ES2373318T3 - Modificación del desarrollo y morfología de una planta. - Google Patents

Abstract

Un metodo para modificar la morfologia en una planta, que comprende introducir en una planta al menos un gen quimerico que comprende una secuencia promotora asociada operativamente con una secuencia de acido nucleico, siendo la secuencia promotora operativa para dirigir la expresi6n en celulas especificas de la planta, y la secuencia de acidos nucleicos que codifica al menos un producto genico capaz de alterar el metabolismo de las celulas especificas y/o pr6ximas, o de causar la muerte de las mismas, en donde la secuencia promotora es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, y en donde la secuencia promotora comprende la secuencia que se muestra en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con la secuencia mostrada en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la totalidad de la longitud de las secuencias a comparar, y en donde expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

Description

Modificaci6n del desarrollo y morfologia de una planta

CAMPO DE LA INVENCION.

La invenci6n se refiere a un metodo para modificar el desarrollo y la morfologia de una planta. La invenci6n se refiere ademas al uso de una secuencia de DNA para regular la expresi6n genica ex6gena en los tejidos de una planta. La invenci6n tambien se refiere a una secuencia de DNA identificada que actua como promotor que es operativo para la expresi6n directa en celulas especificas de una planta.

FUNDAMENTO.

El control de la morfologia de las plantas es de una gran importancia en la producci6n comercial de plantas para fines agricolas u horticolas, para potenciar la productividad y el rendimiento, para mejorar la eficacia de los cultivos y las cosechas, y para conseguir la estetica que se desea. Los aspectos que requieren un control o modificaci6n pueden incluir la morfologia de las flores, frutos o tuberculos, la cantidad de flores, frutos, semillas o tuberculos, la extensi6n de las raices primarias y laterales, la forma de los brotes aereos o el tronco, y la presencia de espinas o pelos urticantes. Otros aspectos que es de desear que puedan ser controlados incluyen el adelanto o el retraso de la abscisi6n de las hojas, flores o fruto, la liberaci6n de las semillas, y la producci6n de 6rganos de almacenamiento o glandulas secretoras.

Los cambios morfol6gicos ocurren con frecuencia como resultado del impacto ambiental sobre la planta, incluyendo los dafos fisicos, la predaci6n por los herbivoros, las infecciones pat6genas, el frio, el calor y la sequia. Frecuentemente pueden ser provocados deliberadamente por la intervenci6n humana, bien sea fisicamente (poda, flexi6n, atado, apilamiento o corte de 6rganos o estructuras particulares) o bien quimicamente (aplicaci6n de productos agroquimicos y sustancias para el crecimiento de las plantas). Sea cual sea el agente causante, los cambios morfol6gicos vienen decretados por la expresi6n de genes dentro de las celulas de la propia planta. El aparecer el cambio, la iniciaci6n de la expresi6n de uno o mas genes ocurre en aquellos tejidos particulares en los que se requiere que el crecimiento de la celula, la proliferaci6n, el desarrollo o la necrosis culminen en el cambio fisico en bruto.

La expresi6n de un gen depende de que su secuencia de DNA se transcriba en RNA por acci6n de la RNA polimerasa. Para lograr esto, la RNA polimerasa tiene que reconocer y unirse a una regi6n de la secuencia de DNA situada secuencia arriba (es decir, 5') de la secuencia que codifica el gen, con el fin de que se inicie la transcripci6n. Tal regi6n se denomina promotor del gen. La naturaleza intrinseca de la secuencia del promotor determina las circunstancias y la manera en la que se expresa el gen.

Expresandolo de una forma amplia, hay cuatro tipos de promotores que se encuentran en los tejidos vegetales: constitutivos, especificos del tejido, regulados por el desarrollo e induciblesrepresibles, si bien se ha de entender que necesariamente estos tipos no son mutuamente excluyentes.

Un promotor constitutivo dirige la expresi6n de un gen a traves de las diversas partes de una planta, continuamente durante el desarrollo de esa planta, aun cuando el gen no puede expresarse al mismo nivel en todos los tipos de celulas. Los ejemplos de promotores constitutivos conocidos incluyen los asociados con el transcripto 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al, 1985), el gen de la actina 1 del arroz (Zhang et al, 1991) y el gen de la ubiquitina 1 del maiz (Cornejo et al, 1993).

Un promotor especifico del tejido es uno que dirige la expresi6n de un gen en una parte de la planta (o en unas pocas partes), normalmente a lo largo del tiempo de vida de esas partes de la planta. La categoria de promotor especifico del tejido incluye tambien comunmente promotores cuya especificidad no es absoluta, es decir, tambien pueden dirigir la expresi6n a un nivel mas bajo en tejidos distintos de los del tejido preferido. Los ejemplos de promotores especificos del tejido conocidos en la tecnica incluyen aquellos que estan asociados con el gen de la patatina expresado en el tuberculo de la patata, y el gen de la glutenina de alto peso molecular expresado en el endospermo del trigo, la cebada o el maiz.

Un promotor regulado por el desarrollo dirige un cambio en la expresi6n de un gen en una o mas partes de una planta en un momento especifico durante el desarrollo de la planta. El gen puede expresarse en esa parte de la planta en otros momentos a un nivel diferente (normalmente mas bajo), y puede tambien expresarse en otras partes de la planta.

Un promotor inducible es capaz de dirigir la expresi6n de un gen en respuesta a un inductor. En ausencia del inductor el gen no se expresara. El inductor puede actuar directamente sobre la secuencia del promotor, o puede actuar contrarrestando el efecto de una molecula de represor. El inductor puede ser un agente quimico tal como un metabolito, una proteina, un regulador del crecimiento, o un elemento t6xico, una tensi6n fisiol6gica tal como calor, lace

raci6n, o presi6n osm6tica, o una consecuencia indirecta de la acci6n de un pat6geno o una plaga. Un promotor regulado por el desarrollo podria describirse como un tipo especifico de promotor inducible que responde a un inductor end6geno producido por la planta o a un estimulo ambiental en un punto concreto del ciclo de vida de la planta. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen los asociados con la respuesta a la laceraci6n, tal como se describe en Warner et al (1993), respuesta a la temperatura como se describe en Benfey y Chua (1989), e inducido quimicamente, como se describe en Gatz (1995).

Una secuencia promotora puede comprender cierto numero de dominios definidos necesarios para su funci6n. El primero de estos comprende aproximadamente 70 pares de bases situadas inmediatamente secuencia arriba (esto es, 5') del gen estructural y forma el promotor nucleo o core. El promotor nucleo contiene las cajas o secuencias CAAT y TATA y define el sitio de la iniciaci6n de la transcripci6n para el gen. Una serie de secuencias reguladoras secuencia arriba del promotor nucleo constituyen el resto de la secuencia del promotor y determinan los niveles de expresi6n, los patrones espacial y temporal de la expresi6n, y la respuesta a los inductores. Ademas, algunos promotores contienen elementos de secuencia que actuan potenciando el nivel de expresi6n, por ejemplo el del promotor de la plastomicina del guisante, como se describe en la publicaci6n de patente internacional nO WO 97/20056.

La modificaci6n genetica de las plantas depende de la introducci6n de genes quimericos en las celulas vegetales y de su expresi6n controlada bajo la direcci6n de un promotor. Pueden obtenerse promotores de diferentes fuentes, entre las que se incluyen animales, plantas, hongos, bacterias y virus, y los distintos promotores pueden trabajar con eficacias distintas en tejidos distintos. Los promotores pueden tambien se construidos sinteticamente.

Con frecuencia puede ser deseable expresar genes introducidos en cierto numero de tejidos diferentes en una planta. Por ejemplo, la expresi6n de una resistencia contra un agente pat6geno o una plaga, o la tolerancia a temperaturas extremas, puede expresarse de la mejor forma por todos los tejidos en una planta. Del mismo modo, podria ser deseable asegurar la expresi6n de los transgenes en todo instante a lo largo del desarrollo de la planta. Tambien, un promotor que se expresa de una manera que es inmune a la influencia de inductores o represores resultantes de estimulos ambientales imprevistos, puede ser tambien util para asegurar la expresi6n continuada de un rasgo. Con estos fines, seria de desear el uso de un promotor "constitutivo". Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor 35S del CaMV. Para cereales, el promotor de ubiquitina es un promotor constitutivo a elegir (Christensen y Quail, 1996).

Sin embargo, en algunos casos es mas deseable controlar la localizaci6n de la expresi6n del gen en una planta transgenica. Esto puede potenciar el efecto de la expresi6n genica asegurando que la expresi6n ocurre preferentemente en aquellos tejidos en los que es mas eficaz el efecto del producto genico. Por el mismo argumento, la expresi6n modulada puede reducir la perdida potencial de rendimiento limitando el drenaje de recursos en la planta. Otras ventajas incluyen la limitaci6n de la expresi6n genes agron6micamente utiles pero generalmente nocivos para tejidos especificos por la localizaci6n y la compartimentaci6n de la expresi6n genica en casos en los que el producto genico tendria que ser restringido, o excluido de ciertos tejidos. Por ejemplo, la expresi6n especifica de la antera de los genes inhibidores sue (Mariani et al., 1990) ha sido usada en sistemas de esterilidad masculina, mientras que la expresi6n en otras partes de la planta podria provocar toxicidad. Un sistema demuerte celular similar se describe en la solicitud de patente internacional WO 89/10396 en la que se usa una proteina RNAsa en combinaci6n con otro promotor especifico de la antera para causar la necrosis de las celulas de la antera y conferir esterilidad masculina en la planta.

En las solicitudes de patente internacional WO 02/33106 y WO 02/33107 se describen sistemas de muerte de celulas vegetales que proporcionan resistencia contra la infecci6n de nematodos por la expresi6n de una proteina inactivadora del ribosoma (proteina inactivadora del ribosoma del maiz, proteina antiviral de la hierba carmesi [Maize Ribosome Inactivating Protein, Pokeweed Antiviral Protein, PAP]) bajo la regulaci6n de promotores especificos para el sitio de alimentaci6n de los nematodos. En estos casos la especificidad de la expresi6n del gen nocivo esta potenciada porque los promotores son tanto especificos del tejido como sensibles a la invasi6n de nematodos.

En algunos casos pueden expresarse dos o mas transgenes en una planta en posiciones similares o diferentes. Cada transgen puede expresarse bajo el control de un promotor diferente que expresa en mas de una regi6n de la planta. Los promotores pueden elegirse de forma que haya un solapamiento en sus respectivos sitios de expresi6n en una o mas posiciones deseadas. Este o estos sitos de solapamiento dan una mayor especificidad y direccionamiento de la expresi6n genica. Mediante una selecci6n inteligente del producto genico codificado por cada transgen, la expresi6n de solapamiento de ambos transgenes puede conducir a un efecto aditivo o potenciado sobre los tejidos diana, mientras que la expresi6n de tan solo uno u otro de los transgenes en otras localizaciones puede no causar efecto alguno sobre la planta. Por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 02/33106, dos dominios de peptido separados derivados de la proteina inhibidora ribos6mica del maiz (RIP) se expresan bajo la regulaci6n de dos promotores especificos del tejido diferentes, que tienen perfiles diferentes de expresi6n pero que nunca tienen un sitio en comun, resultando la producci6n de una proteina activa en el sitio de solapamiento.

En cambio, los dos transgenes pueden codificar una molecula efectora y una molecula agonista o protectora. En este caso, la molecula efectora afectara a la planta en todas las localizaciones en las que se expresa, excepto en

aquellas en las que el sitio de expresi6n se solapa con el de la expresi6n de la molecula agonista o protectora. En NZ 260511 se propone un sistema de muerte de celulas vegetales con mayor especificidad para el tejido. Este sistema comprende la expresi6n de una molecula citot6xica (bajo el control de un primer promotor, el cual primer promotor causa la expresi6n en celulas diana especificas y en uno o mas de otros sitios en la planta), junto con una molecula protectora (bajo el control de un segundo promotor, el cual segundo promotor causa la expresi6n en todos los sitios en los que el primer promotor es activo, excepto en las celulas diana especificas). Ejemplos de moleculas citot6xicas y protectoras adecuadas son las proteasas e inhibidores de proteasa, respectivamente, o nucleasas e inhibidores de nucleasa, respectivamente. El documento WO 93/10251 describe el uso de una molecula de ribonucleasa citot6xica barnasa junto con la molecula protectora de inhibidor Barstar.

Otro ejemplo de sistema transgenico de dos componentes lo proporciona la solicitud de patente internacional nO WO 98/44138. Este sistema comprende la expresi6n de un producto genico bajo el control de un promotor, los cuales promotor y producto genico se eligen de forma que haya un solapamiento en sus respectivos sitios de expresi6n y efector en una localizaci6n deseada. El promotor dirige la expresi6n en las celulas especificas y tambien en uno o mas de otros sitios en la planta, mientras que la diana molecular del producto genico ocurre en un segundo rango de celulas que incluyen tambien las celulas diana especificas. Este sitio o estos sitios de solapamiento dan una mayor especificidad y direccionamiento de la expresi6n genica a las celulas en la localizaci6n deseada. Mediante una cuidadosa selecci6n del producto genico codificado por el transgen, la expresi6n en celulas no diana no produce efecto en la planta.

Una importante aplicaci6n de la expresi6n localizada de un gen nocivo para un tejido particular estaria en la modificaci6n de la morfologia de la planta, por ejemplo mediante la necrosis controlada o prevenci6n del desarrollo de ciertos tejidos u 6rganos, tales como las estructuras de floraci6n, cuerpos fructiferos o esporocarpos, tejidos de almacenamiento, brotes, tejidos foliares, tejidos de la raiz, zonas de abscisi6n, glandulas secretoras, celulas urticantes, tricomas o espinas.

Una aplicaci6n particular de la expresi6n localizada de un gen nocivo para modificar la morfologia de la planta estaria en la prevenci6n de las excrecencias de los brotes laterales de meristemos axilares de la hoja. La anatomia de los meristemos axilares y yemas laterales se describe en Esau (1960). La excrecencia de los brotes laterales surge comunmente cuando se elimina o se reduce la dominancia del brote apical; por ejemplo, cuando el brote apical es dafado o eliminado, bien sea accidentalmente por el dafo fisico o la predaci6n por herbivoros, o como parte de la practica agricola, por ejemplo la corta de renuevos. Otros cambios que modifican por ejemplo la producci6n, el transporte, la detecci6n o el metabolismo de sustancias end6genas de crecimiento de la planta, pueden tambien causar excrecencias a partir de los meristemos axilares. Los brotes laterales, o "suckers (suctores)", pueden ser indeseables por razones meramente esteticas, pueden producir una planta con una morfologia inutilizable, o pueden tener un efecto metab6lico perjudicial sobre la planta como un todo, actuando como una fuente adicional o sumidero para varios metabolitos o sustancias de crecimiento de la planta.

Un ejemplo en el que ocurre la excrecencia de yemas laterales es en el cultivo comercial del tabaco, en el que el brote apical que comprende la inflorescencia y las hojas mas altas es eliminado en un momento especifico durante el crecimiento de la planta, en el proceso conocido como "topping (desmoche)", para estimular el crecimiento y el desarrollo de las hojas restantes, para potenciar el crecimiento de la raiz y para avivar la redistribuci6n de metabolitos y compuestos secundarios a las hojas de la planta. Un inconveniente del proceso de desmoche es que tambien estimula la excrecencia de brotes laterales que de esta forma desvian la redistribuci6n de metabolitos deseada. Este efecto se evita normalmente mediante la eliminaci6n fisica de los brotes laterales, que es muy laboriosa, o mediante la aplicaci6n de supresores quimicos de brotes tales como hidrazida maleica, que es costosa en terminos de materiales, y ademas puede tener como resultado la retenci6n de residuos quimicos en la planta cosechada. Un sistema que previene tal "succi6n" dirigiendo especificamente la rotura de las celulas implicadas en la excrecencia de las yemas laterales, proporcionaria por tanto un gran beneficio al cultivo del tabaco.

Las proteinas desactivadotas del ribosoma (RIPs) son un grupo de proteinas vegetales t6xicas que desactivan cataliticamente los ribosomas eucari6ticos (Stirpe y Barbieri 1986). Las RIPs funcionan como Nglicosidasas para eliminar una adenina especifica en un lazo conservado del rRNA grande, y de esta manera previene la uni6n del Factor de Alargamiento 2, bloqueando asi la sintesis celular de proteinas. Se han descrito tres formas de RIPs. Las RIPs de tipo 1, tal como la proteina antiviral de la hierba carmesi y el inhibidor de traducci6n de cebada estan formadas cada una de ellas por una cadena de polipeptido simple, cada una con un valor de Mf aproximado de 30.000. Las RIPs de tipo 2, tales como ricina, abrina y modecina, comprenden cada una de ellas dos cadenas de polipeptidos, una con actividad de RIP, enlazada con un puente disulfuro a la otra cadena de lectina de uni6n con galactosa. Las RIPs de tipo 3, tales como RIP de maiz, comprenden una cadena de polipeptido unica que subsiguientemente experimenta clivaje o segmentaci6n proteolitica para liberar dos dominios de peptido activos.

La hierba carmesi (Phyto/aeea amerieana) produce tres proteinas antivirales distintas, que son PAP', PAPII y PAPS que aparecen en hojas de primavera, hojas de verano y semillas, respectivamente. Se han observado similitudes de aminoacidos entre estas tres proteinas. Como se usa en el presente texto, la denominaci6n "PAP" cubre las tres proteinas antivirales.

La patente de EE.UU. nO 6 015 940 describe la preparaci6n de un clon de cDNA de PAP' preparado a partir de hojas de primavera, y el uso del mismo bajo el control de un promotor constitutivo (bien sea el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor o el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia) en la producci6n de tabaco trasgenico y plantas de patata resistentes a la infecci6n por los virus PVX y PVY.

Plantas transgenicas que contienen la forma de hoja de verano de PAP, PAPII, han sido descritas en el documento WO 99/60843. Varias secuencias genicas de PAPII de longitud completa y truncadas, fueron cribadas con el fin de identificar las proteinas PAPII variantes que conservaban la actividad antiviral pero que no mostraban fitotoxicidad. Las plantas transgenicas mostraron actividad tanto antiviral como antifungica.

El gen PAP se expresa in vivo en las hojas inicialmente para producir una proteina ProPAP inactiva. Se sabe que despues de la traducci6n, la molecula de proteina ProPAP' es direccionada a la pared de la celula. En alguna fase durante este proceso las extensiones Ny Cterminales de la molecula de ProPAP' son segmentadas para producir una molecula de PAP' activada (PAP' madura). En el caso de PAPS (expresada en semillas) no se conoce la localizaci6n celular. Sin embargo, la regi6n procesada Nterminal de PAPS parece tener propiedades similares a las secuencias sefal para el direccionamiento.

La estructura de la proteina PAPS madura, es decir con las extensiones Ny Cterminales eliminadas, puede describirse en terminos de dos dominios separados, que corresponden a los dos dominios de RIPs de tipo 3, o los dos polipeptidos de RIPs de tipo 2, esto es, el dominio de uni6n con el ribosoma y el dominio catalitico.

SUMARIO DE LA INVENCION.

En un aspecto, la presente invenci6n proporciona un metodo para modificar la morfologia en una planta, que comprende introducir en una planta al menos un gen quimerico que comprende una secuencia promotora asociada operativamente con una secuencia de acido nucleico, siendo la secuencia del promotor operativa para dirigir la expresi6n en celulas especificas de la planta, y la secuencia de acidos nucleicos que codifica al menos un producto genico capaz de alterar el metabolismo de las celulas especificas y/o pr6ximas, o de causar la muerte de las mismas, en donde la secuencia del promotor es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, y en donde la secuencia del promotor comprende la secuencia que se muestra en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con la secuencia mostrada en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la totalidad de la longitud de las secuencias a comparar, y en donde expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

En una realizaci6n, el producto genico puede ser capaz de potenciar el metabolismo de las celulas especificas y/o las celulas pr6ximas, o promover su vigor.

En otra realizaci6n preferible, el producto genico es capaz de interferir el metabolismo de las celulas especificas y/o de las celulas pr6ximas, o de causar la muerte de las mismas.

La expresi6n "de manera sustancialmente especifica" que se usa en el presente texto significa que el promotor de acuerdo con la presente invenci6n es operativo para dirigir la expresi6n predominantemente en la yema lateral y/o el brote lateral. El promotor de acuerdo con la presente invenci6n, ademas de ser operativo para dirigir la expresi6n en la yema lateral y/o en el brote lateral, puede tambien ser operativo para dirigir la expresi6n en otros tipos de celulas o tejidos dentro de la planta, siempre y cuando la expresi6n predominante (es decir, mas del 51% de la expresi6n global (total) en la planta) ocurra en la yema lateral y/o el brote lateral.

El promotor de acuerdo con la presente invenci6n, ademas de ser operativo para dirigir la expresi6n en la yema lateral y/o el brote lateral, puede tambien ser operativo para dirigir la expresi6n en otros tipos de celulas o en otros tejidos dentro de la planta, siempre y cuando la expresi6n global no mate la planta.

Preferentemente, la expresi6n "de manera sustancialmente especifica" que se usa en el presente texto significa que el promotor de acuerdo con la presente invenci6n es operativo para dirigir la expresi6n predominantemente en las yemas laterales y/o brotes laterales, estando menos del 50%, preferentemente menos del 25%, preferentemente menos del 10%, mas preferentemente menos del 5% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos en cualquier otro tejido de la planta o celula de la planta.

Por ejemplo, una secuencia de acidos nucleicos expresada bajo el control del promotor de acuerdo con la presente invenci6n puede expresarse predominantemente en la yema lateral y/o en el brote lateral con menos del 25%, preferentemente menos del 10%, mas preferentemente menos del 5% del nivel de expresi6n global en cualquier otro tejido.

Preferentemente la secuencia del promotor comprende la secuencia mostrada en SEC ID NO 1 o una parte funcional de la misma, o una secuencia que es al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 97% identica a la misma.

En una realizaci6n de la presente invenci6n, la morfologia de una planta es afectada por uno o mas productos genicos, preferentemente un producto genico.

En otra realizaci6n mas de la presente invenci6n, la morfologia de una planta es afectada por dos o mas productos genicos. Preferentemente la secuencia de acidos nucleicos codifica dos o mas productos genicos. Asi pues, a titulo de ejemplo, solamente puede introducirse un gen quimerico en la planta, el cual gen quimerico comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica dos o mas productos genicos. Alternativamente, pueden ser introducidos en la planta dos o mas genes quimericos, comprendiendo cada gen quimerico una secuencia de acidos nucleicos que codifica uno o mas productos genicos. Asi, por ejemplo, un gen quimerico puede comprender una secuencia de acidos nucleicos que codifica un producto genico y otro gen quimerico puede comprender una secuencia de acidos nucleicos que codifica multiples productos genicos, es decir 2, 3 o 4 productos genicos. Alternativamente, ambos genes quimericos pueden comprender una secuencia o secuencias de acidos nucleicos que codifican multiples productos genicos. Preferentemente los dos o mas productos genicos funcionan independientemente entre ellos para efectuar la interferencia del metabolismo de las celulas por un efecto aditivo. Alternativamente los dos o mas productos genicos interaccionan entre si para efectuar la interferencia del metabolismo de las celulas por un efecto sinergico o por un efecto antagonista.

Preferentemente se modifica la excrecencia de brotes laterales. La excrecencia de los brotes laterales puede ser potenciada. Adecuadamente, la excrecencia de los brotes laterales puede ser evitada o reducida y/o retrasada.

Preferentemente la excrecencia de brotes laterales se modifica interfiriendo el metabolismo o causando la muerte de celulas implicadas en el desarrollo de las yemas laterales.

Las celulas implicadas en el desarrollo de las celulas laterales pueden incluir las del promeristemo, protodermo, epidermis, estomas, celulas de guarda, endodermos, peridermo, parenquima del cortex, celulas urticantes, celulas de almacenamiento, endosperma del 6vulo, polen, zona de abscisi6n, tricomas, celulas secretoras, felema, fel6geno, felodermo, procambio, cambio, protoxilema, xilema, rayos, protofloema, floema, colenquima, esclerenquima, parenquima, clorenquima, tunica, corpus, cortex, estructuras del profilo y estructuras foliares.

Se entiende que la expresi6n "celulas especificas" como se usa en el presente texto significa aquellas celulas en las que el promotor se expresa predominantemente, preferentemente aquellas celulas en las que el promotor se expresa de forma sustancialmente especifica.

La expresi6n "celulas especificas de la planta" incluye celulas de yemas laterales y/o de brotes laterales, es decir aquellas celulas implicadas en la iniciaci6n y/o el desarrollo de la yema lateral.

En una realizaci6n preferentemente las "celulas especificas de la planta" son las celulas de la yema lateral y/o del brote lateral.

En una realizaci6n las celulas especificas de la planta pueden ser una celula de uno o mas de los elementos siguientes: promeristemo, protodermo, epidermis, estomas, celulas de guarda, endodermos, peridermo, parenquima del c6rtex, celulas urticantes, endosperma del 6vulo, polen, zona de abscisi6n, tricomas, celulas secretoras, felema, fel6geno, felodermo, procambio, cambio, protoxilema, xilema, rayos, protofloema, floema, colenquima, esclerenquima, parenquima, clorenquima, tunica, corpus, c6rtex, estructuras del profilo y estructuras foliares.

La expresi6n "expresado predominantemente" como se usa en el presente texto significa que el promotor de acuerdo con la presente invenci6n es operativo para dirigir principalmente (esto es, mas del 51% de la expresi6n total) la expresi6n en las celulas especificas de la planta (tal como las celulas de la yema lateral y/o el brote lateral), aun cuando pueden encontrarse niveles de expresi6n mas bajos en otro u otros tipos de celulas o en otro u otros tejidos.

Por ejemplo, se ha encontrado que el promotor de acuerdo con la presente invenci6n es operativo para dirigir predominantemente la expresi6n en la yema lateral y/o el brote lateral, pero que tambien puede haber expresi6n en otro tejido o tipo de celula. Por ejemplo, puede haber tambien expresi6n en tejido lacerado y/o tallo y/o tejido foliar.

Adecuadamente la excrecencia de la yema lateral o del brote lateral puede ser prevenida o reducida y/o retrasada. Preferentemente la excrecencia de la yema lateral o del brote lateral se modifica interfiriendo el metabolismo o provocando la muerte de las celulas implicadas en el desarrollo de la yema lateral y/o el brote lateral.

La expresi6n "tejido de la yema lateral" como se usa en el presente texto incluye celulas de la yema lateral y/o celulas del brote lateral.

Preferentemente el producto genico de la secuencia de acidos nucleicos capaz de interferir el metabolismo de las celulas especificas y/o las celula pr6ximas, o de causar la muerte de las mismas, es un producto nocivo, adecuadamente una molecula citot6xica.

Preferentemente el producto genico de la secuencia de acidos nucleicos capaz de interferir el metabolismo de las celulas especificas y/o las celulas pr6ximas, o de causar la muerte de las mismas, es una proteina desactivadora del ribosoma (RIP) o una variante o parte funcional de la misma. Por ejemplo, la RIP puede ser una RIP de tipo 1 y/o una RIP de tipo 2 y/o una RIP de tipo 3, o una variante o parte funcional de las mismas. Preferentemente el producto genico es una proteina antiviral de la hierba carmesi (PAP) o una variante o parte funcional de la misma. El producto genico puede ser PAP' o PAPII o una variante o parte funcional de la misma. Mas preferentemente, el producto genico es proteina antiviral S de la hierba carmesi (PAPS) o una variante o parte funcional de la misma.

La presente invenci6n proporciona tambien un acido nucleico que comprende una secuencia promotora, siendo la secuencia promotora como se muestra en la SEC ID NO 1, o una parte funcional de la misma, que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 75% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 85% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 95% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 97% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 98% de identidad con ella, lo mas preferentemente al menos un 99% de identidad con ella, y que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre toda la longitud de las secuencias a comparar.

La presente invenci6n proporciona tambien un acido nucleico que comprende una secuencia promotora, siendo la secuencia promotora como se muestra en la SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma, que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 75% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 85% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 95% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 97% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 98% de identidad con ella, lo mas preferentemente al menos un 99% de identidad con ella, y que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre toda la longitud de las secuencias a comparar.

La presente invenci6n proporciona tambien un gen quimerico que comprende una secuencia promotora, siendo la secuencia promotora asociada operativamente con una secuencia de acido nucleico, comprendiendo la secuencia promotora la secuencia mostrada en la SEC ID NO 1, o una parte funcional de la misma, que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 75% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 85% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 95% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 97% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 98% de identidad con ella, lo mas preferentemente al menos un 99% de identidad con ella, y que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre toda la longitud de las secuencias a comparar.

La presente invenci6n proporciona tambien un gen quimerico que comprende una secuencia promotora asociada operativamente con una secuencia de acido nucleico, comprendiendo la secuencia promotora la secuencia mostrada en la SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma, que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 75% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 85% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 95% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 97% de identidad con ella, mas preferentemente al menos un 98% de identidad con ella, lo mas preferentemente al menos un 99% de identidad con ella, y que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre toda la longitud de las secuencias a comparar.

Preferentemente la secuencia de acidos nucleicos y/o el acido nucleico de acuerdo con la presente invenci6n y/o el gen quimerico de acuerdo con la presente invenci6n es una secuencia de DNA.

En una realizaci6n el gen quimerico de acuerdo con la presente invenci6n puede obtenerse, y se obtiene preferentemente, a partir del clon pBNP 0850501001 (NCIMB 41343).

Preferentemente la secuencia de acidos nucleicos es capaz de regular la expresi6n de una secuencia adicional. Adecuadamente la secuencia adicional codifica una proteina o RNA, una secuencia de cosupresi6n, una secuencia antisentido o una secuencia de inhibici6n de dsRNA (RNA de doble cadena).

Preferentemente la secuencia adicional puede obtenerse, y se obtiene preferentemente, a partir de una planta. La planta puede ser un miembro de la familia de las solanaceas. Preferentemente la planta puede ser un miembro de la subfamila de las Cestroideas. Mas preferentemente la planta es una o mas del grupo del tomate, patata, berenjena, petunia o tabaco. Mas preferentemente la planta es del genero Nieotiana. Lo mas preferentemente la planta es Nieotiana tabaeum.

Se prefiere que la secuencia adicional sea capaz de interferir el metabolismo de las celulas especificas y/o celulas pr6ximas, o causar la muerte de las mismas. Se prefiere que la secuencia adicional codifique una proteina antiviral de la hierba carmesi o una parte funcional de la misma.

Las secuencias de acidos nucleicos y/o el acido nucleico y/o el gen quimerico citado en el presente texto pueden ser secuencias aisladas o, alternativamente, pueden ser secuencias sintetizadas.

La presente invenci6n proporciona ademas un DNA recombinante que comprende DNA vector y una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la presente invenci6n y/o un acido nucleico de acuerdo con la presente invenci6n y/o una secuencia promotora de acuerdo con la presente invenci6n, y/o un gen quimerico de acuerdo con la presente invenci6n. El DNA recombinante puede comprender ademas adecuadamente una secuencia codificadora de un gen. Preferentemente el DNA vector comprende un plasmido, un c6smido, un virus o un fago. Adecuadamente el DNA recombinante puede comprender un promotor para dirigir la expresi6n de un gen marcador seleccionable.

Preferentemente el DNA recombinante reside en una celula hospedadora. Adecuadamente la celula hospedadora puede permitir la transcripci6n y la traducci6n del DNA recombinante.

La presente invenci6n proporciona ademas una planta producida de acuerdo con el metodo de la presente invenci6n. La presente invenci6n proporciona ademas una planta construida por ingenieria genetica que comprende una secuencia de acidos nucleicos y/o un acido nucleico y/o una secuencia promotora y/o un gen quimerico de acuerdo con la presente invenci6n. Preferentemente el acido nucleico y/o una secuencia promotora esta asociada operativamente con una secuencia codificadora de un gen.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invenci6n, se proporciona una planta que comprende un DNA recombinante de acuerdo con la presente invenci6n. La planta de acuerdo con la presente invenci6n puede ser de interes para la industria de la horticultura, la industria de la floricultura, la industria forestal y/o la industria de la agricultura. La planta puede ser una planta que se cultiva con el fin de proporcionar cortes de flores. La planta puede ser tomate, pepino, Petunia, Dianthus, Picea, Eucaliptus, Pinus, Populus, una especie dicotiled6nea tal como patata, tabaco, algod6n, lechuga, berenjena, mel6n, calabaza, guisante, canola, soja, remolacha azucarera o girasol, o una especie monocotiled6nea tal como trigo, cebada, centeno, arroz o maiz. Mas preferentemente la planta es de la familia de las solanaceas. Mas preferentemente la planta es de la subfamila de las Cestroideas. Mas preferentemente la planta es una o mas del grupo del tomate, patata, berenjena, Petunia o tabaco. Mas preferentemente la planta es del genero Nieotiana. Lo mas preferentemente la planta es Nieotiana tabaeum.

La presente invenci6n proporciona ademas una celula vegetal de una planta producida de acuerdo con el metodo de la presente invenci6n, teniendo la celula vegetal un metabolismo alterado. La celula vegetal producida de acuerdo con el metodo de la presente invenci6n puede tener un metabolismo que esta alterado para potenciar su metabolismo. Preferentemente, la celula vegetal producid de acuerdo con la presente invenci6n tiene un metabolismo interferodo.

La presente invenci6n proporciona tambien una celula vegetal construida mediante ingenieria genetica, que comprende una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la presente invenci6n. Preferentemente el acido nucleico de acuerdo con la presente invenci6n y/o la secuencia promotora de acuerdo con la presente invenci6n esta asociada operativamente con una secuencia codificadora de un gen.

En otro aspecto de la presente invenci6n se proporciona una celula vegetal que comprende un DNA recombinante de acuerdo con la presente invenci6n. Preferentemente el acido nucleico de acuerdo con la presente invenci6n y/o la secuencia promotora de acuerdo con la presente invenci6n estan asociados operativamente con una secuencia codificadora de un gen.

La presente invenci6n proporciona tambien un metodo para regular la expresi6n de un gen en una planta, comprendiendo el metodo introducir en la planta un acido nucleico de acuerdo con la presente invenci6n y/o una secuencia promotora de acuerdo con la presente invenci6n asociada operativamente con una secuencia codificadora de un gen cuya expresi6n se ha de regular.

La presente invenci6n proporciona ademas un metodo para modificar el metabolismo dentro de una celula de una planta transgenica, comprendiendo el metodo introducir en una planta un acido nucleico de acuerdo con la presente invenci6n y/o una secuencia promotora de acuerdo con la presente invenci6n y/o un gen quimerico de acuerdo con la presente invenci6n. Preferentemente el metodo comprende introducir un acido nucleico de acuerdo con la presente invenci6n y/o una secuencia promotora de acuerdo con la presente invenci6n y/o un gen quimerico de acuerdo con la presente invenci6n, en la celula. Preferentemente el acido nucleico o la secuencia promotora de acuerdo con la presente invenci6n esta asociado operativamente con una secuencia codificadora de un gen. Ventajosamente el gen esta implicado en una ruta metab6lica. Preferentemente un producto metab6lico aumenta o disminuye en la celula.

La presente invenci6n proporciona ademas un metodo para alterar la producci6n de un producto genico dentro de una celula vegetal, que comprende introducir un acido nucleico de acuerdo con la presente invenci6n y/o una secuencia promotora de acuerdo con la presente invenci6n asociada operativamente con una secuencia de codificaci6n de un gen, cuya producci6n de un producto genico se ha de alterar. Preferentemente se aumenta la producci6n del producto genico. Preferentemente el producto genico es una molecula de RNA que puede interaccionar con el proceso de expresi6n del gen a traves del mecanismo de RNAi, antisentido o cosupresi6n, o que puede ser traducida en un producto genico de proteina. Preferentemente el producto genico de proteina es una proteasa, una endonucleasa de restricci6n, una proteina de transporte en la membrana, una ribonucleasa o una proteina desactivadora del ribosoma. Preferentemente la proteina desactivadota del ribosoma es una proteina antiviral de la hierba carmesi (PAP). La PAP puede ser PAP' o PAPII. Pas preferentemente la proteina antiviral de la hierba carmesi es PAPS o una variante o parte funcional de la misma.

Tambien proporciona la presente invenci6n el uso de un acido nucleico que comprende una secuencia promotora como se muestra en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma, que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con ella que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral para modificar la morfologia de una planta, en la que el porcentaje de identidad se determina sobre toda la longitud de las secuencias a comparar, y en donde la expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

Tambien se proporciona por medio de la presente invenci6n el uso de una secuencia de acidos nucleicos que comprende la secuencia promotora mostrada en la SEC ID NO 1 o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 97% de identidad con ella, que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para modificar la morfologia de una planta, en la que el porcentaje de identidad se determina sobre toda la longitud de las secuencias a comparar, y en donde la expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

Tambien se proporciona por medio de la presente invenci6n el uso de una secuencia de acidos nucleicos que comprende la secuencia promotora mostrada en la SEC ID NO 7 o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 97% de identidad con ella, que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para modificar la morfologia de una planta, en la que el porcentaje de identidad se determina sobre toda la longitud de las secuencias a comparar, y en donde la expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

Tambien se proporciona por medio de la presente invenci6n el uso de una secuencia de acidos nucleicos que comprende una secuencia promotora como la mostrada en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7 o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con ella, que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para alterar el metabolismo en una celula vegetal, en la que el porcentaje de identidad se determina sobre toda la longitud de las secuencias a comparar, y en donde la expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes late

rales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

Tambien se proporciona por medio de la presente invenci6n el uso de una secuencia de acidos nucleicos que comprende una secuencia promotora como la mostrada en la SEC ID NO 1 o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que es al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 97% identica a ella, que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para alterar el metabolismo en una celula vegetal, en la que el porcentaje de identidad se determina sobre toda la longitud de las secuencias a comparar, y en donde la expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

Tambien se proporciona por medio de la presente invenci6n el uso de una secuencia de acidos nucleicos que comprende una secuencia promotora como la mostrada en la SEC ID NO 7 o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que es al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 97% identica a ella, que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para alterar el metabolismo en una celula vegetal, en la que el porcentaje de identidad se determina sobre toda la longitud de las secuencias a comparar, y en donde la expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

La presente invenci6n proporciona ademas el uso de un acido nucleico que comprende una secuencia promotora como se muestra en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 60% de identidad con ella, que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para alterar la producci6n de un producto genico en una celula vegetal.

La presente invenci6n proporciona ademas el uso de una secuencia de acidos nucleicos que comprende una secuencia promotora como se muestra en la SEC ID NO 1, o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que es al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 97% identica a ella, que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para alterar la producci6n de un producto genico en una celula vegetal.

Tambien se proporciona mediante la presente invenci6n el uso de una secuencia de acidos nucleicos que comprende una secuencia promotora como se muestra en la SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que es al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 97% identica a ella, que es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para alterar la producci6n de un producto genico en una celula vegetal.

La presente invenci6n puede tambien proporcionar una parte de la SEC ID NO 1, en la que la parte es desde el nucle6tido 1 hasta el nucle6tido 1321 de la SEC ID NO 1 o una parte de la misma. La parte desde el nucle6tido 1 hasta el nucle6tido 1321 puede ser una "parte funcional" de la SEC ID NO 1.

La presente invenci6n puede tambien proporcionar una parte de la SEC ID NO 7, en la que la parte es desde el nucle6tido 1 hasta el nucle6tido 1309 de la SEC ID NO 7 o una parte de la misma. La parte desde el nucle6tido 1 hasta el nucle6tido 1309 puede ser una "parte funcional" de la SEC ID NO 7.

Por "parte funcional" los autores de la presente invenci6n entienden que la parte es operativa para dirigir la expresi6n en celulas especificas de una planta.

Cualquier aspecto de la presente invenci6n puede referirse a solamente una, o a mas de una, de las secuencias mencionadas en el presente texto.

La expresi6n "gen quimerico" como se usa en el presente texto significa cualquier molecula de acido nucleico hibrido formada cuando secuencias de acido nucleico de diferentes fuentes se ligan entre ellas.

En la presente invenci6n, "celulas pr6ximas" son aquellas celulas que son suficientemente cercanas a las celulas especificas que son afectadas por la expresi6n en las celulas especificas, es decir, "celulas pr6ximas" pueden definirse como las celulas que pueden diferenciarse en tejido de yema lateral (es decir, una vez que las celulas de iniciaci6n de la yema lateral han sido alteradas de acuerdo con la presente invenci6n) o celulas que apoyan el crecimiento de la yema lateral y/o el brote lateral.

IDENTIFICADORES DE SECUENCIA.

En la lista de secuencias:

SEC ID NO 1 muestra la secuencia de DNA de un promotor aislado de la presente invenci6n.

SEC ID NO 2 muestra el Oligonucle6tido de PCR S2PCLOFWD.

SEC ID NO 3 muestra el Oligonucle6tido de PCR S2PCLOREV.

SEC ID NO 4 muestra la secuencia de DNA de otro promotor aislado (conocido en el presente texto como el "promotor ATC 023") (no de acuerdo con la invenci6n reivindicada).

SEC ID NO 5 muestra el Oligonucle6tido de PCR AT4G29190L.

SEC ID NO 6 muestra el Oligonucle6tido de PCR AT4G29190R.

SEC ID NO 7 muestra la secuencia de DNA de un promotor aislado de la presente invenci6n (conocido en el presente texto como el "promotor ATC 085").

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS.

Para que la invenci6n pueda ser llevada a efecto facilmente, se hace ahora referencia, a titulo de ejemplo, de los dibujos que siguen, en los cuales:

La Figura 1 muestra el alineamiento de SEC ID NO 1 con el promotor Sar8.2b (registro de GenBank U648116).

La Figura 2 muestra el alineamiento de la secuencia promotora ATC 023 con el genoma de Arabidopsis tha/iana alrededor del locus AT4g29190 [Cromosoma 4: 1439637914392944 orientaci6n inversa]. La regi6n secuencia arriba 5' del gen AT4g29190 se muestra en cursivas, y las regiones no traducidas 5' y 3' se muestran en letras minusculas. Las cajas indican los codones de iniciaci6n y terminaci6n del gen AT4g29190. Los sitios del cebador usados para clonar el promotor ATC 023 estan subrayados. Los cambios de nucle6tido se muestras con doble subrayado.

La Figura 3 muestra la localizaci6n de la expresi6n del gen informador GUS impulsada por el promotor ATC 085 en secciones del tallo del tabaco. (a) - (c) muestran secciones a traves del tallo en la regi6n de la iniciaci6n de la yema lateral; (d) muestra las tres secciones en serie a traves de la misma regi6n de iniciaci6n de la yema lateral; y (e) muestra una secci6n vertical a traves de una axila foliar.

La Figura 4a muestra el efecto de expresi6n de la proteina antiviral de la hierba carmesi activada por el promotor ATC 085 sobre la excrecencia de las yemas laterales 17 y 18 en el tabaco despues del desmoche, en comparaci6n con plantas testigo (NCC).

La Figura 4b muestra el efecto de expresi6n de la proteina antiviral de la hierba carmesi activada por el promotor ATC 085 sobre la excrecencia de la yema lateral 16 en el tabaco despues del desmoche, en comparaci6n con plantas testigo (NCC).

La Figura 5 muestra la excrecencia de los brotes laterales en el tabaco al hacer el desmoche, y el efecto de la transformaci6n con ATC 085PAP; (a) muestra una planta testigo no transformada, mostrando la excrecencia alargada de los brotes laterales; (b) muestra una planta transgenica ATC 085PAP no mostrando una excrecencia visible de la yema.

La Figura 6 muestra la localizaci6n de la expresi6n del gen informador GUS activado por el promotor ATC 023 en secciones del tallo del tabaco despues del desmoche. (a) muestra una secci6n a traves del tallo de una planta en la regi6n de iniciaci6n de la yema lateral; (b) y (c) muestran secciones en serie a traves de las regiones de iniciaci6n de la yema lateral tomadas de diferentes plantas; y (d) muestra una secci6n vertical a traves de una axila foliar.

La Figura 7 muestra la localizaci6n de la expresi6n del gen informador GUS activado por el promotor ATC 023 en secciones del tallo de Arabidopsis. (a) muestra la expresi6n en el punto de excrecencia de la yema al inicio del desarrollo de la yema, y (b) a (d) muestran la subsiguiente expresi6n en yemas en desarrollo y tejidos pr6ximos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION.

Adecuadamente, la secuencia promotora de acuerdo con la presente invenci6n es operativa para dirigir la expresi6n de forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, y comprende una secuencia de nucle6tidos que tiene al menos un 65%, preferentemente al menos un 70%, mas preferentemente al menos un 75%, mas preferentemente al menos un 80%, mas preferentemente al menos un 85%, mas preferentemente al menos un 90%, mas preferentemente al menos un 95%, mas preferentemente al menos un 97% de identidad, mas preferentemente al menos un 98% de identidad, lo mas preferentemente al menos un 99% de identidad con una cualquiera de las secuencias mostradas como SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma, que es operativa para dirigir la expresi6n de una forma sustancialmente especifica en una yema lateral y/o en un brote lateral.

El termino "promotor" como se usa en el presente texto se emplea en el sentido normal de la tecnica, p. ej. un sitio de uni6n de RNA polimerasa.

Como se usa en el presente texto, "alterar el metabolismo" de una celula significa afectar a la funci6n metab6lica de una celula de tal manera que cambie el normal funcionamiento del metabolismo de la celula, con el resultado de una funci6n normal de la celula potenciada o bien inhibida.

Como se usa en el presente texto, la expresi6n "interferir el metabolismo" significa alterar la funci6n metab6lica de una celula de tal manera que interfiera con el normal funcionamiento del metabolismo de la celula, con el resultado de la muerte o la inhibici6n de la funci6n normal de la celula.

Como se usa en el presente texto, la expresi6n "potenciar el metabolismo" de una celula significa alterar la funci6n metab6lica de una celula de tal manera que aumente el crecimiento o la viabilidad de la celula.

Como se usa en el presente texto, "celula de iniciaci6n de la yema lateral" significa una celula asociada con la iniciaci6n del crecimiento de una yema lateral.

Como se usa en el presente texto, "modificar la morfologia" significa alterar el habito de crecimiento normal de una planta que manifiesta un cambio fisico en parte o en la totalidad de la planta. El crecimiento de los brotes laterales de la planta puede ser potenciado, por ejemplo. Preferentemente el crecimiento de las yemas laterales de la planta es inhibido o evitado. De cualquier forma, puede cambiarse la estructura fisica global y/o el aspecto de la planta.

Una secuencia de DNA de una planta puede ser recuperada de las celulas del hospedador natural, o puede ser sintetizada directamente in vitro. La extracci6n del hospedador natural permite el aislamiento de novo de secuencias nuevas, mientras que la sintesis de DNA in vitro requiere generalmente informaci6n de la secuencia preexistente. La sintesis quimica directa in vitro puede conseguirse mediante sintesis manual secuencial o por medio de procedimientos automaticos. Las secuencias de DNA pueden tambien construirse por tecnicas estandar de "annealing" (reasociaci6n o emparejamiento) de fragmentos, o por otros metodos conocidos en la tecnica. Ejemplos de tales procedimientos de clonaci6n se dan en Sambrock et al. (1989).

La secuencia de DNA de la presente invenci6n puede ser aislada por clonaci6n directa de segmentos de DNA gen6mico de la planta. Los segmentos adecuados de DNA gen6mico de la planta pueden ser obtenidos por fragmentaci6n usando endonucleasas de restricci6n, sonicaci6n, cizalladura fisica u otros metodos conocidos en la tecnica. Usando cribado predictivo de la secuencia de DNA del segmento clonado para la presencia de secuencias codificadoras (Baxevanis, 2001) pueden encontrarse motivos caracteristicos de secuencias de promotor conocidas, secuencia arriba de tal secuencia diagn6stica.

La identificaci6n del segmento clonado como secuencia promotora puede conseguirse alternativamente evaluando la funcionalidad, por ejemplo enlazando el segmento clonado con una secuencia de codificaci6n derivada de un gen informador e introduciendo la construcci6n quimerica en una celula hospedadora o un sistema libre de celulas en el que pueda evaluarse la expresi6n del gen informador. Este proceso puede formar parte de otra estrategia de aislamiento de secuencias denominada "trapping" o captura del promotor, en el que los fragmentos de DNA gen6mico son clonados directamente en "vectores de expresi6n" que comprenden una regi6n de codificaci6n del gen informador y otras secuencias necesarias para la expresi6n en una celula hospedadora o un sistema libre de celulas. La expresi6n puede o no requerir la integraci6n de la construcci6n quimerica en el DNA cromos6mico del hospedador.

Un metodo alternativo de obtener una secuencia de DNA de la presente invenci6n es por identificaci6n y aislamiento de una secuencia que codifica DNA que se sabe que se expresa, y subsiguientemente usar esta tecnica para obtener la secuencia promotora contigua, que es por definici6n dirigir la expresi6n de la secuencia de codificaci6n. Alter

nativamente, puede obtenerse una secuencia de DNA por la identificaci6n de una secuencia que se sabe que se expresa en un organismo diferente, y despues aislando la secuencia de codificaci6n hom6loga y subsiguientemente su secuencia promotora asociada, del organismo elegido. Una secuencia de codificaci6n puede ser obtenida mediante el aislamiento del RNA mensajero (mRNA o polyA + RNA) del tejido vegetal o el aislamiento de una proteina y realizando la "traducci6n inversa" de su secuencia. El tejido usado para el aislamiento del DNA se elige sobre la base de que se cree que las secuencias de codificaci6n de genes adecuadas se expresan en ese tejido a niveles 6ptimos para el aislamiento.

Hay varios metodos para aislar el mRNA del tejido vegetal que son bien conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, usar un oligonucle6tido oligodT inmovilizado en una matriz inerte. El mRNA aislado puede ser utilizado para producir su secuencia de DNA complementaria (cDNA) mediante el uso de la enzima transcriptasa inversa (RT) u otras enzimas que tengan actividad de transcriptasa inversa. El aislamiento de una secuencia de cDNA individual de un poo/ o conjunto de cDNAs puede conseguirse clonando en vectores bacterianos o virales, o empleando la reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores de oligonucle6tido seleccionados. La producci6n y el aislamiento de un cDNA especifico a partir de mRNA pueden conseguirse mediante una combinaci6n de pasos de transcripci6n inversa y de PCR, en un procedimiento conocido como RTPCR.

Pueden emplearse varios metodos para mejorar la eficiencia de aislamiento de la secuencia deseada mediante metodos de enriquecimiento o selecci6n que incluyen el aislamiento y la comparaci6n de mRNA (o el cDNA monocatenario o bicatenario resultante) de mas de una fuente, con el fin de identificar las secuencias expresadas predominantemente en el tejido elegido. Numerosos metodos de cribado diferencial, hibridaci6n o clonaci6n son conocidos por los expertos en la tecnica, que incluyen cDNAAFLP, hibridaci6n en cascada y kits comerciales para la clonaci6n selectiva o diferencial.

En la presente invenci6n, una secuencia de cDNA para una proteina SAR 8.2j (EMBL numero de registro U64812) fue utilizada para aislar una nueva secuencia promotora. Ejemplos de otros genes de la proteina SAR se dan en EMBL numeros de registro U64816, U64807, U64808, U64809, U64810, U64811, U64813, U64814, U6481. Una segunda secuencia de cDNA para un factor de transcripci6n dedo de zinc (EMBL numero de registro AL096692) fue tambien utilizada para aislar una secuencia promotora.

El cDNA elegido puede usarse entonces para evaluar las caracteristicas gen6micas de su gen de origen, por el uso como sonda de hibridaci6n en una transferencia Southern de DNA gen6mico vegetal para revelar la complejidad del genoma con respecto a esa secuencia. Alternativamente, la informaci6n de secuencia del cDNA puede usarse para idear o concebir oligonucle6tidos, y estos pueden ser usados de la misma forma que sondas de hibridaci6n; para cebadores de PCR para producir sondas de hibridaci6n o para cebadores de PCR para usarlos en el analisis directo del genoma.

Del mismo modo el cDNA elegido puede ser usado para evaluar el perfil de expresi6n de su gen de origen, por el uso como sonda de hibridaci6n en una transferencia Northern de RNA extraido de varios tejidos vegetales, o de una serie del desarrollo o temporal. Tambien aqui la informaci6n de secuencia del cDNA puede ser usada para concebir oligonucle6tidos que pueden ser usados como sondas de hibridaci6n, para producir sondas de hibridaci6n, o directamente para RTPCR.

El cDNA elegido, u oligonucle6tidos derivados, pueden entonces ser usados como sonda de hibridaci6n para cuestionar una libreria de fragmentos de DNA gen6mico clonados e identificar secuencias de DNA. Por este medio puede ser identificado y aislado un promotor contiguo.

Por la naturaleza del metodo de aislamiento, un cDNA aislado comprende habitualmente el termino 3' de la regi6n de codificaci6n y se extiende hacia el termino 5'. Puede no comprender la secuencia de codificaci6n de longitud completa. Es preferible asegurarse de que la secuencia terminal 5' esta presente si el cDNA se va a usar para identificar el promotor contiguo. Esto puede realizarse por extensi6n de la secuencia del cDNA clonado en la direcci6n 5' por un proceso denominado 5' RACE (amplificaci6n rapida de extremos de cDNA).

Si el analisis de la secuencia del cDNA clonado identifica una secuencia hom6loga ya publicada en la bibliografia cientifica, esta informaci6n puede proporcionar una secuencia candidato adecuada para el termino 5'. Sin embargo, la posibilidad de que haya diferentes miembros de la misma familia de genes con regiones de codificaci6n similares, pero diferentes regiones intr6n, secuencias de promotor y perfiles de expresi6n, puede conducir a la selecci6n de una secuencia promotora incorrecta e inadecuada.

Una vez que el termino 5' de la secuencia de codificaci6n ha sido identificado, la regi6n secuencia arriba contigua que contiene el promotor puede ser identificada si esta presente en las bases de datos de nucle6tidos publicas. Alternativamente el promotor puede ser aislado por posterior extensi6n en la direcci6n 5'. Esto puede conseguirse por metodos que incluyen PCR de ligaci6n de vector, genome wa/king (desplazamiento o paseo gen6mico), PCR vectorette, y otros metodos. Si es necesario el proceso puede repetirse con un nuevo cebador complementario del

termino 5' del primer fragmento de promotor para asegurarse de que son aisladas todas las secuencias de control de los promotores.

La homologia puede determinarse sobre la base del porcentaje de identidad entre dos secuencias de DNA (o de polipeptido). En general, las dos secuencias a comparar son alineadas para dar una correlaci6n maxima entre las secuencias. La alineaci6n de las dos secuencias se examina y se determina el numero de posiciones que dan una correspondencia de nucle6tidos (o aminoacidos) exacta entre las dos secuencias determinadas, dividido por la longitud total de la alineaci6n multiplicado por 100, para dar una cifra de porcentaje de identidad. Esta cifra de porcentaje de identidad puede ser determinada sobre la longitud completa de las secuencias a comparar, lo que es particularmente adecuado para secuencias de la misma longitud o de longitudes muy similares y que son altamente hom6logas, o sobre longitudes definidas mas cortas, lo que es mas adecuado para secuencias de longitudes distintas o que tienen un nivel de homologia mas bajo.

Los metodos para comparar la identidad de dos o mas secuencias son bien conocidos en la tecnica. Asi, por ejemplo, pueden usarse programas disponibles en Wisconsin Sequence Analysis Package, versi6n 9.1 (Devereux J. et al, 1984) (disponible de Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EE.UU.), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, para determinar el porcentaje de identidad entre dos polinucle6tidos y el porcentaje de identidad entre dos secuencias de polipeptidos. El programa BESTFIT usa el algoritmo de "homologia local" de Smith y Waterman (1981) y encuentra la mejor regi6n individual de similitud entre dos secuencias. El programa BESTFIT es mas apto para comparar dos polinucle6tidos o dos secuencias de polipeptidos que son de longitudes distintas, suponiendo el programa que la secuencia mas corta representa una porci6n de la mas larga. En comparaci6n, el programa GAP alinea dos secuencias encontrando una "similitud maxima" de acuerdo con el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970). El programa GAP es mas apropiado para comparar secuencias que son aproximadamente de la misma longitud y se espera una alineaci6n sobre la longitud entera. Preferentemente los parametros "Peso de Gap" y "Peso de Longitud" usados en cada programa son 50 y 3 para secuencias de polinucle6tidos y 12 y 4 para secuencias de polipeptidos, respectivamente. Preferentemente, el porcentaje de identidades y similitudes se determina cuando las dos secuencias que se comparan estan alineadas 6ptimamente.

Tambien son conocidos por los expertos en la tecnica otros programas para determinar la identidad y/o la similitud entre secuencias, por ejemplo la familia de programas BLAST (Karlin y Altschul, 1990, Proe. Nat/. Aead. Sei. USA

87: 2264 2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proe. Nat/. Aead. Sei. USA 90: 5873 5877, disponible del National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Maryland, EE.UU. y accesible a traves de la pagina de NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov. Estos programas ejemplifican un ejemplo no limitante preferido de algoritmo matematico utilizado para la comparaci6n de dos secuencias. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al., 1997, J. Mo/. Bio/. 215: 403 -410. Las busquedas de nucel6tidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST para obtener secuencia de nucle6tidos hom6logas a una molecula de acido nucleico de la invenci6n. Las busquedas de proteina BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, para obtener secuencias de aminoacidos hom6logas a una molecula de proteina de la invenci6n. Para obtener alineamientos separados para fines de comparaci6n, puede usarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al, 1997, Nue/eie Aeids Res. 25 : 3389 3402. Alternativamente, puede usarse PSIBlast para llevar a cabo una busqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moleculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSIBLAST, pueden usarse los parametros por defecto de los programas respectivos (p. ej. XBLAST y NBLAST). Vease http://www.ncbi.nlm.iiih. gov. Otro ejemplo no limitante de algoritmo matematico preferido utilizado para la comparaci6n de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4: 11 -17. Tal algoritmo esta incorporado en el programa ALIGN (versi6n 2.0), que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG.

Otro ejemplo no limitante de programa para determinar la identidad y/o la similitud entre secuencias conocido en la tecnica es FASTA (Pearson W. R. y Lipman D. J., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 85: 2444 2448, 1988, disponible como parte del Wisconsin Sequence Analysis Package [paquete de analisis de secuencias Wisconsin]). Preferentemente se usa la matriz de sustituci6n de aminoacidos BLOSUM62 (Henikoff S. y Henikoff J. G, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 89: 10915 10919, 1992) en comparaciones de la secuencia de polipeptidos incluyendo en donde las secuencias de nucle6tidos son primero traducidas a secuencias de aminoacidos antes de la comparaci6n.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando tecnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin permitir huecos. En el calculo del porcentaje de identidad tipicamente se cuentan las coincidencias exactas.

Preferentemente el programa BESTFIT se usa para determinar el % de identidad de un polinucle6tido problema o una secuencia de polipeptidos con respecto a un polinucle6tido o un polipeptido de la presente invenci6n, estando la secuencia problema y la de referencia alineados 6ptimamente y los parametros del programa ajustados en el valor por defecto.

En el contexto de la presente invenci6n, secuencias sustancialmente hom6logas son aquellas que tienen al menos un 50% de identidad de secuencia, preferentemente al menos 60%, 65% o 70% de identidad de secuencias, mas

preferentemente al menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% o 94% de identidad de secuencias y lo mas preferentemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o mas, de identidad de secuencias.

Como se usa en el presente texto, el termino "hom6logo" significa una entidad que tiene una cierta homologia con las secuencias de aminoacidos sujeto y las secuencias de nucle6tidos sujeto. Aqui, el termino "homologia" puede hacerse equivalente a "identidad".

Aunque la homologia puede tambien ser considerada en terminos de similitud (esto es, restos de aminoacidos que tienen propiedades o funciones quimicas similares), en el contexto de la presente invenci6n se prefiere expresar la homologia en terminos de identidad de secuencias.

En el contexto de la presente invenci6n el termino utilizar incluye, entre otros, usar, introducir y expresar una secuencia o gen.

La presente invenci6n incluye tambien secuencias de DNA que se hibridan con las secuencias de DNA de los promotores anteriores, incluyendo secuencias parciales y secuencias complementarias. Las condiciones bajo las cuales tales secuencias se hibridaran de esta forma pueden determinarse de una manera rutinaria.

La hibridaci6n puede llevarse a cabo bajo condiciones de restricci6n baja, media o alta. Las condiciones bajo las cuales la hibridaci6n y/o el lavado pueden llevarse a cabo estan en el intervalo de 42°C a 68°C, y el tamp6n para lavado puede comprender de 0,1 x SSC, 0,5% SDS a 6 x SSC, 0,5% SDS. Tipicamente la hibridaci6n puede llevarse a cabo durante la noche a 65° C (condiciones de restricci6n alta), 60° C (condiciones de restricci6n media), o 55° C (condiciones de restricci6n baja). Los filtros pueden lavarse durante 2 x 15 minutos con 0,1 x SSC, 0,5% SDS a 65°C (lavado de restricci6n alta). Los filtros pueden lavarse durante 2 x 15 minutos con 0,1 x SSC, 0,5% SDS a 63° C (lavado de restricci6n media). Para el lavado de restricci6n baja, los filtros se lavan a 60° C durante 2 x 15 minutos a 2 x SSC, 0,5% SDS.

La presente invenci6n incluye tambien secuencias de DNA que se hibridan con sondas de oligonucle6tidos. Preferentemente las secuencias de DNA se hibridan con sondas de oligonucle6tido bajo condiciones restrictivas. En casos en los que las moleculas de acido nucleico son oligonucle6tidos ("oligos"), las condiciones altamente restrictivas pueden referirse, por ejemplo, al lavado con 6 x SSC / pirofosfato s6dico al 0,05% a 37°C (para 14 oligos de base), 48°C (para 17 oligos de base), 55°C (para 20 oligos de base), y 60°C (para 23 oligos de base). En una busqueda BLAST frente a la base de datos de secuencias de nucle6tidos EMBL (EMBL Nucleotide Sequence Database), versi6n 77 (Kulikova et al., 2004), el promotor ATC 085 tiene una identidad mayor que el 90% sobre sus ultimas 220 bases con secuencias conocidas secuencia arriba del cod6n de inicio de la traducci6n de otros genes SAR tales como 8.2h y 8.2k. La unica secuencia que muestra cualquier otra regi6n de homologia a lo largo de la longitud del promotor es la regi6n de promotor Sar 8.2b (promotor Sar 8.2b, registro de GenBank U64816, bases 1 a 1907).

La Figura 1 muestra la alineaci6n entre la SEC ID NO 1 (bases 1 a 1566) y la regi6n del promotor SAR 8.2b con homologia (bases 704 a 1907 de la secuencia de GenBank). La identidad se indica mediante puntos entre las secuencias alineadas. De la Figura 1 puede observarse que la SEC ID NO 1 tiene un 61% de identidad con el correspondiente promotor SAR 8.2b globalmente.

La figura 2, que no es de acuerdo con la invenci6n reivindicada, muestra la alineaci6n entre la secuencia del promotor ATC 023 (bases 1 a 1904) y la regi6n de la secuencia de Arabidopsis tha/iana alrededor del locus AT4g29190 (en orientaci6n inversa). De la Figura 2 puede observarse que el promotor ATC 023 clonado tiene mas del 99% de identidad con la secuencia gen6mica publicada.

La secuencia de codificaci6n del gen que se usa bajo el control del promotor y se emplea en llevar a cabo la presente invenci6n puede ser activa en algunos tejidos vegetales o en todos. La secuencia empleada puede codificar una proteina o un resto de RNA. Mediante tecnicas de DNA recombinante, la secuencia puede codificar una variante sintetica de una proteina o RNA, una secuencia parcial o una secuencia compuesta que comprende regiones de uno

o mas genes. Por ejemplo, el gen quimerico puede codificar una poliproteina. La secuencia puede comprender tambien secuencias repetidas, truncadas, inversas o complementarias, para conseguir la interrupci6n de la transcripci6n y la traducci6n de uno o mas genes end6genos, por ejemplo mediante tecnologia antisentido, de cosupresi6n o de inhibici6n de RNA.

Muchos genes vegetales, bacterianos y virales pueden expresarse activamente bajo el control del promotor. Preferentemente tales genes codifican:

(i)

Enzimas GUS, GPF y luciferasa que pueden ser usadas como genes informadores para la funci6n del promotor.

(ii) Genes para enzimas que producen componentes estructurales de la planta, tales como celulosa, hemicelulosas, pectinas y lignina.

(iii) Secuencias de DNA disefadas para alterar el metabolismo en plantas y celulas vegetales. Tales genes incluyen los del metabolismo de carbohidratos, metabolismo del almid6n, metabolismo de aminoacidos y proteinas, metabolismo de acidos nucleicos y metabolismo de lipidos.

(iv)

Secuencias de DNA reguladoras que pueden tener efectos sobre el control del metabolismo o el desarrollo, tal como la floraci6n o la arquitectura vegetal, incluyendo aquellos genes que estan implicados en el metabolismo o el transporte de sustancias de crecimiento de la planta.

(v)

Secuencias de DNA que codifican productos tales como enzimas de restricci6n, proteasas, inhibidores de proteinasa y proteinas desactivadoras del ribosoma, que pueden usarse para conferir deliberadamente una funci6n celular.

(vi)

Resistencia al estres ambiental, a agentes pat6genos o a plagas.

El promotor de la presente invenci6n es preferentemente operativo para dirigir la expresi6n en meristemos laterales y/o auxiliares.

El promotor de acuerdo con la presente invenci6n, ademas de ser operativo para dirigir la expresi6n en yemas y/o brotes laterales, puede ser tambien operativo para dirigir la expresi6n en otros tejidos y/o celulas de la planta. Por ejemplo, puede observarse alguna expresi6n en tejido lacerado, y/o el tallo, y/o las hojas de la planta. Sin embargo, el promotor es operativo para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica (como se define en el presente texto) en una yema lateral y/o un brote lateral.

El perfil de expresi6n de los promotores de la presente invenci6n puede ser determinado por los expertos en la tecnica usando una diversidad de metodos que son preferentemente:

(i)

Expresi6n transitoria en la que el promotor es enlazado a un gen informador tal como GUS, GFP o luciferasa en una construcci6n apropiada, e introducido en el tejido vegetal mediante transformaci6n escopeta. La expresi6n del promotor se detecta por la presencia o ausencia del producto del gen informador en diferentes tejidos vegetales.

(ii)

Expresi6n transitoria en la que el promotor es enlazado a un gen informador tal como GUS, GFP o luciferasa, en una construcci6n binaria apropiada, e introducido en tejido vegetal mediante Agrobaeterium. La expresi6n del promotor se detecta por la presencia o ausencia del producto del gen informador en diferentes tejidos vegetales. La actividad de GUS puede ser detectada visualmente usando sustratos apropiados tales como un colorante, o usando un colorimetro o un espectrofot6metro; la luciferasa y las proteinas marcadoras fluorescentes pueden ser detectadas a simple vista o fotograficamente, bien sea en pelicula o en un medio digital, o cuantitativamente usando un lumin6metro o un fluor6metro. Los genes marcadores pueden tambien ser detectados usando sistemas basados en anticuerpos.

(iii) Transformaci6n y regeneraci6n de la planta. La expresi6n del promotor se detecta por la presencia o la ausencia del gen informador en diferentes tejidos vegetales.

(iv) Transformaci6n y regeneraci6n de la planta. La expresi6n del promotor se detecta por la presencia o la ausencia de un producto genico especifico producido por un gen efector en diferentes tejidos vegetales.

El producto genico de la presente invenci6n puede ser producido por tecnicas recombinantes, en las que clones de DNA gen6mico o clones de cDNA para la secuencia de codificaci6n de cDNA, son producidos, aislados, multiplicados e incorporados a un vector de transformaci6n de la planta de la presente invenci6n.

En la presente invenci6n se presenta por primera vez un promotor que es capaz de expresar un gen de manera sustancialmente especifica en brotes laterales y/o yemas laterales.

Adecuadamente, el promotor de acuerdo con la presente invenci6n es un "promotor inducido", es decir, un promotor que se pone en marcha en respuesta a un estimulo. Asi, al igual que el promotor es operativo para dirigir la expresi6n en celulas especificas de la planta, el promotor puede tambien ser considerado como un promotor inducible.

Preferentemente, el promotor de acuerdo con la presente invenci6n es inducido desmochando la planta, es decir, eliminado el brote o la yema apical de la planta.

Sin animo de vinculaci6n con ninguna teoria, una posible manera en la que el promotor de la presente invenci6n puede ser "conectado" es que puede ser activado o inducido por una sefal que puede ser estimulada por la eliminaci6n de la yema apical, por tanto despues del desmoche. Por ejemplo, la sefal puede ser una hormona del crecimiento de la planta. A titulo de ejemplo solamente, la sefal puede ser una o varias citocinas.

Alternativamente, y tambien ahora sin desear vincularse a teoria alguna, puede ser posible que la yema apical libere una sefal inhibidora que evita la excrecencia del meristemo lateral y/o la conexi6n del promotor de la presente invenci6n, en cuyo caso, por ejemplo, la eliminaci6n de la yema apical, p. ej. por desmoche, puede tener por resultado la perdida de la sefal inhibidora y por tanto la conexi6n del promotor de la presente invenci6n. Por ejemplo, y tan solo a titulo de ejemplo, la sefal inhibidora puede ser una o varias auxinas.

AISLADA.

En un aspecto, preferentemente la secuencia esta en forma aislada. El termino "aislada" significa que la secuencia es al menos sustancialmente libre de al menos otro componente con el cual la secuencia esta asociada naturalmente en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza.

PURIFICADA.

En un aspecto, la secuencia esta preferentemente en forma purificada. El termino "purificada" significa que la secuencia esta en estado relativamente puro, p. ej. al menos aproximadamente el 90% de pureza, o al menos aproximadamente el 95% de pureza, o al menos aproximadamente el 98% de pureza.

SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS.

La expresi6n "secuencia de nucle6tidos" como se usa en el presente texto es sin6nima de "secuencia de acidos nucleicos" y se refiere a una secuencia de oligonucle6tidos o secuencia de polinucle6tidos, y variantes, hom6logos, fragmentos y derivados de las mismas (tal como porciones de las mismas). La secuencia de nucle6tidos puede ser de origen gen6mico o sintetico o recombinante, que puede ser de doble cadena o de cadena simple si representa la cadena sentido o antisentido.

La expresi6n "secuencia de nucle6tidos" o "acido nucleico" en relaci6n con la presente invenci6n incluye DNA gen6mico, cDNA, DNA sintetico y RNA. Preferentemente significa DNA, mas preferentemente secuencia de cDNA que codifica para la presente invenci6n.

Debido a la degeneraci6n del c6digo genetico, pueden producirse facilmente secuencias de nucle6tidos en las que el uso del cod6n triplete, para algunos o todos los aminoacidos codificados por la secuencia de nucle6tidos original, ha sido cambiado, produciendo asi una secuencia de nucle6tidos con baja homologia con la secuencia de nucle6tidos original, pero que codifica la misma secuencia de aminoacidos que la codificada por la secuencia de nucle6tidos original, o una variante de la misma. Por ejemplo, para la mayoria de los aminoacidos, la degeneraci6n del c6digo genetico es en la tercera posici6n del cod6n triplete (posici6n de bamboleo) (para referencia vease Stryer, Lubert, Biochemistry, Tercera Edici6n, Freeman Press, ISBN 0716719207) por tanto una secuencia de nucle6tidos en la que todos los codones triplete han sido "bamboleados" en la tercera posici6n seria aproximadamente un 66% identica a la secuencia de nucle6tidos original, sin embargo la secuencia de nucle6tidos corregida codificaria la misma secuencia de aminoacidos primaria que la secuencia de nucle6tidos original, o una variante de la misma.

Por tanto la presente invenci6n se refiere tambien a cualquier secuencia de nucle6tidos que tenga uso de cod6n triplete alternativo para al menos un cod6n triplete que codifica un aminoacido, pero que codifica la misma secuencia de polipeptido, o una variante, que la secuencia de polipeptido codificada por la secuencia de nucle6tidos original.

Ademas, los organismos especificos tienen tipicamente una tendencia en cuanto a que codones triplete son usados para codificar aminoacidos. Se dispone con facilidad de tablas de uso de cod6n preferido, y pueden usarse para preparar genes optimizados por codones. Tales tecnicas de optimizaci6n por codones se usan rutinariamente para optimizar la expresi6n de transgenes en un hospedador heter6logo.

Tipicamente, la secuencia de nucle6tidos que codifica polipeptidos que tienen las propiedades especificas que se definen en el presente texto, se prepara usando tecnicas de DNA recombinante (esto es, DNA recombinante). Sin embargo, en una realizaci6n alternativa de la invenci6n, la secuencia de nucle6tidos podria ser sintetizada, en su totalidad o en parte, usando metodos quimicos bien conocidos en la tecnica (vease Caruthers M H et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215 23 y Horn T et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225 232).

EVOLUCION MOLECULAR.

Una vez que la secuencia de nucle6tidos que codifica el promotor ha sido aislada, o que ha sido identificada una secuencia de nucle6tidos que codifica un promotor putativo, puede ser deseable modificar la secuencia de nucle6tidos elegida, por ejemplo puede ser deseable mutar la secuencia con el fin de preparar un producto genico de acuerdo con la presente invenci6n.

Las mutaciones pueden introducirse usando oligonucle6tidos sinteticos. Estos oligonucle6tidos contienen secuencias de nucle6tidos que flanquean los sitos de mutaci6n deseados.

Un metodo adecuado se describe en Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, p 646 649). Otro metodo de introducir mutaciones en secuencias de nucle6tidos se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147 151).

En vez de mutagenesis dirigida al sitio, tal como se describi6 antes, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente, por ejemplo usando un kit comercial tal como el kit para mutagenesis GeneMorph PCR de Stratagene, o el kit para mutagenesis aleatoria Diversify PCR de Clontech. El documento EP 0 583 265 se refiere a metodos de optimizar la mutagenesis basada en la PCR, que puede tambien combinarse con el uso de analogos de DNA mutagenicos tales como los descritos en el documento EP 0 866 796.

Un tercer metodo de obtener secuencias nuevas es fragmentar secuencias de nucle6tidos no identicas, bien sea usando cualquier numero de enzimas de restricci6n o una enzima tal como la DNasa I, y reensamblando secuencias de nucle6tidos completas que codifican proteinas funcionales. Alternativamente, se pueden usar una o multiples secuencias de nucle6tidos no identicas e introducir mutaciones durante el reensamblaje de la secuencia de nucle6tidos completa. Metodos adecuados para llevar a cabo el "shuffling" (barajeo o reordenamiento) pueden encontrarse en los documentos EP0 752 008, EP1 138 763 y EP1 103 606. El barajeo puede combinarse tambien con otras formas mutagenesis de DNA como se describe en la patente de EE.UU. nO 6.180.406 y WO 01/34835.

Asi, es posible producir numerosas mutaciones dirigidas al sitio o aleatorias en una secuencia de nucle6tidos, bien sea in vivo o in vitro, y a continuaci6n hacer un cribado en cuanto a la funcionalidad mejorada del polipeptido codificado por varios medios. Usando metodos de recombinaci6n mediados in si/ieo y exo (veanse el documento WO 00/58517, patente de EE.UU. nO 6.344.328, y patente de EE.UU. nO 6.361.974), por ejemplo, puede llevarse a cabo una evoluci6n molecular en la que la variante producida retiene muy poca homologia con proteinas conocidas. Tales variantes obtenidas de esta forma pueden tener una significativa analogia estructural con proteinas conocidas, pero tener muy poca analogia de secuencia de aminoacidos.

Como ejemplo no limitante, ademas, mutaciones o variantes naturales de una secuencia de polinucle6tidos pueden ser recombinadas bien sea con el tipo silvestre o bien con otras mutaciones o variantes naturales para producir nuevas variantes. Tales nuevas variantes pueden tambien ser cribadas en cuanto a la funcionalidad mejorada del polipeptido codificado.

VECTORES DE TRANSFORMACION DE LA PLANTA.

Los vectores de transformaci6n de la planta de la presente invenci6n contendran "casettes de expresi6n" que comprenden 5'3' en la direcci6n de la transcripci6n, una secuencia promotora como se describe en la presente invenci6n, una secuencia de codificaci6n de gen como se discuti6 anteriormente y, opcionalmente, una secuencia del terminador 3' no traducida que incluye una sefal de parada para RNA polimerasa y una sefal de poliadenilaci6n para poliadenilasa.

La secuencia promotora puede estar presente en una o mas copias, y tales copias pueden ser identicas o variantes de la secuencia promotora como se describi6 anteriormente. Tales copias pueden tambien ser completas o secuencias parciales como se describi6 anteriormente.

La secuencia terminadora puede obtenerse de genes vegetales, bacterianos o virales. Secuencias terminadoras adecuadas son la secuencia terminadora rbeS Ep del guisante, la secuencia terminadora nos derivada del gen de la nopalina sintasa de Agrobaeterium tumefaeiens y la secuencia terminadora 35S del virus del mosaico de la coliflor, por ejemplo. Un experto en la tecnica estara al tanto facilmente de otras secuencias terminadoras adecuadas.

La casette de expresi6n puede comprender tambien un mecanismo de potenciaci6n de la expresi6n del gen para aumentar la fuerza del promotor. Un ejemplo de tal elemento potenciador es el que se deriva de una porci6n del promotor del gen de la plastocianina del guisante, y que es el objeto de la solicitud de patente internacional nO WO 97/20056.

Estas regiones reguladoras pueden derivarse del mismo gen que la secuencia de DNA promotora de la presente invenci6n, o pueden derivarse de genes diferentes, de Nieotiana tabaeum o de otros organismos, por ejemplo de una

planta de la familia de las solanaceas o de la subfamilia de las cestroideas. Todas las regiones reguladoras deben ser capaces de operar en celulas del tejido a transformar.

La secuencia de codificaci6n del gen puede derivarse del mismo gen que la secuencia de DNA promotora de la presente invenci6n o puede derivarse de un gen diferente, de Nieotiana tabaeum o de otro organismo, por ejemplo de una planta de la familia de las solanaceas o de la subfamilia de las cestroideas.

La casette de expresi6n puede ser incorporada en un vector de transformaci6n de las plantas basico, tal como pBIN 19 Plus, pBI 101, u otro vector de transformaci6n de las plantas adecuado conocido en la tecnica. Ademas de la casette de expresi6n, el vector de transformaci6n de las plantas contendra secuencias tales como las necesarias para el proceso de transformaci6n. Estas pueden incluir los genes de Agrobaeterium vir, una o mas secuencias borde de TDNA, y un marcador selecccionable u otro medio de identificar celulas de la planta transgenica.

La expresi6n "vector de transformaci6n de la planta" significa una construcci6n capaz de expresi6n in vivo o in vitro.

Preferentemente, el vector de expresi6n se incorpora en el genoma del organismo. La expresi6n "se incorpora" cubre preferentemente la incorporaci6n estable en el genoma.

Los vectores de la presente invenci6n pueden ser transformados en una celula hospedadora adecuada como se describe mas adelante para proporcionar la expresi6n de un polipeptido que tiene las propiedades especificas como se definen en el presente texto.

La elecci6n del vector, p. ej. de plasmido, de c6smido, de virus o de fago, dependera con frecuencia de la celula hospedadora en la cual ha de ser introducido.

Los vectores pueden contener uno o mas genes marcadores seleccionables, tales como genes que confieren resistencia a antibi6ticos, p. ej. resistencia a la ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Alternativamente, la selecci6n puede realizarse por cotransformaci6n (como se describe en el documento WO 91/17243).

Los vectores pueden usarse in vitro, por ejemplo para la producci6n de RNA, o usarse para trasfectar o transformar una celula hospedadora.

La expresi6n "asociado operativamente" se refiere a una yuxtaposici6n en la que los componentes descritos estan en una relaci6n que les permite funcionar de la manera que se pretende. Una secuencia reguladora "asociada operativamente" a una secuencia de codificaci6n esta ligada de tal forma que la expresi6n de la secuencia codificadora se consigue bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

CELULAS HOSPEDADORAS.

La expresi6n "celula hospedadora", en relaci6n con la presente invenci6n, incluye cualquier celula que comprenda un acido nucleico, una secuencia promotora o un gen quimerico de acuerdo con la presente invenci6n, o un vector de expresi6n como se describi6 anteriormente.

Asi pues, otra realizaci6n de la presente invenci6n proporciona celulas hospedadoras transformadas o trasfectadas con un acido nucleico, una secuencia promotora o un gen quimerico de la presente invenci6n. Las celulas se elegiran para que sean compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, celulas procariotas (por ejemplo bacterianas), fungicas, de levadura o vegetales. Preferentemente las celulas hospedadoras no son celulas humanas.

Ejemplos de organismos hospedadores bacterianos adecuados son las bacterias gram negativas o las bacterias gram positivas.

En una realizaci6n, pueden preferirse los hospedadores eucari6ticos tales como levaduras u otros hongos. En general, las celulas de levadura son preferidas sobre las celulas de hongos porque son mas faciles de manipular.

El uso de celulas hospedadoras adecuadas, tales como las celulas hospedadoras de levaduras, hongos, y plantas, puede proporcionar modificaciones posttraduccionales (p. ej. miristoilaci6n, glicosilaci6n, truncaci6n, lapidaci6n y fosforilaci6n de tirosina, serina o treonina), que pueden necesitarse para conferir una 6ptima actividad biol6gica en productos recombinantes de expresi6n de la presente invenci6n.

La celula hospedadora puede ser una cepa deficitaria de proteasa o proteasa minus.

La expresi6n "planta transgenica" en relaci6n con la presente invenci6n incluye cualquier planta que comprenda un acido nucleico, una secuencia promotora o un gen quimerico de la presente invenci6n. Preferentemente el acido nucleico, la secuencia promotora o el gen quimerico se incorporan en el genoma de la planta.

La expresi6n "planta transgenica" no cubre secuencias de codificaci6n de nucle6tidos nativas en su entorno natural cuando estan bajo el control de su promotor nativo, que esta tambien en su entorno natural.

La presente invenci6n tambien abarca el uso de secuencias de nucle6tidos que son complementarias con las secuencias discutidas en el presente texto, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es complementaria de un fragmento de la misma, entonces esa secuencia puede usarse como sonda para identificar secuencias de codificaci6n similares en otros organismos, etc.

El termino "variante" como se usa en el presente texto significa una proteina expresada desde un c6digo genetico no end6geno que resulta en una o mas alteraciones de aminoacidos (es decir, deleciones (borrados), adiciones o sustituciones de aminoacidos) cuando se compara con la secuencia natural o e tipo silvestre en la secuencia de la proteina madura.

TRANSFORMACION DE LA PLANTA.

Las tecnicas para transformar plantas son bien conocidas en este campo e incluyen la transformaci6n mediada por Agrobaeterium, por ejemplo. El principio basico en la construcci6n de plantas modificadas geneticamente es insertar informaci6n genetica en el genoma de la planta de forma que se obtenga un mantenimiento estable del material genetico insertado. Una revisi6n de las tecnicas generales puede encontrarse en publicaciones de Potrykus (Annu Rev P/ant Physio/ P/ant Mo/ Bio/ [1991] 42: 205 225) y Christou (AgroFoodIndustry HiTech marzo/abril de 1994 17 27).

Tipicamente, en la transformaci6n mediada por Agrobaeterium, un vector binario que lleva un DNA extrafo de interes, es decir un gen quimerico, es transferido desde una cepa apropiada de Agrobaeterium a una planta diana mediante el cocultivo del Agrobaeterium con explantes de la planta diana. El tejido vegetal transformado es entonces regenerado en medio de selecci6n, el cual medio de selecci6n comprende un marcador seleccionable y hormonas de crecimiento de la planta. Una alternativa es el metodo de la inmersi6n floral (Clough y Bent, 1998) en el que las yemas florales de una planta intacta se ponen en contacto con una suspensi6n de la cepa de Agrobaeterium que contiene el gen quimerico, y despues de la puesta de la semilla los individuos transformados son germinados e identificados por crecimiento en medio selectivo.

La infecci6n directa de tejidos vegetales por Agrobaeterium es una tecnica simple que ha sido empleada con profusi6n y que se describe en Butcher D. N. et al., (1980), Tissue Cu/ture Methods for P/ant Patho/ogists, eds.: D. S. Ingrams y J. P. Helgeson, 203 208.

Otros metodos de transformaci6n adecuados incluyen la transferencia directa de genes a protoplastos usando polietilen glicol o tecnicas de electroporaci6n, bombardeo con particulas, microinyecci6n, y el uso de fibras de carburo de silicio, por ejemplo.

La transformaci6n de plantas usando transformaci6n balistica, incluyendo la tecnica del pelo de carburo de silicio, se ensefan en Frame B R, Drayton P R, Bagnaall S V, Lewnau C J, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A y Wang K (1994). La producci6n de plantas de maiz transgenico fertiles mediante la transformaci6n mediada por pelo de carburo de silicio se ensefa en The P/ant Journa/ 6: 941 948) y las tecnicas de transformaci6n viral se ensefan, por ejemplo, en Meyer P, Heidmann I y Niedenhof I (1992). El uso del virus del mosaico de la cassava como sistema vector para plantas se ensefa en Gene 110: 213 217.

Otras ensefanzas acerca de la transformaci6n de plantas pueden encontrarse en el documento EPA0449375.

En otro aspecto, la presente invenci6n se refiere a un sistema vector que lleva una secuencia de nucle6tidos o construcci6n de acuerdo con la presente invenci6n y que es capaz de introducir la secuencia de nucle6tidos o la construcci6n en el genoma de un organismo, tal como una planta. El sistema puede comprender un vector pero tambien puede comprender dos vectores. En el caso de dos vectores, el sistema vector se denomina normalmente sistema vector binario. Los sistemas vector binarios se describen con mas detalle en Gynheung An et al., (1980), Binary Vectors, P/ant Mo/eeu/ar Bio/ogy Manua/ A3, 1 -19.

Un sistema empleado con profusi6n para la transformaci6n de celulas vegetales usa el plasmido Ti de Agrobaeterium tumefaeiens, o un plasmido Ri de Agrobaeterium rhizogenes An et al., (1986), P/an Physio/. 81, 303 -305 y Butcher D. N. et al, (1980), Tissue Cu/ture Methods for P/ant Patho/ogists, ed.: D. S. Ingrams y J. P. Helgeson, 203 -

208. Despues de cada metodo de introducci6n del promotor deseado, o construcci6n o secuencia de nucle6tidos de acuerdo con la presente invenci6n en las plantas, puede ser necesaria la presencia y/o la inserci6n de otras secuen

cias de DNA. Si, por ejemplo, para la transformaci6n se usa el plasmido Ti o Ri de las celulas vegetales, pueden conectarse al menos al menos el limite derecho y frecuentemente sin embargo el limite derecho y el izquierdo del TDNA del plasmido Ti y Ri, como areas flanqueantes de los genes introducidos. El uso de TDNA para la transformaci6n de celulas vegetales ha sido intensamente estudiado y se describe en el documento EPA120516; Hoekema, en: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B. B., Alblasserdam, 1985, Capitulo V; Fraley, et al., Crit. Rev. P/ant Sei., 4: 1 -46; y An et al, EMBO J. (1985) 4: 277 -284.

Las celulas vegetales pueden cultivarse y mantenerse de acuerdo con metodos de cultivo de tejidos bien conocidos, tales como cultivar las celulas en un medio de cultivo adecuado provisto de los factores de crecimiento necesarios tales como aminoacidos, hormonas vegetales, vitaminas, etc.

CULTIVO Y PRODUCCION.

Celulas hospedadoras transformadas con el acido nucleico, la secuencia promotora o el gen quimerico de la presente invenci6n pueden ser cultivadas bajo condiciones que conduzcan al crecimiento del hospedador.

El medio usado para cultivar las celulas puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de la celula hospedadora en cuesti6n.

PRODUCCION DEL PRODUCTO GENICO.

La expresi6n de una secuencia de codificaci6n de DNA o secuencia de acidos nucleicos en la celula hospedadora vegetal producira un transcrito de RNA. Este transcrito puede ser una molecula de RNA que subsiguientemente no es traducida en un producto de proteina, sino que puede interaccionar con el proceso de expresi6n del gen a traves del mecanismo del RNAi, antisentido o cosupresi6n. Si la secuencia de codificaci6n se deriva de un gen estructural, el transcrito de RNA puede entonces ser traducido en un producto genico de proteina. Si se desea, el producto genico puede ser aislado por tecnicas estandar para el aislamiento de proteinas de los sistemas biol6gicos, tales como precipitaci6n salina, cromatografia en columna, tecnicas de inmunoafinidad, electroforesis, recristalizaci6n, centrifugaci6n, y tecnicas asi.

EXPRESION DE UN PRODUCTO GENICO NOCIVO PARA LAS CELULAS VEGETALES.

Si la secuencia de codificaci6n de DNA o la secuencia de acidos nucleicos es traducida en un producto genico de proteina que tiene un efecto nocivo sobre la celula hospedadora vegetal, este puede usarse en un sistema de muerte de celulas vegetales. Las proteinas adecuadas que tienen un efecto nocivo podrian incluir proteasas, endonucleasas de restricci6n, proteinas de transporte de la membrana, y ribonucleasas tales como la barnasa. Otros ejemplos incluyen proteinas desactivadoras del ribosoma (RIPs) tales como la proteina RIP b32 del maiz, la ricina, la abrina, la modecina, el inhibidor de la traducci6n de la cebada y la proteina antiviral de la hierba carmesi (PAP). La hierba carmesi (Phyto/aeea amerieana) produce tres proteinas antivirales distintas, que son PAP', PAPII y PAPS. La publicaci6n de patente internacional NO WO 02/33107 demuestra el uso de variantes truncadas de la proteina PAPS en un sistema de muerte celular. Por ello, el uso de una proteina desactivadora del ribosoma (PAP) o de variantes de la misma, proporcionaria un sistema de muerte celular a la planta.

La invenci6n se describira ahora, tan solo a titulo de ejemplo, con referencia a los Ejemplos que siguen.

EJEMPLO�1.

Aislamiento�de�la�region�promotora�ATC�085�(SEC�ID�N°�7)�V�produccion�de�construcciones�transformadas.

Se aisl6 DNA gen6mico del tejido de las hojas del tabaco usando el equipo DNAeasy Plant Miniprep Kit (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a partir de material de las hojas de tabaco K326. Una parte alicuota de un preparado diluido 1:10 de DNA gen6mico se us6 para una PCR primaria, usando 1 IL de un cebador para PCR S2PCLOFWD (SEC ID NO 2) a 10 pM/IL y 1 IL de un cebador para PCR S2PCLOREV (SEC ID NO 3) a 10 pM/IL en una reacci6n de 25 IL que contiene 0,5 IL de elongasa Taq DNA Polimerasa (Gibco BRL), 1 IL de tamp6n A para elongasa, 4 IL de tamp6n B para elongasa, 1 IL de dNTPs a 5 mM cada uno, 15,5 IL de agua bidestilada. Las condiciones de la reacci6n de PCR fueron: un ciclo inicial a 94°C durante 2 minutos seguido por 35 ciclos de 94° C durante 30 segundos, 60° C durante 30 segundos y 68°C durante 4 minutos, seguido por un ciclo final de 68°C durante 10 minutos. La reacci6n PCR fue sometida a electroforesis en un gel de TBE con agarosa al 1,2%, que contiene trazas de bromuro de etidio, a 4 V/cm durante 2 horas. Se vieron dos productos de la PCR. El producto mas grande, de aproximadamente 1600 pb, fue cortado del gel y el DNA se purific6 usando el kit de extracci6n en gel QiaQuick (Qiagen) siguiendo los procedimientos del fabricante.

El producto de la PCR purificado fue clonado en un vector TOPO (Invitrogen) y transformado en E. eo/i quimicamente competente TOP10 (Invitrogen) siguiendo los procedimientos estandar del fabricante. Una parte alicuota de la

reacci6n se cultiv6 en placa sobre agar LB esteril que contiene kanamicina, y las placas se cultivaron durante la noche a 37°C. Las colonias fueron cribadas mediante PCR usando las condiciones anteriores para identificar los clones que contenian el promotor. La secuencia se confirm6 mas mediante secuenciaci6n.

El promotor ATC 085 se cort6 del vector TOPO como un fragmento Hindlll BamHI y se clon6 en el vector de transformaci6n vegetal pBin 19 Plus basado en pGPTVKan (Becker et al, 1992) derivado de pBIN19 (Bevan et al, 1984) frente a tres genes informadores diferentes, para dar las construcciones GUS (ATC vector pBNP0850040001), GFP (ATC vector PBNPO850003001), y Luciferasa (ATC vector pBNPO850017001). El promotor fue tambien clonado frente a un gen efector, la forma activa de la proteina antiviral S de la hierba carmesi de Phyto/aeea amerieana (ATC vector pBNPO850501001). pBNP0850501001 ha sido depositado por Advanced Technologies (Cambridge) Ltd, 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 OWA bajo el Tratado de Budapest de reconocimiento internacional del dep6sito de microorganismos con la finalidad de procedimiento de patente (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of Patent Procedure) en la National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB, el 20 de septiembre de 2005 bajo el numero de registro NCIMB 41343.

EJEMPLO 2

Aislamiento de la region promotora ATC 023 V produccion de la construccion de transformacion (no de acuerdo con la invenci6n reivindicada).

El promotor ATC023 fue aislado por PCR de DNA gen6mico de Arabidopsis tha/iana (ecotipo Columbia) usando PfuTurbo DNA Polimerasa (Stratagene), y los cebadores AT4G29190L (SEC ID NO 5) y AT4g29190R (SEC ID NO 6) que contienen sitios de restricci6n para Hindlll y BamHI respectivamente, a una temperatura de reasociaci6n de 63°C. Los sitios de restricci6n fueron despues usados para clonar el fragmento aislado en el vector de transformaci6n de plantas vector pBIOl frente a un gen informador GUS para dar la construcci6n pBIOl 0230101 001. La construcci6n fue despues transformada en E. coli DH5a.

EJEMPLO 3.

Produccion�de�plantas�de�tasaco�transformadas.

Las construcciones producidas anteriormente fueron transferidas a la cepa de Agrobaeterium tumefaeiens LBA4404, y se obtuvieron plantas de tabaco transgenico var. K326 mediante transformaci6n in vitro de discos de hojas usando el metodo de cocultivo de Horsch et al. (1985). Callo transformado y brotes regenerados fueron seleccionados en medio MS Agar que contiene 100 Ig/mL de kanamicina, y se cultivaron en presencia de Claforan para eliminar las celulas de Agrobaeterium. Las plantas se conservaron y se multiplicaron in vitro en medio sin Claforan para conformar la ausencia de Agrobaeterium.

Las plantas fueron transferidas a la tierra del invernadero para su caracterizaci6n. Las plantas mostraron unas caracterisitcas de crecimiento indistinguibles de la planta de tabaco de tipo silvestre en el invernadero. El analisis de PCR se llev6 a cabo para identificar las plantas transgenicas.

Para la producci6n de generaciones subsiguientes las plantas pueden ser fertilizadas y las semillas se recogen de cabezas de semillas maduras y se almacenen a 6°C. Las relaciones de segregaci6n en la progenie a partir de plantas transgenicas fertilizadas pueden usarse para seleccionar tandas de semillas que contienen sitios de inserci6n unicos basandose en una relaci6n 3:1. El numero de insertos en el genoma del tabaco puede ser tambien determinado por hibridaci6n Southern. La inserci6n en el genoma del tabaco puede ser caracterizada mediante desplazamiento o paseo gen6mico (genome wa/king).

EJEMPLO 4.

Produccion�de�plantas�de�Arasidosis�trangsnicas.

Las construcciones descritas antes fueron transferidas a las cepas LBA4404 y GV3103 de Agrobaeterium tumefaeiens y usadas para transformar Arabidopsis tha/iana por el metodo de inmersi6n floral de Clough y Bent (1998). Despues de recoger las semillas de las plantas sumergidas, los transformantes T1 fueron cribados usando la selecci6n en 40 Ig/mL de kanamicina en ATS/Phytagel™ o 50 Ig/mL de kanamicina en medio MS/Agar. Los transformantes independientes fueron aislados de esta forma y estos fueron transferidos a la tierra y desarrollados bajo condiciones de dia largo.

Las plantas se dejaron autopolinizar para generar semilla T2. Aproximadamente 60 semillas T2 de las lineas independientes se cribaron de nuevo para determinar si la relaci6n de segregaci6n observada era consistente con un

sitio unico de inserci6n del transgen (3 resistente: 1 sensible). Se identificaron multiples lineas independientes con relaciones consistentes con un unico sitio de inserci6n, y las lineas restantes se desecharon.

EJEMPLO�5.

Caracterizacion�de�la�expresion�de�promotor�ATC�085�-�GSS�en�plantas�de�tasaco.

Sesenta plantas transformadas con el vector pBNP0850040001 fueron usadas para analisis de GUS. Despues de aproximadamente 6 a 8 semanas de crecimiento en el invernadero cuando la yema apical habia alcanzado la fase de "bot6n floral", las plantas fueron desmochadas usando un bisturi en el internado por encima de la 18a hoja (contando desde la base), heridas cortando la mitad de los limbos de las hojas 16, 17 y 18, o bien se dejaron sin tratar. Al cabo de 24 horas, se tomaron varias muestras de tejidos, incluyendo secciones del tallo en la base de las yemas laterales 14, 15, 16, 17 y 18, secciones del tallo internodales, brotes de floraci6n apicales cuando estaban presentes, limbos foliares y peciolos, y las raices primarias y secundarias. Todo el tejido recogido fue inmediatamente sumergido en tamp6n de fosfato potasico 0,1 M pH 7,0 que contiene 0,1% de �mercaptoetanol para prevenir el pardeamiento.

La soluci6n de tinci6n se prepar6 de la forma siguiente: se disolvieron 300 mg de polvo Xgluc en 3 mL de DMSO en un recipiente de vidrio y se llevaron a 1 L con tamp6n de fosfato potasico 0,1 M que contiene ferricianuro potasico 0,5 mM, ferrocianuro potasico 0,5 mM, EDTA 10 mM, 0,1% de TritonX y 0,067% de Sarcosyl. Esta soluci6n se guard6 a 4°C en la oscuridad.

Para la tinci6n de las muestras de tejido, el tamp6n de fosfato potasico / �mercaptoetanol fue reemplazado por soluci6n de tinci6n fresca asegurandose de que el tejido estaba totalmente sumergido, y las muestras se incubaron durante la noche a 37°C en la oscuridad. La soluci6n de tinci6n fue despues reemplazada con etanol al 70%, y los tejidos se guardaron en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se aclararon. A veces fue necesario cambiar el etanol al menos una vez para el material foliar. Una vez aclarado el tejido, el etanol se reemplaz6 con glicerol acidificado. Las muestras fueron observadas y fotografiadas bajo un microscopio.

La expresi6n de GUS fue detectada en las plantas despues de los tres tratamientos (desmochada, lacerada o no tratada) y esta fue localizada en la base de las yemas laterales y/o en el tallo pr6ximo al punto de iniciaci6n de la yema lateral en cada caso (Figura 3). Una gran proporci6n de las plantas mostraron expresi6n en cada posici6n de la yema muestreada. La expresi6n en las yemas laterales fue detectada al margen del pretratamiento (desmoche, laceraci6n o sin tratamiento). En la gran mayoria de las plantas, no se detect6 expresi6n en ningun otro tejido, solamente en una pocas plantas an6malas se observ6 algun otro sitio de expresi6n, predominantemente en los bordes de corte de las hojas laceradas. Por tanto se demostr6 que el promotor ATC085 es un promotor que dirige la expresi6n sustancialmente especifica en el punto de iniciaci6n de la yema lateral o alrededor de dicho punto.

EJEMPLO 6.

Caracterizacion de la expresion del promotor ATC 085 -GFP en plantas.

Plantas transformadas con el vector pBNP0850003001 fueron usadas para analisis de la expresi6n de GFP. Plantas enteras, o parte de plantas, secciones de plantas o tejidos vegetales fueron irradiadas con luz azul e inspeccionadas por fluorescencia verde bien sea a simple viste o mediante un microscopio.

EJEMPLO�7.

Caracterizacion de la expresion del promotor ATC 085 -luciferasa en plantas.

Plantas transformadas con el vector pBNP0850017001 fueron usadas para analisis de la expresi6n de la luciferasa. Plantas enteras, o partes de plantas o secciones de plantas o tejidos vegetales, fueron humedecidas o rociadas con luciferina 1 mM (Sigma) e incubadas en la oscuridad durante 15 minutos. La expresi6n de la luciferasa pudo entonces visualizarse, bien mediante autorradiografia sobre pelicula para rayos X, o bien mediante fotografia usando una camara digital con un tiempo de exposici6n largo, o usando un dispositivo de captura de fotones tal como un intensificador de imagen conectado a un sistema de camara.

EJEMPLO�8.

Caracterizacion de la expresion del promotor ATC 085 -PAP en plantas de tasaco.

Veintiuna plantas transgenicas y cinco plantas testigo no transformadas (no cocultivadas o NCC) se desarrollaron en el invernadero y, al cabo de 6 a 8 semanas, las plantas fueron desmochadas usando un bisturi en el internodo

por encima de la hoja 18a, para eliminar la inflorescencia apical y las hojas mas altas, como se describi6 antes. La excrecencia de los brotes laterales desde las axilas de las hojas 16a, 17a y 18a fue controlada diariamente durante 29 dias y puntuada en el siguiente sistema de clasificaci6n de tamafos:

0 = yema lateral colindando con el tallo principal 1 = yema lateral en el tallo lateral alargado (es decir 1 internodo) 2 = brote lateral con 2 internodos 3 = brote lateral con 3 internodos. etc.

A partir de estos datos se calcul6 la excrecencia media de las tras posiciones de yemas laterales cada dia, para las plantas transgenicas y no transformadas. Estos datos se representan graficamente en la Figura 4. Es evidente que la expresi6n localizada de la proteina antiviral de la hierba carmesi dirigida por el promotor ATC085 ha causado un importante retraso de la excrecencia de brotes laterales estimulada en el desmochado, y una reducci6n de la cantidad de excrecencia el dia 29 si se compara con las plantas testigo. El efecto era particularmente acusado en las dos yemas mas altas 17 y 18 (vease la Figura 4a). La yema lateral 16 mostr6 menos excrecencia (Figura 4b) en el desmoche que las yemas 17 y 18, pero esto se redujo mas por la expresi6n de la construcci6n ATC 085PAP.

La Figura 5 muestra la excrecencia reducida de los brotes laterales en plantas transgenicas ATC 085PAP comparadas con las plantas testigo.

EJEMPLO 9.

Caracterizacion de la expresion del promotor ATC 085 -GSS en plantas de Arabidopsis.

La construcci6n pBNP0850040001 fue usada para transformar plantas de Arabidopsis tha/iana. Cuarenta plantas T1 fueron usadas para analisis de GUS. Las plantas se desarrollaron en tierra bajo condiciones de dia largo durante 3 a 4 semanas hasta despues de la transici6n floral cuando el eje primario habia "desbocado" a una longitud entre 20 y 40 mm. Las plantas fueron despues decapitadas eliminando el tallo principal en un punto a aproximadamente 10 mm de la parte superior de la roseta. Despues se dej6 que continuaran creciendo durante 24 horas antes de sacarlas de la tierra, se lavaron intensamente en agua destilada, y se analizaron en cuanto a la actividad de GUS. La tinci6n de GUS se realiz6 como se describi6 antes para las plantas de tabaco, excepto que se usaron plantas enteras.

La expresi6n de GUS fue detectada en las plantas mediante la tinci6n muy intensa en la base de la planta en el sitio de la formaci6n de la yema lateral y en el tallo cerca. Sin embargo, la expresi6n se vio tambien en otros tejidos en algunas de las plantas, incluyendo los tejidos foliares y las venas, peciolos, tallo y raices primarias.

EJEMPLO�10 (no de acuerdo con la invenci6n reivindicada).

Caracterizacion�de�la�expresion�del�promotor ATC 023 -�GSS�en�plantas�de�tasaco.

Cuarenta y dos plantas de tabaco transformadas con la construcci6n pBI101 0230101001 fueron desarrolladas en el invernadero y tratadas como se describi6 antes para el analisis de GUS.

La expresi6n de GUS fue detectada en las yemas laterales del 85% de las plantas, al margen del tratamiento (desmochadas, laceradas o no tratadas), y la mayor parte de las plantas mostraron expresi6n en cada posici6n de yema muestreada. En muchos casos se vio tambien expresi6n localizada en el tallo cerca del punto de iniciaci6n de la yema lateral. Tambien se detect6 expresi6n en otros tejidos en algunas plantas, predominantemente en los tejidos florales, pero en ocasiones en raiz, tallo, hoja o peciolos.

La localizaci6n especifica de la expresi6n en las yemas laterales y cerca del tallo fue observada en el 17% de las plantas (Figura 6). Por ello el promotor ATC023 puede usarse solo para proporcionar expresi6n especifica del tejido. Tambien puede usarse en combinaci6n con otro promotor que expresa en la yema lateral, tal como ATC 085, para proporcionar perfiles de expresi6n complementaria con un sitio de acci6n solapado en el tejido de la yema lateral.

EJEMPLO�11 (no de acuerdo con la invenci6n reivindicada).

Caracterizacion�de�la�expresion�del promotor ATC 023 -GSS en plantas de Arabidopsis.

Cinco lineas T2 transgenicas independientes que llevan insertos simples de la casette 0230101001 fueron desarrolladas en tierra, decapitadas y tefidas para analisis de GUS como se describi6 antes.

La expresi6n de GUS fue observada en las yemas axilares y tallo adyacente, y en tejidos florales (Figura 7). La expresi6n asociada con las yemas mas pequefas fue la mas intensa, y disminuy6 constantemente a medida que se desarrollaban las yemas. Esto indica que el promotor ATC 023 esta asociado con la iniciaci6n de la yema lateral. Tambien se detect6 algo de expresi6n en otros tejidos en algunas plantas, incluyendo los tejidos florales.

5 Todas la publicaciones mencionadas en la anterior memoria se incorporan en el presente texto como referencia. Varias modificaciones y variaciones de los metodos y del sistema de la presente invenci6n descritos seran evidentes para los expertos en la tecnica, sin apartarse del alcance de la presente invenci6n. Aunque la presente invenci6n ha sido descrita en conexi6n con realizaciones especificas preferidas, ha de entenderse que la invenci6n que se reivindica no debe verse limitada de forma indebida a tales realizaciones especificas. En realidad, se entiende que varias

10 modificaciones de los modos de llevar a cabo la presente invenci6n que se han descrito, que son evidentes para los expertos en bioquimica y en biotecnologia o en campos relacionados con ellas, estan dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen.

Referencias

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LISTADO DE SECSENCIAS

5 <110> Advanced Technologies (Cambridge) Limited

<120> Modificaci6n del desarrollo y morfologia de una planta

<130> p022825WO

<150> GB0421598.4

<151> 20040929

<160> 7

<170> PatentIn versi6n 3.3

<210> 1

<211> 1566 20 <212> DNA

<213> Promotor de Nicotiana tabacum

<400>

1

<400>

7

5

<210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial

10

<220> <223> Oligonucle6tido de PCR S2CLOFWD <400> 2 gctartcaagc tttattaaag tgtccaagct caagcc 36

15

<210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial

20

<220> <223> Oligonucle6tido de PCR S2CLOREV

<400> 3 cgagtaggat cctttgatga gctatttgga gtttcaatt

39

25

<210> 4 <211> 1904 <212> DNA <213> Promotor ATC 023 de Nicotiana tabacum

30

<400> 4

5

<210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial

10

<220> <223> Oligonucle6tido de PCR AT4G29190L <400> 5 ggcaagcttc gaagacattg tgtcgtaatc g 31

15

<210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial

20

<220> <223> Oligonucle6tido de PCR AT4G29190R

<400> 6 gcggatccgg tgaacaataa atcacattag tc

32

25

<210> 7 <211> 1541 <212> DNA <213> Promotor ATC 085 de Nicotiana tabacum

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1a. Un metodo para modificar la morfologia en una planta, que comprende introducir en una planta al menos un gen quimerico que comprende una secuencia promotora asociada operativamente con una secuencia de acido nucleico, siendo la secuencia promotora operativa para dirigir la expresi6n en celulas especificas de la planta, y la secuencia de acidos nucleicos que codifica al menos un producto genico capaz de alterar el metabolismo de las celulas especificas y/o pr6ximas, o de causar la muerte de las mismas, en donde la secuencia promotora es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, y en donde la secuencia promotora comprende la secuencia que se muestra en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con la secuencia mostrada en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la totalidad de la longitud de las secuencias a comparar, y en donde expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

   2a. Un metodo segun la reivindicaci6n 1a, en el que el producto genico de la secuencia de acidos nucleicos es una molecula citot6xica.

   3a. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el producto genico de la secuencia de acidos nucleicos es una proteina desactivadora del ribosoma (RIP) o una variante o una parte funcional de la misma.

   4a. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1a o 2a, en el que el producto genico de la secuencia de acidos nucleicos es una proteina antiviral de la hierba carmesi o una variante o una parte funcional de la misma.

   5a. Un metodo segun la reivindicaci6n 4a, en el que la proteina antiviral de la hierba carmesi (PAP) es proteina antiviral de la hierba carmesi S (PAPS) o una variante o parte funcional de la misma.

   6a. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se modifica la excrecencia de una yema lateral y/o un brote lateral.

   7a. Un metodo segun la reivindicaci6n 6a, en el que la excrecencia de una yema lateral y/o un brote lateral se reduce, se evita o se retrasa.

   8a. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2a a 7a, en el que la excrecencia de una yema lateral y/o un brote lateral se modifica interfiriendo el metabolismo o causando la muerte de celulas implicadas en el desarrollo de la yema lateral.

   9a. Un acido nucleico que comprende una secuencia promotora, siendo dicha secuencia promotora la secuencia que se muestra como SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7,o una parte de las mismas que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, y que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la longitud completa de las secuencias a comparar.

   10a. Un acido nucleico segun la reivindicaci6n 9a, en el que dicha secuencia tiene al menos un 70%, preferentemente al menos un 85%, mas preferentemente al menos un 90%, mas preferentemente al menos un 97% de identidad con SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7.

   11a. Un acido nucleico segun la reivindicaci6n 9a o la reivindicaci6n 10a, en el que el acido nucleico comprende ademas una secuencia de acido nucleico que codifica una molecula citot6xica.

   12a. Un acido nucleico segun la reivindicaci6n 11a, en el que la secuencia de acido nucleico codifica una proteina desactivadora del ribosoma (RIP) o una variante citot6xica o parte funcional citot6xica de la misma.

   13a. Un acido nucleico segun la reivindicaci6n 11a, en el que la secuencia de acido nucleico codifica una proteina antiviral de la hierba carmesi o una variante citot6xica o parte funcional citot6xica de la misma.

   14a. Un acido nucleico segun la reivindicaci6n 13a, en el que la proteina antiviral de la hierba carmesi (PAP) es proteina S antiviral de la hierba carmesi o una variante citot6xica o parte funcional de la misma.

   15a. Un gen quimerico que comprende una secuencia promotora asociada operativamente con una secuencia de acido nucleico, comprendiendo la secuencia promotora la secuencia que se muestra en SEC ID NO 1, SEC ID NO 7,o parte de las mismas que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, y que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la longitud completa de las secuencias a comparar.

   16a. Un gen quimerico segun la reivindicaci6n 15a, en el que la secuencia tiene al menos un 70%, preferentemente al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 97% de identidad con SEC ID NO 1

   o SEC ID NO 7.

   17a. Un gen quimerico segun la reivindicaci6n 15a o la reivindicaci6n 16a, en el que el acido nucleico comprende ademas una secuencia de acidos nucleicos que codifica una molecula citot6xica.

   18a. Un gen quimerico segun la reivindicaci6n 17a, en el que la secuencia de acidos nucleicos codifica una proteina desactivadora del ribosoma (RIP) o una variante citot6xica o parte funcional citot6xica de la misma.

   19a. Un gen quimerico segun la reivindicaci6n 17a, en el que la secuencia de acidos nucleicos codifica una proteina antiviral de la hierba carmesi o una variante citot6xica o parte funcional citot6xica de la misma.

   20a. Un gen quimerico segun la reivindicaci6n 19a, en el que la proteina antiviral de la hierba carmesi (PAP) es proteina antiviral de la hierba carmesi S (PAPS) o una variante citot6xica o parte funcional citot6xica de la misma.

   21a. Un DNA recombinante que comprende DNA vector y un acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 9a a 14a, o un gen quimerico segun una cualquiera de las reivindicaciones 15a a 20a.

   22a. Una planta producida segun el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 8a.

   23a. Una planta que comprende el acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 11a a 14a, o un gen quimerico segun una cualquiera de las reivindicaciones 17a a 20a.

   24a. Una planta segun las reivindicaciones 22a o 23a, en donde la planta es de la familia de las solanaceas.

   25a. Una planta segun la reivindicaci6n 24a, en donde la planta es de la subfamilia de las cestroideas.

   26a. Una planta segun la reivindicaci6n 25a, en donde dicha planta es del genero Nicotiana.

   27a. Una planta segun la reivindicaci6n 25a, en donde dicha planta es Nicotiana tabacum.

   28a. Una planta segun la reivindicaci6n 22a o la reivindicaci6n 23a, en donde dicha planta se elige entre el grupo consistente en tomate, pepino, Petunia, Dianthus, Picea, Eucaliptus, Pinus, Euacalyptus, Populus, patata, tabaco, algod6n, lechuga, berenjena, mel6n, calabaza, guisante, canola, soja, remolacha azucarera, girasol, trigo, cebada, centeno, arroz y maiz.

   29a. Una celula vegetal que comprende el acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 11a a 14a, o un gen quimerico segun una cualquiera de las reivindicaciones 17a a 20a, o un DNA recombinante segun la reivindicaci6n 21a.

   30a. Un metodo para regular la expresi6n de un gen en una planta, comprendiendo el metodo introducir en una planta un acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 9a a 14a asociado operativamente con una secuencia de codificaci6n de un gen cuya expresi6n se ha de regular.

   31a. Un metodo para modificar el metabolismo dentro de una celula de una planta transgenica, comprendiendo el metodo introducir en una planta un acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 9a a 14a o un gen quimerico segun una cualquiera de las reivindicaciones 15a a 20a.

   32a. El uso de un acido nucleico que comprende una secuencia promotora que tiene una secuencia como se muestra en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con la secuencia mostrada en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para modificar la morfologia de una planta, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la totalidad de la longitud de las secuencias a comparar, y en donde expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

   33a. El uso de un gen quimerico segun una cualquiera de las reivindicaciones 15a a 20a, o de un acido nucleico se5 gun una cualquiera de las reivindicaciones 9a a 14a, para transformar una planta para modificar la morfologia de la planta.

   34a. El uso de un acido nucleico que comprende una secuencia promotora que tiene una secuencia como se muestra en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de 10 identidad con la secuencia mostrada en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para alterar el metabolismo en una planta, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la totalidad de la longitud de las secuencias a comparar, y en donde expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de

   15 forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

   35a. Un gen quimerico que se puede obtener a partir del clon pBNP 0850501001 (NCIMB 41343).

   Figura 3

   Figura 5

   Figura 6

   Figura 7