JP3955942B2 - リボソーム不活性化タンパク質（ｒｉｐ）遺伝子およびそれを導入したイネ科植物 - Google Patents
リボソーム不活性化タンパク質（ｒｉｐ）遺伝子およびそれを導入したイネ科植物 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物に病害抵抗性を付与するＤＮＡ、このＤＮＡを含む発現カセット、該発現カセットを含むベクター、このベクターを保持する植物細胞、この植物細胞を再生して得られた植物体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イネは日本を含むアジアの主作物であり、そのためアジア諸国では古くからイネの収量増加のための研究を行ってきた。イネの収量を減少させる原因の一つとしては病害が挙げられ、その中でもいもち病（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）と白葉枯病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）は深刻な被害をもたらす病害として恐れられてきた。いもち病は日本で最も恐れられている病害であり、主に日本の中部から北部にかけて長雨、冷害に伴って発生する。 いもち病菌は糸状菌の一種である。いもち病に冒されたイネは黒色の斑点型病斑を生じ、イネの成長が停止する。
【０００３】
白葉枯病は細菌病の一種であり、九州から東南アジアにかけて深刻な被害をもたらす病害である。白葉枯病に冒されたイネは白褐色の病斑が葉縁に沿って拡大し、葉全体が枯死する（Ｏｈａｔａ，１９８９，Ｚｅｎｋｏｋｕ Ｎｏｓｏｎ Ｋｙｏｉｋｕ Ｋｙｏｋａｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ．ｐｐ．５６３）。
【０００４】
植物は、病原菌の侵入シグナルを認識すると、植物体を防御するために感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）を誘導発現し、防御応答を行う（Ｂｏｗｌｅｓ，１９９０，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，８７３）。病原菌の感染によって誘導された抗菌性タンパク質は、病原菌に直接作用することによって植物の防御機構に関わっている（ＶａｎＬｏｏｎ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ．１２，２４５；ＶａｎＬｏｏｎ，１９９９，Ｐｈｙｓｉｏ１．Ｍｏｌ．ＰｌａｎｔＰａｔｈ．５５，８５）。また、グルカナーゼやキチナーゼ遺伝子を遺伝子組換えする事によって、植物に病害抵抗性をもたらしたことが報告されている（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，１９９９，Ｋａｇａｋｕ ｔｏ Ｓｈｅｉｂｕｔｓｕ ３７，２９５）。
【０００５】
リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）は、真核生物のｒＲＮＡに対してＮ−グリコシダーゼ活性を持ち、アデニン残基を特異的に切断する塩基性タンパク質である。ＲＩＰは作物を含む植物のほとんど全ての組織で発現しており、植物の病原菌に対して抗菌活性がある（Ｂａｒｂｉｅｒｉ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１５４，２３７；Ｙｕｎ，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １４，３９）。これまでに、オオムギ、コムギ、トウモロコシなどに由来するリボソーム不活性化タンパク質が単離されている（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３）：１５６４−７３（１９９１）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１）：１７１−６（１９９３）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３４）：２３４２２−７（１９９１）；Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）６２（６）：１１５２−１１５６；およびＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７（２），６６１−６６２を参照のこと）。リボソーム不活性化タンパク質の総説については、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４０５−４１２（１９９２）およびＣｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）４２（４）：４６１−４７１を参照のこと。オオムギから精製されたＲＩＰはｒＲＮＡに対して特異性を持ち、カビのｒＲＮＡに対して哺乳動物のｒＲＮＡよりも１０倍以上のＮ−グリコシダーゼ活性を持つことが明らかになっている（Ｅｎｄｏ，１９８８，Ｂｉｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９５４，２２４）。また、オオムギＲＩＰは植物のｒＲＮＡに対してＮ−グリコシダーゼ活性を持たないので、ＲＩＰは植物の病害抵抗性機構に関与していると推測されている（Ｔａｙｌｏｒ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，８２７）。
【０００６】
このＲＩＰの抗菌性を利用し、これまでＲＩＰ遺伝子の導入によって植物に病害抵抗性を付与させる試みが行われてきた。例えば、オオムギＲＩＰに創傷誘導性（ｗｏｕｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモーターを用いてタバコに形質転換させた場合では、形質転換個体はタバコ腰折れ病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）に対する病害抵抗性が向上したことが報告されている（Ｌｏｇｅｍａｎｎ，１９９２，ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，３０５）。さらに、オオムギのキチナーゼ遺伝子とＲＩＰ遺伝子をともに恒常的に発現する形質転換タバコは、それぞれの遺伝子の単独導入の場合よりも、腰折れ病に対して強い抵抗性を示すことが報告された。これは、溶菌酵素の作用によって、ＲＩＰの菌体内への浸透性が高められたためと考えられている（Ｊａｃｈ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｊ．８，９７）。ヤマゴボウＲＩＰが導入されたタバコは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に対する抵抗性が付与された（Ｍｏｏｎ，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ ７，８０７）。しかしながら、このように、ＲＩＰ遺伝子を単独で導入した研究はタバコ、ジャガイモでしか行われていない。特に、主要作物の中に含まれるイネ科植物において、病害に対する抵抗性を付与する遺伝子が望まれているが、イネ科植物でＲＩＰ遺伝子の発現を強化した場合の病害抵抗性に及ぼす効果は未知である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題を解決するためのものであり、その目的とするところは、種々の病原性生物に対する抵抗性を与える遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターを保持する植物細胞、この植物細胞を再生して得られた植物体を提供し、さらに病原性生物に対して抵抗性の植物を作出する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意努力した結果、イネから２種類、ライ麦、エンバクからそれぞれ１種類のＲＩＰ ｃＤＮＡをクローニングした。また、これらのＲＩＰ ｃＤＮＡをアグロバクテリウム形質転換法を用いてイネに形質転換を行い、植物体内で発現させることに成功した。本発明者らは、さらに、この遺伝子の解析を進めた結果、この遺伝子の発現と植物の病害抵抗性との間に顕著な相関関係が認められることを見いだし、これにより発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明は、以下のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）をコードするポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１の１４６〜９５５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； または
（ｂ）該（ａ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチド。
【００１０】
１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１の１４６〜９５５位に記載のヌクレオチド配列、配列番号３の５４〜８９９位に記載のヌクレオチド配列、配列番号５の３５〜８７７位に記載のヌクレオチド配列、および配列番号７の３７〜８４３位に記載のヌクレオチド配列を含み得る。
【００１１】
別の実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１の１４６〜９５５位に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも７２．５％の相同性を有し、かつリボソーム不活性化タンパク質活性を有するタンパク質をコードし得る。
【００１２】
本発明はさらに、以下のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）をコードするポリヌクレオチドを提供する：
（ｃ）配列番号２の１〜２７０位に記載されるアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）（ｃ）に示すアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
【００１３】
１つの実施形態において、上記タンパク質は、配列番号２の１〜２７０位に記載のアミノ酸配列、配列番号４の１〜２８２位に記載のアミノ酸配列、配列番号６の１〜２８１位に記載のアミノ酸配列、配列番号８の１〜２６９位に記載のアミノ酸配列およびそれらのフラグメントを含み得る。
【００１４】
別の実施形態において、上記タンパク質は、配列番号２の１〜２７０位に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも６２％の相同性を有し、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質を含み得る。
【００１５】
本発明はまた、上記ポリヌクレオチドを含む発現カセット、この発現カセットを含む発現ベクター、およびこのベクターが導入された植物細胞を含み得る。
【００１６】
本発明は、上記植物細胞を再生して得られた植物もまた含み得る。
【００１７】
本発明は、植物病原性生物に対して抵抗性を有する植物を作出するための方法を提供し、この方法は、上記発現ベクターを植物細胞に導入する工程を包含する。
【００１８】
１つの実施形態において、上記方法は、上記植物細胞を、リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現し、そして植物病原性生物に対して抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに包含し得る。
【００１９】
別の実施形態において、上記植物病原性生物は、病原性細菌、真菌類、および病原性ウイルスを含み得る。
【００２０】
さらに別の実施形態において、上記病原性細菌は、白葉枯病細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）を含み得る。
【００２１】
さらに別の実施形態において、上記真菌類は、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）を含み得る。
【００２２】
なお別の実施形態において、上記抵抗性を有する植物は、少なくとも２つの植物病原性生物に対する複合病害抵抗性を示し得る。
【００２３】
他の実施形態において、上記少なくとも２つの病原性生物は、真菌類と病原性細菌との組み合わせを含み得る。
【００２４】
他の実施形態において、上記少なくとも２つの病原性生物は、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）と白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）との組み合わせを含み得る。
【００２５】
さらなる実施形態において、上記植物は、単子葉植物または双子葉植物である。
【００２６】
１つの実施形態において、上記植物は単子葉植物であり得る。別の実施形態において、上記単子葉植物はイネ科植物であり得る。また、このイネ科植物はイネであり得る。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物に病害抵抗性を付与するタンパク質の発見に関する。「病害抵抗性」とは、以下に説明するような病原性生物によって引き起こされる病気を防ぐ、または最小限にとどめる性質をいう。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、エリシター処理またはサリチル酸によって植物においてその発現が誘導され、植物に病害抵抗性を付与し得る。エリシターとは、植物の病害抵抗反応に関与するフィトアレキシン産生を誘導する物質である。サリチル酸は、植物の病害抵抗性を引き起こすシグナル物質の１つである。本発明のポリヌクレオチドは、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）をコードし得る。
【００２９】
リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）は、原核生物／真核生物のｒＲＮＡに対してＮ−グリコシダーゼ活性を持ち、アデニン残基を特異的に切断する塩基性タンパク質である。このタンパク質は、原核生物／真核生物のタンパク質合成を触媒的に著しく不活化し得る。また、このタンパク質は、植物細胞のｒＲＮＡに対してはＮ−グリコシダーゼ活性がほとんどない。
【００３０】
本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドはさらに、本発明のリボソーム不活性化タンパク質（例えば、図１に示したアミノ酸配列を有するリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１））のアミノ酸配列（配列番号２）またはポリヌクレオチド配列（配列番号１）に対して実質的な同一性を有する改変体をコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書中で使用される場合、本発明のリボソーム不活性化タンパク質のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を有する改変体とは、このタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失（すなわち、短縮化）または付加；このタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の欠失または付加；あるいはこのタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の置換によりネイティブタンパク質から誘導されたタンパク質を意図する。
【００３１】
リボソーム不活性化タンパク質の改変体において、目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適当なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９８７）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、これは、参考として本明細書中に援用される）のモデルに見出され得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のものと交換する置換）が好ましいとされ得る。このような置換としては、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）；親水性アミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）同士の置換が挙げられる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換」とは、本発明で使用され得るポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が有する機能を発現し得る限りにおいて、任意の数（１または数個）のアミノ酸が上記アミノ酸配列において欠失、付加、および／もしくは置換していることを意味する。アミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加のような改変が活性に与える影響は、改変されるアミノ酸の位置、程度、種類などに依存し得ることは当業者には明らかである。本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が有する機能を発現し得る限りにおいて、好ましくは以下のアミノ酸配列同一性を満たす個数で欠失、置換および／もしくは付加された改変体をコードする。
【００３３】
さらに、本発明で使用される「リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド」とは、縮重異性体をすべて含むものである。ここで、「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて、同一のポリペプチドをコードすることのできる遺伝子を意味する。例えば、図１の塩基配列を有するＤＮＡに対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係にあるコドン例えばＡＡＴに変わったものを縮重異性体と呼ぶこととする。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのプラスミドに組み込まれたリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いても良い。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドは、病害抵抗性を付与し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２７０位のＡｓｎまでのアミノ酸配列と、少なくとも６２％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドは、病害抵抗性を付与し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２７０位のＡｓｎまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１の１４６〜９５５位までに示されるヌクレオチド配列）と、少なくとも７２．５％、好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドの１つの好ましい実施形態としては、配列番号４の１〜２８２位に記載のアミノ酸配列、配列番号６の１〜２８１位に記載のアミノ酸配列、配列番号８の１〜２６９位に記載のアミノ酸配列またはそれらのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「参照配列」とは、配列比較の基準として使用される規定の配列である。参照配列は、記載された配列のサブセットまたは全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子配列としてである。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続しかつ特定化されたセグメントについて言及し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことにより、参照配列に対して高い類似性となることを避けるために、典型的には、ギャップペナルティーを導入し、そしてこれを、一致の数から差し引くことを理解する。
【００３９】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野において周知である。参照配列（本発明の配列）と対象配列との間の最適な全体の整合を決定するための好ましい方法として、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析が用いられる。配列整列において、参照配列および対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。上記の全体的配列整列の結果が、同一性％である。同一性％を算定するためにＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴ整列において、一般的には、デフォルトパラメーターが使用され得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定化された比較ウインドウにわたって最大に一致するように整列された場合に同一である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパク質に関して配列同一性％が使用される場合、しばしば、保存的アミノ酸置換によって同一ではない残基位置は異なることが理解される。上述したように、保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について矯正するように上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整をするための手段は、当業者には周知である。代表的には、これは、完全なミスマッチではなく、部分的なものとして保存性置換を点数付けすることを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行されるように計算される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性％」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２つの配列を比較することによって決定された値を意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在して一致した位置の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００４２】
用語、ポリヌクレオチドの「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーター（例えば、デフォルトパラメーター）を使用して、記載されるかさもなくば公知のアラインメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮に入れることによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされる対応するタンパク質の同一性を決定するために、これらの値が適切に調整され得ることを理解する。これらのために、対応するアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００４３】
ペプチドの文脈における用語「実質的同一性」は、ペプチドが、特定化された比較ウィンドウにわたって、参照配列に対して、より好ましくは少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。好ましくは、最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して行われる。例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、ペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が保存的アミノ酸変化によって異なり得るということ以外は、上記に示したような配列同一性を共有する。
【００４４】
本発明においては、ＧＥＮＥＴＹＸソフトウェア（ソフトウェア開発株式会社、東京）を使用することにより、アミノ酸配列／ヌクレオチド配列の同一性または類似性を決定した。しかし、同一性または類似性の％は、使用されるソフトウェアに依存して異なり得ることは当業者により理解される。また、例えば、ＡおよびＢの２つのアミノ酸配列／ヌクレオチド配列を比較する場合、アミノ酸配列／ヌクレオチド配列Ａの長さが、アミノ酸配列／ヌクレオチド配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列／ヌクレオチド配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列／ヌクレオチド同一性とは等しくない場合もあることは明らかである。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、病害抵抗性を与えるリボソーム不活性化タンパク質の生物学的に活性な部分をコードするフラグメントは、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５の連続するアミノ酸、または本発明で使用されるリボソーム不活性化タンパク質の全長タンパク質に存在するアミノ酸の総数まで（例えば、配列番号２の２７０アミノ酸）をコードする。ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＰＣＲプライマーについて）として用いるための、病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質のフラグメントは、一般に、病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードする遺伝子により発現されるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする必要はない。
【００４６】
イネ以外の他の植物に由来する、病害抵抗性を与えるリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドホモログもまた、本願発明において使用され得る。そのようなポリヌクレオチドホモログは、例えば、公知のリボソーム不活性化タンパク質（例えば、図１に記載されたイネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１））の全長または一部のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いて、選択した植物のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡフラグメントをプローブとして用いて同じ植物のゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどのような方法が、公知のリボソーム不活性化タンパク質（例えば、図１に記載されたイネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１））の配列に対するそれらの配列同一性に基づいてこのような配列を同定するために使用され得る。とりわけ、図１に記載の配列全体に対する、またはそれらのフラグメントに対する、それらの配列同一性に基づいて単離された配列は、本発明によって特に好ましく使用される。
【００４７】
ハイブリダイゼーション技術において、公知のリボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは部分が、選択された生物由来のクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。このハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであり得、そして検出可能な基（例えば、32Ｐ）または任意の他の検出可能なマーカーで標識され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本発明の病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質のヌクレオチド配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドを標識することによって作製され得る。ハイブリダイゼーションのためのプローブの調製およびｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築の方法は、一般に、当該分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（これは、本明細書中に参考として援用される））において開示される。
【００４８】
例えば、本明細書中に示された病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列全体、またはそれらの１つ以上の部分が、対応する病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質の遺伝子配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードする遺伝子配列間で独特であり、そして好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を包含する。このようなプローブは、選択された生物から対応する病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードする遺伝子配列をＰＣＲによって増幅するために使用され得る。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １： １７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考として援用する）。この技術は、所望の生物からさらなるコード配列を単離するために使用され得る。ハイブリダイゼーション技術は、プレート化したＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを包含する（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。
【００４９】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施され得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。あるいは、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性が検出され得るように、配列中にいくらかミスマッチとなることが可能になるように調整され得る。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満であり、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００５０】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、代表的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。例示的な高ストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして６０〜６５℃における０．１× ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェントな条件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして５５〜６０℃における０．５×〜１× ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な低ストリンジェントな条件としては、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして５０〜５５℃における１×〜２× ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。
【００５１】
特異性は、代表的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔmは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔmは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。Ｔmは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；従って、Ｔm、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔmは、１０低下し得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補物に対する熱融点（Ｔm）よりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度のストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望されるＴmを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴmを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと（これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００５２】
本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、代表的には、本発明のリボソーム不活性化タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に記載されるイネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１）のアミノ酸配列）の情報またはそれをコードするヌクレオチド配列情報に従って得られるが、それらの既知の配列情報を基に、化学合成によっても得られ得る。例えば、本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（現Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）のポリヌクレオチド合成機を用いて製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。
【００５３】
さらに他の実施形態では、本発明で使用されるリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する１つの方法としては、核酸合成の手法に従ってそのポリヌクレオチドの少なくとも一部を化学合成し、これをプローブとして使用して、適当なｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、ＢＡＣクローンライブラリー、ＰＡＣクローンライブラリー、ＹＡＣクローンライブラリーなどから、慣用されている方法（例えば、免疫学的方法あるいはハイブリダイゼーション法など）により取得する方法を挙げることができる。上記の方法に用いるいくつかのプラスミド類、様々な制限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類としては市販のものを使用し得る。また、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体の培養および培養物からのＤＮＡ，ＲＮＡ等の回収は文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ））に準じて行い得る。
【００５４】
さらに別の実施形態では、以下の様にして、リボソーム不活性化タンパク質をコードするＤＮＡを取得することができる。まず、本発明のリボソーム不活性化タンパク質（例えば、図１に記載されるイネのリボソーム不活性化タンパク質）中の２種類のアミノ酸部分配列を選択し、これらのアミノ酸配列のＣ末端をコードすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーと上記アミノ酸配列のＮ末端側をコードすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーとを作製し、これらをミックスプライマーとして用い、適当なライブラリーおよびＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応（Ｓａｉｋｉ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７）（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ反応（Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄ，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７，４５３））を行う。その後、ＰＣＲ反応生成物の中から、増幅が予想される特定の長さの増幅フラグメントを取り出し、これらの塩基配列を決定する。得られた増幅フラグメントをプローブとしてハイブリダイズさせることにより、上記のライブラリーからリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを獲得する。
【００５５】
得られたポリヌクレオチドの塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法マキサム−ギルバート法（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５，４９９）やジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ１９８２，Ｇｅｎｅ １９，２６９））、または市販されている自動シーケンサーにより決定し得る。
【００５６】
また、得られたポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入すること、そして適切な宿主においてポリペプチドを発現させることによって、コードされるタンパク質を容易に組換え的に発現させ得る。当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを用いて、組換えタンパク質を発現させ得る。組換えタンパク質の発現は、取得されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞（例えば、大腸菌）、下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）および高等真核生物細胞などが挙げられる。用いられる宿主細胞としては、植物細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、哺乳動物の細胞株（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）、昆虫細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。この様式で発現されるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、天然に存在するポリペプチドの一部分、またはそれらの他の改変体をコードし得る。組換えポリペプチドを分泌する適切な宿主／ベクター系由来の上清は、まず、市販のフィルターを用いて濃縮され得る。次いで、この濃縮物は、タンパク質の性質に応じて、塩析や有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、免疫吸着体によるカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動などを適宜組み合わせて行うことが可能である。また、本発明の組換えタンパク質をヒスチジンタグやグルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの標識との融合タンパク質として発現させた場合には、該標識に対するアフィニティークロマトグラフィーなどにより精製することも可能である。最後に、１回以上の逆相ＨＰＬＣの工程が用いられ、組換えポリペプチドは、さらに精製され得る。
【００５７】
上記のように取得されたポリヌクレオチドが、Ｎ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするか否かを、当業者は容易に確認し得る。Ｎ−グリコシダーゼ活性は、例えば、Ｔａｙｌｏｒ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，８２７またはＥｎｄｏ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９５４：２２４−２２６（１９８８）に記載の方法を用いて容易に測定され得る。詳細には、取得されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、上記のように組換え生成することにより獲得し、この組換え生成タンパク質を病原性生物のｒＲＮＡと反応させ、電気泳動によってｒＲＮＡの分解を確認し得る。
【００５８】
また、上記のように取得されたポリヌクレオチドが、抗菌活性を有するタンパク質をコードするか否かを、当業者は容易に確認し得る。例えば、タンパク質の抗菌活性を測定する方法としては、阻止円法（佐藤昭二ら、植物病理学実験法、第２１９−２２３頁、講談社を参照のこと）が挙げられる。詳細には、取得されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、上記のように組換え生成することにより獲得し、病原菌胞子などを混合した寒天培地上に、この組換え生成タンパク質を染み込ませた濾紙ディスクを載せて、所定時間培養する。組換え生成タンパク質が、使用された病原菌に対して抗菌性を有している場合、この濾紙の周りに生育阻止円が形成される。さらに、タンパク質濃度に応じて阻止円の大きさを測定することによって、抗菌性の強さを測定し得る。
【００５９】
本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドの代表的形態は、プラスミドまたはファージＤＮＡなどの中に構成員の一部としてこのポリヌクレオチドが挿入された形態、並びに、ゲノムＤＮＡの中にこのポリヌクレオチドが挿入された形で微生物またはファージ粒子あるいは植物の中に存在する形態である。本明細書中で使用される微生物の一例として、大腸菌やアグロバクテリウムを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、３’−末端側に接して少なくとも１個の停止コドン（例えばＴＡＧ）を有することが望ましい。
【００６１】
さらに本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、所望により５’−側上流に翻訳フレームと合わせて翻訳開始のメチオニンをコードするＡＴＧ配列、その５’−側上流および３’−側下流に非翻訳領域として適当な長さの他のポリヌクレオチドが結合しても良い。
【００６２】
組換えタンパク質を発現させるためのベクターとしては、例えば、植物、酵母細胞に関しては、プラスミドｐＢＩ１２１，ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、大腸菌等の細菌細胞に関しては、プラスミドｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９）、哺乳動物細胞に関しては、プラスミドｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、昆虫細胞に関しては、プラスミドｐＢａｃＰＡＫ８．９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明における使用に有用な発現ベクターとしては、例えば、プラスミドｐＢＩ１２１，ｐＢＩ２２１，ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９）などが挙げられる。リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物中で安定に発現し得るように、このポリヌクレオチドに、種々のプロモーター、エンハンサー、翻訳開始コドンをコードするＤＮＡ（ＡＴＧ）またはターミネーターを、適宜組み合わせて付加することが好ましい。
【００６４】
上記のプロモーターとしては、本発明のタンパク質を恒常的あるいは誘導的に発現させるためのプロモーターが挙げられる。
【００６５】
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＲｅｐ．４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８２，Ｃｅｌｌ ３０，７６３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅｌｌ，１９８５，ｎａｔｕｒｅ ３１３，８１０）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３，１１５５）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ １９９３，Ｐｌａｎｔ ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを用い得る。特に好ましい実施形態では、ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーターを使用し得る。
【００６６】
誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、病原性生物の感染や侵入、光、傷害、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現を誘導することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターの例としては、例えば、光照射によって発現を誘導するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，２３５８）、糸状菌・細菌・ウイルスなどの病原性生物の感染や侵入によって発現を誘導するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｘｕ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０，３８７）およびタバコのＰＲタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター（Ｏｈｓｈｉｍａ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２，９５）、低温によって発現を誘導するイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって発現を誘導するイネのｈｓｐ７２，ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（Ｖａｎ Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔａ１９３，５７）、乾燥によって発現を誘導するシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６）、紫外線の照射によって発現を誘導するトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６５１）などが挙げられる。また、上記のイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターおよびタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターは、サリチル酸またはジャスモン酸などの特定の化合物によって、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導されることが公知である。
【００６７】
本発明で使用され得るターミネーターとしては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１）、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｇｉｅｌｅｎ，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３，８３５）などを用い得る。
【００６８】
用語「植物」とは、他に特に示さない限り、完全な植物体のみではなく、その植物体を構成する植物細胞、組織、および器官をも含み得る。本明細書中に出てくる植物の構成要素を示す用語（例えば、根、茎、葉、塊茎、花粉、種子胚、種子、プロトプラスト、カルス、および芽条原基など）は、当業者が通常理解し得る通りの構成物を表す。
【００６９】
植物細胞および植物体への遺伝子導入法としては、通常公知の方法、例えば「Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｄｒａｐｅｒ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９」記載の方法を用いて行うことができる。その例としては、生物的方法（例えば、ウイルスを用いる方法またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（Ｈｏｏｄ，１９９３，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２，２１８、Ｔｏｋｉ Ｓ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５，１６．）など）、物理・化学的方法（例えば、エレクトロポレーション法（Ｔａｄａ，１９９０，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０，４７５）、ポリエチレングリコール法（Ｌａｚｚｅｒｉ，１９９１，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１，４３７）、パーティクル・ガン法（ｓａｎｆｏｒｄ，１９８７，Ｊ．Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．５，２７）など）などが挙げられる。
【００７０】
ポリヌクレオチド導入に使用するための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択し得る。植物細胞としては特に制限はないが、植物体への再分化の系が確立されている、例えば、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコなどの植物細胞が特に好ましい。適当な導入法および植物材料を選択することは、当業者によって容易になされ得る。
【００７１】
植物培養細胞へポリヌクレオチドを導入する場合、材料として代表的にはプロトプラストを用いて、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってポリヌクレオチドの導入が行われる。植物組織へポリヌクレオチドを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など（好ましくは葉、茎、カルス）を用いて、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法、好ましくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法によって、ポリヌクレオチドの導入が行われる。
【００７２】
上記方法により、リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が導入された植物組織または植物細胞から完全な植物を再分化させるには、このような形質転換植物組織または形質転換植物細胞を、再分化培地またはホルモンフリーのＭＳ培地などにおいて培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再分化の方法は、使用される植物組織または植物細胞の種類により異なり、適切な再分化方法の選択は、当業者によって容易になされ得る。様々な文献において、各種の植物（例えば、イネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）など）の再分化の方法が記載されている。
【００７３】
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原性生物に対する抵抗性を有しているか否かは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに記載されている試験方法により容易に確認し得る。例えば、イネいもち病の場合は、実施例８−１に実質的に記載のように、特定のイネ品種にその品種に罹病性のイネいもち病菌のレースを接種した場合の病斑形成や病斑面積率の程度を、原品種と組換え体とを比較することによって検定することが可能であるが、これに限定されることはない。例えば、イネいもち病の抵抗性検定については、今回の実験で使用した噴霧接種法の他に、イネの葉に接種用パンチで穴を開け、その上にいもち病菌胞子のペーストをのせて感染させるパンチ接種法、針の先にいもち病菌胞子ペーストを付けて葉を突き刺す針接種法が挙げられる。これらの接種法では、病斑は葉の傷口から広がるように発病するので、病斑の伸展長を測定することによって、抵抗性強度の検定を行い得る（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。また例えば、白葉枯病の場合は、実施例８−２に実質的に記載のような、白葉枯病細菌懸濁液中に抵抗性を検定する植物の組織（例えば、成葉）を浸漬し、病斑の進行距離を測定する方法、または噴霧接種法、針接種法が挙げられる。いずれの方法においても、葉全体の病斑面積率を測定することによって、発病程度を評価する（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。
【００７４】
上記のような方法でリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を導入し、発現させることにより、病原性生物に対する抵抗性を付与または増強することができる「植物」としては、病原性生物に感染するあらゆる植物を挙げることができる。特定の実施形態では、本発明の方法に従って形質転換される植物は、単子葉植物または双子葉植物である。より詳細には、本発明の方法に従って形質転換される植物の例としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、パンコムギ、ジャガイモ、タバコ、ナス、トマトなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の方法に従って得られる植物、またはその植物器官もしくは植物組織が抵抗性を示す「病原性生物」としては、植物に感染可能なあらゆる病原性生物、例えば、真菌類（糸状菌を含む）、細菌、ウイルスなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００７６】
真菌類としては、イネいもち病菌、イネ紋枯病菌、イネ苗腐病菌、イネ苗立枯病菌、イネばか苗病菌、イネ黄化萎縮病菌、イネごま葉枯病菌、ムギ類さび病類菌、ムギ類うどんこ病菌、ジャガイモ疫病菌、タバコ疫病菌、タバコ灰色かび病菌、タバコ舞病菌、シバ類さび病類菌、立枯病類菌、雪腐病類菌、野菜類の疫病菌、べと病菌、うどんこ病菌、灰色かび病菌、炭そ病菌、苗立枯病菌、根こぶ病菌、カーネーション萎ちょう病菌、キク白さび病菌、ウリ類べと病菌、オオムギ黒穂病菌、ナシ赤星病菌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
病原性細菌としては、イネ白葉枯病細菌、イネ苗立枯細菌病細菌、イネもみ枯細菌病細菌、イネゴマ葉枯病細菌、タバコ空洞病細菌、タバコ野火病細菌、各種野菜類の軟腐病細菌、斑点細菌病細菌、青枯病細菌、インゲンマメかさ枯病細菌、核果類かいよう病細菌、クワ縮葉細菌病細菌、アブラナ科植物黒腐病細菌、カンキツかいよう病細菌、トマトかいよう病細菌、ジャガイモ輪腐病細菌、ジャガイモそうか病細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
病原性ウイルスに起因する病害としては、イネ萎縮病ウイルス、イネ縞葉枯病ウイルス、ムギ斑葉モザイクウイルス病ウイルス、タバコモザイク病ウイルス、タバコ輪点ウイルス病ウイルス、タバコ条斑ウイルス病ウイルス、カリフラワーモザイクウイルス病ウイルス、ジャガイモモザイク病ウイルス、ジャガイモ葉巻病ウイルス、ジャガイモＸウイルス病ウイルス、ジャガイモＹウイルス病ウイルス、キュウリモザイク病ウイルス、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス、トマト黄化えそ病ウイルス、ダイズ矮化病ウイルス、エンドウ茎えそ病ウイルス、ビート萎縮病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明の方法に従って得られる植物が示す「少なくとも２つの病原性生物に対する複合病害抵抗性」とは、真菌類、細菌、ウイルスなどの分類群から選択される少なくとも２つの異なる分類に属する少なくとも２つの病原性生物に対する抵抗性を意味する。例えば、少なくとも２つの病原性生物に対する抵抗性としては、病原性真菌類と病原性細菌との組み合わせに対する抵抗性、病原性細菌と病原性ウイルスとの組み合わせに対する抵抗性、真菌類と病原性ウイルスとの組み合わせに対する抵抗性などが挙げられる。
【００８０】
本発明により、植物に導入されたリボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、植物体から植物体へ種子を媒介として後代へと遺伝され得る。このため、本発明の植物体の花粉あるいは子房から形成される種子においても導入したヌクレオチド配列が存在し、遺伝形質が子孫へと受け継がれ得る。従って、本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列が導入された植物は、例えば、種子による増殖によって、病原性生物に対する抵抗性が失われることなく、増殖が可能である。また、植物組織細胞を用いた大量培養法や従来から行われている挿木、接木、株分けなどによっても、病害抵抗性が失われることなく、増殖が可能である。このような増殖によって得られた後代または子孫もまた、本発明によって包含される。
【００８１】
本発明の方法に従って作出された病害抵抗性を有する植物は、各種病原性生物に対する抵抗性を有するために生産性の向上、収量の安定化、品質の向上、農薬使用量の低減化とそれによる生産コストと労働時間の低減化や環境に対する負荷の軽減に効果があると期待される。また、病害抵抗性の性質から、有機栽培農法や農薬使用が困難な発展途上国においても高い収量が確保できると考えられる。また、本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原性生物に対する抵抗性の機能解明、病害抵抗性を誘導するエリシターの誘導体の開発、およびリボソーム不活性化タンパク質に対する抗体を調製するための抗原を作製するために有用である。
【００８２】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００８３】
【実施例】
（実施例１．ｃＤＮＡライブラリーの作製）
本発明のＲＩＰ ｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡライブラリーの作製を試みた。イネ「日本晴」のカルスをエリシター処理したｃＤＮＡライブラリーは、農業生物資源研究所より供与された（Ｍｉｎａｍｉ，１９９６，ＰｌａｎｔｃｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３７，５６３）。ライ麦、エンバク由来のｃＤＮＡライブラリーは、サリチル酸処理を行った葉から単離したｍＲＮＡから作製した。
【００８４】
ライ麦「初春」、エンバク「太豊」種子を育苗箱に播種し、温室内で発芽させた。第３葉まで生育したときに、第３葉を切り取り、０．５ｍＭサリチル酸の入ったバットにリーフディスクにして浮かべた。３日後、サリチル酸で誘導した葉１２枚（１．２ｇ）からＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて、２００μｇの総ＲＮＡを調製した。この総ＲＮＡからＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて１７μｇのｍＲＮＡを精製した。このうち１０μｇをｃＤＮＡライブラリーの作製に用いた。キットはＺＡＰ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。ｃＤＮＡ合成後、８００ｂｐ以上のフラグメントを回収し、リンカーを結合させ、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にパッケージを行い、大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’で増幅させた。作製したライブラリーには、ライ麦、エンバクそれぞれ１．２×１０5ｐｆｕ／ｍｌ、１．１×１０5ｐｆｕ／ｍｌのファージが含まれていた。
【００８５】
（実施例２．イネＲＩＰ ｃＤＮＡに対するプローブの作製とＰＣＲ）
既知のＲＩＰ遺伝子の塩基配列および翻訳されるアミノ酸配列を独自に解析したところ、ＲＩＰ遺伝子には塩基配列が保存されている領域が存在することが明らかになった。その共通配列を元にして１０個のプライマーを作製した。今回の研究に用いたプライマーはすべてＯ１ｉｇｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を用いた。
【００８６】
これらのプライマーを用いて、イネ「日本晴」のカルスをエリシター処理したｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ反応を行った。０．５μｌのｃＤＮＡライブラリー中の全ＤＮＡを３１μｌの蒸留水に溶解し、５μｌの１０×ＰＣＲバッファー（ロシュ）、８μ１の２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、５μｌの５０ｐｍｏｌ／μｌ 各種プライマー、０．５μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＥｘｐａｎｄＴＭ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ；ロシュ）を加え、最終量５０μｌとし、以下のようにＰＣＲ反応を行った。反応装置はＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（宝酒造）を用いた。反応は、１）変性９５℃；１分、２）再生４４℃；１分、３）伸長７２℃；１分の操作を３０サイクル繰り返して行った。このＰＣＲ反応を２回行い、反応液１５μｌを１．２％ ＴＡＥアガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動後のゲルを０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム溶液で１０分間染色し、紫外線下で観察して、増幅したフラグメントを全て回収した。回収したフラグメントの塩基配列をＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエルマージャパン）と蛍光自動ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（パーキンエルマージャパン）を用いて決定した。
【００８７】
この様にして数十のＤＮＡ増幅フラグメントの塩基配列を決定した結果、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行ったときに増幅される３００ｂｐのＤＮＡフラグメントが、ＲＩＰと相同性を持っていることが判明した。
【００８８】
５’プライマー ５’−ＧＡＣＡＡＣＭＴＳＴＡＣＹＫＳＧＷＧＧＧＣＴＴＣＡ−３’
３’プライマー ５’−ＣＳＶＧＡＣＡＣＳＧＴＳＴＫＧＡＡＣＣＧＣ−３’（Ｍ：Ａ／Ｃ，Ｓ：Ｃ／Ｇ，Ｙ：Ｃ／Ｔ，Ｋ：Ｇ／Ｔ，Ｗ：Ａ／Ｔ，Ｖ：Ａ／Ｃ／Ｇ）
（実施例３．イネＲＩＰ ｃＤＮＡのクローニング）
エリシター処理を行ったイネカルス由来のｃＤＮＡライブラリーから、ＲＩＰｃＤＮＡのスクリーニングを行った。スクリーニングの際の基本的実験操作は、実験書Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に準じて行った。角型シャーレに大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’で溶菌させた約２×１０4個のファージプラークを培養し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）にファージを転写した。ファージが転写されたナイロンメンブレンを８０℃で２時間ベーキングしてＤＮＡを固定した後、実施例２の方法に基づいて増幅させたＤＮＡフラグメントをプローブとして用いてプラークハイブリダイゼーションを行った（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３）。プラークハイブリダイゼーションの検出には、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。得られたシグナルに対応するプラークをＳＭ溶液に懸濁し、さらに２次スクリーニングを行い、単独の陽性クローンを単離した。このクローンのインサート領域の塩基配列を決定すると、ＰＣＲ増幅フラグメントの配列を含む既知のＲＩＰ遺伝子と類似した塩基配列を持つことが判明した（図１）。このｃＤＮＡをＲＩＰ１ ｃＤＮＡと名付けた。さらにＲＩＰ１ ｃＤＮＡをプローブとして用いて、エリシター処理を行ったイネカルス由来のｃＤＮＡライブラリーからＲＩＰ ｃＤＮＡのスクリーニングを行った結果、ＲＩＰ１とは異なる配列を持ったｃＤＮＡが単離された（図２）。このｃＤＮＡをＲＩＰ２ ｃＤＮＡと名付けた。
【００８９】
（実施例４）
（実施例４−１．ライムギ、エンバクＲＩＰｃＤＮＡのクローニング）
実施例１で作製したライムギ、エンバク由来のｃＤＮＡライブラリーからＲＩＰ ｃＤＮＡのスクリーニングを行った。角形シャーレに大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’で溶菌させた約２×１０4個のファージプラークを培養し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）にファージを転写した。ファージが転写されたナイロンメンブレンを８０℃で２時間べーキングしてＤＮＡを固定した後、イネＲＩＰ１ ｃＤＮＡをプローブとして用いてプラークハイブリダイゼーションを行った（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．９８，５０３）。プラークハイブリダイゼーションの検出にはＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。得られたシグナルに対応するプラークをＳＭ溶液に懸濁し、さらに２次スクリーニングを行い、それぞれ単独の陽性クローンを単離した。これらのクローンのインサート領域の塩基配列を決定すると、イネ科ＲＩＰに相同性のある配列を有していた。ライムギ由来のＲＩＰ ｃＤＮＡの塩基配列を図３に、エンバク由来のＲＩＰ ｃＤＮＡの塩基配列を図４に示す。
【００９０】
（実施例４−２．リボソーム不活性化タンパク質の塩基配列および推定アミノ酸配列における相同性決定）
実施例３および４−１において得られたイネＲＩＰ１、ＲＩＰ２、ライムギＲＩＰおよびエンバクＲＩＰのｃＤＮＡ、ならびに既知のリボソーム不活性化タンパク質をコードする塩基配列（オオムギＲＩＰ：Ｌｅａｈ，Ｒ．ら，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１５６４−１５７３（１９９１）；コムギＲＩＰ：Ｈａｂｕｋａ，Ｎ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１）：１７１−１７６（１９９３）；トウモロコシＲＩＰ１：Ｗａｌｓｈ，Ｔ．Ａ．ら，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２３４２２−２３４２７（１９９１）；およびトウモロコシＲＩＰ２：Ｂａｓｓ，Ｈ．Ｗ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７（２）：６６１−６６２（１９９５））を用いて、ＧＥＮＥＴＹＸソフトウェア（ソフトウェア開発株式会社、東京）を使用することにより、塩基配列間および推定アミノ酸配列間の相同性を決定した。塩基配列間および推定アミノ酸配列間の相同性決定の結果を、それぞれ以下の表１および２に示す。
【００９１】
【表１】
【００９２】
【表２】
（実施例５．ＲｌＰ遺伝子を発現させる発現ベクターの構築）
実施例１〜４の方法でイネから２種類（ＲＩＰ１，ＲＩＰ２）、ライムギ、エンバクからそれぞれ１種類（ライムギＲＩＰ、エンバクＲＩＰ）のＲＩＰ ｃＤＮＡを単離した。これらのＲＩＰ ｃＤＮＡをイネ「どんとこい」に遺伝子導入し、イネの中でＲＩＰを発現させるため、発現ベクターを構築した。形質転換用バイナリーベクターは、ｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．２５，９８９）を用いた。発現ベクター作製の際の基本的実験操作は、実験書Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に準じて行った。形質転換の際に用いたプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、大腸菌はＤＨ５α（東洋紡）を用いた。
【００９３】
ｐＰＺＰ２０２をＨｉｎｄＩＩ一ＢａｍＨＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）または松由来のＰＳＩＩのクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ｃａｂ）をコードする遺伝子のプロモーター（ｃａｂ１プロモーター）（Ｙａｍａｍｏｔｏ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５，７７３）をライゲーションした。ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、ＮＯＳターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１）をライゲーションした。ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、それぞれのＲＩＰのｃＤＮＡをセンスに組み込んだ。最後にＨｉｎｄＩＩ−ＢａｍＨＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ：ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｇｒｉｔｚ，１９８３，ｇｅｎｅ ２５，１７９）にＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３，８１０）とＮＯＳターミネーターを連結させた遺伝子を選抜マーカーとして導入した。以上の方法でＲＩＰが高発現する発現ベクターを構築した（図５）。
【００９４】
（実施例６．ＲＩＰ遺伝子導入イネ系統の作出）
イネ、ライムギ、エンバクのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）を高発現させる形質転換植物の作出は、アグロバクテリウムによる方法を用いた（Ｔｏｋｉ Ｓ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５，１６．Ｈｉｅｉ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｊ．６，２７１）。アグロバクテリウムの系統は、ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８，１２９１）を用いた。
【００９５】
実施例５で構築した発現ベクターを、エレクトロポーレーション法でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１に形質転換した。エレクトロポーレーション装置はＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポーレーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地に懸濁し、２８℃で２時間振盪培養した。この培養液を２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、水酸化ナトリウムでｐＨ５．８に調整）上に拡散し、増殖した形質転換個体を選抜した。
【００９６】
遺伝子導入したアグロバクテリウムを水稲品種「どんとこい」種子、または胚盤由来カルス（４週間）に感染させた。「どんとこい」種子から穎を除いて玄米とし、これを７０％エタノールで１分間殺菌し、滅菌蒸留水で２回洗浄した。さらに、２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で４０分間殺菌し、滅菌蒸留水で２回洗浄した。この玄米を、カルス誘導培地（３０ｇ／ｌ シュクロース、０．３ｇ／ｌ カザミノ酸、２．８ｇ／ｌ プロリン、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを添加し、ｐＨ５．８に調整し、４ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＮ６培地（Ｃｈｕ，１９７４，Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ １８，６５９））上に置床した。玄米を２８℃明所で生育させてカルスを得た。このカルスをアグロバクテリウム感染に用いた。さらにカルス誘導培地に３日間置床した「どんとこい」種子もアグロバクテリウム感染に用いた。
【００９７】
２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１００ｍｇ／ｌ スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地上に２８℃で培養したアグロバクテリウム０．５ｃｍ四方をミクロスパテルでかき取り、１０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴンを含むＡＡＭ培地（Ｔｏｒｉｙａｍａ，１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４１，１７９）に懸濁した。この懸濁液をカルスに注ぎ、２分間浸漬させた。このカルスを水切りした後、１０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴンを含むカルス誘導培地上で、２８℃で３日間培養した。感染後のカルスを滅菌蒸留水で５回洗浄し、余分なアグロバクテリウムを除去した。
【００９８】
アグロバクテリウムを除去したカルスを、選抜培地（５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、３００ｍｇ／ｌ カルベニシリンを含むカルス誘導培地）に２８℃で２週間培養し、再び同じ培地に移し替え、さらに２週間培養した。その結果、遺伝子組換えされたカルスがハイグロマイシン耐性になり、選抜培地上で増殖した。
【００９９】
増殖したカルスを５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、２００ｍｇ／ｌ カルベニシリンを含む再分化培地（３０ｇ／ｌ シュクロース、３０ｇ／ｌ ソルビトール、２ｇ／ｌ カザミノ酸、２０μｇ／ｌ ＮＡＡ、２．２ｍｇ／ｌ カイネチンを添加し、ｐＨ５．８に調整し、４ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ １５，４７３））上に移植した。再分化培地では２８℃で２週間の培養を２回行い、再分化個体を選抜した。
【０１００】
再分化したイネを鉢上げし、５０〜１００系統の再分化個体（Ｔ0）を隔離温室内で生育させた。これを図６に示す。ＡおよびＢともに、左側が原品種「どんとこい」（ＷＴ）であり、右側がリボソーム不活性化タンパク質遺伝子導入系統（それぞれ、ＲＩＰ２６およびＲＩＰ５２）の生育個体である。生育したＲｌＰ遺伝手組換え系統では一部に不稔、矮性化などが生じた。これらの個体は消却し、外見上は原品種とほとんど変わらない個体を耐病性検定に用いた。これらの組換え系統からＴ1種子を採種した。なお、これ本実施例以降、代表としてイネＲＩＰ１遺伝手組換え系統について例示するが、イネＲＩＰ２、ライムギＲＩＰ、エンバクＲＩＰでも同等の結果が観察された。
【０１０１】
（実施例７．Ｔ1世代の非組換え個体の除去）
遺伝の法則からＴ1種子には組換え個体と非組換え個体が、３：１の割合で混合していることが示唆された。このうち、組換え個体はハイグロマイシンに対して抵抗性を有することが推測された。そこで採種したＴ1種子と原品種の「どんとこい」種子を５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシンを含み、４ｇ／ｌ のゲルライトで固化させたＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ １５，４７３）上で発芽させ、２８℃で１週間培養した。培養後のＴ1種子および原品種「どんとこい」種子を図７に示す（Ａ：原品種「どんとこい」（ＷＴ）、ＢおよびＣ：組換え系統（それぞれ、ＲＩＰ２６およびＲＩＰ５２））。実験に使用したハイグロマイシン濃度において、原品種「どんとこい」種子はすべて、ハイグロマイシンの影響を受けて、発芽後黒変し枯死した（図７Ａ）。Ｔ1種子は正常に生育した個体と枯死した個体に分離した。その比率は約３：１であった（図７ＢおよびＣ）。
【０１０２】
以上の結果から、この選抜方法によってＴ1世代の非組換え個体を除去できたと考えられる。また後に行ったゲノミックサザン法による分析の結果、正常に生育したＴ1個体にはイネ、ライムギ、エンバク由来のＲＩＰ遺伝子が導入されていることが確認できた。正常に生育したＴ1世代系統をシードリングケースに鉢上げし、４．５葉期になるまで生育させた。
【０１０３】
（実施例８）
（実施例８−１．いもち病菌の接種と耐病性検定）
いもち病菌の接種は噴霧接種法を用いた（Ｙａｅｇａｓｈｉ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３７）。
【０１０４】
いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ Ｃａｖ．：レース００７）を粉末オートミール培地に移植し、２６℃で培養した。菌叢がシャーレ全面を覆った段階で殺菌水を加え、絵筆で培地表面をこすり、気中菌糸を取り除いた。その後シャーレの蓋を外し、近紫外光を照射して胞子形成を行った（Ｆｕｒｕｔａ，１９６７，Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ２１，１６０）。
【０１０５】
４．５葉期まで生育した原品種個体と組換え体（Ｔ1）の幼苗に、いもち病菌胞子の懸濁液（胞子数５×１０8／ｍｌ）を噴霧し、接種箱内で２６℃で２４時間接種した。接種後の原品種および組換え系統を隔離温室に移動し、病斑を観察した。この噴霧接種検定の結果を、図８（イネＲＩＰ１）、１４（イネＲＩＰ２）、１８（ライムギＲＩＰ）、および２２（エンバクＲＩＰ）に示す。図８の写真中、ＡおよびＢともに、左側の植物群が圃場抵抗性強の品種（トドロキワセ）、中央の植物群が圃場抵抗性中の品種（どんとこい）（ＷＴ）、右側の植物群がイネＲＩＰ１遺伝子組換え系統（それぞれ、ＲＩＰ２６およびＲＩＰ５２）（いずれも接種３週間後）を示す。図１４の写真中、１４Ａが圃場抵抗性強の品種（トドロキワセ）、１４Ｂが圃場抵抗性中の品種（どんとこい）（ＷＴ）、１４ＣがイネＲＩＰ２遺伝子組換え系統（いずれも接種３週間後）を示す。図１４ＢおよびＣは、それぞれＷＴおよびＲＩＰ２遺伝子組換え系統の拡大写真である。図１８の写真中、ＡおよびＢともに、左側の植物群が圃場抵抗性強の品種（トドロキワセ）、中央の植物群が圃場抵抗性中の品種（どんとこい）（ＷＴ）、右側の植物群がライムギＲＩＰ遺伝子組換え系統（それぞれ、ＲＲＩＰ７およびＲＲＩＰ２６）（いずれも接種３週間後）を示す。図２２の写真中、ＡおよびＢともに、左側の植物群が圃場抵抗性強の品種（トドロキワセ）、中央の植物群が圃場抵抗性中の品種（どんとこい）（ＷＴ）、右側の植物群がエンバクＲＩＰ遺伝子組換え系統（それぞれ、ＯＲＩＰ１１およびＯＲＩＰ３４）（いずれも接種３週間後）を示す。耐病性検定は病斑の形状の判定と、病斑面積率の測定を行い、以下に示す病斑指数を用いて解析を行った（Ａｓａｇａ，１９８１，Ｊ．Ｃｅｎｔ．Ａｇｒｉｃ．Ｅｘｐ．Ｓｔｎ．３５，５１）。
【０１０６】
この耐病性検定の結果を図９、１５、１９および２３に示す。各図において、横軸は接種後日数、縦軸は病斑指数を表す。図９中、黒菱形は組換え体（１−２６）、白四角は組換え体（１−４９）、黒三角は組換え体（１−５２）、白丸は原品種どんとこい（ＷＴ）、黒四角はトドロキワセ（Ｔ）を示す。図１５中、白丸は原品種どんとこい（ＷＴ）、黒四角はトドロキワセ（Ｔ）、黒菱形は組換え体（ＲＩＰ２）を示す。図１９中、白菱形は原品種どんとこい（ＷＴ）、黒四角はトドロキワセ（Ｔ）、黒三角は組換え体（ＲＲＩＰ７）および×は組換え体（ＲＲＩＰ２６）を示す。図２３中、白丸は原品種どんとこい（ＷＴ）、黒四角はトドロキワセ（Ｔ）、黒三角は組換え体（ＯＲＩＰ１１）および×は組換え体（ＯＲＩＰ３４）を示す。
【０１０７】
この結果、組換え体では原品種と変わらない罹病性病斑が認められた。また、組換え体の中にいもち病の進行が遅延する系統が見つかった。これらの個体はいもち病の罹病性病斑が認められるものの、病斑面積率は非常に小さかった。従って、イネ、ライムギ、エンバク由来のＲＩＰ遺伝子細換え系統はいもち病に対して圃場抵抗性型の抵抗性をもたらすことが明らかになった。
【０１０８】
（実施例８−２．白葉枯病菌の接種と耐病性検定）
いもち病菌に対して抵抗性が確認されたイネ、ライムギ、エンバク由来のＲＩＰ遺伝手組換え系統（Ｔ0）の成苗に対して白葉枯病の接種検定を行った。白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ：レース３−Ａ）を、馬鈴薯半合成培地（馬鈴薯３００ｇ、硝酸カルシウム０．５ｇ、リン酸水素ニナトリウム・１２水和物２ｇ、ペプトン５ｇ、ショ糖１５ｇ、寒天２０ｇ、蒸留水１ｌ）で増殖させた。試験管の中に蒸留水１０ｍｌを入れ、白葉枯病菌０．５ｃｍ四方を懸濁させ、接種用の懸濁液を作製した。原品種及びＲｌＰ遺伝子組換え系統（Ｔ0）の成葉の先端を白葉枯病菌の懸濁液に浸したハサミで切り取り、白葉枯病の接種を行った（Ｔｓｕｓｈｉｍａ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２８）。２０日後、葉の先端から白葉枯病が進行した距離を測定することによって、白葉枯病に対する抵抗性を検定した。この結果を図１０、１６、２０および２４に示す。図１０中、ＷＴは原品種（どんとこい）の葉であり、ＲＩＰ１−２６およびＲＩＰ１−５２は、それぞれ組換え系統（Ｔ0）（接種後２０日）の葉である。図１６中、ＷＴは原品種（どんとこい）の葉であり、Ｒｉｃｅ ＲＩＰ２−３０は、組換え系統（Ｔ0）（接種後２０日）の葉である。図２０中、ＷＴは原品種（どんとこい）の葉であり、Ｒｙｅ ＲＩＰ２０は、組換え系統（Ｔ0）（接種後２０日）の葉である。図２４中、ＷＴは原品種（どんとこい）の葉であり、Ｏａｔ ＲＩＰ１６は、組換え系統（Ｔ0）（接種後２０日）の葉である。原品種に比べてＲＩＰ遺伝子組換え系統（Ｔ0）は白葉枯病斑の進展が遅れた（図１０、１６、２０および２４）。この耐病性検定の結果を図１１、１７、２１および２５に示す。図１１において、ＷＴは、原品種（どんとこい）、１−２０、１−２６、１−３４および１−５２は、ＲＩＰ１遺伝子組換え系統である。図１７において、ＷＴは、原品種（どんとこい）、２−１０、２−１８、２−３０および２−４６は、ＲＩＰ２遺伝子組換え系統である。図２１において、ＷＴは、原品種（どんとこい）、Ｒｙｅ４、Ｒｙｅ６、Ｒｙｅ７、Ｒｙｅ８、Ｒｙｅ１０、Ｒｙｅ１２、Ｒｙｅ１４、Ｒｙｅ１６、Ｒｙｅ１８およびＲｙｅ２０は、ライ麦ＲＩＰ遺伝子組換え系統である。図２５において、ＷＴは、原品種（どんとこい）、Ｏａｔ１、Ｏａｔ４、Ｏａｔ５、Ｏａｔ１０、Ｏａｔ１１、Ｏａｔ１６、Ｏａｔ２２、Ｏａｔ２９、Ｏａｔ３２、Ｏａｔ３３はエンバクＲＩＰ遺伝子組換え系統である。これらの結果により、イネ、ライムギ、エンバク由来のＲＩＰ遺伝子組換え系統は白葉枯病に対して抵抗性をもたらすことが明らかになった。
【０１０９】
（実施例９．ゲノミックサザン法によるＲＩＰ遺伝子導入の確認）
原品種及び病害抵抗性が確認されたＲＩＰ遺伝手組換え系統（Ｔ0）の葉身からＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｍｕｒｒａｙ，１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，４３２１）を用いてゲノミックＤＮＡを抽出した。イネ地上部１０ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となったイネを１．５×ＣＴＡＢ液（１．５％ ＣＴＡＢ，７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０，１．０５Ｍ 塩化ナトリウム）と混合し、５６℃で２０分間軽く浸透してＤＮＡを溶出させた後、クロロホルム抽出を２回行ってタンパク質を除去した。この溶液に１／１０容の１０％ ＣＴＡＢ、１．５容の沈殿溶液（１％ ＣＴＡＢ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を加えＤＮＡを析出した。このＤＮＡを、１Ｍ 塩化ナトリウムに溶解し、ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＡでＲＮＡを分解した後、エタノール沈殿を行ってゲノミックＤＮＡを抽出した。
【０１１０】
抽出したゲノミックＤＮＡ（１０μｇ）を制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩで処理し、１．２％アガロースゲルで１８時間電気泳動を行った。泳動後のゲルを加水分解液（０．２５Ｍ ＨＣｌ溶液）に１０分間、アルカリ変性溶液（１．５Ｍ ＮａＯＨ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）に３０分間浸漬して軽く振盪した。その後、アルカリ転写溶液（０．４Ｍ ＮａＯＨ）を用いてＤＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）に転写した。ゲノミックＤＮＡが転写されたナイロンメンブレンを８０℃で２時間べ一キングしてＤＮＡを固定した後、それぞれのＲＩＰ ｃＤＮＡをプローブとして用いてゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３）。サザンハイブリダイゼーションの検出には、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。洗浄条件は、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）の場合には、０．２×ＳＳＣ濃度の洗浄液を使用し、Ａｌｋｐｈｏｓ（アルカリホスファターゼ）の場合には、供給業者の推奨するプロトコールに記載された洗浄液を用いて、５５〜６０℃で洗浄を行った。
【０１１１】
この結果を図１２（Ａ〜Ｃ）に示す。図１２Ａ〜Ｃ中、それぞれ、レーンＭは１ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ、レーン１はＢｇｌＩＩ処理、レーン２はＥｃｏＲＶ処理、レーン３はＮｄｅＩ処理、レーン４はＥｃｏＲＩ処理を示す。
【０１１２】
サザンハイブリダイゼーションの結果、原品種からはＲＩＰプローブとハイブリダイゼーションしたバンドが１つ（イネＲＩＰ１、ＲＩＰ２）もしくは全く確認されなかった（ライムギ、エンバクＲＩＰ）のに対し、組換え個体からは１〜２本のバンドが検出された。従って、これらの組換え系統には少なくとも１コピーのＲＩＰ遺伝子が導入されていることが明らかになった。
【０１１３】
（実施例１０．ノーザン法によるＲＩＰ ｍＲＮＡ発現の確認）
原品種及びＲＩＰ遺伝子組換え系統（Ｔ0）の葉身から、ＣＴＡＢ／ＬｉＣｌ法で総ＲＮＡを抽出した（Ｃｈａｎｇ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ １１，１１３）。イネ地上部２ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となったイネを１０容の２×ＣＴＡＢ液（２％ ＣＴＡＢ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１．４Ｍ 塩化ナトリウム，１％ メルカプトエタノール）と混合し、６０℃で１０分間軽く浸透してＲＮＡを溶出させた後、クロロホルム抽出を２回行ってタンパク質を除去した。この溶液に１／４容の１０Ｍ 塩化リチウムを加えＲＮＡを析出した。ＲＮＡをＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に溶解させ、フェノール／クロロホルム抽出処理を行った後、上記方法で塩化リチウム抽出をもう一度行い、総ＲＮＡを単離した。
【０１１４】
単離した総ＲＮＡ（３０μｇ）を６．３％ ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロース変性ゲルで電気泳動し、２０×ＳＳＣ（３Ｍ 塩化ナトリウム、３００ｍＭ クエン酸三ナトリウム二水和物）を用いて総ＲＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）に転写した。総ＲＮＡが転写されたナイロンメンブレンに、導入したそれぞれのＲＩＰ ｃＤＮＡをプローブとして用いて、ノーザンハイブリダイゼーションを行った（Ａｌｗｉｎｅ，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５３５０）。ノーザンハイブリダイゼーションの検出には、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。
【０１１５】
これらの結果を、図１３（Ａ〜Ｄ）に示す。ＡおよびＣは、総ＲＮＡ像であり、ＢおよびＤはノーザンハイブリダイゼーション像を示す。Ａ〜Ｄのいずれも、レーンの左から右の順に、Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ、Ｗ：原品種、２６および５２：それぞれ、イネＲＩＰ１遺伝子導入系統を示す。
【０１１６】
ノーザンハイブリダイゼーションの結果、原品種からはＲＩＰプローブとハイブリダイゼーションしたバンドが確認されなかったのに対し、いもち病、白葉枯病に対する抵抗性を示した組換え系統から約１，５００ｂｐのバンドが確認できた（図１３：矢印）。従って、これらの組換え系統にはＲＩＰ ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
【０１１７】
【発明の効果】
本発明により、種々の病原性生物に対する抵抗性を与える遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターを保持する植物細胞、この植物細胞を再生して得られた植物体が提供され、さらに病原性生物に対して抵抗性の植物を作出する方法が提供される。
【０１１８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、イネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ酸配列である。
【図２】図２は、イネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ２）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ酸配列である。
【図３】図３は、ライムギのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ酸配列である。
【図４】図４は、エンバクのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ酸配列である。
【図５】図５は、ＲＩＰ遺伝子の発現ベクター（ｐＰＺＰ２０２）の構築を示す模式図である。
【図６】図６は、ＲＩＰ遺伝子組換え系統（イネＲＩＰ１組換え系統）の形態を示す生物形態写真である。
【図７】図７は、組換え系統Ｔ1種子のハイグロマイシン選抜（イネＲＩＰ１組換え系統）の形態を示す生物形態写真である。
【図８】図８は、いもち病（レース００７）の噴霧接種検定（イネＲＩＰ１組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図９】図９は、組換え系統のいもち病に対する抵抗性程度（イネＲＩＰ１組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ１組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図１１】図１１は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ１組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ゲノミックサザン法による導入遺伝子の確認（イネＲＩＰ１組換え系統）を示す電気泳動図である。
【図１３】図１３は、ノーザン法によるＲＩＰｍＲＮＡの発現調査（イネＲＩＰ１組換え系統）を示す電気泳動図である。
【図１４】図１４は、いもち病（レース００７）の噴霧接種検定（イネＲＩＰ２組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図１５】図１５は、組換え系統のいもち病に対する抵抗性程度（イネＲＩＰ２組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ２組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図１７】図１７は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ２組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、いもち病（レース００７）の噴霧接種検定（ライムギＲＩＰ組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図１９】図１９は、組換え系統のいもち病に対する抵抗性程度（ライムギＲＩＰ組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、白葉枯病の接種検定（ライムギＲＩＰ組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図２１】図２１は、白葉枯病の接種検定（ライムギＲＩＰ組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、いもち病（レース００７）の噴霧接種検定（エンバクＲＩＰ組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図２３】図２３は、組換え系統のいもち病に対する抵抗性程度（エンバクＲＩＰ組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図２４】図２４は、白葉枯病の接種検定（エンバクＲＩＰ組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図２５】図２１は、白葉枯病の接種検定（エンバクＲＩＰ組換え系統）の結果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物に病害抵抗性を付与するＤＮＡ、このＤＮＡを含む発現カセット、該発現カセットを含むベクター、このベクターを保持する植物細胞、この植物細胞を再生して得られた植物体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イネは日本を含むアジアの主作物であり、そのためアジア諸国では古くからイネの収量増加のための研究を行ってきた。イネの収量を減少させる原因の一つとしては病害が挙げられ、その中でもいもち病（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）と白葉枯病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）は深刻な被害をもたらす病害として恐れられてきた。いもち病は日本で最も恐れられている病害であり、主に日本の中部から北部にかけて長雨、冷害に伴って発生する。 いもち病菌は糸状菌の一種である。いもち病に冒されたイネは黒色の斑点型病斑を生じ、イネの成長が停止する。
【０００３】
白葉枯病は細菌病の一種であり、九州から東南アジアにかけて深刻な被害をもたらす病害である。白葉枯病に冒されたイネは白褐色の病斑が葉縁に沿って拡大し、葉全体が枯死する（Ｏｈａｔａ，１９８９，Ｚｅｎｋｏｋｕ Ｎｏｓｏｎ Ｋｙｏｉｋｕ Ｋｙｏｋａｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ．ｐｐ．５６３）。
【０００４】
植物は、病原菌の侵入シグナルを認識すると、植物体を防御するために感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）を誘導発現し、防御応答を行う（Ｂｏｗｌｅｓ，１９９０，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，８７３）。病原菌の感染によって誘導された抗菌性タンパク質は、病原菌に直接作用することによって植物の防御機構に関わっている（ＶａｎＬｏｏｎ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ．１２，２４５；ＶａｎＬｏｏｎ，１９９９，Ｐｈｙｓｉｏ１．Ｍｏｌ．ＰｌａｎｔＰａｔｈ．５５，８５）。また、グルカナーゼやキチナーゼ遺伝子を遺伝子組換えする事によって、植物に病害抵抗性をもたらしたことが報告されている（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，１９９９，Ｋａｇａｋｕ ｔｏ Ｓｈｅｉｂｕｔｓｕ ３７，２９５）。
【０００５】
リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）は、真核生物のｒＲＮＡに対してＮ−グリコシダーゼ活性を持ち、アデニン残基を特異的に切断する塩基性タンパク質である。ＲＩＰは作物を含む植物のほとんど全ての組織で発現しており、植物の病原菌に対して抗菌活性がある（Ｂａｒｂｉｅｒｉ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１５４，２３７；Ｙｕｎ，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １４，３９）。これまでに、オオムギ、コムギ、トウモロコシなどに由来するリボソーム不活性化タンパク質が単離されている（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３）：１５６４−７３（１９９１）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１）：１７１−６（１９９３）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３４）：２３４２２−７（１９９１）；Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）６２（６）：１１５２−１１５６；およびＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７（２），６６１−６６２を参照のこと）。リボソーム不活性化タンパク質の総説については、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４０５−４１２（１９９２）およびＣｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）４２（４）：４６１−４７１を参照のこと。オオムギから精製されたＲＩＰはｒＲＮＡに対して特異性を持ち、カビのｒＲＮＡに対して哺乳動物のｒＲＮＡよりも１０倍以上のＮ−グリコシダーゼ活性を持つことが明らかになっている（Ｅｎｄｏ，１９８８，Ｂｉｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９５４，２２４）。また、オオムギＲＩＰは植物のｒＲＮＡに対してＮ−グリコシダーゼ活性を持たないので、ＲＩＰは植物の病害抵抗性機構に関与していると推測されている（Ｔａｙｌｏｒ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，８２７）。
【０００６】
このＲＩＰの抗菌性を利用し、これまでＲＩＰ遺伝子の導入によって植物に病害抵抗性を付与させる試みが行われてきた。例えば、オオムギＲＩＰに創傷誘導性（ｗｏｕｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモーターを用いてタバコに形質転換させた場合では、形質転換個体はタバコ腰折れ病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）に対する病害抵抗性が向上したことが報告されている（Ｌｏｇｅｍａｎｎ，１９９２，ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，３０５）。さらに、オオムギのキチナーゼ遺伝子とＲＩＰ遺伝子をともに恒常的に発現する形質転換タバコは、それぞれの遺伝子の単独導入の場合よりも、腰折れ病に対して強い抵抗性を示すことが報告された。これは、溶菌酵素の作用によって、ＲＩＰの菌体内への浸透性が高められたためと考えられている（Ｊａｃｈ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｊ．８，９７）。ヤマゴボウＲＩＰが導入されたタバコは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に対する抵抗性が付与された（Ｍｏｏｎ，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ ７，８０７）。しかしながら、このように、ＲＩＰ遺伝子を単独で導入した研究はタバコ、ジャガイモでしか行われていない。特に、主要作物の中に含まれるイネ科植物において、病害に対する抵抗性を付与する遺伝子が望まれているが、イネ科植物でＲＩＰ遺伝子の発現を強化した場合の病害抵抗性に及ぼす効果は未知である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題を解決するためのものであり、その目的とするところは、種々の病原性生物に対する抵抗性を与える遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターを保持する植物細胞、この植物細胞を再生して得られた植物体を提供し、さらに病原性生物に対して抵抗性の植物を作出する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意努力した結果、イネから２種類、ライ麦、エンバクからそれぞれ１種類のＲＩＰ ｃＤＮＡをクローニングした。また、これらのＲＩＰ ｃＤＮＡをアグロバクテリウム形質転換法を用いてイネに形質転換を行い、植物体内で発現させることに成功した。本発明者らは、さらに、この遺伝子の解析を進めた結果、この遺伝子の発現と植物の病害抵抗性との間に顕著な相関関係が認められることを見いだし、これにより発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明は、以下のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）をコードするポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１の１４６〜９５５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； または
（ｂ）該（ａ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチド。
【００１０】
１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１の１４６〜９５５位に記載のヌクレオチド配列、配列番号３の５４〜８９９位に記載のヌクレオチド配列、配列番号５の３５〜８７７位に記載のヌクレオチド配列、および配列番号７の３７〜８４３位に記載のヌクレオチド配列を含み得る。
【００１１】
別の実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１の１４６〜９５５位に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも７２．５％の相同性を有し、かつリボソーム不活性化タンパク質活性を有するタンパク質をコードし得る。
【００１２】
本発明はさらに、以下のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）をコードするポリヌクレオチドを提供する：
（ｃ）配列番号２の１〜２７０位に記載されるアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）（ｃ）に示すアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
【００１３】
１つの実施形態において、上記タンパク質は、配列番号２の１〜２７０位に記載のアミノ酸配列、配列番号４の１〜２８２位に記載のアミノ酸配列、配列番号６の１〜２８１位に記載のアミノ酸配列、配列番号８の１〜２６９位に記載のアミノ酸配列およびそれらのフラグメントを含み得る。
【００１４】
別の実施形態において、上記タンパク質は、配列番号２の１〜２７０位に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも６２％の相同性を有し、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質を含み得る。
【００１５】
本発明はまた、上記ポリヌクレオチドを含む発現カセット、この発現カセットを含む発現ベクター、およびこのベクターが導入された植物細胞を含み得る。
【００１６】
本発明は、上記植物細胞を再生して得られた植物もまた含み得る。
【００１７】
本発明は、植物病原性生物に対して抵抗性を有する植物を作出するための方法を提供し、この方法は、上記発現ベクターを植物細胞に導入する工程を包含する。
【００１８】
１つの実施形態において、上記方法は、上記植物細胞を、リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現し、そして植物病原性生物に対して抵抗性を有する植物体に再生する工程をさらに包含し得る。
【００１９】
別の実施形態において、上記植物病原性生物は、病原性細菌、真菌類、および病原性ウイルスを含み得る。
【００２０】
さらに別の実施形態において、上記病原性細菌は、白葉枯病細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）を含み得る。
【００２１】
さらに別の実施形態において、上記真菌類は、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）を含み得る。
【００２２】
なお別の実施形態において、上記抵抗性を有する植物は、少なくとも２つの植物病原性生物に対する複合病害抵抗性を示し得る。
【００２３】
他の実施形態において、上記少なくとも２つの病原性生物は、真菌類と病原性細菌との組み合わせを含み得る。
【００２４】
他の実施形態において、上記少なくとも２つの病原性生物は、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）と白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）との組み合わせを含み得る。
【００２５】
さらなる実施形態において、上記植物は、単子葉植物または双子葉植物である。
【００２６】
１つの実施形態において、上記植物は単子葉植物であり得る。別の実施形態において、上記単子葉植物はイネ科植物であり得る。また、このイネ科植物はイネであり得る。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物に病害抵抗性を付与するタンパク質の発見に関する。「病害抵抗性」とは、以下に説明するような病原性生物によって引き起こされる病気を防ぐ、または最小限にとどめる性質をいう。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、エリシター処理またはサリチル酸によって植物においてその発現が誘導され、植物に病害抵抗性を付与し得る。エリシターとは、植物の病害抵抗反応に関与するフィトアレキシン産生を誘導する物質である。サリチル酸は、植物の病害抵抗性を引き起こすシグナル物質の１つである。本発明のポリヌクレオチドは、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）をコードし得る。
【００２９】
リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）は、原核生物／真核生物のｒＲＮＡに対してＮ−グリコシダーゼ活性を持ち、アデニン残基を特異的に切断する塩基性タンパク質である。このタンパク質は、原核生物／真核生物のタンパク質合成を触媒的に著しく不活化し得る。また、このタンパク質は、植物細胞のｒＲＮＡに対してはＮ−グリコシダーゼ活性がほとんどない。
【００３０】
本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドはさらに、本発明のリボソーム不活性化タンパク質（例えば、図１に示したアミノ酸配列を有するリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１））のアミノ酸配列（配列番号２）またはポリヌクレオチド配列（配列番号１）に対して実質的な同一性を有する改変体をコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書中で使用される場合、本発明のリボソーム不活性化タンパク質のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を有する改変体とは、このタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失（すなわち、短縮化）または付加；このタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の欠失または付加；あるいはこのタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の置換によりネイティブタンパク質から誘導されたタンパク質を意図する。
【００３１】
リボソーム不活性化タンパク質の改変体において、目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適当なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９８７）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、これは、参考として本明細書中に援用される）のモデルに見出され得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のものと交換する置換）が好ましいとされ得る。このような置換としては、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）；親水性アミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）同士の置換が挙げられる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換」とは、本発明で使用され得るポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が有する機能を発現し得る限りにおいて、任意の数（１または数個）のアミノ酸が上記アミノ酸配列において欠失、付加、および／もしくは置換していることを意味する。アミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加のような改変が活性に与える影響は、改変されるアミノ酸の位置、程度、種類などに依存し得ることは当業者には明らかである。本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が有する機能を発現し得る限りにおいて、好ましくは以下のアミノ酸配列同一性を満たす個数で欠失、置換および／もしくは付加された改変体をコードする。
【００３３】
さらに、本発明で使用される「リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド」とは、縮重異性体をすべて含むものである。ここで、「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて、同一のポリペプチドをコードすることのできる遺伝子を意味する。例えば、図１の塩基配列を有するＤＮＡに対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係にあるコドン例えばＡＡＴに変わったものを縮重異性体と呼ぶこととする。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのプラスミドに組み込まれたリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いても良い。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドは、病害抵抗性を付与し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２７０位のＡｓｎまでのアミノ酸配列と、少なくとも６２％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドは、病害抵抗性を付与し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから２７０位のＡｓｎまでのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１の１４６〜９５５位までに示されるヌクレオチド配列）と、少なくとも７２．５％、好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドの１つの好ましい実施形態としては、配列番号４の１〜２８２位に記載のアミノ酸配列、配列番号６の１〜２８１位に記載のアミノ酸配列、配列番号８の１〜２６９位に記載のアミノ酸配列またはそれらのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「参照配列」とは、配列比較の基準として使用される規定の配列である。参照配列は、記載された配列のサブセットまたは全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子配列としてである。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続しかつ特定化されたセグメントについて言及し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことにより、参照配列に対して高い類似性となることを避けるために、典型的には、ギャップペナルティーを導入し、そしてこれを、一致の数から差し引くことを理解する。
【００３９】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野において周知である。参照配列（本発明の配列）と対象配列との間の最適な全体の整合を決定するための好ましい方法として、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析が用いられる。配列整列において、参照配列および対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。上記の全体的配列整列の結果が、同一性％である。同一性％を算定するためにＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴ整列において、一般的には、デフォルトパラメーターが使用され得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定化された比較ウインドウにわたって最大に一致するように整列された場合に同一である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパク質に関して配列同一性％が使用される場合、しばしば、保存的アミノ酸置換によって同一ではない残基位置は異なることが理解される。上述したように、保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について矯正するように上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整をするための手段は、当業者には周知である。代表的には、これは、完全なミスマッチではなく、部分的なものとして保存性置換を点数付けすることを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行されるように計算される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性％」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２つの配列を比較することによって決定された値を意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在して一致した位置の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００４２】
用語、ポリヌクレオチドの「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーター（例えば、デフォルトパラメーター）を使用して、記載されるかさもなくば公知のアラインメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮に入れることによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされる対応するタンパク質の同一性を決定するために、これらの値が適切に調整され得ることを理解する。これらのために、対応するアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００４３】
ペプチドの文脈における用語「実質的同一性」は、ペプチドが、特定化された比較ウィンドウにわたって、参照配列に対して、より好ましくは少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。好ましくは、最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して行われる。例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、ペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が保存的アミノ酸変化によって異なり得るということ以外は、上記に示したような配列同一性を共有する。
【００４４】
本発明においては、ＧＥＮＥＴＹＸソフトウェア（ソフトウェア開発株式会社、東京）を使用することにより、アミノ酸配列／ヌクレオチド配列の同一性または類似性を決定した。しかし、同一性または類似性の％は、使用されるソフトウェアに依存して異なり得ることは当業者により理解される。また、例えば、ＡおよびＢの２つのアミノ酸配列／ヌクレオチド配列を比較する場合、アミノ酸配列／ヌクレオチド配列Ａの長さが、アミノ酸配列／ヌクレオチド配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列／ヌクレオチド配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列／ヌクレオチド同一性とは等しくない場合もあることは明らかである。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、病害抵抗性を与えるリボソーム不活性化タンパク質の生物学的に活性な部分をコードするフラグメントは、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５の連続するアミノ酸、または本発明で使用されるリボソーム不活性化タンパク質の全長タンパク質に存在するアミノ酸の総数まで（例えば、配列番号２の２７０アミノ酸）をコードする。ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＰＣＲプライマーについて）として用いるための、病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質のフラグメントは、一般に、病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードする遺伝子により発現されるタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする必要はない。
【００４６】
イネ以外の他の植物に由来する、病害抵抗性を与えるリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドホモログもまた、本願発明において使用され得る。そのようなポリヌクレオチドホモログは、例えば、公知のリボソーム不活性化タンパク質（例えば、図１に記載されたイネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１））の全長または一部のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いて、選択した植物のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡフラグメントをプローブとして用いて同じ植物のゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどのような方法が、公知のリボソーム不活性化タンパク質（例えば、図１に記載されたイネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１））の配列に対するそれらの配列同一性に基づいてこのような配列を同定するために使用され得る。とりわけ、図１に記載の配列全体に対する、またはそれらのフラグメントに対する、それらの配列同一性に基づいて単離された配列は、本発明によって特に好ましく使用される。
【００４７】
ハイブリダイゼーション技術において、公知のリボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは部分が、選択された生物由来のクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。このハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであり得、そして検出可能な基（例えば、32Ｐ）または任意の他の検出可能なマーカーで標識され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本発明の病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質のヌクレオチド配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドを標識することによって作製され得る。ハイブリダイゼーションのためのプローブの調製およびｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築の方法は、一般に、当該分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（これは、本明細書中に参考として援用される））において開示される。
【００４８】
例えば、本明細書中に示された病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列全体、またはそれらの１つ以上の部分が、対応する病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質の遺伝子配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードする遺伝子配列間で独特であり、そして好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を包含する。このようなプローブは、選択された生物から対応する病害抵抗性を付与するリボソーム不活性化タンパク質をコードする遺伝子配列をＰＣＲによって増幅するために使用され得る。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １： １７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考として援用する）。この技術は、所望の生物からさらなるコード配列を単離するために使用され得る。ハイブリダイゼーション技術は、プレート化したＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを包含する（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。
【００４９】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施され得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。あるいは、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性が検出され得るように、配列中にいくらかミスマッチとなることが可能になるように調整され得る。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満であり、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００５０】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、代表的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。例示的な高ストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして６０〜６５℃における０．１× ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェントな条件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして５５〜６０℃における０．５×〜１× ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な低ストリンジェントな条件としては、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして５０〜５５℃における１×〜２× ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。
【００５１】
特異性は、代表的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔmは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔmは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。Ｔmは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；従って、Ｔm、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔmは、１０低下し得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補物に対する熱融点（Ｔm）よりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度のストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望されるＴmを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴmを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと（これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００５２】
本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、代表的には、本発明のリボソーム不活性化タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に記載されるイネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１）のアミノ酸配列）の情報またはそれをコードするヌクレオチド配列情報に従って得られるが、それらの既知の配列情報を基に、化学合成によっても得られ得る。例えば、本発明で使用され得るポリヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（現Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）のポリヌクレオチド合成機を用いて製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。
【００５３】
さらに他の実施形態では、本発明で使用されるリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する１つの方法としては、核酸合成の手法に従ってそのポリヌクレオチドの少なくとも一部を化学合成し、これをプローブとして使用して、適当なｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、ＢＡＣクローンライブラリー、ＰＡＣクローンライブラリー、ＹＡＣクローンライブラリーなどから、慣用されている方法（例えば、免疫学的方法あるいはハイブリダイゼーション法など）により取得する方法を挙げることができる。上記の方法に用いるいくつかのプラスミド類、様々な制限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類としては市販のものを使用し得る。また、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体の培養および培養物からのＤＮＡ，ＲＮＡ等の回収は文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ））に準じて行い得る。
【００５４】
さらに別の実施形態では、以下の様にして、リボソーム不活性化タンパク質をコードするＤＮＡを取得することができる。まず、本発明のリボソーム不活性化タンパク質（例えば、図１に記載されるイネのリボソーム不活性化タンパク質）中の２種類のアミノ酸部分配列を選択し、これらのアミノ酸配列のＣ末端をコードすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーと上記アミノ酸配列のＮ末端側をコードすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーとを作製し、これらをミックスプライマーとして用い、適当なライブラリーおよびＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応（Ｓａｉｋｉ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７）（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ反応（Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄ，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７，４５３））を行う。その後、ＰＣＲ反応生成物の中から、増幅が予想される特定の長さの増幅フラグメントを取り出し、これらの塩基配列を決定する。得られた増幅フラグメントをプローブとしてハイブリダイズさせることにより、上記のライブラリーからリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを獲得する。
【００５５】
得られたポリヌクレオチドの塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法マキサム−ギルバート法（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５，４９９）やジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ１９８２，Ｇｅｎｅ １９，２６９））、または市販されている自動シーケンサーにより決定し得る。
【００５６】
また、得られたポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入すること、そして適切な宿主においてポリペプチドを発現させることによって、コードされるタンパク質を容易に組換え的に発現させ得る。当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを用いて、組換えタンパク質を発現させ得る。組換えタンパク質の発現は、取得されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞（例えば、大腸菌）、下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）および高等真核生物細胞などが挙げられる。用いられる宿主細胞としては、植物細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、哺乳動物の細胞株（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）、昆虫細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。この様式で発現されるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、天然に存在するポリペプチドの一部分、またはそれらの他の改変体をコードし得る。組換えポリペプチドを分泌する適切な宿主／ベクター系由来の上清は、まず、市販のフィルターを用いて濃縮され得る。次いで、この濃縮物は、タンパク質の性質に応じて、塩析や有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、免疫吸着体によるカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動などを適宜組み合わせて行うことが可能である。また、本発明の組換えタンパク質をヒスチジンタグやグルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの標識との融合タンパク質として発現させた場合には、該標識に対するアフィニティークロマトグラフィーなどにより精製することも可能である。最後に、１回以上の逆相ＨＰＬＣの工程が用いられ、組換えポリペプチドは、さらに精製され得る。
【００５７】
上記のように取得されたポリヌクレオチドが、Ｎ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするか否かを、当業者は容易に確認し得る。Ｎ−グリコシダーゼ活性は、例えば、Ｔａｙｌｏｒ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，８２７またはＥｎｄｏ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９５４：２２４−２２６（１９８８）に記載の方法を用いて容易に測定され得る。詳細には、取得されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、上記のように組換え生成することにより獲得し、この組換え生成タンパク質を病原性生物のｒＲＮＡと反応させ、電気泳動によってｒＲＮＡの分解を確認し得る。
【００５８】
また、上記のように取得されたポリヌクレオチドが、抗菌活性を有するタンパク質をコードするか否かを、当業者は容易に確認し得る。例えば、タンパク質の抗菌活性を測定する方法としては、阻止円法（佐藤昭二ら、植物病理学実験法、第２１９−２２３頁、講談社を参照のこと）が挙げられる。詳細には、取得されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、上記のように組換え生成することにより獲得し、病原菌胞子などを混合した寒天培地上に、この組換え生成タンパク質を染み込ませた濾紙ディスクを載せて、所定時間培養する。組換え生成タンパク質が、使用された病原菌に対して抗菌性を有している場合、この濾紙の周りに生育阻止円が形成される。さらに、タンパク質濃度に応じて阻止円の大きさを測定することによって、抗菌性の強さを測定し得る。
【００５９】
本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドの代表的形態は、プラスミドまたはファージＤＮＡなどの中に構成員の一部としてこのポリヌクレオチドが挿入された形態、並びに、ゲノムＤＮＡの中にこのポリヌクレオチドが挿入された形で微生物またはファージ粒子あるいは植物の中に存在する形態である。本明細書中で使用される微生物の一例として、大腸菌やアグロバクテリウムを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、３’−末端側に接して少なくとも１個の停止コドン（例えばＴＡＧ）を有することが望ましい。
【００６１】
さらに本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、所望により５’−側上流に翻訳フレームと合わせて翻訳開始のメチオニンをコードするＡＴＧ配列、その５’−側上流および３’−側下流に非翻訳領域として適当な長さの他のポリヌクレオチドが結合しても良い。
【００６２】
組換えタンパク質を発現させるためのベクターとしては、例えば、植物、酵母細胞に関しては、プラスミドｐＢＩ１２１，ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、大腸菌等の細菌細胞に関しては、プラスミドｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９）、哺乳動物細胞に関しては、プラスミドｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、昆虫細胞に関しては、プラスミドｐＢａｃＰＡＫ８．９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明における使用に有用な発現ベクターとしては、例えば、プラスミドｐＢＩ１２１，ｐＢＩ２２１，ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９）などが挙げられる。リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物中で安定に発現し得るように、このポリヌクレオチドに、種々のプロモーター、エンハンサー、翻訳開始コドンをコードするＤＮＡ（ＡＴＧ）またはターミネーターを、適宜組み合わせて付加することが好ましい。
【００６４】
上記のプロモーターとしては、本発明のタンパク質を恒常的あるいは誘導的に発現させるためのプロモーターが挙げられる。
【００６５】
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＲｅｐ．４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８２，Ｃｅｌｌ ３０，７６３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅｌｌ，１９８５，ｎａｔｕｒｅ ３１３，８１０）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３，１１５５）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ １９９３，Ｐｌａｎｔ ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを用い得る。特に好ましい実施形態では、ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーターを使用し得る。
【００６６】
誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、病原性生物の感染や侵入、光、傷害、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現を誘導することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターの例としては、例えば、光照射によって発現を誘導するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，２３５８）、糸状菌・細菌・ウイルスなどの病原性生物の感染や侵入によって発現を誘導するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｘｕ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０，３８７）およびタバコのＰＲタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター（Ｏｈｓｈｉｍａ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２，９５）、低温によって発現を誘導するイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって発現を誘導するイネのｈｓｐ７２，ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（Ｖａｎ Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔａ１９３，５７）、乾燥によって発現を誘導するシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６）、紫外線の照射によって発現を誘導するトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６５１）などが挙げられる。また、上記のイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターおよびタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターは、サリチル酸またはジャスモン酸などの特定の化合物によって、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導されることが公知である。
【００６７】
本発明で使用され得るターミネーターとしては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１）、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｇｉｅｌｅｎ，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３，８３５）などを用い得る。
【００６８】
用語「植物」とは、他に特に示さない限り、完全な植物体のみではなく、その植物体を構成する植物細胞、組織、および器官をも含み得る。本明細書中に出てくる植物の構成要素を示す用語（例えば、根、茎、葉、塊茎、花粉、種子胚、種子、プロトプラスト、カルス、および芽条原基など）は、当業者が通常理解し得る通りの構成物を表す。
【００６９】
植物細胞および植物体への遺伝子導入法としては、通常公知の方法、例えば「Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｄｒａｐｅｒ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９」記載の方法を用いて行うことができる。その例としては、生物的方法（例えば、ウイルスを用いる方法またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（Ｈｏｏｄ，１９９３，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２，２１８、Ｔｏｋｉ Ｓ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５，１６．）など）、物理・化学的方法（例えば、エレクトロポレーション法（Ｔａｄａ，１９９０，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０，４７５）、ポリエチレングリコール法（Ｌａｚｚｅｒｉ，１９９１，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１，４３７）、パーティクル・ガン法（ｓａｎｆｏｒｄ，１９８７，Ｊ．Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．５，２７）など）などが挙げられる。
【００７０】
ポリヌクレオチド導入に使用するための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択し得る。植物細胞としては特に制限はないが、植物体への再分化の系が確立されている、例えば、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコなどの植物細胞が特に好ましい。適当な導入法および植物材料を選択することは、当業者によって容易になされ得る。
【００７１】
植物培養細胞へポリヌクレオチドを導入する場合、材料として代表的にはプロトプラストを用いて、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってポリヌクレオチドの導入が行われる。植物組織へポリヌクレオチドを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など（好ましくは葉、茎、カルス）を用いて、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法、好ましくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法によって、ポリヌクレオチドの導入が行われる。
【００７２】
上記方法により、リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が導入された植物組織または植物細胞から完全な植物を再分化させるには、このような形質転換植物組織または形質転換植物細胞を、再分化培地またはホルモンフリーのＭＳ培地などにおいて培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再分化の方法は、使用される植物組織または植物細胞の種類により異なり、適切な再分化方法の選択は、当業者によって容易になされ得る。様々な文献において、各種の植物（例えば、イネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）など）の再分化の方法が記載されている。
【００７３】
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原性生物に対する抵抗性を有しているか否かは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに記載されている試験方法により容易に確認し得る。例えば、イネいもち病の場合は、実施例８−１に実質的に記載のように、特定のイネ品種にその品種に罹病性のイネいもち病菌のレースを接種した場合の病斑形成や病斑面積率の程度を、原品種と組換え体とを比較することによって検定することが可能であるが、これに限定されることはない。例えば、イネいもち病の抵抗性検定については、今回の実験で使用した噴霧接種法の他に、イネの葉に接種用パンチで穴を開け、その上にいもち病菌胞子のペーストをのせて感染させるパンチ接種法、針の先にいもち病菌胞子ペーストを付けて葉を突き刺す針接種法が挙げられる。これらの接種法では、病斑は葉の傷口から広がるように発病するので、病斑の伸展長を測定することによって、抵抗性強度の検定を行い得る（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。また例えば、白葉枯病の場合は、実施例８−２に実質的に記載のような、白葉枯病細菌懸濁液中に抵抗性を検定する植物の組織（例えば、成葉）を浸漬し、病斑の進行距離を測定する方法、または噴霧接種法、針接種法が挙げられる。いずれの方法においても、葉全体の病斑面積率を測定することによって、発病程度を評価する（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。
【００７４】
上記のような方法でリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を導入し、発現させることにより、病原性生物に対する抵抗性を付与または増強することができる「植物」としては、病原性生物に感染するあらゆる植物を挙げることができる。特定の実施形態では、本発明の方法に従って形質転換される植物は、単子葉植物または双子葉植物である。より詳細には、本発明の方法に従って形質転換される植物の例としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、パンコムギ、ジャガイモ、タバコ、ナス、トマトなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の方法に従って得られる植物、またはその植物器官もしくは植物組織が抵抗性を示す「病原性生物」としては、植物に感染可能なあらゆる病原性生物、例えば、真菌類（糸状菌を含む）、細菌、ウイルスなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００７６】
真菌類としては、イネいもち病菌、イネ紋枯病菌、イネ苗腐病菌、イネ苗立枯病菌、イネばか苗病菌、イネ黄化萎縮病菌、イネごま葉枯病菌、ムギ類さび病類菌、ムギ類うどんこ病菌、ジャガイモ疫病菌、タバコ疫病菌、タバコ灰色かび病菌、タバコ舞病菌、シバ類さび病類菌、立枯病類菌、雪腐病類菌、野菜類の疫病菌、べと病菌、うどんこ病菌、灰色かび病菌、炭そ病菌、苗立枯病菌、根こぶ病菌、カーネーション萎ちょう病菌、キク白さび病菌、ウリ類べと病菌、オオムギ黒穂病菌、ナシ赤星病菌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
病原性細菌としては、イネ白葉枯病細菌、イネ苗立枯細菌病細菌、イネもみ枯細菌病細菌、イネゴマ葉枯病細菌、タバコ空洞病細菌、タバコ野火病細菌、各種野菜類の軟腐病細菌、斑点細菌病細菌、青枯病細菌、インゲンマメかさ枯病細菌、核果類かいよう病細菌、クワ縮葉細菌病細菌、アブラナ科植物黒腐病細菌、カンキツかいよう病細菌、トマトかいよう病細菌、ジャガイモ輪腐病細菌、ジャガイモそうか病細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
病原性ウイルスに起因する病害としては、イネ萎縮病ウイルス、イネ縞葉枯病ウイルス、ムギ斑葉モザイクウイルス病ウイルス、タバコモザイク病ウイルス、タバコ輪点ウイルス病ウイルス、タバコ条斑ウイルス病ウイルス、カリフラワーモザイクウイルス病ウイルス、ジャガイモモザイク病ウイルス、ジャガイモ葉巻病ウイルス、ジャガイモＸウイルス病ウイルス、ジャガイモＹウイルス病ウイルス、キュウリモザイク病ウイルス、キュウリ緑斑モザイク病ウイルス、トマト黄化えそ病ウイルス、ダイズ矮化病ウイルス、エンドウ茎えそ病ウイルス、ビート萎縮病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明の方法に従って得られる植物が示す「少なくとも２つの病原性生物に対する複合病害抵抗性」とは、真菌類、細菌、ウイルスなどの分類群から選択される少なくとも２つの異なる分類に属する少なくとも２つの病原性生物に対する抵抗性を意味する。例えば、少なくとも２つの病原性生物に対する抵抗性としては、病原性真菌類と病原性細菌との組み合わせに対する抵抗性、病原性細菌と病原性ウイルスとの組み合わせに対する抵抗性、真菌類と病原性ウイルスとの組み合わせに対する抵抗性などが挙げられる。
【００８０】
本発明により、植物に導入されたリボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、植物体から植物体へ種子を媒介として後代へと遺伝され得る。このため、本発明の植物体の花粉あるいは子房から形成される種子においても導入したヌクレオチド配列が存在し、遺伝形質が子孫へと受け継がれ得る。従って、本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列が導入された植物は、例えば、種子による増殖によって、病原性生物に対する抵抗性が失われることなく、増殖が可能である。また、植物組織細胞を用いた大量培養法や従来から行われている挿木、接木、株分けなどによっても、病害抵抗性が失われることなく、増殖が可能である。このような増殖によって得られた後代または子孫もまた、本発明によって包含される。
【００８１】
本発明の方法に従って作出された病害抵抗性を有する植物は、各種病原性生物に対する抵抗性を有するために生産性の向上、収量の安定化、品質の向上、農薬使用量の低減化とそれによる生産コストと労働時間の低減化や環境に対する負荷の軽減に効果があると期待される。また、病害抵抗性の性質から、有機栽培農法や農薬使用が困難な発展途上国においても高い収量が確保できると考えられる。また、本発明のリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原性生物に対する抵抗性の機能解明、病害抵抗性を誘導するエリシターの誘導体の開発、およびリボソーム不活性化タンパク質に対する抗体を調製するための抗原を作製するために有用である。
【００８２】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００８３】
【実施例】
（実施例１．ｃＤＮＡライブラリーの作製）
本発明のＲＩＰ ｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡライブラリーの作製を試みた。イネ「日本晴」のカルスをエリシター処理したｃＤＮＡライブラリーは、農業生物資源研究所より供与された（Ｍｉｎａｍｉ，１９９６，ＰｌａｎｔｃｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３７，５６３）。ライ麦、エンバク由来のｃＤＮＡライブラリーは、サリチル酸処理を行った葉から単離したｍＲＮＡから作製した。
【００８４】
ライ麦「初春」、エンバク「太豊」種子を育苗箱に播種し、温室内で発芽させた。第３葉まで生育したときに、第３葉を切り取り、０．５ｍＭサリチル酸の入ったバットにリーフディスクにして浮かべた。３日後、サリチル酸で誘導した葉１２枚（１．２ｇ）からＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて、２００μｇの総ＲＮＡを調製した。この総ＲＮＡからＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて１７μｇのｍＲＮＡを精製した。このうち１０μｇをｃＤＮＡライブラリーの作製に用いた。キットはＺＡＰ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。ｃＤＮＡ合成後、８００ｂｐ以上のフラグメントを回収し、リンカーを結合させ、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にパッケージを行い、大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’で増幅させた。作製したライブラリーには、ライ麦、エンバクそれぞれ１．２×１０5ｐｆｕ／ｍｌ、１．１×１０5ｐｆｕ／ｍｌのファージが含まれていた。
【００８５】
（実施例２．イネＲＩＰ ｃＤＮＡに対するプローブの作製とＰＣＲ）
既知のＲＩＰ遺伝子の塩基配列および翻訳されるアミノ酸配列を独自に解析したところ、ＲＩＰ遺伝子には塩基配列が保存されている領域が存在することが明らかになった。その共通配列を元にして１０個のプライマーを作製した。今回の研究に用いたプライマーはすべてＯ１ｉｇｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を用いた。
【００８６】
これらのプライマーを用いて、イネ「日本晴」のカルスをエリシター処理したｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ反応を行った。０．５μｌのｃＤＮＡライブラリー中の全ＤＮＡを３１μｌの蒸留水に溶解し、５μｌの１０×ＰＣＲバッファー（ロシュ）、８μ１の２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、５μｌの５０ｐｍｏｌ／μｌ 各種プライマー、０．５μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＥｘｐａｎｄＴＭ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ；ロシュ）を加え、最終量５０μｌとし、以下のようにＰＣＲ反応を行った。反応装置はＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（宝酒造）を用いた。反応は、１）変性９５℃；１分、２）再生４４℃；１分、３）伸長７２℃；１分の操作を３０サイクル繰り返して行った。このＰＣＲ反応を２回行い、反応液１５μｌを１．２％ ＴＡＥアガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動後のゲルを０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム溶液で１０分間染色し、紫外線下で観察して、増幅したフラグメントを全て回収した。回収したフラグメントの塩基配列をＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエルマージャパン）と蛍光自動ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（パーキンエルマージャパン）を用いて決定した。
【００８７】
この様にして数十のＤＮＡ増幅フラグメントの塩基配列を決定した結果、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行ったときに増幅される３００ｂｐのＤＮＡフラグメントが、ＲＩＰと相同性を持っていることが判明した。
【００８８】
５’プライマー ５’−ＧＡＣＡＡＣＭＴＳＴＡＣＹＫＳＧＷＧＧＧＣＴＴＣＡ−３’
３’プライマー ５’−ＣＳＶＧＡＣＡＣＳＧＴＳＴＫＧＡＡＣＣＧＣ−３’（Ｍ：Ａ／Ｃ，Ｓ：Ｃ／Ｇ，Ｙ：Ｃ／Ｔ，Ｋ：Ｇ／Ｔ，Ｗ：Ａ／Ｔ，Ｖ：Ａ／Ｃ／Ｇ）
（実施例３．イネＲＩＰ ｃＤＮＡのクローニング）
エリシター処理を行ったイネカルス由来のｃＤＮＡライブラリーから、ＲＩＰｃＤＮＡのスクリーニングを行った。スクリーニングの際の基本的実験操作は、実験書Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に準じて行った。角型シャーレに大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’で溶菌させた約２×１０4個のファージプラークを培養し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）にファージを転写した。ファージが転写されたナイロンメンブレンを８０℃で２時間ベーキングしてＤＮＡを固定した後、実施例２の方法に基づいて増幅させたＤＮＡフラグメントをプローブとして用いてプラークハイブリダイゼーションを行った（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３）。プラークハイブリダイゼーションの検出には、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。得られたシグナルに対応するプラークをＳＭ溶液に懸濁し、さらに２次スクリーニングを行い、単独の陽性クローンを単離した。このクローンのインサート領域の塩基配列を決定すると、ＰＣＲ増幅フラグメントの配列を含む既知のＲＩＰ遺伝子と類似した塩基配列を持つことが判明した（図１）。このｃＤＮＡをＲＩＰ１ ｃＤＮＡと名付けた。さらにＲＩＰ１ ｃＤＮＡをプローブとして用いて、エリシター処理を行ったイネカルス由来のｃＤＮＡライブラリーからＲＩＰ ｃＤＮＡのスクリーニングを行った結果、ＲＩＰ１とは異なる配列を持ったｃＤＮＡが単離された（図２）。このｃＤＮＡをＲＩＰ２ ｃＤＮＡと名付けた。
【００８９】
（実施例４）
（実施例４−１．ライムギ、エンバクＲＩＰｃＤＮＡのクローニング）
実施例１で作製したライムギ、エンバク由来のｃＤＮＡライブラリーからＲＩＰ ｃＤＮＡのスクリーニングを行った。角形シャーレに大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’で溶菌させた約２×１０4個のファージプラークを培養し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）にファージを転写した。ファージが転写されたナイロンメンブレンを８０℃で２時間べーキングしてＤＮＡを固定した後、イネＲＩＰ１ ｃＤＮＡをプローブとして用いてプラークハイブリダイゼーションを行った（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．９８，５０３）。プラークハイブリダイゼーションの検出にはＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。得られたシグナルに対応するプラークをＳＭ溶液に懸濁し、さらに２次スクリーニングを行い、それぞれ単独の陽性クローンを単離した。これらのクローンのインサート領域の塩基配列を決定すると、イネ科ＲＩＰに相同性のある配列を有していた。ライムギ由来のＲＩＰ ｃＤＮＡの塩基配列を図３に、エンバク由来のＲＩＰ ｃＤＮＡの塩基配列を図４に示す。
【００９０】
（実施例４−２．リボソーム不活性化タンパク質の塩基配列および推定アミノ酸配列における相同性決定）
実施例３および４−１において得られたイネＲＩＰ１、ＲＩＰ２、ライムギＲＩＰおよびエンバクＲＩＰのｃＤＮＡ、ならびに既知のリボソーム不活性化タンパク質をコードする塩基配列（オオムギＲＩＰ：Ｌｅａｈ，Ｒ．ら，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１５６４−１５７３（１９９１）；コムギＲＩＰ：Ｈａｂｕｋａ，Ｎ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１）：１７１−１７６（１９９３）；トウモロコシＲＩＰ１：Ｗａｌｓｈ，Ｔ．Ａ．ら，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２３４２２−２３４２７（１９９１）；およびトウモロコシＲＩＰ２：Ｂａｓｓ，Ｈ．Ｗ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７（２）：６６１−６６２（１９９５））を用いて、ＧＥＮＥＴＹＸソフトウェア（ソフトウェア開発株式会社、東京）を使用することにより、塩基配列間および推定アミノ酸配列間の相同性を決定した。塩基配列間および推定アミノ酸配列間の相同性決定の結果を、それぞれ以下の表１および２に示す。
【００９１】
【表１】
【表２】
実施例１〜４の方法でイネから２種類（ＲＩＰ１，ＲＩＰ２）、ライムギ、エンバクからそれぞれ１種類（ライムギＲＩＰ、エンバクＲＩＰ）のＲＩＰ ｃＤＮＡを単離した。これらのＲＩＰ ｃＤＮＡをイネ「どんとこい」に遺伝子導入し、イネの中でＲＩＰを発現させるため、発現ベクターを構築した。形質転換用バイナリーベクターは、ｐＰＺＰ２０２（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．２５，９８９）を用いた。発現ベクター作製の際の基本的実験操作は、実験書Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に準じて行った。形質転換の際に用いたプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、大腸菌はＤＨ５α（東洋紡）を用いた。
【００９３】
ｐＰＺＰ２０２をＨｉｎｄＩＩ一ＢａｍＨＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて ＣａＭＶ３５Ｓ改良型ＲＥＸφプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）または松由来のＰＳＩＩのクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ｃａｂ）をコードする遺伝子のプロモーター（ｃａｂ１プロモーター）（Ｙａｍａｍｏｔｏ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５，７７３）をライゲーションした。ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、ＮＯＳターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１）をライゲーションした。ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、それぞれのＲＩＰのｃＤＮＡをセンスに組み込んだ。最後にＨｉｎｄＩＩ−ＢａｍＨＩ（宝酒造）で処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ：ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｇｒｉｔｚ，１９８３，ｇｅｎｅ ２５，１７９）にＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３，８１０）とＮＯＳターミネーターを連結させた遺伝子を選抜マーカーとして導入した。以上の方法でＲＩＰが高発現する発現ベクターを構築した（図５）。
【００９４】
（実施例６．ＲＩＰ遺伝子導入イネ系統の作出）
イネ、ライムギ、エンバクのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）を高発現させる形質転換植物の作出は、アグロバクテリウムによる方法を用いた（Ｔｏｋｉ Ｓ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １５，１６．Ｈｉｅｉ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｊ．６，２７１）。アグロバクテリウムの系統は、ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８，１２９１）を用いた。
【００９５】
実施例５で構築した発現ベクターを、エレクトロポーレーション法でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１に形質転換した。エレクトロポーレーション装置はＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポーレーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地に懸濁し、２８℃で２時間振盪培養した。この培養液を２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、水酸化ナトリウムでｐＨ５．８に調整）上に拡散し、増殖した形質転換個体を選抜した。
【００９６】
遺伝子導入したアグロバクテリウムを水稲品種「どんとこい」種子、または胚盤由来カルス（４週間）に感染させた。「どんとこい」種子から穎を除いて玄米とし、これを７０％エタノールで１分間殺菌し、滅菌蒸留水で２回洗浄した。さらに、２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で４０分間殺菌し、滅菌蒸留水で２回洗浄した。この玄米を、カルス誘導培地（３０ｇ／ｌ シュクロース、０．３ｇ／ｌ カザミノ酸、２．８ｇ／ｌ プロリン、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを添加し、ｐＨ５．８に調整し、４ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＮ６培地（Ｃｈｕ，１９７４，Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ １８，６５９））上に置床した。玄米を２８℃明所で生育させてカルスを得た。このカルスをアグロバクテリウム感染に用いた。さらにカルス誘導培地に３日間置床した「どんとこい」種子もアグロバクテリウム感染に用いた。
【００９７】
２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１００ｍｇ／ｌ スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地上に２８℃で培養したアグロバクテリウム０．５ｃｍ四方をミクロスパテルでかき取り、１０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴンを含むＡＡＭ培地（Ｔｏｒｉｙａｍａ，１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４１，１７９）に懸濁した。この懸濁液をカルスに注ぎ、２分間浸漬させた。このカルスを水切りした後、１０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴンを含むカルス誘導培地上で、２８℃で３日間培養した。感染後のカルスを滅菌蒸留水で５回洗浄し、余分なアグロバクテリウムを除去した。
【００９８】
アグロバクテリウムを除去したカルスを、選抜培地（５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、３００ｍｇ／ｌ カルベニシリンを含むカルス誘導培地）に２８℃で２週間培養し、再び同じ培地に移し替え、さらに２週間培養した。その結果、遺伝子組換えされたカルスがハイグロマイシン耐性になり、選抜培地上で増殖した。
【００９９】
増殖したカルスを５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、２００ｍｇ／ｌ カルベニシリンを含む再分化培地（３０ｇ／ｌ シュクロース、３０ｇ／ｌ ソルビトール、２ｇ／ｌ カザミノ酸、２０μｇ／ｌ ＮＡＡ、２．２ｍｇ／ｌ カイネチンを添加し、ｐＨ５．８に調整し、４ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ １５，４７３））上に移植した。再分化培地では２８℃で２週間の培養を２回行い、再分化個体を選抜した。
【０１００】
再分化したイネを鉢上げし、５０〜１００系統の再分化個体（Ｔ0）を隔離温室内で生育させた。これを図６に示す。ＡおよびＢともに、左側が原品種「どんとこい」（ＷＴ）であり、右側がリボソーム不活性化タンパク質遺伝子導入系統（それぞれ、ＲＩＰ２６およびＲＩＰ５２）の生育個体である。生育したＲｌＰ遺伝手組換え系統では一部に不稔、矮性化などが生じた。これらの個体は消却し、外見上は原品種とほとんど変わらない個体を耐病性検定に用いた。これらの組換え系統からＴ1種子を採種した。なお、これ本実施例以降、代表としてイネＲＩＰ１遺伝手組換え系統について例示するが、イネＲＩＰ２、ライムギＲＩＰ、エンバクＲＩＰでも同等の結果が観察された。
【０１０１】
（実施例７．Ｔ1世代の非組換え個体の除去）
遺伝の法則からＴ1種子には組換え個体と非組換え個体が、３：１の割合で混合していることが示唆された。このうち、組換え個体はハイグロマイシンに対して抵抗性を有することが推測された。そこで採種したＴ1種子と原品種の「どんとこい」種子を５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシンを含み、４ｇ／ｌ のゲルライトで固化させたＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ １５，４７３）上で発芽させ、２８℃で１週間培養した。培養後のＴ1種子および原品種「どんとこい」種子を図７に示す（Ａ：原品種「どんとこい」（ＷＴ）、ＢおよびＣ：組換え系統（それぞれ、ＲＩＰ２６およびＲＩＰ５２））。実験に使用したハイグロマイシン濃度において、原品種「どんとこい」種子はすべて、ハイグロマイシンの影響を受けて、発芽後黒変し枯死した（図７Ａ）。Ｔ1種子は正常に生育した個体と枯死した個体に分離した。その比率は約３：１であった（図７ＢおよびＣ）。
【０１０２】
以上の結果から、この選抜方法によってＴ1世代の非組換え個体を除去できたと考えられる。また後に行ったゲノミックサザン法による分析の結果、正常に生育したＴ1個体にはイネ、ライムギ、エンバク由来のＲＩＰ遺伝子が導入されていることが確認できた。正常に生育したＴ1世代系統をシードリングケースに鉢上げし、４．５葉期になるまで生育させた。
【０１０３】
（実施例８）
（実施例８−１．いもち病菌の接種と耐病性検定）
いもち病菌の接種は噴霧接種法を用いた（Ｙａｅｇａｓｈｉ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３７）。
【０１０４】
いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ Ｃａｖ．：レース００７）を粉末オートミール培地に移植し、２６℃で培養した。菌叢がシャーレ全面を覆った段階で殺菌水を加え、絵筆で培地表面をこすり、気中菌糸を取り除いた。その後シャーレの蓋を外し、近紫外光を照射して胞子形成を行った（Ｆｕｒｕｔａ，１９６７，Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ２１，１６０）。
【０１０５】
４．５葉期まで生育した原品種個体と組換え体（Ｔ1）の幼苗に、いもち病菌胞子の懸濁液（胞子数５×１０8／ｍｌ）を噴霧し、接種箱内で２６℃で２４時間接種した。接種後の原品種および組換え系統を隔離温室に移動し、病斑を観察した。この噴霧接種検定の結果を、図８（イネＲＩＰ１）、１４（イネＲＩＰ２）、１８（ライムギＲＩＰ）、および２２（エンバクＲＩＰ）に示す。図８の写真中、ＡおよびＢともに、左側の植物群が圃場抵抗性強の品種（トドロキワセ）、中央の植物群が圃場抵抗性中の品種（どんとこい）（ＷＴ）、右側の植物群がイネＲＩＰ１遺伝子組換え系統（それぞれ、ＲＩＰ２６およびＲＩＰ５２）（いずれも接種３週間後）を示す。図１４の写真中、１４Ａが圃場抵抗性強の品種（トドロキワセ）、１４Ｂが圃場抵抗性中の品種（どんとこい）（ＷＴ）、１４ＣがイネＲＩＰ２遺伝子組換え系統（いずれも接種３週間後）を示す。図１４ＢおよびＣは、それぞれＷＴおよびＲＩＰ２遺伝子組換え系統の拡大写真である。図１８の写真中、ＡおよびＢともに、左側の植物群が圃場抵抗性強の品種（トドロキワセ）、中央の植物群が圃場抵抗性中の品種（どんとこい）（ＷＴ）、右側の植物群がライムギＲＩＰ遺伝子組換え系統（それぞれ、ＲＲＩＰ７およびＲＲＩＰ２６）（いずれも接種３週間後）を示す。図２２の写真中、ＡおよびＢともに、左側の植物群が圃場抵抗性強の品種（トドロキワセ）、中央の植物群が圃場抵抗性中の品種（どんとこい）（ＷＴ）、右側の植物群がエンバクＲＩＰ遺伝子組換え系統（それぞれ、ＯＲＩＰ１１およびＯＲＩＰ３４）（いずれも接種３週間後）を示す。耐病性検定は病斑の形状の判定と、病斑面積率の測定を行い、以下に示す病斑指数を用いて解析を行った（Ａｓａｇａ，１９８１，Ｊ．Ｃｅｎｔ．Ａｇｒｉｃ．Ｅｘｐ．Ｓｔｎ．３５，５１）。
【０１０６】
【０１０７】
この結果、組換え体では原品種と変わらない罹病性病斑が認められた。また、組換え体の中にいもち病の進行が遅延する系統が見つかった。これらの個体はいもち病の罹病性病斑が認められるものの、病斑面積率は非常に小さかった。従って、イネ、ライムギ、エンバク由来のＲＩＰ遺伝子細換え系統はいもち病に対して圃場抵抗性型の抵抗性をもたらすことが明らかになった。
【０１０８】
（実施例８−２．白葉枯病菌の接種と耐病性検定）
いもち病菌に対して抵抗性が確認されたイネ、ライムギ、エンバク由来のＲＩＰ遺伝手組換え系統（Ｔ0）の成苗に対して白葉枯病の接種検定を行った。白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ：レース３−Ａ）を、馬鈴薯半合成培地（馬鈴薯３００ｇ、硝酸カルシウム０．５ｇ、リン酸水素ニナトリウム・１２水和物２ｇ、ペプトン５ｇ、ショ糖１５ｇ、寒天２０ｇ、蒸留水１ｌ）で増殖させた。試験管の中に蒸留水１０ｍｌを入れ、白葉枯病菌０．５ｃｍ四方を懸濁させ、接種用の懸濁液を作製した。原品種及びＲｌＰ遺伝子組換え系統（Ｔ0）の成葉の先端を白葉枯病菌の懸濁液に浸したハサミで切り取り、白葉枯病の接種を行った（Ｔｓｕｓｈｉｍａ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２８）。２０日後、葉の先端から白葉枯病が進行した距離を測定することによって、白葉枯病に対する抵抗性を検定した。この結果を図１０、１６、２０および２４に示す。図１０中、ＷＴは原品種（どんとこい）の葉であり、ＲＩＰ１−２６およびＲＩＰ１−５２は、それぞれ組換え系統（Ｔ0）（接種後２０日）の葉である。図１６中、ＷＴは原品種（どんとこい）の葉であり、Ｒｉｃｅ ＲＩＰ２−３０は、組換え系統（Ｔ0）（接種後２０日）の葉である。図２０中、ＷＴは原品種（どんとこい）の葉であり、Ｒｙｅ ＲＩＰ２０は、組換え系統（Ｔ0）（接種後２０日）の葉である。図２４中、ＷＴは原品種（どんとこい）の葉であり、Ｏａｔ ＲＩＰ１６は、組換え系統（Ｔ0）（接種後２０日）の葉である。原品種に比べてＲＩＰ遺伝子組換え系統（Ｔ0）は白葉枯病斑の進展が遅れた（図１０、１６、２０および２４）。この耐病性検定の結果を図１１、１７、２１および２５に示す。図１１において、ＷＴは、原品種（どんとこい）、１−２０、１−２６、１−３４および１−５２は、ＲＩＰ１遺伝子組換え系統である。図１７において、ＷＴは、原品種（どんとこい）、２−１０、２−１８、２−３０および２−４６は、ＲＩＰ２遺伝子組換え系統である。図２１において、ＷＴは、原品種（どんとこい）、Ｒｙｅ４、Ｒｙｅ６、Ｒｙｅ７、Ｒｙｅ８、Ｒｙｅ１０、Ｒｙｅ１２、Ｒｙｅ１４、Ｒｙｅ１６、Ｒｙｅ１８およびＲｙｅ２０は、ライ麦ＲＩＰ遺伝子組換え系統である。図２５において、ＷＴは、原品種（どんとこい）、Ｏａｔ１、Ｏａｔ４、Ｏａｔ５、Ｏａｔ１０、Ｏａｔ１１、Ｏａｔ１６、Ｏａｔ２２、Ｏａｔ２９、Ｏａｔ３２、Ｏａｔ３３はエンバクＲＩＰ遺伝子組換え系統である。これらの結果により、イネ、ライムギ、エンバク由来のＲＩＰ遺伝子組換え系統は白葉枯病に対して抵抗性をもたらすことが明らかになった。
【０１０９】
（実施例９．ゲノミックサザン法によるＲＩＰ遺伝子導入の確認）
原品種及び病害抵抗性が確認されたＲＩＰ遺伝手組換え系統（Ｔ0）の葉身からＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｍｕｒｒａｙ，１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，４３２１）を用いてゲノミックＤＮＡを抽出した。イネ地上部１０ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となったイネを１．５×ＣＴＡＢ液（１．５％ ＣＴＡＢ，７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０，１．０５Ｍ 塩化ナトリウム）と混合し、５６℃で２０分間軽く浸透してＤＮＡを溶出させた後、クロロホルム抽出を２回行ってタンパク質を除去した。この溶液に１／１０容の１０％ ＣＴＡＢ、１．５容の沈殿溶液（１％ ＣＴＡＢ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を加えＤＮＡを析出した。このＤＮＡを、１Ｍ 塩化ナトリウムに溶解し、ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＡでＲＮＡを分解した後、エタノール沈殿を行ってゲノミックＤＮＡを抽出した。
【０１１０】
抽出したゲノミックＤＮＡ（１０μｇ）を制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩで処理し、１．２％アガロースゲルで１８時間電気泳動を行った。泳動後のゲルを加水分解液（０．２５Ｍ ＨＣｌ溶液）に１０分間、アルカリ変性溶液（１．５Ｍ ＮａＯＨ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）に３０分間浸漬して軽く振盪した。その後、アルカリ転写溶液（０．４Ｍ ＮａＯＨ）を用いてＤＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）に転写した。ゲノミックＤＮＡが転写されたナイロンメンブレンを８０℃で２時間べ一キングしてＤＮＡを固定した後、それぞれのＲＩＰ ｃＤＮＡをプローブとして用いてゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３）。サザンハイブリダイゼーションの検出には、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。洗浄条件は、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）の場合には、０．２×ＳＳＣ濃度の洗浄液を使用し、Ａｌｋｐｈｏｓ（アルカリホスファターゼ）の場合には、供給業者の推奨するプロトコールに記載された洗浄液を用いて、５５〜６０℃で洗浄を行った。
【０１１１】
この結果を図１２（Ａ〜Ｃ）に示す。図１２Ａ〜Ｃ中、それぞれ、レーンＭは１ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ、レーン１はＢｇｌＩＩ処理、レーン２はＥｃｏＲＶ処理、レーン３はＮｄｅＩ処理、レーン４はＥｃｏＲＩ処理を示す。
【０１１２】
サザンハイブリダイゼーションの結果、原品種からはＲＩＰプローブとハイブリダイゼーションしたバンドが１つ（イネＲＩＰ１、ＲＩＰ２）もしくは全く確認されなかった（ライムギ、エンバクＲＩＰ）のに対し、組換え個体からは１〜２本のバンドが検出された。従って、これらの組換え系統には少なくとも１コピーのＲＩＰ遺伝子が導入されていることが明らかになった。
【０１１３】
（実施例１０．ノーザン法によるＲＩＰ ｍＲＮＡ発現の確認）
原品種及びＲＩＰ遺伝子組換え系統（Ｔ0）の葉身から、ＣＴＡＢ／ＬｉＣｌ法で総ＲＮＡを抽出した（Ｃｈａｎｇ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ １１，１１３）。イネ地上部２ｇを液体窒素で凍結させた後、乳鉢で粉砕した。粉末状となったイネを１０容の２×ＣＴＡＢ液（２％ ＣＴＡＢ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１．４Ｍ 塩化ナトリウム，１％ メルカプトエタノール）と混合し、６０℃で１０分間軽く浸透してＲＮＡを溶出させた後、クロロホルム抽出を２回行ってタンパク質を除去した。この溶液に１／４容の１０Ｍ 塩化リチウムを加えＲＮＡを析出した。ＲＮＡをＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に溶解させ、フェノール／クロロホルム抽出処理を行った後、上記方法で塩化リチウム抽出をもう一度行い、総ＲＮＡを単離した。
【０１１４】
単離した総ＲＮＡ（３０μｇ）を６．３％ ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロース変性ゲルで電気泳動し、２０×ＳＳＣ（３Ｍ 塩化ナトリウム、３００ｍＭ クエン酸三ナトリウム二水和物）を用いて総ＲＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）に転写した。総ＲＮＡが転写されたナイロンメンブレンに、導入したそれぞれのＲＩＰ ｃＤＮＡをプローブとして用いて、ノーザンハイブリダイゼーションを行った（Ａｌｗｉｎｅ，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５３５０）。ノーザンハイブリダイゼーションの検出には、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。
【０１１５】
これらの結果を、図１３（Ａ〜Ｄ）に示す。ＡおよびＣは、総ＲＮＡ像であり、ＢおよびＤはノーザンハイブリダイゼーション像を示す。Ａ〜Ｄのいずれも、レーンの左から右の順に、Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ、Ｗ：原品種、２６および５２：それぞれ、イネＲＩＰ１遺伝子導入系統を示す。
【０１１６】
ノーザンハイブリダイゼーションの結果、原品種からはＲＩＰプローブとハイブリダイゼーションしたバンドが確認されなかったのに対し、いもち病、白葉枯病に対する抵抗性を示した組換え系統から約１，５００ｂｐのバンドが確認できた（図１３：矢印）。従って、これらの組換え系統にはＲＩＰ ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
【０１１７】
【発明の効果】
本発明により、種々の病原性生物に対する抵抗性を与える遺伝子、この遺伝子を含む発現カセット、この発現カセットを含むベクター、このベクターを保持する植物細胞、この植物細胞を再生して得られた植物体が提供され、さらに病原性生物に対して抵抗性の植物を作出する方法が提供される。
【０１１８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、イネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ１）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ酸配列である。
【図２】図２は、イネのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ２）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ酸配列である。
【図３】図３は、ライムギのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ酸配列である。
【図４】図４は、エンバクのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）ｃＤＮＡの塩基配列及び翻訳されるアミノ酸配列である。
【図５】図５は、ＲＩＰ遺伝子の発現ベクター（ｐＰＺＰ２０２）の構築を示す模式図である。
【図６】図６は、ＲＩＰ遺伝子組換え系統（イネＲＩＰ１組換え系統）の形態を示す生物形態写真である。
【図７】図７は、組換え系統Ｔ1種子のハイグロマイシン選抜（イネＲＩＰ１組換え系統）の形態を示す生物形態写真である。
【図８】図８は、いもち病（レース００７）の噴霧接種検定（イネＲＩＰ１組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図９】図９は、組換え系統のいもち病に対する抵抗性程度（イネＲＩＰ１組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ１組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図１１】図１１は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ１組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ゲノミックサザン法による導入遺伝子の確認（イネＲＩＰ１組換え系統）を示す電気泳動図である。
【図１３】図１３は、ノーザン法によるＲＩＰｍＲＮＡの発現調査（イネＲＩＰ１組換え系統）を示す電気泳動図である。
【図１４】図１４は、いもち病（レース００７）の噴霧接種検定（イネＲＩＰ２組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図１５】図１５は、組換え系統のいもち病に対する抵抗性程度（イネＲＩＰ２組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ２組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図１７】図１７は、白葉枯病の接種検定（イネＲＩＰ２組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、いもち病（レース００７）の噴霧接種検定（ライムギＲＩＰ組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図１９】図１９は、組換え系統のいもち病に対する抵抗性程度（ライムギＲＩＰ組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、白葉枯病の接種検定（ライムギＲＩＰ組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図２１】図２１は、白葉枯病の接種検定（ライムギＲＩＰ組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、いもち病（レース００７）の噴霧接種検定（エンバクＲＩＰ組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図２３】図２３は、組換え系統のいもち病に対する抵抗性程度（エンバクＲＩＰ組換え系統）の結果を示すグラフである。
【図２４】図２４は、白葉枯病の接種検定（エンバクＲＩＰ組換え系統）の結果を示す生物形態写真である。
【図２５】図２１は、白葉枯病の接種検定（エンバクＲＩＰ組換え系統）の結果を示すグラフである。
Claims (3)
- 白葉枯病細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）に対して抵抗性を有する植物を作出するための方法であって、以下からなる群より選択されるリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）をコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１の１４６〜９５５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）該（ａ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３の５４〜８９９位に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）該（ｃ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号５の３５〜８７７位に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）該（ｅ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号７の３７〜８４３位に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）該（ｇ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２の１〜２７０位に記載されるアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）（ｉ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４の１〜２８２位に記載のアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）（ｋ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号６の１〜２８１位に記載のアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）（ｍ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号８の１〜２６９位に記載のアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｐ）（ｏ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド、
を含む発現カセットを含む発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する、方法。 - いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）に対して抵抗性を有する植物を作出するための方法であって、以下からなる群より選択されるリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）をコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１の１４６〜９５５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）該（ａ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３の５４〜８９９位に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）該（ｃ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号５の３５〜８７７位に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）該（ｅ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号７の３７〜８４３位に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）該（ｇ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２の１〜２７０位に記載されるアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）（ｉ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４の１〜２８２位に記載のアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）（ｋ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号６の１〜２８１位に記載のアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）（ｍ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号８の１〜２６９位に記載のアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｐ）（ｏ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド、
を含む発現カセットを含む発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する、方法。 - 白葉枯病細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）といもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）との組み合わせに対して抵抗性を有する植物を作出するための方法であって、以下からなる群より選択されるリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）をコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１の１４６〜９５５位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）該（ａ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３の５４〜８９９位に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）該（ｃ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号５の３５〜８７７位に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）該（ｅ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号７の３７〜８４３位に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）該（ｇ）に示すポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２の１〜２７０位に記載されるアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）（ｉ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４の１〜２８２位に記載のアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）（ｋ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号６の１〜２８１位に記載のアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）（ｍ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号８の１〜２６９位に記載のアミノ酸配列を有するイネのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｐ）（ｏ）に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで該タンパク質は植物病原性生物のｒＲＮＡに対するＮ−グリコシダーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド、
を含む発現カセットを含む発現ベクターを、植物細胞に導入する工程を包含する、方法。
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