JP5343460B2 - 植物の開花時期制御方法 - Google Patents
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Description
即ち、本発明は、
1.下記の遺伝子構築物が導入されてなる植物に銅イオンを接触させることを特徴とする前記植物の開花時期を制御する方法(以下、本発明誘導発現方法と記すこともある。);
遺伝子構築物;
銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列を含有する遺伝子構築物。前記転写因子が銅イオンにより活性化される第一の転写因子のDNA結合領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する。:
2.銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のDNA結合領域及び転写活性化領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する、前項1記載の方法:
3.銅イオンにより活性化される第一の転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする前項1〜2のいずれかに記載の方法:
<転写因子群>
(1)真核生物由来の転写因子
(2)酵母由来の転写因子
(3)酵母ACE1由来の転写因子
4.第一の転写因子とは異なる転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする前項1〜3のいずれかに記載の方法:
<転写因子群>
(1)ウイルス由来の転写因子
(2)シンプレックスウイルス属に属するウイルス由来の転写因子
(3)単純ヘルペスウイルス由来の転写因子
(4)単純ヘルペスウイルス由来のVP16転写因子
5.開花時期制御に関わる外来遺伝子が、下記の外来遺伝子群から選ばれてなる外来遺伝子であることを特徴とする前項1〜4のいずれかに記載の方法:
<外来遺伝子群>
(1)植物由来の遺伝子
(2)被子植物由来の遺伝子
(3)双子葉植物由来の遺伝子
(4)アブラナ科植物由来の遺伝子
(5)シロイヌナズナ由来の遺伝子
(6)シロイヌナズナFT由来の遺伝子
6.記の遺伝子構築物が、銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列の上流に、プロモーターを付加され構築されてなる遺伝子構築物であることを特徴とする前項1〜5のいずれかに記載の方法:
7.植物の開花時期を制御するための遺伝子構築物であって、
(a)銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子であって、前記転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のDNA結合領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する、前記転写因子をコードする塩基配列と、
(b)前記転写因子により転写を誘導され且つ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子を発現する遺伝子発現カセットと
を有するように構築可能に調製されてなることを特徴とする遺伝子構築物(以下、本発明遺伝子構築物と記すこともある。):
8.銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のDNA結合領域及び転写活性化領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域を含有する、前項7記載の遺伝子構築物:
9.銅イオンにより活性化される第一の転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする前項7又は8に記載の遺伝子構築物:
<転写因子群>
(1)真核生物由来の転写因子
(2)酵母由来の転写因子
(3)酵母ACE1由来の転写因子
10.第一の転写因子とは異なる転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする前項7〜9のいずれかにに記載の遺伝子構築物:
<転写因子群>
(1)ウイルス由来の転写因子
(2)シンプレックスウイルス属に属するウイルス由来の転写因子
(3)単純ヘルペスウイルス由来の転写因子
(4)単純ヘルペスウイルス由来のVP16転写因子
11.開花時期制御に関わる外来遺伝子が、下記の外来遺伝子群から選ばれてなる外来遺伝子であることを特徴とする前項7〜10のいずれかに記載の遺伝子構築物:
<外来遺伝子群>
(1)植物由来の遺伝子
(2)被子植物由来の遺伝子
(3)双子葉植物由来の遺伝子
(4)アブラナ科植物由来の遺伝子
(5)シロイヌナズナ由来の遺伝子
(6)シロイヌナズナFT由来の遺伝子
12.銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列の上流に、プロモーターを付加され構築されてなる遺伝子構築物であることを特徴とする前項7〜11のいずれかに記載の遺伝子構築物:
13.前項7〜12のいずれかに記載の遺伝子構築物が導入されてなることを特徴とする形質転換植物(以下、本発明形質転換植物と記すこともある。):
等を提供するものである。
本発明遺伝子構築物は、植物において、化学物質により開花時期制御に関わる外来遺伝子を誘導発現させ、植物の開花時期を制御するために利用することができる。当該遺伝子構築物は、
(a)銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子(以下、本転写因子と記すこともある。)であって、前記転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のDNA結合領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する、前記転写因子をコードする塩基配列と、
(b)前記転写因子により転写を誘導され且つ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子(以下、本開花制御遺伝子と記すこともある。)を発現する遺伝子発現カセットと、
を有するように構築可能に調製すればよい。このようにして、本発明遺伝子構築物を得ることができる。尚、遺伝子発現カセットとは、宿主細胞中で本開花制御遺伝子等の構造遺伝子が発現可能な一つのユニットである。具体的には例えば、構造遺伝子の上流にプロモーターを、構造遺伝子の下流にターミネーターを付加したものである。
このようなベクターの構築は、通常の遺伝子工学的手法を用いて行えばよい。尚、2つのベクターとして構築する場合には、例えば、前記(a)を第一ベクターとして構築し、また前記(b)を第二ベクターとして構築してもよい。
また更に、本発明遺伝子構築物としては、好ましくは、任意のターミネーターを本転写因子をコードする塩基配列の下流に付加され構築されてなる遺伝子構築物等を挙げることができる。当該ターミネーターとしては、例えば、NOSターミネーター、CR16ターミネーター(特開2000-166577)、ダイズ種子グリシニンターミネーター(特開06-189777)等を挙げることができる。
具体的には例えば、前記(a)及び前記(b)の各要素を有するように構築した1つのベクターを用いて本発明遺伝子構築物を導入してもよいし、前記(a)を有するように構築した第一ベクターと前記(b)を有するように構築した第二ベクターを混合して本発明遺伝子構築物を導入してもよい。また、第一ベクター又は第二ベクターのいずれかを用いて本発明遺伝子構築物の一部を導入した宿主植物に、再度、他方のベクターを用いて残りの本発明遺伝子構築物を導入してもよい。さらに、第一ベクターを用いて本発明遺伝子構築物の一部を導入した個体と第二ベクターを用いて本発明遺伝子構築物の一部を導入した個体とを交配してもよい。第二ベクターを複数種類構築して本発明遺伝子構築物の一部を導入することで、複数種類の開花時期制御に関わる外来遺伝子を同時に誘導発現することも可能である。
前記銅イオンの本発明形質転換植物への接触は、通常の農業用の有害生物防除剤(殺虫剤、殺菌剤、除草剤、植調剤等)や肥料と混合して行うことができる。また、本発明形質転換植物への潅水を兼ねて行うこともできる。
因みに、転写因子は、通常、DNA結合領域と転写活性化領域とを有している。転写活性化領域は、宿主植物の細胞内において、RNAポリメラーゼ複合体のメディエーターをリクルートし、標的遺伝子の転写を活性化するはたらきを有する。本発明誘導発現方法及び本発明遺伝子構造物において、本転写因子は、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のDNA結合領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する。また、本転写因子は、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のDNA結合領域及び転写活性化領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有していてもよい。本転写因子に、第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域を含有させることにより、目的とする外来遺伝子の発現の誘導倍率を高める効果を実現し得る。本発明形質転換植物の開花時期を制御するためには、本開花制御遺伝子の発現の誘導倍率は高いほど好ましい。
<転写因子群>
(1)真核生物由来の転写因子
(2)酵母由来の転写因子
(3)酵母ACE1由来の転写因子
また例えば、candida glabrataのAMT1(Thorvaldsen JL et al、1993、J Biol Chem 268、12512-12518)、Yarrowia lipolyticaのCRF1(Garcia S、2002、J Biol Chem 277、37359-37368)、トウモロコシのSOD遺伝子群を銅イオン依存的に誘導発現させる転写因子(Ruzsa SM et al、2003、Biochemistry 42、1508-1516)等を挙げることができる。
開花を促進する遺伝子としては、例えば、FT、CO、GI、SOC1、AGL24、LD、FCA、FUL、LFY、AP1、TSF、FD等を挙げることができるが、さらに任意の開花を促進する遺伝子が含まれる。また、後述のような開花を遅延する遺伝子の優勢劣性変異やアンチセンス遺伝子及びRNAiを誘発する遺伝子をも挙げることができる。より好ましくは、例えば、光周期依存的促進経路、自立的促進経路、春化依存的促進経路、ジベレリン依存的促進経路などの開花時期決定に関わる夫々の経路を統合する遺伝子であるFT、SOC1、LFY等を利用することが望ましい。より好ましくは、フロリゲンの原因遺伝子であるFT及びその相同遺伝子を利用することが望ましい。
開花を遅延する遺伝子としては、例えば、FLC、FRI、PIE1、TFL2、VIP1-7、LHY、SVP、SPA、CDF1等を挙げることができるが、さらに任意の開花を遅延する遺伝子が含まれる。また、前述のような開花を促進する遺伝子の優勢劣性変異やアンチセンス遺伝子及びRNAiを誘発する遺伝子をも挙げることができる。より好ましくは、例えば、光周期依存的促進経路、自立的促進経路、春化依存的促進経路、ジベレリン依存的促進経路などの開花時期決定に関わる夫々の経路を統合する遺伝子であるFT、SOC1、LFY等の優勢劣性変異やアンチセンス遺伝子及びRNAiを誘発する遺伝子を利用することが望ましい。より好ましくは、フロリゲンの原因遺伝子であるFT及びその相同遺伝子の優勢劣性変異やアンチセンス遺伝子及びRNAiを誘発するを利用することが望ましい。
なお、上述の開花時期制御に関わる遺伝子の詳細については、総説(Kobayashi Y and Weigel D、2007、Genes Dev 21、2371-84、及びPutterill J et al、2004、Bioessays 26、363-373等)に記載されている。
<外来遺伝子に係る塩基配列群>
(1)植物由来の遺伝子
(2)被子植物由来の遺伝子
(3)双子葉植物由来の遺伝子
(4)アブラナ科植物由来の遺伝子
(5)シロイヌナズナ由来の遺伝子
(6)シロイヌナズナFT由来の遺伝子
構成的プロモーターとしては、例えば、CaMV 35Sプロモーター、PG10-90(特開09-131187)、ユビキチンプロモーター(国際公開01/094394)、アクチンプロモーター(国際公開00/070067)等を挙げることができる。また、組織特異的プロモーターとしては、例えば、ダイズ種子グリシニンプロモーター(特開06-189777)、プロラミンプロモーター(国際公開2004/056993)、インゲンマメ種子ファゼオリンプロモーター(国際公開91/013993)、ナタネ種子ナピンプロモーター(国際公開91/013972)、シロイヌナズナSultr2;2プロモーター(Takahashi H et al、2000、Plant J 23、171-82)、アグロバクテリウムrolCプロモーター(Almon E et al、1997、Physiol 115、1599-1607)等を挙げることができる。
<転写活性化領域に係る塩基配列群>
(1)ウイルス由来の転写因子
(2)シンプレックスウイルス属に属するウイルス由来の転写因子
(3)単純ヘルペスウイルス由来の転写因子
(4)単純ヘルペスウイルス由来のVP16転写因子(Triezenberg SJ et al、1988、Genes Dev 2(6)、718-29)
また例えば、GAL4転写因子(Gill G、Ptashne M、1987、Cell 51(1)、121-126)、転写活性化能力を有する人工的に合成されたペプチドAH(Ansari AZ et al、2001、Chem Biol 8(6)、583-592)等を挙げることもできる。
(1)転写因子遺伝子発現カセットの構築
YPD培地(1% 酵母エキス、2% ポリペプトン、2% グルコース)中、30℃で2日間振とう培養した出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae strain AH22)から、ゲノムDNA抽出キット「Genとるくん」(タカラバイオ)を用いてゲノムDNAを抽出した。抽出されたゲノムDNAを鋳型に、2種の特異的プライマー(ACE1-1F、ACE1-1RC)を用いてPCRを行うことにより、ACE1転写因子遺伝子を増幅した。増幅されたACE1転写因子遺伝子を、pBI221(Clontech)のGUS遺伝子と置換し、p35S-ACE1-NOSを作製した。次に、p35S-ACE1-NOSに含まれるNOSターミネーターを、CR16ターミネーター(特開2000-166577)に置換し、p35S-ACE1-CRを作製した。
ACE1-1RC:5'-tggagctcttattgtgaatgtgagttatg-3'(配列番号2)
ACE1-2RC:5'-aactcgagttgtgaatgtgagttatgcg-3’(配列番号3)
VP16-1F:5'-acggctccaccgaccgacgtc-3'(配列番号4)
VP16-1RC:5'-ctacccaccgtactcgtcaattc-3'(配列番号5)
VP16-2F:5'-ggacgaactccacttagacgg-3'(配列番号6)
VP16-2RC:5'-ccgtctaagtggagttcgtcc-3'(配列番号7)
VP16-3F:5'-tactcgagtcaacggctccaccgaccgacgt-3'(配列番号8)
VP16-3RC:5'-aagagctcttacccaccgtactcgtcaattccaag-3'(配列番号9)
VP16-4F:5'-taagatctatcaacggctccaccgaccgacgt-3'(配列番号10)
プラスミドCaMV35S-sGFP(S65T)-NOS3'(「植物の細胞を観る実験プロトコール」 福田裕穂他監修、1997年、秀潤社、ISBN 4-87962-170-6)からsGFP遺伝子を切り出し、アダプター(NS-1F、NS-1RC)を使用して、pBI221のGUS遺伝子と置換、p35S-sGFPを作製した。p35S-sGFPに含まれるCaMV35Sプロモーターの-830bpから-91bpまでの領域を、合成オリゴヌクレオチド(MRE-1F、MRE-1RC)に置換し、pMRE/35S(-90)-sGFPを作製した。
pMRE/35S(-90)-sGFPを制限酵素EcoRVで処理した後、「Calf intestine Alkaline Phosphatase」(タカラバイオ)で脱リン酸化した。そこへ、「Blunting Kination Ligation kit」(タカラバイオ)を用いて平滑末端化及びリン酸化した合成オリゴヌクレオチド(MRE-1F、MRE-1RC)を挿入することで、MRE配列を順向きに2回繰返して配置させた。得られたMRE配列の2回繰返し部分を切り出し、上記と同様の方法で平滑末端化し、再度EcoRVサイトに挿入した。これにより、MRE配列を順向きに4回繰返して配置させたpMRE4/35S(-90)-sGFPを作製した。
他方では、CaMV35Sプロモーターの-90bpから-1bpまでの領域に存在するas-1サイト(Benfey PN & Chua NH、1990、Science 250、959-966)に変異が導入された配列と置換した。まず、NASCより購入した組換えシロイヌナズナ(No.N70016)からゲノムDNAを抽出した。抽出されたゲノムDNAを鋳型に、2種の特異的プライマー(90m-1F、90m-1RC)を用いてPCRを行うことにより、as-1サイトに変異を持つ35S(-90m)配列をpCR2.1(Invitrogen)にTAクローニングし、pCR2.1-35S(-90m)を作製した。pCR2.1-35S(-90m)を鋳型に、2種の特異的プライマー(90m-2F、90m-2RC)を用いてPCRを行うことにより、5’末端にEcoRVサイトを付加し3’末端にXbaIサイトを付加した。得られたDNA断片を、pMRE4/35S(-90)-sGFPの4回繰返し配置させたMRE配列の下流に位置するCaMV35Sプロモーターの-90bpから-1bpまでの領域と置換し、pMRE4/35S(-90m)-sGFPを作製した。
pMRE4/35S(-46)-sGFP又はpMRE4/35S(-90m)-sGFPを夫々制限酵素HindIIIで処理した後、「Blunting Kination Ligation kit」を用いて平滑末端化及びリン酸化し、そこへ合成オリゴヌクレオチド(KXS-1F、KXS-1RC)を挿入、pKXS-MRE4/35S(-46)-sGFP又はpKXS-MRE4/35S(-90m)-sGFPを作製した。
NS-1RC:5'-gactgagctcgc-3'(配列番号12)
MRE-1F:5'-agcttagcgatgcgtcttttccgctgaaccgttccagcaaaaaagactagat-3'(配列番号13)
MRE-1RC:5'-atctagtcttttttgctggaacggttcagcggaaaagacgcatcgcta-3'(配列番号14)
46bp-1F:5'-tagatatcgcaagacccttcctctatataagg-3'(配列番号15)
46bp-1RC:5'-atcctctagagtcccccgtgttc-3'(配列番号16)
90m-1F:5'-gctatgaccatgattacgccaagcttg-3'(配列番号17)
90m-1RC:5'-cattgttatatctccttggatccgtcg-3'(配列番号18)
90m-2F:5'-tagatatctccacgtccataagggac-3'(配列番号19)
90m-2RC:5'-aatctagactgcaggtcgtcctctcca-3'(配列番号20)
KXS-1F:5'-ggtacctcgagtcgac-3'(配列番号21)
KXS-1RC:5'-gtcgactcgaggtacc-3'(配列番号22)
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)を改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天)に播種し、23℃で3週間生育させた。得られた植物を、予め培土が入れられたポットに移植し、人工気象器内で生育させた。移植後2週間目の植物の花芽及び本葉から、植物RNA抽出キット「RNeasy Plant Mini Kit」(QIAGEN)を用いて全RNAを抽出した。抽出された全RNAから、cDNA合成キット「ReverTra Ace」(TOYOBO)を用いてcDNAを合成した。合成されたcDNAを鋳型に、2種の特異的プライマー(FT-1F、FT-1RC)を用いてPCRを行うことにより、FT遺伝子(GenBank Accession Number AB027504)を増幅した。増幅されたFT遺伝子を、pBI221(Clontech)のGUS遺伝子と置換した。このようにして得られたプラスミドを鋳型に、6種の特異的プライマー(FT-2F、FT-2RC、FT-3F、FT-3RC、FT-4F、FT-1RC)を用いてfusion PCRを行うことにより、FT遺伝子内部に存在するBamHIサイト及びEcoRIサイトにアミノ酸置換を伴わない変異を導入し且つ5’末端のXbaIサイトをBamHIサイトに変更した。このようにして得られた改変FT遺伝子を、pKXS-MRE4/35S(-90m)-sGFPのsGFP遺伝子と置換することにより、pKXS-MRE4/35S(-90m)-FTを作製した。
FT-1RC:5'-atagagctcctaaagtcttcttcctccg-3'(配列番号24)
FT-2F:5'-taaggatccatgtctataaatataagagaccctc-3'(配列番号25)
FT-2RC:5'-gaacatctggatcgaccataaccaaagta-3'(配列番号26)
FT-3F:5'-tactttggttatggtcgatccagatgttc-3'(配列番号27)
FT-3RC:5'-gacacgatgaatacctgcagtggga-3'(配列番号28)
FT-4F:5'-tcccactgcaggtattcatcgtgtc-3'(配列番号29)
転写因子遺伝子発現カセットを含むp35S-ACE-CR又はp35S-ACE1DBD/VP16AD-CR、p35S-ACE1/VP16AD-CRを制限酵素HindIII及びEcoRIで処理し、転写因子遺伝子発現カセットを切り出した。また、sGFP遺伝子発現カセットを含むpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFP又はpKXS-MRE4/35S(-90m)-sGFP、FT遺伝子発現カセットを含むpKXS-MRE4/35S(-90m)-FTを制限酵素KpnI及びEcoRIで処理し、夫々sGFP遺伝子発現カセット又はFT遺伝子発現カセットを切り出した。
一方、pBI121(Clontech)に含まれるGUS遺伝子発現カセットを、合成オリゴヌクレオチド(HEK-1F、HEK-1RC)に置換し、pBI121-HEKを作製した。pBI121-HEKを制限酵素HindIII及びKpnIで処理した。制限酵素HindIII及びKpnIで処理したpBI121-HEKに、切り出した転写因子遺伝子発現カセットとsGFP遺伝子発現カセット又はFT遺伝子発現カセットとをライゲーションすることにより、転写因子遺伝子発現カセットとsGFP遺伝子発現カセット又はFT遺伝子発現カセットとが、夫々のターミネーター側で連結したバイナリーベクターを得た(図1参照)。p35S-ACE1-CRとpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFPを由来とするものをベクター(a)、p35S-ACE1DBD/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFPを由来とするものをベクター(b)、p35S-ACE1/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFPを由来とするものをベクター(c)、p35S-ACE1/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-90m)-sGFPを由来とするものをベクター(d)、p35S-ACE1/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-90m)-FTを由来とするものをベクター(e)とした。
HEK-1RC:5'-aattgagctcgtcctaggtaccgtcgacgaattca-3'(配列番号31)
(1)組換えタバコ培養細胞の作製及び選抜
実施例1で作製されたベクター(a)、(b)、(c)、及び(d)がコーティングされた直径1.0μmの金粒子を用いたパーティクルガン法(森川弘道ら著、1992年、植物細胞工学 Vol.4 No.1 p.47-52、秀潤社)により、前記ベクターをそれぞれタバコ培養細胞(BY-2)に導入した。金粒子1mg当たりのDNA量は0.1μgとした。遺伝子導入されたタバコ培養細胞の細胞懸濁液を、遺伝子導入操作後3〜5日目に、30 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、3% ショ糖、1μM 2,4-D、1 mg/L thiamin・HCl、100 mg/L myo-inositol、200 mg/L KH2PO4、0.8 % 寒天)に広げた。培養1ヵ月間後に、30 mg/L カナマイシンに耐性を示す細胞塊を選抜し、選抜された細胞塊をその後1〜2週間毎に新しい寒天培地に植え継ぎながら4〜8週間培養した。培養条件は、暗下、23〜25℃とした。
得られた細胞塊を、誘導発現処理区として100μM CuSO4を含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、3% ショ糖、1μM 2,4-D、1 mg/L thiamin・HCl、100 mg/L myo-inositol、200 mg/L KH2PO4、0.8 % 寒天)に移植することにより、銅イオンによる目的とする外来遺伝子の誘導発現のための処理(以下、誘導発現処理と記すこともある。)を行った(尚、非誘導発現処理区として CuSO4を含まない改変MS寒天培地を用いた。)。
その後、当該誘導発現処理3日間後の細胞塊について、蛍光顕微鏡(Nikon)にて、GFPの蛍光発光状態を調べた。
ベクター(a)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞では、誘導発現処理区でのGFPの蓄積量が非誘導発現処理区でのGFPの蓄積量と比較して2倍(以下、ベクター(a)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と記すこともある。)であった。ACE1転写因子のACE1ADをVP16ADに置換したベクター(b)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞では、誘導発現処理区でのGFPの蓄積量が非誘導発現処理区でのGFPの蓄積量と比較して4倍(以下、ベクター(b)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と記すこともある。)であり、またベクター(a)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と比較して2倍の改善が認められた。
一方、ACE1転写因子にVP16ADが付加されたベクター(c)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞では、誘導発現処理区でのGFPの蓄積量が非誘導発現処理区でのGFPの蓄積量と比較して18倍(以下、ベクター(c)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と記すこともある。)であり、またベクター(a)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と比較して9倍の改善が認められた。
また、as-1サイトに変異を持つ35S(-90m)配列が用いられたベクター(d)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞では、誘導発現処理区でのGFPの蓄積量が非誘導発現処理区でのGFPの蓄積量と比較して18倍(以下、ベクター(d)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と記すこともある。)であり、またベクター(a)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と比較して9倍の改善が認められた。
(1)組換えシロイヌナズナの作製及び選抜
実施例1で作製されたベクター(e)をアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens strain C58C1)に導入した。得られたアグロバクテリウムを50 mg/L カナマイシン、100 mg/L アンピシリン、100 mg/L リファンピシンを含むLB寒天培地(0.5% 酵母エキス、1.0% バクトトリプトン、0.5% 食塩、1% 寒天)で培養して薬剤耐性コロニーを選抜することにより、組換えアグロバクテリウムを得た。得られた組換えアグロバクテリウムを、モデル植物ラボマニュアル(岩渕雅樹他編集、2000年、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、ISBN 4-431-70881-2 C3045)に記載される方法に準じて、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)に感染させることにより、遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたシロイヌナズナから採取されたT1種子を、20 mg/L ベンレート、200 mg/L クラフォラン、25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、1% ショ糖、0.8 % 寒天)に播種し生育した後、カナマイシンに耐性を示す植物個体を選抜した。選抜された植物個体を予め培土が入れられたポットに移植し、人工気象器内で生育させることにより、T2種子を得た。得られたT2種子を25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天)に播種し生育した後、χ2検定に基づいた5%の有意水準において、カナマイシンに耐性を示す植物個体が3:1の割合で出現するラインを選抜した。尚、植物個体の生育のための培養条件は、明期23時間、暗期1時間、23〜25℃とした。
選抜されたラインについて、T2種子を、改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天)に播種した。明期23時間、暗期1時間、23〜25℃の条件下で11日間生育させた植物個体を誘導発現処理区として50μM CuSO4を含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8 % 寒天)に移植することにより、銅イオンによる目的とする外来遺伝子の誘導発現のための処理(以下、誘導発現処理と記すこともある。)を行った(尚、非誘導発現処理区として CuSO4を含まない改変MS寒天培地を用いた。)。
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号2
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号6
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号8
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号9
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号10
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号11
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号12
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号13
置換DNA断片のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号14
置換DNA断片のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号15
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号16
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号17
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号18
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号19
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号20
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号21
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号22
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号23
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号24
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号25
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号26
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号27
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号28
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号29
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号30
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号31
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
Claims (5)
- 下記の遺伝子構築物が導入されてなる植物に銅イオンを接触させることを特徴とする前記植物の開花時期を制御する方法。
遺伝子構築物;
(a)銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列と、
(b)前記転写因子により転写を誘導され且つ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子を発現する遺伝子発現カセットと
を有するように構築可能に調製されてなる遺伝子構築物であって、
前記転写因子をコードする塩基配列が、ACE1転写因子遺伝子と、その下流に連結してなるVP16AD遺伝子とを含有することを特徴とする遺伝子構築物。 - 開花時期制御に関わる外来遺伝子が、下記の外来遺伝子群から選ばれてなる外来遺伝子であることを特徴とする請求項1記載の方法。
<外来遺伝子群>
(1)植物由来の遺伝子
(2)被子植物由来の遺伝子
(3)双子葉植物由来の遺伝子
(4)アブラナ科植物由来の遺伝子
(5)シロイヌナズナ由来の遺伝子
(6)シロイヌナズナFT由来の遺伝子 - 植物の開花時期を制御するための遺伝子構築物であって、
(a)銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列と、
(b)前記転写因子により転写を誘導され且つ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子を発現する遺伝子発現カセットと
を有するように構築可能に調製されてなり、
前記転写因子をコードする塩基配列が、ACE1転写因子遺伝子と、その下流に連結してなるVP16AD遺伝子とを含有することを特徴とする遺伝子構築物。 - 開花時期制御に関わる外来遺伝子が、下記の外来遺伝子群から選ばれてなる外来遺伝子であることを特徴とする請求項3記載の遺伝子構築物。
<外来遺伝子群>
(1)植物由来の遺伝子
(2)被子植物由来の遺伝子
(3)双子葉植物由来の遺伝子
(4)アブラナ科植物由来の遺伝子
(5)シロイヌナズナ由来の遺伝子
(6)シロイヌナズナFT由来の遺伝子 - 請求項3または4記載の遺伝子構築物が導入されてなることを特徴とする形質転換植物。
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