WO2011068261A1 - 식물 병원균에 대한 저항성을 증진시키는 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물 병원균에 대한 저항성을 증진시키는 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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이동주
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Definitions

  • the present invention relates to a gene for enhancing resistance to plant pathogens and its use, and more particularly, CaRLK1 ( Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) protein derived from red pepper, a gene encoding the protein, comprising the gene Recombinant vectors, plants transformed with the recombinant vector and seeds thereof, methods of expressing the genes in plants to enhance resistance to plant pathogens, resistance to the protein and resistance to pathogens of plants comprising the genes It relates to a composition for promotion.
  • CaRLK1 Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1
  • Plant receptor-like protein kinase (RLK) genes have over 600 and 1000 genes in the Arabidopsis and rice genomes, respectively, making them a large family in plants. However, animals contain only a small number of receptor tyrosine kinases, which are similar to the plant RLK gene. Recently, Oh et al. (2009. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 106 (2): 658-663) describe a recombinant cytoplasmic domain of brassinosteroid insensitive 1 (BRI1) and its co-receptor BRI1.
  • BRI1 brassinosteroid insensitive 1
  • RLK kinases 1
  • ALK1 autophosphorylate on tyrosine residues, and that certain tyrosine residues appear to play an important role in vivo in plant receptor kinase action.
  • RLK plays an important role in growth, development, cell wall biosynthesis and protective responses. They are defined by the presence of signal sequences, amino-terminal domains with transmembrane regions, and carboxyl-terminal kinase domains (Torii, 2000. Molecular Plant-Microbe Interaction 3: 361-367).
  • Kinase domains of different RLKs share high levels of homology (at least 45% identity at the amino acid level), but their extracellular domains are even more different.
  • SERK3 Arabidopsis somatic embryonic receptor kinase
  • BAK1 brasinosteroid-related kinase 1
  • NADPH oxidase consists of one component that is about 105 kDa.
  • NADPH oxidase homologues include multigene families in rice, tomato and arabidopsis.
  • the first identified plant NADPH oxidase gene was the AtRboh gene.
  • Arabidopsis encodes 10 AtRboh genes.
  • AtRbohD and AtRbohF are known to produce superoxide when invading pathogens (Torres et al., 2002. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 99: 517-522).
  • Miller et al. 2009. Science Signaling. 2 (84): ra45
  • the O 2 ⁇ produced by AtRbohD plays an important role in mediating long-range cell-to-cell communication (fast systemic signaling) in plants. Reported good results.
  • NbRbohA and NbRbohB from Nicotiana Ventamiana ( N. benthamiana ) are also required for H 2 O 2 accumulation and resistance to Phytophthora .
  • SOD Superoxide Dismutase
  • FSD FeSOD
  • MSD MnSOD
  • CSD CuZnSOD
  • LSD1 Lesion irritation One
  • Glutathione S-transferase (GST) (EC 2.5.1.18) conjugates reduced glutathione with a range of toxic compounds to catalyze the removal of toxins from biological foreign bodies and the protection of plant tissues against oxidative damage. It is a family of functional enzymes. Accordingly, their expression is induced by a range of stimuli such as pathogen attack and oxidative stress.
  • Arabidopsis GST1 Has been found to be highly induced by ozone treatment (Sharma & Davis, 1997. Free Radical Biology and Medicine 23 (3): 480-488).
  • Korean Patent Registration No. 10-0764563 discloses a plant disease resistance gene, a vector and a transformant obtained therefrom
  • Korean Patent Registration No. 10-0701302 discloses a plant disease resistance gene Ojipial 1 isolated from wild rice. Amino acid sequences and transformant plants using the same are disclosed, but differ from the genes of the invention.
  • the present invention has been made by the above-described demands, pepper ( Capsicum annuum ) Receptor-like kinase 1 ( CaRLK1 ) And identified functionally. remind CaRLK1 Gene is pathogen, H 2 O 2 Induced by treatment with and SA, RBOH O through the induction of genes 2 - As an important factor in production regulation CaRLK1
  • the present invention was completed by revealing the role of and confirming that it enhances resistance to plant pathogens.
  • the present invention provides CaRLK1 ( Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) protein derived from red pepper.
  • the present invention also provides a gene encoding the protein.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.
  • the present invention also provides a plant transformed with the recombinant vector and seeds thereof.
  • the present invention provides a method for expressing the gene in a plant to enhance the resistance to plant pathogens.
  • the present invention also provides an antibody against the protein.
  • the present invention provides a composition for enhancing resistance to pathogens of plants comprising the gene.
  • the CaRLK1 gene of the present invention can enhance plant resistance to plant pathogens.
  • CaRLK1 shows the identification and sequence analysis of CaRLK1.
  • CaRLK1 smGFP fusion protein is located in the plasma membrane.
  • CaRLK1 is Mn in an in vitro phosphorylation assay 2+
  • Has protein kinase activity in the presence of His-tag fusion protein (0.5 ⁇ g) of CaRLK1-kinase domain (CaRLK1-KD) was added at 5 mM of Mg. 2+ , 5 mM Ca 2+ 5 mM Mn 2+ And 5 mM of Mn 2+ And [ ⁇ - for 60 minutes in the presence or absence of 2 mM pyrophosphate (PPi).
  • PPi 2 mM pyrophosphate
  • 32 Incubated with P] -ATP.
  • Phosphorylated proteins were then separated by SDS-PAGE, transferred to PVDF membranes, radiographed (top) or Coomassie blue stained (bottom). Similar results were obtained in three independent experiments. One representative experiment is presented.
  • FIG. 4 shows a schematic of the cloning of pMBP: CaRLK1 constructs.
  • CaRLK1 Suppressed in overexpressed plants .
  • CaRLK1 Regular topic expression of Pseudomonas syringe fib. Tabashi ( Ps pv tabaci) Inhibited necrotic cell death induced by
  • Pseudomonas syringe fib It shows the effect of enhancing the resistance of CaRLK1 transgenic tobacco to Tabashi ( Ps pv tabaci ).
  • Pseudomonas syringe f Phenotypes of WT (wild type) and CaRLK1 transgenic tobacco for Tabashi .
  • Detection of H 2 O 2 using DAB staining (c) Comparison of host cell death by trypan blue staining.
  • Figure 8 shows the effect of enhancing the resistance of CaRLK1 transgenic tobacco against soil-borne pathogen Ralstonia solanacearum 1931.
  • the present invention provides CaRLK1 ( Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) protein derived from red pepper, which enhances the resistance of plant pathogens.
  • CaRLK1 Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1
  • the range of CaRLK1 protein according to the present invention includes proteins having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 isolated from red pepper and functional equivalents of the proteins.
  • “Functional equivalent” means at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 70% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution, or deletion of the amino acid Is 95% or more of sequence homology, and refers to a protein that exhibits substantially homogeneous physiological activity with the protein represented by SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides a gene encoding the CaRLK1 protein.
  • the CaRLK1 gene of the invention encodes what is presumed to be receptor-like kinase ( CARRLK1 ) with four distinct regions: N-terminal hydrophobic signal peptide (SP), extracellular domain (ECD), transmembrane domain (TM), And cytoplasmic kinase domain (KD) (see FIG. 1B).
  • SP receptor-like kinase
  • ECD extracellular domain
  • TM transmembrane domain
  • KD cytoplasmic kinase domain
  • the CaRLK1 cDNA of the present invention may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the gene has a base sequence having a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, respectively. It may include.
  • the "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the CaRLK1 gene according to the present invention.
  • Recombinant refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene fragments that are not found in their natural form in either the sense or antisense form.
  • Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes have been modified and reintroduced into cells by artificial means.
  • vector is used to refer to a DNA fragment (s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. Vectors can replicate DNA and be reproduced independently in host cells.
  • carrier is often used interchangeably with “vector”.
  • expression vector refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • the recombinant vector is preferably a recombinant plant expression vector.
  • Ti-plasmid vectors which, when present in a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens, can transfer part of themselves, the so-called T-region, into plant cells.
  • a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens
  • Another type of Ti-plasmid vector (see EP 0 116 718 B1) is used to transfer hybrid DNA sequences to protoplasts from which current plant cells or new plants can be produced that properly insert hybrid DNA into the plant's genome. have.
  • a particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is the so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and US Pat. No. 4,940,838.
  • viral vectors such as those which can be derived from double stranded plant viruses (eg CaMV) and single stranded viruses, gemini viruses, etc.
  • CaMV double stranded plant viruses
  • gemini viruses single stranded viruses
  • it may be selected from an incomplete plant viral vector.
  • the use of such vectors can be advantageous, especially when it is difficult to properly transform a plant host.
  • the expression vector preferably comprises one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by chemical methods, and all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinotricin, antibiotic resistance genes such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol.
  • herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinotricin
  • antibiotic resistance genes such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the promoter may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS or histone promoter, but is not limited thereto.
  • the term “promoter” refers to a region of DNA upstream from a structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription.
  • a "plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in plant cells.
  • a “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Constitutive promoters may be preferred in the present invention because selection of the transformants may be made by various tissues at various stages. Thus, the constitutive promoter does not limit the selection possibilities.
  • a conventional terminator may be used, for example nopalin synthase (NOS), rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, agrobacterium Terminators of the octopine gene of agrobacterium tumefaciens, but are not limited thereto.
  • NOS nopalin synthase
  • rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator phaseoline terminator
  • agrobacterium Terminators of the octopine gene of agrobacterium tumefaciens but are not limited thereto.
  • terminators it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of terminators is highly desirable in the context of the present invention.
  • the present invention also provides a plant transformed with the recombinant vector of the present invention.
  • the plant according to the present invention is Arabidopsis, potato, eggplant, tobacco, pepper, tomato, burdock, garland chrysanthemum, lettuce, bellflower, spinach, chard, sweet potato, celery, carrot, buttercup, parsley, Chinese cabbage, cabbage, gall, watermelon, It may be a dicotyledonous plant such as melon, cucumber, pumpkin, gourd, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean, pea or monocotyledonous plant such as rice, barley, wheat, rye, corn, sugar cane, oats, onions, preferably Dicotyledonous plant.
  • the present invention also provides seed of the plant.
  • said seed is a seed of a dicotyledonous plant, more preferably a seed of tobacco.
  • the present invention also provides a method of enhancing resistance to a pathogen of a plant, comprising the step of transforming a plant with a recombinant vector comprising the CaRLK1 gene of the present invention to express the CaRLK1 gene.
  • the pathogen is Pseudomonas syringe fib. Tabasi ( Ps pv tabaci ), Ralstonia solanacearum , and the like, but are not limited thereto.
  • the plant is a dicotyledonous or monocotyledonous plant, preferably a dicotyledonous plant, most preferably tobacco.
  • Plant transformation refers to any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a period of regeneration and / or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species, including both dicotyledonous plants as well as monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells. Methods include calcium / polyethylene glycol methods for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74), electroporation of protoplasts (Shillito RD et al., 1985 Bio / Technol. 3, 1099-1102 ), Microscopic injection into plant elements (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet.
  • Preferred methods according to the invention include Agrobacterium mediated DNA delivery. Especially preferred is the use of the so-called binary vector technology as described in EP A 120 516 and US Pat. No. 4,940,838.
  • the "plant cells” used for plant transformation may be any plant cells.
  • the plant cells may be cultured cells, cultured tissues, cultured organs or whole plants, preferably cultured cells, cultured tissues or cultured organs and more preferably any form of cultured cells.
  • Plant tissue refers to the tissues of differentiated or undifferentiated plants, such as, but not limited to, roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues and various types of cells used in culture, ie single cells, protoplasts. (protoplast), shoots and callus tissue.
  • the plant tissue may be in planta or in an organ culture, tissue culture or cell culture.
  • the invention also provides an antibody against the CaRLK1 protein of the invention.
  • antibody refers to monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, camelised antibodies, chimeric antibodies, single chain Fvs (scFv), single chain antibodies , Single domain antibodies, Fab fragments, F (ab) fragments, disulfide-binding Fvs (sdFv), and antiidiotype (anti-Id) antibodies, and any of the epitope binding fragments described above.
  • antibodies include immunoglobulin molecules and immunologically active immunoglobulin molecule fragments, ie molecules containing antigen-binding sites.
  • Immunoglobulin molecules can be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), class (eg, IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , IgG 4 , IgA 1 , and IgA 2 ) or subclass Can be.
  • Antibodies of the invention can be prepared by cloning the gene of the invention in an expression vector according to a conventional method to obtain a protein, and from the obtained protein by a conventional method. Also included are partial peptides that may be made from such proteins, and the partial peptides of the present invention include at least seven amino acids, preferably nine amino acids, more preferably twelve or more amino acids.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited and a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included as long as they are polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding.
  • the antibody of this invention also contains special antibodies, such as a humanized antibody.
  • the present invention also provides a composition for enhancing resistance to pathogens of plants comprising the CaRLK1 gene of the present invention. Since the CaRLK1 gene of the present invention enhances resistance to plant pathogens, the composition comprising the CaRLK1 gene is capable of enhancing the resistance of plant pathogens.
  • Bacterial populations were measured as presented in Thilmony et al. (1995. Plant Cell 7: 1529-1536) and Thara et al. (1999. Plant J ournal 20: 475-483).
  • a series of diluted suspensions were inoculated by syringe, inoculated, and then 0.785 cm wide per plant. 2 Collected three leaf discs. 10 mM MgCl 2 After crushing the leaf disks in, count the bacterial populations, and serially dilute 100 mg L of bacterial solution.
  • pMBP-1 CaRLK1 constructs (FIG. 4) were transferred to Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens (GV2260).
  • the leaf disks are incubated with Agrobacterium tumefaciens for 10 minutes and 1 mg L in the dark -One 6-benzylaminopurine (BA) And 0.1 mg L -One Transfer to MS medium containing 1-naphthaleneacetic acid (NAA). After 3 days of coculture, the leaf discs were selected in medium (MS, 1 mg L).
  • Plant cell death was detected by modified lactophenol-trypan blue staining as described in Koch and Slusarenko (1990. Plant Cell 2: 437-445).
  • the stock solution of lactophenol-trypan blue contains 10 mL lactic acid, 10 mL glycerol, 10 g phenol and 10 mg trypan blue dissolved in 10 mL deionized distilled water.
  • the working solution was prepared by diluting the stock solution with ethanol (1: 2 v / v).
  • the leaf discs (1 cm in diameter) were stained with lactophenol-trypan blue working solution and placed in a heated water bath and boiled for 4 minutes. The tissue was left overnight and then decolorized with chlorohydrate solution (2.5 g chloral hydrate dissolved in 1 mL distilled water). It was fixed in 50% glycerol and his picture was taken on an optical microscope (Cool Photo Technology, Suwon, South Korea). Three independent replicates were performed for experiments with similar results.
  • Nucleic Acids Research Database 32 D138-D141 estimated that the cDNA was a receptor-like kinase ( CARRL1 ) with four distinct regions: Coding for the N-terminal hydrophobic signal peptide (SP), extracellular domain (ECD), transmembrane domain (TM), and cytoplasmic kinase domain (KD) (FIG. 1B).
  • CARRL1 receptor-like kinase
  • SP N-terminal hydrophobic signal peptide
  • ECD extracellular domain
  • TM transmembrane domain
  • KD cytoplasmic kinase domain
  • Plant RLKs are classified into several subfamily based on their internal kinase domain (IKD) and extracellular domain (ECD). The majority of RLKs have no sequence motifs established in their ECD.
  • CaRLK1 The ECD of a gene has low homology with any other known plant receptor like kinase or any other protein in the protein database.
  • CaRLK1 Contains 27 leucine residues in its ECD (FIG. 1), which cannot be organized into leucine-rich repeat consensus as defined by Kajava (1998. Journal of Molecular Biology 277: 519-527), this being a new type It suggests that it contains the extracellular domain of.
  • Vitis vinifera Two hypothetical proteins (CAN81685 and CAV65965) from CaMK1 have the highest homology with the ECD of CaRLK1 (about 27% identical and 45% similar), and one of four cell wall-related kinases in the LRK10L-1a subfamily. At1g25390 also shows 45% similarity. Accordingly, CaRLK1 The gene belongs to the LRK10L-1a subfamily. Two hypothetical proteins from grapes (CAN81685 and CAV65965) show 70% identity with the IKD (amino acid sequence from 250 to 627) of CaRLK1, respectively.
  • CaRLK1 mRNA expression in pepper was examined whether or not induced by pathogen attack.
  • Bugang is a commercial cultivar, which was used because it provides a sequence tag (http://genepool.kribb.re.kr/new/index.php) that peppers express.
  • Non-Host Pathogens Xag Inoculation with 8ra can induce leaf hypersensitivity (HR) in peppers, Xag Inoculation with 8-13 is not.
  • CaRLK1 Expression was induced 4 hours after inoculation (hpi) and HR-occurrence ( Xag 8ra treatment) and non-HR-generating tissue ( Xag 8-13 treatment) in all cases (FIG. 2A).
  • CaRLK1 The abundance and duration of expression can be attributed to non-HR-generating tissues ( Xag Much stronger and longer in HR-generating tissue (Xag8ra treatment) than in 8-13 treatment (FIG. 2A).
  • PR-4 Expression Park et al., 2001. Molecules and Cells 28: 122-127 was not induced in mock treatment.
  • Xag 8ra or Xag It was initially induced at 4 hpi of 8-13 and much at 8-12 hpi.
  • Example 4 CaRLK1 is a Functional Protein Kinase Using Mn 2+ as Cofactor
  • CaRLK1 encodes a functional protein kinase
  • a kinase assay using recombinant CaRLK1 protein expressed in E. coli was performed.
  • CaRLK1-KD amino acid No. 306-598
  • [ ⁇ - 32 P] ATP 32 P was specifically incorporated into the protein when Mn 2+ was used as cofactor.
  • lower levels of incorporation were observed in the presence of Ca 2+ or Mg 2+ .
  • NPK5 Muranaka et al., 1994. Molecular and Cellular Biology 14: 2958-2965
  • CIPK1 Shi et al., 1999.
  • CaRLK1 cDNA construct was converted to Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation into nicotine. Introduced to T. Ventamiana ( N. benthamiana) . Eight isoline lines from more than 30 lines expressing CaRLK1 were finally selected for resistance to kanamycin (50 mg L ⁇ 1 ) and no morphologically different phenotypes were shown (data not shown). To confirm the presence of the CaRLK1 gene in overexpressed plants, genomic PCR amplification was performed. PCR product (0.5 kb) was detected without any other PCR product in all transgenic lines (data not shown). Transgenic Line 3 (CaRLK1-3) was chosen primarily for further characterization.
  • LSD1 is known to be an important factor in the regulation of predetermined cell suicide (PCD) of plants (Dietrich et al., 1997. Cell 88: 685-694). lsd1 mutants do not limit the spread of cell death under various conditions such as pathogen infection, strong light and treatment of SA. Expression of NbLSD1 transcripts was increased in overexpressing plants compared to wild type (FIG. 5D), suggesting that constitutive expression of LSD under the control of CaRLK1 may inhibit the spread of sandpaper death in overexpressing plants.
  • the putative amino acid sequence of the two genes ( BoLSD1 and BoLSD2 ) from Brassica oleracea shows 85% similarity to that of NbLSD1 (data not shown). Interestingly, the AtLSD1 protein shows 75% similarity to that of NbLSD1 (data not shown).
  • Example 7 Effect of enhancing resistance to various plant pathogens of CaRLK1 transgenic tobacco
  • Plant pathogens include Pseudomonas syringe fib. Ralstonia solanacearum ( Ps pv tabaci ) and soil-borne pathogens were used.
  • Figure 8 shows the effect of enhancing the resistance of CaRLK1 transgenic tobacco against soil-borne pathogen Ralstonia solanacearum 1931.
  • Wild-type Nicotiana benthamiana

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Abstract

본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자, 상기 유전자를 식물에서 발현하여 식물의 병원균에 대한 저항성을 증진시키는 방법, 상기 단백질에 대한 항체 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 병원균에 대한 저항성 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

식물 병원균에 대한 저항성을 증진시키는 유전자 및 이의 용도
본 발명은 식물 병원균에 대한 저항성을 증진시키는 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고추 유래의 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자, 상기 유전자를 식물에서 발현하여 식물의 병원균에 대한 저항성을 증진시키는 방법, 상기 단백질에 대한 항체 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 병원균에 대한 저항성 증진용 조성물에 관한 것이다.
식물 수용체 유사 단백질 키나아제 (RLK) 유전자는, 아라비돕시스 (Arabidopsis) 및 쌀 게놈에서는 각각 600 개 및 1000 개가 넘는 유전자가 있어, 식물에서 큰 패밀리를 이룬다. 그러나, 동물들은 적은 수의 수용체 타이로신 키나아제만을 포함하며, 이는 식물 RLK 유전자와 유사하다. 최근, Oh 등 (2009. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 106(2): 658-663)은 브라시노스테로이드 비감수성 1 (brassinosteroid insensitive 1 (BRI1))의 재조합성 세포질 도메인 및 그의 보조수용체 BRI1-관련 키나아제 1 (BAK1)이 타이로신 잔기 상에서 자가인산화하며, 특정 타이로신 잔기는 식물 수용체 키나아제 작용에 있어서 생체 내에서 중요한 역할을 하는 것으로 보였다고 보고한 바 있다. 식물에서, RLK 는 성장, 발생, 세포벽 생합성 및 방어 반응에 있어서 중요한 역할을 한다. 이들은 신호 서열, 트랜스멤브레인 영역이 있는 아미노-말단 도메인 및 카르복실-말단 키나아제 도메인의 존재로 정의된다 (Torii, 2000. Molecular Plant-Microbe Interaction 3: 361-367). 상이한 RLK 의 키나아제 도메인들은 높은 수준의 상동성을 공유하지만 (아미노산 수준에서 45% 이상의 동일성), 그들의 세포외 도메인들은 더욱더 상이하다. 대부분의 식물 RLK 의 작용은 분류되지 않았지만, 몇가지 RLK 구성원들은 질병 내성 제어 또는 미생물 기원 단백질과의 상호작용에 관련된다 (Zipfel 등, 2006. Cell 125(4): 749-760). 막에 결합되어 있는 세포질의 단백질 키나아제 도메인을 포함하고 있는 상기 유전자들에는, 벼 Xa21 (Song 등, 1995. Science 270: 1804-1806), 밀 LRK10 (Feuillet 등, 1997. Plant J ournal 11: 45-52), 아라비돕시스 체세포 배아형성 수용체 키나아제 (SERK3)/브라시노스테로이드-관련 키나아제 1 (BAK1) (Heese 등, 2007. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 104: 12217-12222) 및 아라비돕시스 FLS2 (Gomez-Gomez & Boller, 2000. Molecules and Cells 5: 1003-1011)가 포함된다. 예를 들어, SERK3/BAK1 는 아라비돕시스에서 FLS2 및 그의 펩티드 유도체 flg22 이 있는 elicitor-dept 복합체에 신속하게 들어간다.
ROS의 신속한 증가는 식물과 병원균 사이의 초기 사건의 표식이다. 원형질막결합성 NADPH 옥시다아제는 ROS, 특히 수퍼옥사이드 음이온 (O2 -)의 생성에서 중요한 역할을 하는데, 이는 산소 분자의 1-전자성 환원에 관련된다. 상기 NADPH 옥시다아제 유전자는 식세포 (호중구 및 대식 세포)에서 동정되었는데, 이들은 침입 병원균 제어의 임무를 맡고 있다 (Vulcano 등, 2004. Journal of Immunology 173(9): 5749-5756). 식물 NADPH 옥시다아제는 약 105 kDa 인 하나의 구성요소로 이루어진다. NADPH 옥시다아제 상동체는 벼, 토마토 및 아라비돕시스에서의 멀티유전자 패밀리를 포함한다. 최초의 동정된 식물 NADPH 옥시다아제 유전자는 AtRboh 유전자였다. 아라비돕시스는 10 개의 AtRboh 유전자를 코딩한다. AtRbohD 및 AtRbohF 는 병원균이 침입하면 수퍼옥사이드를 생성하는 것으로 공지되어 있다 (Torres 등, 2002. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 99: 517-522). 최근, Miller 등 (2009. Science Signaling. 2(84): ra45)은 AtRbohD 에 의해 생성된 O2 - 가 식물에서 장거리에 걸친 세포-대-세포 커뮤니케이션 (신속한 전신성 신호전달)을 매개함에 있어서 중요한 역할을 한다는 좋은 결과를 보고했다. 니코티아나 벤타미아나 (N. benthamiana) 유래의 NbRbohA 및 NbRbohB 는 또한 H2O2 축적 및 파이토프쏘라 (Phytophthora)에 대한 내성에 필요하다.
수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (SOD)는 O2 - 를 H2O2 로의 디스뮤테이션을 촉매한다. 식물은 3 개 클래스의 SOD 를 포함한다: FeSOD (FSD), MnSOD (MSD) 및 CuZnSOD (CSD). 병소 자극 질환1 (LSD1)은 CSD 단백질 유도를 위한 신호전달 경로의 일부이다. 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 (GST) (EC 2.5.1.18)는 환원된 글루타티온을 일정 범위의 독성 화합물에 콘쥬게이션시켜 생체이물에서 독을 제거하고 산화적 손상에 대해 식물 조직을 보호하는 것을 촉매하는 다중기능성 효소의 한 패밀리이다. 이에 따라, 그들의 발현은 병원균 공격 및 산화 스트레스와 같은 일정 범위의 자극으로 유도된다. 아라비돕시스 GST1 의 발현은 오존 처리로 매우 유도된다는 것을 발견했다 (Sharma & Davis, 1997. Free Radical Biology and Medicine 23(3): 480-488).
한국특허등록 제10-0764563호에는 식물 병저항성 유도 유전자，벡터 및 이로부터 얻어지는 형질전환체가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0701302호에는 야생벼로부터 분리한 식물병 저항성 유전자 오지피알1, 그 아미노산 서열 및 이를 이용한 형질전환체 식물이 개시되어 있으나, 본 발명의 유전자와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 고추 (Capsicum annuum) 수용체 유사 키나아제1 (CaRLK1)를 동정하고, 기능적으로 규명했다. 상기 CaRLK1 유전자는 병원균, H2O2 및 SA 를 이용한 처리로 유도했으며, RBOH 유전자의 유도를 통해 O2 - 생성 조절의 중요 인자로서의 CaRLK1 의 역할을 밝혀내고, 식물 병원균에 대한 저항성을 증진시킨다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 식물에서 발현하여 식물의 병원균에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질에 대한 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물의 병원균에 대한 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 CaRLK1 유전자에 의해 식물의 병원균에 대한 식물의 저항성을 증진시킬 수 있다.
도 1은 CaRLK1의 동정 및 서열 분석을 보여준다. (a) CaRLK1 의 예상 아미노산 서열. 신호 펩티드 서열 및 트랜스멤브레인 영역은 진한 글자로 표시되어 있다. 로마 숫자는 Hanks 및 Quinn (1991. Methods In Enzymology 200: 38-62)에 의해 정의된 바와 같은 단백질 키나아제의 11 개의 특징적인 서브도메인을 표시한다. (b) CaRLK1 의 선형의 도식적인 표시는 4 개의 도메인을 나타낸다. SP, 신호 펩티드; ECD, 세포외 도메인; TMD, 트랜스멤브레인 도메인.
도 2는 박테리아 병원균에 대한 CaRLK1 mRNA의 발현을 보여준다. (a) mock solution(1mM MgCl2) 또는 잔토모나스 액소노포디스 피브이. 글리시네스 (Xanthomonas axonopodis pv. glycines) 8ra (비-숙주 병원균) 및 Xag8-13 을 포함하는 용액으로 고춧잎들을 침투시켰다. (b) 거의 동질유전자형인 고추 라인 (Capsicum annuum ECW-20R, 내성; Capsicum annuum ECW, 감수성)을 재료 및 방법에 기재한 바와 같이 고추 점무늬병 병원균으로 침투시켰다. 하나의 블롯을 CaRLK1 프로브에 혼성화시키고, 동일한 블롯을 병원균 감염에 대한 포지티브 마커로서의 PR4b 프로브에 혼성화시켰다. 3 회의 독립적인 실험에서 유사한 결과를 수득했다. 1 개의 대표적인 실험을 제시한다.
도 3은 CaRLK1:smGFP 융합 단백질이 원형질막에 위치한다는 것을 보여준다. CaRLK1는 시험관내 인산화 검정에서 Mn2+ 의 존재 하에서 단백질 키나아제 활성을 갖는다. CaRLK1-키나아제 도메인(CaRLK1-KD)의 His-태그 융합 단백질 (0.5 ㎍)을 5 mM 의 Mg2+, 5 mM 의 Ca2+, 5 mM 의 Mn2+ 및 5 mM 의 Mn2+ 및 2 mM 의 피로포스페이트 (PPi)의 존재 또는 부재 하에 60 분 동안 [γ-32P]-ATP와 인큐베이션했다. 이어서, 인산화된 단백질을 SDS-PAGE 로 분리하고, PVDF 멤브레인에 옮기고, 방사능사진을 찍거나 (상단) 또는 쿠마씨 블루 염색을 했다 (하단). 3 회의 독립적인 실험에서 유사한 결과를 수득했다. 1 개의 대표적인 실험을 제시한다.
도 4는 pMBP:CaRLK1 구축물의 클로닝 모식도를 보여준다.
도 5는 세포 사멸이 CaRLK1 과발현 식물체에서 억제된다는 것을 보여준다. (a) CaRLK1 의 정규 엑토픽 발현은 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci)에 의해 유도되는 괴사성 세포 사멸을 저해했다. (b) CaRLK1 는 슈도모나스 시링게 피브이. 토마토 (P.s.tomato) 균주 T1 에 의해 유도되는 HR-형 세포 사멸을 저해했다. 배양 세포는 10 mM MgCl2 에 다시 현탁시키고, 잎에 침투시켰다 (OD600 = 0.005 또는 0.01). 접종된 영역 내의 숙주 세포는 검게 변하며 사멸했다. 침투 3 일 후 사진을 촬영했다. 4 회의 독립적인 실험에서 유사한 결과가 관찰되었다. (c) 트리판 블루 염색에 의한 세포 사멸의 검출. 4 주령의 잎을 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci)로 침투시켰다. 트리판 블루로 염색한 디스크를 현미경으로 분석했다. 막대는 0.1 cm 를 나타낸다. (d) 과발현 식물에서의 NbLSD1 유전자의 유도 발현. 3 회의 독립적인 실험에서 유사한 결과가 관찰되었다. 1 개의 대표적인 실험을 제시한다.
도 6은 CaRLK1 과발현 식물이 낮은 전해질 유출을 나타낸다는 것을 보여준다. 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci)의 감염 전 (a) 및 후 (b)에 이온 유출을 측정했다. 야생형 및 과발현 식물 유래의 잎 디스크 (직경 1 cm)를 이온 유출 측정에 이용했다. (c) 콜로니 형성 단위/cm2로 본 독성 병원균 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci)의 성장. 데이터는 3 개의 식물체에서의 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 유사한 결과를 제공한 실험을 4 회 반복했다.
도 7은 식물 괴사 병원균인 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci)에 대한 CaRLK1 형질전환 담배의 저항성 증진 효과를 보여준다. (a) 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시에 대한 WT(야생형) 및 CaRLK1 형질전환 담배의 표현형. (b) DAB 염색법을 이용한 H2O2의 검출. (c) 트리판 블루 염색에 의한 숙주 세포 사멸의 비교.
도 8은 토양 매개(soil-borne) 병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum) 1931에 대한 CaRLK1 형질전환 담배의 저항성 증진 효과를 보여준다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 병원균에 대한 저항성을 증진시키는, 고추 유래의 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 CaRLK1 단백질의 범위는 고추로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
또한, 본 발명은 상기 CaRLK1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 CaRLK1 유전자는 4 개의 구별된 영역을 가진 수용체 유사 키나아제 (CaRLK1)로 추정되는 것을 코딩한다: N-말단 소수성 신호 펩티드 (SP), 세포외 도메인 (ECD), 트랜스멤브레인 도메인 (TM), 및 세포질 키나아제 도메인 (KD) (도 1b 참고). 본 발명의 유전자는 CaRLK1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 CaRLK1 cDNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 CaRLK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 이원성(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 저항성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이다.
본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 종자는 쌍자엽 식물의 종자이며, 더욱 바람직하게는 담배의 종자이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 CaRLK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 CaRLK1 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 식물의 병원균에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다. 상기 병원균은 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci), 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum) 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 식물은 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물이며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 가장 바람직하게는 담배이다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 CaRLK1 단백질에 대한 항체를 제공한다. 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 모노클로날 항체, 다중특이적(multispecific) 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화 항체(camelised antibody), 키메라 항체, 단일 체인 Fvs(scFv), 단일 체인 항체, 단일 도메인 항체, Fab 프래그먼트, F(ab) 프래그먼트, 디설피드-결합 Fvs(sdFv), 및 항이디오타입(항-Id) 항체, 및 상기 임의의 에피토프 결합 단편을 말한다. 특히, 항체는 면역 글로불린 분자 및 면역학적으로 활성이 있는 면역글로불린 분자 단편, 즉 항원결합부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 종류(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
본 발명의 항체는 본 발명의 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 CaRLK1 유전자를 포함하는 식물의 병원균에 대한 저항성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 CaRLK1 유전자는 식물 병원균에 대한 저항성을 증진시키므로, 상기 CaRLK1 유전자를 포함하는 조성물은 식물의 병원균에 대한 저항성을 증진시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
식물 생장 및 박테리아 감염
25℃에서 공기 상대습도 50 내지 60%로 하여, 장일 조건 하의 표준 온실 조건 하에서 식물을 생장시켰다. 고추의 접종을 위해, 잔토모나스 액소노포디스 피브이. 글리시네스 (Xanthomonas axonopodis pv. glycines) (Xag) 및 잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 베시카토리아 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) race 3 (Xcv) 의 2×108 cfu mL-1 용액을, 바늘이 없는 주사기를 이용해 잎 조직에 압력을 가하며 침투시켰다. Thilmony 등의 문헌 (1995. Plant Cell 7: 1529-1536) 및 Thara 등의 문헌 (1999. Plant J ournal 20: 475-483)에서 제시한 바와 같이 박테리아 개체군을 측정했다. 일련의 희석한 현탁액을 주사기로 침투시켜 접종시킨 후, 식물마다 넓이가 0.785 cm2 인 3 장의 잎 디스크를 수집했다. 10 mM MgCl2 에서 잎 디스크를 분쇄 후, 박테리아 개체군을 계수하고, 박테리아 용액의 일련의 희석물을 100 mg L-1 리팜피신을 포함하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅했다. 박테리아 세포의 평균 갯수를 접종된 잎의 cfu/cm2 로 표시한다.
RNA 겔 블롯 분석 및 RT-PCR
노던 블롯 분석을 위해, 전체 RNA 를 포름알데히드-포함 아가로스 겔 상에서 분리해 내고, 표준 과정에 따라 나일론 막으로 블롯팅했다. 블롯은 [α-32P]dCTP-표지 프로브로 혼성화했다. CaRLK1-특이적 프로브는 유전자 특이적 프라이머인 CaRLK1proLP 및 CaRLK1proRP를 이용한 PCR 증폭으로 생성시켰다. PR4 의 고추 cDNA 프로브는 고추로부터 미리 분리했다 (Lee 등, 2002. Molecular Plant-Microbe Interaction 15: 540-548). RT-PCR을 위해, 제1가닥 cDNA를 2 ㎍ 의 전체 RNA 로부터 합성하고, PCR 에 의한 증폭에 이용했다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 공개된 프라이머 서열로 제조했다.
니코티아나 벤타미아나의 형질전환
Lee & Zeevaart (2005. Plant Physiology 138: 243-254)의 문헌에 따른 식물 형질전환을 위해, pMBP-1:CaRLK1 구축물(도 4)을 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens (GV2260))에 도입했다. 잎 디스크를 아그로박테리움 투메파시엔스와 함께 10 분 동안 인큐베이션하고, 암실에서 1 mg L-1 6-벤질아미노퓨린 (BA) 및 0.1 mg L-1 1-나프탈렌아세트산 (NAA)을 함유하는 MS 배지에 옮겼다. 3 일간의 공동배양 후, 잎 디스크를 선발 배지 (MS, 1 mg L-1 BA, 0.1 mg L-1 NAA, 100 mg L-1 카나마이신, 및 500 mg L-1 카르베니실린)로 옮겼다. 30 개가 넘는 개별 신초를 잘라내어, 뿌리 유도 배지로 옮겼다 (MS, 0.1 mg L-1 NAA, 100 mg L-1 카나마이신, 및 500 mg L-1 카르베니실린). 작은 식물들 (T1)을 토양에 심고, 온실에서 키웠다. T1 세대를 자가수분시켜 T2 세대를 수득했다. 독립적인 트랜스제닉 라인을 50 mg L-1 카나마이신을 함유하는 1/2 MS 배지에서 선별했다. 3:1 (내성:감수성)의 분리비를 나타내는 각각의 T1 라인을 선별하여, 동질접합 T3 식물을 수득했다. 상기 동질접합 라인들 중 라인 3 을 대표 라인으로 선택했다.
세포 사멸의 조직화학적 검출
식물 세포 사멸을 Koch 및 Slusarenko (1990. Plant Cell 2: 437-445)의 문헌에 기재된 변형된 락토페놀-트리판 블루 염색으로 검출했다. 락토페놀-트리판 블루의 스톡 용액은 10 mL 의 탈이온 증류수에 용해된 10 mL 락트산, 10 mL 글리세롤, 10 g 페놀 및 10 mg 트리판 블루를 함유한다. 작용 용액은 상기 스톡 용액을 에탄올로 희석하여 제조했다 (1:2 v/v). 잎 디스크 (직경 1 cm)를 락토페놀-트리판 블루 작용 용액으로 염색하고, 가열된 수조에 넣어, 4 분 동안 끓여줬다. 조직을 밤새 방치한 후, 클로로히드레이트 용액 (1 mL 증류수에 용해시킨 2.5 g 클로랄 히드레이트)으로 탈색시켰다. 이를 50% 글리세롤에서 고정시키고, 광학 현미경에서 그의 사진을 촬영했다 (시원 광기술, 수원, 대한민국). 유사한 결과를 갖는 실험에 대해 3 회의 독립적인 반복을 수행했다.
실시예 1: CaRLK1 cDNA의 분리
전장(full length) cDNA를 분리하기 위해, 세린/트레오닌 키나아제 단백질에 대해 서열 상동성을 가진, 차별 표시 RT-PCR 로부터 수득한 부분적인 cDNA 단편을 프로브로서 이용하여, 고추 (C. annuum) 유래의 기존 구축된 cDNA 라이브러리를 스크리닝했다. 22 개의 양성 클론을 분리해 내고, 제한효소 절단 및 DNA 서열분석으로 더 분석하여, 2.5 kb 이상의 cDNA 삽입체가 있는 6 개의 클론을 동정해 냈다. 이들 중, 5 개의 클론은 627 개 아미노산의 오픈 리딩 프레임이 있고, 계산된 분자량이 69 kDa 인 전장 단백질을 코딩할 것으로 예측되었다 (도 1a). Pfam (Bateman 등, 2004. Nucleic Acids Research Database 32: D138-D141)를 이용한 예측 단백질의 구조적인 특징의 분석은, 상기 cDNA가 하기와 같은 4 개의 구별된 영역을 가진 수용체 유사 키나아제 (CaRLK1)로 추정되는 것을 코딩한다는 것을 나타낸다: N-말단 소수성 신호 펩티드 (SP), 세포외 도메인 (ECD), 트랜스멤브레인 도메인 (TM), 및 세포질 키나아제 도메인 (KD) (도 1b).
실시예 2: CaRLK1 는 신규한 수용체 유사 키나아제로 추정된다
식물 RLK는 그의 내부 키나아제 도메인 (IKD) 및 세포외 도메인 (ECD)을 근거로 여러개의 서브패밀리로 분류된다. 대다수의 RLK 에는 그의 ECD에서 확립된 서열 모티프가 전혀 없다. CaRLK1 유전자의 ECD는 기타 공지된 식물 수용체 유사 키나아제 또는 단백질 데이터베이스 중의 임의의 기타 단백질과 낮은 상동성이 있다. CaRLK1 은 그의 ECD 내에 27 개의 류신 잔기를 포함하며 (도 1), 이는 Kajava (1998. Journal of Molecular Biology 277: 519- 527)가 정의한 바와 같은 류신-풍부 반복 콘센서스로 조직화될 수 없어, 이것이 새로운 유형의 세포외 도메인을 포함한다는 점을 시사한다. 포도 (Vitis vinifera) 유래의 2 개의 가상적인 단백질 (CAN81685 및 CAV65965)은 CaRLK1 의 ECD 와 가장 높은 상동성을 보이며 (약 27% 동일 및 45% 유사), LRK10L-1a 서브패밀리 중 4 개의 세포벽-관련 키나아제들 중 하나인 At1g25390 도, 45% 유사성을 보인다. 이에 따라, CaRLK1 유전자는 LRK10L-1a 서브패밀리에 속한다. 포도 유래의 2 개의 가상적인 단백질 (CAN81685 및 CAV65965)은, CaRLK1 의 IKD (250 부터 627 까지의 아미노산 서열)와 각각 70% 동일성을 보인다. 흥미롭게도, 벼 (Oryza sativa) 유래의 녹병 저항성 키나아제로 추정되는 Lr10 의 IKD (BAB17345) 및 아라비돕시스 (Arabidopsis) RLK 의 IKD (At1g70250)는 CaRLK1 의 IKD 에 대해 75% 유사성을 나타낸다.
실시예 3: 병원균에 의해 유도된 CaRLK1의 발현
CaRLK1 mRNA 의 발현이 고추 (Capsicum annuum L cv. Bukang)에서의 병원균 공격에 의해 유도되는지 여부를 검사했다. 부강(Bukang)은 시판 재배종으로, 고추가 발현하는 서열 태그 (http://genepool.kribb.re.kr/new/index.php)를 제공하기 때문에 이용했다. 비-숙주 병원균 Xag8ra 를 이용한 접종은 고추에서 잎 과민반응 (HR)을 유도할 수 있으나, Xag8-13 를 이용한 접종은 그렇지 않다. CaRLK1 의 발현은 접종 4 시간 후 (hours post inoculation; hpi) 유도되었으며, HR-발생 (Xag8ra 처리) 및 비-HR-발생 조직 (Xag8-13 처리) 모두에서 지속되었다 (도 2a). 그러나, CaRLK1 발현의 풍부함 및 지속기간은 비 HR-발생 조직 (Xag8-13 처리)에서보다는 HR-발생 조직 (Xag8ra 처리)에서 훨씬 더 강하고 더 길었다 (도 2a). 양성 대조군으로서, PR-4 의 발현 (Park 등, 2001. Molecules and Cells 28: 122-127)은 모방 처리 (mock treatment)에서는 유도되지 않았다. 그러나, Xag8ra 또는 Xag8-13 의 4 hpi에서 최초로 유도되었으며, 8 내지 12 hpi에서 많이 유도되었다.
CaRLK1 발현의 특이성을 평가하기 위해, 고추 재배종 ECW-20R (BS2/BS2) 및 ECW (bs2/bs2)의 잎은 고추 점무늬병 병원균인 잔토모나스 액소노포디스 피브이. 베시카토리아 (Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav)) race3 를 주사기로 침투시켜, avrBS2 유전자를 발현시켰다. Compatible 숙주 (cv ECW)는 24 hpi 까지는 그 어떤 가시적인 반응을 나타내지 않았다. 그 반면, incompatible 숙주 (cv ECW-20R)는 24 시간 내에 HR 를 발생시켰다 (데이터는 나타내지 않음). CaRLK mRNA 의 현저하게 증강된 수준은 4 hpi 에서 incompatible 상호작용에서 검출했으며, 36 시간 동안 높은 수준으로 유지된 반면, compatible 상호작용에서의 CaRLK 전사 수준의 양 및 지속기간은, 4 시간 내지 24 시간에서의 incompatible 상호작용에서의 수준에 도달하지 못했다 (도 2b). 예상한 바와 같이, PR-4 전사물은 ECW-20R (BS2/BS2)에서 상당히 상향조절되었으나, ECW (bs2/bs2)에서는 그렇지 않았다 (도 2b).
실시예 4: CaRLK1은 보조인자로서 Mn2+ 를 이용하는 기능성 단백질 키나아제이다
CaRLK1가 기능성 단백질 키나아제를 코딩하는지 여부를 결정하기 위해, 대장균(E. coli)에서 발현되는 재조합 CaRLK1 단백질을 이용한 키아나제 검정을 수행했다. 재조합 CaRLK1-KD (아미노산 No. 306-598)을 [γ-32P]ATP 와 함께 인큐베이션할 때, 32P 는 Mn2+ 를 보조인자로서 사용했을 때 단백질에 특이적으로 혼입되었다. 대조적으로, Ca2+ 또는 Mg2+ 의 존재하에서는 더 낮은 수준의 혼입이 관찰되었다. NPK5 (Muranaka 등, 1994. Molecular and Cellular Biology 14: 2958-2965), CIPK1 (Shi 등, 1999. Plant Cell 11: 2393-2405) 및 RLK5 (Horn & Walker, 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1208: 65-74)을 포함하는 일부 식물 단백질 키아나제는 Mn2+ 를 보조인자로서 사용했을 때 더욱 활성이 높다. 단백질 키나아제의 저해제로서 사용된 피로인산나트륨은 키나아제 활성을 제거하였다 (도 3). 이러한 데이터들은 CaRLK1-KD 가 기능성 단백질 키나아제를 코딩한다는 것을 뒷받침한다.
실시예 5: 니코티아나 벤타미아나에서의 CaRLK1 의 정규 엑토픽(ectopic) 발현
CaRLK1 의 정규 엑토픽 발현이 또다른 종에서의 식물 방어 반응 및 세포 사멸에 영향을 주는지 여부를 알기 위해, 35S::CaRLK1 cDNA 구축물을 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)-매개 형질전환으로 니코티아나 벤타미아나 (N. benthamiana)에 도입했다. CaRLK1 를 발현하는 30 개가 넘는 라인 유래의 8 개의 동형 라인을 카나마이신 (50 mg L-1)에 대한 내성에 대해 최종적으로 선별했고, 형태적으로 상이한 표현형은 나타내지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 과발현 식물에서의 CaRLK1 유전자의 존재성을 확인하기 위해, 게놈 PCR 증폭을 수행했다. PCR 생성물 (0.5 kb)은 모든 트랜스제닉 라인에서의 임의의 기타 PCR 생성물 없이 검출되었다 (데이터는 나타내지 않음). 트랜스제닉 라인 3 (CaRLK1-3)을 추가 특징분석을 위해 주로 선택했다.
실시예 6: 식물 세포 사멸에 대한 CaRLK1의 정규 엑토픽 발현의 영향
숙주 세포 사멸을 저해할 가능성이 있는 CaRLK1 의 역할을 연구하기 위해, 독성 병원균 (슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci) 균주 11528, OD600 = 0.01 및 0.005)을 이용하여, 5 내지 6 주령 식물체당 3 개 이상의 완전히 성장한 잎을 감염시키고, 트리판 블루 배제법을 이용하여 세포 사멸을 측정했다 (도 5). 놀랍게도, WT 식물체 및 트랜스제닉 대조군으로서의 GFP 과발현 식물체에서는 6 개의 접종된 스팟 중 4 개 스팟 이상이 검게 변하며 사멸했으나, CaRLK1 과발현 식물체에서는 6 개의 접종된 스팟 중 오직 1 개 스팟만이 검게 변하며 사멸했다 (도 5a). 슈도모나스 시링게 토마토 (P.s. tomato) T1 (OD600 = 0.01 및 0.005)를 이용한 감염시, WT 및 GFP 과발현 식물체는 역시 세포 사멸 표현형을 나타냈으나, CaRLK1 과발현 식물체는 약한 세포 사멸 표현형을 나타냈다 (도 5b).
야생형 잎에서의 세포 사멸은 락토페놀-트리판 블루 염색에 의한 강한 염색을 특징으로 한다 (도 5c). CaRLK1 과발현 라인에서의 숙주 세포 사멸은 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci)의 접종 후 24 및 48 시간째 둘다에서 야생형 잎에서보다 훨씬 더 적어서, 세포 사멸의 저해가 CaRLK1 의 특이적인 발현으로 인한 것임을 시사한다 (도 5c).
LSD1 은 식물체의 예정된 세포 자살 (PCD) 조절에 중요한 인자로 공지되어 있다 (Dietrich 등, 1997. Cell 88: 685-694). lsd1 돌연변이체는 병원균 감염, 강한 광선 및 SA의 처리와 같은 여러가지 조건 하에서의 세포 사멸의 확산을 제한하지 못한다. NbLSD1 전사물의 발현은 야생형에 비해 과발현 식물체에서 증가되어 (도 5d), CaRLK1 의 제어 하에서의 LSD 의 구성적인 발현은 과발현 식물체에서의 사포 사멸의 확산을 억제시킬 수 있음을 시사한다. 브라시카 올레라세아 (Brassica oleracea) 유래의 2 개의 유전자 (BoLSD1 및 BoLSD2)의 추정되는 아미노산 서열은 NbLSD1 의 것과 85% 유사성을 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음). 흥미롭게도, AtLSD1 단백질은 NbLSD1 의 것과 75% 유사성을 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음).
과발현 식물체에서 세포 사멸이 억제된다는 것을 확인하기 위해, 전해질 유출을 정량했다. 임의의 병원균 적용이 없을 때, 야생형의 전도도는 CaRLK1 과발현 식물체보다 항상 더 높아서, 과발현 식물체가 항상 자가 생존 또는 자가 방어에 대해 준비되어 있음을 시사한다 (도 6a). 이러한 관찰사항은 병원균 접종 후 감소되는 전해질 유출로 유사하게 반복되는데; CaRLK1 과발현 식물체의 전도도는 그렇게 많이 증가하지 않았다. 그러나, 야생형의 경우, 3 배 증가했다 (도 6b). 이러한 결과는 또한, 락토페놀-트리판 블루 염색 (도 5c)에서 보여준 바와 같이, CaRLK1 가 식물 세포 사멸을 네거티브하게 조절하는 것에 연루되어 있다는 것을 뒷받침한다.
흥미롭게도, 접종 2 내지 3 일 후 (day post inoculation; dpi) 병원균 군체형성은, 예상보다는 더 적은 정도이긴 하지만, CaRLK1 과발현 식물체에서보다는 야생형에서 2 또는 3 배 더 많았다 (도 6c). 이러한 결과는, 과발현 식물체가 병원균 성장을 지연시킴으로써, 야생형 식물체보다는 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci)에 대해 더욱 잘 견딘다는 것을 시사한다. 추가로, 병원성 관련 유전자 (PR1s), SAR8.2 및 NPR 의 발현이 또한 과발현 식물체에서 유도되었다. 이러한 결과는 CaRLK1 가 식물체의 기본 저항성에 연루되어 있을 수 있다는 것을 시사했다.
실시예 7: CaRLK1 형질전환 담배의 각종 식물 병원균에 대한 저항성 증진 효과
CaRLK1 형질전환 담배의 각종 식물 병원균에 대한 저항성 증진 효과를 조사하였다. 식물 병원균으로는 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci) 및 토양 매개(soil-borne) 병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum)을 이용하였다.
도 7은 식물 괴사 병원균인 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시 (P.s. pv tabaci)에 대한 CaRLK1 형질전환 담배의 저항성 증진 효과를 보여준다. 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana) 야생형 및 CaRLK1 과발현 식물을 25℃에서 키웠다. 4주 후에, 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시의 현탁액(OD600=0.1)을 식물 위에 분무하여 식물을 완전히 젖게 하였다. 질병 심각도를 챌린지 분무 후 5 내지 10일에 평가하였다.
슈도모나스 시링게 피브이. 타바시(OD600=0.1)로 챌린지했을 때, 야생형 식물은 세포 사멸 표현형을 나타낸 반면, CaRLK1 과발현 식물은 약한 세포 사멸 표현형을 보여주었다. 야생형 잎은 노란색으로 되었고, 엽록소를 상실하였으며, 많은 사멸 영역이 존재하였다. 그러나, CaRLK1 과발현 식물 잎은 여전히 녹색이었다. DAB 염색의 더 낮은 수준이 야생형 잎보다 CaRLK1 과발현 식물에서 관찰되었다. 상기 결과는 야생형이 CaRLK1 형질전환 식물보다 슈도모나스 시링게 피브이. 타바시에 의해 잘 감염된다는 것을 지지한다. 이는 형질전환 식물이 H2O2를 생성하는 것을 저해한다는 것을 의미한다. 4주된 식물을 독성 병원균 (P.s. pv tabaci 균주 11528, OD600 = 0.1)로 챌린지하고, 트리판 블루 배제법을 이용하여 세포 사멸을 측정하였다. 놀랍게도, WT 식물은 락토페놀-트리판 블루 염색에 의해 강한 염색을 보이는 세포 사멸 표현형을 보여주었다. 그러나, CaRLK1 과발현 식물은 약한 세포 사멸 표현형을 보여주었는데, 이는 세포 사멸의 저해가 CaRLK1의 특이적인 발현에 기인한다는 것을 나타낸다.
도 8은 토양 매개(soil-borne) 병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum) 1931에 대한 CaRLK1 형질전환 담배의 저항성 증진 효과를 보여준다. 야생형 (Nicotiana benthamiana) 및 CaRLK1 과발현 식물을 25℃에서 키웠다. 4주 후에, 랄스토니아 솔라나세아룸 1931의 현탁액(OD600=1)을 침지 접종하였다. 질병 심각도를 챌린지 접종 후 10일에 평가하였다. CaRLK1-3 라인에서는 어떠한 시들음 표현형도 관찰되지 않은 반면, 야생형, NahG, CaRLKxNahG20 (RxG20), 및 CaRLKxNahG31(RxG31)는 세균 시들음병의 원인균인 랄스토니아 솔라나세아룸에 의해 완전히 사멸하였다.
접종 후 12일(12 dpi)에, 야생형, NahG 과발현 라인, 및 교배 라인 (RG20 및 RG31)은 심각한 시들음 증상을 보여준 반면, CaRLK1 과발현 식물은 어떠한 증상도 없었는데, 이는 CaRLK가 토양 매개 병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 1931에 대한 저항성을 증진시키는데 관련된다는 것을 나타낸다.

Claims (9)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 고추 유래의 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 단백질.
  2. 제1항의 CaRLK1 단백질을 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CaRLK1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지진 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
  6. 제5항에 따른 식물체의 종자.
  7. 제4항의 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 CaRLK1 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 식물의 병원균에 대한 저항성을 증진시키는 방법.
  8. 제1항의 CaRLK1 단백질에 대한 항체.
  9. 제2항의 유전자를 포함하는 식물의 병원균에 대한 저항성 증진용 조성물.
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