsteno de 1.8 µ?? se resuspenden en 150 µ? de etanol puro. Después de la sonicación, 8 µ? de este se déjá gotear en el centro de la superficie del macroportador . Cada placa se bombardea dos 0 veces con discos de ruptura de 650 psi en el primer anaquel en 26 mm de Hg de vacío de la pistola de helio.

El plásmido de interés se introduce en la cepa EHA105 de Agrobacterium turnefaciens con congelación- descongelación como es descrito previamente. La pelotilla de 5 bacterias cultivadas durante la noche a 28°C en un medio YEP líquido (10 g/1 de extracto de levadura, 10 g/1 de Bactopeptona, y 5 g/1 de NaCl, pH 7.0) en la presencia de 50 g/l de canamicina se resuspenden en el medio de inoculación , (ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico 12.5 m 2-mM, MES, 1 g/1 ;5 de NH4C1 y 0.3 g/1 de MgS0 a pH 5.7) para alcanzar una concentración final de 4.0 en OD 600. Las explantas bombardeadas con partículas se transfieren al medio GBA (374E) , y una gotita de suspensión de bacterias se colocan directamente en la parte superior del meristema. Las 0 explantas se co-cultivan en el medio durante 4 días, después de lo cual las explantas se transfieren al medio 374C (GBA con sacarosa al 1% y nada de BAP, IAA, GA3 y suplementado con 250 g/ml de cefotaxime) . Las plantitas se cultivan en el medio durante aproximadamente dos semanas bajo condiciones de 5 incubación de día de 16 horas y 26°.

Las explantas (alrededor de 2 cm de largo) de dos semanas de cultivo en el medio 374C se clasifican para una modulación de desarrollo de meristema (es decir, una alteración del tamaño y apariencia del retoño y meristemas 0 florales) . Después de que se identifican las explantas positivas, estos retoños que no logran exhibir actividad asociada con la captación de nitrato modificada se descartan, y cada explanta positiva se subdivide en explantas nodales. Una explanta nodal contiene por lo menos un nodo potencial. 5 Los segmentos nodales se cultivan en el medio GBA durante tres a cuatro días para promover la formación de brotes auxiliares de cada nodo. Luego se transfieren al medio 374C y se dejan desarrollar durante cuatro semanas adicionales. Los brotes en desarrollo se separan y se cultivan durante cuatro ¦5 semanas adicionales en el medio 374C. Las muestras de hoja acumuladas de cada retoño recientemente recuperado se ¦ clasifican nuevamente mediante el ensayo de actividad de i proteína apropiado. En este momento, los retoños positivos i recuperados de un solo nodo generalmente serán enriquecidos 0 en el sector transgénico detectado en el ensayo inicial antes del cultivo nodal.

Los retoños recuperados positivos para la expresión asociada con la captación de nitrado modificada se injertan al extracto de raíz de plántula de girasol cultivada in vitro 5 Pioneer hybrid 6440. Los extractos de raíz se preparan de la siguiente manera. Las semillas se desvainan y se esterilizan en la superficie durante 20 minutos en una solución blanqueadora de Clorox al 20% con la adición de dos a tres gotas de Tween 20 por 100 mi de solución, y se enjuagan tres 0 veces con agua destilada. Las semillas esterilizadas se germinan en el filtro humedecido con agua durante tres días, luego se transfieren en el medio 48 (sal MS de mediana concentración, sacarosa al 0.5%, gelrite al 0.3% pH 5.0) y se cultivan a 26°C bajo la oscuridad durante tres días, luego se 5 incuban en condiciones de cultivo de día de 16 horas. La ; porción superior de la plántula seleccionada se remueve, una ranura vertical se hace en cada hipocótilo, y un retoño transformado se inserta en un corte en forma de V. el área de corte se envuelve con parafilm. Después de una semana de ¦5 cultivo en el medio, las plantas injertadas se transfieren al suelo. En las primeras dos semanas, ellas se mantienen bajo condiciones de alta humedad para aclimatizarse a un ambiente de invernadero.

Ejemplo 26 - Transformación del Tejido de Arroz 0 Confirmación genética del gen asociado con la captación de nitrato.

Un método para transformar DNA en células de plantas superiores que están disponibles para aquellos expertos en la técnica es un bombardeo balístico de alta 5 velocidad utilizando partículas de metal recubiertas con los constructos de ácido nucleico de interés (ver, Klein, y colaboradores, Nature (1987) (London) 327:70-73, y ver la patente norteamericana No. 4,945,050). Un Biolistic PDS- 1000/He (BioRAD Laboratories, Hercules, CA) se utiliza para 0 estos experimentos de complementación . La técncia de bombardeo de partícula se utiliza para transformar los imitantes asociados con la captación de nitrato y el arroz de tipo silvestre con fragmento de DNA.

El gen de higromicina B de fosfotransferasa (Hpt 5 II) bacteriano de Streptomyces hygroscopicus que confiere resistencia al antibiótico se utiliza como el marcador seleccionable para transformación de arroz. En el vector, ; pMLl8, el gen Hpt II se diseña con el promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor y las señales de terminación y '5 poliadenilación del gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens . pML18 fue descrito en WO 97/47731, que se publicó el 18 de Diciembre de 1997, la descripción de la cual es incorporada en la presente por referencia.

Cultivo de callo embriogénico derivados del 0 escutelo de semillas de arroz germinantes sirve como material de fuente para los experimentos de transformación. Este material se genera al germinan semillas de arroz estériles en un medio de iniciación de callo (sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, 1.0 mg/1 de 2,4-D y AgN03 10 µ ) en la oscuridad a 5 27-28 °C. El callo embriogénico que prolifera del escutelo de los embriones luego se transfiere al medio CM (sales N6, vitaminas Nitsch y Nitsch, 1 mg/1 de 2,4-D, Chu, y colaboradores, 1985, Sci. Sínica 18:659-668). Los cultivos de callo se mantienen en CM en el subcultivo de rutina en 0 intervalos de dos semanas y se utilizan para transformación dentro de 10 semanas de iniciación. i El callo se prepara para la transformación al subcultivar piezas de 0.5-1.0 mm aproximadamente 1 mm aparte, ; arreglada en un área circular de aproximadamente 4 cm en 5 diámetro, en el centro de un circulo de papal Whatman #541 colocado en el medio CM. Las placas con los callos se incuban ' en la oscuridad a 27-28 °C durante 3-5 días. Antes del bombardeo, los filtros con los callos se transfieren a CM suplementado con manitol al 0.25 M y sorbitol 0.25 M durante 5 3 h en la oscuridad. Las papas de caja petri luego se dejan durante 20-45 minutos en un campana estéril para permitir que se disipe la humedad en el tejido.

' Cada fragmento de DNA genómico se co-precipita con pML18 que contiene marcadores seleccionables para la 0 transformación de arroz en la superficie de partículas de oro. Para realizar esto, un total de 10 g de DNA en una relación de 2:1 de DNAs de atributos con marcadores seleccionables se adicionan a una alícuota de 50 µ? de partículas de oro que se ha resuspendido en una concentración 5 de 60 mg mi-1. Cloruro de calcio (50 µ? de una solución de 2.5 M) y espermidina (20 µ? de una solución de 0.1 ) luego se adicionan a la suspensión de oro-DNA conforme el tubo está sometiéndose a vórtice durante 3 min. Las partículas de oro 1 se centrifugan en una microcentrífuga durante 1 seg y el 0 sobrenadante se remueve. Las partículas de oro luego se lavan dos veces con 1 mi de etanol puro y luego se resuspenden en 50 µ? de etanol puro y se sonican (sonicador de baño) durante un segundo para dispersar las partículas de oro. La suspensión de oro se incuba a -70°C durante cinco minutos y 5 se sónica (sonicador de baño) si es necesario para dispersar las partículas. Seis µ? de las partículas de oro recubiertas de DNA luego se cargan y discos macroportadores mylar y el etanol se deja evaporar.

Al final del período de secado, un disco de petri que contiene el tejido se coloca en la cámara del PDS- 10007He. El aire en la cámara luego se evacúa a un vacío de 28-29 pulgadas de Hg. El macroportador se acelera con una onda de choque de helio utilizando una membrana de ruptura que estalla cuando la presión de He en el tubo de choque alcanza 1080-1100 psi. El tejido se coloca aproximadamente 8 cm desde la criba de tensión y el callo se bombardea dos veces. Dos a cuatro placas de tejido se bombardean de esta manera con las partículas de oro recubiertas de DNA. Después del bombardeo, el tejido de callo se transfiere al medio CM sin sorbitol o manitol suplemental.

Dentro de 3-5 días después del bombardeo el tejido de callo se transfiere al medio SM (medio de CM que contiene 50 mg/1 de higromicina) . Para realizar eso, el tejido de callo se transfiere de las placas a tubos cónicos de 50 mi de estéril y se pesan. El agar superior fundido a 40°C se adiciona utilizando 2.5 mi de agar superior/100 mg de callo. , Los grupos del callo se rompen en fragmentos de menor que 2 mm de diámetro mediante el suministro repetido a través de una pipeta de 10 mi. Alícuotas de tres mi de la suspensión de callos se coloca en el medio SM fresco y las placas se incuban en la oscuridad durante 4 semanas a 27-28 °C. Después de 4 semanas, los eventos de callo transgénico se identifican, se transfieren a las placas SM frescas y se cultivan durante 2 semanas adicionales en la oscuridad a 27-28°C.

El callo en crecimiento se transfiere al medio RM1 (sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, sacarosa al 2%, sorbitol al 3%, gelrite al 0.4% + 50 ppm de hyg B) durante 2 semanas en la oscuridad a 25°C. Después de 2 semanas el callo se transfiere al medio RM2 (sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, sacaros al 3%, gelrite al 0.4% + 50 ppm de hyg B) y se coloca bajo luz blanca fría (~40 pEm^s"1) con un foto periodo de 12 hr a 25°C y humedad de 30-40%. Después de 2-4 semanas en la luz, el callo comienza a organizarse, y formar retoños. Los retoños se remueven del callo/medio circundante y se transfieren moderadamente al medio RM3 (1/2 x sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, sacarosa al 1% + 50 ppm de higromicina B) en fitacharolas (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y la incubación se continua utilizando las mismas condiciones como es descrito en la etapa previa.

Las plantas se transfieren del RM3 a macetas de 4" que contienen mezcla Metro 350 después de 2-3 semanas, cuando ha ocurrido suficiente crecimiento de la raíz y retoño. La semilla obtenida de la planta transgénica se examina para la complementación genérica de la mutación asociada con la captación de nitrato con el DNA genómico de tipo silvestre que contiene el gen asociado con la captación de nitrato.

Ejemplo 27 - Variantes de Secuencias asociadas con la Captación de Nitrato A. Secuencias de Nucleótido Variante de las Proteínas asociadas con la captación de nitrato que no Alteran la Secuencia de Aminoácidos Codificada Las secuencias de nucleótido asociadas con la captación de nitrato se utilizan para generar secuencias de nucleótidos variantes que tienen la secuencia de nucleótido de la estructura de lectura abierta con aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, y 95% de identidad de secuencia de nucleótidos cuando se comparar con la secuencia de nucleótidos ORF no alterado de partida de la SEQ ID NO. correspondiente. Estas variantes funcionales se generan utilizando una tabla de codones estándar. Mientras que la secuencia de nucleótido de las variantes se altera, la secuencia de aminoácido codifica por las estructuras de lectura abierta no cambian.

B. Secuencias de Aminoácidos Variantes de Polipéptidos asociados con la captación de nitrato Las secuencias de aminoácidos variante de los polipéptidos asociados con la captación de nitrato son generados. En este ejemplo, se altera un aminoácido. Específicamente, las estructuras de lectura abierta se revisan para determinar la alteración de aminoácido apropiada. La selección del aminoácido para cambiar se hace ;5 al consultar la alineación de proteína (con los otros ortólogos y otros miembros de la familia de genes de varias i especies) . Se selecciona un aminoácido que se considera que no está bajo alta presión de selección (no altamente conservado) y que es más bien fácilmente sustituido por un 0 aminoácido con características químicas simialres (es decir, cadena lateral funcional similar) . Utilizando la alineación ; de proteína, se puede cambiar un aminoácido apropiado. Una vez que se identifica el aminoácido dirigido, el procedimiento resumido en la siguiente sección C es seguido. 5 Las variantes que tienen aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de secuencia de ácido nucleico se genera utilizando este método.

C. Secuencias de Aminoácidos Variantes Adicionales de Polipéptidos asociados con la captación de 0 nitrato En este ejemplo, se crean secuencias de proteína artificiales que tienen 80%, 85%, 90% y 95% de identidad con relación a la secuencia de proteína de referencia. Este último esfuerzo requieren identificar regiones conservadas y 5 variables de la alineación y luego la aplicación a buen criterio de una tabla de sustituciones de aminoácido. Estas partes serán discutidas en más detalle enseguida.

Grandemente, la determinación de la cual se alteran las secuencias de aminoácido se hace basado en las regiones conservadas entre la proteína asociada con la captación de nitrato o entre los polipéptidos asociados con la captación de nitrato. Basado en la alineación de secuencia, las diversas regiones del polipéptido asociado con la captación de nitrato que probablemente puede ser alterada se representan en letras minúsculas, mientras que las regiones conservadas se representan por letras mayúsculas. Se reconoce que las sustituciones conservativas se pueden hacer en las regiones conservadas enseguida sin alterar la función. Además, uno de habilidad entenderá que variantes funcionales de la secuencia asociada con la captación de nitrato de la invención pueden tener alteraciones de aminoácido no conservadas menores en el dominio conservado.

Las secuencias de proteína artificiales luego se crean que son diferentes del original en los intervalos de 80-85%, 85-90%, 90-95% y 95-100% de identidad. Los puntos medios de estos intervalos son dirigidos, con latitud liberal de más o menos 1%, por ejemplo. Las sustituciones de aminoácidos serán efectuadas por un Perl script usual. La tabla de sustituciones se proporciona enseguida en la Tabla Tabla 2. Tabla de Sustitución Aminoácido Fuertemente Clasificación Comentario Similar y de Orden para Sustitución el Cambio Óptima I L, V 1 50:50 sustitución L I,V 2 50:50 sustitución V I,L 3 50:50 sustitución A G 4 G A 5 D E 6 E D 7 W Y 8 Y W 9 S T 10 T s 11 K R 12 R K 13 N Q 14 Q N 15 F Y 16 M L 17 La primera metionina no puede cambiar H Na Nada de sustitutos buenos c Na Nada de sustitutos buenos P Na Nada de sustitutos buenos Primero, cualquiera de los aminoácidos conservados , en la proteina que no deben ser cambiados se identifica y "se ; marca" para el aislamiento de la sustitución. La metionina de inicio por supuesto será adicionada a esta lista 5 automáticamente. Enseguida, se hacen los cambios.

H, C y P no se cambian en cualquier circunstancia. Los cambios ocurrirán con isoleucina primero, oscilando el N- terminal a C-terminal. Luego leucina y asi sucesivamente hacia abajo en la lista hasta que se alcanza el objetivo 0 deseado. Las sustituciones de número interinas se pueden hacer para no causar reversión de los cambios. La lista se ordena 1-17, así se inicia con muchos cambios de isoleucina como sea necesario antes de leucina, y así hacia abajo a la metionina. Claramente muchos aminoácidos de esta manera no 5 será necesario que sean cambiados. L, I y V involucrarán una sustitución de 50:50 de las dos sustituciones óptimas alternas.

Las secuencias de aminoácidos variantes se escriben como la salida. Perl script se utiliza para calcular el por 0 ciento de identidades. Utilizando este procedimiento, las variantes de los polipéptidos asociados con la captación de nitrato se generan para tener aproximadamente 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de aminoácidos a la secuencia de nucleótidos ORF no alterada de partida de la SEQ ID NOS:l.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente de esta especificación son indicativas del nivel de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente por referencia en el mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada por referencia.

La invención se ha descrito con referencia a varias modalidades y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, se debe entender que muchas variaciones y modificaciones se pueden hacer mientras que permanezcan dentro del espíritu y alcance de la invención.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a. un polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia, como es determinado por el algoritmo GAP bajo parámetros de error, a la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO:l o 17; en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que funciona como un modificador de la eficiencia de utilización de nitrógeno; b. un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste de la SEQ ID NO: 2 u 8; c. un polinucleótido que consiste de la SEQ ID NO: 1 o 17; y d. un polinucleótido que es complementario al polinucleótido de (a), (b) , o (c) .

2. Un cásete de expresión recombinante, caracterizado porque comprende el polinucleótido de la reivindicación 1, en donde el polinucleótido se enlaza operablemente, o en orientación de sentido o antisentido, a un promotor.

3. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el cásete de expresión de la reivindicación 2.

4. Una planta transgénica, caracterizada porque comprende el cásete de expresión recombinante de la ' reivindicación 2.

5. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta es una 5 monocotiledónea .

6. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta es una dicotiledónea.

7. La planta transgénica de conformidad con la 0 reivindicación 4, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de: maiz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, cacahuate y cacao.

8. Una semilla transgénica, caracterizada porque es 5 de la planta transgénica de la reivindicación 4.

9. Un método para modular la captación de nitrato en plantas, caracterizado porque comprende: a. introducir en una célula de planta un cásete de expresión recombinante que comprende el 0 polinucleótido de la reivindicación 1, operablemente enlazado a un promotor; y b. cultivar la planta bajo condiciones de , crecimiento de célula de planta; en donde la utilización de nitrógeno se modula en la 5 célula de planta.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la actividad de captación de nitrato se incrementa comparado con la actividad de captación de nitrato en una planta no transformada. '5

11. La planta transgénica de conformidad con la \ reivindicación 9, caracterizada porque la planta tiene crecimiento de raíz aumentada.

12. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la planta tiene 0 permanencia verde incrementada.

13. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la planta tiene tamaño de mazorca incrementado.

14. La planta transgénica de conformidad con la 5 reivindicación 9, caracterizada porque la planta tiene arquitectura de raíz incrementada.

15. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la célula de planta es de una planta seleccionada del grupo que consiste de: maíz, soja, girasol, 0 sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, cacahuate y cacao.

16. Una planta con captación de nitrato modulada en una planta, caracterizada porque se produce por el método de: a. introducir en una célula de planta un cásete 5 de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1, operablemente enlazado a un promotor; b. cultivar la célula de planta bajo condiciones de crecimiento de célula de planta; y c. regenerar una planta de la célula de planta; en donde la captación de nitrato se modula en la planta.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste de: maíz, soja, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, cacahuate y cacao.

18. Un método para disminuir la actividad de captación de nitrato en una célula de planta, caracterizado porque comprende: a. proporcionar una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos del complemento de la SEQ ID NO: 1 o 17; b. proporcionar una célula de planta que comprende un mRNA que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID N0:1 o 17; e c. introducir la secuencia de nucleótidos de la etapa (a) en la célula de planta de la etapa (b) , en donde la secuencia de nucleótidos inhibe la expresión de mRNA en la célula de planta .

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la célula de planta es de una monocotiledónea .

20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la monocotiledónea es maiz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.

21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la célula de planta es de una dicotiledónea.

22. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a. un polinucleótido que consiste de la SEQ ID NO:l o 17; b. un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste de la SEQ ID NO: 2 u 8; y c. un polinucleótido que es complementario al polinucleótido de longitud completa de (a) o (b) .

23. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de: a. polipéptido de por lo menos 20 aminoácidos contiguos de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 2 u 8; b. un polipéptido de la SEQ ID NO: 2 u 8; c. un polipéptido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a, y que tiene por lo menos un epitope lineal en común con, un polipéptido de la SEQ ID NO: 2 u 8, en donde la identidad de secuencia se determina utilizando BLAST 2.0 bajo parámetros de error; y d. por lo menos un polipéptido codificado por un polinucleótido de la reivindicación 1.

24. Un polipéptido aislado de la SEQ ID NO: 2 u 8.

25. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la planta tiene rendimiento incrementado.