KR101324712B1 - 식물세포 분열, 세포 총량 및 장수를 증진시키는 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물세포 분열, 세포 총량 및 장수를 증진시키는 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 유전자를 포함하는 식물 세포 분열 촉진 및 세포 총량 증식용 조성물 또는 노화 억제용 조성물, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 식물 세포 분열속도가 촉진되고 세포 총량이 증가한 식물체 및 세포 노화가 억제된 식물체, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질 전환하여 CaRLK1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물 세포 분열 및 세포총량 증가 방법 및 세포 노화 억제 방법에 관한 것이다.

Description

식물세포 분열, 세포 총량 및 장수를 증진시키는 유전자 및 이의 용도 {Genes enhancing plant cell division, cell mass, and longevity, and uses thereof}
본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 유전자 또는 단백질의 신규한 기능 및 용도에 관한 것이다.
보다 상세하게는 고추 유래의 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 유전자를 포함하는 식물 세포 분열 촉진 및 세포 총량 증식용 조성물 또는 노화 억제용 조성물, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 식물 세포 분열속도가 촉진되고 세포 총량이 증가한 식물체 및 세포 노화가 억제된 식물체, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질 전환하여 CaRLK1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물 세포 분열을 촉진시키고 세포 총량을 증가시키는 방법 및 세포 노화 억제 방법에 관한 것이다.
식물 수용체 유사 단백질 키나아제 (RLK, plant receptor-like protein kinase) 유전자는, 아라비돕시스 (Arabidopsis) 및 쌀 게놈에서는 각각 600 개 및 1000 개가 넘는 유전자가 있으며, 식물에서 큰 패밀리를 이룬다. 그러나 동물은 식물 RLK 유전자와 유사한 적은 수의 타이로신 키나아제만을 포함하고 있다. 최근, Oh 등 (2009. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 106(2): 658-663)은 브라시노스테로이드 비감수성 1 (brassinosteroid insensitive 1 (BRI1))의 재조합성 세포질 도메인 및 그의 보조수용체 BRI1-관련 키나아제 1 (BAK1)이 타이로신 잔기 상에서 자가 인산화하며, 특정 타이로신 잔기는 식물 수용체 키나아제 작용에 있어서 생체 내에서 중요한 역할을 하는 것으로 보였다고 보고한 바 있다. 식물에서, RLK 는 성장, 발생, 세포벽 생합성 및 방어 반응에 있어서 중요한 역할을 한다. 이들은 신호 서열, 트랜스멤브레인 영역이 있는 아미노-말단 도메인 및 카르복실-말단 키나아제 도메인의 존재로 정의된다 (Torii, 2000. Molecular Plant-Microbe Interaction 3: 361-367). 상이한 RLK의 키나아제 도메인들은 높은 수준의 상동성을 공유하지만 (아미노산 수준에서 45% 이상의 동일성), 그들의 세포 외 도메인들은 더욱더 상이하다. 대부분의 식물 RLK의 작용은 분류되지 않았지만, 몇 가지 RLK 구성원들은 질병 내성 제어 또는 미생물 기원 단백질과의 상호작용에 관련된다 (Zipfel 등, 2006. Cell 125(4): 749-760).
한편, 천연물을 기초로 한 의약품 개발은 전 세계적으로 이루어지고 있으며, 대표적으로 Taxus속 식물(주목)로부터 개발된 항암제 택솔 (Taxol), 브라질산 뱀독 성분인 터프로티드 (Teprotide)를 기초로 하여 개발된 고혈압 치료제 ACE 억제제 캡토프릴 (Captopril), 미생물로부터 획득한 혈중콜레스테롤 저하제 컴팩틴 (Compactin), 은행잎 추출 혈액순환 장애 치료제 등이 있다. 특히 식물은 유용 물질의 근원으로써 다양한 분야에 영향을 주고 있으며, 최근 약 20여 년 동안 세포 배양 기술과 유전공학 등 첨단기술의 발전과 함께 식물의 산업적 응용이 보다 활발하게 이루어지고 있다. 식물이 생산하는 유용 물질들은 대부분 알칼로이드, 스테로이드, 터프로티드, 석탄산과 같은 이차 대사 산물로서 의약품, 염료, 색소, 향료, 식품 첨가제 등에 이용된다.
그러나 식물에서 유용 물질을 얻기 위하여 식물 재배를 할 경우, 유용물질 생산에 사용 가능한 식물의 양이 한정되어 있으며, 물질 생산에 맞는 기후 풍토의 특이성 때문에 번식이 어렵고, 외부 인자에 의한 영향에 민감하며, 생장 속도가 느려 대량생산이 어려운 문제점이 있었다. 이를 극복하기 위해 재배할 토지가 필요 없고, 고농도의 순수한 물질을 얻을 수 있는 식물 세포 배양을 이용한 유용물질 추출 방법이 이용되었다. 특히 식물세포를 이용하게 될 경우, 동물 세포 배양에서 문제가 되던 고가의 배지나 분리 정제 공정의 문제점을 극복할 수 있고, 환경 조절이 용이하여 대사를 인위적으로 조절해 생산량을 증가시키는 것이 가능하다.
그러나 식물세포 역시 미생물 배양에 비하여 성장 속도가 느리고 생산성이 낮아 상업화에 문제점이 존재하였다. 식물 세포의 생산성을 향상시키기 위하여 세포 생리적 연구, 식물 방어기작의 신호전달체계 연구, 생합성 경로를 이용한 대사공학적 연구 등 다양한 접근 방향으로 연구가 계속되고 있다.
한국특허등록 제10-0990369호에는 식물 스트레스 저항성을 증가시키는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 돌연변이체 및 상기 유전자가 도입된 성장을 촉진시키는 형질전환 식물체가 개시되어 있으며, 한국 특허등록 제10-0871591에는 생장이 촉진된 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1) 형질전환 식물체 및 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1)유전자가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제10-2010-0090135호에는 생장 증진, 내염성 및 노화 조절에 관여하는 고추의 CaHB1 유전자 및 그의 용도가 개시되어 있으나, 본 발명의 유전자와는 상이하다.
이에 본 발명자들은 식물 세포의 생장 속도를 증가시켜 유용물질의 생산량을 증가시키고, 안정적인 세포주를 찾기 위한 연구를 계속한 결과, 고추로부터 유래한 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 유전자를 도입한 형질전환 식물체에서, 상기 유전자를 과발현 시켰을 때 캘러스의 배양 성장속도가 증가하고, 노화가 억제되는 효과를 나타내는 것을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포 분열을 촉진하고, 세포 총량을 배가하고, 노화를 억제하는 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 분열이 촉진되고, 세포 총량이 배가되고, 노화가 억제된 식물체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 분열을 촉진하고, 세포 총량을 배가하고, 노화를 억제하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 유전자를 포함하는 식물 세포 분열 촉진용 및 세포 총량 증식용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 유전자를 포함하는 노화 억제용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 식물 세포 분열이 촉진되고 세포 총량이 증가한 형질전환 식물체를 제공한다.
또한 본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 세포 노화가 억제된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한 본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 CaRLK1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물 세포 분열 촉진 및 세포 총량을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 CaRLK1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 세포의 노화를 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 CaRLK1 유전자를 과발현시킴으로써 세포 분열을 촉진시키고, 세포 총량을 증식시키며, 노화를 억제시키는 효과를 나타낼 수 있기에, 식물세포를 이용하는 의약품 및 화장품관련 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1는 pMBP:CaRLK1 구축물의 클로닝 모식도를 나타낸 것이다.
도 2은 니코티아나 벤타미아나 유래의 형질전환 식물체에서 CaRLK1의 과발현에 의해 캘러스 생장이 증가됨을 보여주는 그림이다. ((A)는 3주 후 캘러스의 크기를 비교한 그림이고, (B)는 캘러스의 중량을 그래프로 나타낸 그림이다.)
도 3는 니코티아나 타바쿰 cv BY-2 유래의 형질전환 세포에서 CaRLK1의 과발현에 의해 생장이 증가됨을 보여주는 그림이다. ((A)는 1주 후 액체 배지에서 세포의 양을 비교한 그림이고, (B)는 세포의 부피를 그래프로 나타낸 그림이고, (C)는 세포의 중량을 그래프로 나타낸 그림이다. (D)는 단위부피당 세포의 총 개수를 그래프로 나타낸 그림이다.)
도 4은 니코티아나 벤타미아나 유래의 형질전환 식물체 또는 니코티아나 타바쿰 cv BY-2 유래의 형질전환 세포에서 CaRLK1을 도입시킨 세포 (RLK1ox)에서만 CaRLK1이 과발현됨을 확인한 그림이다.
도 5는 암조건 하에서 니코티아나 벤타미아나 유래의 형질전환 식물체의 세포 (A), 명조건 하에서 니코티아나 벤타미아나 유래의 형질전환 식물체의 세포 (B) 또는 니코티아나 타바쿰 cv BY-2유래의 형질전환 세포 (C)에서 CaRLK1의 과발현에 의해 캘러스의 노화가 억제됨을 보여주는 그림이다.
도 6은 니코티아나 벤타미아나 유래의 형질전환 식물체에서 CaRLK1 과발현체 (CaRLK1ox) 캘러스가 MV에 의한 산화 스트레스에 대한 저항성이 높음을 확인한 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 고추 유래의 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물 세포 분열 촉진용 및 세포 총량 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 CaRLK1 단백질의 범위는 고추로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
본 발명의 CaRLK1 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. CaRLK1 단백질의 변이체란 CaRLK1 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아세틸화 (acetylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파렌실화 (farnesylation) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다.
상기 CaRLK1 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
또한, 본 발명의 CaRLK1 유전자는 4 개의 구별된 영역을 가진 수용체 유사 키나아제 (CaRLK1)로 추정되는 것을 코딩한다: N-말단 소수성 신호 펩티드 (SP), 세포외 도메인 (ECD), 트랜스멤브레인 도메인 (TM), 및 세포질 키나아제 도메인 (KD). 본 발명의 유전자는 CaRLK1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함하며 게놈 DNA 및 cDNA는 당업계의 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.
게놈 DNA는 예를 들어, CaRLK1 유전자를 가지는 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고 게놈 라이브러리(벡터는 예를 들면 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC, PAC 등이 이용될 수 있다)를 제작하고 상기 라이브러리를 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA(예를들어, 서열번호 2) 를 기초로 제작한 프로브를 이용하여 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA (예를 들어, 서열번호 1) 에 특이적인 프라이머를 작성하고, 이를 이용한 폴리머라제 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행함으로써 제조할 수도 있다.
cDNA는 예를 들어, CaRLK1 유전자를 가지는 세포에서 추출한 mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고, 상기 합성된 cDNA를 λZAP 등의 벡터로 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 상기 cDNA 라이브러리를 전개하여, 상기와 동일하게 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나 또는 PCR을 수행하여 제조할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 CaRLK1 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 CaRLK1 단백질을 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 CaRLK1 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, CaRLK1 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, CaRLK1 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 CaRLK1 단백질을 코딩하는 유전자는 세포 내 전달을 위한 재조합 벡터에 포함되어 제공될 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투메파시엔스 (agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 이원성(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 저항성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스 (agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 CaRLK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 식물 세포 분열이 촉진된 식물체 또는 세포 노화가 억제된 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 보다 바람직하게는 담배이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 CaRLK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 CaRLK1 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 식물 세포의 분열을 촉진하는 방법, 세포 총량 증가 및 노화를 억제하는 방법을 제공한다. 상기 식물은 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물이며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 보다 바람직하게는 담배이다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개 된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체 (protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타 (in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 CaRLK1 유전자를 포함하는 식물세포의 분열을 촉진하는 조성물 및 세포 총량을 증식시키는 조성물, 또는 본 발명의 CaRLK1 유전자를 포함하는 노화를 억제하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 CaRLK1 유전자는 캘러스의 세포 분열을 촉진하여 세포 총량을 배가시키고, 노화를 억제하였으므로, 상기 CaRLK1 유전자를 포함하는 조성물은 식물의 세포 분열을 촉진하고, 세포 총량을 배가시키고 노화를 억제시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 형질전환 식물체 및 형질전환 식물세포의 제조
CaRLK1의 기능을 확인하기 위해 형질전환 식물체를 제조하였다. Lee & Zeevaart (2005. Plant Physiology 138: 243-254)의 문헌에 따른 식물 형질전환을 위해, pMBP-1:CaRLK1 구축물(도 1)을 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens (GV2260))에 넣은 후, CaRLK1 유전자를 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)-매개 형질전환으로 담배과 식물인 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana. benthamiana)에 도입하여 형질전환 식물체를 구축하였다.
대조구로 니코티아나 벤타미아나로부터 유래한 야생형 (WT) 및 녹색형광단백질 (Green fluorescence protein, GFP) 과발현 형질 전환 식물체 (GFPox) 를 사용하였고, 실험구로 CaRLK1 유전자 과발현체인 CaRLK1ox-2 (계통 2)와 CaRLK1ox-3 (계통 3) 식물체를 이용하였다 (Yi et al., 2010). 이 두 계통에서 CaRLK1 유전자의 발현이 잘 되었고, CaRLK1ox-3 (계통 3) 식물체에서 CaRLK1 유전자의 발현이 CaRLK1ox-2 (계통 2)에서 발현보다 더 높았다 (Yi et al., 2010).
식물 세포로는 담배과 식물인 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 유래 야생종 BY-2 세포 (Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow-2)를 형질전환하여 사용하였다 (Nagata et al., 1992; Lee et al., 2002). 카나마이신 (kanamycin)을 선택 마커로 하여, 저항성을 보이는 벡터로 형질전환된 BY-2 세포 (BYK)와 야생형 세포 (BY-2)를 대조구로 사용하였고, 실험구로 CaRLK1 유전자 과발현체인 BY-2 세포 (RLK1ox)를 이용하여 실험하였다.
실시예 1. CaRLK1 과발현이 캘러스 생장에 미치는 영향 분석
1.1. 캘러스 유도
니코티아나 벤타미아나의 야생형 종자 (WT), GFPox 종자 (Green fluorescence protein 과발현체), CaRLK1 유전자 과발현체 (RLK1ox)인 CaRLK1ox-2, CaRLK1ox-3 종자를 70% 에탄올에서 1분, 2% NaClO에서 5분간 세척한 후 멸균한 증류수로 3회 세척하였다. 소독한 종자를 발아용 1/2 MS 배지 (1/2 Murashige & Skoog medium, 3% sucrose, pH 5.7)에 치상하여 열흘간 빛에 노출한 채로 온도 25℃, 습도 100%의 조건에서 발아시켰다 (Lee and Zeevaart, 2005). 발아한 새싹에서 본엽을 캘러스 유도용 MS 배지 (Murashige & Skoog medium, 3% sucrose, pH5.7, 200μg/L 2,4-D, 100μg/L Kinetin)에 치상하여 온도 25℃, 습도 100%의 조건에서 암배양하였다. 캘러스가 유도된 후, 수차례의 계대 배양을 통하여 캘러스를 안정화시키고, 이들을 무작위로 선택하여 실험에 사용하였다.
1.2 캘러스 생장속도 비교
먼저 캘러스를 고체 배지 위에서 계대 배양하여 생장 속도에 미치는 영향을 분석하였다. 도 2A 나타낸 바와 같이 새로운 고체배양액에 옮긴 뒤 약 2-3 주 후부터 RLK1ox 세포들이 WT과 GFPox 세포보다 더 빠르게 증식하였다. 또한, 고체배지에서 3주 동안 배양한 캘러스의 생체중량 (Fresh weight)을 측정한 결과 WT 유래 캘러스와 GFPox 캘러스도 생장하였지만, CaRLK1ox-2 (계통 2)와 CaRLK1ox-3 (계통 3) 캘러스의 생장이 4 배 이상 빠른 것으로 나타났다 (도 2B).
또한 형질전환된 니코티아나 타바쿰 cv BY-2 세포에서 생장 속도에 미치는 영향을 분석하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이 대조구 (BYK) 세포와 CaRLK1 과발현체 (RLK1ox)를 액체 배양액에서 1 주일 동안 키운 후 500 rpm에서 2분간 원심분리 후 생체 부피를 측정하였더니 RLK1ox 세포가 BYK 대조구 세포보다 2.5배 정도 빠르게 성장하였다. 배양 날짜별로 생장 속도를 비교 측정한 결과, 새로운 액체 배지에 접종한 후 3일 째 되는 날부터 RLK1ox 세포가 대조구 (BYK) 세포보다 더 빠르게 생장하였고 배양 후 9 일째에도 RLK1ox 세포는 빠르게 생장하였다 (도 3B). 또한 총 4 주 동안 고체 배지에서 배양하였을 경우에도 RLK1ox 세포가 대조구 (BYK) 세포보다 더 빠르게 생장하였다 (도 3C). 또한 단위 부피당 세포수를 결정하기 위해 세포벽을 제거한 프로토플라스트 (protoplast)로 만들어서 현미경으로 세포수를 센 결과, RLK1ox의 세포수가 단위 부피당 가장 많았으며 (도 3D), 이를 통해 세포분열 속도도 RLK1ox 세포가 야생종 (BY-2)과 BYK 세포보다 더 빠른 것을 확인할 수 있었다.
1.3. CaRLK1 과발현 확인
상기와 같은 결과가 CaRLK1의 발현에 의한 것인지 확인하였다. 먼저 형질전환된 니코티아나 벤타미아나의 캘러스에서 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행하여 CaRLK1의 발현을 확인한 결과, CaRLK1ox 과발현체 (RKL1ox)에서만 CaRLK1 유전자가 발현되었다 (도 4A). NbrRNA 유전자를 정량적 분석을 위한 대조구로 사용하였다. 이를 통해 CaRLK1 유전자가 발현되어 캘러스가 빠르게 생장하였음을 확인할 수 있었다. 또한, 니코티아나 타바쿰 cv BY-2 세포에서 0일과 3 일된 대조구와 RLK1ox 세포에서 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행한 결과, CaRLK1ox 세포 과발현체 (RLK1ox)에서만 CaRLK1 유전자가 발현됨을 확인하였다 (도 4B). NtEF1 유전자를 정량적 분석을 위한 대조구로 사용하였다. 이를 통해 세포의 빠른 성장 속도가 CaRLK1 유전자의 과발현에 의한 것임을 확인할 수 있었다.
실시예 2. CaRLK1 과발현이 노화에 미치는 영향
CaRLK1의 과발현이 노화에 미치는 영향을 분석하였다. 먼저 니코티아나 벤타미아나 유래 캘러스 (야생종-WT, GFPox, 과 RLK1ox 세포 계통)를 새 고체 배양액에 치상한 후 4 주간 배양하고, 노화에 따른 산화 스트레스에 의한 캘러스의 색깔 변화를 관찰하였다. 또한 니코티아나 타바쿰 유래 세포 (BY-2 세포와 RLK1ox 세포)를 새로운 액체 배지에 4 주간 배양하고, 노화에 따른 산화 스트레스에 의한 캘러스의 색깔 변화를 관찰하였다.
도 5A에서 보는 바와 같이, 야생종 캘러스의 색깔이 갈변되었고, 갈색이 가장 진하게 나타났으며, GFPox 캘러스의 색깔도 갈색으로 변하기 시작하였지만 RLK1ox 캘러스들의 색깔은 전혀 변하지 않았다. 도 5B에서 보는 바와 같이, 빛이 있는 조건에서 4 주간 배양하였을 경우에도 야생종 캘러스의 녹색 색깔이 갈변되었지만 RLK1ox 캘러스들의 색깔은 녹색으로서 전혀 갈변하지 않았다. 또한, 도 5C에서 보는 바와 같이, BY-2 캘러스의 색깔은 흑갈색으로 변하여 배양세포가 죽어가는 현상을 보였지만 RLK1ox 캘러스의 배양세포의 색깔은 초기 색깔과 거의 차이가 없었다.
이를 통해 어두운 조건이나 밝은 조건에서 식물종에 상관없이 CaRLK1 유전자의 과발현 캘러스의 노화가 WT과 GFPox 캘러스의 노화보다 느리게 진행됨을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 산화적 스트레스 ( Oxidative stress )에 대한 저항성에 미치는 영향
메틸 비올로겐 (methyl viologen (MV; paraquat))은 세계에서 가장 많이 사용되는 제초제의 일종으로서 생명체 내에서 O2 - 와 H2O2를 생성하여 산화적 스트레스 (oxidative stress)를 유발하여 세포의 사멸을 유발하는 것으로 알려졌다. CaRLK1의 과발현이 MV에 의한 세포 사멸에 효과에 영향을 받는지 확인하기 위하여, MV 농도가 0, 5, 15, 50μM로 포함하는 배지에 야생종 (WT)과 CaRLK1ox 과발현 캘러스를 동일한 크기로 떼어내 옮긴 후 저항성을 발휘하는지 분석하였다.
도 6A에서 나타낸 바와 같이, MV의 농도가 높아질수록 생장 차이가 줄어드는 현상이 관찰되었지만 RLK1ox 캘러스의 생장이 야생종 캘러스보다 빠른 것을 확인하였다. 또한 도 6B에서 나타낸 바와 같이, RLK1ox 캘러스의 갈변 정도가 적어서 CaRLK1ox 캘러스가 MV에 의한 산화스트레스에 대한 저항성이 야생종 캘러스보다 더 높다고 증명하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 고추 유래의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물 세포 분열 촉진 및 세포 총량 증식용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 세포 내 전달을 위한 재조합 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 고추 유래의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaRLK1 (Capsicum annuum Receptor-like Kinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 식물 세포 분열이 촉진되고 세포 총량이 증가한 형질전환 담배 식물체.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 식물체.
  8. 삭제
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  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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