JP2003199577A - リボソーム不活性化タンパク質（ｒｉｐ）遺伝子およびそれを導入したイネ科植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 種々の病原性生物に対する抵抗性を与える遺
伝子、該遺伝子を含む発現カセット、該発現カセットを
含むベクター、該ベクターを保持する植物細胞、該植物
細胞を再生して得られた植物体を提供し、さらに病原性
生物に対して抵抗性の植物を作出する方法を提供するこ
と。 【解決手段】 リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩ
Ｐ）をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌ
クレオチドが、（ａ）特定の配列の１〜１３１４位のヌ
クレオチドを含むポリヌクレオチド；または（ｂ）該
（ａ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド、である、ポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物に病害抵抗性
を付与するＤＮＡ、このＤＮＡを含む発現カセット、該
発現カセットを含むベクター、このベクターを保持する
植物細胞、この植物細胞を再生して得られた植物体に関
する。

【０００２】

【従来の技術】イネは日本を含むアジアの主作物であ
り、そのためアジア諸国では古くからイネの収量増加の
ための研究を行ってきた。イネの収量を減少させる原因
の一つとしては病害が挙げられ、その中でもいもち病
（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）と白葉枯病
（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）は
深刻な被害をもたらす病害として恐れられてきた。いも
ち病は日本で最も恐れられている病害であり、主に日本
の中部から北部にかけて長雨、冷害に伴って発生する。
いもち病菌は糸状菌の一種である。いもち病に冒され
たイネは黒色の斑点型病斑を生じ、イネの成長が停止す
る。

【０００３】白葉枯病は細菌病の一種であり、九州から
東南アジアにかけて深刻な被害をもたらす病害である。
白葉枯病に冒されたイネは白褐色の病斑が葉縁に沿って
拡大し、葉全体が枯死する（Ｏｈａｔａ，１９８９，Ｚ
ｅｎｋｏｋｕ ＮｏｓｏｎＫｙｏｉｋｕ Ｋｙｏｋａｉ
Ｃｏ．Ｌｔｄ．ｐｐ．５６３）。

【０００４】植物は、病原菌の侵入シグナルを認識する
と、植物体を防御するために感染特異的タンパク質（Ｐ
Ｒタンパク質）を誘導発現し、防御応答を行う（Ｂｏｗ
ｌｅｓ，１９９０，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．５９，８７３）。病原菌の感染によって誘導された
抗菌性タンパク質は、病原菌に直接作用することによっ
て植物の防御機構に関わっている（ＶａｎＬｏｏｎ，１
９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒ
ｔ．１２，２４５；ＶａｎＬｏｏｎ，１９９９，Ｐｈｙ
ｓｉｏ１．Ｍｏｌ．ＰｌａｎｔＰａｔｈ．５５，８
５）。また、グルカナーゼやキチナーゼ遺伝子を遺伝子
組換えする事によって、植物に病害抵抗性をもたらした
ことが報告されている（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，１９９
９，Ｋａｇａｋｕｔｏ Ｓｈｅｉｂｕｔｓｕ ３７，２
９５）。

【０００５】リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）
は、真核生物のｒＲＮＡに対してＮ−グリコシダーゼ活
性を持ち、アデニン残基を特異的に切断する塩基性タン
パク質である。ＲＩＰは作物を含む植物のほとんど全て
の組織で発現しており、植物の病原菌に対して抗菌活性
がある（Ｂａｒｂｉｅｒｉ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１５４，２３７；Ｙ
ｕｎ，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ １４，３９）。これまでに、オオムギ、コ
ムギ、トウモロコシなどに由来するリボソーム不活性化
タンパク質が単離されている（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６６（３）：１５６４−７３（１９９
１）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１）：１
７１−６（１９９３）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
６（３４）：２３４２２−７（１９９１）；Ｂｉｏｓｃ
ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）６
２（６）：１１５２−１１５６；およびＰｌａｎｔ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．１０７（２），６６１−６６２を参照の
こと）。リボソーム不活性化タンパク質の総説について
は、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４０５−４
１２（１９９２）およびＣｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）４２
（４）：４６１−４７１を参照のこと。オオムギから精
製されたＲＩＰはｒＲＮＡに対して特異性を持ち、カビ
のｒＲＮＡに対して哺乳動物のｒＲＮＡよりも１０倍以
上のＮ−グリコシダーゼ活性を持つことが明らかになっ
ている（Ｅｎｄｏ，１９８８，Ｂｉｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ ９５４，２２４）。また、オオムギ
ＲＩＰは植物のｒＲＮＡに対してＮ−グリコシダーゼ活
性を持たないので、ＲＩＰは植物の病害抵抗性機構に関
与していると推測されている（Ｔａｙｌｏｒ，１９９
４，Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，８２７）。

【０００６】このＲＩＰの抗菌性を利用し、これまでＲ
ＩＰ遺伝子の導入によって植物に病害抵抗性を付与させ
る試みが行われてきた。例えば、オオムギＲＩＰに創傷
誘導性（ｗｏｕｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモータ
ーを用いてタバコに形質転換させた場合では、形質転換
個体はタバコ腰折れ病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏ
ｌａｎｉ）に対する病害抵抗性が向上したことが報告さ
れている（Ｌｏｇｅｍａｎｎ，１９９２，ＢＩＯ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，３０５）。さらに、オオムギ
のキチナーゼ遺伝子とＲＩＰ遺伝子をともに恒常的に発
現する形質転換タバコは、それぞれの遺伝子の単独導入
の場合よりも、腰折れ病に対して強い抵抗性を示すこと
が報告された。これは、溶菌酵素の作用によって、ＲＩ
Ｐの菌体内への浸透性が高められたためと考えられてい
る（Ｊａｃｈ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｊ．８，９
７）。ヤマゴボウＲＩＰが導入されたタバコは、タバコ
モザイクウイルス（ＴＭＶ）に対する抵抗性が付与され
た（Ｍｏｏｎ，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ ７，８
０７）。しかしながら、このように、ＲＩＰ遺伝子を単
独で導入した研究はタバコ、ジャガイモでしか行われて
いない。特に、主要作物の中に含まれるイネ科植物にお
いて、病害に対する抵抗性を付与する遺伝子が望まれて
いるが、イネ科植物でＲＩＰ遺伝子の発現を強化した場
合の病害抵抗性に及ぼす効果は未知である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
を解決するためのものであり、その目的とするところ
は、種々の病原性生物に対する抵抗性を与える遺伝子、
この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含
むベクター、このベクターを保持する植物細胞、この植
物細胞を再生して得られた植物体を提供し、さらに病原
性生物に対して抵抗性の植物を作出する方法を提供する
ことである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意努力した結果、イネから２種類、ライ
麦、エンバクからそれぞれ１種類のＲＩＰ ｃＤＮＡを
クローニングした。また、これらのＲＩＰ ｃＤＮＡを
アグロバクテリウム形質転換法を用いてイネに形質転換
を行い、植物体内で発現させることに成功した。本発明
者らは、さらに、この遺伝子の解析を進めた結果、この
遺伝子の発現と植物の病害抵抗性との間に顕著な相関関
係が認められることを見いだし、これにより発明を完成
させるに至った。

【０００９】本発明は、以下のリボソーム不活性化タン
パク質（ＲＩＰ）をコードするポリヌクレオチドを提供
する： （ａ）配列番号１の１４６〜９５５位のヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチド； または（ｂ）該（ａ）に
示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオ
チド、である、ポリヌクレオチド。

【００１０】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、配列番号１の１４６〜９５５位に記載のヌク
レオチド配列、配列番号３の５４〜８９９位に記載のヌ
クレオチド配列、配列番号５の３５〜８７７位に記載の
ヌクレオチド配列、および配列番号７の３７〜８４３位
に記載のヌクレオチド配列を含み得る。

【００１１】別の実施形態において、上記ポリヌクレオ
チドは、配列番号１の１４６〜９５５位に記載のヌクレ
オチド配列に対して少なくとも７２．５％の相同性を有
し、かつリボソーム不活性化タンパク質活性を有するタ
ンパク質をコードし得る。

【００１２】本発明はさらに、以下のリボソーム不活性
化タンパク質（ＲＩＰ）をコードするポリヌクレオチド
を提供する： （ｃ）配列番号２の１〜２７０位に記載されるアミノ酸
配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチド；または（ｄ）（ｃ）に示す
アミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の挿入、欠
失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコード
するポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は
植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ
活性を有する、ポリヌクレオチド。

【００１３】１つの実施形態において、上記タンパク質
は、配列番号２の１〜２７０位に記載のアミノ酸配列、
配列番号４の１〜２８２位に記載のアミノ酸配列、配列
番号６の１〜２８１位に記載のアミノ酸配列、配列番号
８の１〜２６９位に記載のアミノ酸配列およびそれらの
フラグメントを含み得る。

【００１４】別の実施形態において、上記タンパク質
は、配列番号２の１〜２７０位に記載のアミノ酸配列に
対して少なくとも６２％の相同性を有し、かつ植物病原
性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有
するタンパク質を含み得る。

【００１５】本発明はまた、上記ポリヌクレオチドを含
む発現カセット、この発現カセットを含む発現ベクタ
ー、およびこのベクターが導入された植物細胞を含み得
る。

【００１６】本発明は、上記植物細胞を再生して得られ
た植物もまた含み得る。

【００１７】本発明は、植物病原性生物に対して抵抗性
を有する植物を作出するための方法を提供し、この方法
は、上記発現ベクターを植物細胞に導入する工程を包含
する。

【００１８】１つの実施形態において、上記方法は、上
記植物細胞を、リボソーム不活性化タンパク質をコード
するポリヌクレオチドを発現し、そして植物病原性生物
に対して抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに
包含し得る。

【００１９】別の実施形態において、上記植物病原性生
物は、病原性細菌、真菌類、および病原性ウイルスを含
み得る。

【００２０】さらに別の実施形態において、上記病原性
細菌は、白葉枯病細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａ
ｍｐｅｓｔｒｉｓ）を含み得る。

【００２１】さらに別の実施形態において、上記真菌類
は、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａ
ｅ）を含み得る。

【００２２】なお別の実施形態において、上記抵抗性を
有する植物は、少なくとも２つの植物病原性生物に対す
る複合病害抵抗性を示し得る。

【００２３】他の実施形態において、上記少なくとも２
つの病原性生物は、真菌類と病原性細菌との組み合わせ
を含み得る。

【００２４】他の実施形態において、上記少なくとも２
つの病原性生物は、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉ
ａ ｏｒｙｚａｅ）と白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ
ａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）との組み合わせを含み得
る。

【００２５】さらなる実施形態において、上記植物は、
単子葉植物または双子葉植物である。

【００２６】１つの実施形態において、上記植物は単子
葉植物であり得る。別の実施形態において、上記単子葉
植物はイネ科植物であり得る。また、このイネ科植物は
イネであり得る。

【００２７】

【発明の実施の形態】本発明は、植物に病害抵抗性を付
与するタンパク質の発見に関する。「病害抵抗性」と
は、以下に説明するような病原性生物によって引き起こ
される病気を防ぐ、または最小限にとどめる性質をい
う。

【００２８】本発明のポリヌクレオチドによりコードさ
れるタンパク質は、エリシター処理またはサリチル酸に
よって植物においてその発現が誘導され、植物に病害抵
抗性を付与し得る。エリシターとは、植物の病害抵抗反
応に関与するフィトアレキシン産生を誘導する物質であ
る。サリチル酸は、植物の病害抵抗性を引き起こすシグ
ナル物質の１つである。本発明のポリヌクレオチドは、
リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）をコードし得
る。

【００２９】リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）
は、原核生物／真核生物のｒＲＮＡに対してＮ−グリコ
シダーゼ活性を持ち、アデニン残基を特異的に切断する
塩基性タンパク質である。このタンパク質は、原核生物
／真核生物のタンパク質合成を触媒的に著しく不活化し
得る。また、このタンパク質は、植物細胞のｒＲＮＡに
対してはＮ−グリコシダーゼ活性がほとんどない。

【００３０】本発明のリボソーム不活性化タンパク質を
コードするポリヌクレオチドはさらに、本発明のリボソ
ーム不活性化タンパク質（例えば、図１に示したアミノ
酸配列を有するリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ
１））のアミノ酸配列（配列番号２）またはポリヌクレ
オチド配列（配列番号１）に対して実質的な同一性を有
する改変体をコードするポリヌクレオチドを含む。本明
細書中で使用される場合、本発明のリボソーム不活性化
タンパク質のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列
に対して実質的な同一性を有する改変体とは、このタン
パク質のＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上
のアミノ酸の欠失（すなわち、短縮化）または付加；こ
のタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の欠失また
は付加；あるいはこのタンパク質中の１つ以上の部位の
アミノ酸の置換によりネイティブタンパク質から誘導さ
れたタンパク質を意図する。

【００３１】リボソーム不活性化タンパク質の改変体に
おいて、目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない
適当なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら
（１９８７）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔ
ｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、これは、参考として本明細書中に
援用される）のモデルに見出され得る。保存的置換（例
えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のものと
交換する置換）が好ましいとされ得る。このような置換
としては、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、
Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）；
親水性アミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇ
ｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈ
ｒ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、
Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ）；水酸基含有側鎖を
有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）；硫黄原子
含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）；カルボ
ン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、
Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；塩基含有側鎖を有するアミ
ノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）；芳香族含有側鎖を有
するアミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）同士
の置換が挙げられる。

【００３２】本明細書中で使用される場合、「１つ以上
のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換」と
は、本発明で使用され得るポリヌクレオチドによりコー
ドされるタンパク質が有する機能を発現し得る限りにお
いて、任意の数（１または数個）のアミノ酸が上記アミ
ノ酸配列において欠失、付加、および／もしくは置換し
ていることを意味する。アミノ酸の置換、欠失および／
もしくは付加のような改変が活性に与える影響は、改変
されるアミノ酸の位置、程度、種類などに依存し得るこ
とは当業者には明らかである。本発明で使用され得るポ
リヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドによりコード
されるタンパク質が有する機能を発現し得る限りにおい
て、好ましくは以下のアミノ酸配列同一性を満たす個数
で欠失、置換および／もしくは付加された改変体をコー
ドする。

【００３３】さらに、本発明で使用される「リボソーム
不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド」と
は、縮重異性体をすべて含むものである。ここで、「縮
重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なってい
て、同一のポリペプチドをコードすることのできる遺伝
子を意味する。例えば、図１の塩基配列を有するＤＮＡ
に対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例
えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重
関係にあるコドン例えばＡＡＴに変わったものを縮重異
性体と呼ぶこととする。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのプラスミドに組
み込まれたリボソーム不活性化タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドを用いても良い。

【００３４】本発明のポリヌクレオチドは、病害抵抗性
を付与し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔ
から２７０位のＡｓｎまでのアミノ酸配列と、少なくと
も６２％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくと
も７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより
好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少な
くとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列
同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを包含する。

【００３５】本発明のポリヌクレオチドは、病害抵抗性
を付与し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔ
から２７０位のＡｓｎまでのアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１の１４６〜
９５５位までに示されるヌクレオチド配列）と、少なく
とも７２．５％、好ましくは７５％、より好ましくは少
なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％の配
列同一性、なおより好ましくは少なくとも９０％の配列
同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列
同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性
を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを
包含する。

【００３６】本発明のポリヌクレオチドの１つの好まし
い実施形態としては、配列番号４の１〜２８２位に記載
のアミノ酸配列、配列番号６の１〜２８１位に記載のア
ミノ酸配列、配列番号８の１〜２６９位に記載のアミノ
酸配列またはそれらのフラグメントをコードするポリヌ
クレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【００３７】本明細書中で使用される場合、「参照配
列」とは、配列比較の基準として使用される規定の配列
である。参照配列は、記載された配列のサブセットまた
は全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝
子配列のセグメント、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子
配列としてである。

【００３８】本明細書中で使用される場合、「比較ウィ
ンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続しかつ特定化
されたセグメントについて言及し、ここで比較ウィンド
ウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適
なアラインメントのために、参照配列（これは、付加ま
たは欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（す
なわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィン
ドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であ
り、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以
上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列
中にギャップを含むことにより、参照配列に対して高い
類似性となることを避けるために、典型的には、ギャッ
プペナルティーを導入し、そしてこれを、一致の数から
差し引くことを理解する。

【００３９】比較のための配列のアラインメントの方法
は、当該分野において周知である。参照配列（本発明の
配列）と対象配列との間の最適な全体の整合を決定する
ための好ましい方法として、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌ
ｔｓｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相
同性解析が用いられる。配列整列において、参照配列お
よび対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配
列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。上
記の全体的配列整列の結果が、同一性％である。同一性
％を算定するためにＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴ整列におい
て、一般的には、デフォルトパラメーターが使用され得
る。

【００４０】本明細書中で使用される場合、２つの核酸
配列または２つのポリペプチド配列の文脈において「配
列同一性」または「同一性」は、特定化された比較ウイ
ンドウにわたって最大に一致するように整列された場合
に同一である２つの配列中の残基に対して言及される。
タンパク質に関して配列同一性％が使用される場合、し
ばしば、保存的アミノ酸置換によって同一ではない残基
位置は異なることが理解される。上述したように、保存
的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特
性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸
残基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させな
い。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性
パーセントは、置換の保存的性質について矯正するよう
に上方に調整され得る。このような保存的置換によって
異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有す
るといわれる。この調整をするための手段は、当業者に
は周知である。代表的には、これは、完全なミスマッチ
ではなく、部分的なものとして保存性置換を点数付けす
ることを含み、それによって配列同一性パーセントを増
加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコ
アを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与え
られる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与
えられる。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラ
ムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）
において実行されるように計算される。

【００４１】本明細書中で使用される場合、「配列同一
性％」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインさ
れた２つの配列を比較することによって決定された値を
意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチ
ド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントの
ために、参照配列（これは、付加または欠失を含まな
い）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャッ
プ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基ま
たはアミノ酸残基が両方の配列に存在して一致した位置
の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置
の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、
およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセン
テージを得ることによって計算される。

【００４２】用語、ポリヌクレオチドの「実質的な同一
性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーター
（例えば、デフォルトパラメーター）を使用して、記載
されるかさもなくば公知のアラインメントプログラムの
１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、
好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも８５％、
より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましく
は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むこ
とを意味する。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸の類
似性、リーディングフレームの位置などを考慮に入れる
ことによって、２つのヌクレオチド配列によってコード
される対応するタンパク質の同一性を決定するために、
これらの値が適切に調整され得ることを理解する。これ
らのために、対応するアミノ酸配列の実質的な同一性
は、通常、少なくとも７０％、より好ましくは少なくと
も７５％、８０％、９０％、および最も好ましくは少な
くとも９５％の配列同一性を意味する。

【００４３】ペプチドの文脈における用語「実質的同一
性」は、ペプチドが、特定化された比較ウィンドウにわ
たって、参照配列に対して、より好ましくは少なくとも
６０％の配列同一性、好ましくは７０％、より好ましく
は８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少な
くとも９０％または９５％の配列同一性を有する配列を
含むことを意味する。好ましくは、最適なアラインメン
トは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴ
リズムを使用して行われる。例えば、２つのペプチドが
保存的置換によってのみ異なる場合に、ペプチドは、第
２のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似
の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が保存的アミ
ノ酸変化によって異なり得るということ以外は、上記に
示したような配列同一性を共有する。

【００４４】本発明においては、ＧＥＮＥＴＹＸソフト
ウェア（ソフトウェア開発株式会社、東京）を使用する
ことにより、アミノ酸配列／ヌクレオチド配列の同一性
または類似性を決定した。しかし、同一性または類似性
の％は、使用されるソフトウェアに依存して異なり得る
ことは当業者により理解される。また、例えば、Ａおよ
びＢの２つのアミノ酸配列／ヌクレオチド配列を比較す
る場合、アミノ酸配列／ヌクレオチド配列Ａの長さが、
アミノ酸配列／ヌクレオチド配列Ｂの長さと等しくない
場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列／ヌクレオチ
ド配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列／ヌク
レオチド同一性とは等しくない場合もあることは明らか
である。

【００４５】本明細書中で使用される場合、病害抵抗性
を与えるリボソーム不活性化タンパク質の生物学的に活
性な部分をコードするフラグメントは、少なくとも１
５、２５、３０、５０、１００、１２５、１５０、１７
５、２００、２２５の連続するアミノ酸、または本発明
で使用されるリボソーム不活性化タンパク質の全長タン
パク質に存在するアミノ酸の総数まで（例えば、配列番
号２の２７０アミノ酸）をコードする。ハイブリダイゼ
ーションプローブ（例えば、ＰＣＲプライマーについ
て）として用いるための、病害抵抗性を付与するリボソ
ーム不活性化タンパク質のフラグメントは、一般に、病
害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコ
ードする遺伝子により発現されるタンパク質の生物学的
に活性な部分をコードする必要はない。

【００４６】イネ以外の他の植物に由来する、病害抵抗
性を与えるリボソーム不活性化タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドホモログもまた、本願発明において使
用され得る。そのようなポリヌクレオチドホモログは、
例えば、公知のリボソーム不活性化タンパク質（例え
ば、図１に記載されたイネのリボソーム不活性化タンパ
ク質（ＲＩＰ１））の全長または一部のヌクレオチド配
列に基づいて設計したプライマーを用いて、選択した植
物のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その
後、得られた増幅ＤＮＡフラグメントをプローブとして
用いて同じ植物のゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングすることにより単離され得
る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション
などのような方法が、公知のリボソーム不活性化タンパ
ク質（例えば、図１に記載されたイネのリボソーム不活
性化タンパク質（ＲＩＰ１））の配列に対するそれらの
配列同一性に基づいてこのような配列を同定するために
使用され得る。とりわけ、図１に記載の配列全体に対す
る、またはそれらのフラグメントに対する、それらの配
列同一性に基づいて単離された配列は、本発明によって
特に好ましく使用される。

【００４７】ハイブリダイゼーション技術において、公
知のリボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレ
オチド配列の全てまたは部分が、選択された生物由来の
クローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤ
ＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノムライブラリ
ーまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他の対応
するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプ
ローブとして使用される。このハイブリダイゼーション
プローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラ
グメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌク
レオチドであり得、そして検出可能な基（例えば、
³²Ｐ）または任意の他の検出可能なマーカーで標識され
得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーションのため
のプローブは、本発明の病害抵抗性を付与するリボソー
ム不活性化タンパク質のヌクレオチド配列に基づいて合
成されたオリゴヌクレオチドを標識することによって作
製され得る。ハイブリダイゼーションのためのプローブ
の調製およびｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブ
ラリーの構築の方法は、一般に、当該分野で公知であ
り、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａ
ｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（これは、本明細書
中に参考として援用される））において開示される。

【００４８】例えば、本明細書中に示された病害抵抗性
を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードする
ヌクレオチド配列全体、またはそれらの１つ以上の部分
が、対応する病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化
タンパク質の遺伝子配列およびメッセンジャーＲＮＡに
特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用され
得る。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーション
を達成するために、このようなプローブは、病害抵抗性
を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードする
遺伝子配列間で独特であり、そして好ましくは少なくと
も約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約
２０ヌクレオチド長である配列を包含する。このような
プローブは、選択された生物から対応する病害抵抗性を
付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードする遺
伝子配列をＰＣＲによって増幅するために使用され得
る。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣ
ＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａ
ｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆ
ｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１
９９２）；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄ
ｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋ
ｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔ
ｉｌａら（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ． １９： ４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．
およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ１：
１７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅ
ｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆ
ｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考として援用す
る）。この技術は、所望の生物からさらなるコード配列
を単離するために使用され得る。ハイブリダイゼーショ
ン技術は、プレート化したＤＮＡライブラリーのハイブ
リダイゼーションスクリーニングを包含する（プラーク
またはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ 、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ）を参照のこと）。

【００４９】このような配列のハイブリダイゼーション
は、ストリンジェントな条件下で実施され得る。「スト
リンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列
に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えば、
バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的
配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。スト
リンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる
環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／また
は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによ
り、プローブに対して１００％相補的である標的配列が
同定され得る。あるいは、ストリンジェンシー条件は、
より低い程度の類似性が検出され得るように、配列中に
いくらかミスマッチとなることが可能になるように調整
され得る。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチ
ド長未満であり、好ましくは５００ヌクレオチド長未満
である。

【００５０】代表的には、ストリンジェントな条件は、
塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、代表的に
は約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の
塩）（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、
短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）につ
いては少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ
（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少
なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェント
な条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添
加によって達成され得る。例示的な高ストリンジェント
な条件としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣ
ｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーシ
ョン、そして６０〜６５℃における０．１× ＳＳＣ中
の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェン
トな条件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ
ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイ
ゼーション、そして５５〜６０℃における０．５×〜１
× ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な低ストリン
ジェントな条件としては、３０〜３５％ホルムアミド、
１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）の緩衝溶液を用いた３７℃におけるハイブリダイゼ
ーション、そして５０〜５５℃における１×〜２× Ｓ
ＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ
クエン酸三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。

【００５１】特異性は、代表的には、ハイブリダイゼー
ション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗
浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリッドについては、Ｔ_mは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈお
よびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１３８：２６７−２８４の式：Ｔ_m＝８１．５℃＋１
６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１
（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭ
は、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ
中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチ
ドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダ
イゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージで
あり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さであ
る。Ｔ_mは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致す
るプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオ
ン強度およびｐＨで）である。Ｔ_mは、１％のミスマッ
チにつき約１℃低下する；従って、Ｔ_m、ハイブリダイ
ゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性
の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例え
ば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場
合、Ｔ_mは、１０低下し得る。一般的に、ストリンジェ
ントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特
定の配列およびその相補物に対する熱融点（Ｔ_m）より
も約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェ
ントな条件は、熱融点（Ｔ_m）よりも１、２、３、また
は４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄
を利用し得；中程度のストリンジェントな条件は、熱融
点（Ｔ_m）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハ
イブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；
低いストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_m）よりも
１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイ
ブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。
この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、な
らびに所望されるＴ_mを使用して、当業者は、ハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗
浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されること
を理解する。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水
溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴ
_mを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳ
ＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリ
ダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓ
ｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＰ
ｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９
５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎ
ｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出され
る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎ
ｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと（これらは
本明細書中に参考として援用される）。

【００５２】本発明で使用され得るポリヌクレオチド
は、代表的には、本発明のリボソーム不活性化タンパク
質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に記載されるイ
ネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１）のアミ
ノ酸配列）の情報またはそれをコードするヌクレオチド
配列情報に従って得られるが、それらの既知の配列情報
を基に、化学合成によっても得られ得る。例えば、本発
明で使用され得るポリヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ
ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（現Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
社）のポリヌクレオチド合成機を用いて製造業者によっ
て提供される仕様書に従って合成され得る。

【００５３】さらに他の実施形態では、本発明で使用さ
れるリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドを取得する１つの方法としては、核酸合成の
手法に従ってそのポリヌクレオチドの少なくとも一部を
化学合成し、これをプローブとして使用して、適当なｃ
ＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、ＢＡＣクロ
ーンライブラリー、ＰＡＣクローンライブラリー、ＹＡ
Ｃクローンライブラリーなどから、慣用されている方法
（例えば、免疫学的方法あるいはハイブリダイゼーショ
ン法など）により取得する方法を挙げることができる。
上記の方法に用いるいくつかのプラスミド類、様々な制
限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類としては
市販のものを使用し得る。また、ＤＮＡのクローニン
グ、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体
の培養および培養物からのＤＮＡ，ＲＮＡ等の回収は文
献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＣ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８
７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ））に準じて行い
得る。

【００５４】さらに別の実施形態では、以下の様にし
て、リボソーム不活性化タンパク質をコードするＤＮＡ
を取得することができる。まず、本発明のリボソーム不
活性化タンパク質（例えば、図１に記載されるイネのリ
ボソーム不活性化タンパク質）中の２種類のアミノ酸部
分配列を選択し、これらのアミノ酸配列のＣ末端をコー
ドすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライ
マーと上記アミノ酸配列のＮ末端側をコードすると考え
られるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーとを作製
し、これらをミックスプライマーとして用い、適当なラ
イブラリーおよびＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応（Ｓａ
ｉｋｉ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７）
（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ反応（Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄ，１
９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７，４５
３））を行う。その後、ＰＣＲ反応生成物の中から、増
幅が予想される特定の長さの増幅フラグメントを取り出
し、これらの塩基配列を決定する。得られた増幅フラグ
メントをプローブとしてハイブリダイズさせることによ
り、上記のライブラリーからリボソーム不活性化タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドを獲得する。

【００５５】得られたポリヌクレオチドの塩基配列は、
当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法マキサム−ギ
ルバート法（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８０，
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５，４９９）やジ
デオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ１９８２，Ｇｅｎｅ １
９，２６９））、または市販されている自動シーケンサ
ーにより決定し得る。

【００５６】また、得られたポリヌクレオチドを適切な
発現ベクターに挿入すること、そして適切な宿主におい
てポリペプチドを発現させることによって、コードされ
るタンパク質を容易に組換え的に発現させ得る。当業者
に公知の任意の種々の発現ベクターを用いて、組換えタ
ンパク質を発現させ得る。組換えタンパク質の発現は、
取得されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質
転換またはトランスフェクトされた任意の適切な宿主細
胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原
核生物細胞（例えば、大腸菌）、下等真核生物細胞（例
えば、酵母細胞）および高等真核生物細胞などが挙げら
れる。用いられる宿主細胞としては、植物細胞、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ細胞、酵母細胞、哺乳動物の細胞株（例えば、Ｃ
ＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）、昆虫細胞などが挙げられ
るが、これらに限定されない。この様式で発現されるポ
リペプチドは、天然に存在するポリペプチド、天然に存
在するポリペプチドの一部分、またはそれらの他の改変
体をコードし得る。組換えポリペプチドを分泌する適切
な宿主／ベクター系由来の上清は、まず、市販のフィル
ターを用いて濃縮され得る。次いで、この濃縮物は、タ
ンパク質の性質に応じて、塩析や有機溶媒による沈殿、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー、免疫吸着体によるカラムクロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動など
を適宜組み合わせて行うことが可能である。また、本発
明の組換えタンパク質をヒスチジンタグやグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼなどの標識との融合タンパク質
として発現させた場合には、該標識に対するアフィニテ
ィークロマトグラフィーなどにより精製することも可能
である。最後に、１回以上の逆相ＨＰＬＣの工程が用い
られ、組換えポリペプチドは、さらに精製され得る。

【００５７】上記のように取得されたポリヌクレオチド
が、Ｎ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドするか否かを、当業者は容易に確認し得る。Ｎ−グリ
コシダーゼ活性は、例えば、Ｔａｙｌｏｒ，１９９４，
Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，８２７またはＥｎｄｏ，Ｙ．ら、
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９５４：
２２４−２２６（１９８８）に記載の方法を用いて容易
に測定され得る。詳細には、取得されたポリヌクレオチ
ドがコードするタンパク質を、上記のように組換え生成
することにより獲得し、この組換え生成タンパク質を病
原性生物のｒＲＮＡと反応させ、電気泳動によってｒＲ
ＮＡの分解を確認し得る。

【００５８】また、上記のように取得されたポリヌクレ
オチドが、抗菌活性を有するタンパク質をコードするか
否かを、当業者は容易に確認し得る。例えば、タンパク
質の抗菌活性を測定する方法としては、阻止円法（佐藤
昭二ら、植物病理学実験法、第２１９−２２３頁、講談
社を参照のこと）が挙げられる。詳細には、取得された
ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、上記のよ
うに組換え生成することにより獲得し、病原菌胞子など
を混合した寒天培地上に、この組換え生成タンパク質を
染み込ませた濾紙ディスクを載せて、所定時間培養す
る。組換え生成タンパク質が、使用された病原菌に対し
て抗菌性を有している場合、この濾紙の周りに生育阻止
円が形成される。さらに、タンパク質濃度に応じて阻止
円の大きさを測定することによって、抗菌性の強さを測
定し得る。

【００５９】本発明のリボソーム不活性化タンパク質を
コードするポリヌクレオチドの代表的形態は、プラスミ
ドまたはファージＤＮＡなどの中に構成員の一部として
このポリヌクレオチドが挿入された形態、並びに、ゲノ
ムＤＮＡの中にこのポリヌクレオチドが挿入された形で
微生物またはファージ粒子あるいは植物の中に存在する
形態である。本明細書中で使用される微生物の一例とし
て、大腸菌やアグロバクテリウムを挙げることができる
が、これらに限定されない。

【００６０】本発明のリボソーム不活性化タンパク質を
コードするポリヌクレオチドは、３’−末端側に接して
少なくとも１個の停止コドン（例えばＴＡＧ）を有する
ことが望ましい。

【００６１】さらに本発明のリボソーム不活性化タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドは、所望により５’
−側上流に翻訳フレームと合わせて翻訳開始のメチオニ
ンをコードするＡＴＧ配列、その５’−側上流および
３’−側下流に非翻訳領域として適当な長さの他のポリ
ヌクレオチドが結合しても良い。

【００６２】組換えタンパク質を発現させるためのベク
ターとしては、例えば、植物、酵母細胞に関しては、プ
ラスミドｐＢＩ１２１，ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）、大腸菌等の細菌細胞に関しては、プラスミドｐＥ
Ｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）、ｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃ
ｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，
９８９）、哺乳動物細胞に関しては、プラスミドｐＭＡ
Ｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、昆虫細胞に関しては、プラス
ミドｐＢａｃＰＡＫ８．９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等が挙
げられるが、これらに限定されない。

【００６３】本発明における使用に有用な発現ベクター
としては、例えば、プラスミドｐＢＩ１２１，ｐＢＩ２
２１，ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＰＺＰ２
０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９）などが挙げられ
る。リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドが植物中で安定に発現し得るように、このポ
リヌクレオチドに、種々のプロモーター、エンハンサ
ー、翻訳開始コドンをコードするＤＮＡ（ＡＴＧ）また
はターミネーターを、適宜組み合わせて付加することが
好ましい。

【００６４】上記のプロモーターとしては、本発明のタ
ンパク質を恒常的あるいは誘導的に発現させるためのプ
ロモーターが挙げられる。

【００６５】恒常的に発現させるためのプロモーターと
しては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモータ
ー（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｃｅ
ｌｌＲｅｐ．４，３５５）、カリフラワーモザイクウイ
ルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌ
ｅｙ，１９８２，Ｃｅｌｌ ３０，７６３）、カリフラ
ワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモー
ター（Ｏｄｅｌｌ，１９８５，ｎａｔｕｒｅ ３１３，
８１０）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，
１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３，１１５５）、ト
ウモロコシユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ
１９９３，Ｐｌａｎｔ ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６
７）、ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーター（Ｍ
ｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを用い得る。特に好
ましい実施形態では、ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプ
ロモーターを使用し得る。

【００６６】誘導的に発現させるためのプロモーターと
しては、例えば、病原性生物の感染や侵入、光、傷害、
低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布
などの外因によって発現を誘導することが知られている
プロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーター
の例としては、例えば、光照射によって発現を誘導する
リブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブ
ユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈ
ｒ，１９８６，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８３，２３５８）、糸状菌・細菌・ウイルスな
どの病原性生物の感染や侵入によって発現を誘導するイ
ネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｘｕ，１９９６，
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０，３８７）および
タバコのＰＲタンパク質をコードする遺伝子のプロモー
ター（Ｏｈｓｈｉｍａ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ
ｌ２，９５）、低温によって発現を誘導するイネのｌｉ
ｐ１９遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によ
って発現を誘導するイネのｈｓｐ７２，ｈｓｐ８０遺伝
子のプロモーター（Ｖａｎ Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９
９４，Ｐｌａｎｔａ１９３，５７）、乾燥によって発現
を誘導するシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモ
ーター（Ｎｕｎｄｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６）、紫外線
の照射によって発現を誘導するトウモロコシのアルコー
ルデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌ
ｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６
５１）などが挙げられる。また、上記のイネキチナーゼ
遺伝子のプロモーターおよびタバコのＰＲタンパク質遺
伝子のプロモーターは、サリチル酸またはジャスモン酸
などの特定の化合物によって、ｒａｂ１６遺伝子のプロ
モーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によって
も誘導されることが公知である。

【００６７】本発明で使用され得るターミネーターとし
ては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｄｅ
ｐｉｃｋｅｒ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ
ｎ．１，５６１）、オクトピン合成酵素遺伝子のターミ
ネーター（Ｇｉｅｌｅｎ，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．
３，８３５）などを用い得る。

【００６８】用語「植物」とは、他に特に示さない限
り、完全な植物体のみではなく、その植物体を構成する
植物細胞、組織、および器官をも含み得る。本明細書中
に出てくる植物の構成要素を示す用語（例えば、根、
茎、葉、塊茎、花粉、種子胚、種子、プロトプラスト、
カルス、および芽条原基など）は、当業者が通常理解し
得る通りの構成物を表す。

【００６９】植物細胞および植物体への遺伝子導入法と
しては、通常公知の方法、例えば「Ｐｌａｎｔ ｇｅｎ
ｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇ
ｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｄｒａｐｅｒ，Ｂｌａｃｋｗｅｌ
ｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，１９」記載の方法を用いて行うことができる。その
例としては、生物的方法（例えば、ウイルスを用いる方
法またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）を用いる方法（Ｈｏｏｄ，１９９３，Ｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２，２１８、Ｔｏｋｉ Ｓ，Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５，
１６．）など）、物理・化学的方法（例えば、エレクト
ロポレーション法（Ｔａｄａ，１９９０，Ｔｈｅｏｒ．
Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０，４７５）、ポリエチレン
グリコール法（Ｌａｚｚｅｒｉ，１９９１，Ｔｈｅｏ
ｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１，４３７）、パーティ
クル・ガン法（ｓａｎｆｏｒｄ，１９８７，Ｊ．Ｐａｒ
ｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．５，２７）など）などが挙げら
れる。

【００７０】ポリヌクレオチド導入に使用するための植
物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊
茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基
などから適当なものを選択し得る。植物細胞としては特
に制限はないが、植物体への再分化の系が確立されてい
る、例えば、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコ
などの植物細胞が特に好ましい。適当な導入法および植
物材料を選択することは、当業者によって容易になされ
得る。

【００７１】植物培養細胞へポリヌクレオチドを導入す
る場合、材料として代表的にはプロトプラストを用い
て、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコー
ル法などの物理・化学的方法によってポリヌクレオチド
の導入が行われる。植物組織へポリヌクレオチドを導入
する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花
粉、種子胚、苗条原基など（好ましくは葉、茎、カル
ス）を用いて、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを
用いた生物学的方法またはパーティクルガン法などの物
理・化学的方法、好ましくはアグロバクテリウムを用い
た生物学的方法によって、ポリヌクレオチドの導入が行
われる。

【００７２】上記方法により、リボソーム不活性化タン
パク質をコードするポリヌクレオチド配列が導入された
植物組織または植物細胞から完全な植物を再分化させる
には、このような形質転換植物組織または形質転換植物
細胞を、再分化培地またはホルモンフリーのＭＳ培地な
どにおいて培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌
に移植して栽培することにより植物体とすることができ
る。再分化の方法は、使用される植物組織または植物細
胞の種類により異なり、適切な再分化方法の選択は、当
業者によって容易になされ得る。様々な文献において、
各種の植物（例えば、イネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９
５，Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅ
ｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，
１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏ
ｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８
９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９
４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ
９９，１２）など）の再分化の方法が記載されてい
る。

【００７３】本発明の方法によって作出された遺伝子組
換え植物が、病原性生物に対する抵抗性を有しているか
否かは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａ
ｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐ
ａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｉｏｎに記載されている試験方法により容易に確
認し得る。例えば、イネいもち病の場合は、実施例８−
１に実質的に記載のように、特定のイネ品種にその品種
に罹病性のイネいもち病菌のレースを接種した場合の病
斑形成や病斑面積率の程度を、原品種と組換え体とを比
較することによって検定することが可能であるが、これ
に限定されることはない。例えば、イネいもち病の抵抗
性検定については、今回の実験で使用した噴霧接種法の
他に、イネの葉に接種用パンチで穴を開け、その上にい
もち病菌胞子のペーストをのせて感染させるパンチ接種
法、針の先にいもち病菌胞子ペーストを付けて葉を突き
刺す針接種法が挙げられる。これらの接種法では、病斑
は葉の傷口から広がるように発病するので、病斑の伸展
長を測定することによって、抵抗性強度の検定を行い得
る（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏ
ｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉ
ｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏ
ｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９
９５）を参照のこと）。また例えば、白葉枯病の場合
は、実施例８−２に実質的に記載のような、白葉枯病細
菌懸濁液中に抵抗性を検定する植物の組織（例えば、成
葉）を浸漬し、病斑の進行距離を測定する方法、または
噴霧接種法、針接種法が挙げられる。いずれの方法にお
いても、葉全体の病斑面積率を測定することによって、
発病程度を評価する（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉ
ｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａ
ｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａ
ｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。

【００７４】上記のような方法でリボソーム不活性化タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を導入し、
発現させることにより、病原性生物に対する抵抗性を付
与または増強することができる「植物」としては、病原
性生物に感染するあらゆる植物を挙げることができる。
特定の実施形態では、本発明の方法に従って形質転換さ
れる植物は、単子葉植物または双子葉植物である。より
詳細には、本発明の方法に従って形質転換される植物の
例としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オ
オムギ、ライムギ、パンコムギ、ジャガイモ、タバコ、
ナス、トマトなどが挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００７５】本発明の方法に従って得られる植物、また
はその植物器官もしくは植物組織が抵抗性を示す「病原
性生物」としては、植物に感染可能なあらゆる病原性生
物、例えば、真菌類（糸状菌を含む）、細菌、ウイルス
などを挙げることができるが、これらに限定されること
はない。

【００７６】真菌類としては、イネいもち病菌、イネ紋
枯病菌、イネ苗腐病菌、イネ苗立枯病菌、イネばか苗病
菌、イネ黄化萎縮病菌、イネごま葉枯病菌、ムギ類さび
病類菌、ムギ類うどんこ病菌、ジャガイモ疫病菌、タバ
コ疫病菌、タバコ灰色かび病菌、タバコ舞病菌、シバ類
さび病類菌、立枯病類菌、雪腐病類菌、野菜類の疫病
菌、べと病菌、うどんこ病菌、灰色かび病菌、炭そ病
菌、苗立枯病菌、根こぶ病菌、カーネーション萎ちょう
病菌、キク白さび病菌、ウリ類べと病菌、オオムギ黒穂
病菌、ナシ赤星病菌などが挙げられるが、これらに限定
されない。

【００７７】病原性細菌としては、イネ白葉枯病細菌、
イネ苗立枯細菌病細菌、イネもみ枯細菌病細菌、イネゴ
マ葉枯病細菌、タバコ空洞病細菌、タバコ野火病細菌、
各種野菜類の軟腐病細菌、斑点細菌病細菌、青枯病細
菌、インゲンマメかさ枯病細菌、核果類かいよう病細
菌、クワ縮葉細菌病細菌、アブラナ科植物黒腐病細菌、
カンキツかいよう病細菌、トマトかいよう病細菌、ジャ
ガイモ輪腐病細菌、ジャガイモそうか病細菌が挙げられ
るが、これらに限定されない。

【００７８】病原性ウイルスに起因する病害としては、
イネ萎縮病ウイルス、イネ縞葉枯病ウイルス、ムギ斑葉
モザイクウイルス病ウイルス、タバコモザイク病ウイル
ス、タバコ輪点ウイルス病ウイルス、タバコ条斑ウイル
ス病ウイルス、カリフラワーモザイクウイルス病ウイル
ス、ジャガイモモザイク病ウイルス、ジャガイモ葉巻病
ウイルス、ジャガイモＸウイルス病ウイルス、ジャガイ
モＹウイルス病ウイルス、キュウリモザイク病ウイル
ス、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス、トマト黄化えそ
病ウイルス、ダイズ矮化病ウイルス、エンドウ茎えそ病
ウイルス、ビート萎縮病ウイルスが挙げられるが、これ
らに限定されない。

【００７９】本発明の方法に従って得られる植物が示す
「少なくとも２つの病原性生物に対する複合病害抵抗
性」とは、真菌類、細菌、ウイルスなどの分類群から選
択される少なくとも２つの異なる分類に属する少なくと
も２つの病原性生物に対する抵抗性を意味する。例え
ば、少なくとも２つの病原性生物に対する抵抗性として
は、病原性真菌類と病原性細菌との組み合わせに対する
抵抗性、病原性細菌と病原性ウイルスとの組み合わせに
対する抵抗性、真菌類と病原性ウイルスとの組み合わせ
に対する抵抗性などが挙げられる。

【００８０】本発明により、植物に導入されたリボソー
ム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列
は、植物体から植物体へ種子を媒介として後代へと遺伝
され得る。このため、本発明の植物体の花粉あるいは子
房から形成される種子においても導入したヌクレオチド
配列が存在し、遺伝形質が子孫へと受け継がれ得る。従
って、本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコード
するヌクレオチド配列が導入された植物は、例えば、種
子による増殖によって、病原性生物に対する抵抗性が失
われることなく、増殖が可能である。また、植物組織細
胞を用いた大量培養法や従来から行われている挿木、接
木、株分けなどによっても、病害抵抗性が失われること
なく、増殖が可能である。このような増殖によって得ら
れた後代または子孫もまた、本発明によって包含され
る。

【００８１】本発明の方法に従って作出された病害抵抗
性を有する植物は、各種病原性生物に対する抵抗性を有
するために生産性の向上、収量の安定化、品質の向上、
農薬使用量の低減化とそれによる生産コストと労働時間
の低減化や環境に対する負荷の軽減に効果があると期待
される。また、病害抵抗性の性質から、有機栽培農法や
農薬使用が困難な発展途上国においても高い収量が確保
できると考えられる。また、本発明のリボソーム不活性
化タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原性
生物に対する抵抗性の機能解明、病害抵抗性を誘導する
エリシターの誘導体の開発、およびリボソーム不活性化
タンパク質に対する抗体を調製するための抗原を作製す
るために有用である。

【００８２】以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって
限定されるものではない。

【００８３】

【実施例】（実施例１．ｃＤＮＡライブラリーの作製）
本発明のＲＩＰ ｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡラ
イブラリーの作製を試みた。イネ「日本晴」のカルスを
エリシター処理したｃＤＮＡライブラリーは、農業生物
資源研究所より供与された（Ｍｉｎａｍｉ，１９９６，
ＰｌａｎｔｃｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３７，５６３）。
ライ麦、エンバク由来のｃＤＮＡライブラリーは、サリ
チル酸処理を行った葉から単離したｍＲＮＡから作製し
た。

【００８４】ライ麦「初春」、エンバク「太豊」種子を
育苗箱に播種し、温室内で発芽させた。第３葉まで生育
したときに、第３葉を切り取り、０．５ｍＭサリチル酸
の入ったバットにリーフディスクにして浮かべた。３日
後、サリチル酸で誘導した葉１２枚（１．２ｇ）からＲ
Ｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｉ
ｐｏｒｅ）を用いて、２００μｇの総ＲＮＡを調製し
た。この総ＲＮＡからＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓ
ｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ
（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて１７μｇのｍＲＮＡを精製し
た。このうち１０μｇをｃＤＮＡライブラリーの作製に
用いた。キットはＺＡＰ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。ｃＤＮ
Ａ合成後、８００ｂｐ以上のフラグメントを回収し、リ
ンカーを結合させ、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌ
ｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にパッケージを行い、大腸
菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’で増幅させた。作製した
ライブラリーには、ライ麦、エンバクそれぞれ１．２×
１０⁵ｐｆｕ／ｍｌ、１．１×１０⁵ｐｆｕ／ｍｌのファ
ージが含まれていた。

【００８５】（実施例２．イネＲＩＰ ｃＤＮＡに対す
るプローブの作製とＰＣＲ）既知のＲＩＰ遺伝子の塩基
配列および翻訳されるアミノ酸配列を独自に解析したと
ころ、ＲＩＰ遺伝子には塩基配列が保存されている領域
が存在することが明らかになった。その共通配列を元に
して１０個のプライマーを作製した。今回の研究に用い
たプライマーはすべてＯ１ｉｇｏＥｘｐｒｅｓｓ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を用いた。

【００８６】これらのプライマーを用いて、イネ「日本
晴」のカルスをエリシター処理したｃＤＮＡライブラリ
ーからＰＣＲ反応を行った。０．５μｌのｃＤＮＡライ
ブラリー中の全ＤＮＡを３１μｌの蒸留水に溶解し、５
μｌの１０×ＰＣＲバッファー（ロシュ）、８μ１の
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、５μｌの５０ｐｍｏｌ／μｌ各
種プライマー、０．５μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（ＥｘｐａｎｄＴＭＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣ
Ｒ Ｓｙｓｔｅｍ；ロシュ）を加え、最終量５０μｌと
し、以下のようにＰＣＲ反応を行った。反応装置はＴａ
ＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４
８０（宝酒造）を用いた。反応は、１）変性９５℃；１
分、２）再生４４℃；１分、３）伸長７２℃；１分の操
作を３０サイクル繰り返して行った。このＰＣＲ反応を
２回行い、反応液１５μｌを１．２％ ＴＡＥアガロー
スゲルで電気泳動を行った。電気泳動後のゲルを０．５
μｇ／ｍｌの臭化エチジウム溶液で１０分間染色し、紫
外線下で観察して、増幅したフラグメントを全て回収し
た。回収したフラグメントの塩基配列をＤｙｅＴｅｒｍ
ｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆ
Ｓ ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエ
ルマージャパン）と蛍光自動ＤＮＡシークエンサー３７
３Ａ（パーキンエルマージャパン）を用いて決定した。

【００８７】この様にして数十のＤＮＡ増幅フラグメン
トの塩基配列を決定した結果、以下のプライマーを用い
てＰＣＲを行ったときに増幅される３００ｂｐのＤＮＡ
フラグメントが、ＲＩＰと相同性を持っていることが判
明した。

【００８８】５’プライマー ５’−ＧＡＣＡＡＣＭＴ
ＳＴＡＣＹＫＳＧＷＧＧＧＣＴＴＣＡ−３’ ３’プライマー ５’−ＣＳＶＧＡＣＡＣＳＧＴＳＴＫ
ＧＡＡＣＣＧＣ−３’（Ｍ：Ａ／Ｃ，Ｓ：Ｃ／Ｇ，Ｙ：
Ｃ／Ｔ，Ｋ：Ｇ／Ｔ，Ｗ：Ａ／Ｔ，Ｖ：Ａ／Ｃ／Ｇ） （実施例３．イネＲＩＰ ｃＤＮＡのクローニング）エ
リシター処理を行ったイネカルス由来のｃＤＮＡライブ
ラリーから、ＲＩＰｃＤＮＡのスクリーニングを行っ
た。スクリーニングの際の基本的実験操作は、実験書Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に準じて行った。角型シャーレに大腸
菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’で溶菌させた約２×１０
⁴個のファージプラークを培養し、ナイロンメンブレン
（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）にファージを転写した。
ファージが転写されたナイロンメンブレンを８０℃で２
時間ベーキングしてＤＮＡを固定した後、実施例２の方
法に基づいて増幅させたＤＮＡフラグメントをプローブ
として用いてプラークハイブリダイゼーションを行った
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．９８，５０３）。プラークハイブリダイゼーション
の検出には、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａｂｉｏｔｅｃｈ）を用い
た。得られたシグナルに対応するプラークをＳＭ溶液に
懸濁し、さらに２次スクリーニングを行い、単独の陽性
クローンを単離した。このクローンのインサート領域の
塩基配列を決定すると、ＰＣＲ増幅フラグメントの配列
を含む既知のＲＩＰ遺伝子と類似した塩基配列を持つこ
とが判明した（図１）。このｃＤＮＡをＲＩＰ１ ｃＤ
ＮＡと名付けた。さらにＲＩＰ１ ｃＤＮＡをプローブ
として用いて、エリシター処理を行ったイネカルス由来
のｃＤＮＡライブラリーからＲＩＰ ｃＤＮＡのスクリ
ーニングを行った結果、ＲＩＰ１とは異なる配列を持っ
たｃＤＮＡが単離された（図２）。このｃＤＮＡをＲＩ
Ｐ２ ｃＤＮＡと名付けた。

【００８９】（実施例４） （実施例４−１．ライムギ、エンバクＲＩＰｃＤＮＡの
クローニング）実施例１で作製したライムギ、エンバク
由来のｃＤＮＡライブラリーからＲＩＰ ｃＤＮＡのス
クリーニングを行った。角形シャーレに大腸菌ＸＬ１
Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’で溶菌させた約２×１０⁴個のファ
ージプラークを培養し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏ
ｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａｂ
ｉｏｔｅｃｈ社）にファージを転写した。ファージが転
写されたナイロンメンブレンを８０℃で２時間べーキン
グしてＤＮＡを固定した後、イネＲＩＰ１ ｃＤＮＡを
プローブとして用いてプラークハイブリダイゼーション
を行った（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏ１．９８，５０３）。プラークハイブリダイゼー
ションの検出にはＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）
を用いた。得られたシグナルに対応するプラークをＳＭ
溶液に懸濁し、さらに２次スクリーニングを行い、それ
ぞれ単独の陽性クローンを単離した。これらのクローン
のインサート領域の塩基配列を決定すると、イネ科ＲＩ
Ｐに相同性のある配列を有していた。ライムギ由来のＲ
ＩＰ ｃＤＮＡの塩基配列を図３に、エンバク由来のＲ
ＩＰ ｃＤＮＡの塩基配列を図４に示す。

【００９０】（実施例４−２．リボソーム不活性化タン
パク質の塩基配列および推定アミノ酸配列における相同
性決定）実施例３および４−１において得られたイネＲ
ＩＰ１、ＲＩＰ２、ライムギＲＩＰおよびエンバクＲＩ
ＰのｃＤＮＡ、ならびに既知のリボソーム不活性化タン
パク質をコードする塩基配列（オオムギＲＩＰ：Ｌｅａ
ｈ，Ｒ．ら，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１５６
４−１５７３（１９９１）；コムギＲＩＰ：Ｈａｂｕｋ
ａ，Ｎ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２
（１）：１７１−１７６（１９９３）；トウモロコシＲ
ＩＰ１：Ｗａｌｓｈ，Ｔ．Ａ．ら，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６６，２３４２２−２３４２７（１９９１）；
およびトウモロコシＲＩＰ２：Ｂａｓｓ，Ｈ．Ｗ．ら，
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７（２）：６６１−
６６２（１９９５））を用いて、ＧＥＮＥＴＹＸソフト
ウェア（ソフトウェア開発株式会社、東京）を使用する
ことにより、塩基配列間および推定アミノ酸配列間の相
同性を決定した。塩基配列間および推定アミノ酸配列間
の相同性決定の結果を、それぞれ以下の表１および２に
示す。

【００９１】

【表１】

【００９２】

【表２】 （実施例５．ＲｌＰ遺伝子を発現させる発現ベクターの
構築）実施例１〜４の方法でイネから２種類（ＲＩＰ
１，ＲＩＰ２）、ライムギ、エンバクからそれぞれ１種
類（ライムギＲＩＰ、エンバクＲＩＰ）のＲＩＰ ｃＤ
ＮＡを単離した。これらのＲＩＰ ｃＤＮＡをイネ「ど
んとこい」に遺伝子導入し、イネの中でＲＩＰを発現さ
せるため、発現ベクターを構築した。形質転換用バイナ
リーベクターは、ｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗ
ｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．２
５，９８９）を用いた。発現ベクター作製の際の基本的
実験操作は、実験書Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）および
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８
７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に準じて行っ
た。形質転換の際に用いたプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、大腸菌
はＤＨ５α（東洋紡）を用いた。

【００９３】ｐＰＺＰ２０２をＨｉｎｄＩＩ一ＢａｍＨ
Ｉ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ
（東洋紡）を用いて ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプ
ロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）または松
由来のＰＳＩＩのクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質
（ｃａｂ）をコードする遺伝子のプロモーター（ｃａｂ
１プロモーター）（Ｙａｍａｍｏｔｏ，１９９４，Ｐｌ
ａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５，７７３）を
ライゲーションした。ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ（宝酒造）
で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用
いて、ＮＯＳターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，１９
８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１）を
ライゲーションした。ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ（宝酒造）
で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用
いて、それぞれのＲＩＰのｃＤＮＡをセンスに組み込ん
だ。最後にＨｉｎｄＩＩ−ＢａｍＨＩ（宝酒造）で処理
し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、
ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ：ｈｙｇｒｏｍｙ
ｃｉｎ Ｂ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，
Ｇｒｉｔｚ，１９８３，ｇｅｎｅ ２５，１７９）にＣ
ａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌ，１９８５，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１３，８１０）とＮＯＳターミネーターを
連結させた遺伝子を選抜マーカーとして導入した。以上
の方法でＲＩＰが高発現する発現ベクターを構築した
（図５）。

【００９４】（実施例６．ＲＩＰ遺伝子導入イネ系統の
作出）イネ、ライムギ、エンバクのリボソーム不活性化
タンパク質（ＲＩＰ）を高発現させる形質転換植物の作
出は、アグロバクテリウムによる方法を用いた（Ｔｏｋ
ｉ Ｓ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ
ｅｒ １５，１６．Ｈｉｅｉ，１９９４，Ｐｌａｎｔ
Ｊ．６，２７１）。アグロバクテリウムの系統は、ＥＨ
Ａ１０１（Ｈｏｏｄ，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１６８，１２９１）を用いた。

【００９５】実施例５で構築した発現ベクターを、エレ
クトロポーレーション法でアグロバクテリウムＥＨＡ１
０１に形質転換した。エレクトロポーレーション装置は
ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）ＩＩ（ＢＩＯ−Ｒ
ＡＤ）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５
ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポ
ーレーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地
に懸濁し、２８℃で２時間振盪培養した。この培養液を
２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１００ｍｇ／ｌスペクチ
ノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０ｇ／ｌ トリ
プトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ 塩化ナト
リウム、水酸化ナトリウムでｐＨ５．８に調整）上に拡
散し、増殖した形質転換個体を選抜した。

【００９６】遺伝子導入したアグロバクテリウムを水稲
品種「どんとこい」種子、または胚盤由来カルス（４週
間）に感染させた。「どんとこい」種子から穎を除いて
玄米とし、これを７０％エタノールで１分間殺菌し、滅
菌蒸留水で２回洗浄した。さらに、２．５％次亜塩素酸
ナトリウム溶液で４０分間殺菌し、滅菌蒸留水で２回洗
浄した。この玄米を、カルス誘導培地（３０ｇ／ｌ シ
ュクロース、０．３ｇ／ｌ カザミノ酸、２．８ｇ／ｌ
プロリン、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを添加し、ｐＨ
５．８に調整し、４ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＮ
６培地（Ｃｈｕ，１９７４，Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ １
８，６５９））上に置床した。玄米を２８℃明所で生育
させてカルスを得た。このカルスをアグロバクテリウム
感染に用いた。さらにカルス誘導培地に３日間置床した
「どんとこい」種子もアグロバクテリウム感染に用い
た。

【００９７】２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１００ｍｇ
／ｌ スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地上に
２８℃で培養したアグロバクテリウム０．５ｃｍ四方を
ミクロスパテルでかき取り、１０ｍｇ／ｌ アセトシリ
ンゴンを含むＡＡＭ培地（Ｔｏｒｉｙａｍａ，１９８
５，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４１，１７９）に懸濁した。
この懸濁液をカルスに注ぎ、２分間浸漬させた。このカ
ルスを水切りした後、１０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴン
を含むカルス誘導培地上で、２８℃で３日間培養した。
感染後のカルスを滅菌蒸留水で５回洗浄し、余分なアグ
ロバクテリウムを除去した。

【００９８】アグロバクテリウムを除去したカルスを、
選抜培地（５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、３００ｍ
ｇ／ｌ カルベニシリンを含むカルス誘導培地）に２８
℃で２週間培養し、再び同じ培地に移し替え、さらに２
週間培養した。その結果、遺伝子組換えされたカルスが
ハイグロマイシン耐性になり、選抜培地上で増殖した。

【００９９】増殖したカルスを５０ｍｇ／ｌ ハイグロ
マイシン、２００ｍｇ／ｌ カルベニシリンを含む再分
化培地（３０ｇ／ｌ シュクロース、３０ｇ／ｌ ソル
ビトール、２ｇ／ｌ カザミノ酸、２０μｇ／ｌ ＮＡ
Ａ、２．２ｍｇ／ｌ カイネチンを添加し、ｐＨ５．８
に調整し、４ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＭＳ培地
（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐ
ｌａｎｔ １５，４７３））上に移植した。再分化培地
では２８℃で２週間の培養を２回行い、再分化個体を選
抜した。

【０１００】再分化したイネを鉢上げし、５０〜１００
系統の再分化個体（Ｔ₀）を隔離温室内で生育させた。
これを図６に示す。ＡおよびＢともに、左側が原品種
「どんとこい」（ＷＴ）であり、右側がリボソーム不活
性化タンパク質遺伝子導入系統（それぞれ、ＲＩＰ２６
およびＲＩＰ５２）の生育個体である。生育したＲｌＰ
遺伝手組換え系統では一部に不稔、矮性化などが生じ
た。これらの個体は消却し、外見上は原品種とほとんど
変わらない個体を耐病性検定に用いた。これらの組換え
系統からＴ₁種子を採種した。なお、これ本実施例以
降、代表としてイネＲＩＰ１遺伝手組換え系統について
例示するが、イネＲＩＰ２、ライムギＲＩＰ、エンバク
ＲＩＰでも同等の結果が観察された。

【０１０１】（実施例７．Ｔ₁世代の非組換え個体の除
去）遺伝の法則からＴ₁種子には組換え個体と非組換え
個体が、３：１の割合で混合していることが示唆され
た。このうち、組換え個体はハイグロマイシンに対して
抵抗性を有することが推測された。そこで採種したＴ₁
種子と原品種の「どんとこい」種子を５０ｍｇ／ｌ ハ
イグロマイシンを含み、４ｇ／ｌ のゲルライトで固化
させたＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，１９６２，Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ １５，４７３）上で発芽さ
せ、２８℃で１週間培養した。培養後のＴ ₁種子および
原品種「どんとこい」種子を図７に示す（Ａ：原品種
「どんとこい」（ＷＴ）、ＢおよびＣ：組換え系統（そ
れぞれ、ＲＩＰ２６およびＲＩＰ５２））。実験に使用
したハイグロマイシン濃度において、原品種「どんとこ
い」種子はすべて、ハイグロマイシンの影響を受けて、
発芽後黒変し枯死した（図７Ａ）。Ｔ₁種子は正常に生
育した個体と枯死した個体に分離した。その比率は約
３：１であった（図７ＢおよびＣ）。

【０１０２】以上の結果から、この選抜方法によってＴ
₁世代の非組換え個体を除去できたと考えられる。また
後に行ったゲノミックサザン法による分析の結果、正常
に生育したＴ₁個体にはイネ、ライムギ、エンバク由来
のＲＩＰ遺伝子が導入されていることが確認できた。正
常に生育したＴ₁世代系統をシードリングケースに鉢上
げし、４．５葉期になるまで生育させた。

【０１０３】（実施例８） （実施例８−１．いもち病菌の接種と耐病性検定）いも
ち病菌の接種は噴霧接種法を用いた（Ｙａｅｇａｓｈ
ｉ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔ
ｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐ
ａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｉｏｎ，３７）。

【０１０４】いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏ
ｒｙｚａｅ Ｃａｖ．：レース００７）を粉末オートミ
ール培地に移植し、２６℃で培養した。菌叢がシャーレ
全面を覆った段階で殺菌水を加え、絵筆で培地表面をこ
すり、気中菌糸を取り除いた。その後シャーレの蓋を外
し、近紫外光を照射して胞子形成を行った（Ｆｕｒｕｔ
ａ，１９６７，Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ２
１，１６０）。

【０１０５】４．５葉期まで生育した原品種個体と組換
え体（Ｔ₁）の幼苗に、いもち病菌胞子の懸濁液（胞子
数５×１０⁸／ｍｌ）を噴霧し、接種箱内で２６℃で２
４時間接種した。接種後の原品種および組換え系統を隔
離温室に移動し、病斑を観察した。この噴霧接種検定の
結果を、図８（イネＲＩＰ１）、１４（イネＲＩＰ
２）、１８（ライムギＲＩＰ）、および２２（エンバク
ＲＩＰ）に示す。図８の写真中、ＡおよびＢともに、左
側の植物群が圃場抵抗性強の品種（トドロキワセ）、中
央の植物群が圃場抵抗性中の品種（どんとこい）（Ｗ
Ｔ）、右側の植物群がイネＲＩＰ１遺伝子組換え系統
（それぞれ、ＲＩＰ２６およびＲＩＰ５２）（いずれも
接種３週間後）を示す。図１４の写真中、１４Ａが圃場
抵抗性強の品種（トドロキワセ）、１４Ｂが圃場抵抗性
中の品種（どんとこい）（ＷＴ）、１４ＣがイネＲＩＰ
２遺伝子組換え系統（いずれも接種３週間後）を示す。
図１４ＢおよびＣは、それぞれＷＴおよびＲＩＰ２遺伝
子組換え系統の拡大写真である。図１８の写真中、Ａお
よびＢともに、左側の植物群が圃場抵抗性強の品種（ト
ドロキワセ）、中央の植物群が圃場抵抗性中の品種（ど
んとこい）（ＷＴ）、右側の植物群がライムギＲＩＰ遺
伝子組換え系統（それぞれ、ＲＲＩＰ７およびＲＲＩＰ
２６）（いずれも接種３週間後）を示す。図２２の写真
中、ＡおよびＢともに、左側の植物群が圃場抵抗性強の
品種（トドロキワセ）、中央の植物群が圃場抵抗性中の
品種（どんとこい）（ＷＴ）、右側の植物群がエンバク
ＲＩＰ遺伝子組換え系統（それぞれ、ＯＲＩＰ１１およ
びＯＲＩＰ３４）（いずれも接種３週間後）を示す。耐
病性検定は病斑の形状の判定と、病斑面積率の測定を行
い、以下に示す病斑指数を用いて解析を行った（Ａｓａ
ｇａ，１９８１，Ｊ．Ｃｅｎｔ．Ａｇｒｉｃ．Ｅｘｐ．
Ｓｔｎ．３５，５１）。

【０１０６】 病斑指数 病状 病斑面積率 ０．罹病性病斑が全く認められない ０％ １．罹病性病斑がわずかに認められる １％ ２．罹病性病斑が一見して認められる ２％ ３．罹病性病斑が中程度に認められる ５％ ４．罹病性病斑が多く認められる １０％ ５．罹病性病斑がはなはだしいか、枯死葉がわずかに認められる ２０％ ６．枯死葉が一見して認められる ４０％ ７．枯死葉が中程度に認められる ６０％ ８．枯死葉が多く認められる ８０％ ９．全葉ほとんど枯死 ９０％ １０．全茎葉枯死 １００％ この耐病性検定の結果を図９、１５、１９および２３に
示す。各図において、横軸は接種後日数、縦軸は病斑指
数を表す。図９中、黒菱形は組換え体（１−２６）、白
四角は組換え体（１−４９）、黒三角は組換え体（１−
５２）、白丸は原品種どんとこい（ＷＴ）、黒四角はト
ドロキワセ（Ｔ）を示す。図１５中、白丸は原品種どん
とこい（ＷＴ）、黒四角はトドロキワセ（Ｔ）、黒菱形
は組換え体（ＲＩＰ２）を示す。図１９中、白菱形は原
品種どんとこい（ＷＴ）、黒四角はトドロキワセ
（Ｔ）、黒三角は組換え体（ＲＲＩＰ７）および×は組
換え体（ＲＲＩＰ２６）を示す。図２３中、白丸は原品
種どんとこい（ＷＴ）、黒四角はトドロキワセ（Ｔ）、
黒三角は組換え体（ＯＲＩＰ１１）および×は組換え体
（ＯＲＩＰ３４）を示す。

【０１０７】この結果、組換え体では原品種と変わらな
い罹病性病斑が認められた。また、組換え体の中にいも
ち病の進行が遅延する系統が見つかった。これらの個体
はいもち病の罹病性病斑が認められるものの、病斑面積
率は非常に小さかった。従って、イネ、ライムギ、エン
バク由来のＲＩＰ遺伝子細換え系統はいもち病に対して
圃場抵抗性型の抵抗性をもたらすことが明らかになっ
た。

【０１０８】（実施例８−２．白葉枯病菌の接種と耐病
性検定）いもち病菌に対して抵抗性が確認されたイネ、
ライムギ、エンバク由来のＲＩＰ遺伝手組換え系統（Ｔ
₀）の成苗に対して白葉枯病の接種検定を行った。白葉
枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉ
ｓ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ：レース３−Ａ）を、馬鈴薯半
合成培地（馬鈴薯３００ｇ、硝酸カルシウム０．５ｇ、
リン酸水素ニナトリウム・１２水和物２ｇ、ペプトン５
ｇ、ショ糖１５ｇ、寒天２０ｇ、蒸留水１ｌ）で増殖さ
せた。試験管の中に蒸留水１０ｍｌを入れ、白葉枯病菌
０．５ｃｍ四方を懸濁させ、接種用の懸濁液を作製し
た。原品種及びＲｌＰ遺伝子組換え系統（Ｔ₀）の成葉
の先端を白葉枯病菌の懸濁液に浸したハサミで切り取
り、白葉枯病の接種を行った（Ｔｓｕｓｈｉｍａ，１９
９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，
Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ，２８）。２０日後、葉の先端から白葉枯病が進行
した距離を測定することによって、白葉枯病に対する抵
抗性を検定した。この結果を図１０、１６、２０および
２４に示す。図１０中、ＷＴは原品種（どんとこい）の
葉であり、ＲＩＰ１−２６およびＲＩＰ１−５２は、そ
れぞれ組換え系統（Ｔ₀）（接種後２０日）の葉であ
る。図１６中、ＷＴは原品種（どんとこい）の葉であ
り、Ｒｉｃｅ ＲＩＰ２−３０は、組換え系統（Ｔ₀）
（接種後２０日）の葉である。図２０中、ＷＴは原品種
（どんとこい）の葉であり、Ｒｙｅ ＲＩＰ２０は、組
換え系統（Ｔ₀）（接種後２０日）の葉である。図２４
中、ＷＴは原品種（どんとこい）の葉であり、Ｏａｔ
ＲＩＰ１６は、組換え系統（Ｔ₀）（接種後２０日）の
葉である。原品種に比べてＲＩＰ遺伝子組換え系統（Ｔ
₀）は白葉枯病斑の進展が遅れた（図１０、１６、２０
および２４）。この耐病性検定の結果を図１１、１７、
２１および２５に示す。図１１において、ＷＴは、原品
種（どんとこい）、１−２０、１−２６、１−３４およ
び１−５２は、ＲＩＰ１遺伝子組換え系統である。図１
７において、ＷＴは、原品種（どんとこい）、２−１
０、２−１８、２−３０および２−４６は、ＲＩＰ２遺
伝子組換え系統である。図２１において、ＷＴは、原品
種（どんとこい）、Ｒｙｅ４、Ｒｙｅ６、Ｒｙｅ７、Ｒ
ｙｅ８、Ｒｙｅ１０、Ｒｙｅ１２、Ｒｙｅ１４、Ｒｙｅ
１６、Ｒｙｅ１８およびＲｙｅ２０は、ライ麦ＲＩＰ遺
伝子組換え系統である。図２５において、ＷＴは、原品
種（どんとこい）、Ｏａｔ１、Ｏａｔ４、Ｏａｔ５、Ｏ
ａｔ１０、Ｏａｔ１１、Ｏａｔ１６、Ｏａｔ２２、Ｏａ
ｔ２９、Ｏａｔ３２、Ｏａｔ３３はエンバクＲＩＰ遺伝
子組換え系統である。これらの結果により、イネ、ライ
ムギ、エンバク由来のＲＩＰ遺伝子組換え系統は白葉枯
病に対して抵抗性をもたらすことが明らかになった。

【０１０９】（実施例９．ゲノミックサザン法によるＲ
ＩＰ遺伝子導入の確認）原品種及び病害抵抗性が確認さ
れたＲＩＰ遺伝手組換え系統（Ｔ₀）の葉身からＣＴＡ
Ｂ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ
ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｍｕｒｒａｙ，１９８０，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，４３２１）を用い
てゲノミックＤＮＡを抽出した。イネ地上部１０ｇを液
体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となっ
たイネを１．５×ＣＴＡＢ液（１．５％ ＣＴＡＢ，７
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ ｐＨ８．０，１．０５Ｍ 塩化ナトリウム）と
混合し、５６℃で２０分間軽く浸透してＤＮＡを溶出さ
せた後、クロロホルム抽出を２回行ってタンパク質を除
去した。この溶液に１／１０容の１０％ ＣＴＡＢ、
１．５容の沈殿溶液（１％ ＣＴＡＢ，５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ
８．０）を加えＤＮＡを析出した。このＤＮＡを、１Ｍ
塩化ナトリウムに溶解し、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ
ＡでＲＮＡを分解した後、エタノール沈殿を行ってゲノ
ミックＤＮＡを抽出した。

【０１１０】抽出したゲノミックＤＮＡ（１０μｇ）を
制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲ
Ｉで処理し、１．２％アガロースゲルで１８時間電気泳
動を行った。泳動後のゲルを加水分解液（０．２５Ｍ
ＨＣｌ溶液）に１０分間、アルカリ変性溶液（１．５Ｍ
ＮａＯＨ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）に３０分間浸漬して
軽く振盪した。その後、アルカリ転写溶液（０．４Ｍ
ＮａＯＨ）を用いてＤＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙ
ｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）に転写した。ゲノミックＤＮＡ
が転写されたナイロンメンブレンを８０℃で２時間べ一
キングしてＤＮＡを固定した後、それぞれのＲＩＰ ｃ
ＤＮＡをプローブとして用いてゲノミックサザンハイブ
リダイゼーションを行った（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７
５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３）。サザンハ
イブリダイゼーションの検出には、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄ
ｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ
ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。洗浄条件は、ＥＣＬ（Ｅｎ
ｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）
の場合には、０．２×ＳＳＣ濃度の洗浄液を使用し、Ａ
ｌｋｐｈｏｓ（アルカリホスファターゼ）の場合には、
供給業者の推奨するプロトコールに記載された洗浄液を
用いて、５５〜６０℃で洗浄を行った。

【０１１１】この結果を図１２（Ａ〜Ｃ）に示す。図１
２Ａ〜Ｃ中、それぞれ、レーンＭは１ｋｂ ＤＮＡ ｌ
ａｄｄｅｒ、レーン１はＢｇｌＩＩ処理、レーン２はＥ
ｃｏＲＶ処理、レーン３はＮｄｅＩ処理、レーン４はＥ
ｃｏＲＩ処理を示す。

【０１１２】サザンハイブリダイゼーションの結果、原
品種からはＲＩＰプローブとハイブリダイゼーションし
たバンドが１つ（イネＲＩＰ１、ＲＩＰ２）もしくは全
く確認されなかった（ライムギ、エンバクＲＩＰ）のに
対し、組換え個体からは１〜２本のバンドが検出され
た。従って、これらの組換え系統には少なくとも１コピ
ーのＲＩＰ遺伝子が導入されていることが明らかになっ
た。

【０１１３】（実施例１０．ノーザン法によるＲＩＰ
ｍＲＮＡ発現の確認）原品種及びＲＩＰ遺伝子組換え系
統（Ｔ₀）の葉身から、ＣＴＡＢ／ＬｉＣｌ法で総ＲＮ
Ａを抽出した（Ｃｈａｎｇ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ １１，１１３）。イネ
地上部２ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕し
た。粉末状となったイネを１０容の２×ＣＴＡＢ液（２
％ ＣＴＡＢ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
９．５，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１．４Ｍ 塩化ナトリウ
ム，１％ メルカプトエタノール）と混合し、６０℃で
１０分間軽く浸透してＲＮＡを溶出させた後、クロロホ
ルム抽出を２回行ってタンパク質を除去した。この溶液
に１／４容の１０Ｍ 塩化リチウムを加えＲＮＡを析出
した。ＲＮＡをＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に溶解さ
せ、フェノール／クロロホルム抽出処理を行った後、上
記方法で塩化リチウム抽出をもう一度行い、総ＲＮＡを
単離した。

【０１１４】単離した総ＲＮＡ（３０μｇ）を６．３％
ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロース変性ゲル
で電気泳動し、２０×ＳＳＣ（３Ｍ 塩化ナトリウム、
３００ｍＭ クエン酸三ナトリウム二水和物）を用いて
総ＲＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋，
Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃ
ｈ社）に転写した。総ＲＮＡが転写されたナイロンメン
ブレンに、導入したそれぞれのＲＩＰ ｃＤＮＡをプロ
ーブとして用いて、ノーザンハイブリダイゼーションを
行った（Ａｌｗｉｎｅ，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５３５０）。ノーザ
ンハイブリダイゼーションの検出には、ＡｌｋＰｈｏｓ
Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。

【０１１５】これらの結果を、図１３（Ａ〜Ｄ）に示
す。ＡおよびＣは、総ＲＮＡ像であり、ＢおよびＤはノ
ーザンハイブリダイゼーション像を示す。Ａ〜Ｄのいず
れも、レーンの左から右の順に、Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ
ｌａｄｄｅｒ、Ｗ：原品種、２６および５２：それぞ
れ、イネＲＩＰ１遺伝子導入系統を示す。

【０１１６】ノーザンハイブリダイゼーションの結果、
原品種からはＲＩＰプローブとハイブリダイゼーション
したバンドが確認されなかったのに対し、いもち病、白
葉枯病に対する抵抗性を示した組換え系統から約１，５
００ｂｐのバンドが確認できた（図１３：矢印）。従っ
て、これらの組換え系統にはＲＩＰ ｍＲＮＡが発現し
ていることが明らかになった。

【０１１７】

【発明の効果】本発明により、種々の病原性生物に対す
る抵抗性を与える遺伝子、この遺伝子を含む発現カセッ
ト、この発現カセットを含むベクター、このベクターを
保持する植物細胞、この植物細胞を再生して得られた植
物体が提供され、さらに病原性生物に対して抵抗性の植
物を作出する方法が提供される。

【０１１８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Agricultural Research Foundation <120> Ribosome-inactivated protein (RIP) gene and a plant introducing the same <130> RIP protein gene <140> unassigned <141> 2002-1-7 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1314 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (146)..(955) <400> 1 tttttttctt cttctttgtt tgacggaaca aaaatctcag gcatgatatg atattctgat 60 ctgttcatga gttcatctgt atctcagtgt acatgcattt gcaaagcaaa aattccattt 120 tgttttgact atttcgcttc cggcc atg gcg ttg aac ccg ctc ttc acc gtg 172 Met Ala Leu Asn Pro Leu Phe Thr Val 1 5 acg ttc gac gtg agc agc ggc gac aac tac ggc gac ttc atc gcc ggc 220 Thr Phe Asp Val Ser Ser Gly Asp Asn Tyr Gly Asp Phe Ile Ala Gly 10 15 20 25 atc cgc agc agg gtg gcc aac ccg agg cac ttc tcc cgc aac cgc ccc 268 Ile Arg Ser Arg Val Ala Asn Pro Arg His Phe Ser Arg Asn Arg Pro 30 35 40 gtc ctg ccg ccg gtg gag ccg ccg ccg ccg ccg cgc cgc tgg ttc cac 316 Val Leu Pro Pro Val Glu Pro Pro Pro Pro Pro Arg Arg Trp Phe His 45 50 55 gtc gtg ctc cgg gcg tcg ccg acc gcc gcg ctc acg ctc gcc acg cgc 364 Val Val Leu Arg Ala Ser Pro Thr Ala Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg 60 65 70 gcc gac aac ctc tac ctg gag gga ttc cgg agc agc gac ggg agg tgg 412 Ala Asp Asn Leu Tyr Leu Glu Gly Phe Arg Ser Ser Asp Gly Arg Trp 75 80 85 tgg gag ctc acc ccg ggc atc ctc ggc gcc gcc ccc ggc ggc gcc gcc 460 Trp Glu Leu Thr Pro Gly Ile Leu Gly Ala Ala Pro Gly Gly Ala Ala 90 95 100 105 gcc acc tac gtc ggc ttc ggc ggc tcg tac cgc gac ctc ctc ggc gac 508 Ala Thr Tyr Val Gly Phe Gly Gly Ser Tyr Arg Asp Leu Leu Gly Asp 110 115 120 acg gac agg ctc acc gtc gtc acg ctc ggc ccg cag cag atg gcg cag 556 Thr Asp Arg Leu Thr Val Val Thr Leu Gly Pro Gln Gln Met Ala Gln 125 130 135 gcg gtg aac gcg ctc gcc gcg cgc agg ccg gcc gac ctc gcc aac ggc 604 Ala Val Asn Ala Leu Ala Ala Arg Arg Pro Ala Asp Leu Ala Asn Gly 140 145 150 gcg gcg cag cgg cgc gcc atg gac gcg gtg gcg gcg ctg ctc ctg atg 652 Ala Ala Gln Arg Arg Ala Met Asp Ala Val Ala Ala Leu Leu Leu Met 155 160 165 gtg cac gag gcg acg cgg ttc cag acc gtg tcg agg ctg gtc gcc ggg 700 Val His Glu Ala Thr Arg Phe Gln Thr Val Ser Arg Leu Val Ala Gly 170 175 180 185 ctc atg cac ccc aag gcg gcg agc aag agc ggc gcc atc acc acc gcg 748 Leu Met His Pro Lys Ala Ala Ser Lys Ser Gly Ala Ile Thr Thr Ala 190 195 200 atg agg aag cag gtg aac ggg tgg cag gtc ctc tcg gcg gcc atg ctc 796 Met Arg Lys Gln Val Asn Gly Trp Gln Val Leu Ser Ala Ala Met Leu 205 210 215 ggc acg gac gcg cgg ccg ccg gcg agg ttc gcg ccg ctg agg gac atg 844 Gly Thr Asp Ala Arg Pro Pro Ala Arg Phe Ala Pro Leu Arg Asp Met 220 225 230 ggc gtg gac acg gtg gag gag gcg gcg gcg acg gtg ggg atc ctg ctg 892 Gly Val Asp Thr Val Glu Glu Ala Ala Ala Thr Val Gly Ile Leu Leu 235 240 245 ttc gtc gag gtc ccc ggc ggg atg acg gcg gcg agg gcg ctc cag ctg 940 Phe Val Glu Val Pro Gly Gly Met Thr Ala Ala Arg Ala Leu Gln Leu 250 255 260 265 ttc cac cat ggg aac tagattttga tgcagctgga tttttttctc cttgtttgag 995 Phe His His Gly Asn 270 ccaataaaat gttagatttg tgatggtttt gctatttgat ttgagtagaa atgttagatt 1055 ttgtgtgtat tcggaataaa ttcagcacca tagttttatc tatagctatt ttaattcatg 1115 tgagtactag taagaacaat aacatatcct actctgactg atgcaaccag atagagatta 1175 tacttgttca tactgaaaat ttgttcataa caactttcac aatcttttct cagagatatt 1235 ttgcattcag ataactatgt atacacagga cacatatttc tggatatgaa catccaattg 1295 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1314 <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ala Leu Asn Pro Leu Phe Thr Val Thr Phe Asp Val Ser Ser Gly 1 5 10 15 Asp Asn Tyr Gly Asp Phe Ile Ala Gly Ile Arg Ser Arg Val Ala Asn 20 25 30 Pro Arg His Phe Ser Arg Asn Arg Pro Val Leu Pro Pro Val Glu Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Arg Arg Trp Phe His Val Val Leu Arg Ala Ser Pro 50 55 60 Thr Ala Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg Ala Asp Asn Leu Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Gly Phe Arg Ser Ser Asp Gly Arg Trp Trp Glu Leu Thr Pro Gly Ile 85 90 95 Leu Gly Ala Ala Pro Gly Gly Ala Ala Ala Thr Tyr Val Gly Phe Gly 100 105 110 Gly Ser Tyr Arg Asp Leu Leu Gly Asp Thr Asp Arg Leu Thr Val Val 115 120 125 Thr Leu Gly Pro Gln Gln Met Ala Gln Ala Val Asn Ala Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Arg Pro Ala Asp Leu Ala Asn Gly Ala Ala Gln Arg Arg Ala Met 145 150 155 160 Asp Ala Val Ala Ala Leu Leu Leu Met Val His Glu Ala Thr Arg Phe 165 170 175 Gln Thr Val Ser Arg Leu Val Ala Gly Leu Met His Pro Lys Ala Ala 180 185 190 Ser Lys Ser Gly Ala Ile Thr Thr Ala Met Arg Lys Gln Val Asn Gly 195 200 205 Trp Gln Val Leu Ser Ala Ala Met Leu Gly Thr Asp Ala Arg Pro Pro 210 215 220 Ala Arg Phe Ala Pro Leu Arg Asp Met Gly Val Asp Thr Val Glu Glu 225 230 235 240 Ala Ala Ala Thr Val Gly Ile Leu Leu Phe Val Glu Val Pro Gly Gly 245 250 255 Met Thr Ala Ala Arg Ala Leu Gln Leu Phe His His Gly Asn 260 265 270 <210> 3 <211> 1300 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (54)..(899) <400> 3 cagcaatcct ctgcttttgt cagttgtagt tcacaacgat cgagcatccg gcc atg 56 Met 1 gcg ttg aac ccg ctg ttc acc gtg acg ttc aac gtg agc ggc agc ggc 104 Ala Leu Asn Pro Leu Phe Thr Val Thr Phe Asn Val Ser Gly Ser Gly 5 10 15 agc gac aac tac ggc gac ttc atc gcc ggc atc cgc aag agg gtg gcc 152 Ser Asp Asn Tyr Gly Asp Phe Ile Ala Gly Ile Arg Lys Arg Val Ala 20 25 30 aac ccg agg cac ttc tcc cac aac cgc ccc gtc ctc ccg ccg gtg gag 200 Asn Pro Arg His Phe Ser His Asn Arg Pro Val Leu Pro Pro Val Glu 35 40 45 ccc gac gtc ccg ccg cgc cgc tgg ttc cac gtc gtg ctc cgg acg cag 248 Pro Asp Val Pro Pro Arg Arg Trp Phe His Val Val Leu Arg Thr Gln 50 55 60 65 acc agc gag ctc acg ctc gcc acg cgc gcc gac aac ctc tac ctg gag 296 Thr Ser Glu Leu Thr Leu Ala Thr Arg Ala Asp Asn Leu Tyr Leu Glu 70 75 80 ggc ttc cgc ggc agc gac ggc acc agc gcg tgg tgg gag ctc acc cgc 344 Gly Phe Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Ala Trp Trp Glu Leu Thr Arg 85 90 95 ggc ctc atc gcc ggc gcc acc tac ctc ggc ttc ggc ggc tcg tac cgc 392 Gly Leu Ile Ala Gly Ala Thr Tyr Leu Gly Phe Gly Gly Ser Tyr Arg 100 105 110 gag ctc ctc ggg cac acg gac aac atg gtc ggt gtc acg ctc ggc ccg 440 Glu Leu Leu Gly His Thr Asp Asn Met Val Gly Val Thr Leu Gly Pro 115 120 125 cag cag atg acg cag gcc gtg gac acg ctc gcc ggt ctc gcc gcc agc 488 Gln Gln Met Thr Gln Ala Val Asp Thr Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ser 130 135 140 145 ggc ggc ggc gcg gcg cgg caa cgg gcc ggc gag gcg ttg gcg acg ctg 536 Gly Gly Gly Ala Ala Arg Gln Arg Ala Gly Glu Ala Leu Ala Thr Leu 150 155 160 ctc ctg atg gtg aac gaa gcc gtg cgt ttc ctg acc gtg gcg gag ctt 584 Leu Leu Met Val Asn Glu Ala Val Arg Phe Leu Thr Val Ala Glu Leu 165 170 175 gtg ggc ggc ttc atg aac ccc agg gcg gtg agg aag agc ggg acg atc 632 Val Gly Gly Phe Met Asn Pro Arg Ala Val Arg Lys Ser Gly Thr Ile 180 185 190 acc gcc gac atg aag gag cag gtg aac ggg tgg aag gtc ttg tcc agg 680 Thr Ala Asp Met Lys Glu Gln Val Asn Gly Trp Lys Val Leu Ser Arg 195 200 205 gcg ctg ctc acc atg gac gcg ctg cag cta gag gac tcc aac tcg gcg 728 Ala Leu Leu Thr Met Asp Ala Leu Gln Leu Glu Asp Ser Asn Ser Ala 210 215 220 225 tcc aag cac aac aag gtg gat aca aag aag atg gag cag gag aag aag 776 Ser Lys His Asn Lys Val Asp Thr Lys Lys Met Glu Gln Glu Lys Lys 230 235 240 gcg tgg gag gcg gcg gag aag ttg gcc gtg gag gcg gcc aag gcg gtg 824 Ala Trp Glu Ala Ala Glu Lys Leu Ala Val Glu Ala Ala Lys Ala Val 245 250 255 ggg atc ctg ctg ttc gtc gag aag gtg ccg gcc ggg atg acg aag gcg 872 Gly Ile Leu Leu Phe Val Glu Lys Val Pro Ala Gly Met Thr Lys Ala 260 265 270 acg gcg ctt cag ctg ttt cat ggg aac taaagttgct gctgctggta 919 Thr Ala Leu Gln Leu Phe His Gly Asn 275 280 gatttcagct tgcttgatcg aacagcaaat caatctgagc gactcgagta aaattgattc 979 tccctccaac ccaaaatata agtattttca gttattaatc tggacaactg cgtgtccaga 1039 tacatagaca aaagttgtta tattttgaga cggttgttat attttgggac ggaggcagta 1099 gttaaatagc ctctatagtg tgatgtaact actatatact cccttcgtcc caaaaaagac 1159 aaacactggt ctccgtgtcc aacgtttgac tgtccgtctt atatgaaatt ttttttataa 1219 ttaatatttt cattgttgtt agatgataaa acatgattaa taatttatgt gtgaaaaaaa 1279 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1300 <210> 4 <211> 282 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 4 Met Ala Leu Asn Pro Leu Phe Thr Val Thr Phe Asn Val Ser Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Asp Asn Tyr Gly Asp Phe Ile Ala Gly Ile Arg Lys Arg Val 20 25 30 Ala Asn Pro Arg His Phe Ser His Asn Arg Pro Val Leu Pro Pro Val 35 40 45 Glu Pro Asp Val Pro Pro Arg Arg Trp Phe His Val Val Leu Arg Thr 50 55 60 Gln Thr Ser Glu Leu Thr Leu Ala Thr Arg Ala Asp Asn Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Gly Phe Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Ala Trp Trp Glu Leu Thr 85 90 95 Arg Gly Leu Ile Ala Gly Ala Thr Tyr Leu Gly Phe Gly Gly Ser Tyr 100 105 110 Arg Glu Leu Leu Gly His Thr Asp Asn Met Val Gly Val Thr Leu Gly 115 120 125 Pro Gln Gln Met Thr Gln Ala Val Asp Thr Leu Ala Gly Leu Ala Ala 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Ala Ala Arg Gln Arg Ala Gly Glu Ala Leu Ala Thr 145 150 155 160 Leu Leu Leu Met Val Asn Glu Ala Val Arg Phe Leu Thr Val Ala Glu 165 170 175 Leu Val Gly Gly Phe Met Asn Pro Arg Ala Val Arg Lys Ser Gly Thr 180 185 190 Ile Thr Ala Asp Met Lys Glu Gln Val Asn Gly Trp Lys Val Leu Ser 195 200 205 Arg Ala Leu Leu Thr Met Asp Ala Leu Gln Leu Glu Asp Ser Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Lys His Asn Lys Val Asp Thr Lys Lys Met Glu Gln Glu Lys 225 230 235 240 Lys Ala Trp Glu Ala Ala Glu Lys Leu Ala Val Glu Ala Ala Lys Ala 245 250 255 Val Gly Ile Leu Leu Phe Val Glu Lys Val Pro Ala Gly Met Thr Lys 260 265 270 Ala Thr Ala Leu Gln Leu Phe His Gly Asn 275 280 <210> 5 <211> 1039 <212> DNA <213> Secale cereale <220> <221> CDS <222> (35)..(877) <400> 5 gcttaatagc cagtctcatc ttagcttcat atac atg gcg gca aag atg gcc aag 55 Met Ala Ala Lys Met Ala Lys 1 5 aac gtg gac aag ccg ctc ttc act gcg acg ttc aac gtc cag agc agc 103 Asn Val Asp Lys Pro Leu Phe Thr Ala Thr Phe Asn Val Gln Ser Ser 10 15 20 tcc gcc gac tac gtc acc ttc atc acc ggc atc cgc aac aag ctc ggc 151 Ser Ala Asp Tyr Val Thr Phe Ile Thr Gly Ile Arg Asn Lys Leu Gly 25 30 35 aac ccc cgc cac ttc tcc cac aac cgc ccc gtg ctg ccg ccg atc gag 199 Asn Pro Arg His Phe Ser His Asn Arg Pro Val Leu Pro Pro Ile Glu 40 45 50 55 ccc aag gtc ccg ccg agc cgg tgg ttc cac atc gtg ctc aag aca tcg 247 Pro Lys Val Pro Pro Ser Arg Trp Phe His Ile Val Leu Lys Thr Ser 60 65 70 ccg gcc agc acc ggg ctc acg ctc gcc acc cgc gcc gac aac ctc tac 295 Pro Ala Ser Thr Gly Leu Thr Leu Ala Thr Arg Ala Asp Asn Leu Tyr 75 80 85 tgg gag ggc ttc aag agc agc gac ggc acc tgg tgg gag ctc acc ccc 343 Trp Glu Gly Phe Lys Ser Ser Asp Gly Thr Trp Trp Glu Leu Thr Pro 90 95 100 ggc ctc atc ccc ggc gcc acc tac ctc ggg ttc ggc ggc acc tac cgc 391 Gly Leu Ile Pro Gly Ala Thr Tyr Leu Gly Phe Gly Gly Thr Tyr Arg 105 110 115 gac ctc ctc ggg gac acc gac aag ctg acc aac gtc gct ctc ggc cgg 439 Asp Leu Leu Gly Asp Thr Asp Lys Leu Thr Asn Val Ala Leu Gly Arg 120 125 130 135 cag caa atg gcc gac gcg gtg acc gcg ctc tac ggg cgc acc aag gct 487 Gln Gln Met Ala Asp Ala Val Thr Ala Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Ala 140 145 150 gac aaa acc tcc ggc ccg aag cag cag cag gcg agg gag gcg gtg aca 535 Asp Lys Thr Ser Gly Pro Lys Gln Gln Gln Ala Arg Glu Ala Val Thr 155 160 165 acg ctg ctc ctc atg gtc cac gag gcc acg cgg ttc cag tcc gtg tcg 583 Thr Leu Leu Leu Met Val His Glu Ala Thr Arg Phe Gln Ser Val Ser 170 175 180 gcg ttc gtg gcc ggc ctg ctg cac ccc aag gcg gtg gag aag aag agc 631 Ala Phe Val Ala Gly Leu Leu His Pro Lys Ala Val Glu Lys Lys Ser 185 190 195 ggg aag atc tcc aac gag cta aag gcc cag gtg aac ggg tgg cag gac 679 Gly Lys Ile Ser Asn Glu Leu Lys Ala Gln Val Asn Gly Trp Gln Asp 200 205 210 215 ctg tcc gaa gcg ctg ctg aag acg gac gcg aag ccc ccc gcg ggt aag 727 Leu Ser Glu Ala Leu Leu Lys Thr Asp Ala Lys Pro Pro Ala Gly Lys 220 225 230 ccg cca gcg aag ttc acg ccg atc gag aag atg ggc gtg agg acg gcg 775 Pro Pro Ala Lys Phe Thr Pro Ile Glu Lys Met Gly Val Arg Thr Ala 235 240 245 gag cag gcg gcc gcc acc ctg ggg atc ctg ctg ttc gtc cag gtg ccc 823 Glu Gln Ala Ala Ala Thr Leu Gly Ile Leu Leu Phe Val Gln Val Pro 250 255 260 ggt ggg atg acg gcg gcc cag gcg ctg gag ctg ttt cat gct agt ggg 871 Gly Gly Met Thr Ala Ala Gln Ala Leu Glu Leu Phe His Ala Ser Gly 265 270 275 ggg aaa taggtagttg tgcaggtata tctgcaatgg tattgtataa gtcgaataaa 927 Gly Lys 280 catgtcacag agtgactgaa tgatataaat aaataaacat gtcactgagt gactgaataa 987 tataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ac 1039 <210> 6 <211> 281 <212> PRT <213> Secale cereale <400> 6 Met Ala Ala Lys Met Ala Lys Asn Val Asp Lys Pro Leu Phe Thr Ala 1 5 10 15 Thr Phe Asn Val Gln Ser Ser Ser Ala Asp Tyr Val Thr Phe Ile Thr 20 25 30 Gly Ile Arg Asn Lys Leu Gly Asn Pro Arg His Phe Ser His Asn Arg 35 40 45 Pro Val Leu Pro Pro Ile Glu Pro Lys Val Pro Pro Ser Arg Trp Phe 50 55 60 His Ile Val Leu Lys Thr Ser Pro Ala Ser Thr Gly Leu Thr Leu Ala 65 70 75 80 Thr Arg Ala Asp Asn Leu Tyr Trp Glu Gly Phe Lys Ser Ser Asp Gly 85 90 95 Thr Trp Trp Glu Leu Thr Pro Gly Leu Ile Pro Gly Ala Thr Tyr Leu 100 105 110 Gly Phe Gly Gly Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Gly Asp Thr Asp Lys Leu 115 120 125 Thr Asn Val Ala Leu Gly Arg Gln Gln Met Ala Asp Ala Val Thr Ala 130 135 140 Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Ala Asp Lys Thr Ser Gly Pro Lys Gln Gln 145 150 155 160 Gln Ala Arg Glu Ala Val Thr Thr Leu Leu Leu Met Val His Glu Ala 165 170 175 Thr Arg Phe Gln Ser Val Ser Ala Phe Val Ala Gly Leu Leu His Pro 180 185 190 Lys Ala Val Glu Lys Lys Ser Gly Lys Ile Ser Asn Glu Leu Lys Ala 195 200 205 Gln Val Asn Gly Trp Gln Asp Leu Ser Glu Ala Leu Leu Lys Thr Asp 210 215 220 Ala Lys Pro Pro Ala Gly Lys Pro Pro Ala Lys Phe Thr Pro Ile Glu 225 230 235 240 Lys Met Gly Val Arg Thr Ala Glu Gln Ala Ala Ala Thr Leu Gly Ile 245 250 255 Leu Leu Phe Val Gln Val Pro Gly Gly Met Thr Ala Ala Gln Ala Leu 260 265 270 Glu Leu Phe His Ala Ser Gly Gly Lys 275 280 <210> 7 <211> 1015 <212> DNA <213> Avena sativa <220> <221> CDS <222> (37)..(843) <400> 7 attattgtgc gtctcatctt cccatcgatc gatccc atg gct gcg acc aac gtc 54 Met Ala Ala Thr Asn Val 1 5 acc acc aac gag ctc ttc acc aag aac ttc gac ctc ggg agc aac gac 102 Thr Thr Asn Glu Leu Phe Thr Lys Asn Phe Asp Leu Gly Ser Asn Asp 10 15 20 aac tac ggc agc ctc atc acc agc atc cgc aac gag ctc ggc aac ccg 150 Asn Tyr Gly Ser Leu Ile Thr Ser Ile Arg Asn Glu Leu Gly Asn Pro 25 30 35 agg cac ttc tct cac aac cgc ccc gtg ctg ccg ccg gtg gag ccc aac 198 Arg His Phe Ser His Asn Arg Pro Val Leu Pro Pro Val Glu Pro Asn 40 45 50 gtc ccg ccg ggc cgg tgg ttc cac atc aag ctc aag gcc ccg gtg acc 246 Val Pro Pro Gly Arg Trp Phe His Ile Lys Leu Lys Ala Pro Val Thr 55 60 65 70 ggc gcc gaa ctc aca atc acg acg cgc gcc gac aac ctc tac ctg gag 294 Gly Ala Glu Leu Thr Ile Thr Thr Arg Ala Asp Asn Leu Tyr Leu Glu 75 80 85 ggc ttc agg aac agc gac ggc tca tgg tgg gag ctc act cgc ggc ctc 342 Gly Phe Arg Asn Ser Asp Gly Ser Trp Trp Glu Leu Thr Arg Gly Leu 90 95 100 atc ccc ggc gcc tcc tac gtg ggc ttc ggc ggc agc tac cgc gac ctc 390 Ile Pro Gly Ala Ser Tyr Val Gly Phe Gly Gly Ser Tyr Arg Asp Leu 105 110 115 ctc ggc gac tcg gag aat ttg tct ggc gtc gtc ctc ggc ccg aag aag 438 Leu Gly Asp Ser Glu Asn Leu Ser Gly Val Val Leu Gly Pro Lys Lys 120 125 130 atg atc gat gcc gtc aat gtg ctc gcc ggc ctc acc agg gcc gac ctc 486 Met Ile Asp Ala Val Asn Val Leu Ala Gly Leu Thr Arg Ala Asp Leu 135 140 145 150 gca tcc agc cag aag cag aag cag gcc aag gac gcg gtg gcg gcg ctg 534 Ala Ser Ser Gln Lys Gln Lys Gln Ala Lys Asp Ala Val Ala Ala Leu 155 160 165 ctc ctg atg gtg cac gag gcc aca cgg ttc cag tcc gtg tcg gcg ttc 582 Leu Leu Met Val His Glu Ala Thr Arg Phe Gln Ser Val Ser Ala Phe 170 175 180 gtg gcc gac ttg atg cac ccc aag act ggg gat aag agc ggg acc atc 630 Val Ala Asp Leu Met His Pro Lys Thr Gly Asp Lys Ser Gly Thr Ile 185 190 195 acc aag gag atg aaa gcc cag gtg aac ggg tgg cag aac ctg tcc gcg 678 Thr Lys Glu Met Lys Ala Gln Val Asn Gly Trp Gln Asn Leu Ser Ala 200 205 210 gcg ctg ctg acg acg gac gcc aag ccg ccg ggg aag ttc acg ccg ttc 726 Ala Leu Leu Thr Thr Asp Ala Lys Pro Pro Gly Lys Phe Thr Pro Phe 215 220 225 230 gag aat atg ggg gtg aat acg gtg gaa cag gcg gcc gcc acg gtg ggg 774 Glu Asn Met Gly Val Asn Thr Val Glu Gln Ala Ala Ala Thr Val Gly 235 240 245 atc ctg ctg ttc gtc gag gtg cca ggc ggg ttg act gct gct cag gcg 822 Ile Leu Leu Phe Val Glu Val Pro Gly Gly Leu Thr Ala Ala Gln Ala 250 255 260 ctc aag ctg ttt cat ggg aac tagctagcta gactgatgcc tcacgcagcg 873 Leu Lys Leu Phe His Gly Asn 265 aataatccta ctactgtaat cactttctat agtctgtaat aatgtactgc aatttgaata 933 aatctgtgtg agagtagtca atcatgaata aagaagtgga tgttcccacc caaaaaaaaa 993 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1015 <210> 8 <211> 269 <212> PRT <213> Avena sativa <400> 8 Met Ala Ala Thr Asn Val Thr Thr Asn Glu Leu Phe Thr Lys Asn Phe 1 5 10 15 Asp Leu Gly Ser Asn Asp Asn Tyr Gly Ser Leu Ile Thr Ser Ile Arg 20 25 30 Asn Glu Leu Gly Asn Pro Arg His Phe Ser His Asn Arg Pro Val Leu 35 40 45 Pro Pro Val Glu Pro Asn Val Pro Pro Gly Arg Trp Phe His Ile Lys 50 55 60 Leu Lys Ala Pro Val Thr Gly Ala Glu Leu Thr Ile Thr Thr Arg Ala 65 70 75 80 Asp Asn Leu Tyr Leu Glu Gly Phe Arg Asn Ser Asp Gly Ser Trp Trp 85 90 95 Glu Leu Thr Arg Gly Leu Ile Pro Gly Ala Ser Tyr Val Gly Phe Gly 100 105 110 Gly Ser Tyr Arg Asp Leu Leu Gly Asp Ser Glu Asn Leu Ser Gly Val 115 120 125 Val Leu Gly Pro Lys Lys Met Ile Asp Ala Val Asn Val Leu Ala Gly 130 135 140 Leu Thr Arg Ala Asp Leu Ala Ser Ser Gln Lys Gln Lys Gln Ala Lys 145 150 155 160 Asp Ala Val Ala Ala Leu Leu Leu Met Val His Glu Ala Thr Arg Phe 165 170 175 Gln Ser Val Ser Ala Phe Val Ala Asp Leu Met His Pro Lys Thr Gly 180 185 190 Asp Lys Ser Gly Thr Ile Thr Lys Glu Met Lys Ala Gln Val Asn Gly 195 200 205 Trp Gln Asn Leu Ser Ala Ala Leu Leu Thr Thr Asp Ala Lys Pro Pro 210 215 220 Gly Lys Phe Thr Pro Phe Glu Asn Met Gly Val Asn Thr Val Glu Gln 225 230 235 240 Ala Ala Ala Thr Val Gly Ile Leu Leu Phe Val Glu Val Pro Gly Gly 245 250 255 Leu Thr Ala Ala Gln Ala Leu Lys Leu Phe His Gly Asn 260 265 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 9 gacaacmtst acyksgwggg cttca 25 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 10 csvgacacsg tstkgaaccg c 21

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、イネのリボソーム不活性化タンパク質
（ＲＩＰ１）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ
酸配列である。

【図２】図２は、イネのリボソーム不活性化タンパク質
（ＲＩＰ２）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ
酸配列である。

【図３】図３は、ライムギのリボソーム不活性化タンパ
ク質（ＲＩＰ）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミ
ノ酸配列である。

【図４】図４は、エンバクのリボソーム不活性化タンパ
ク質（ＲＩＰ）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミ
ノ酸配列である。

【図５】図５は、ＲＩＰ遺伝子の発現ベクター（ｐＰＺ
Ｐ２０２）の構築を示す模式図である。

【図６】図６は、ＲＩＰ遺伝子組換え系統（イネＲＩＰ
１組換え系統）の形態を示す生物形態写真である。

【図７】図７は、組換え系統Ｔ₁種子のハイグロマイシ
ン選抜（イネＲＩＰ１組換え系統）の形態を示す生物形
態写真である。

【図８】図８は、いもち病（レース００７）の噴霧接種
検定（イネＲＩＰ１組換え系統）の結果を示す生物形態
写真である。

【図９】図９は、組換え系統のいもち病に対する抵抗性
程度（イネＲＩＰ１組換え系統）の結果を示すグラフで
ある。

【図１０】図１０は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ
１組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。

【図１１】図１１は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ
１組換え系統）の結果を示すグラフである。

【図１２】図１２は、ゲノミックサザン法による導入遺
伝子の確認（イネＲＩＰ１組換え系統）を示す電気泳動
図である。

【図１３】図１３は、ノーザン法によるＲＩＰｍＲＮＡ
の発現調査（イネＲＩＰ１組換え系統）を示す電気泳動
図である。

【図１４】図１４は、いもち病（レース００７）の噴霧
接種検定（イネＲＩＰ２組換え系統）の結果を示す生物
形態写真である。

【図１５】図１５は、組換え系統のいもち病に対する抵
抗性程度（イネＲＩＰ２組換え系統）の結果を示すグラ
フである。

【図１６】図１６は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ
２組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。

【図１７】図１７は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ
２組換え系統）の結果を示すグラフである。

【図１８】図１８は、いもち病（レース００７）の噴霧
接種検定（ライムギＲＩＰ組換え系統）の結果を示す生
物形態写真である。

【図１９】図１９は、組換え系統のいもち病に対する抵
抗性程度（ライムギＲＩＰ組換え系統）の結果を示すグ
ラフである。

【図２０】図２０は、白葉枯病の接種検定（ライムギＲ
ＩＰ組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。

【図２１】図２１は、白葉枯病の接種検定（ライムギＲ
ＩＰ組換え系統）の結果を示すグラフである。

【図２２】図２２は、いもち病（レース００７）の噴霧
接種検定（エンバクＲＩＰ組換え系統）の結果を示す生
物形態写真である。

【図２３】図２３は、組換え系統のいもち病に対する抵
抗性程度（エンバクＲＩＰ組換え系統）の結果を示すグ
ラフである。

【図２４】図２４は、白葉枯病の接種検定（エンバクＲ
ＩＰ組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。

【図２５】図２１は、白葉枯病の接種検定（エンバクＲ
ＩＰ組換え系統）の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 黒田 秧 新潟県上越市南新町５−20 107 (72)発明者 重宗 明子 新潟県上越市本城町１−26 104 Ｆターム(参考） 2B030 AA00 AB03 AD04 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA12 CA01 DA01 GA11 GA17 HA20 4B050 CC03 DD13 EE10 LL10 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14 AC20 BA02 BC50 CA31 CA53

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩ
   Ｐ）をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌ
   クレオチドが、 （ａ）配列番号１の１４６〜９５５位のヌクレオチド配
   列を含むポリヌクレオチド； または（ｂ）該（ａ）に
   示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダ
   イゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオ
   チド、である、ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１の
   １４６〜９５５位に記載のヌクレオチド配列、配列番号
   ３の５４〜８９９位に記載のヌクレオチド配列、配列番
   号５の３５〜８７７位に記載のヌクレオチド配列、およ
   び配列番号７の３７〜８４３位に記載のヌクレオチド配
   列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、
   請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１の
   １４６〜９５５位に記載のヌクレオチド配列に対して少
   なくとも７２．５％の相同性を有し、かつリボソーム不
   活性化タンパク質活性を有するタンパク質をコードす
   る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩ
   Ｐ）をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌ
   クレオチドが、 （ｃ）配列番号２の１〜２７０位に記載されるアミノ酸
   配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコ
   ードするポリヌクレオチド；または（ｄ）（ｃ）に示す
   アミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の挿入、欠
   失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコード
   するポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は
   植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ
   活性を有する、ポリヌクレオチド、である、ポリヌクレ
   オチド。
5. 【請求項５】 前記タンパク質が、配列番号２の１〜２
   ７０位に記載のアミノ酸配列、配列番号４の１〜２８２
   位に記載のアミノ酸配列、配列番号６の１〜２８１位に
   記載のアミノ酸配列、配列番号８の１〜２６９位に記載
   のアミノ酸配列およびそれらのフラグメントからなる群
   より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の
   ポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 前記配列番号２の１〜２７０位に記載の
   アミノ酸配列に対して少なくとも６２％の相同性を有
   し、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコ
   シダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、請求項
   ４に記載のポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載のポリヌ
   クレオチドを含む、発現カセット。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の発現カセットを含む、
   発現ベクター。
9. 【請求項９】 請求項８に記載のベクターが導入され
   た、植物細胞。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の植物細胞を再生して
    得られた、植物。
11. 【請求項１１】 植物病原性生物に対して抵抗性を有す
    る植物を作出するための方法であって、請求項８に記載
    の発現ベクターを植物細胞に導入する工程を包含する、
    方法。
12. 【請求項１２】 請求項９に記載の植物細胞を、前記リ
    ボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオ
    チドを発現し、そして植物病原性生物に対して抵抗性を
    有する植物体に再生する工程をさらに包含する、請求項
    １１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記植物病原性生物が、病原性細菌、
    真菌類、および病原性ウイルスからなる群から選択され
    る、請求項１１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記病原性細菌が、白葉枯病細菌（Ｘ
    ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）であ
    る、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記真菌類が、いもち病菌（Ｐｙｒｉ
    ｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）である、請求項１３に
    記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記抵抗性を有する植物が、少なくと
    も２つの植物病原性生物に対する複合病害抵抗性を示
    す、請求項１１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記少なくとも２つの病原性生物が、
    真菌類と病原性細菌との組み合わせである、請求項１６
    に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記少なくとも２つの病原性生物が、
    いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）
    と白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓ
    ｔｒｉｓ）との組み合わせである、請求項１６に記載の
    方法。
19. 【請求項１９】前記植物が、単子葉植物または双子葉植
    物である、請求項１１に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記植物が単子葉植物である、請求項
    １９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記単子葉植物がイネ科植物である、
    請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記イネ科植物がイネである、請求項
    ２１に記載の方法。