CN101631868B - 用于在单子叶植物中调节胚特异性表达的核酸序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农业生物技术领域。本文中公开了用于萌芽胚特异性表达的方法、核酸分子和表达构建体或其载体；包含此类核酸、载体、表达构建体的转基因植物和细胞，以及制备和使用此类DNA构建体和转基因植物的方法。
Description
发明领域
本发明涉及农业生物技术领域。本文中公开了具有针对萌芽胚(germinatingembryo)的表达特异性的表达构建体、包含此类表达构建体的转基因植物以及制备并使用此类DNA构建体和转基因植物的方法。
发明背景
在农学重要的谷类作物中，种子形成是植物发育的最终目标。将种子收获用于食品、饲料及工业产品。这些种子的用途和价值由种子中所含有的蛋白质、油和淀粉的数量和品质决定。于是，所产生的种子的品质和数量可能在受精前至种子成熟的任何时点上受环境条件影响。尤其，在受精时刻及其附近的胁迫可以明显地影响种子发育。包括谷类谷粒(cerealgrain)在内的禾本科(Poaceae)成员产生干的单种子果实。严格地说，这种类型的果实是颖果，但通常叫做核(kernel)或谷粒(grain)。颖果的果皮或囊果皮包围种子并且牢固地与种子外皮附着。种子由胚和胚乳组成，被珠心表皮和种子外皮包裹。因此，谷粒包含种子和其外皮或囊果皮。种子包含胚和胚乳。
能育的谷物(corn)植物含有雄性繁殖组织和雌性繁殖组织，通常分别称作雄穗(tassel)和雌穗(ear)。雄穗组织形成了单倍花粉粒，每个花粉粒中具备两个核，其中在花开期被散播时，所述花粉粒与雌穗的穗丝接触。雌穗可以位于散播花粉的同一株植物上，或位于不同的植物上。花粉细胞发育为称作花粉管的结构，其中所述花粉管向下延伸穿过单个雌性穗丝抵达胚珠。两个雄性核经花粉管移动以抵达位于穗丝基部的单倍体雌性卵。两个雄性核之一与所述单倍体雌性卵核融合并且使其受精以形成合子，其中所述合子在染色体数上是二倍体并且会变成谷粒中的胚。剩余雄性核与第二个雌性核融合并且使其受精以形成初生胚乳核，其中所述的初生胚乳核在染色体数上是三倍体并且会变成谷物植物的谷粒或种子的胚乳。未受精的胚珠不产生谷粒并且未受精的组织逐步退化。
谷粒由众多部分组成，其中一些部分从母体组织衍生而其他部分来自受精过程。按照母系方式，所述谷粒继承了众多种组织，包括保护性包围的囊果皮和花梗。花梗是使谷粒连接于穗轴并且促使营养从母体组织转移至谷粒的短柱样组织。谷粒含有因受精活动产生的组织，包括新胚和胚乳。胚是下一个世代的缩微祖先，含有用于新生幼龄谷物植物的根和苗生长的细胞。胚也是贮藏油和蛋白质于谷粒中的一种组织。胚乳更多地作为营养组织发挥作用并且以贮藏淀粉、蛋白质和油形式提供胚萌发及初期生长所需要的能量。
鉴于高等植物中胚及谷粒发育期间存在复杂的调节作用，并且鉴于谷粒通常是动物及人类营养的主要来源，所需要旨在改良此类营养来源的重要工具包括可以驱动营养增强性基因表达的遗传启动子。另一方面，胚对胁迫高度敏感。针对植物的胁迫可以由生物介质和非生物介质引起。例如，胁迫的生物原因包括病原体感染、昆虫采食及被另一种植物(如槲寄生)寄生以及反刍动物啃食。非生物性胁迫例如包括过量或不充分的可用水、不充分的光照、极端温度、人工化学品(如除草剂)、大风、土壤极端pH、受限的营养获得性和空气污染。然而，利用多种内部机制及外部机制以躲避或耐受胁迫，植物存活下来并且经常枝繁叶茂，甚至在不利条件下也是如此。植物对胁迫的生理应答反映在基因表达方面的改变。
尽管操作胁迫诱导型基因可能在改善植物的胁迫耐受性方面发挥重要作用，然而已经证实当胁迫不存在时，胁迫诱导型基因的组成型表达严重不利地影响植物生长和发育(Kasuga1999)。因此，本领域需要驱动具有时间和/或空间差异性地表达的启动子，旨在提供在重要时间处控制并指导在特定细胞或组织中基因表达的工具，尤其旨在提供胁迫耐受性或躲避。尤其，玉米的干旱胁迫和/或密度胁迫经常导致减产。为稳定在不利环境下的植物发育及谷粒产量，调节种子萌发期间对胚(胚轴和盾片)的激素和营养供应是有意义的。因此，需要在非生物胁迫条件下驱动胚或盾片中基因表达的转录调节序列。
植物生物技术领域中的另一个熟知的问题是标记缺失(marker-deletion)。选择标记在转化过程期间用来选择并鉴定转化的生物，然而一旦已经鉴定出转化的生物后，则选择标记一般不提供有用的功能，并且主要构成消费者中不接受这些“基因食品”产品的原因(Kuiper2001)，并且几乎没有不基于这些机制的标记(Hare2002)。因此，人们反复尝试开发这样的技术，其中借助所述技术可以从植物基因组切除标记DNA(Ow1995；Gleave1999)。本领域技术人员熟悉用于位点定向方式除去重组导入的核酸序列的多种系统。这些系统主要基于使用序列特异性的重组酶。描述了多种序列特异性重组系统，如噬菌体P1的Cre/lox系统(Dale1991；Russell1992；Osborne1995)、酵母FLP/FRT系统(Kilby1995；Lyznik1996)、Mu噬菌体Gin重组酶、大肠杆菌(E.coli)Pin重组酶、质粒pSR1的R/RS系统(Onouchi1995；Sugita2000)、attP/噬菌体λ系统(Zubko2000)。现有技术领域已知的这些方法的一个已知缺点是切除在整个植物范围内是不均一的，因此产生嵌合样的切除模式，这需要繁琐的额外选择和再生轮次。
描述了在种子或谷粒成熟期间赋予表达增强的启动子(如大麦(barley)的大麦醇溶蛋白启动子；见美国专利申请20040088754)。在双子叶植物中指导胚特异性或种子特异性表达的启动子(例如大豆(soybean)伴大豆球蛋白启动子；Chen1988；油菜籽蛋白启动子，Kridl1991)通常不能在单子叶植物中指导相似的表达。不幸地是，相当少的启动子被鉴定为特异性指导此方面的生理学(见例如US20040163144)。
因而，所描述的种子特异性或谷粒特异性启动子包括与编码植物种子贮藏蛋白的基因(如编码大麦的大麦醇溶蛋白、稻(rice)的稻谷蛋白、水稻素、谷醇溶蛋白或球蛋白；小麦(wheat)的麦醇溶蛋白或麦谷蛋白；玉米(maize)的玉米醇溶蛋白或谷蛋白；燕麦(oat)的谷蛋白；高粱(sorghum)的高粱醇溶蛋白；黍(millet)pennisetins或黑麦(rye)的裸麦醇溶蛋白的基因)相关的那些启动子。然而，另一方面，这些启动子的表达往往是渗漏的，或是低表达水平的。此外，已经指出用多个转基因(“堆积”)改良作物植物的兴趣正在增长。例如，单个玉米杂交体可以包含不仅赋予昆虫抗性，也赋予特定除草剂抗性的重组DNA构建体。重要的是：需要适宜的调节序列以驱动这些或其他目的转基因中的每一转基因按需要表达。此外，重要的是调节元件应当彼此明显不同。伴随利用相似调节序列驱动多个基因表达的顾虑包括但不限于：(a)在整合前的质粒内或在整合后的植物基因组内，沿同源区域配对、交换和间插区域丢失；(b)由相反方向彼此邻近的序列的两个拷贝导致的发夹环，以及切除和丢失这些调节区域的可能性；(c)相同启动子区域的不同拷贝间对结合启动子特异性转录因子或其它调节性DNA结合蛋白的竞争。
因此，本领域迫切需要鉴定可以用于经济重要的植物、尤其单子叶植物中表达所选择的转基因的新序列。另外，本领域还需要在早期萌发种子期间允许在胚或盾片中表达的转录调节序列。因此，本发明的一个目的是提供用于胚优先地或特异地表达的新颖和备选的表达盒。该目的由本发明实现。
发明概述
本发明涉及包含植物转录调节序列的分离的核酸分子，其中所述的转录调节序列包含
i)第一核酸序列，其包含干旱、寒冷应答性和/或ABA调节型基因的启动子序列，例如图4中定义的植物基因-干燥应答性rd29或低温诱导的蛋白78基因或其功能等同物或同源物(homolog)的启动子序列(在下文中为“cor78启动子”)，
和与其有效连接的
ii)第二核酸序列，其包含如图5中定义的编码金属硫蛋白1(在下文中为“MET1”)的植物基因或其功能等同物或同源物的第一内含子(在下文中为“MET1内含子”)。
干旱、寒冷应答性和/或ABA调节型基因的启动子序列包含熟知的蛋白质类型的启动子。优选地，它是干旱、寒冷应答性和ABA调节型基因的启动子序列。干旱、寒冷应答性和/或ABA调节型基因的基因实例是rd29A、rd29B、lti或cor78。
图4序列代表RD29A和低温诱导的蛋白78。cor78启动子又称作rd29启动子序列。Genbank数据库的BLAST指例如Genbank登录号AB019226，其包含其他基因。在这个基因组序列中，cor78启动子以5’-3’方向位于bp11743-bp12328。位于该启动子区下游的基因是低温诱导的蛋白78(例如bp12650-12698、12784-12966、13063-13536和13621-15047)。
干燥应答性RD29植物基因例如在登录号NM_001036984下公开，具有2131bpmRNA，注册日期PLN2006年6月9日，VERSIONNM_001036984.1GI：79330663，并且被描述为编码一种在应答水剥夺如寒冷、高盐和干燥时诱导表达的蛋白质的基因。该应答似乎通过脱落酸进行。所述启动子区含有对于rd29B脱水应答性表达所需要的两个ABA应答元件(ABRE)作为顺式应答元件。所述蛋白质是具有植物、动物和真菌中存在的其他成员的基因家族的成员。将其描述为类似于胁迫应答蛋白相关的[拟南芥(Arabidopsisthaliana)](TAIR：At4g25580.1)。RD29还作为cor78在登录号GB：AAA32776.1下公开。
因此，在一个实施方案中，使用在植物中控制编码所述蛋白质之一的mRNA转录的启动子，例如编码胁迫应答蛋白的基因的启动子，如拟南芥(TAIR：At4g25580.1)的启动子，例如rd29A，rd29B，lti或cor78(GB：AAA32776.1)的启动子。优选地，所述启动子具有图4中所示的序列或其同源物，例如其直向同源物。
优选地，cor78启动子衍生自双子叶植物。
在一个实施方案中，所述同源物是作为直向同源物预测在植物界(Viridiplantae)中存在；优选地在链形植物(Streptophyta)，更优选在有胚植物(Embryophyta)；维管植物(Tracheophyta)、甚至更优选在种子植物门(Spermatophyta)中存在的同源物。所述同源物更优选地从被子植物门(Magnoliophtya)鉴定到，该同源物更优选地来自真双子叶植物(eudicotyledons)，该同源物甚至更优选来自核心真双子叶植物(coreeudicotyledons)。因此，该同源物优选地来自蔷薇分支(rosids)；更优选来自真蔷薇II(eurosidsII)；甚至更优选来自十字花目(Brassicales)，该同源物甚至更优选例如来自十字花科(Brassicaceae)，优选地来自拟南芥属(Arabbidopsis)。
在一个实施方案中，所述同源物来自拟南芥栽培品种，例如来自C24，或来自生态型如“Columbia”。
除了具有基本上相同的功能外，两种多肽基本上彼此相似的一个进一步迹象是与所述多肽之一特异性结合的物质(例如抗体)还特异性地结合至另一个多肽。因此，在一个实施方案中，RD29的同源物是可以在蛋白质印迹分析法中因与单克隆抗体结合而被鉴定的蛋白质，其中产生所述的单克隆抗体以特异性结合至具有图4中所示的氨基酸的蛋白质。
在一个实施方案中，使用其启动子的基因是与图4中所示的氨基酸序列或核酸序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％和甚至90％或更大，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、大到至少99％的氨基酸序列同一性或核酸同一性的核酸或蛋白质。
优选地，使用其启动子的基因是显示低温诱导的蛋白78的表达模式的基因或RD29基因。优选地，与所述基因连接的启动子序列与如SEQIDNO.：1所描述的核酸序列60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％和甚至90％或更大，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、大到至少99％同一。可以通过使用鉴定或克隆核酸序列的标准技术(但不排除其他技术)、数据库搜索法、杂交或基于PCR的技术，利用SEQIDNO.：1、5或6的或例如图4a-4c中所示的低温诱导的蛋白78或RD29基因的至少10、15、20、30或更多个连续核苷酸获得所述启动子。
Met1基因在Sasaki，T.等，Nature420(6913)，312-316(2002)中并在登录号AP002540下公开，是249bp的线性DNA，PLN19-OCT-2004，VERSIONAP002540.2GI：13872872。该序列于2000年6月21日提交，并且在2001年4月27日将该序列版本替换为gi：8698578。基因从以下数据库GENSCAN、FGENESH、GeneMark.hmm、GlimmerM、RiceHMM、SplicePredictor、sim4、gap2、BLASTN和BLASTX的综合结果中预测。将基因组序列针对NCBI非冗余蛋白质数据库、在RGP或DDBJ上的nr和cDNA序列数据库搜索。将编码区的蛋白质同源性针对NCBI非冗余蛋白质数据库用BLASTP搜索。EST代表使用BLASTN、以相应DDBJ登录号和RGP克隆ID鉴定的cDNA序列。全长cDNA代表使用BLASTN，以相应DDBJ登录号鉴定的cDNA序列。与某蛋白质具有同一性或显著同源性的基因基于该蛋白质的名称进行分类，以指示同源性水平，如相同名称、“推定的-”和“-样蛋白”。与任意蛋白质无显著同源性，但具有全长cDNA或EST同源性(覆盖部分序列的几乎全部长度)的基因分类为“未知的”蛋白。根据IRGSP标准，由两个或多个基因预测程序预测的基因分类为“假定的”蛋白。由单个基因预测程序预测的基因也分类为可能的“假定”蛋白，并且将该基因纳入作为序列的一个混杂特征。所述序列的方向是从PAC克隆的T7至SP6。P0434B04克隆的这个序列与P0416D03(DDBJ：AP002872)克隆在5′端处重叠并且与P0009G03(DDBJ：AP002522)克隆在3′端处重叠。关于重叠和装配品质的详细信息以及该条目的注释可在GenomeSeq获得。
优选地，使用图5中所示的MET1基因或其同源物的内含子，例如其直向同源物的内含子。
优选地，所述第一内含子衍生自单子叶植物的MET1基因。所述同源物优选地是例如来自植物界，例如来自链形植物，更优选来自有胚植物，甚至更优选来自维管植物的直向同源物。该同源物例如来自种子植物门，优选地来自被子植物门，更优选来自百合纲(Liliopsida)、甚至更优选来自禾本目(Poales)，甚至更优选来自禾本科(Poaceae)。在一个实施方案中，该同源物来自BEP进化枝，例如来自稻亚科(Ehrhartoideae)，更优选来自稻族(Oryzeae)，例如来自稻属(Oryza)。
在一个实施方案中，使用衍生自稻(Oryzasativa)，例如衍生自栽培品种如粳型稻栽培品种组(japonicacultivar-group)的直向同源物。
优选地，所述同源物是直向同源物并且在耗尽测定法(depletionassay)中显示与野生型基本上相同的表型。
除了具有基本上相同的功能外，两种多肽基本上彼此相似的一个进一步迹象是与所述多肽之一特异性结合的物质(例如抗体)还特异性地结合至另一个多肽。因此，在一个实施方案中，MET1的同源物是可以在蛋白质印迹分析法中因与单克隆抗体结合而被鉴定的蛋白质，其中产生所述的单克隆抗体以特异性结合至具有图5中所示的氨基酸的蛋白质。
在一个实施方案中，使用其内含子例如所述第一内含子的基因的同源物编码这样的蛋白质，所述蛋白质与图5中所示的氨基酸序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％和甚至90％或更高，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、大到至少99％的氨基酸序列同一性或核酸同一性。
优选地，使用其内含子的基因的同源物编码显示MET1基因表达模式的蛋白质。优选地，所述基因的内含子的核酸序列与如SEQIDNO.：3所描述的核酸序列60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％和甚至90％或更高，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、大到至少99％同一。可以通过使用鉴定或克隆核酸序列的标准技术(但不排除其他技术)、数据库搜索法、杂交或基于PCR的技术，利用SEQIDNO.：3、7或8的或MET1基因的至少10、15、20、30或更多个连续核苷酸获得所述启动子。
可以使用Smith-Waterman序列比对算法(参见例如Waterman1995)实施序列比较，优选地使用具有以下参数的localS程序1.16版：匹配：1，错配罚分：0.33，开口缺口罚分：2，延伸缺口罚分：2。
cor78启动子与所述内含子(例如MET1的第一内含子)之间的距离优选地是短的。在一个实施方案中，核酸分子包含例如接头序列，所述的接头序列位于cor78启动子与所述内含子的第一核苷酸之间，例如长度是0bp-100bp，例如10bp-90bp或20-80bp，例如20、30、40、50、60、70、80或90bp。
在本发明的另一个实施方案中，所述的内含子例如MET1的第一内含子位于受转录调节性核苷酸序列控制所转录的核苷酸序列的另一个内含子的序列中。
此外，在一个实施方案中，所述的核酸分子包含例如位于所述cor78启动子序列与MET1内含子的第一核苷酸之间的5’UTR。
一种可能的排列由SEQIDNO：2的第8199-第9656位碱基对代表，其包含cor79启动子和MET1基因的第一内含子，或由第8134-第9656位碱基对代表，其包含cor79启动子、MET1基因的第一内含子和5’UTR。
受转录调节性核苷酸序列控制所转录的核苷酸序列的内含子例如位于5’UTR中或位于靠近cor78启动子序列的另一个位置内，例如它位于编码区5’端的头100bp范围内或位于转录起始密码子后的第一个100bp范围内。
因此在一个实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码植物转录调节序列的多核苷酸，其中所述植物转录调节序列包含
i)选自以下的第一核酸
a)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：1的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中所定义多核苷酸的至少50个核苷酸的核酸杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，和
ii)选自以下的第二核酸
a)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：3的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：3的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，
其中所述的第一和第二核酸序列是功能性连接的并且彼此是异源的。
优选地，包含编码转录调节序列的多核苷酸的核酸分子能够介导植物或植物细胞中有效连接的核酸序列转录。更优选地，包含编码转录调节序列的多核苷酸的核酸分子能够介导单子叶植物或单子叶植物细胞中有效连接的核酸序列转录。优选包含编码转录调节序列的多核苷酸的核酸分子具有组织特异性。更优选地，包含编码转录调节序列的多核苷酸的核酸分子优先地在胚或盾片中表达。还优选包含编码转录调节序列的多核苷酸的核酸分子优先地在非生物性或生物性胁迫条件下表达。所述生物性胁迫条件选自真菌、线虫、昆虫、病毒和细菌和其组合。所述非生物胁迫条件选自干旱、寒冷、热、盐、盐度、植物群体高密度、氮、紫外光和其组合。最优选地，包含编码转录调节序列的多核苷酸的核酸分子优先地在干旱条件下表达。
本发明的另一个实施方案涉及包含编码如上所述的转录调节序列的多核苷酸的核酸分子，其中所述核酸包含选自以下序列的至少两个，优选地多个，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，例如多到所有核心启动子基序，所述的序列如SEQIDNOs：10、12、14、17、20、22、25、27、29、31、33、35、37、39、42、44、46、48、50、53、55、57、59、63、66、68、70、72、74、77、79、82、84、86、88、90、94、96、98、102、104、108、112、114、117、121、123、125、127、129、131、137和138中定义。优选地，所述启动子基序排列在如表8和9中所述的转录调节序列的负链或正链上。甚至更优选地，所述的启动子基序位于与如表8和9中所述的转录调节序列相同或相似的位置处。
本发明的又一个实施方案涉及了包含编码如上所述的转录调节序列的多核苷酸的核酸分子，其中所述核酸包含选自以下序列的至少两个，优选地多个，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，例如多到所有核心启动子基序，所述的序列如SEQIDNOs：9、11、13、15、16、18、19、21、23、24、26、28、30、32、34、36、38、40、41、43、45、47、49、51、52、54、56、58、60、61、62、64、65、67、69、71、73、75、76、78、80、81、83、85、87、89、91、92、93、95、97、99、100、101、103、105、106、107、109、110、111、113、115、116、118、119、120、122、124、126、128、130、132、133、134、135和136中定义。优选地，所述启动子基序排列在如表8和9中所述的转录调节序列的负链或正链上。甚至更优选地，所述的启动子基序位于与如表8和9中所述的转录调节序列相同或相似的位置处。
本发明的另一个实施方案涉及表达构建体，其中所述的表达构建体包含与核酸序列功能性连接的这样的核酸分子，所述核酸分子包含编码转录调节序列的多核苷酸。优选地，所述功能性连接的核酸序列赋予植物性状或特性，其中所述的性状或特性选自提高的产量、胁迫条件下提高的抗性、提高的种子或籽苗营养品质和/或油含量、和选择标记切除。所述提高的营养品质和/或油含量可以包括至少一种化合物的含量提高，其中所述的化合物选自维生素、类胡萝卜素、抗氧化剂、不饱和脂防酸、多不饱和脂防酸或其氨基酸含量改变的蛋白质。还优选的是所述表达构建体中功能性连接的核酸序列的转录导致能够在目标植物中赋予至少一种基因功能的蛋白质或功能性核糖核苷酸序列表达。功能性RNA包含选自反义RNA、有义RNA、dsRNA、微RNA、ta-siRNA、snRNA、RNAi或其组合的至少一种RNA。
本发明的一个实施方案提供了由转基因植物产生的植物或种子，其中所述的转基因植物用包含编码与核酸功能性连接的转录调节序列的多核苷酸的核酸分子转化。在一个进一步优选的实施方案中，由所述转基因植物产生的种子表达了能够在目标植物中赋予至少一种基因功能的蛋白质或功能性核糖核苷酸序列，其中所述的种子或植物具有胁迫条件下提高的抗性和/或提高的产量和/或提高的种子或籽苗营养品质和/或油含量。更优选地，所述种子或植物是单子叶植物。优选地，所述种子或植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、黑麦草或薏苡。更优选地，所述种子或植物是禾谷类植物，选自玉米、小麦、大麦、稻、燕麦、黑麦和高粱，甚至更优选地选自玉米、小麦和稻，最优选地，所述种子或植物是玉米。本发明的其他实施方案涉及本发明单子叶植物的种子、部分和细胞。优选地，所述植物部分选自细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞团块、胚、花粉、胚珠、种子、花、谷粒、穗、穗轴、叶、外壳、柄、根、根尖、花药和穗丝。
本发明的另一个实施方案涉及用于植物提高产量和/或提高胁迫耐受性的方法，其中所述的方法包括步骤
A)向植物导入表达构建体，所述表达构建体包含
i)选自以下的第一核酸序列
a)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：1的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中所定义多核苷酸的至少50个核苷酸的核酸杂交的多核苷酸或其互补物，其中所述的条件是：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，和与其有效连接的
ii)选自以下的第二核酸
a)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：3的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：3的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸杂交的多核苷酸或其互补物，其中所述的条件是：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，
并且与至少一个核酸有效连接，其中所述的至少一个核酸相对于所述第一或第二核酸序列是异源的并且能够向植物赋予提高的产量和/或提高的胁迫耐受性，和
B)选择转基因植物，其中与野生型或无效分离子植物相比较，所述的植物具有提高的产量和/或在胁迫条件下提高的胁迫耐受性。
本领域技术人员已知多种核酸以获得产量和/或胁迫抗性。所述核酸可以包括但不限于编码参与植物激素生物合成、植物激素调节、细胞周期调节或糖代谢的多肽。
本发明的另一个实施方案涉及用于赋予提高的种子或籽苗营养品质和/或油含量的方法，其中所述的方法包括步骤
A)向植物导入表达构建体，所述表达构建体包含
i)选自以下的第一核酸
a)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：1的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中所定义多核苷酸的至少50个核苷酸的核酸杂交的多核苷酸或其互补物，其中所述的条件是：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤；和与其有效连接的
ii)选自以下的第二核酸
a)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：3的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：3的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸杂交的多核苷酸或其互补物，其中所述的条件是：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，
并且与至少一个核酸有效连接，其中所述的至少一个核酸相对于所述第一或第二核酸序列是异源的并且适于向植物赋予提高的种子或籽苗营养品质和/或油含量，并且
B)选择转基因植物，其中与野生型或无效分离子植物相比较，所述的植物具有提高的营养品质和/或油含量。
营养品质和/或油含量如上文定义。更具体的实例在下文中给出。转录调节序列在上文描述，更优选地，所述转录调节序列是胚特异的。
本发明的又一个实施方案涉及用于从植物中切除靶序列例如标记序列的方法，所述的方法包括步骤
A)通过有效地连接转录调节性核苷酸序列而构建表达盒，所述转录调节性核苷酸序列包含
i)选自以下的第一核酸
a)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：1的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中所定义多核苷酸的至少50个核苷酸的核酸杂交的多核苷酸或其互补物，其中所述的条件是：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤；和与其有效连接的
ii)选自以下的第二核酸
a)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：3的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：3的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸杂交的多核苷酸或其互补物，其中所述的条件是：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，
并且与至少一个核酸有效连接，其中所述的至少一个核酸相对于所述的第一或第二核酸序列异源性的并且适于诱导从植物中切除靶序列例如标记序列，和
B)将所述的表达盒插入包含至少一个靶序列例如标记序列的植物以产生转基因植物，其中所述的植物表达所述的异源核酸序列，和
C)选择转基因植物，其中所述转基因植物表现出切除所述靶序列例如所述标记序列。
优选地，所述靶序列是标记序列，例如抗生素抗性基因或除草剂抗性基因。
在本发明的一个优选实施方案中，从本发明的嵌合性转录调节序列表达的核苷酸序列不编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或不是用于表达GUS基因以实现GUS介导染色的方法。
附图简述
图1.质粒pBPSMM368：At.Cor78::BPS1.1::GUS::NOS的图谱
图2.At.Cor78启动子构建体的组织化学GUS染色。显示了所述构建体的典型染色模式的代表性实例。A：At.Cor78::BPS1.1::GUS::NOS(pBPSMM368)；B：At.Cor78::GUS::NOS(pBPSMM250)；C：At.Cor78::Ubi-内含子1::GUS::NOS(pBPSMM346)
图3.玉米中受pBPSMM346启动子构建体控制的干旱胁迫诱导型表达或稳定表达。5叶簇阶段的转基因植物因断水遭受干旱胁迫。在所示时间点上从叶采集样品。RNA从叶样品分离并用定量RT-PCR分析。针对每个样品中的内对照基因归一化GUS表达。与设置为1的0-时间点相比，结果表示为表达水平提高的倍数。
图4a-4c：RD29A基因和低温诱导的蛋白78基因的核苷酸序列和氨基酸序列。
图5：MET1基因的核苷酸序列。
定义
除非另外说明，技术术语根据常规用法使用。分子生物学中常见术语的定义可以在Lewin，GenesV，OxfordUniversityPress出版，1994年(ISBN0-19-854187-9)；Kendrew等(编者)，TheEncyclopediaofMolecularBiology，BlackwellScienceLtd.出版，1994年(ISBN0-632-02182-9)以及VCHPublishers，Inc.出版，RobertA.Meyers(编著)，MolecularBiologyandBiotechnology：aComprehensiveDeskReference，1995年(ISBN1-56081-569-8)中找到。
应当理解本发明不限于所描述的具体方法学、方案、细胞系、植物物种或属、构建体和试剂。还应当理解本文中所用术语的目的仅是描述具体实施方案，并且不意图限制本发明的范围，其中所述的本发明范围仅受所附的权利要求书限制。必须指出：如本文中和在所附权利要求书中所用，单数形式“一”和“该”包括复数指称，除非上下文另外清楚地声明。因此，例如对“一个载体”的称谓是对一个或多个载体的称谓并包括本领域技术人员已知的其等同物，以及其他等。
术语“约”在本文中用来意指大约地、粗略地、左右或在......范围内。当术语“约”与数字范围相连使用时，该术语通过延伸边界值高于和低于所述值而修饰这个范围。通常，术语“约”在本文中用来以高于和低于一个数字值的20％变异、优选以10％以上或以下(之上或之下)的变异修饰所述值。
如本文中所用，词语“或”意指特定列举的任一成员并且也包括所列举成员的任意组合。
术语“基因”广义地用来指与生物学功能相关的核酸的任意节段。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需要的调节序列。例如，基因指表达mRNA或功能性RNA或者编码特定蛋白质的核酸片段，并且其包括调节序列。基因可以包括非编码性DNA序列和/或调节序列，其中所述的非编码区可以转录成如微RNA。基因也包括例如形成其他蛋白质和/或RNA的识别序列的非表达性节段。基因可以通过化学方法或分子生物学方法从多种来源获得，包括从目的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可以包括设计旨在具有所需参数的序列。
术语“天然”或“野生型”基因指在未转化的细胞即没有已知突变的细胞的基因组中存在的基因。
“标记基因”或“标记序列”编码可选择或可筛选性状。
术语“嵌合基因”指含有以下项的任一基因
1)包括在自然界中不在一起存在的调节序列和编码序列的DNA序列，或
2)非天然连接的编码部分编码序列(例如编码蛋白质)的序列，或
3)非天然连接的调节序列(例如启动子)的部分。
因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或包含衍生自相同来源，但以不同于自然界中存在的方式排列的调节序列和编码序列。
“转基因”指已经通过转化作用导入基因组并且得以稳定维持的基因。转基因可以包括例如相对于待转化的特定植物的基因为异源的或同源的基因。此外，转基因可以包含插入非原本生物的天然基因或包含嵌合基因。术语“内源性基因”指位于生物基因组中其天然位置内的天然基因。“外源”基因指通常在宿主细胞中找不到，但通过基因转移所导入的基因。
与本发明核苷酸序列相对应的例如用于探测或扩增反应中的“寡核苷酸”可以是约30个或更少核苷酸长度(例如9、12、15、18、20、21或24个或在9和30个之间的任意数)。通常，特异性引物具有多于14个核苷酸的长度。对于最佳特异性和成本效率而言，可以优选16至24个核苷酸长度的引物。本领域技术人员完全能够针对使用方法如PCR法设计引物。根据需要，探测可以用本文中公开的基因的完整限制性片段进行，其中所述的完整限制性片可以是100个或甚至1000个核苷酸长度。
术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文中可互换地用来指连续氨基酸残基的聚合物或寡聚物。如本文中所用，术语“氨基酸序列”或“多肽序列”指一串代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或词。氨基酸可以在本文中通过它们共知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推荐的单字母符号提到。本文中所用的缩写是氨基酸的常规单字母代码：A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D天冬氨酸；E，谷氨酸(glutamate)，谷氨酸(glutamicacid)；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H组氨酸；I异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸(参见L.Stryer，Biochemistry，1988，W.H.FreemanandCompany，NewYork)。如本文在氨基酸序列中所用的字母“X”可以代表任意氨基酸残基。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列并且排除非编码序列的DNA序列或RNA序列。它可以构成“未间断的编码序列”(即无内含子)，如在cDNA中，或它可以包括由适宜的剪接接点(splicejunction)界定的一个或多个内含子。“内含子”是这样的RNA序列，其包含在初级转录物中，但通过细胞内的RNA切割和再连接作用被除去以产生可以翻译成蛋白质的成熟mRNA。
术语“可读框”和“ORF”指在编码序列的翻译起始密码子与终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指编码序列中分别指导蛋白质合成(mRNA翻译)起始和链终止的三个毗邻核苷酸的单元(“密码子”)。
“功能性RNA”指不被翻译的反义RNA、核酶或其他RNA。
术语“RNA转录物”指因RNA聚合酶催化DNA序列转录而产生的产物。当所述RNA转录物是此DNA序列的完美互补性拷贝时，此RNA转录物称作初级转录物，或所述RNA转录物可以是从所述初级转录物的翻译后加工过程衍生的RNA序列并且称作成熟RNA。“信使RNA”(mRNA)指无内含子并可由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA互补并且衍生自mRNA的单链或双链DNA。
“转录调节性核苷酸序列”、“调节序列”和“合适的调节序列”分别指影响已连接(或功能性连接)的待转录核苷酸序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。转录调节性核苷酸序列可以相对于待转录的核苷酸序列具有多种定位。转录调节性核苷酸序列可以位于待转录序列(例如编码序列)的上游(5’非编码序列)、位于其中或其下游(3’非编码序列)。转录调节性核苷酸序列可以选自增强子、启动子、翻译前导序列、内含子、5’-非翻译序列、3’-非翻译序列和聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然序列和人工序列，以及可以是人工序列与天然序列组合的序列。如上文指出，术语“转录调节性核苷酸序列”不限于启动子。然而优选地，本发明的转录调节性核苷酸序列包含至少一个启动子序列(例如位于能够诱导下游序列转录的基因的转录起点上游的序列)。在一个优选实施方案中，本发明的转录调节性核苷酸序列包含相应基因的启动子序列和任选地且优选地该基因的天然5’非翻译区。此外，也可以使用该基因的3’非翻译区和/或聚腺苷酸化区。
“启动子”指为RNA聚合酶和对于正确转录所需要的其他因子(例如反式作用转录因子)提供识别作用而控制编码序列表达的核苷酸序列，其通常位于编码序列的上游(5′)。“启动子”包括最小启动子，其中所述的最小启动子是由起指定转录起点作用的TATA盒和其他序列组成的短DNA序列，其中向所述的短DNA序列添加调节元件(例如顺式元件)以控制表达。“启动子”还指包含最小启动子和能够控制编码序列或功能性RNA表达的调节元件的核苷酸序列。这种类型的启动子序列由近端和更远的上游元件组成，更远的上游元件常称作增强子。因此，“增强子”是这样的DNA序列，该DNA序列可以刺激启动子活性并且可以是该启动子的固有元件或所插入旨在增强启动子的水平或组织特异性的异源性元件。增强子能够在两个(正常或倒转)方向上起作用，并且甚至当被移到该启动子上游或下游时还能够发挥功能。增强子和其他上游启动子元件均结合介导其效应的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以完整地从天然基因衍生，或由从自然界中存在的不同启动子衍生的不同元件组成，或甚至由人工DNA节段组成。启动子也可以含有参与蛋白质因子结合的DNA序列，其中所述的蛋白质因子控制应答生理条件或发育条件时的转录起始效率。如本文中所用，术语“顺式元件”指赋予整体控制基因表达的一个方面的顺式作用转录调节元件。顺式元件可以结合调节转录的转录因子、反式作用蛋白质因子而发挥作用。一些顺式元件结合不止一种转录因子，并且转录因子可以与不止一种顺式元件以不同的亲和力相互作用。本发明的启动子受欢迎地含有可以赋予基因表达或调节基因表达的顺式元件。顺式元件可以通过多种技术鉴定，其中所述的技术包括缺失分析(即从启动子的5’端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹法的DNA结合蛋白分析法、甲基化干扰、电泳迁移率移动分析、通过连接介导的PCR进行体内基因组足迹法和其他常规分析；或通过常规DNA序列比较方法与已知顺式元件基序比较的DNA序列相似性分析。顺式元件的精细结构可以通过诱变(或置换)一个或多个核苷酸或通过其他常规方法进一步研究。顺式元件可以通过化学合成或通过从包含如此元件的启动子分离获得，并且可以合成带有额外侧翼核苷酸的所述顺式元件，其中所述的额外侧翼核苷酸含有旨在促进亚序列操作的有用限制性酶位点。
“起始位点”是环绕在构成已转录序列的部分的第一核苷酸周围的位置，该位置又定义为位置+1。相对于该位置，对基因及其控制区的全部其他序列编号。下游序列(即3’方向上的其他蛋白质编码序列)命名为正数，而上游序列(大部分是5’方向上的控制区)命名为负数。
在缺少上游激活作用时无活性或启动子活性明显降低的启动子元件、尤其TATA元件称作“最小或核心启动子”。在合适的转录因子存在下，所述最小启动子发挥允许转录的作用。“最小或核心启动子”因此仅由对于转录起始所需要的全部基础元件组成，例如TATA盒和/或起始子。
术语“内含子”指在基因中DNA的部分(间插序列)，其中所述的部分不编码由该基因产生蛋白质的部分并且在从该基因转录出的mRNA离开细胞核被输出之前，从该mRNA中剪接出来。内含子序列指内含子的核酸序列。因此，内含子是DNA序列的这些区域，其中所述区域随编码序列(外显子)一起转录出来，但是在成熟mRNA形成期间被除去。内含子可以位于实际编码区内部或位于前mRNA(未剪接的mRNA)的5’或3’非翻译前导序列中。初级转录物中的内含子被切除，并且同时且精确地连接所述编码序列以形成成熟的mRNA。内含子与外显子的接界形成剪接位点。内含子序列始于GU并且止于AG。此外，已经在植物中描述了两个AU-AC内含子实例：来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的RecA样蛋白质基因的内含子14和G5基因的内含子7是AT-AC内含子。含有内含子的前mRNA具有三个短序列，其中除了其他序列之外，这三个短序列对于精确地剪接内含子是必需的。这些序列是5’剪接位点、3’剪接位点和分支点。mRNA剪接是除去在初级mRNA转录物中存在的间插序列(内含子)，以及接合或连接外显子序列。这又称作顺式剪接，其中使相同RNA上的两个外显子接合，同时除去间插序列(内含子)。内含子的功能性元件包含由剪接体的特定蛋白质成分结合并识别的序列(例如在内含子末端的剪接共有序列)。所述功能性元件与剪接体的相互作用导致内含子序列从不成熟mRNA中除去并外显子序列再连接。内含子具有对于内含子精确剪接所必需(尽管不充分)的三个短序列。这些序列是5’剪接位点、3’剪接位点和分支点。分支点序列对于植物中剪接作用和剪接位点的选择是重要的。分支点序列通常位于3’剪接位点上游10-60个核苷酸。植物序列在分支点中显示序列变异性，所述的共有序列是CURAY或YURAY。
“组成型表达”指使用组成型启动子或调节型启动子的表达。“条件性表达”和“调节型表达”指由调节型启动子控制的表达。
“组成型启动子”指这样的启动子，其能够在植物的全部或几乎全部发育阶段期间的全部或几乎全部植物组织中表达受该启动子控制的可读框(ORF)。每种转录激活元件均不表现绝对的组织特异性，不过在绝大多数植物部分中以转录最活跃的植物部分内所达到水平的至少1％水平介导转录激活。
“调节型启动子”指这样的启动子，该启动子并不以组成型方式而以时间和/或空间调节方式指导基因表达，并且包括组织特异性启动子和诱导型启动子。这种启动子包含天然序列、人工序列以及可以是人工序列与天然序列组合的序列。不同启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中或在不同发育阶段或应答不同环境条件时表达。不断发现用于植物细胞的多种类型的新启动子，众多实例可以在Okamuro等(1989)的编著内找到。植物中有用的常见调节型启动子包括但不限于安全剂诱导型启动子、从四环素诱导型系统衍生的启动子、从水杨酸诱导型系统衍生的启动子、从醇诱导型系统衍生的启动子、从糖皮质激素诱导型系统衍生的启动子、从病原体诱导型系统衍生的启动子和从蜕皮激素诱导型系统衍生的启动子。
“组织特异性启动子”指并不在全部植物细胞中表达而仅在特定器官(如叶或种子)、特定组织(如胚或子叶)的一个或多个细胞类型中，或在特定细胞类型(如叶薄壁组织细胞或种子贮藏细胞)中表达的调节型启动子。这些启动子也包括以时间方式，例如在胚发生早期或晚期、在正在发育的种子或果实中果实成熟期间、在充分分化的叶内或在衰老发作时受到调节的启动子。
“诱导型启动子”指可以由外部刺激(如化学品、光、激素、胁迫或病原体)在一个或多个细胞类型中开启(turnon)的那些调节型启动子。
“有效连接”或“功能性连接”优选地指多个核酸序列在单个核酸片段上的连接，从而一个核酸序列的功能受另一个核酸序列影响。更具体地，它指第一个序列的位置与第二序列充分接近，从而所述第一序列可以对第二序列或对受所述第二序列控制的区域产生影响。例如，如果调节性DNA序列和编码RNA或多肽的DNA序列如此安置，从而所述调节性DNA序列影响编码性DNA序列的表达(即编码序列或功能性RNA处于所述启动子的转录性控制下)，则将调节性DNA序列称作与编码RNA或多肽的DNA序列“有效连接”或“结合”。
大部分激活性序列(例如内含子)处于被增强的启动子的约300-400碱基对范围内。
在一个实施方案中，内含子(例如INME内含子)的位置在受控基因的5’UTR内(Rose等，RNA2002，8：1444-1453；Callis等，1987，Genes&Dev1：1183-1200；PF56400)。
在所述启动子区与内含子之间的接头例如小于400碱基对长度，例如200、100、50或更少碱基对。优选地，核酸分子的第一序列通过长度约100个核苷酸或更少核苷酸的接头与第二序列连接。
在本发明的又一个实施方案中，使用不止一个激活性序列并且所述激活性序列相互之间间隔约16-约80碱基对。所述编码序列可以有效地以有义或反义方向连接于调节序列，例如转录成编码多肽或蛋白质片段的mRNA或转录成调节性或酶型RNA分子，例如反义RNA、RNAi、核酶、miRNA、ta-siRNA、dsRNA、snRNA或本文中或相关文献描述的其他RNA等，或者其组合。
“表达”指植物中内源性基因、ORF或其部分或转基因的转录和/或翻译。例如，在反义构建体的情形下，表达可以仅指反义DNA的转录。此外，表达指有义RNA(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定累积。表达也可以指蛋白质产生。
“特异性表达”是限于一种或一些种植物组织(空间限制)和/或限于一个或一些植物发育阶段(时间限制)的基因产物表达。已知几乎不存在真正的特异性：启动子似乎优选地在某些组织中开启，而在其他组织中可能无活性或仅有少量活性。这种现象称作渗漏表达。然而，特异性表达在本发明中意指优先在一种或几种植物组织中表达。
(具有或没有增强子的)启动子的“表达模式”是显示转录由该启动子在植物何处及在哪个发育阶段启动的表达水平模式。当一种启动子的表达模式显示与其余启动子的表达模式很少重叠时，将一组启动子的表达模式称为是互补的。启动子的表达水平可以通过测量已转录的标准报道mRNA的‘稳态’浓度来确定。这种测量是间接的，因为报道mRNA的浓度不仅仅取决于其合成速率，还取决于该mRNA降解的速率。因此，稳态水平是合成速率和降解速率的结果。然而当转录的序列相同时，可以认为降解速率以固定速率进行，并且这个值因此可以起到测量合成速率的作用。当启动子以这种方式比较时，本领域技术人员可用的技术是杂交、S1-RNA酶分析法、RNA印迹法和竞争性RT-PCR。这些技术无论如何不代表可用的全部技术，反而仅描述了分析mRNA转录活性和表达水平的常用方法。实际上分析几乎全部启动子内的转录起点表明在转录起始的位点处通常不存在单个碱基，反而存在或多或少簇集的成组起始位点，其中每组起始位点构成mRNA的一些起点。由于这种分布在启动子与启动子之间不同，故在每个群体内的报道mRNA序列彼此不同。由于每一mRNA种类或多或少地易于降解，因而不可能对不同的报道mRNA期望单一降解速率。已经对多种真核生物启动子序列证实：围绕起始位点(“起始子”)的序列在决定受所述具体启动子指导的RNA表达水平中发挥重要作用。这种序列也包括已转录序列的部分。因此，启动子与报道序列的直接融合将导致次优水平的转录。分析表达模式和表达水平的常用方法是测定细胞内蛋白质累积的‘稳态’水平。本领域技术人员已知的常见使用的候选报道基因是β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)和具有荧光特性的蛋白质，如维多利亚水母(Aequoravictoria)的绿色荧光蛋白(GFP)。然而原则上，众多蛋白质适用于此目的，只要该蛋白质不干扰重要的植物功能即可。多种工具适用于量化和确定位置。可以轻易地产生或获得检测系统，其中所述的检测系统基于例如免疫化学、酶、荧光检测和定量。可以在植物组织提取物或在完整组织中使用蛋白质表达的原位分析法测定蛋白质水平。通常，用一种嵌合启动子报道构建体转化的单个株系在它们的报道基因表达水平上不同。还经常观察到此类转化体不表达任何可检测产物(RNA或蛋白质)的现象。通常这种表达变异性归咎于‘位置效应’，虽然决定这种无活性的分子机制通常不明了。
“过量表达”指转基因细胞或转基因生物中这样的表达水平，其超过正常或未转化(非转基因)的细胞或生物中的表达水平。
“5’非编码序列”或“5’-非翻译序列”或“-区域”指位于编码序列5’(上游)的核苷酸序列。这种核苷酸序列存在于充分加工的mRNA的起始密码子上游并且可以影响初级转录物至mRNA的加工过程、mRNA稳定性或翻译效率(Turner1995)。
“3’非编码序列”或“3’-非翻译序列”或“-区域”指位于编码序列3’(下游)的核苷酸序列并且包括聚腺苷酸化信号序列和其他序列，其中所述的其他序列编码能够影响mRNA加工过程或基因表达的调节信号。聚腺苷酸化信号通常以影响聚腺苷酸添加至mRNA前体的3’末端。不同3’非编码序列的用途由Ingelbrecht等，1989例举。
术语“翻译前导序列”指基因在启动子和编码序列之间的DNA序列部分，其中所述的DNA序列部分转录成RNA并且存在于充分加工的mRNA的翻译起始密码子上游(5′)。翻译前导序列可以影响初级转录物至mRNA的加工过程、mRNA稳定性或翻译效率。
“信号肽”指一种多肽的氨基端延伸物，这种氨基端延伸物同所述多肽一起被翻译，形成前体肽，并且是该前体肽进入分泌途径所需要的。术语“信号序列”指编码所述信号肽的核苷酸序列。如本文中所用的术语“转运肽”指已表达多肽的一部分(优选地指多肽的氨基端延伸物)，这个部分与所述多肽一起被翻译，形成前体肽，并且是该前体肽进入细胞器(如质体(例如叶绿体)或线粒体)所需要的。术语“转运序列”指编码所述转运肽的核苷酸序列。
“反义抑制”指产生能够抑制蛋白质从内源性基因或转基因表达的反义RNA转录物。
“基因沉默”指病毒基因、转基因或内源核基因的同源性依赖抑制作用。当所述抑制作用因受影响基因的转录降低引起时，基因沉默可以是转录水平的，或当所述抑制作用因与受影响基因同源的RNA种类周转(降解)增加引起时(English1996)，基因沉默可以是转录后的。基因沉默包括病毒诱导的基因沉默(Ruiz等1998)。
如本文中所用，术语“异源DNA序列”、“外源DNA节段”或“异源核酸”分别指这样的序列，其源自相对于特定宿主细胞为外来的来源，或若来自相同来源，则相对于其原初形式是经修饰的。因此，宿主细胞中的异源性基因包括相对于特定宿主细胞是内源性的，但已经例如通过利用DNA改组法被修饰的基因。该术语也包括天然存在的DNA序列的多重非天然存在的拷贝。因此，本术语指这样的DNA节段，其相对于所述细胞是外来或异源性的，或虽然相对于所述细胞是同源的，但是处于宿主细胞核酸内该元件通常不存在的位置中。表达外源DNA节段以产生外源性多肽。“同源”DNA序列是这样的DNA序列，其与导入该DNA序列的宿主细胞天然地相关。
在核苷酸序列同一性的上下文中，“同源于”指两种核酸分子的核苷酸序列之间或两种蛋白质分子的氨基酸序列之间的相似性。通过如本领域技术人员充分理解的严格条件下(如在Haines和Higgins(编者)，NucleicAcidHybridization，IRLPress，Oxford，U.K.中描述)DNA-DNA杂交或DNA-RNA杂交或通过两种核酸或两种蛋白质之间的序列相似性比较，提供对此类同源性的评估。
术语“基本上相似”指代表本文中所公开序列、尤其稻、拟南芥或欧洲油菜(Brassicanapus)序列的功能性和/或结构性等同物或直向同源物的核苷酸和氨基酸序列。
在最广泛的意义上，当在本文中就核苷酸序列使用“基本上相似”时，术语“基本上相似”意指该核苷酸序列是编码多肽的基因的部分，其中所述的多肽具有与作为参考核苷酸序列的基因编码的多肽基本上相同的结构和功能，例如，该核苷酸序列包含来自基因(其中该基因是与参考核苷酸序列相对应的基因的直向同源物)的启动子以及在结构上与本文中特别例举启动子序列相关的启动子序列，即基本上相似的启动子序列与本文中所例举启动子序列的互补序列在高严格条件或极高严格条件下杂交。例如，仅反映遗传密码子简并性但仍编码与特定氨基酸序列相同的氨基酸序列的变异核苷酸序列与特定核苷酸序列基本上相似。术语“基本上相似”也包括这样的核苷酸序列，其中所述序列已经被修饰例如旨在优化于特定细胞中的表达，也包括编码变异多肽的核苷酸序列，其中所述的变异多肽相对于所述参考序列编码的(未修饰)多肽具有一个或多个氨基酸置换，所述的置换不改变该变异多肽相对于所述未修饰多肽的活性。
在最广泛的意义上，当在本文中就多肽使用“基本上相似”时，术语“基本上相似”意指该多肽具有与参考多肽基本上相同的结构和功能。优选地，所述同源物是直向同源物。可以在一种简单测定法中检验具有基本上相似序列的基因是否是基因(例如cor78或Met1基因)的直向同源物：首先缺失内源性基因例如cor78或Met并随后将所述潜在直向同源物导入缺失的细胞或植物。直向同源物应当重建与野生型相似或基本上相似的表型，优选地，该表型与野生型相同。在一个实施方案中，该术语可以意指与特定序列基本上相似的氨基酸序列是这样一些氨基酸序列，其中整体氨基酸同一性相对于本发明序列是至少60％或更高。产生等效核苷酸或氨基酸序列的修饰完全属于本领域常规技术的范围内。在一个实施方案中，基本上相似的多肽与参考多肽之间的氨基酸序列同一性百分数是至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％和甚至90％或更高，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、大到至少99％。除了具有基本上相同的功能以外，两种多肽彼此基本上相似的又一个迹象是与所述多肽之一特异性结合的一种物质(例如抗体)也特异性地与另一种多肽结合。
序列比较可以使用Smith-Waterman序列比对算法(参见例如Waterman(1995))实施。优选地使用具有如下参数的1.16版localS程序：匹配：1、错配罚分：0.33，缺口开口罚分：2，缺口延伸罚分：2。
此外，与参考核苷酸序列“基本上相似”的核苷酸序列称作与该参考核苷酸序列“等效”。技术人员认识到由本发明包含的等效核苷酸序列也可以由它们在低严格条件、中等严格条件和/或严格条件(例如0.1×SSC、0.1％SDS、65℃)下与本权利要求书字面意思范围内的核苷酸序列杂交的能力进行定义。
当谈及多核苷酸片段或多肽片段使用“基本上相同活性”时，“基本上相同活性”的含义是所述片段具有全长多核苷酸活性或全长多肽活性的至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％和甚至90％或更高，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、大到至少99％。
“靶基因”指表达所需要的目的编码序列、功能性RNA或蛋白质的基因，如指复制子中的基因。在一个实施方案中，靶基因不是复制子复制必需的。此外，靶基因可以包含插入非本源生物的天然非病毒基因或包含嵌合基因，并且将处于适宜的调节序列控制下。因此，在所述靶基因中的调节序列可以来自任何来源，包括病毒。靶基因可以包括相对于待转化的具体植物的基因为异源性或同源的编码序列。然而，在一个实施方案中，靶基因可以是不包含天然病毒基因的基因。常见靶基因包括但不限于编码结构蛋白、种子贮藏蛋白、赋予除草剂抗性的蛋白质和赋予昆虫抗性的蛋白质的基因。由靶基因编码的蛋白质称作“外源蛋白”。植物中靶基因的表达通常将导致改变的植物性状。
术语“改变的植物性状”意指转基因植物中相对于野生型或非转基因植物宿主的任意表型变化或基因型变化。
术语“转化”指转移核酸片段至宿主细胞的基因组，产生遗传稳定的遗传。含有转化核酸片段的宿主细胞称作“转基因”细胞，并且包含转基因细胞的生物称作“转基因生物”。转化植物和植物细胞的方法实例包括农杆菌介导的转化法(DeBlaere1987)和粒子轰击技术(US4,945,050)。完整植物可以从转基因细胞通过技术人员熟知的方法再生(参见例如，Fromm1990)。
“转化的”、“转基因的”和”重组的”指其中已经导入异源性核酸分子的宿主生物，如细菌或植物。所述核酸分子可以稳定地整合至基因组中。例如，“转化的”、“转化体”和“转基因”植物或愈伤组织已经经历转化过程并且含有整合至其染色体中的外来基因。术语“未转化的”指未经历转化过程的正常植物。
“瞬时转化的”指其中转基因和外来DNA(例如通过此类方法，如农杆菌介导的转化法或生物射弹轰击法)已经导入，但是没有针对稳定维持进行选择的细胞。
“稳定转化”指转化后已经在选择性培养基上选择和再生的细胞。
“染色体整合的”指外来基因或DNA构建体通过共价键整合至宿主DNA。在基因未发生“染色体整合”的情形下，它们可以被“瞬时地表达”。基因瞬时表达指如此基因的表达，其中所述基因未整合至宿主染色体，但例如作为自主复制性质粒或表达盒的部分或作为另一种生物系统(如病毒)的部分而独立发挥作用。
“瞬时表达”指在如此细胞中的表达，在所述细胞中病毒或转基因借助病毒感染或借助此类方法如农杆菌介导的转化法、电穿孔法或生物射弹轰击法导入，但是没有针对其稳定维持进行选择。
“遗传稳定的”和“可遗传的”指在植物中稳定维持并经过连续世代由子代稳定遗传的染色体性整合性遗传元件。
“原代转化体”和“T0世代”指具有与最初所转化组织(即自转化以来没有经历减数分裂和受精)相同的遗传世代的转基因植物。
“次代转化体”和“T1、T2、T3等世代”指经一个或多个减数分裂循环和受精循环从原代转化体衍生的转基因植物。它们可以通过原代转化体或次代转化体的自我受精或原代转化体或次代转化体与其他转化或未转化的植物杂交而衍生。
“野生型”指无任何已知突变的自然界中存在的病毒或生物。
无效分离子是因孟德尔分离作用而不含转基因的转基因植物后代(或从该后代衍生的株系)。
术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物的可遗传性遗传信息。所述基因组DNA包含核DNA(又称作染色体DNA)，也包括质体(例如叶绿体)和其他细胞器(例如线粒体)的DNA。优选地，术语“基因组”或“基因组DNA”指核的染色体DNA。
术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”应当理解为独立于细胞周期状态的细胞核基因组DNA。染色体DNA因此可以在染色体或染色单体中组织，它们可能是压缩的或松散的。对染色体DNA的插入可以通过本领域已知的多种方法例如聚合酶链反应(PCR)分析法、DNA印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR证实并分析。
术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及由含有糖、磷酸酯和碱基(其为嘌呤或嘧啶)的单体(核苷酸)组成的单链或双链形式的聚合物。除非专门限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其中所述的核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外说明，特定核酸序列也内在地包括其保守修饰变体(例如简并密码子置换)和互补性序列，以及明确指出的序列。具体地，简并密码子置换可以通过产生这样的序列实现，在所述序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置置换为混合碱基和/或脱氧次黄苷残基(Batzer1991；Ohtsuka1985；Rossolini1994)。“核酸片段”是给定核酸分子的部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与将DNA中所含的信息转移至蛋白质。术语“核苷酸序列”指可以作为单链或双链的DNA或RNA聚合物，其中所述聚合物任选含有能够并入DNA或RNA聚合物的人工、非天然性或改变的核苷酸碱基。术语“核酸”或“核酸序列”也可以与基因、cDNA、DNA和由基因编码的RNA相互交换使用。
本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。在本发明的上下文中，“分离的”或“纯化的”DNA分子或“分离的”或“纯化的”多肽是这样的DNA分子或多肽，其因人为作用而脱离于其天然环境存在并且因此不是自然产物。分离的DNA分子或多肽可以以纯化形式存在或可以存在于非本源环境(例如转基因宿主细胞)内。例如“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质或其生物活性部分通过重组技术产生时，基本上没有其他细胞材料或培养基，或通过化学合成时，基本上没有化学前体或其他化学品。优选地，“分离的”核酸(优选地，蛋白质编码序列)不含在衍生该核酸的生物的基因组DNA中天然分布于该核酸侧翼的序列(即位于该核酸的5′和3′末端的序列)。例如，在不同的实施方案中，分离的核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列是在衍生所述核酸分子的细胞的基因组DNA中天然分布于该核酸分子侧翼的核苷酸序列。基本上没有细胞材料的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％、5％(干重)杂质蛋白质的蛋白质或多肽制品。当重组地产生本发明的蛋白质或其生物活性部分时，培养基优选地占少于约30％、20％、10％、或5％(干重)的化学前体或非目的蛋白质的化学品。本发明的核苷酸序列包括天然存在的序列以及突变(变异)形式。此类变体仍将具有想要的活性，即启动子活性或由非变异核苷酸序列的可读框编码的产物的活性。
就序列(例如多肽序列或核酸序列，例如本发明的转录调节性核苷酸序列)而言，术语“变体”意指基本上相似的序列。对于包含可读框的核苷酸序列，变体包括这样的序列，其中所述序列因遗传密码子简并性而编码天然蛋白质的相同氨基酸序列。诸如此类的天然存在的等位变体可以使用熟知的分子生物学技术(例如聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)鉴定。变异核苷酸序列也包括以合成方式衍生的核苷酸序列，例如通过使用位点定向诱变法产生并(对于可读框而言)编码天然蛋白质的那些核苷酸序列，以及编码相对于天然蛋白质具有氨基酸置换的多肽的那些核苷酸序列。通常，本发明的核苷酸序列变体具有相对于天然(野生型或内源性)核苷酸序列的至少40％、50％、60％，至70％，例如优选71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、至79％，通常至少80％，例如81％-84％、至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，至98％和99％核苷酸序列同一性。
特定核酸序列的“保守修饰性变异”指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸序列，或当该核酸序列不编码氨基酸序列时，指基本上相同的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意给定的多肽。例如，密码子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG均编码氨基酸精氨酸。因此，在精氨酸由密码子指定的每个位置上，该密码子可以变更成任意的所述相应密码子，而不改动编码的蛋白质。此类核酸变异是作为“保守修饰性变异”类型之一的“沉默变异”。本文所述编码多肽的每种核酸序列还描述了每种可能的沉默变异，除非另外指出。技术人员将认识到可以通过标准技术修饰核酸中的每个密码子(ATG例外，该密码子通常是仅用于甲硫氨酸的密码子)以产生功能性相同的分子，因此，编码多肽的核酸的每种“沉默变异”包含在所描述的每种序列中。
本发明的核酸分子可以进行“优化”以在目的植物中增强表达(参见例如，WO91/16432；Perlak1991；Murray1989)。以这种方式，基因或基因片段中的可读框可以利用植物优选性密码子合成(参见例如，Campbell和Gowri，1990年对宿主优选性密码子选择的讨论)。因此，可以优化核苷酸序列以在任何植物中表达。已经认识到基因序列的全部或任何部分可以是优化的或人工的，也即也可以使用人工序列或部分优化序列。变异核苷酸序列和蛋白质也包括从诱变方法和重组方法(如DNA改组法)衍生的序列和蛋白质。使用这种方法，可以操作一种或多种不同的编码序列以产生具有想要特性的新多肽。以这种方式，从相关多核苷酸序列群体产生重组多核苷酸文库，其中所述的多核苷酸序列群体包含具有相当大的序列同一性并可以在体外或体内同源重组的序列区域。本领域中已知用于这种DNA改组法的策略(参见例如，Stemmer1994；Stemmer1994；Crameri1997；Moore1997；Zhang1997；Crameri1998和US5,605,797、9、11、13、15和17,837,458)。
“变异”多肽意指通过如此方式从天然蛋白质衍生的多肽：即对所述天然蛋白质的氨基末端和/或羧基末端缺失(所谓截短)或添加一个或多个氨基酸；在所述天然蛋白质的一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸或在所述天然蛋白质的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸。此类变体可以例如因遗传多态性或因人类操作产生。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。
因此，多肽可以通过多种方法(包括氨基酸置换、缺失、截短和插入)改变。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，所述多肽的氨基酸序列变体可以通过在DNA中突变而制备。用于诱变和改变核苷酸序列的方法是本领域熟知的(参见例如，Kunkel1985；Kunkel1987；US4,873,192；Walker和Gaastra，1983及其中引用的参考文献)。不影响目的蛋白生物学活性的适宜氨基酸置换指南可以在Dayhoff等(1978)的模型中找到。优选保守性置换，如一种氨基酸与具相似特性的其他氨基酸交换。变更、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小百分比例氨基酸(一般少于5％，更一般少于1％)的个别置换、缺失或添加是“保守修饰性变异”，其中所述的变更导致氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守性置换表是本技术领域熟知的。以下五个组分别含有可以相互进行保守性置换的氨基酸：脂族氨基酸：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族氨基酸：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫氨基酸：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性氨基酸：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性氨基酸：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。还见Creighton，1984。此外，变更、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小百分比例氨基酸的个别置换、缺失或添加也是“保守修饰性变异”。
“表达盒”或“表达构建体”如本文中所用意指能够指导特定核苷酸序列在适宜宿主细胞中表达的DNA序列，其中所述DNA序列包含与目的核苷酸序列有效连接的启动子，所述目的核苷酸序列任选地与终止信号和/或其他调节元件有效连接。表达盒也可以包含对该核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区域通常编码目的蛋白，然而也可以编码有义方向或反义方向上的功能性目的RNA，例如反义RNA或非翻译性RNA。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个该表达盒的成分相对于该表达盒其他成分的至少之一是异源的。所述表达盒也可以是这样一种表达盒，其中此表达盒天然地存在，但是已经以重组形式获得用于异源性表达。表达盒可以完全在细胞外装配(例如通过重组克隆技术)。然而，表达盒也可以部分地使用内源性成分进行装配。例如，表达盒可以通过将启动子序列置于(或插入)内源性序列上游获得，其中所述的内源性序列因此功能性地与所述启动子序列连接并受其控制。类似地，待表达的核酸序列可以置于(或插入)内源性启动子序列下游，因而形成表达盒。通常，表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或受诱导型启动子控制，其中所述的诱导型启动子仅在宿主细胞暴露于某些特定外部刺激时才启动转录。本发明的表达盒、转录调节序列或启动子也可以针对特定组织或器官或发育阶段，尤其针对胚或盾片是特异性的。在一个优选实施方案中，此类表达盒将包含与目的核苷酸序列连接的本发明转录起始区。这样的表达盒优选地配备有多个限制性位点用于插入受所述调节区域转录调节的目的基因。该表达盒可以额外地含有选择标记基因。这种表达盒在转录的5′-3′方向包括转录和翻译起始区、目的DNA序列以及植物中有功能的转录和翻译终止区。所述终止区可以与转录起始区是天然关系，可以与目的DNA序列是天然关系或可以从另一来源衍生。便利的终止区可以从根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒获得，如章鱼碱合酶终止区和胭脂碱合酶终止区和下文描述的其他终止区(还参见Guerineau1991；Proudfoot1991；Sanfacon1991；Mogen1990；Munroe1990；Ballas1989；Joshi1987)。
“载体”定义为尤其包括双链或单链的直链或环状形式的任意质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌双元载体，它们可以或不可以自我传播或运动，和可以通过整合至细胞基因组而转化原核或真核宿主，或者以染色体外方式存在(例如具有复制起点的自主复制质粒)。
具体地包括穿梭载体，所述的穿梭载体意指能够天然地或通过设计在两种不同宿主生物中复制的DNA运载体，其中所述的宿主生物可以选自例如放线菌(actinomycete)和相关物种，如酿酒酵母(Sacharomycescerevisiae)、细菌和真核生物(例如高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。
优选地，所述载体中的核酸处于适宜启动子或其他调节元件控制下并与其有效连接以在宿主细胞如微生物(例如细菌)细胞或植物细胞中转录。该载体可以是在多种宿主中有功能的双功能表达载体。在基因组DNA的情况下，所述核酸可以含有自身启动子或其他调节元件，并且在cDNA的情况下，所述核酸可以处在适宜启动子或其他调节元件控制下以在宿主细胞中表达。
“克隆载体”通常含有一个或少数限制性核酸内切酶识别位点和在鉴定并选择以所述克隆载体转化的细胞中适用的标记基因，其中外来DNA序列可以按照确定方式插入所述限制性核酸内切酶识别位点，同时该载体的基本生物学功能不丧失。标记基因一般包括提供四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
“转基因植物”是具有一个或多个含有表达载体或重组表达盒(如本发明表达盒)的植物细胞的植物。
“植物组织”包括分化和未分化的组织或植物，包括但不限于根、茎、苗、叶、花粉、种子、瘤组织和多种形式的细胞和培养物，如单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织。所述植物组织可以处于植物中或位于器官、组织或细胞培养物中。
如下术语用于描述两个或多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分数”和(e)“相当大的同一性”。
(a)如本文中所用，“参考序列”是作为序列比较基础使用的定义序列。参考序列可以是指定序列的子集或全体；例如，作为全长cDNA或基因序列的节段或完整cDNA或基因序列。
(b)如本文中所用，“比较窗口”指多核苷酸序列中连续且指定的节段，其中与所述参考序列(不包含添加或缺失)相比，在比较窗口中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即缺口)以便这两个序列的最佳比对。通常，所述比较窗口是至少20个连续核苷酸长度并且任选地可以是30、40、50、100个连续核苷酸长度或更长。本领域技术人员理解为避免因多核苷酸序列中包含缺口而与参考序列高度相似，一般引入并从匹配数中扣减缺口罚分。
用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。因此，使用数学算法可以实现任意两个序列之间同一性百分数的确定。此类数学算法的优选非限制性实例是Myers和Miller(1988年)算法；Smith等(1981年)局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970年)同源性比对算法；Pearson和Lipman(1988年)相似性搜索法；Karlin和Altschul(1990年)算法，该算法在Karlin和Altschul(1993年)中改良。
这些数学算法的计算机执行可以用于序列比较以确定序列同一性。这类执行包括但不限于：在PC/Gene程序(可从Intelligenetics，MountainView，Calif.获得)的CLUSTAL；ALIGN程序(版本2.0)和(从GeneticsComputerGroup(GCG)，575ScienceDrive，Madison，Wis.，USA可获得的)WisconsinGeneticsSoftwarePackage，版本8中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。可以使用默认执行参数，使用这些程序开展比对。已充分描述了CLUSTAL程序(Higgins1988年，1989年；Corpet1988年；Huang1992；Pearson1994年)。ALIGN程序以上述Myers和Miller的算法为基础。Altschul等1990年的BLAST程序以上述Karlin和Altschul的算法为基础。优选地使用ClustalW算法(Thompson1994年；例如在软件VectorNTITM，版本9；InvitrogenInc.)，评分矩阵BLOSUM62MT2，默认设置(缺口开口罚分15/19，缺口延伸罚分6.66/0.05；缺口分离罚分范围8；比对延误的％同一性40；使用残基特异性缺口和亲水性残基缺口)开展多重比对(即多于2种序列)。
可从NationalCenterforBiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得开展BLAST分析的软件。这种算法包括首先通过确定提交序列中长度为W的短字而确定高评分序列对(HSP)，其中与数据库序列中长度相同的字比对时，所述的短字匹配或满足某些正值阈评分T。T称作邻近字评分阈值(Altschul1990)。这些初始性邻近字命中充当种子用于启动搜索以发现含有这些种子的更长HSP。所述的字命中随后在两个方向上沿每个序列尽可能远地延伸，只要可以提高累积性比对评分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的回馈评分；总是＞0)和N(错配残基的惩罚评分；总是＜0)计算所述累积性评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算所述累积性评分。当该累积性比对评分以量X从其最大实现值上降低时，则停止每一方向上的字命中延伸，所述累积性评分变成零或以下，原因在于累积了一个或多个负评分性残基比对结果或抵达两种序列之一的末尾。
除了计算序列同一性百分数之外，BLAST算法还开展两个序列之间相似性的统计分析(参见例如Karlin和Altschul(1993).由BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，这种统计分析提供了两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配会因偶然发生匹配的概率的指示。例如，若最小总和概率在一个试验核酸序列与参考核酸序列的比较结果中小于约0.1，更优选地小于约0.01和最优选地小于约0.001，则认为该试验核酸序列与此参考序列相似。
为出于比较目的获得缺口比对结果，可以利用(BLAST2.0中的)GappedBLAST，如Altschul等1997年所述。或者，可以使用(BLAST2.0中的)PSI-BLAST开展可检测分子之间远缘关系的多重搜索。见上文Altschul等。利用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST时，可以使用各自程序的默认执行参数(例如BLASTN用于核苷酸序列、BLASTX用于蛋白质)。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长度(W)11、期望(E)10、界限值100、M＝5、N＝-4并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长度(W)3、期望(E)10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，1989)。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。也可以人工地通过观察进行比对。
为了本发明的目的，优选地使用具有其默认执行参数的BlastN程序(版本1.4.7或更新的版本)或任何等效程序开展核苷酸序列比较，以确定与本文中公开的启动子序列的序列同一性百分数。“等效程序”意指任意的序列比较程序，即针对所讨论的任意两个序列，与通过优选程序生成的对应比对结果相比，所述的序列比较程序产生具有相同核苷酸匹配或相同氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分数的比对结果。
(c)如本文中所用，“序列同一性”或“同一性”在两个核酸序列或多肽序列的情况中意指在指定比较窗口范围内为最大对应进行比对时，这两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数用于蛋白质时，认识到不相同的残基位置经常因保守性氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基被替换为具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并且因而并不改变该分子的功能特性。当序列因保守性置换而不同时，序列同一性百分数可以上调以校正置换的保守性本质。因此类保守性置换而不同的序列称作具有“序列相似性”或“相似性”。本领域技术人员熟知开展这种调整的方法。通常，这种方法包括将一个保守性置换评定为部分错配而非完全错配，因而提高序列同一性百分数。因此，例如，当给予相同氨基酸评分1并且给予非保守性置换评分0时，则给予保守性置换0-1之间的评分。保守性置换的评分例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics，MountainView，Calif.)中执行那样计算。
(d)如本文中所用，“序列同一性百分数”意指通过比较一个比较窗口范围内两个最佳比对序列所确定的值，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比时，所述多核苷酸序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即缺口)以最佳比对这两种序列。通过这种方式计算该百分数，即通过确定其中相同核酸碱基或相同氨基酸残基在两个序列内均存在的位置数目以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并且结果乘以100以产生所述序列同一性百分数。
(e)(i)术语多核苷酸序列的“相当大的同一性”意指包含如此序列的多核苷酸，其中使用所述的比对程序之一，利用标准参数与参考序列相比时，所述序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％、优选至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更优选至少90％、91％、92％、93％或94％和最优选至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。考虑到密码子简并性、氨基酸相似性、读码框位置等，本领域技术人员将认识到这些值可以适度地调整以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。出于这些目的，氨基酸序列的相当大的同一性通常意指至少60％或70％、更优选至少80％、90％，和最优选至少95％序列同一性。
核苷酸序列是基本上相同的另一个指标是两种分子是否在严格条件下(参见下文)相互杂交。通常，选择的严格条件是在定义的离子强度和pH处低于具体序列的热解链温度(Tm)约5℃。然而，严格条件包括范围在约1℃-约20℃范围的温度，这取决于如本文中另外定义的所需严格性程度。若核酸编码的多肽是基本上相同的，则在严格条件下相互不杂交的核酸仍是基本上相同的。例如当使用遗传密码子所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，这种情况可以出现。当第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽出现免疫交叉反应时，则表明这两个核酸序列基本上相同。
(ii)术语“相当大的同一性”在肽的情况下指肽包含这样的序列，其中所述序列相对于指定比较窗口中的参考序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％、优选80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更优选至少90％、91％、92％、93％或94％或甚至更优选地95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。优选地，使用Needleman和Wunsch(1970)同源性比对算法实施最佳比对。当一种肽与针对第二种肽的抗体发生免疫交叉反应时，则表明这两种肽序列是基本上相同的。因此，例如在两种肽仅因保守性置换而不同时，这种肽与第二种肽是基本上相同的。
对于序列比较，通常一种序列充当参考序列，将试验序列与之比较。当使用序列比较算法时，将试验序列和参考序列输入计算机，根据需要指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。基于指定的程序参数，该序列比较算法随后计算试验序列相对于参考序列的序列同一性百分数。
如上所述，两个核苷酸序列基本上相同的另一个指标是两个分子在严格条件下相互杂交。短语“特异性杂交至”指一种分子仅与一个特定核苷酸序列在严格条件下结合、配对或杂交，此时所述序列存在于复杂混合物(例如总细胞)DNA或RNA中。“基本上结合”指探针核酸与靶核酸之间的互补性杂交并且包括可通过降低杂交介质的严格性而容忍的少量错配，以实现所需要的靶核酸序列检测。
“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”在核酸杂交实验如Southern和Northern杂交的上下文中是序列依赖性的并且在不同环境参数下是不同的。Tm是(在定义的离子强度和pH下)50％靶序列与完全匹配性探针杂交的温度。特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是终末洗液的离子强度和温度。对DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl，1984的等式近似计算：
Tm＝81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L
其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶的百分含量。％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分含量并且L是杂交体的碱基对长度。对于每1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可以调节Tm、杂交条件和/或洗涤条件以便与具有目的同一性的序列杂交。例如，若寻求具有＞90％同一性的序列，则Tm可以减少10℃。通常，选择的严格条件是在定义的离子强度和pH处低于具体序列和其互补序列的热解链温度I约5℃。然而，极严格条件可以使用在比热解链温度I低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格的条件可以使用在比热解链温度I低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以使用在比热解链温度I低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗涤组合物以及想要的T，技术人员将理解杂交溶液和/或洗涤溶液严格性的变化是内在描述的。若所需的错配程度导致小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T，优选提高SSC浓度，从而可以使用较高温度。关于核酸杂交的深入指南可在Tijssen，1993中找到。通常，选择高度严格杂交条件和洗涤条件是在定义的离子强度和pH处低于具体序列的热解链温度Tm约5℃。
高度严格洗涤条件的实例是0.15MNaCl，在72℃持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是0.2×SSC，在65℃洗15分钟(对于SSC缓冲液的描述，尤其参见Sambrook)。低严格洗涤往往先于高严格洗涤进行，以除去背景探针信号。对双链体(例如超过100个核苷酸)的中等严格性洗涤的实例是1×SSC，在45℃持续15分钟。对双链体(例如超过100个核苷酸)的低严格洗涤的实例是4×至6×SSC，在40℃持续15分钟。对于短探针(例如约10个至50个核苷酸)，严格条件通常包括在pH7.0-8.3，低于约1.5M的盐浓度，更优选约0.01-1.0M的Na离子浓度(或其他盐)，并且温度一般是至少约30℃且对于长探针(例如＞50个核苷酸)是至少约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)实现。通常，信噪比2倍(或更高倍)于特定杂交分析中对非相关性探针观察到的信噪比时，表明检测到特异性杂交。在严格条件下相互不杂交的核酸，如果它们编码的多肽基本上相同，则仍基本上是相同的。例如当使用遗传密码子所允许的最大密码子简并性产生核酸的拷贝时，这种情况可以出现。
选择非常严格条件等同于具体探针的Tm。对于DNA或RNA印迹中在滤纸上具有超过100个互补残基的互补核酸杂交的严格条件的实例是50％甲酰胺，例如在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中于37℃杂交并在0.1×SSC于60℃-65℃洗涤。示例性低严格条件包括使用含30％-35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交并在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50℃-55℃洗涤。示例性的中等严格条件包括使用含40％-45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS在37℃杂交并在0.5×至1×SSC中于55℃-60℃洗涤。
如下是可以用来克隆与本发明参考核苷酸序列基本上相同的直向同源性核苷酸序列的杂交/洗涤组合条件的实例：直向同源性核苷酸序列优选地与参考核苷酸序列在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC、0.1％SDS中洗涤，更希望是在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃在1×SSC、0.1％SDS中洗涤，还更希望是在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC、0.1％SDS中洗涤，优选地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤，更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。
“DNA改组法”是在DNA分子中导入、优选随机导入突变或重排的方法或在两种或多种DNA分子之间产生、优选随机产生DNA序列交换的方法。因DNA改组法而产生的DNA分子是改组的DNA分子，该DNA分子是从至少一个模板DNA分子衍生的非天然存在的DNA分子。改组的DNA优选地编码变异多肽，其中所述的变异多肽相对于由所述模板DNA编码的多肽是修饰的，并且相对于由所述模板DNA编码的多肽而言，可以具有改变的生物学活性。
“重组DNA分子”是使用例如Sambrook等，1989中描述的用来将DNA序列连接起来的重组DNA技术和方法连接在一起的DNA序列的组合。
本发明尤其在单子叶植物中应用。术语“单子叶植物”包括具有多个倍性水平的植物，所述的倍性水平包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。还包括成熟的植物、种子、苗和籽苗，和部分、繁殖材料(例如种子和果实)以及从中衍生的培养物，例如细胞培养物。一年生和多年生单子叶植物是旨在产生转基因植物的优选宿主生物。
此外，本发明包括成熟的植物、种子、苗和籽苗，和部分、繁殖材料以及从中衍生的培养物，例如细胞培养物。成熟的植物指除籽苗发育阶段之外处于任意发育阶段上的植物。术语“籽苗”指处于发育早期的年幼不成熟植物，在所述的发育早期上籽苗仍依赖于贮藏在种子中(例如胚乳、外胚乳或子叶中)的同化产物。本发明包括竹亚科(Bambusoideae)(例如bamboo属)、Andropogonoideae(例如甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)或玉蜀黍属(Zea))、芦竹族(Arundineae)(例如芦苇属(Phragmites))、稻亚科(Oryzoideae)(例如稻属(Oryza))、黍亚科(Panicoideae)(例如黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)和狗尾草属(Setaria))、早熟禾亚科(Pooideae)(羊茅亚科(Festuciadeae))(例如早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)、三毛草属(Trisetum)、剪股颖属(Agrostis)、梯牧草属(Phleum)、鸭茅属(Dactylis)、看麦娘属(Alopecurus)、燕麦属(Avena)、小麦属(Triticum)、黑麦属(Secale)和大麦属(Hordeum))的全部属。优选的是燕麦(Avenasativa)(燕麦)、簕竹属物种(Bambusasp.)和印度箣(Bambusabambos)(bamboo)、甘蔗(Saccharumofficinarum)(甘蔗)、栽培二粒小麦(Triticumdicoccum)(二粒小麦(Emmerwheat))、栽培一粒小麦(Triticummonococcum)(一粒小麦(Einkornwheat))、斯卑尔脱小麦(Triticumspelta)(斯卑尔脱小麦(speltawheat))、硬粒小麦(Triticumdurum)(小麦)、圆锥小麦(Triticumturgidum)、普通小麦(Triticumaestivum)(小麦)、玉蜀黍(玉米(maize)/玉米(corn))、稷(Panicummiliaceum)(普通黍)、Pennisetumthiphoide(Bulrushmillet)、大麦(Hordeumvulgare或H.sativum)(大麦)、稻(Oryzasativa)(稻)、水生菰(Zizaniaaquatica)(野生稻(wildrice))、黑麦(Secalecereale)(黑麦)、高粱(Sorghumbicolor)(S.vulgare)(高粱)。更优选小麦(Triticumspp.)、稻(Oryzaspp.)、大麦(Hordeumspp.)、燕麦(Avenaspp.)、黑麦(Secalespp.)、玉米(玉蜀黍)、高粱和黍(Pennisettumspp)。更优选的是小麦(小麦属物种(Triticumspp.))、稻(稻属物种(Oryzaspp.))、大麦(大麦属物种(Hordeumspp.))、燕麦(燕麦属物种(Avenaspp.))、黑麦(黑麦属物种(Secalespp.))、玉米(玉蜀黍)、高粱和谷子(黍属物种(Pennisettumspp))。优选的是小麦家族的全部小麦种(包括冬小麦和春小麦)、更具体是普通小麦(Triticumspp.：common(T.aestivum))、硬粒小麦(T.durum)、斯卑尔脱小麦(T.spelta)、栽培二粒小麦、圆锥小麦和栽培一粒小麦，特别优选普通小麦。本发明的方法可以用来从春小麦(例如Bobwhite、Marshall、PIVOT1、UC702和Panewawa)和从冬小麦(例如HY368、Neeley、FL302、RH91、R332、R1269和R585)产生的转基因植物。其他合适的小麦基因型包括但不限于YecoraRojo、Karl和Anza。然而，应当指出本发明不限于某些品种，而是高度基因型非依赖的。
词语“植物”指任何植物，尤其指农学有用的植物(例如种子植物)，并且“植物细胞”是植物的结构单元和生理单元，其包含细胞壁，然而还可以指原生质体。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养的细胞形式，或作为更高级有机体单元的部分，其中更高级有机体单元例如是植物组织，或分化成为植物任何发育阶段上均存在的结构的植物器官。此类结构包括一种或多种植物器官，包括但不限于果实、苗、茎、叶、花瓣等。优选地、术语“植物”包括完整植物、苗营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)，和前述对象的后代。
“显著增加”是大于测量技术中固有误差边界的增加，优选增加约2倍或更多倍。
“显著少于”意指大于测量技术中固有误差边界的减少，优选减少约2倍或更多倍。
发明详述
本发明的第一个实施方案涉及
包含表达盒的植物或植物细胞，所述的表达盒包含
a)选自以下的第一核酸分子
i)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
ii)与SEQIDNO：1的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；和
iii)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸中至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，
和与其有效连接的
b)第二核酸分子，其选自以下多核苷酸
i)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
ii)与SEQIDNO：3的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；和
iii)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，
并且与至少一个核酸有效连接，其中所述的至少一个核酸相对于转录调节序列的所述第一或第二核酸序列是异源的，并且能够适用于向植物赋予提高的产量和/或提高的胁迫耐受性和/或提高的种子或籽苗营养品质和/或油含量。
优选地，所述嵌合性转录调节核苷酸序列引起所述异源性DNA优势地在萌芽胚中表达。这种表达模式对如下应用特别有用：
i)增强胁迫因子抗性：现有技术中如上所述，胚对各种生物性和非生物性胁迫因子(干旱、寒冷、疾病等)非常敏感。这些胁迫因子直接影响产量和作物品质。本领域中已知的绝大多数启动子在胚期没有表达能力或具有低表达能力。本文中公开的转录调节特异性尤其用来按需要表达胁迫抗性基因，即在合适时间到达高水平。此外，由于淀粉胚乳中的特异性，有可能寻求解决胁迫抗性的新途径。因为淀粉胚乳是滋养胚的组织，故可以通过改善胚的养分补充而提高胁迫抗性。
ii)提高的种子营养品质或籽苗营养品质：嵌合的转录调节核酸序列(例如超级启动子)的表达模式允许转化种子(谷粒)成分或允许改变种子中成分的分布。例如，可以将糖类(淀粉)转化成油或其它高价值成分(例如维生素)或可以使成分从胚乳转移至胚，因而提供具有改善的营养价值的籽苗。
iii)提高产量：提高的产量部分地与胁迫抗性(见以上i))相关。然而，嵌合的转录调节核酸序列(例如超级启动子)的表达模式甚至允许在无胁迫因子下通过优化胚生长而增加产量，其中胚的生长将直接影响幼苗生长。还可以实现田间条件下更早的萌发以及会引起更高或更早产量的其它性状。
iv)靶向的序列切除。如上所述，均一地切除序列(尤其标记序列)是生物技术领域内未解决的问题。绝大多数植物表现出嵌合样切除模式，既有成功切除的区域，又有未切除的区域。当生物不是由众多植物组成时，为实现均一或基本均一的切除，优选地需要在发育早期激活切除机制。此外需要强烈的激活(即切除介导酶的表达)。这两种要求均由本文中公开的嵌合的转录调节核酸序列(例如超级启动子)的表达模式满足。早期胚萌发中的强烈转录活性允许在该时期有效地切除标记，由此产生无靶序列(例如无标记)的植物。
“萌芽胚特异性转录”在本发明上下文中意指核酸序列由转录调节元件以如此方式转录，从而所述核酸序列在萌芽植物、优选在萌芽胚中的转录作用提供了大于90％、优选大于95％、更优选大于99％的在所述发育阶段期间从完整植物、种子或籽苗中转录的全部RNA量。
1.嵌合性转录调节核酸序列
在其最一般形式中，包含编码嵌合性转录调节核苷酸序列的多核苷酸的核酸分子包含
i)选自以下的第一核酸分子
a)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：1的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；和
c)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸中至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，和
ii)第二核酸分子，其选自以下多核苷酸
a)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：3的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；和
c)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，
其中所述的第一和第二核酸序列是功能性连接的并且彼此是异源的。
当在DNA区域如启动子、转录调节性核酸序列或上游激活性序列的上下中使用时，术语“衍生”指如此情形，其中衍生的DNA区域从天然存在的DNA区域或其他来源的DNA区域获得或基于这些区域获得。衍生的DNA区域可以与天然存在的DNA区域或其他来源的DNA区域不同，通常是通过故意的突变而不同。
1.1本发明的嵌合性转录调节核苷酸序列和其功能性元件的衍生物和变体
在本文公开的本发明构思了：除了本文中公开的具体嵌合性转录调节核苷酸序列和其特定元件之外，还可以使用所述序列的衍生物和变体。
所述具体嵌合性转录调节核苷酸序列和其特定元件的衍生物可以包括但不限于序列缺失、单个或多个点突变、在特定限制性酶位点处改变、添加功能性元件或分子修饰的其他方法。这种修饰可以或不可以增强，或可以或不可以改变所述序列的转录调节活性。
例如，本领域技术人员可以限定所述序列中的功能性元件并且删除任意非必需元件。可以修饰或组合功能性元件以增加本发明序列的用途或表达用于任意具体应用。也可以通过除去或删除非必需序列而不删除必需序列，获得本发明的转录调节性核苷酸序列的功能性等效片段。所述转录调节性核苷酸序列缩减至其介导转录的必需元件可以体外通过试误法(trial-and-error)缺失突变或在计算机(insilico)中使用启动子元件搜索常用程序在体外实现。启动子活性必需的区域经常显示某些已知启动子元件的簇集。此类分析可以使用可获得的计算机算法如PLACE(“植物顺式作用调节性DNA元件(PlantCis-actingRegulatoryDNAElements)”；Higo1999，BIOBASE数据库“Transfac”(BiologischeDatenbankenGmbH，Braunschweig；Wingender2001)或数据库PlantCARE(Lescot2002)进行。尤其优选的是转录调节性核苷酸序列的等效片段，其中所述的等效片段通过删除编码mRNA的5’非翻译区的区域，因而仅提供(非转录的)启动子区域而获得。所述5’非翻译区可以轻易地通过本领域已知的方法(如5’-RACE分析)确定。因此，本发明的一些转录调节性核苷酸序列是其他序列的等效片段。
如上所示，本发明启动子的缺失突变体可随机地制备并随后进行分析。使用这种策略，制备了一系列构建体，每种构建体含有所述克隆的不同部分(亚克隆)，并且随后筛选这些构建体的活性。用于筛选活性的合适方法是将含有缺失节段的缺失型启动子构建体连接至选择标记或筛选标记，并且仅分离可表达所述标记基因的那些细胞。以这种方式，鉴定了众多不同的缺失型启动子构建体，它们仍保留想要的或甚至增强的活性。因此，通过比较所选择的构建体鉴定到活性必需的最小节段。随后，该节段可以用来构建表达外源基因的载体。
在编码任意启动子序列的DNA节段中诱变或产生缺失的方法是本领域技术人员熟知的并且公开于例如US6,583,338，其中所述文献通过引用的方式完整地并入本文。本发明的某些变异核苷酸序列仍保留生物学活性(即以如以上定义的模式调节转录)。调节性序列变体的一个实例是通过从较长启动子中进行一个或多个缺失所形成的启动子。启动子的5’部分直至接近转录起点的TATA盒有时可以缺失，而不消除启动子活性，如Zhu等，(1995)ThePlantCell7：1681-1689描述。除去部分DNA序列的常规方法是结合DNA扩增，使用外切核酸酶，以产生双链DNA克隆的单向巢式缺失。用于此目的的商业试剂盒在商品名Exo-Size.TM.(NewEnglandBiolabs，Beverly，Mass.)下出售。生物学活性变体还包括例如具有一个或多个核苷酸置换、缺失或插入的本发明天然启动子序列。
衍生物和变体也包括来自其他物种，如但不限于细菌、真菌和植物的同源物、旁系同源物和直向同源物。“同源物”是本领域用来指示与参考序列具有高程度序列相关性的多核苷酸或多肽序列的类属性术语。这种相关性可以通过确定两个序列之间如前文定义的同一性和/或相似性程度加以量化。术语“直向同源物”和“旁系同源物”属于这个类属性术语。“旁系同源物”指相同物种中功能相似的多核苷酸或多肽。“直向同源物”指这样的多核苷酸或多肽，其是另一个物种中所述多核苷酸或多肽的功能等同物。直向同源基因优选地意指编码直向同源蛋白质的基因。更具体地，术语“直向同源物”指从一个物种获得的多肽或蛋白质，其中所述的多肽或蛋白质是来自不同物种的多肽或蛋白质的功能性对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
优选地，嵌合性转录调节核苷酸序列的变体或衍生物的转录调节活性基本上与本文具体公开的嵌合性转录调节核苷酸序列的转录调节活性(即以如上所述的萌芽胚特异性方式调节表达)相同(或等效)。除此之外，衍生物或变体的转录调节活性也可以与其亲本序列的活性不同，尤其在表达水平方面如此。所述表达水平可以高于或低于亲本序列的表达水平。这两种偏离可能是有利的，这取决于待表达的目的核酸序列。优选这类功能性等效序列，其中与亲本序列相比，所述的功能性等效序列偏离所述亲本序列的表达水平不超过50％、优选25％、更优选10％(如优选地通过mRNA表达或蛋白质(例如报道基因)表达进行判断)。更优选这样的等效序列，其与它的亲本序列相比显示表达增加，优选增加达至少50％，更优选至少100％，最优选至少500％。此类表达模式优选地使用与所述转录调节性核苷酸序列有效连接的报道基因证实。在本上下文中的优选报道基因(Schenborn1999)是绿色荧光蛋白(GFP)(Chui1996；Leffel1997)、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶(Millar1992)、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。特别优选β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson1987)。分析转录性调节作用的其他方法是本领域熟知的并且包括RNA印迹和RT-PCR(参见例如以上提到的本文中引用作为参考的Sambrook等)。
在一个优选实施方案中，所述转录调节性核苷酸序列由包含多核苷酸的分离的核酸分子描述，所述的多核苷酸编码选自以下的序列
i)由SEQIDNO：1描述的序列；
ii)由SEQIDNO：1描述的序列的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段
iii)与由SEQIDNO：1描述的序列具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列，
iv)能够与由SEQIDNO：1描述的序列或其互补物杂交(所述杂交优选地在如上文“定义”部分中定义的低严格条件下、更优选在中等严格条件下、最优选在高严格条件下，例如在等效于如下的条件下进行：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤、更希望在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、仍更希望在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、优选地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤)的核苷酸序列；
v)核苷酸序列，能够与包含由SEQIDNO：1描述的序列的50-200个或更多个连续核苷酸(如50或100个、优选150或200个、更优选250或400个连续核苷酸、最优选全部序列)的核酸或其互补物杂交(所述杂交优选地在如上文“定义”部分中定义的低严格条件下、更优选在中等严格条件下、最优选在高严格条件下，例如在等效于如下的条件下进行：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤、更希望在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、仍更希望在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、优选地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤)；
vi)作为前述在i)-v)下提及的任一核苷酸序列的互补物或反向互补物的核苷酸序列。
在另一个优选实施方案中，所述上游激活性序列由包含多核苷酸的核酸分子描述，所述的多核苷酸编码选自以下的序列
i)由SEQIDNO：3描述的序列，
ii)由SEQIDNO：3描述的序列的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段，
iii)与由SEQIDNO：3描述的序列具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列，
iv)能够与由SEQIDNO：3描述的序列或其互补物杂交(所述杂交优选地在如上文“定义”部分中定义的低严格条件下、更优选在中等严格条件下、最优选在高严格条件下，例如在等效于如下的条件下进行：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤、更希望在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、仍更希望在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、优选地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤)的核苷酸序列；
v)核苷酸序列，能够与包含由SEQIDNO：3描述的序列的50-200个或更多个连续核苷酸(如50或100个、优选150或200个、更优选250或400个连续核苷酸、最优选全部序列)的核酸或其互补物杂交(所述杂交优选地在如上文“定义”部分中定义的低严格条件下、更优选在中等严格条件下、最优选在高严格条件下，例如在等效于如下的条件下进行：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤、更希望在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、仍更希望在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、优选地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤)；
vi)作为前述在i)-v)下提及的任一核苷酸序列的互补物或反向互补物的核苷酸序列。
上文定义的任意所述嵌合性转录调节序列的在ii)、iii)、iv)、v)和vi)下详述的序列优选地能够调节单子叶植物细胞或生物中的转录，它们更优选地能够诱导胚特异性表达。优选地，在iv)或v)下详述的序列在严格条件下与所述靶序列杂交。
优选地，所述核苷酸序列同一性通过使用带其默认执行参数(字长度(W)11、期望(E)10、截止值100、M＝5、N＝-4并比较两条链)的BlastN程序(版本1.4.7或更新版本)或任何等效程序确定。
在杂交技术中，使用已知核苷酸序列的全部或部分作为选择性地与其他相应核苷酸序列杂交的探针，其中所述的其他相应核苷酸序列存在于来自所选生物的克隆基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组文库或cDNA文库)的群体中。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团如32P或任何其他可检测标记物标记。因此，例如，用于杂交的探针可以通过标记以本发明序列为基础的合成寡核苷酸进行制造。用于制备杂交探针的方法和用于构建cDNA文库和基因组文库的方法通常是本领域已知的并且在Sambrook等(1989)中公开。通常，与本文公开的序列杂交的序列将与所述公开的序列具有至少约60％-70％并且甚至约80％、85％、90％、95％-98％或更多同一性。即，序列的序列相似性可以变化，共有至少约60％-70％并且甚至约80％、85％、90％、95％-98％的序列相似性。
如表8和表9中所示的本发明常见核心启动子基序包含四个充分定义的核苷酸，在所述启动子基序5′和3′端侧翼均分布有一串任意核苷酸。例如，GAPB/GAP.01启动子基序包含如SEQIDNO：26中定义的15个核苷酸“aaaaATGAatagaaa”，其中“nnnnATGAnnnnnnn”是如SEQIDNO：27中描述的核心GAPB/GAP.01启动子基序，其中n选自a、c、t和g。在核心启动子基序的5′端或3′端处的数值n对应于分别在5′端或3′端处，在相应启动子基序中的核心启动子基序侧翼分布的核苷酸数目。例如下文所示，计算核心启动子基序相对于相应启动子基序的同一性百分数。当SEQIDNO：26的核心GAPB/GAP.01启动子基序中的两个“n”与SEQIDNO：27的GAPB/GAP.01启动子基序在相应位置处的核苷酸相同，例如n(2)＝a和n(4)＝a时，所述同一性百分数通过相同核苷酸(包括所述四个核心核苷酸)总数除以该启动子基序的全部长度而确定，即6/15＝40％。当SEQIDNO：26的核心GAPB/GAP.01启动子基序中的5个“n”与SEQIDNO：27的GAPB/GAP.01启动子基序在相应位置处的核苷酸相同，例n(1)＝a，n(3)＝a，n(10)＝t，n(12)＝g和n(14)＝a时，所述同一性百分数是9/15＝60％。
在Ar.cor78中鉴定出的启动子基序和核心启动子基序在表8和表9中显示。更具体地，SEQIDNOs：10、12、14、17、20、22、25、27、29、31、33、35、37、39、42、44、46、48、50、53、55、57、59、63、66、68、70、72、74、77、79、82、84、86、88、90、94、96、98、102、104、108、112、114、117、121、123、125、127、129、131、137和138是Ar.cor78启动子中鉴定出的核心启动子基序。SEQIDNOs：9、11、13、15、16、18、19、21、23、24、26、28、30、32、34、36、38、40、41、43、45、47、49、51、52、54、56、58、60、61、62、64、65、67、69、71、73、75、76、78、80、81、83、85、87、89、91、92、93、95、97、99、100、101、103、105、106、107、109、110、111、113、115、116、118、119、120、122、124、126、128、130、132、133、134、135和136是Ar.cor78启动子中鉴定出的启动子基序。拟南芥属植物cor78启动子(SEQIDNO：1)例如在(Horvath1993)和(Gilmour等，1991；Nordin等，1991)中描述。在一些情况下，如表9中所示，一种核心启动子基序与具有不同侧翼5′和3′核苷酸的位于At.cor78不同位置的启动子基序相对应。
本发明还涉及包含多核苷酸的核酸分子，其中所述的多核苷酸编码包含至少两个核心启动子基序的转录调节序列，所述的核心启动子基序选自如SEQIDNOs：10、12、14、17、20、22、25、27、29、31、33、35、37、39、42、44、46、48、50、53、55、57、59、63、66、68、70、72、74、77、79、82、84、86、88、90、94、96、98、102、104、108、112、114、117、121、123、125、127、129、131、137和138中定义的序列。优选地，SEQIDNOs：10、12、14、17、20、22、25、27、29、31、33、35、37、39、42、44、46、48、50、53、55、57、59、63、66、68、70、72、74、77、79、82、84、86、88、90、94、96、98、102、104、108、112、114、117、121、123、125、127、129、131、137和138的核心启动子基序分别与SEQIDNOs：9、(11、18)、13、(15、16)、19、(21、23、61、92)、(24、75)、(26、40)、28、30、(32、51、80、105、109)、34、36、38、41、(43、64、132)、45、47、49、52、(54、99)、(56、119)、(58、60)、62、65、67、69、71、73、76、78、81、83、85、(87、100、106、110)、(89、91)、93、95、97、101、103、107、111、(113、115)、(116、118)、120、122、124、126、128、(130、134、135)、136和133是30-40％、优选40-50％或更优选50-60％或更高地同一的。更优选地，SEQIDNOs：10、12、14、16、19、22、24、27、29、31、33、35、37、39、41、44、46、48、50、52、55、57、59、61、65、68、70、72、74、76、79、81、84、86、88、90、92、96、98、100、104、106、110、114、116、119、123、125、127、129、131、133、139和140的核心启动子基序分别与SEQIDNOs：9、(11、18)、13、(15、16)、19、(21、23、61、92)、(24、75)、(26、40)、28、30、(32、51、80、105、109)、34、36、38、41、(43、64、132)、45、47、49、52、(54、99)、(56、119)、(58、60)、62、65、67、69、71、73、76、78、81、83、85、(87、100、106、110)、(89、91)、93、95、97、101、103、107、111、(113、115)、(116、118)、120、122、124、126、128、(130、134、135)、136和133是60-70％、优选地70-80％或更优选地80-90％或更高地同一的。最优选地，SEQIDNOs：10、12、14、16、19、22、24、27、29、31、33、35、37、39、41、44、46、48、50、52、55、57、59、61、65、68、70、72、74、76、79、81、84、86、88、90、92、96、98、100、104、106、110、114、116、119、123、125、127、129、131、133、139和140的核心启动子基序分别与SEQIDNOs：9、(11、18)、13、(15、16)、19、(21、23、61、92)、(24、75)、(26、40)、28、30、(32、51、80、105、109)、34、36、38、41、(43、64、132)、45、47、49、52、(54、99)、(56、119)、(58、60)、62、65、67、69、71、73、76、78、81、83、85、(87、100、106、110)、(89、91)、93、95、97、101、103、107、111、(113、115)、(116、118)、120、122、124、126、128、(130、134、135)、136和133是90-95％或优选95-99％同一的。
1.2用于本发明的表达盒和载体的额外调节元件和功能性元件
本发明的表达盒可以包含其他调节元件。该术语在本上下文中应当作广义理解，包含可以影响表达盒的构建或功能的全部序列。调节元件可以例如在原核或真核生物中调节转录和/或翻译。在一个优选的实施方案中，本发明的表达盒包含转录调节序列和任选地额外的调节元件，每一所述转录调节序列和任选地额外的调节元件与待表达的核酸序列(或转录调节性核苷酸序列)有效连接。
多种5’和3’转录调节序列可用于本发明中。转录终止子负责终止转录和使mRNA正确地聚腺苷酸化。3’非翻译调节性DNA序列优选地包含约50-约1000个、更优选约100-约1000个核苷酸碱基对并且含有植物转录终止序列和翻译终止序列。适宜的转录终止子和已知在植物中有功能的那些转录终止子包括CaMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子、豌豆(pea)rbcSE9终止子、来自根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的用于T7转录物的终止子和来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制物I或II基因的3’端，不过也可以使用本领域技术人员已知的其他3’元件。备选地，还可以使用γ薏苡醇溶蛋白终止子、油质蛋白3终止子或来自薏苡属(Coix)的其他终止子。
由于在转录起点与编码序列的起点之间的DNA序列(即非翻译的前导序列)可以影响基因表达，也可以希望使用特定前导序列。优选的前导序列构思包括这样的前导序列，它们包括据预测会指导所连接基因最佳表达的序列，即构思包括优选的共有前导序列，其中所述的共有前导序列可以提高或维持mRNA稳定性并防止不恰当的翻译启动。本领域技术人员因本公开而知道选择此类序列。最优选衍生自植物中高表达基因的序列。
优选的调节元件还包括基因的5’非翻译区、内含子和3’非翻译区。
已经发现在转基因植物中增强基因表达的此类序列包括内含子序列(详见下文)和病毒前导序列(例如来自TMV、MCMV和AMV；Gallie1987)。例如，从病毒衍生的众多非翻译性前导序列已知增强表达。具体而言，已经证实来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列有效地增强表达(例如Gallie1987；Skuzeski1990)。本领域已知的其他前导序列包括但不限于：微小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)(Elroy-Stein1989)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejak1991)；来自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻译前导序列(Jobling1987)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie1989)和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel1991)。还见Della-Cioppa1987。根据需要，也可以包括调节元件如TMVΩ元件(Gallie1989)。增强子的额外实例包括来自CaMV35S启动子、章鱼碱合酶基因(Ellis等，1987)、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis1987)、玉米皱缩I基因(Vasil1989)的元件、TMVΩ元件(Gallie1989)和来自非植物的真核生物(例如酵母；Ma1988)的启动子。可以构建根据本发明用途的载体以包括ocs增强子元件。这种元件首先被鉴定为来自鳄梨(ultilane)章鱼碱合酶(ocs)基因中的16bp回文增强子(Ellis1987)并且存在于至少10种其他启动子中(Bouchez1989)。当用于植物转化时，使用增强子元件(如ocs元件)和尤其所述元件的多重拷贝将起到提高来自毗邻启动子的转录水平的作用。
额外的优选调节元件是增强子序列或聚腺苷酸化序列。优选的聚腺苷酸化序列是来自植物基因或农杆菌T-DNA基因的那些序列(例如OCS(章鱼碱合酶)基因或NOS(胭脂碱合酶)基因的终止子序列)。
本发明的表达盒(或自其衍生的载体，即包含本发明表达盒的载体)可以包含额外的功能性元件，其中所述的功能性元件应当广义地理解为影响表达盒或载体或包含所述表达盒或载体的转基因生物的构建、增殖或功能的全部元件。此类功能性元件可以包括复制起点(以允许在细菌中复制；pBR322的ORI或P15Aori；Sambrook1989)，或对于农杆菌T-DNA转移所需要的元件(例如所述T-DNA的左边界和/或右边界)。
此外，可以构建所述表达盒并用于转基因植物细胞内特定基因产物的胞内靶向或用于引导蛋白质至胞外环境。通常，这通过将编码转运肽或信号肽序列的DNA序列与具体基因的编码序列连接而实现。所得的转运肽或信号肽将分别转运所述蛋白质至特定胞内或胞外目的地并随后以翻译后方式被去除。转运肽或信号肽的作用是协助蛋白质转运穿过胞内膜(如液泡、囊泡、质体和线粒体膜)，而信号肽指导蛋白质穿过胞外膜。通过协助蛋白质转运至区室内部和细胞外，这些序列可以增加基因产物的积累，保护基因产物免遭蛋白酶解降解。这些序列还允许来自高表达基因的其他mRNA序列与基因的编码序列连接。由于经核糖体翻译的mRNA比裸mRNA更稳定，可翻译性mRNA在基因前的存在可以提高该基因的mRNA转录物的整体稳定性并且因而增加基因产物的合成。因为转运序列和信号序列通常以翻译后方式从初始翻译产物中除去，故这些序列的使用允许添加可能在最终多肽中不出现的额外翻译的序列。可能希望使某些蛋白质定向分布，以增强蛋白质的稳定性(US5,545,818)。
1.3本发明的嵌合性转录调节核酸序列、表达盒和载体的装配
就本发明任意的嵌合性转录调节核酸序列、表达盒或载体而言，有效连接可以通过本领域已知的多种方法(包括体外方法和体内方法)实现。因此，本发明任意的嵌合性转录调节核酸序列、表达盒或载体可以通过使用本领域熟知的标准重组技术和克隆技术实现(参见例如Maniatis1989；Siihavy1984；Ausubel1987)。已经开发了众多方案或方法并用于基因克隆。这些方法的实例是通过限制性酶消化并连接匹配性末端的克隆法、直接从PCR产物进行的T-A克隆法、TOPO-连接的单向克隆法和基于重组的克隆法。基于重组的克隆法是最通用的可用克隆方法之一，其原因是克隆效率高和广泛用于克隆多种基因，无论是否存在可用的限制性酶位点。重组克隆法使用λ重组系统将基因克隆入载体，其中所述的载体含有用于λ重组酶装置的重组序列。重组克隆法使用位点特异性重组酶，其中所述的位点特异性重组酶(在某些情况下连同相关蛋白质)识别核酸分子中特定的碱基序列并交换这些序列侧翼的核酸节段。重组酶和相关蛋白质统称为“重组蛋白”。位点特异性重组酶是在众多生物(例如病毒和细菌)中存在并已经被表征为具有核酸内切酶特性和连接酶特性这两者的蛋白质。已知的多种位点特异性重组酶属于整合酶家族重组酶，包括来自噬菌体λ的整合酶/att系统。来自噬菌体λ的整合酶/att系统的一个应用实例是如在US5,888,732和US6,277,608和美国公开的专利申请2002/0007051A1和国际申请WO02/081711A1中公开的LR克隆反应，其中所述文献通过引用的方式并入本文作为参考。LR克隆反应可作为GATEWAYTM克隆技术(可从InvitrogenCorporation，Carlsbad，California获得)从商业途径获得。LR克隆反应由LR克隆酶酶混合物催化，其中所述的LR克隆酶酶混合物包含λ重组蛋白Int、Xis和大肠杆菌编码的蛋白IHF。
表达盒也可以通过将本发明的嵌合性转录调节核酸序列插入植物基因组进行装配。这种插入将导致与已经存在于基因组中的目的核酸序列有效连接。通过插入，目的核酸以萌芽胚特异性方式表达，原因在于所述嵌合性转录调节核苷酸序列的转录调节特性。所述插入可以是定向的或随机的。优选地，该插入是定向的并且通过例如同源重组实现。通过这种方法，天然启动子可以替换为本发明的嵌合性转录调节核苷酸序列，从而调节内源性基因的表达模式。所述转录调节性核苷酸序列也可以通过内源性基因的反义mRNA表达的方式插入，从而诱导基因沉默。
有效连接例如可以包含本发明嵌合性转录调节核苷酸序列连同待表达的核酸序列和任选地额外调节元件，例如聚腺苷酸化元件或转录终止元件、增强子、内含子等以如此方式依次排列，从而转录调节性核苷酸序列可以在适宜条件下表达目的核酸序列的过程中实现其功能。术语“适宜条件”优选地意指植物细胞中所述表达盒的存在。优选这样的排列，其中待表达的目的核酸序列以如此方式置于本发明的嵌合性转录调节核苷酸序列下游(即在3’方向上)，从而使这两种序列共价地连接。任选地，额外序列可以插入这两种序列之间。此类序列可以例如是接头或多克隆位点。此外，可以插入编码融合蛋白的部分的序列(在意图表达由目的核酸编码的蛋白质的融合蛋白的情况下)。优选地，待表达的目的核酸序列与本发明转录调节性核苷酸序列之间的距离不超过200碱基对，优选地不超过100碱基对，更优选地不超过50碱基对。
实际上，任意DNA组合物可以用于递送至受体单子叶植物或细胞中，以最终产生本发明的能育性转基因植物。例如，可以使用载体或质粒形式的DNA节段或片段，或线性DNA节段或片段等，在一些情况下，所述的DNA节段或片段仅含有待于植物中表达的DNA元件。在本公开内容的教导下，构建可以与本发明联合使用的载体将为本领域技术人员所知(参见例如Sambrook1989；Gelvin1990)。
本发明也提供含有本发明表达盒的适用于植物转化的重组载体或其他DNA构建体(包括但不限于粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)和植物人工染色体)，和包含所述表达盒或载体(例如包含质粒)的单子叶植物宿主细胞。所述表达盒或载体可以(优选地)增多转化的单子叶植物的基因组或可以以染色体外方式维持。本发明的表达盒或载体可以存在于植物细胞的细胞核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体包含于植物细胞核的染色体DNA中。在某些实施方案中，构思的是可能想要在单子叶植物转化中利用有复制能力的病毒载体。这些载体包括例如小麦矮化病毒(WDV)“穿梭”载体，如pW1-11和PW1-GUS(Ugaki1991)。这些载体能够在玉米细胞和大肠杆菌中自主性复制，并且从而可以为检测递送至转基因细胞的DNA提供提高的灵敏度。复制型载体也可以用于递送在侧翼具有来自转座元件(如Ac、Ds或Mu)的DNA序列的基因。
本发明的DNA构建体和从其衍生的任意载体可以包含其他功能性元件。应当广义地理解术语“其他功能性元件”。该术语优选地指这样的全部元件，它们影响所述DNA构建体或包含所述DNA构建体的载体或包含所述DNA构建体或载体的细胞或生物的产生、繁殖、功能、用途或价值。所述的其他功能性元件可以包括，但是不应当限于：
i)确保本发明的表达盒或载体复制(例如在大肠杆菌中复制)的复制起点。可以提到的实例是ORI(DNA复制起点、pBR322ori或P15Aori(Sambrook等，1989)。
ii)使得能够和使得便于插入一个或多个核酸序列的多克隆位点(MCS)。
iii)使同源重组或插入宿主生物基因组成为可能的序列。
iv)使植物细胞中用于转移和整合至植物基因组的农杆菌介导的转移成为可能的元件，例如边界序列，例如T-DNA的右边界或左边界或vir区域。
用于本文中转化的所导入的重组DNA分子可以是环状或线性、双链或单链的。通常，DNA是嵌合DNA形式，如质粒DNA，其中所述的嵌合DNA也可以含有在侧翼具有调节序列的编码区，所述调节序列促进所得植物中存在的重组DNA表达。通常，所导入的重组DNA分子相对较小，即小于约30kb，以最小化对任意的物理、化学或酶降解的易感性，其中所述的降解易感性随核苷酸分子大小增加而增加。如上指出，优选地预先选择并限定导入植物基因组的蛋白质、RNA转录物或其混合物的数量，例如，可以形成导入的DNA的1个-约5-10个此类产物。
本发明也提供单子叶植物(优选转基因植物)、来自这种植物的种子和部分、和来自这种植物的子代植物，包括杂交种和近交种。
本发明也提供植物育种方法，例如旨在制备能育性杂交转基因植物。所述方法包括使包含本发明具体表达盒的能育性转基因植物与自身或与第二种植物(例如缺少所述具体表达盒的一种植物)杂交，以制备包含所述具体表达盒的能育性杂交转基因植物的种子。随后将种子播种以获得能育性杂交转基因植物。所述植物可以优选地是单子叶植物(优选如以上定义)。该能育性杂交转基因植物可以具有经雌性亲代或经雄性亲代遗传的所述具体表达盒。第二种植物可以是近交植物。该能育性杂交转基因植物可以是杂交种。本发明也包括这些能育性杂交转基因植物中任意植物的种子。
2.由本发明的表达盒表达的有利性状或特性
本发明的嵌合性转录调节核苷酸序列用于改变植物的表型。转基因植物表型的多种改变是想要的并且可以使用本文公开的转录调节性核苷酸序列的有利表达模式(即萌芽胚特异性表达)实现。这些结果可以通过提供植物中异源性产物表达或内源性产物表达增加来实现。备选地，这些结果可以通过提供植物中一种或多种内源性产物、尤其酶或辅因子表达减少来实现。通常，所述嵌合性转录调节核苷酸序列可以用来在植物中表达与所述启动子有效连接的核酸节段(例如可读框)或其部分、反义序列、编码有义RNA序列或双链RNA序列的序列、编码微RNA序列的序列、或转基因。这些变化导致转化植物的表型变异。
将根据转化的目的选择用于在本发明单子叶植物宿主细胞中表达的异源性DNA。作物植物转化的主要目的之一是向植物添加商业上希望的、农学重要的性状或终产物性状。
虽然众多核酸序列适于由本发明的嵌合性转录调节核酸序列表达，最优选地，所述核酸在表达后赋予单子叶植物选自如下的性状或特性：
i)针对至少一种胁迫因子的增强抗性，
ii)提高的种子或籽苗营养品质，
iii)提高的产量，和
iv)切除靶序列，例如切除选择标记序列。
2.1基本原理
已知两类基本方法用于控制表达：过量表达和不足表达。过量表达可以通过插入所选择基因的一个或多于一个额外拷贝实现，然而，不清楚用核苷酸序列的一个或多于一个的额外拷贝最初转化的植物或其子代是否表现出对不足表达和过量表达的影响。对于不足表达，存在两种基本方法，它们在本领域中通常称作“反义下调”和“有义下调”(有义下调又称作“共抑制”)。这些方法通常称作“基因沉默”。这两类方法导致靶基因表达的抑制。
因此，所述核酸序列在嵌合性转录调节序列控制下的表达可以导致mRNA转录和蛋白质表达，或反义RNA、有义RNA、dsRNA、微RNA、ta-siRNA、snRNA、RNAi、或其任意组合的表达。
在本发明方法中表达/转录的mRNA或调节性RNA可以是例如
a)如上所述的双链RNA核酸序列(dsRNA)；
b)反义核酸序列，包括其中引导所述反义核酸序列针对基因(即基因组DNA序列，包括启动子序列)或包括5′和3′非翻译区在内的基因转录物(即RNA序列)的那些方法。也包括α-异头核酸序列；
c)与核酶组合的反义核酸序列；
d)用于诱导共抑制的有义核酸序列；
e)编码显性失活因子的核酸序列；
f)针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子或者抗体；
g)引起RNA降解的病毒核酸序列；
h)微RNA或微小RNA(miRNA)，它们已经被设计旨在靶向目的基因以诱导该目的基因的mRNA降解或翻译性抑制并且因而使基因表达沉默；
i)ta-siRNA，它们已经被设计旨在靶向目的基因以诱导该目的基因的mRNA降解(或可能诱导翻译抑制)并且因而使基因表达沉默；和/或
下文是对各个优选方法的简短描述。通常，根据需要，术语“表达”的含义应当包括术语“转录”和/或“翻译”的含义。
a)在本发明方法中表达的调节性RNA可以例如是双链RNA核酸序列(dsRNA)，例如用于降低或消除在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的活性。
作为反义多核苷酸和有义多核苷酸的替代，双链RNA(dsRNA)可以用来降低基因的表达。如本文中所用，术语“dsRNA”指包含两条RNA链的RNA杂交体。所述dsRNA可以在结构上是线性或环状。杂交性RNA可以是基本上或完全互补的。“基本上互补”意指当两条杂交性RNA使用如上所述Needleman和Wunsch算法进行最佳比对时，杂交部分是至少95％互补的。优选地，所述dsRNA具有至少100个碱基对长度。用于制备和使用dsRNA的方法是本领域已知的。一种方法包括在体内同时转录两条互补性DNA链(参见如美国专利号5,795,715)。
dsRNA可以通过标准转化方法直接导入植物或植物细胞。或者，可以通过转录两条互补RNA在植物细胞中表达dsRNA。
已经对动物、酵母、真菌和植物生物，例如对脉孢霉(Neurospora)、斑马鱼(Zebrafish)、果蝇、小鼠、人类、锥虫(Trypanosoma)、矮牵牛或拟南芥属植物广泛描述了通过双链RNA(“双链RNA干扰”；dsRNAi)调节基因的方法(例如MatzkeMA等，(2000)PlantMol.Biol.43：401-415；FireA.等，(1998)Nature391：806-811；WO99/32619；WO99/53050；WO00/68374；WO00/44914；WO00/44895；WO00/49035；WO00/63364)。此外，还报道RNAi作为抑制细菌(如大肠杆菌)基因的有利工具，例如由Tchurikov等报道[J.Biol.Chem.，2000，275(34)：26523-26529]。Fire等将RNAi现象命名为RNA干扰。明确地参考在以上参考文献中描述的技术和方法。高效基因抑制也可以在例如瞬时表达的情况下或在瞬时转化后观察到，例如，作为生物射弹转化法的结果(SchweizerP等(2000)PlantJ200024：895-903)。dsRNAi方法基于这样的现象，即同时导入基因转录物的互补链和反向链导致高效地抑制所讨论基因的表达。所得的表型极相似于类似的敲除突变体的表型(WaterhousePM等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13959-64)。
Tuschl等[GensDev.，1999，13(24)：3191-3197]能够证实RNAi方法的效率与双链体长度、3′-末端突出物的长度和这些突出物中的序列相关。
基于Tuschl等的工作并且认为以下原则在不同物种间是保守的，可以给予技术人员如下指导原则。因此，本发明或本发明方法中使用的dsRNA分子优选地符合以下至少一个原则：
-为实现良好的结果，通常应当避开所用核酸序列的5′和3′非翻译区和靠近起始密码子的区域，因为这些区域中的调节蛋白结合位点较丰富，并且RNAi序列与此类调节蛋白之间的相互作用可能导致不希望的相互作用；
-在植物中，所用核酸序列的5′和3′非翻译区和靠近起始密码子的区域，优选在起始密码子上游50至100nt的区域产生良好结果并且不应当避开；
-优选地，选择所用mRNA的这样一个区域，其在AUG起始密码子下游50至100nt(＝核苷酸或碱基)；
-仅来自外显子的dsRNA(＝双链RNA)序列用于本方法，因为来自内含子的序列没有效果；
-该区域中的G/C含量应当大于30％并小于70％，理想地在50％左右；
-靶mRNA的可能二级结构对RNAi方法的效果而言重要性较低。
所述dsRNAi方法可能特别有效和有利于减少在本发明方法中待降低其活性的核酸分子表达。尤其如WO99/32619中描述，dsRNAi方法明显优于常规反义方法。
因此，本发明可以用于表达双链RNA分子(dsRNA分子)，其中所述的双链RNA分子导入生物，有利地导入植物(或细胞、组织、器官或由它们衍生的种子)时，因本发明方法中待降低其活性的核酸分子的表达降低而引起改变的代谢活性。
在双链RNA分子，例如用于减少由本发明方法中待降低其活性的核酸分子编码的蛋白质表达的dsRNA，这两条RNA链之一与核酸序列的至少部分基本上相同，并且相应的另一条RNA链与核酸序列的互补链的至少部分基本上相同。
术语“基本上相同”指这样的事实，即与靶序列相比，所述dsRNA序列也可以包括插入、缺失和单个点突变，而仍导致表达的有效降低。优选地，所述抑制性dsRNA的“有义”链与本发明核酸序列(其中所述的本发明核酸序列在本发明的优选实施方案中包括其内源性5’和3’非翻译区)的部分节段之间或“反义”链与核酸序列的互补链之间如上定义的同源性分别等于至少30％、优选至少40％、50％、60％、70％或80％、非常特别优选至少90％、最优选100％。所述的部分节段达至少10个碱基、优选至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基、特别优选至少40、50、60、70、80或90个碱基、非常特别优选至少100、200、300或400个碱基、最优选至少500、600、700、800、900或更多个碱基或至少1000或2000个碱基或更多个碱基长度。在本发明的另一个优选实施方案中，所述的部分节段达17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个碱基、优选地达20、21、22、23、24或25个碱基。这些短序列在动物和植物中是优选的。200-800个碱基之间的较长序列在非哺乳动物中、优选在无脊椎动物中、在酵母、真菌或细菌中是优选的，但是它们也可用于植物中。长的双链RNA在所述生物中例如由蛋白质Dicer加工成众多siRNA(＝小/短干扰性RNA)，其中所述的蛋白质Dicer是双链特异性RNA酶III。作为一种替代，“基本上相同的”dsRNA也可以定义为能够与基因转录物的部分杂交(例如在50℃或70℃于400mMNaCl，40mMPIPESpH6.4，1mMEDTA中持续12-16小时)的核酸序列。
所述dsRNA可以由聚合的核糖核苷酸的一条或两条链组成。也可以存在对糖-磷酸酯主链和对核苷的修饰。例如，天然RNA的磷酸二酯键可以按照如此方式受到修饰，从而它们包含至少一个氮或硫杂原子。碱基可以按照如此方式受到修饰，从而例如腺苷脱氨酶的活性受到限制。这些修饰和其他修饰在下文用于稳定反义RNA的方法中描述。
所述dsRNA可以酶学地制备；它也可以完全地或部分地以化学方式合成。有效介导RNA干扰的达30bp的短dsRNA可以例如通过使用大肠杆菌核糖核酸酶III(RNaseIII)部分消化长dsRNA模板而有效地产生(Yang，D.，等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，9942.)。
双链结构可以从一条自我互补的单链开始或从两条互补链开始而形成。在一条自我互补的单链中，“有义”序列和“反义”序列可以通过接头序列(“接头”)连接并形成例如发夹结构。优选地，所述接头序列可以采取内含子的形式，其中所述的内含子在dsRNA合成后被剪切掉。编码dsRNA的核酸序列可以含有其他元件，例如转录终止信号或聚腺苷酸化信号。如果所述dsRNA的两条链将在细胞或生物中、有利地在植物中组合，则这可以以多种方式引起：
a)用包含两个表达盒的载体转化细胞或生物，有利地转化植物；
b)用两种载体共转化细胞或生物，有利地转化植物，其中所述的两种载体之一包含具有“有义”链的表达盒而另一种载体包含具有“反义”链的表达盒；
c)在已经用包含具有“反义”链的表达盒的载体转化细胞或生物后，用包含具有“有义”链的表达盒的载体超转化所述的细胞或生物，有利地超转化植物，或反之操作；
d)杂交，例如使两种生物、有利地使植物杂交，其中每种生物已经用一种载体转化，其中一种载体包含具有“有义”链的表达盒而另一种载体包含具有“反义”链的表达盒；
e)导入包含两个启动子的构建体，其中所述的启动子导致所需序列从两个方向上转录；
f)用能够产生所需dsRNA分子的工程化病毒感染细胞或感染生物，有利地感染植物。
RNA双链体的形成可以在细胞外部或在细胞内部启动。若所述dsRNA在靶细胞或生物外部合成，则它可以通过注射法、微注射法、电穿孔法、高速粒子法、通过激光束导入或通过化学化合物(DEAE葡聚糖、磷酸钙、脂质体)介导而导入生物或所述生物的细胞。
因此在一个实施方案中，本发明涉及一种dsRNA，其中所述双链RNA核酸分子的有义链与所述核酸序列具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％、优选地65％、70％、75％或80％、更优选地85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
本发明的另一个实施方案是一种dsRNA分子，其包含核酸分子中至少10碱基对(＝个碱基，nt，核苷酸)、优选至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50、特别优选至少55、60、70、80或90碱基对、非常特别优选至少100、200、300或400碱基对、最优选至少500、600、700、800、900或更多碱基对或至少1000或2000碱基对的片段，所述的片段与核酸分子具有至少50％、60％、70％、80％或90％、优选地100％的同源性。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述dsRNA分子的编码序列或其部分节段达17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个碱基、优选地达20、21、22、23、24或25个碱基，其中所述序列的同源性基本上是95％、96％、97％、98％或优选99％或100％。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述双链RNA的有义和反义链共价地结合或通过其他键，例如弱化学键如氢键相互结合，并且所述反义链基本上是所述有义RNA链的互补物。
如WO99/53050中所示，所述dsRNA也可以通过“接头”(例如内含子)连接“有义”链和“反义”链而包含发夹结构。优选自我互补性dsRNA结构，因为它们仅需要一个构建体的表达并且总是以等摩尔比率包含互补链。
使用本文如下所述的方法(如使用选择标记)，优选地将编码dsRNA的“反义”链或“有义”链或编码dsRNA的自我互补链的表达盒插入载体并稳定地插入植物基因组，旨在确保所述dsRNA的持久表达。用细菌载体或病毒载体的瞬时表达是类似有用的。
可以利用可能使每细胞具有至少一个拷贝的量导入所述dsRNA。更大的量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可以引起效率更高的减少作用。
如已经描述那样，为引起表达的有效降低，并不是必需要求所述dsRNA与待减少的核酸分子的基因转录物之间具有100％序列同一性。因此，有利的是本发明方法容忍序列偏差，因为所述的序列偏差可以作为遗传性突变、多态性或进化趋异性的结果存在。因此，例如使用了从根据本发明方法待减少的核酸分子开始所产生的dsRNA。
所述dsRNA可以在体内或在体外合成。为此目的，可以将编码dsRNA的DNA序列导入处在至少一个遗传控制元件(例如，启动子、增强子、沉默子、剪接供体或剪接受体或聚腺苷酸化信号)控制下的表达盒。合适的有利构建体在下文中描述。聚腺苷酸化并非是必需的，用于启动翻译的元件也不是必需存在的。
dsRNA可以按照化学或酶方式合成。细胞RNA聚合酶或细菌噬菌体RNA聚合酶(例如T3、T7或SP6RNA聚合酶)可以用于此目的。描述了用于体外表达RNA的合适方法(WO97/32016；US5,593,874；US5,698,425、US5,712,135、US5,789,214、US5,804,693)。在导入细胞、组织或生物之前，已在体外以化学或酶方式合成的dsRNA可以例如通过提取、沉淀、电泳、层析或这些方法的组合较高或较低程度地从反应混合物中分离。所述dsRNA可以直接导入细胞或在细胞外使用(例如进入胞间隙)。在本发明的一个实施方案中，所述RNAi方法仅导致基因功能的部分丧失并且因而能够使技术人员在希望的生物中研究基因剂量效应并且细致地调节本发明的方法。在另一个优选实施方案中，此方法导致功能完全丧失并且因而提高精细化学品的生产。此外，该方法还能够使本领域技术人员研究基因的多个功能。
然而，优选用引起dsRNA表达的表达构建体稳定地转化植物。合适的方法在下文描述。
b)在本发明方法中表达的调节性RNA可以是反义核酸序列，例如旨在降低或消除在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽。
可以设计外源性DNA序列以下调特定核酸序列。例如通过与本发明的嵌合性转录调节核酸序列、处于反义方向的外源性DNA或如此设计从而转录后产生发夹型RNA分子的DNA有效连接而实现这一点。基因抑制可以针对与性状相关的天然植物基因实现，例如旨在为植物提供降低水平的由所述天然基因编码的蛋白质或提供增强或减弱水平的受影响的代谢物。例如，本发明的嵌合性转录调节核酸序列可以与异源性DNA有效连接，其中如此设计所述的异源性DNA，从而形成旨在抑制玉米胚中天然基因的发夹形RNA。导致基因抑制的不同类型的外源性DNA排列是本领域技术人员已知的，并且包括，但不限于以下内容。国际公开WO94/01550披露了DNA构建体，其中反义RNA以自我互补性3′节段稳定。转录的RNA中形成双链发夹的其他元件在WO98/05770中披露，其中所述的反义RNA由形成发夹的聚(CG)核苷酸重复序列稳定，并且专利申请公开号2002/0048814A1描述了由聚(T)-聚(A)尾稳定的有义或反义RNA。美国专利申请公开号2003/0018993A1披露了由NOS基因3′非翻译区的亚序列的反向重复序列稳定的有义或反义RNA。美国专利申请公开号2003/0036197A1描述了由与靶序列具有同源性的两个互补性RNA区稳定的RNA。
用于通过“反义”技术阻止特定蛋白质的mRNA累积而抑制该蛋白质的方法可以被广泛使用并且已经被广泛地描述，包括针对植物的描述；Sheehy等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：8805-8809；US4,801,100；MoIJN等(1990)FEBSLett268(2)：427-430)。反义核酸分子与编码待抑制的靶蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或与之结合。这个过程抑制所述靶蛋白的转录和/或翻译。杂交可以通过形成稳定双链体以常规方式发生，或在基因组DNA的情况下，通过反义核酸分子借助DNA螺旋大沟内的特异性相互作用与该基因组DNA的双链体结合而发生。
在一个实施方案中，“反义”核酸分子包含至少部分地与编码蛋白质的“有义”核酸分子互补(例如与双链cDNA分子的编码链互补或与编码性mRNA序列互补)的核苷酸序列。因此，反义核酸分子可以通过氢键与有义核酸分子杂交。该反义核酸分子可以与核酸分子的完整编码链互补或仅与其一部分互补，其中所述的核酸分子引起在本发明方法中待减少的多肽表达或包含在本发明方法中待降低其活性的核酸分子。因此，反义核酸分子可以反义于本发明核酸分子的核苷酸序列中编码链的“编码区”。
术语“编码区”指核苷酸序列的区域，该区域包含翻译成氨基酸残基的密码子。
在另一个实施方案中，该反义核酸分子反义于mRNA中分布在核苷酸序列编码区侧翼的“非编码区”。术语“非编码区”指分布在编码区侧翼的不翻译成多肽的5′和3′序列，即也称为5′和3′非翻译区(5′-UTR或3′-UTR)。有利地，所述非编码区处在所述编码区上游或下游50bp、100bp、200bp或300bp、优选地400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp或1000bp的区域内。
假定编码在本发明方法中待减少的多肽或核酸分子的编码链序列例如具有上文提及的活性，例如这样一种多肽的活性，其中所述的多肽具有在如本文公开的本发明方法中待降低其活性的蛋白质的活性，反义核酸分子可以根据Watson和Crick碱基配对原则设计。
在又一个实施方案中，所述反义核酸分子可以是α-异头核酸。此类α-异头核酸分子与互补性RNA形成特定双链杂交体，在所述的双链杂交体中，与常见的β核酸相反，所述两条链相互呈平行分布(Gaultier等，1987，NucleicAcids.Res.15：6625-6641)。此外，所述反义核酸分子也可以包含2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，NucleicAcidsRes.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBSLett.215：327-330))。
本发明的反义核酸分子一般施用至细胞或原位地(insitu)产生，从而它们与编码多肽或编码核酸分子的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或与之结合(其中所述的多肽具有在本发明的方法中待降低其活性的蛋白质的活性，所述的核酸分子具有在本发明的方法中待降低其活性的核酸分子的活性)并因而抑制该蛋白质表达，例如通过抑制转录和/或翻译并引起前述精细化学品提高活性。
本发明的反义分子也包含这样的核酸分子，其包含与编码本发明天然存在的多肽(例如序列表中所示的或根据本文描述的方法鉴定的多肽序列)的核苷酸序列的调节区(例如其启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，例如旨在形成阻止靶细胞中转录所述基因的三股螺旋结构，一般参见Helene，C.(1991)AnticancerDrugDes.6(6)：569-84；Helene，C.等(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassavs14(12)：807-15。
c)在本发明方法中表达的调节性RNA可以是与核酶联合的反义核酸序列，例如旨在降低或消除在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的活性。
有利的是将上文所述反义策略与核酶方法联合。催化性RNA分子或核酶可以适应于任意的靶RNA并且切割特定位置上的磷酸二酯主链，因而功能性地使靶RNA失活(TannerNK(1999)FEMSMicrobiol.Rev.23(3)：257-275)。核酶本身因而不被修饰，但是能够以类似方式切割其他靶RNA分子，因此获得酶的特性。将核酶序列并入“反义”RNA则向这些“反义”RNA精确地赋予这种酶样RNA切割特性并且因此在使所述靶RNA失活时提高“反义”RNA的效率。合适的核酶“反义”RNA分子的制备和用途例如由Haseloff等(1988)Nature310：585-591描述。
此外，本发明的反义核酸分子也可以是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区的单链核酸，如mRNA。以这种方式，核酶(例如锤头状核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334，585-591中描述)可以用来催化地切割待抑制的酶的mRNA并且用来阻止翻译。核酶技术可以提高反义策略的效率。用于表达核酶以减少特定蛋白质的方法在(EP0291533、EP0321201、EP0360257)中描述。核酶表达也已经针对植物细胞(SteineckeP等(1992)EMBOJ11(4)：1525-1530；deFeyterR等(1996)Mol.Gen.Genet.250(3)：329-338)描述。合适的靶序列和核酶可以如SteineckeP，Ribozymes，MethodsinCellBiology50，编者Galbraith等，AcademicPress，Inc.(1995)，第449-460页所述，通过计算核酶RNA和靶RNA的二级结构并通过它们的相互作用[BayleyCC等(1992)PlantMol.Biol.18(2)：353-361；LloydAM和DavisRW等(1994)Mol.Gen.Genet.242(6)：653-657]鉴定。例如，可以构建与待抑制的蛋白质的mRNA具有互补区的四膜虫(Tetrahymena)L-19IVSRNA的衍生物(还参见US4,987,071和US5,116,742)。作为替代，此类核酶也可以通过选择过程从多种核酶的文库鉴定(Bartel，D.和Szostak，J.W.，1993，Science261：1411-1418)。
d)在本发明方法中表达的调节性RNA可以例如是用于诱导共抑制的(有义)核酸序列，例如旨在降低或消除在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的活性。
如本发明中所用，“基因抑制”意指用于抑制RNA转录物或抑制从RNA转录物翻译的蛋白质产生(包括转录后基因抑制和转录抑制)的任意熟知方法。转录后基因抑制由与基因具有同源性的双链RNA介导，其靶向所述的基因以抑制。由转录自外源性DNA构建体的RNA进行的基因抑制是称作反义抑制、共抑制和RNA干扰的基因抑制方法的共同特征，其中所述的外源性DNA构建体包含至少部分的转录单位的反向重复序列。更具体地，通过插入具有反义方向DNA的外源性DNA构建体以调节植物细胞中基因表达的转录后基因抑制在US5,107,065和US5,759,829中披露。转录抑制可以由转录的双链RNA介导，其中所述转录的双链RNA与启动子DNA序列具有同源性以实施所谓启动子反式抑制作用。通过插入具有有义方向DNA的外源性DNA构建体以调节植物中基因表达的转录后基因抑制在US5,283,184和US5,231,020中披露。
表达有义方向的核酸序列可以导致相应的同源内源性基因共抑制。表达与内源性基因具有同源性的有义RNA可以按照如已对以下反义方法所描述的类似方式减少或实际上消除所述内源性基因的表达：Jorgensen等[(1996)PlantMol.Biol.31(5)：957-973]、Goring等[(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：1770-1774]、Smith等[(1990)Mol.Gen.Genet.224：447-481]、Napoli等[(1990)PlantCell2：279-289]或VanderKrol等[(1990)PlantCell2：291-99]。在本上下文中，所导入的构建体可以代表完整或仅部分的待减少的同源基因。这项技术对植物的应用已经例如由Napoli等[(1990)ThePlantCell2：279-289中描述和在US5,010,323中描述。此外，上文所述的共抑制策略可以有利地与如Brummell等，2003，PlantJ.33，第793-800页所述的RNAi方法联合。至少在植物中有利的是在共抑制方法中使用强启动子或非常强的启动子。最近的研究工作，例如Schubert等(PlantJournal2004，16，2561-2572)的研究工作，已经表明共抑制效应依赖于基因特定的阈值水平，高于所述阈值水平时共抑制发生。
e)在本发明方法中表达的mRNA可以例如是编码显性失活蛋白的核酸序列，例如旨在降低或消除在本发明方法中待降低其活性的多肽的活性。
蛋白质的功能或活性也可以通过表达该蛋白质的显性失活变体有效地降低。技术人员熟悉用于通过共表达蛋白质的显性失活形式而降低该蛋白质的功能或活性的方法[LagnaG和Hemmati-BrivanlouA(1998)CurrentTopicsinDevelopmentalBiology36：75-98；PerlmutterRM和Alberola-llaJ(1996)CurrentOpinioninImmunology8(2)：285-90；SheppardD(1994)AmericanJournalofRespiratoryCell&MolecularBiology11(1)：1-6；HerskowitzI(1987)Nature329(6136)：219-22]。
显性失活变体可以例如通过改变多肽的氨基酸实现。
这种改变可以例如通过计算机辅助的比较法(“比对法”)确定。用于实现显性失活变体的这些突变优选地在核酸序列水平上实施。相应的突变可以例如使用籍此导入所希望突变的合适寡核苷酸引物，通过PCR介导的体外诱变法进行。为此目的，使用技术人员熟悉的方法。例如“LAPCR体外诱变试剂盒”(TakaraShuzo，Kyoto)可以用于此目的。也有可能并且本领域技术人员已知的是缺失或改变功能域(例如，可以结合但不激活的TF或其他信号成分)可以实现蛋白质活性的降低。
f)本发明的又一个实施方案是受控的mRNA编码DNA结合因子或蛋白质结合因子。
这些因子结合至内源性靶基因的基因组序列，优选结合在调节区内，并引起内源性基因的抑制。这种方法的使用使得降低内源性基因表达而无需重组性操作内源性基因的序列成为可能。用于制备相关因子的此类方法在DreierB等[(2001)J.Biol.Chem.276(31)：29466-78和(2000)J.Mol.Biol.303(4)：489-502]、BeerliRR等[(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(25)：14628-14633；(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(4)：1495-1500和(2000)J.Biol.Chem.275(42)：32617-32627)]、SegalDJ和BarbasCF[第三版(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4(1)：10-39]、KangJS和KimJS[(2000)J.Biol.Chem.275(12)：8742-8748]、KimJS等[(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(8)：3616-3620]、KlugA[(1999)J.Mol.Biol.293(2)：215-218]、TsaiSY等[(1998)Adv.DrugDeliv.Rev.30(1-3)：23-31]、MappAK等[(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(8)：3930-3935]、SharrocksAD等[(1997)Int.J.Biochem.CellBiol.29(12)：1371-1387]和ZhangL等[(2000)J.Biol.Chem.275(43)：33850-33860]中描述。这项技术在植物中应用的实例已经在WO01/52620、OrdizMl等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第99卷，第20期，13290-13295，2002)或Guan等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第99卷，第20期，13296-13301，2002)中描述。
可以使用基因的任何部分选择这些因子。这种节段优选地位于启动子区内。然而，为基因抑制目的，它也可以位于编码性外显子区或内含子区内。技术人员可以通过数据库搜索从Genbank获得相关节段，或从其基因不存在于Genbank中的cDNA开始，通过筛选基因组文库的相应基因组克隆而获得相关节段。
还有可能首先鉴定目标作物中的序列，其中所述的序列编码在本发明的方法中待降低其活性的多肽，随后通过使用上文提及的因子找到启动子并降低表达。
技术人员熟悉为如此操作所需要的方法。
此外，导入细胞的因子也可以是本身抑制靶蛋白的那些因子。蛋白质结合因子例如可以是适配子[FamulokM和MayerG(1999)Curr.TopMicrobiol.Immunol.243：123-36]或者抗体或抗体片段或单链抗体。已经描述这些因子的获得并且是技术人员熟悉的。例如，一种胞浆scFv抗体已经用于调节经遗传修饰的烟草植物中植物光敏素A蛋白的活性[OwenM等(1992)Biotechnology(NY)10(7)：790-794；FrankenE等(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8(4)：411-416；Whitelam(1996)TrendPlantSci.1：286-272]。
基因表达也可以由特制的低分子量合成化合物抑制，例如聚酰胺型化合物[DervanPB和RW(1999)CurrentOpinioninChemicalBiology3：688-693；GottesfeldJM等(2000)GeneExpr.9(1-2)：77-91]。这些寡聚物由3-(二甲胺基)丙胺、N-甲基-3-羟基吡咯、N-甲基咪唑和N-甲基吡咯单元组成；它们可以按照如此方式适配至双链DNA的每个部分，所述方式为它们以序列特异性方式与大沟结合并阻断位于该位置内的基因序列的表达。合适方法已经在BremerRE等[(2001)Bioorg.Med.Chem.9(8)：2093-103]、AnsariAZ等[(2001)Chem.Biol.8(6)：583-92]、GottesfeldJM等[(2001)J.Mol.Biol.309(3)：615-29]、WurtzNR等[(2001)Org.Lett3(8)：1201-3]、WangCC等[(2001)Bioorg.Med.Chem.9(3)：653-7]、UrbachAR和DervanPB[(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98(8)：4103-8]以及ChiangSY等[(2000)J.Biol.Chem.275(32)：24246-54]中描述。
g)在本发明方法中表达的调节性RNA可以例如是引起RNA降解的病毒核酸序列，例如旨在降低或消除在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的活性。
借助病毒表达系统(Amplikon)，也可以通过由生物、有利地在植物中诱导特异性RNA降解而有效地引起失活或下调[Angell，SM等(1999)PlantJ.20(3)：357-362]。与待抑制的转录物具有同源性的核酸序列通过这些系统借助病毒载体导入植物，其中所述的系统又称做“VIGS”(病毒诱导的基因沉默)。随后，转录被关闭，这可能由针对病毒的植物防御机制介导。合适的技术和方法在RatcliffF等[(2001)PlantJ.25(2)：237-45]、FagardM和VaucheretH[(2000)PlantMol.Biol.43(2-3)：285-93]、AnandalakshmiR等[(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(22)：13079-84]和RuizMT[(1998)PlantCell10(6)：937-46]中描述。
g)在本发明方法中表达的调节性RNA可以例如是微RNA(或微小RNA)，其中所述的微RNA已经被设计旨在靶向目的基因以诱导该目的基因的mRNA降解或翻译性抑制并且因而使基因表达沉默或靶向确保所述目的基因表达的表达盒，例如旨在降低或消除在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的活性。
基因表达的调节也可以通过调节微RNA的表达实现。日益增长的证据表明植物miRNA在分生组织鉴定、细胞分裂、器官分离、器官极化和非生物胁迫应答方面具有广泛的调节功能(BartelD2004)。众多植物miRNA具有独特的空间或时间表达模式。植物miRNA的过量表达或异位表达可以改变植物的形态学和生理学。也可以设计植物miRNA前体以靶向拟南芥属植物中的报道基因(ParizottoEA等，2004)。
微RNA(miRNA)作为植物和动物中进化保守的基于RNA的基因表达调节物出现。miRNA(约21-25nt)来自具有茎环结构的更大前体，所述的前体从非蛋白质编码基因转录出来。miRNA靶向特定mRNA以在转录后水平上(即降解mRNA)或在翻译水平(即抑制蛋白质合成)抑制基因表达(BartelD2004，Cell116，281-297)。可以有效地设计miRNA，以特异性地靶向并下调所选择的基因。Schwab及其合作者已经分析了天然植物miRNA的靶选择的决定因素(Schwab等，2005，Dev.Cell8，517-527)。该项工作已经扩展至有效下调靶基因的人工miRNAs(amiRNAs)的设计和用途，形成设计用于定向基因沉默的有效amiRNA的概念和原则(拟南芥中通过人工微RNA的高度特异性基因沉默(HighlySpecificGeneSilencingbyArtificialmicroRNAsinArabidopsis)，Schwab等，PlantCell200618(4))和用于有效amiRNA设计的基于网络的工具(http://wmd.weigelworld.org))。
i)在本发明方法中表达的调节性RNA可以例如是反式的干扰性小RNA(ta-siRNA)或是确保前者表达的表达盒，例如旨在降低或消除在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的活性。
反式siRNA(ta-siRNA)是新近鉴定的内源性siRNA(Peragine等，2004；Vazquez等，2004)。ta-siRNA的产生需要miRNA介导的mRNA切割和随后由一种RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)RDR6(Allen等，2005)进行的dsRNA合成。ta-siRNA以类似于miRNA的方式调节基因表达。
反式的干扰性小RNA(ta-siRNA)可以设计为靶向目的基因，以诱导目的基因的mRNA降解并且因而使基因沉默。
使用ta-siRNA用以根据本发明方法抑制或失活基因产物的方法在US60/672976和60/718645中描述。
如以上项中描述的核酸序列在细胞或生物中通过转化/转染所述细胞或生物进行表达或通过已知方法(例如项A)中披露的方法)导入所述细胞或生物。
2.2农学相关的性状
所述嵌合性转录调节核苷酸序列可以优选地用来向转化的单子叶植物赋予农学相关的性状。此类性状包括但不限于除草剂抗性、除草剂耐受性、昆虫抗性、昆虫耐受性、疾病抗性、疾病耐受性(病毒病、细菌病、真菌病、线虫病)、胁迫耐受性、胁迫抗性，例如对干旱、热、急冷、冷冻、过度潮湿、盐胁迫和氧化胁迫的抗性或耐受性、提高的产量、食品含量与价值、提高的饲料含量与价值、物理外观、雄性不育、雌性不育性、干透、直立性、多育性、淀粉的量与品质、油的量与品质、蛋白质的品质与量、氨基酸组成等。虽然众多核酸序列适合由(例如与优选的启动子，例如与超级启动子组合的)本发明的嵌合性转录调节核酸序列表达，不过最优选地，所述核酸在表达后向所述单子叶植物赋予选自以下性状的农学相关性状
i)增强的针对至少一种胁迫因子的抗性或耐受性
ii)提高的种子或籽苗营养品质，
iii)提高的产量。
经济上最相关的性状之一是产量，对胚和年幼籽苗的任意类型的损伤严重影响产量。因此，保护年幼籽苗和胚或增强其性能的任意类型的性状就产量而言是有利的。因此，导致胁迫抗性的性状(见下文)也可导致增加的产量。因此，本发明的另一个实施方案涉及向植物赋予提高的产量和/或提高的胁迫耐受性的方法，所述的方法包括步骤
A)将表达构建体导入植物，所述表达构建体包含编码植物转录调节序列的多核苷酸和与其有效连接的至少一个核酸，其中所述编码转录调节序列的多核苷酸包含
i)选自以下的第一核酸分子
a)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：1的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：1的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸中至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，和与其有效连接的
ii)第二核酸分子，其选自以下多核苷酸
a)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：3的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：3的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段，和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤
其中所述的至少一个核酸相对于转录调节序列的所述第一或第二核酸序列是异源的并且能够向植物赋予提高的产量和/或提高的胁迫耐受性，和
B)选择转基因植物，其中与野生型或无效分离子植物相比较，所述的植物具有提高的产量和/或提高的胁迫耐受性。
所述提高的产量和/或提高的胁迫耐受性以及相应待表达的异源核酸序列如上文定义。更具体的实例在下文给出。优选的嵌合性转录调节核苷酸序列在上文描述。
2.2.1提高胁迫抗性或耐受性
所述转录调节核苷酸序列可以优选地用来向转化的单子叶植物赋予提高(或增强)的胁迫抗性(优选地用来产生抗胁迫或胁迫耐受性植物)。“抗性”意指基本上不显示因施用化学物、病原体感染或暴露于胁迫所致表型变化的植物。“耐受性”意指这样的植物，该植物尽管可以表现一些因感染所致的表型变化，然而其繁殖力没有明显下降或其代谢没有明显改变。
本领域技术人员已知多种核酸序列可获得此类胁迫抗性。所述序列可以包括但不限于编码参与植物激素生物合成、植物激素调节、细胞周期调节或糖代谢的多肽的多核苷酸。所述胁迫因子优选地如上文定义。待(例如作为有义、反义或双链RNA)表达的异源核酸序列可以编码如上所述的胁迫相关多肽(或其部分；优选至少5个、更优选至少10个、最优选至少30个连续氨基酸的一部分)。优选的嵌合性转录调节核苷酸序列在上文描述。
所述胁迫因子和待表达的异源核酸序列优选地如上文定义。优选的嵌合性转录调节核苷酸序列在上文描述。
可以有利地获得的胁迫抗性优选地针对非生物性或生物性胁迫因子。所述生物性胁迫因子可以选自真菌抗性、线虫抗性、昆虫抗性、病毒抗性和细菌抗性。优选地，所述生物性胁迫因子是种生疾病(主要是真菌疾病，例如主要在小麦中的普通腥黑穗病(小麦光腥黑穗菌(Tilletiatritici))；主要在大麦中的条纹病(麦类核腔菌(Pyrenophoragraminea))和散黑穗病(麦散黑粉菌(Ustilagonuda)))。
非生物性胁迫因子可以选自干旱、过度潮湿、热、急冷、冷冻、寒冷、盐、氮、植物群体高密度、紫外光和氧化胁迫。优选地，所述胁迫抗性通过诱导早期生长势实现。
本领域技术人员已知多种核酸序列可获得此类胁迫抗性。所述序列可以包括但不限于编码参与植物激素生物合成、植物激素调节、细胞周期调节或糖代谢的多肽的多核苷酸。更具体的实例在下文给出。
本发明适用于全部单子叶植物如玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、谷子、小黑麦、黑麦草或薏苡，然而优选地适用于禾本科产生谷粒的禾谷类植物如玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、谷子或小黑麦，优选地适用于玉米、大麦和小麦，最优选地适用于玉米。
本发明的其他实施方案涉及本发明单子叶植物的种子、部分和细胞。优选地，所述植物部分选自：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞团块、胚、花粉、胚珠、种子、花、谷粒、穗、穗轴、叶、外壳、柄、根、根尖、花药和穗丝。
所述提高的胁迫耐受性可以间接地引起促进谷粒农学特征增强、谷粒充实提高、谷粒败育下降、营养转运增加等方面的一种或多种性状。
2.2.1.1昆虫抗性和耐受性
本发明的一个重要方面涉及导入赋予昆虫抗性的基因至植物中。可以导入的潜在昆虫抗性基因包括苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)结晶毒素基因或Bt基因(Watrud1985)。Bt基因可以提供对鳞翅目(lepidopteran)害虫或鞘翅目(coleopteran)害虫如欧洲玉米螟(EuropeanMaizeBorer，ECB))和南瓜十二星叶甲(cornrootworm，CRW)的抗性。用于此类实施方案的优选Bt毒素基因包括CryIA(b)和CryIA(c)基因。就此方面而言，还可以使用来自苏云金芽孢杆菌的其它种中影响昆虫生长或发育的内毒素基因。蛋白酶抑制物也可以提供昆虫抗性(Johnson1989)并且因此用于植物转化。预期使用来自番茄或马铃薯的蛋白酶抑制物II基因即pinII特别有用。甚至更有利的是使用与Bt毒素基因组合的pinII基因，本发明人已经发现该组合的联合效应产生协同性杀昆虫活性。还可以使用编码昆虫消化系统抑制物的其它基因或编码促进抑制物产生的酶或辅因子的那些基因。如那些来自小麦和大麦的半胱氨酸蛋白酶抑制物和淀粉酶抑制物可以作为本组的示例。
另外，编码凝集素的基因可以赋予额外的或备选的杀昆虫特性。凝集素(最初称作植物血凝素)是多价的糖结合蛋白，具有凝集来自多个物种中的红细胞。最近已经确定凝集素作为具有抗象甲(weevil)、ECB和根虫的杀虫剂(Murdock1990；Czapla&Lang，1990)。预计有用的凝集素基因包括例如，大麦和小麦胚凝集素(WGA)和稻凝集素(Gatehouse1984)，优选WGA。
在导入昆虫害虫时控制具有抗昆虫活性的大多肽或小多肽(例如裂解肽、肽激素和毒素和毒物)产生的基因形成了本发明的另一方面。例如，预计表达针对特定昆虫害虫的保幼激素酯酶还可以产生杀昆虫活性或可能引起变态中止(Hammock1990)。
表达编码影响昆虫角质层完整性的酶的基因的转基因植物又形成本发明的另外方面。此类基因包括编码例如几丁质酶、蛋白酶、脂肪酶的那些基因并且还是产生日光霉素(一种抑制几丁质合成的化合物)的基因，其中导入所述的任一基因预计产生抗昆虫的玉米植物。编码影响昆虫蜕皮活性的基因，如影响蜕皮激素UDP-葡糖基转移酶产生的那些基因也处于本发明的有用转基因范围内。
本发明还包括这样的基因，其中所述的基因编码促进对害虫而言降低宿主植物营养品质的化合物产生的酶。有可能例如通过改变甾醇组成而赋予植物杀昆虫活性。甾醇由昆虫从它们的肠道中获得并用于激素合成和膜稳定性。因此，通过表达新基因改变植物甾醇组成可能对昆虫生长和/或发育产生不利影响并赋予植物杀昆虫活性，其中所述的新基因例如是直接促进不想要的甾醇产生的基因和使所需要的甾醇转化成不利形式的甾醇的基因。脂肪氧化酶是已经证实对昆虫表现抗营养效应并降低昆虫膳食的营养品质的天然存在的植物酶。因此，本发明的又一实施方案涉及具有增强的脂肪氧化酶活性的可以抗昆虫采食的转基因植物。
本发明还提供了借此实现植物次级代谢产物的定性或定量改变的方法和组合物。一个实例涉及转化植物以便产生预计将赋予抗欧洲玉米螟、南瓜十二星叶甲和其它数种玉米害虫抗性的DIMBOA。特别考虑用于该方面的候选基因包括已知参与DIMBOA合成途径的在bx基因座内的那些基因(Dunn1981)。还预计导入可以调节黄酮甙(maysin)产生的基因以及在高粱内参与蜀黍苷产生的基因分别用于促进棉铃虫(earworm)抗性和根虫抗性。
鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)是抗某些昆虫(包括南瓜十二星叶甲)的禾草物种。预计将从摩擦禾中分离编码这样的蛋白质的基因，其中所述的蛋白质对昆虫有毒或参与对昆虫有毒的化合物的生物合成，并且这些新基因将用于赋予抗昆虫抗性。已知摩擦禾中的昆虫抗性基础是遗传性的，因为所述的抗性已经通过有性交配转移至玉米中(Branson和Guss，1972)。
编码表征为具有有效杀虫活性的蛋白质的其它基因还可以用作本文中的转基因。此类基因包括例如编码可以用作根虫拒食剂的豇豆胰蛋白酶抑制物(CpTI；Hilder1987)的基因；编码可以特别用作南瓜十二星叶甲拒食剂的阿维菌素(Campbell1989；Ikeda1987)的基因；核糖体失活蛋白基因和甚至调节植物结构的基因。还考虑了包括抗昆虫抗体基因和编码这样的酶的基因的转基因玉米，其中所述的酶可以将施加在植物外部的无毒杀虫剂(杀虫剂原)转变成植物中的杀虫剂。
2.2.1.2环境或胁迫抗性和耐受性
对植物耐受多种环境胁迫(如但不限于干旱、过度潮湿、氮、急冷、冷冻、高温、盐和氧化胁迫)能力的改善还可以通过表达异源基因或过量表达同源基因实施。可以通过导入如WinterFlounder(Cutler1989)所述的“抗冻”蛋白或其合成性基因衍生物实现增加的抗冰冻温度抗性而受益。还可以通过增加叶绿体中甘油-3-磷酸乙酰基转移酶的表达赋予改善的急冷耐受性(Murata1992；Wolter1992)。对氧化胁迫(常由于如寒冷温度加高光照强度恶化)的抗性可以通过表达超氧化物歧化酶(Gupta1993)赋予并可以通过谷胱甘肽还原酶加以改善(Bowler1992)。此类策略可以允许在新出田地中耐受冰冻并允许将产量较高的较晚成熟品种延伸到相对较早熟的地带内。
表达有利地影响植物水含量、总水势、渗透势和膨压的新基因可以增强植物耐受干旱的能力。如本文中所用，术语“干旱抗性”和“干旱耐受性”用来指与正常环境相比，植物增加对降低的有效水诱导的胁迫的抗性或耐受性，以及植物在缺水环境中发挥功能并存活，以及性能相对优异的能力。在本发明的这个方面，提出例如表达编码渗透活性溶质生物合成的基因可以赋予抗干旱保护。在这类基因中包括编码甘露醇脱氢酶(Lee和Saier，1982)和海藻糖-6-磷酸合酶(Kaasen1992)的DNA。通过细胞内天然磷酸酶的后续作用或通过导入并共表达特定的磷酸酶，这些导入的基因将分别导致甘露醇累积或海藻糖累积，甘露醇和海藻糖均已充分报道为能够减轻胁迫效应的保护性化合物。已经验证在转基因烟草中的甘露醇累积并且初步结果表明表达高水平甘露醇的植物能够耐受所施加的渗透胁迫(Tarczynski1992)。
类似地，已经报道其它代谢物在保护酶功能(例如2，2亚氨双丙氨酸(alanopine)或丙酸)或膜完整性(例如2，2亚氨双丙氨酸)(Loomis1989)方面的效力并且因此表达编码这些化合物生物合成的基因可以按照与甘露醇相似或互补的方式赋予干旱抗性。在干旱和/或脱水期间有渗透活性和/或提供某些直接保护效应的天然存在的代谢物的其它实例包括糖和糖衍生物，如果糖、赤藓醇(Coxson1992)、山梨醇、卫矛醇(Karsten1992)、葡糖基甘油(Reed1984；Erdmann1992)、蔗糖、水苏糖(Koster和Leopold1988；Blackman1992)、芒柄醇和松醇(Vernon和Bohnert1992)和棉子糖(Bernal-Lugo和Leopold1992)。其它不是糖的渗透活性溶质包括但不限于脯氨酸和甘氨酸-甜菜碱(Wyn-Jones和Storey，1981)。在胁迫期间的冠继续生长和生殖适合度增加可以通过导入并表达如控制以上所讨论的渗透活性化合物和此类其它化合物的那些基因(如在一个示例性实施方案由肌醇O-甲基转移酶代表的基因)而增强。
考虑了特定蛋白质的表达也可以增加干旱耐受性。基于结构相似性，将晚期胚发生蛋白划分为三组(见Dure1989)。全部三组这些蛋白质已经在正在成熟(即正在干燥)的种子中得到证实。在这3类蛋白质中，II型(脱水素(dehydrin)-型)通常在植物营养部分中在干旱和/或干燥耐受性方面发挥作用(例如Mundy和Chua，1988；Piatkowski1990；Yamaguchi-Shinozaki1992)。最近，发现烟草中表达的III型LEA(HVA-1)可影响植物高度、成熟度和干旱耐受性(Fitzpatrick，1993)。因此，表达来自全部三组的结构基因可以赋予干旱耐受性。在水胁迫期间被诱导的其他类型蛋白质包括可以在干旱胁迫期间赋予多种保护型功能和/或修复型功能的巯基蛋白酶、醛缩酶和跨膜转运蛋白(Guerrero1990)。执行脂类生物合成因此影响膜组成的基因的表达还可以用来赋予植物干旱抗性。
改善干旱抗性的众多基因具有互补性作用模式。因此，这些基因的组合可能在改善玉米的干旱抗性方面具有加成效应和/或协同效应。众多的这些基因还改善冰冻耐受性(或抗性)；在冰冻和干旱期间发生的物理胁迫在本质上是相似的并且可以以类似方式减轻。可以通过这些基因的组成型表达或组织特异性表达而受益，但是表达这些新基因的优选方式可以是利用膨压诱导型启动子(如用于膨压诱导型基因的启动子在Guerrero等1990和Shagan1993中描述)。这些基因的空间和时间表达模式可以使玉米更好地忍受胁迫。
表达这样的基因是有益的，其中所述的基因参与允许增加从干燥土壤中汲取水的特定形态学性状。例如，导入并表达改变根特征的基因可以增强水摄取。表达在胁迫期间增强生殖适合度的基因将有明显的价值。例如，表达改善花粉散播的同步性和雌性花部分(即穗丝)的接受性的DNA将有意义。此外，表达在胁迫期间使谷粒败育最小化的基因将增加待收获的谷粒量并且是有价值的。通过导入并表达具有适宜调节序列的异戊烯基转移酶基因而调节单子叶植物(如玉米)中的细胞分裂素水平可以改善单子叶植物的胁迫抗性和产量(Gan1995)。
鉴于水在决定产量方面的重要作用，预计能够通过导入并表达新基因而使植物更有效地利用水将改善整体性能，甚至当土壤水可用性无限制时也是如此。通过导入这样的基因可以实现产量稳定性或均匀，其中所述的基因改善植物在与水可用性有关的严重程度胁迫期间最大程度利用水的能力。
改善植物免受非生物性胁迫因子如干旱、热或寒冷作用还可以如此实现-例如通过过量表达来自短角床杜父鱼(MyoxocephalusScorpius)(WO00/00512)、多刺床杜父鱼(Myoxocephalusoctodecemspinosus)的抗冻多肽、拟南芥菜转录激活物CBF1、谷氨酸脱氢酶(WO97/12983，WO98/11240)、钙依赖性蛋白激酶基因(WO98/26045)、钙依赖性磷酸酶(WO99/05902)、来自酵母的酪蛋白激酶(WO02/052012)、法尼基转移酶(WO99/06580；PeiZM等(1998)Science282：287-290)、铁蛋白(DeakM等(1999)NatureBiotechnology17：192-196)、草酸氧化酶(WO99/04013；DunwellJM(1998)BiotechnGenetEngRev15：1-32)、DREB1A因子(“dehydrationresponseelementB1A”；KasugaM等(1999)NatureBiotech17：276-286)、甘露醇或海藻糖合成的基因如海藻糖-磷酸合酶基因或海藻糖-磷酸磷酸酶基因(WO97/42326)或通过对基因如海藻糖酶抑制(WO97/50561)。
嵌合性转录调节序列的一个用途是保护胚在萌发期间免受冷损伤。一个重要因子是氧化损害。超级启动子能够驱动即过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶、超氧化物歧化酶等。寒冷还通过使膜硬化而影响COX酶活性。对于干旱胁迫，表达谷氨酰胺合酶和甘氨酸甜菜碱合酶可能是有益的。
2.2.1.3疾病抗性和耐受性
提出可以通过将基因导入植物中实现疾病抗性增加。有可能对病毒、细菌、真菌、根病原体、昆虫和线虫所引起的疾病产生抗性。还预计可以通过表达导入的基因而实现控制产生霉菌毒素的生物。
病毒抗性可以通过表达新基因产生。例如，已经证实在转基因植物中表达病毒衣壳蛋白可以赋予对病毒及可能其它亲缘关系密切的病毒感染植物的抗性(Cuozzo1988、Hemenway1988、Abel1986)。预计表达靶向病毒必需功能的反义基因可以赋予对该病毒的抗性。例如，以负责复制病毒核酸的基因为靶的反义基因可以抑制所述复制并产生病毒抗性。认为通过使用反义基因而干扰病毒的其它功能还可以增加病毒抗性。另外，提出有可能通过其它方法(包括但不限于使用卫星病毒)实现病毒抗性。
提出可以通过导入新基因实现对细菌和真菌所致疾病的抗性的增加。预计可使用编码所谓“肽抗生素”、致病相关蛋白(PR)、毒素抗性和影响宿主-病原体相互作用如形态学特征的蛋白质的基因。肽抗生素是抑制细菌和其它微生物生长的多肽序列。例如，称作杀菌肽和蛙皮素的肽类抑制众多种类的细菌和真菌生长，提出PR蛋白在植物中的表达可以用于赋予细菌性疾病抗性。这些基因在病原体侵袭宿主植物后被诱导并且分成至少5类蛋白质(Bol1990)。在PR蛋白中包括β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶和渗透蛋白以及认为对植物抵抗病原生物有作用的其它蛋白质。已经鉴定了具有抗真菌特性的其它基因，例如UDA(荨麻(stingingnettle)凝集素)和橡胶蛋白(Broakgert1989；Barkai-Golan1978)。已知某些植物疾病因植物毒素的产生而引起。可以通过如此方式实现对这些疾病的抗性，即表达编码能够降解植物毒素或使植物毒素失活的酶的新基因。表达改变宿主植物与病原体之间相互作用的新基因可以用于减少疾病生物侵入宿主植物组织的能力，例如增加叶角质层蜡质或其它形态学特征。
植物寄生性线虫是众多植物中的病因。提出有可能通过表达新基因而使植物抵抗这些生物。预期控制线虫感染将通过改变线虫识别或黏着宿主植物的能力和/或使植物能够产生杀线虫化合物(包括但不限于蛋白质)而完成。
此外，对真菌、昆虫、线虫和疾病的抗性可以通过定向地累积某些代谢物或蛋白质而实现。此类蛋白质包括但不限于芥子油苷(抗食草动物防御)、几丁质酶或葡聚糖酶和摧毁寄生虫细胞壁的其它酶、核糖体失活蛋白(RIP)和(如当植物受到伤害或微生物侵袭时或化学方式(例如通过水杨酸、茉莉酮酸或乙烯)所诱导的)植物抗性和胁迫反应的其它蛋白质，或来自非植物源的溶菌酶例如T4-溶菌酶或来自多种哺乳动物的溶菌酶、杀虫蛋白如苏云金芽孢杆菌内毒素、α-淀粉酶抑制物或蛋白酶抑制物(豇豆胰蛋白酶抑制物)、集素如小麦胚凝集素、RNA酶或核酶。其它实例是编码哈茨木霉(Trichodermaharzianum)chit42内切几丁质酶(GenBank登录号：S78423)或来自高粱的N-羟基化多功能细胞色素P-450(CYP79)蛋白质(GenBank登录号：U32624)，或这些蛋白质的功能等同物的核酸。累积作为抗害虫保护的芥子油苷(RaskL等(2000)PlantMolBiol42：93-113；MenardR等(1999)Phytochemistry52：29-35)、表达苏云金芽孢杆菌内毒素(Vaeck等(1987)Nature328：33-37)或通过表达几丁质酶(例如来自绿豆(bean))而保护免受真菌侵袭(Broglie等(1991)Science254：1194-1197)是有利的。害虫(例如稻植物中的稻害虫褐稻虱(Nilaparvatalugens))抗性可以通过表达雪钟花(Galanthusnivalis)凝集素(agglutinin)(Rao等(1998)PlantJ15(4)：469-77)而实现。表达编码鳞翅目昆虫特异性苏云金芽孢杆菌D-内毒素的合成性基因cryIA(b)和cryIA(c)可以在多种植物中引起害虫抗性(GoyalRK等(2000)CropProtection19(5)：307-312)。适用于防御病原体的其它靶基因包含“聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白”(PGIP)、非洲甜果素、转化酶和抗微生物肽(如乳铁蛋白)(LeeTJ等(2002)JAmerSocHorticultSci127(2)：158-164)。可以利用于本文中的其它核酸序列包括用于昆虫控制的性状(美国专利号6,063,597；6,063,756；6,093,695；5,942,664及6,110,464)、真菌疾病抗性(美国专利号5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407及6,506,962)、病毒抗性(美国专利号5,304,730及6,013,864)、线虫抗性(US6,228,992)和细菌疾病抗性(US5,516,671)。
待表达的异源核酸序列可以编码胁迫相关多肽(或其部分；优选至少5个、更优选至少10个、最优选至少30个连续氨基酸的一部分)。优选的嵌合性转录调节核苷酸序列在上文描述。
2.2.2提高的种子或籽苗营养品质
所述嵌合性转录调节核苷酸序列(可以优选地用来向转化的单子叶植物赋予提高(或增强)的种子或籽苗营养品质。因此，本发明的另一个实施方案涉及用于向单子叶植物赋予提高的种子或籽苗营养品质和/或油含量的方法，所述方法包括步骤
A)向植物导入表达构建体，所述的构建体包含编码植物转录调节序列的多核苷酸和与其有效连接的至少一个核酸，其中编码转录调节序列的多核苷酸包含
i)选自以下的第一核酸分子
a)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：1的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；和
c)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸中至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，和与其有效连接的
ii)第二核酸分子，其选自以下多核苷酸
a)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：3的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；和
c)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，
并且与至少一个核酸有效连接，其中所述的至少一个核酸与所述第一或第二核酸序列是异源的，并且适用于向植物赋予提高的种子或籽苗营养品质和/或油含量，和
B)选择转基因植物，其中与野生型或无效分离子植物相比较，所述的植物具有提高的种子或籽苗营养品质和/或油含量。
所述的营养品质和/或油含量可以包括选自维生素、类胡萝卜素、抗氧化剂、不饱和脂防酸和多不饱和脂防酸至少一种化合物的含量提高。待表达的异源核酸序列(例如作为有义、反义或双链RNA表达)可以编码如下文描述的性状相关多肽(或其部分；优选地是至少5个、更优选至少10个、最优选至少30个连续氨基酸的部分)或其功能等同物，其中所述的功能等同物能够带来与任一所述多肽所致的相同表型。优选的嵌合性转录调节核苷酸序列在上文描述。
所述的营养品质和待表达的相应异源核酸序列优选地如下文定义。优选的嵌合性转录调节核苷酸序列在上文描述，最优选是超级启动子。优选适用于本发明方法的单子叶植物可以选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、黑麦草或薏苡。优选地，该植物是选自玉米、小麦、大麦、稻、燕麦、黑麦和高粱的禾谷类植物，甚至更优选地来自玉米、小麦和稻，最优选地，该植物是玉米植物。
提高的营养品质可以例如导致一种或多种如下特性：调节植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、提高植物代谢物的浓度。
基因可以导入单子叶植物，尤其商业重要的禾谷类植物，如玉米、小麦或稻，以改良谷粒，其中主要为获得所述谷粒而种植该禾谷类植物。根据谷粒的最终具体用途，可以预见种类广泛的以这种方式产生的新颖转基因植物。
例如，玉米谷粒的最大用途是饲料或食品。导入改变谷粒成分的基因可以明显增强饲料价值或食品价值。玉米谷粒的主要成分是淀粉、蛋白质和油。玉米谷粒的这些主要成分中的每一种可以通过改变其水平或组成加以改良。可以提及数个用于说明目的的实例，但是无论如何不是提供对可能性的穷举。
就饲料和食品目的而言，多种谷类谷粒的蛋白质是次优的，尤其用于猪、家禽和人食用时。蛋白质在这些物种的饮食中的数种必需氨基酸上有缺陷，需要向谷粒添加补充物。受限的必需氨基酸可以包括赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸和组氨酸。某些氨基酸仅在谷粒以用于饲料配合的其它输入物补充后才变成受限的。例如，当时谷粒用豆粕补充以满足赖氨酸要求时，甲硫氨酸变成受限的。种子和谷粒内这些必需氨基酸的水平可以通过如此机制提高，所述的机制包括，但不限于导入增加氨基酸生物合成的基因、减少氨基酸降解、增加蛋白质中氨基酸的贮藏或增加氨基酸转运至种子或谷粒内。
用于增加氨基酸生物合成的一个机制是导入解除氨基酸生物合成途径中受控制的基因以至于植物不再能够充分控制氨基酸的产生水平。这可以通过解除控制氨基酸生物合成途径中通常受途径内氨基酸终产物水平调节的步骤或绕过所述步骤而完成。实例包括导入编码用于增加赖氨酸和苏氨酸产生的解除控制形式的天冬氨酸激酶或二氢吡啶二羧酸(DHDP)合酶和用于增加色氨酸产生的邻氨基苯甲酸合酶的基因。减少氨基酸的代谢可以通过导入减少或消除编码酶的基因表达的DNA序列完成，其中所述的酶催化分解代谢途径中的步骤，如赖氨酸-酮戊二酸还原酶。
谷粒的蛋白质组成可以用多种方式加以改变以改善氨基酸的平衡，所述方式包括提高天然蛋白质的表达、降低那些具有不良组成的天然蛋白质的表达、改变天然蛋白质的组成或导入编码具有优异组成的全新蛋白质的基因。可以导入降低贮藏蛋白中玉米醇溶蛋白家族成员表达的DNA。这种DNA可以编码旨在破坏玉米醇溶蛋白表达或破坏玉米醇溶蛋白表达的调节物(如不透明-2基因产物)表达的核酶或反义序列。谷粒的蛋白质组成可以通过共抑制现象(即通过表达经转化作用导入的相同结构性基因或基因片段而抑制内源基因的表达)进行修饰(Goring1991)。此外，导入的DNA可以编码降解玉米醇溶蛋白的酶。所实现的玉米醇溶蛋白表达降低可以伴随增加具有更希望的氨基酸组成的蛋白质以及增加种子其它主要成分如淀粉。或者，可以导入嵌合基因，其中该嵌合基因包含具有适当氨基酸组成的天然蛋白质(如玉米中球蛋白的一种或10kD玉米醇溶蛋白)的编码序列以及设计旨在提高所述蛋白质表达的启动子或其它调节序列。所述基因的编码序列可以包括必需氨基酸的额外密码子或替换密码子。此外，可以使用从其它物种中获得的编码序列，或编码完全独特的肽序列的部分或完全合成的序列，其中所述肽序列的设计目的旨在增强种子的氨基酸组成。
导入改变谷粒油含量的基因可以是有价值的。油含量增加可以导致增加用于饲料和食品中的种子的可代谢能量含量及密度。导入的基因可以编码移除或减弱脂肪酸或脂类生物合成中限速步骤或受调节步骤的酶。此类基因可以包括，但不限于编码乙酰CoA羧化酶、ACP-酰基转移酶、β-酮酰基-ACP合酶和其它众所周知的脂肪酸生物合成活性的那些基因。其它可能基因是编码无酶活性的蛋白质如酰基载体蛋白的基因。额外的实例包括2-乙酰基转移酶、油质蛋白丙酮酸脱氢酶复合体、乙酰CoA合成酶、ATP柠檬酸裂合酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶和涉及肉碱CoA-乙酰-CoA穿梭的基因。预计使用质体转运肽序列并且优选地在种子胚中表达，将使与油生物合成有关的基因的表达导向质体。可以导入改变存在于油中的脂肪酸平衡的基因，提供更有益健康或更有营养的饲料原料。导入的DNA还可以编码这样的序列，该序列阻遏参与脂肪酸生物合成的酶的表达，从而如下所述改变存在于谷粒中的脂肪酸的比例。
可以导入增强谷粒中淀粉成分的营养价值的基因，例如通过增加分支程度，从而因延缓淀粉代谢而导致淀粉在奶牛中利用的改善。
除了影响谷粒的主要成分之外，可以导入影响饲料或食品用谷粒的多种其它养分方面、加工方面或其它品质方面的基因。例如，可以增加或减少谷粒的色素形成。某些动物饲料中黄色色素形成的增强和稳定性是受到欢迎的并可以通过导入这样的基因而实现，其中所述的基因通过消除叶黄素及胡萝卜素产生中的限速步骤而导致增强产生叶黄素和胡萝卜素。此类基因可以编码改变形式的八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶或番茄红素合酶。或者，无色素的白色玉米是众多食品产品产生所需要的并且可以通过导入阻遏或消除色素产生途径中的步骤的DNA而产生。
包含一些谷类谷粒的饲料或食品具有不充分量的维生素并且必须进行补足以提供合适的营养价值。可以设想导入增强种子中维生素生物合成的基因，包括例如维生素A、E、B12、胆碱等。例如，玉米谷粒也不具有用于最佳营养价值的充分矿物质含量。影响含磷、硫、钙、锰、锌和铁等的化合物累积或可用性的基因是有价值的。实例可以是导入减少植酸生产或编码植酸酶的基因，这增强植酸分解。这些基因将增加食物中的可用磷酸盐水平，减少用矿物磷酸盐作补充的需要。
可描述为饲料和食品目的而改良谷物的众多其它实例。改良可以实际上甚至不涉及谷粒，然而可以例如改善谷粒的青贮价值。为此目的所导入的DNA可以包括改变木质素产生的序列，如导致与牛的优良饲用价值相关的“棕色中脉(brownmidrib)”表型的那些序列。
除了指导改良饲料价值或食品价值外，还可以导入这样的基因，该基因改善谷粒加工并改善从加工中所产生产品的价值。加工某些谷粒如玉米的主要方法是湿磨法。玉米可以通过新基因的表达受到改良，其中所述的新基因提高加工效率并降低加工成本(如通过减少浸泡时间)。
改善湿磨法产物的价值可以包括改变淀粉、油、玉米面筋粉的数量或品质或玉米淀粉渣的成分。可以如此实现淀粉的升高，即通过鉴定并消除淀粉生物合成中的限速步骤或通过降低谷粒其它成分水平，从而导致成比例地增加淀粉。前者的实例可以是导入这样的基因，该基因编码具有改变的调节活性或在更高水平上表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶。后者的实例可以包括在谷粒发育晚期期间表达的例如蛋白质生物合成或油生物合成的选择性抑制物。
油是玉米和其它谷物的另一种湿磨法产物，其价值可以通过导入并表达基因加以改善。能够通过湿磨法提取的油量可以通过如以上对饲料和食品所述的方法加以提高。也可以改变油的特性以改善油在食用油、起酥油、润滑油或其它的油衍生性产物的生产和使用中的性能或改善其在用于食品相关性应用中的健康特性。还可以合成可在提取后充当化学合成原材料的新脂肪酸。油特性的改变可以通过改变存在于油中的脂肪酸的类型、水平或脂类排列而实现。这又可以通过添加编码酶的基因(其中所述的酶催化新脂肪酸和含有新脂肪酸的脂类合成)或通过提高天然脂肪酸的水平，与此同时可能降低前体的水平而完成。或者，可以导入这样的DNA序列，其延缓或阻断脂肪酸生物合成中的步骤，导致前体脂肪酸中间体增加。可以添加的基因包括去饱和酶、环氧酶、水合酶、脱水酶和催化涉及脂肪酸中间体的反应的其它酶。可以被阻断的催化步骤的代表性实例包括从硬脂酸至油酸和从油酸至亚麻酸的去饱和步骤，阻断所述步骤导致相应地累积硬脂酸酸和油酸。
也可以通过导入用来获得新植物的基因实现改良其它的谷物湿磨法产物、面筋粉和玉米淀粉渣。代表性的可能方式包括但不限于以上对改善食品价值和饲料价值所述的那些方式。
此外，还可以考虑应当使用植物来产生或制造植物中先前根本不产生或不以这个水平产生的有用生物化合物。可能通过转化方法导入并表达基因而制备产生这些化合物的新植物。有可能包括，但不限于目前通过任何生物所产生的任一生物化合物，如蛋白质、核酸、初级代谢物和中间代谢物、糖类聚合物等。化合物可以由植物产生、在收获和/或加工后提取并且用于任何目前认识到的有用目的，如药物、香料、工业用酶，不一而足。
作为由转基因植物中导入的基因所潜在编码的谷粒性状或特性范围的其它可能例证包括因导入增强γ-玉米醇溶蛋白合成的基因而具有较少易断性的出口用谷粒或在干磨法加工时具有较大粒度的谷粒、因增加囊果皮厚度的基因而具有改良的爆裂性、品质和膨胀体积的爆花玉米、因导入有效阻断参与色素产生途径的酶发生表达的基因而具有食品用白色谷粒的玉米以及因导入影响风味的基因如甜玉米矮缩基因(编码蔗糖合酶)而改善的酒精饮料或甜玉米品质。
可以与本发明的启动子核酸序列组合并改良终产物性状的有用核酸序列包括但不限于编码种子贮藏蛋白、脂肪酸途径酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶和淀粉分支酶的那些基因。对用于改良植物表型的示例性异源DNA的讨论可以在例如美国专利号6,194,636；6,207,879；6,232,526；6,426,446；6,429,357；6,433,252；6,437,217；6,515,201；和6,583,338以及PCT公开WO02/057471中找到，所述每篇文献具体地在本文中完整引用作为参考。所述性状包括但不限于：
-用于食品和饲料领域内的代谢酶(如植酸酶和纤维素酶)的表达。尤其优选核酸，如编码微生物植酸酶的人工cDNA(GenBank登录号：A19451)或其功能等同物。
-引起精细化学品如生育酚、生育三烯酚或类胡萝卜素累积的基因的表达。可以提到的实例是八氢番茄红素去饱和酶。优选编码黄水仙(Narcissuspseudonarcissus)八氢番茄红素去饱和酶的核酸(GenBank登录号：X78815)或其功能等同物。优选的生育酚生物合成酶包括tyrA、slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、GMT、MT1、tMT2、AANT1、slr1737和用于尿黑酸双加氧酶的反义构建体(Kridl等(1991)；Keegstra(1989)；Nawrath等(1994)；Xia等(1992)；Lois等(1998)；Takahashi等(1998)；Norris等(1998)；Bartley和Scolnik(1994)；Smith等(1997)；WO00/32757；WO00/10380；SaintGuily等(1992)；Sato等(2000))，全部文献在本文中引用作为参考。
-淀粉生产(美国专利号5,750,876和6,476,295)、高量蛋白质生产(US6,380,466)、果实成熟(US5,512,466)、增强的动物及人营养(美国专利号5,985,605和6,171,640)、生物聚合物(US5,958,745和美国专利公开号2003/0028917)、环境胁迫抗性(US6,072,103)、药学肽(US6,080,560)、改良的加工性状(US6,476,295)、改善的消化性(US6,531,648)、低棉子糖(US6,166,292)、工业用酶生产(US5,543,576)、改善的风味(US6,011,199)、固氮(US5,229,114)、杂交种子生产(US5,689,041)和生物燃料生产(US5,998,700)，其中在以上所列专利中描述的遗传元件和转基因在本文中引用作为参考。优选的淀粉分支酶(用于改良淀粉特性)包括在美国专利号6,232,122和6,147,279；和PCT公开WO97/22703中所述的那些淀粉分支酶，全部文献在本文中引用作为参考。
-改变的油生产(US6,444,876)、高量油生产(美国专利号5,608,149和6,476,295)或改变的脂肪酸含量(US6,537,750)。优选的脂肪酸途径酶包括硫酯酶(美国专利号5,512,482；5,530,186；5,945,585；5,639,790；5,807,893；5,955,650；5,955,329；5,759,829；5,147,792；5,304,481；5,298,421；5,344,771；和5,760,206)、二酰甘油酰基转移酶(美国专利公开20030115632A1和20030028923A1)和去饱和酶(美国专利号5,689,050；5,663,068；5,614,393；5,856,157；6,117,677；6,043,411；6,194,167；5,705,391；5,663,068；5,552,306；6,075,183；6,051,754；5,689,050；5,789,220；5,057,419；5,654,402；5,659,645；6,100,091；5,760,206；6,172,106；5,952,544；5,866,789；5,443,974和5,093,249)，其中全部文献在本文中引用作为参考。
-优选的氨基酸生物合成酶包括邻氨基苯甲酸合酶(US5,965,727和PCT公开WO97/26366，WO99/11800，WO99/49058)、色氨酸脱羧酶(PCT公开WO99/06581)、苏氨酸脱羧酶(美国专利号5,534,421和5,942,660；PCT公开WO95/19442)、苏氨酸脱氨酶(PCT公开WO99/02656和WO98/55601)、二氢吡啶二羧酸合酶(US5,258,300)和天冬氨酸激酶(美国专利号5,367,110；5,858,749和6,040,160)，其中全部文献在本文中引用作为参考。
-通过脂肪酸延伸酶和/或去饱和酶的表达生产营养品，例如多不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸)，或产生具有改良的营养价值例如具有高含量的必需氨基酸(例如巴西坚果树(brazilnut)的高-甲硫氨酸2S白蛋白基因)的蛋白质。优选这样的核酸，其编码巴西坚果树(Bertholletiaexcelsa)高-甲硫氨酸2S白蛋白(GenBank登录号：AB044391)、小立碗藓Δ6-酰基-脂去饱和酶(GenBank登录号：AJ222980；Girke等(1998))、高山被孢霉(Mortierellaalpina)Δ6-去饱和酶(Sakuradani等(1999))、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegan)Δ5-去饱和酶(Michaelson等(1998))、秀丽隐杆线虫Δ5-脂肪酸去饱和酶(des-5)(GenBank登录号：AF078796)、高山被孢霉Δ5-去饱和酶(Michaelson等JBC273：19055-19059)、秀丽隐杆线虫Δ6-延伸酶(Beaudoin等，2000)、小立碗藓Δ6-延伸酶(Zank等，2000)或这些蛋白质的功能等同物。
-产生用于工业目的的高质量蛋白质和酶(例如酶，如脂肪酶)或药物(例如，抗体、凝血因子、干扰素、淋巴因子、集落刺激因子、纤溶酶原激活剂、激素或疫苗，如HoodEE和JilkaJM(1999)所述的)。例如，已经有可能在转基因玉米植物中大规模产生来自鸡卵清内的重组抗生物素蛋白和细菌的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Hood等，1999)。
-例如通过表达乙酰CoA羧化酶获得在通常包含较少贮藏蛋白或贮藏脂类的细胞内增加的贮藏性，其目的是增加这些物质的产量。优选的核酸是编码紫苜蓿(Medicagosativa)乙酰CoA羧化酶(ACC酶)(GenBank登录号：L25042)的那些核酸，或其功能等同物。或者，在某些情况下，增加贮藏蛋白含量可能对生产高量蛋白质产物有利。优选的种子贮藏蛋白包括玉米醇溶蛋白(美国专利号4,886,878；4,885,357；5,215,912；5,589,616；5,508,468；5,939,599；5,633,436；和5,990,384；PCT公开WO90/01869、WO91/13993、WO92/14822、WO93/08682、WO94/20628、WO97/28247、WO98/26064和WO99/40209)、7S蛋白质(美国专利号5,003,045和5,576,203)、巴西坚果树蛋白(US5,850,024)、无苯丙氨酸的蛋白质(PCT公开WO96/17064)、白蛋白(PCT公开WO97/35023)、β-伴大豆球蛋白(PCT公开WO00/19839)、11S(US6,107,051)、α-大麦硫素(hordothionin)(美国专利号5,885,802和5,88,5801)、arcelin种子贮藏蛋白(US5,270,200)、凝集素(US6,110,891)和麦谷蛋白(美国专利号5,990,389和5,914,450)，其中全部文献在本文中引用作为参考。
-降低α-葡聚糖L-型块茎磷酸化酶(GLTP)或α-葡聚糖H-型块茎磷酸化酶(GHTP)酶活性的水平，优选地是在马铃薯块茎内(见US5,998,701)。马铃薯块茎内淀粉至糖的转化在表现降低的GLTP或GHTP酶活性的块茎内减少，尤其马铃薯块茎在低于7℃贮藏时。减少马铃薯内的冷致甜作用允许在更凉的温度下贮藏马铃薯，导致休眠延长、降低疾病发生率并增加贮藏期。降低马铃薯块茎内GLTP或GHTP的活性可以通过如使用同源性反义RNA或双链RNA抑制基因表达、利用共抑制、调节性沉默序列的技术而实现。具有改良冷贮藏特征的马铃薯植物包含用如此表达盒转化的马铃薯植物，其中所述的表达盒具有与DNA序列有效连接的TPT启动子序列，其中所述的DNA序列包含编码选自α-葡聚糖L-型块茎磷酸化酶(GLTP)和α-葡聚糖H-型磷酸化酶(GHTP)的α-葡聚糖磷酸化酶的基因的至少20个核苷酸。
有利基因的其它实例在例如DunwellJM，Transgenicapproachestocropimprovement，JExpBot.2000；51SpecNo；第487-96页提到。对用于改良植物表型的示例性异源DNA的讨论可以在例如美国专利号6,194,636中找到。
本发明的另一个方面提供这样的DNA构建体，所述DNA构建体中具有淀粉胚乳和/或萌芽胚特异性或优先地表达的启动子驱动基因抑制性DNA元件，其目的是例如抑制氨基酸分解代谢酶。
种子成熟或谷粒发育指始于受精并止于种子干燥的时间段，其中可代谢性食物储备(例如蛋白质、脂类、淀粉等)沉积在正在发育的种子中，尤其沉积在种子的贮藏器官内，所述的贮藏器官包括胚乳、种皮、糊粉层、胚和盾片上皮，导致种子增大和充实，并且以种子干燥为结束。
本发明的胚特异性启动子可以用于使产量滞后和对玉米生长和发育的其它潜在不利生理影响最小化，其中所述的不利生理影响可能因在植物中转基因蛋白质或其它分子的高水平非诱导的组成型表达而遭遇。当每种转基因与本发明启动子融合时，可以使DNA序列同源性依赖的转基因失活(共抑制)的风险最小化。
使DNA本身定位在细胞内可能有用。例如，导入的DNA定位在细胞核内可能是有用的，因为这可以增加转化频率。在细胞核内，为了实现位点特异性整合，以基因为靶是有用的。例如，使经过转化作用所导入的基因替换细胞内现存的基因将是有用的。其它元件包括可以受内源性介质或外源性物质(例如受锌指蛋白，包括天然存在的锌指蛋白或嵌合的锌指蛋白(见，例如US5,789,538，WO99/48909；WO99/45132；WO98/53060；WO98/53057；WO98/53058；WO00/23464；WO95/19431和WO98/54311)或Myb样转录因子)调节的那些元件。嵌合的锌指蛋白可以包括结合至特定DNA序列的氨基酸序列(锌指)以及激活(例如GAL4序列)或抑制与这种特定DNA序列连接的序列转录的氨基酸序列。
为本发明目的，对目的基因的一般分类例如包括与信息有关的那些基因如锌指基因、与通信有关的那些基因如激酶基因，和与持家有关的那些基因如热休克蛋白基因。更具体的转基因分类包括这样的基因，其编码对农学品质、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性和谷粒特征重要的性状。其它的转基因分类包括诱导来自植物和其它真核生物以及来自原核生物的外源产物(如酶、辅因子和激素)表达的基因。已经认识到任一目的基因可以有效地与本发明的启动子连接并在胁迫下得以表达。
在一个更优选的实施方案中，本发明的启动子调节这样的基因，该基因编码充当细胞周期调节物或控制糖代谢或植物激素水平的蛋白质，这一点已经在具有其它组织优选的启动子的烟草和卡诺拉油菜(canola)中证实(Ma，Q.H.等，1998；Roeckel，P.等，1997)。例如，编码异戊烯基转移酶或IAA-M的基因可以用于调节雌性小花枝的发育。其它重要的基因编码生长因子和转录因子。表达受启动子指导的所选择内源核苷酸或异源核苷酸可以引起雌性小花枝在不利条件下持续或改善的发育。
种子产生可以通过改变在环境胁迫期间影响种子生长和发育应答的基因(Cheikh-N等，1994)和控制糖代谢以减少玉米中种子败育(Zinselmeier等，1995)的基因表达进行改善。
2.3靶向的序列切除
本发明的嵌合性转录调节核酸序列在单子叶植物中的特异性使其特别用于从所述单子叶植物的基因组中定向地切除或缺失序列(如标记序列)。现有技术中已知方法的一个已知缺点是在整个植物范围内切除的不均一性，因此导致嵌合样的切除模式，这需要繁琐的额外选择和再生轮次。本发明启动子在早期胚中的特异性允许遍及整个胚的均一性切除，随后将提供无植物同源靶序列(例如标记)的植物。
本发明的另一个实施方案涉及用于从植物，优选地从单子叶植物切除靶序列(例如标记序列)的方法，所述方法包括步骤
A)通过将编码嵌合性转录调节核苷酸序列的多核苷酸有效连接至至少一个核酸序列而构建表达盒，其中所述的嵌合性转录调节核苷酸序列包含
i)选自以下的第一核酸分子
a)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：1的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：1的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸中至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，和与其有效连接的
ii)第二核酸分子，其选自以下多核苷酸
a)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：3的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：3的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段，和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，
其中所述的至少一个核酸序列相对于所述的嵌合性转录调节核苷酸序列是异源的并且适于诱导从单子叶植物切除靶序列，和
B)将所述表达盒插入包含至少一个靶序列的单子叶植物以提供转基因植物，其中所述的植物表达所述的异源核酸序列，和
C)选择表现出所述标记切除的转基因植物。
所述切除由多种方法实现，所述方法包括但不限于：
-使用位点特异性重组酶通过位点特异性重组而诱导序列缺失，其中所述的位点特异性重组酶由本发明的嵌合性转录调节核苷酸序列表达，
-通过诱导的同源重组而诱导序列缺失，其中待缺失的序列在侧翼分布有这样的序列，所述序列具有允许在它们之间发生同源重组的方向、足够长度和相互同源性，其中同源重组因位点特异性核酸内切酶(优选归巢核酸内切酶、更优选归巢核酸内切酶I-SceI)所产生的位点特异性双链断裂而诱导，其中所述的位点特异性核酸内切酶由本发明的嵌合的转录调节核苷酸序列表达。
本发明的另一个实施方案涉及植物，优选单子叶植物，或植物细胞，它们包含
A)稳定整合至所述植物基因组的至少一个靶序列，其中所述的靶序列在侧翼具有切除序列，该切除序列与介导序列特异性切除的酶相互作用时能够介导从该植物基因组切除所述靶序列，和
B)包含至少一个核酸序列的表达盒，其中所述的核酸序列编码能够与i)的所述切除序列相互作用的介导切除的酶，其中所述的核酸序列有效连接至包含以下核酸分子的嵌合性转录调节核苷酸序列
i)选自以下的第一核酸分子
a)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：1的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：1的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸中至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，和与其有效连接的
ii)第二核酸分子，其选自以下多核苷酸
a)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：3的多核苷酸具有至少50％、优选至少60％、70％或80％、更优选至少85％或90％、最优选至少95％、98％或99％序列同一性的多核苷酸；
c)SEQIDNO：3的多核苷酸的至少50个连续碱基、优选至少100个连续碱基、更优选200个连续碱基的片段；和
d)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于1×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.5×SSC，0.1％SDS中洗涤、更优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤，并且最优选在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在65℃于0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤。
上文描述了包含编码嵌合性转录调节核苷酸序列的多核苷酸的优选核酸分子。在下文描述待表达以实现序列切除的优选异源核酸序列(例如编码位点特异性重组酶或核酸内切酶)。
优选适用于本发明方法的单子叶植物可以选自玉米、小麦、稻、大麦、黑麦、谷子、高粱、黑麦草或薏苡、小黑麦或燕麦和甘蔗。优选地，所述植物选自玉米、小麦、大麦、稻、燕麦、黑麦和高粱，甚至更优选地选自玉米、小麦和稻，最优选地，该植物是玉米植物。
所述嵌合性转录调节核苷酸序列优选地如上定义。一旦所述植物的种子萌发和胚开始生长，将切除在以上定义的单子叶植物或植物细胞中的靶序列。无靶序列的植物将从这种胚产生。
靶序列和用于切除介导酶的表达盒可以组合于一个DNA中或在不同的构建体上。不同DNA构建体可以通过其它方法于单子叶植物或单子叶植物细胞的基因组中组合-例如，使分别包含所述靶序列和所述的用于切除介导酶的表达盒的不同亲代株系杂交，或共转化或后继转化。
因此，本发明的另一个实施方案涉及用于从单子叶植物或植物细胞的基因组中切除至少一个靶序列的方法，所述方法包括步骤
A)将包含至少一个靶序列的核酸构建体稳定插入基因组，其中所述核酸构建体稳定插入植物基因组中，其中所述靶序列的侧翼为切除序列，该切除序列能够在与序列特异性切除介导酶相互作用后介导从植物基因组中切除所述靶序列，和
B)将包含至少一个编码介导切除的酶的核酸序列和与其有效连接的嵌合性转录调节核苷酸序列的表达盒导入所述的单子叶植物或单子叶植物细胞，其中所述的介导切除的酶能够与i)的所述切除序列相互作用，其中所述的嵌合性转录调节核苷酸序列包含：
i)选自以下的第一核酸分子
a)如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：1的多核苷酸具至少50％序列同一性的多核苷酸；和
c)在下述条件下与包含如SEQIDNO：1中定义的多核苷酸中至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，和与其有效连接的
ii)第二核酸分子，其选自以下多核苷酸
a)如SEQIDNO：3中定义的多核苷酸；
b)与SEQIDNO：3的多核苷酸具至少50％序列同一性的多核苷酸；和
c)在下述条件下与包含如SEQIDNO：3所描述序列的至少50个核苷酸的核酸或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述的条件等同于：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中杂交并在50℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤，
C)产生包含所述靶序列和所述表达盒这两者的所述单子叶植物或植物细胞的种子，萌发该种子并培育来自其的植物，和
D)选择切除了所述靶序列的植物。
在一个优选的实施方案中，本发明方法还包括再生能育植物的步骤。所述方法还可以包括有性繁殖或无性繁殖或培育从所述植物细胞再生的植物的子孙或后代。
优选地，靶序列的切除(或缺失)可以通过本领域已知的多种方法实现，包括但不限于一个或多个如下的方法：
a)通过序列特异性重组酶诱导的重组，其中所述的靶序列以如此方式在侧翼具有相应的重组位点，以至于在所述的侧翼重组位点之间的重组导致从基因组中缺失侧翼重组位点之间的靶序列，
b)在所述靶序列侧翼分布的同源序列A和A’之间同源重组，其中在同源序列之间的所述同源重组优选地由序列特异性核酸内切酶所产生的序列特异性双链断裂诱导，其中所述的同源序列A和A’具有足够长度和同源性以便确保A和A’之间发生同源重组，并具有这样的方向，当A和A’之间重组时，所述方向将导致从所述植物的基因组中切除所述靶序列。
优选的切除序列和切除酶在以下详细描述。在另一个优选的实施方案中，可以以如此方式诱导或激活缺失/切除机制以防止过早地缺失/切除双功能标记。优选地，因此优选采用的序列特异性重组酶或核酸内切酶的表达和/或活性可以被诱导和/或激活，优选地通过选自如下的方法：
a)通过将编码所述切除酶(例如重组酶或核酸内切酶)的序列有效连接至与诱导型启动子或启动子元件组合的嵌合性转录调性序列而可诱导的表达，
b)通过利用可诱导的、经修饰(例如包含配体结合结构域)的切除酶(例如重组酶或核酸内切酶)而可诱导的激活，其中所述经修饰切除酶的活性可以通过用具有对所述配体结合结构域的结合活性的化合物处理受到调节。
优选地，靶序列是一个标记，更优选地是一个选择标记(优选的标记序列下文详述)。因此，本发明方法产生无选择标记的单子叶植物细胞或单子叶植物。
2.3.1优选的切除序列和切除酶
为确保靶序列缺失/切除，靶序列在侧翼具有在与序列特异性切除介导酶相互作用时能够介导从植物基因组中切除所述靶序列的切除序列。优选地，靶序列的缺失可以通过本领域已知的多种方法实现，包括但不限于一个或多个如下的方法：
a)通过序列特异性重组酶诱导的重组，其中所述的靶序列以如此方式在侧翼具有相应的重组位点，以至于在所述的侧翼重组位点之间的重组导致从基因组中缺失在侧翼重组位点之间的靶序列，
b)在所述靶序列侧翼分布的同源序列A和A’之间同源重组，其中在同源序列之间的所述同源重组优选地由序列特异性核酸内切酶所产生的序列特异性双链断裂诱导，其中所述的同源序列A和A’具有足够长度和同源性以便确保A和A’之间发生同源重组，并具有这样的方向，当A和A’之间重组时，所述方向将导致从所述植物的基因组中切除所述序列。
因此，为确保靶序列缺失/切除，靶序列在侧翼具有允许特异性地缺失所述表达盒的序列。所述的序列可以是序列特异性重组酶的重组位点，其中以如此方式安置所述的重组位点以至于在所述的侧翼重组位点之间的重组导致从基因组中缺失所述靶序列。存在本领域中已知的多种重组位点和相应的序列特异性重组酶(描述于下文)，可以为本发明的目的而采用。
在另一个优选的实施方案中，靶序列的缺失/切除通过分子内(优选在染色体内的)同源重组开展。同源重组可以天然发生，但是优选地由序列特异性双链断裂(例如在同源序列之间)诱导。基本原理在WO03/004659中公开。为此目的，靶序列在侧翼具有同源序列A和A’，其中所述的同源序列A和A’具有足够长度和同源性以便确保A和A’之间发生同源重组，并具有这样的方向，当A和A’之间重组时，所述方向将导致从所述基因组中切除所述序列。此外，在侧翼有所述同源序列的序列还包含具有至少10个碱基对的至少一个识别序列，其中所述的识别序列用于通过序列特异性DNA双链断裂诱导酶、优选序列特异性DNA核酸内切酶、更优选归巢核酸内切酶、最优选选自I-SceI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI和I-ChuI的核酸内切酶或其具有配体结合结构域的嵌合体而位点定向地诱导DNA双链断裂。合适的核酸内切酶在下文描述。
2.3.1.1重组位点和重组酶
在本发明范围内适合的序列特异性重组酶和它们相应的重组位点可以包括但不限于噬菌体P1的Cre/lox系统(DaleEC和OwDW1991；RussellSH等，1992；OsborneBI等，1995)、酵母FLP/FRT系统(KilbyNJ等，1995；LyznikLA等，1996)、Mu噬菌体Gin重组酶、大肠杆菌Pin重组酶或质粒pSR1的R/RS系统(OnouchiH等，1995；SugitaKet等，2000)。所述重组酶(例如Cre或FLP)与其相应的重组序列(分别是34bplox序列和47bpFRT序列)特异性地相互作用以缺失或倒转位于所述重组序列之间的序列。描述了植物中通过Cre缺失在侧翼具有两个lox序列的标准选择标记(DaleEC和OwDW1991)。下表1中描述了用于适宜重组酶的优选重组位点：
表1.合适的序列特异性重组酶
| 重组酶 | 来源生物 | 重组位点 |
| CRE | 噬菌体P1 | 5’-AACTCTCATCGCTTCGGATAACTTCCTGTTATCCGAAACATATCACTCACTTTGGTGATTTCACCGTAACTGTCTATGATTAATG-3’ |
| FLP | 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) | 5’-GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAA AGTATAGGAACTTC-3’ |
| R | pSR1质粒 | 5’-CGAGATCATATCACTGTGGACGTTG |
| 重组酶 | 来源生物 | 重组位点 |
| ATGAAAGAATACGTTATTCTTTCATCAAATCGT |
2.3.1.2同源序列
就同源序列(例如A，A’)而言，“足够长度”优选指具有至少20碱基对、优选至少50碱基对、特别优选至少100碱基对、非常特别优选至少250碱基对、最优选至少500碱基对长度的序列。
就同源序列(例如A，A’)而言，“足够同源性”优选指这样的序列，所述的序列在这些同源序列中在至少20碱基对、优选至少50碱基对、特别优选至少100碱基对、非常特别优选至少250碱基对、最优选至少500碱基对长度的范围内具有至少70％、优选地80％、优选至少90％、特别优选至少95％、非常特别优选地至少99％、最优选地100％同源性。
同源序列A和A’优选地以同向重复序列的形式排列。术语“同向重复序列”意指两种序列在DNA分子的同一链上在相同方向上的连续定位，其中这两种序列满足以上所给出的所述两个序列之间发生同源重组的条件。
在一个优选的实施方案中，同源序列可以是DNA构建体中具有额外用途的序列的复制。例如，同源序列可以是两个转录终止子序列。这两个终止子序列中的一个序列可以有效地与具有农学价值的性状基因连接，而另一个序列可以与存在于性状基因3’方向的双功能选择标记连接。在两个终止子序列之间的重组将切除靶序列(例如标记基因)，但是将重构性状基因的终止子。在另一个实例中，同源序列可以是两个启动子序列。这两个启动子序列中的一个序列可以有效地与具有农学价值的性状基因连接，而另一个序列可以与性状基因5’-方向存在的靶序列(例如选择标记)连接。在两个启动子序列之间的重组将切除靶序列(例如标记基因)，但是将重构性状基因的启动子。本领域技术人员知道同源序列没有必要限于单一功能性元件(例如启动子或终止子)，而可以包含或扩展到其它的序列(例如作为性状基因编码区域的部分和所述性状基因的分别的终止子序列的部分)。
2.3.1.3.双链断裂诱导酶
优选地，靶序列(例如标记基因)的缺失/切除通过在以上所述同源序列之间、优选在应当发生重组的同源序列之间由序列特异性双链断裂所诱导的同源重组而实现。一般方法在例如WO03/004659中公开，所述文献在本文中完整引用作为参考。本领域中已知适用于诱导序列特异性双链断裂的多种酶(本文以下统称为“核酸内切酶”)。核酸内切酶可以例如选自：
1.(II型)限制性核酸内切酶，优选如下文详述的归巢核酸内切酶。
2.转座酶，例如P-元件转座酶(KaufmanPD和RioDC1992)或AcDs(XiaoYL和PetersonT2000)。原则上，所有转座酶或整合酶是合适的，只要它们具有序列特异性(HarenL等，1999；BeallEL，RioDC1997)。
3.如下文详述的嵌合核酸酶。
4.免疫系统中诱导双链断裂的酶，如RAG1/RAG2系统(AgrawalA等，1998)。
5.II组内含子核酸内切酶。对内含子序列的修饰允许将II组内含子指向双链DNA内的几乎任一序列，其中II组内含子可以随后借助逆剪接机制插入(Mohr等，2000；Guo等，2000)。在这种逆剪接机制期间，双链断裂被导入靶DNA内，已切除的内含子RNA切割有义链，同时II组内含子核酸内切酶的蛋白质部分水解反义链(Guo等，1997)。当仅需要诱导双链断裂而不实现彻底的逆剪接时，正如本发明的情况，有可能借助例如无逆转录酶活性的II组内含子核酸内切酶。尽管这未阻止产生双链断裂，然而逆剪接机制不能推进至完成。
合适的酶是天然酶和合成酶。优选的酶是其识别序列已知并且可以以其蛋白质形式获得(例如通过纯化)或使用其核酸序列加以表达的全部核酸内切酶。
在一个优选的实施方案中，使用序列特异性核酸内切酶用于特异性诱导双链断裂并随后诱导同源重组。术语“序列特异性DNA核酸内切酶”通常指全部的如此核酸内切酶，这些酶能够在双链DNA中于一个或多个识别序列处以序列特异性方式生成双链断裂。所述的DNA切割可以产生DNA的平端或所谓“粘端”(具有5’-或3’-突出端)。切割位点可以位于识别序列内部或外部。可以采用多种类型的核酸内切酶。核酸内切酶可以属于例如II类或IIs类型。IIs类R-M限制性核酸内切酶在识别位点之外的序列处催化DNA切割，即它们在距离识别序列特定数目的核苷酸的DNA序列处切割(Szybalski等，1991)。可以通过举例方式，但不是限制性方式提到如下酶：
1.限制性核酸内切酶(例如I型或II型)，优选如本文以下详述的归巢核酸内切酶。
2.如本文以下详述的嵌合核酸酶或合成核酸酶。
与重组酶不同，限制性酶一般连接DNA，而仅切割DNA。限制性酶例如在NewEnglandBiolabs在线目录(www.neb.com)、Promega在线目录(www.promega.com)和Rao等(2000)描述。在本发明中，因核酸内切酶切割产生的DNA末端的“连接”通过同源序列的同源重组引起的融合实现。
优选地，以如此方式选择核酸内切酶，从而该核酸内切酶的相应识别序列是目标植物生物的未修饰基因组中稀有的，甚至是未曾出现过的。理想地，在所述基因组中的唯一(数个)识别序列拷贝是由本发明的DNA构建体导入的识别序列拷贝，因而消除了表达这种序列特异性核酸内切酶时切除或使基因组中其他DNA重排的可能性。
选择合适核酸内切酶的一个标准是该核酸内切酶相应的识别序列的长度。所述识别序列具有适宜长度以产生稀有切割，更优选仅在本发明的DNA构建体中所包含的识别位点处切割。从统计观点看，决定所述识别序列的最小长度的一个因素是宿主生物基因组的大小。在一个优选的实施方案中，所述识别序列的长度是至少10碱基对、优选至少14碱基对、更优选至少16碱基对、尤其优选至少18碱基对、最优选至少20碱基对。
切割10碱基对识别序列的限制性酶在HuangB等，1996中描述。
合适的酶是天然酶和合成酶。优选的酶是其识别序列已知并且可以以其蛋白质形式获得(例如通过纯化)或使用其核酸序列进行表达的全部序列特异性DNA核酸内切酶。
特别优选除了在转基因重组构建体内存在的识别序列之外，在特定真核生物的染色体DNA序列内没有或仅有少量识别序列的限制性核酸内切酶(限制性酶)。这避免了在基因组中在不需要的基因座处的其它双链断裂。这是特别优选归巢核酸内切酶的原因(综述：(BelfortM和RobertsRJ1997；JasinM1996；Internet：http://rebase.neb.com/rebase/rebase.homing.html)。由于其长的识别序列，归巢核酸内切酶大多数情况下在真核生物的染色体DNA序列中没有或仅有少量其他识别序列。
编码此类归巢核酸内切酶的序列可以例如从衣藻(Chlamydomonas)的叶绿体基因组(TurmelM等，1993)分离。它们是小分子(18至26kD)并且其可读框(ORF)具有直接适用于真核生物中胞核表达的“密码子使用频率”(MonnatRJJr等，1999)。极特别优选加以分离的归巢核酸内切酶是归巢核酸内切酶I-SceI(WO96/14408)、I-SceII(SarguielB等，1990)、I-SceIII(SarguielB等，1991)、I-CeuI(Marshall1991)、I-CreI(WangJ等，1997)、I-ChuI(CoteV等，1993)、I-TevI(Chu等，1990；Bell-Pedersen等，1990)、I-TevII(Bell-Pedersen等，1990)、I-TevIII(Eddy等，1991)、EndoSceI(Kawasaki等，1991)、I-CpaI(TurmelM等，1995a)和I-CpaII(TurmelM等，1995b)。
其他归巢核酸内切酶在以上提及的互联网站点详细描述，并且可以提到的实例是归巢核酸内切酶如F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HspNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NclIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PpbIP、I-PpoI、I-SPBetaIP、I-ScaI、I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiS3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPA1P、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP、PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-PspI、PI-Rma43812IP、PI-SPBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、PI-TliII、H-DreI、I-BasI、I-BmoI、I-PogI、I-TwoI、PI-MgaI、PI-PabI、PI-PabII。
在本上下文中优选的是已知其基因序列的归巢核酸内切酶，例如F-SceI、I-CeuI、I-ChuI、I-DmoI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI、I-CsmI、F-TevI、F-TevII、I-TevI、I-TevII、I-AniI、I-CvuI、I-DdiI、I-HmuI、I-HmuII、I-LlaI、I-NanI、I-MsoI、I-NitI、I-NjaI、I-PakI、I-PorI、I-PpoI、I-ScaI、I-Ssp6803I、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-PspI、PI-TfuI、PI-TliI。特别优选市售的归巢核酸内切酶，如I-CeuI、I-SceI、I-DmoI、I-PpoI、PI-PspI或PI-SceI。具有极长识别序列并且因而在基因组中仅以稀有方式(若存在)切割的核酸内切酶包括：I-CeuI(26bp识别序列)、PI-PspI(30bp识别序列)、PI-SceI(39bp识别序列)、I-SceI(18bp识别序列)和I-PpoI(15bp识别序列)。所述酶可以从其来源生物以技术人员熟悉的方式分离，和/或可以克隆所述酶的编码核酸序列。多种酶的序列已保存在GenBank。特别优选归巢核酸内切酶I-SceI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI和I-ChuI。编码所述核酸酶的序列是本领域已知的并且例如在WO03/004659中详述(如作为WP03/004659的SEQIDNO：2、4、6、8和10，该文献以引用方式并入本文)。
待表达的异源核酸序列可以优选地编码如SEQIDNO：22所述的多肽或其功能等同物，其中所述的功能等同物能够产生与所述任意多肽相同的表型。最优选地，待表达的核酸序列由SEQIDNO21或23描述。
在一个优选的实施方案中，编码所述归巢核酸内切酶的序列可以通过插入内含子序列进行修饰。这防止功能性酶在原核宿主生物中表达并且因而促进(例如基于大肠杆菌或农杆菌的)克隆和转化过程。在植物生物中，实现了功能性酶的表达，因为植物能够识别并“剪接”去掉内含子。优选地，将内含子插入以上提到作为优选的归巢核酸内切酶(例如I-SceI或I-CreI)的基因中。
在本发明的一些方面，可以利用分子演化来产生改良的核酸内切酶。编码候选核酸内切酶的多核苷酸例如可以用DNA改组方法进行调整。DNA改组是递归性重组和突变的过程，通过使相关基因集合的随机片段化而进行，随后通过聚合酶链式反应样过程使片段再装配。见例如Stemmer(1994)；Stemmer(1994)；和US5,605,793、US5,837,458、US5,830,721和US5,811,238。
可以通过举例方式提到的其他合成的核酸内切酶是由非特异性核酸酶结构域和包含锌指的序列特异性DNA结合结构域组成的嵌合核酸酶(BibikovaM等，2001)。这些结合DNA的锌指结构域可以加以改变以适应于任意DNA序列。描述了用于制备适用锌指结构域的合适方法并且它们是技术人员已知的(BeerliRR等，2000；BeerliRR等，2000；SegalDJ和BarbasCF2000；KangJS和KimJS2000；BeerliRR等，1998；KimJS等，1997；KlugA1999；TsaiSY等，1998；MappAK等，2000；SharrocksAD等，1997；ZhangL等，2000)。
优选地将所述核酸内切酶表达为具有核定位序列(NLS)的融合蛋白。这种NLS序列能够促进输送至胞核并提高重组系统的效率。多种NLS序列是技术人员已知的并且尤其由JicksGR和RaikhelNV1995描述。例如，优选用于植物生物的是SV40大抗原的NLS序列。在WO03/060133中提供实例。然而，由于许多DSBI酶(例如归巢核酸内切酶)尺寸小，故而NLS序列实际上并非必需。这些酶甚至在无任何协助时就能经过核孔。
在又一个优选的实施方案中，可以诱导所述核酸内切酶的活性。已经描述了适用于序列特异性重组酶的方法(AngrandPO等，1998；LogieC和StewartAF1995；ImaiT等，2001)。这些方法利用核酸内切酶与针对类固醇激素受体(例如，人雄激素受体或如本文中描述的人雌激素受体的突变变体)的配体结合结构域的融合蛋白。诱导可以用配体例如雌二醇、地塞米松、4-羟基他莫昔芬或雷洛昔芬实现。一些核酸内切酶作为二聚体(同二聚体或异二聚体；I-CreI形成同二聚体；I-SecIV形成异二聚体)有活性(WernetteCM1998)。二聚化可以设计为诱导型特征，例如通过天然二聚化结构域交换成低分子量配体结合结构域。二聚体配体的添加随后导致融合蛋白的二聚化。已经描述了相应的诱导型二聚化方法和所述二聚体配体的制备法(AmaraJF等，1997；MuthuswamySK等，1999；SchultzLW和ClardyJ1998；KeenanT等，1998)。
本领域描述了序列特异性DNA核酸内切酶(例如归巢核酸内切酶)的识别序列。“识别序列”指由本发明的序列特异性DNA核酸内切酶识别的DNA序列。该识别序列的长度一般是至少10碱基对，更一般是10至30碱基对长度并且在绝大多数的实施方案中，长度少于50碱基对。
“识别序列”一般指在本发明范围内所用的植物细胞中的条件下，能够由序列特异性DNA-核酸内切酶识别并切割的那些序列。在下文表2中以举例方式，而非限制性方式提及各自序列特异性DNA-核酸内切酶的识别序列。
表2.核酸内切酶的识别序列和来源生物(例如归巢核酸内切酶；“^”指示序列特异性DNA-核酸内切酶在识别序列中的切割位点).
| DSBI酶 | 来源生物 | 识别序列 |
| P-元件转座酶 | 果蝇(Drosophila) | 5’-CTAGATGAAATAACATAAGGTGG-3’ |
| I-AniI | 构巢曲霉(Aspergillusnidulans) | 5’-TTGAGGAGGTT^TCTCTGTAAATAANNNNNNNNNNNNNNN3’-AACTCCTCCAAAGAGACATTTATTNNNNNNNNNNNNNNN^ |
| I-DdiI | 盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)AX3 | 5’-TTTTTTGGTCATCCAGAAGTATAT3’-AAAAAACCAG^TAGGTCTTCATATA |
| I-CvuI | 小球藻(Chlorellavulgaris) | 5’-CTGGGTTCAAAACGTCGTGA^GACAGTTTGG3’-GACCCAAGTTTTGCAG^CACTCTGTCAAACC |
| I-CsmI | 史氏衣藻(Chlamydomonassmithii) | 5’-GTACTAGCATGGGGTCAAATGTCTTTCTGG |
| I-CmoeI | 淡水衣藻(Chlamydomonasmoewusii) | 5’-TCGTAGCAGCT^CACGGTT3’-AGCATCG^TCGAGTGCCAA |
| I-CreI | 莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) | 5’-CTGGGTTCAAAACGTCGTGA^GACAGTTTGG3’-GACCCAAGTTTTGCAG^CACTCTGTCAAACC |
| I-ChuI | 土生衣藻(Chlamydomonashumicola) | 5’-GAAGGTTTGGCACCTCG^ATGTCGGCTCATC3’-CTTCCAAACCGTG^GAGCTACAGCCGAGTAG |
| I-CpaI | 大斑衣藻(Chlamydomonaspallidostigmatica) | 5’-CGATCCTAAGGTAGCGAA^ATTCA3’-GCTAGGATTCCATC^GCTTTAAGT |
| I-CpaII | 大斑衣藻 | 5’-CCCGGCTAACTC^TGTGCCAG3’-GGGCCGAT^TGAGACACGGTC |
| I-CeuI | Chlamydomonaseugametos | 5’-CGTAACTATAACGGTCCTAA^GGTAGCGAA3’-GCATTGATATTGCCAG^GATTCCATCGCTT |
| I-DmoI | 运动脱硫球菌(Desulfurococcusmobilis) | 5’-ATGCCTTGCCGGGTAA^GTTCCGGCGCGCAT3’-TACGGAACGGCC^CATTCAAGGCCGCGCGTA |
| I-SceI | 酿酒酵母 | 5’-AGTTACGCTAGGGATAA^CAGGGTAATATAG3’-TCAATGCGATCCC^TATTGTCCCATTATATC5’-TAGGGATAA^CAGGGTAAT3’-ATCCC^TATTGTCCCATTA(“Core”-序列) |
| I-SceII | 酿酒酵母 | 5’-TTTTGATTCTTTGGTCACCC^TGAAGTATA3’-AAAACTAAGAAACCAG^TGGGACTTCATAT |
| I-SceIII | 酿酒酵母 | 5’-ATTGGAGGTTTTGGTAAC^TATTTATTACC3’-TAACCTCCAAAACC^ATTGATAAATAATGG |
| I-SceIV | 酿酒酵母 | 5’-TCTTTTCTCTTGATTA^GCCCTAATCTACG3’-AGAAAAGAGAAC^TAATCGGGATTAGATGC |
| I-SceV | 酿酒酵母 | 5’-AATAATTTTCT^TCTTAGTAATGCC3’-TTATTAAAAGAAGAATCATTA^CGG |
| I-SceVI | 酿酒酵母 | 5’-GTTATTTAATG^TTTTAGTAGTTGG3’-CAATAAATTACAAAATCATCA^ACC |
| I-SceVII | 酿酒酵母 | 5’-TGTCACATTGAGGTGCACTAGTTATTAC |
| PI-SceI | 酿酒酵母 | 5’-ATCTATGTCGGGTGC^GGAGAAAGAGGTAAT3’-TAGATACAGCC^CACGCCTCTTTCTCCATTA |
| F-SceI | 酿酒酵母 | 5’-GATGCTGTAGGC^ATAGGCTTGGTT3’-CTACGACA^TCCGTATCCGAACCAA |
| F-SceII | 酿酒酵母 | 5’-CTTTCCGCAACA^GTAAAATT3’-GAAAGGCG^TTGTCATTTTAA |
| I-HmuI | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体SPO1 | 5’-AGTAATGAGCCTAACGCTCAGCAA3’-TCATTACTCGGATTGC^GAGTCGTT |
| I-HmuII | 枯草芽孢杆菌噬菌体SP82 | 5’-AGTAATGAGCCTAACGCTCAACAANNNNNNNNNNNNNNNN-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN |
| I-LlaI | 乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) | 5’-CACATCCATAAC^CATATCATTTTT3’-GTGTAGGTATTGGTATAGTAA^AAA |
| I-MsoI | Monomastix物种 | 5’-CTGGGTTCAAAACGTCGTGA^GACAGTTTGG3’-GACCCAAGTTTTGCAG^CACTCTGTCAAACC |
| I-NanI | 安氏纤毛虫(Naegleriaandersoni) | 5’-AAGTCTGGTGCCA^GCACCCGC3’-TTCAGACC^ACGGTCGTGGGCG |
| I-NitI | 斜纤毛虫(Naegleriaitalica) | 5’-AAGTCTGGTGCCA^GCACCCGC3’-TTCAGACC^ACGGTCGTGGGCG |
| I-NjaI | 加米纤毛虫(Naegleriajamiesoni) | 5’-AAGTCTGGTGCCA^GCACCCGC3’-TTCAGACC^ACGGTCGTGGGCG |
| I-PakI | Pseudendocloniumakinetum | 5’-CTGGGTTCAAAACGTCGTGA^GACAGTTTGG3’-GACCCAAGTTTTGCAG^CACTCTGTCAAACC |
| I-PorI | Pyrobaculumorganotrophum | 5’-GCGAGCCCGTAAGGGT^GTGTACGGG3’-CGCTCGGGCATT^CCCACACATGCCC |
| I-PpoI | 多头绒泡菌(Physarumpolycephalum) | 5’-TAACTATGACTCTCTTAA^GGTAGCCAAAT3’-ATTGATACTGAGAG^AATTCCATCGGTTTA |
| I-ScaI | 好望角酵母(Saccharomycescapensis) | 5’-TGTCACATTGAGGTGCACT^AGTTATTAC3’-ACAGTGTAACTCCAC^GTGATCAATAATG |
| I-Ssp6803I | 集胞藻(Synechocystisspecies) | 5’-GTCGGGCT^CATAACCCGAA3’-CAGCCCGAGTA^TTGGGCTT |
| PI-PfuI | 激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)Vc1 | 5’-GAAGATGGGAGGAGGG^ACCGGACTCAACTT3’-CTTCTACCCTCC^TCCCTGGCCTGAGTTGAA |
| PI-PfuII | 激烈热球菌Vc1 | 5’-ACGAATCCATGTGGAGA^AGAGCCTCTATA3’-TGCTTAGGTACAC^CTCTTCTCGGAGATAT |
| PI-PkoI | PyrococcuskodakaraensisKOD1 | 5’-GATTTTAGAT^CCCTGTACC3’-CTAAAA^TCTAGGGACATGG |
| PI-PkoII | PyrococcuskodakaraensisKOD1 | 5’-CAGTACTACG^GTTAC3’-GTCATG^ATGCCAATG |
| PI-PspI | 热球菌(Pyrococcussp.) | 5’-AAAATCCTGGCAAACAGCTATTAT^GGGTAT3’-TTTTAGGACCGTTTGTCGAT^AATACCCATA |
| PI-TfuI | Thermococcusfumicolans ST557 | 5’-TAGATTTTAGGT^CGCTATATCCTTCC3’-ATCTAAAA^TCCAGCGATATAGGAAGG |
| PI-TfuII | Thermococcusfumicolans ST557 | 5’-TAYGCNGAYACN^GACGGYTTYT3’-ATRCGNCT^RTGNCTGCCRAARA |
| PI-ThyI | Thermococcushydrothermalis | 5’-TAYGCNGAYACN^GACGGYTTYT3’-ATRCGNCT^RTGNCTGCCRAARA |
| PI-TliI | Thermococcuslitoralis | 5’-TAYGCNGAYACNGACGG^YTTYT3’-ATRCGNCTRTGNC^TGCCRAARA |
| PI-TliII | Thermococcuslitoralis | 5’-AAATTGCTTGCAAACAGCTATTACGGCTAT |
| I-TevI | 噬菌体T4 | 5’-AGTGGTATCAAC^GCTCAGTAGATG3’-TCACCATAGT^TGCGAGTCATCTAC |
| I-TevII | 噬菌体T4 | 5’-GCTTATGAGTATGAAGTGAACACGT^TATTC3’-CGAATACTCATACTTCACTTGTG^CAATAAG |
| F-TevI | 噬菌体T4 | 5’-GAAACACAAGA^AATGTTTAGTAAANNNNNNNNNNNNNN3’-CTTTGTGTTCTTTACAAATCATTTNNNNNNNNNNNNNN^ |
| F-TevII | 噬菌体T4 | 5’-TTTAATCCTCGCTTC^AGATATGGCAACTG3’-AAATTAGGAGCGA^AGTCTATACCGTTGAC |
| H-DreI | 大肠杆菌pI-DreI | 5’-CAAAACGTCGTAA^GTTCCGGCGCG3’-GTTTTGCAG^CATTCAAGGCCGCGC |
| I-BasI | 苏云金芽孢杆菌噬菌体Bastille | 5’AGTAATGAGCCTAACGCTCAGCAA3’-TCATTACGAGTCGAACTCGGATTG |
| I-BmoI | 莫哈维芽胞杆菌(Bacillusmojavensis)s87-18 | 5’-GAGTAAGAGCCCG^TAGTAATGACATGGC3’-CTCATTCTCG^GGCATCATTACTGTACCG |
| I-PogI | Pyrobaculumoguniense | 5’-CTTCAGTAT^GCCCCGAAAC3’-GAAGT^CATACGGGGCTTTG |
| I-TwoI | 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)噬菌体Twort | 5’-TCTTGCACCTACACAATCCA3’-AGAACGTGGATGTGTTAGGT |
| PI-MgaI | 胃分支杆菌(Mycobacteriumgastri) | 5’-CGTAGCTGCCCAGTATGAGTCA3’-GCATCGACGGGTCATACTCAGT |
| PI-PabI | Pyrococcus abyssi | 5’-GGGGGCAGCCAGTGGTCCCGTT3’-CCCCCGTCGGTCACCAGGGCAA |
| PI-PabII | Pyrococcus abyssi | 5’-ACCCCTGTGGAGAGGAGCCCCTC3’-TGGGGACACCTCTCCTCGGGGAG |
还包括仍能够由所讨论的序列特异性DNA-核酸内切酶识别和切割的识别序列的微小偏离(简并性)。已经描述此类偏离及与之有关的不同构架条件，例如钙浓度或镁浓度(ArgastGM等，1998)。还包括这些识别序列的核心序列和其中的微小偏离(简并性)。已知识别序列的内侧部分足以诱导双链断裂并且外侧部分不是绝对重要的，但是可以共同地决定切割效率。因此，例如，可以对I-SceI定义18bp核心序列。
2.3.2缺失/切除的启动
存在适宜地启动靶序列缺失/切除的多种方法。优选地，缺失仅在靶序列成功整合至植物基因组后才启动。例如在靶序列是选择标记的情况下，优选地标记已经成功完成其功能，导致DNA构建体插入待转化植物细胞或生物的基因组之后，启动切除。
本领域技术人员可获得多种方法以将切除酶与侧翼具有切除序列的靶序列组合。优选地，通过选自如下的方法可以表达切除酶(例如重组酶或核酸内切酶)或与其相应的切除序列(例如重组或识别位点)的组合：
a)将切除酶(例如重组酶或序列特异性核酸内切酶)的表达盒掺入DNA构建体，优选地连同侧翼具有所述切除序列的靶序列(例如标记基因)一起掺入，
b)将切除酶(例如重组酶或序列特异性核酸内切酶)的表达盒的掺入已经包含侧翼具有所述切除序列的靶序列(例如标记基因)的植物细胞或植物，
c)将切除酶(例如重组酶或序列特异性核酸内切酶)的表达盒掺入植物细胞或植物，其中所述的植物细胞或植物随后作为以构建体转化的主植物或主细胞使用，其中所述的构建体包含侧翼具有所述切除序列的靶序列(例如标记基因)，
d)将切除酶(例如重组酶或序列特异性核酸内切酶)的表达盒掺入分别的DNA构建体，其中所述的DNA构建体通过共转化方式与包含侧翼具有所述切除序列的靶序列(例如标记基因)的独立DNA构建体转化。
因此，靶序列和切除酶(例如重组酶或核酸内切酶)可以在例如以下的植物生物、细胞、细胞区室或组织中组合：
1.)以惯常方式方式产生这样的植物，该植物包含插入其基因组中(优选地至染色体DNA)的侧翼具有切除序列的靶序列(例如标记基因)。另外的用于切除酶的表达盒随后与所述DNA构建体以如下方式组合：
a)用所述第二表达盒进行第二转化，或
b)包含靶序列的植物与包含切除酶表达盒的主植物杂交。
2.)编码切除酶的表达盒可以整合至已经携带靶序列的DNA构建体中。优选将编码切除酶的序列插入允许进行缺失的序列之间，并因此在该序列完成其功能后，从基因组DNA中缺失该序列。非常特别优选在这种情况下(例如在下文所述的诱导型启动子之一控制下)，核酸内切酶的表达是使用发育依赖性启动子以发育依赖性方式可诱导的，或采用这样的切除酶，其中为避免双功能标记在插入基因组之前过早缺失，该切除酶的活性是可诱导的。
3.)根据共转化技术，切除酶的表达盒可以随包含靶序列而位于另外的DNA分子(例如载体)中的DNA构建体同时转化至细胞内。共转化可以是稳定的或短暂的。在此时，切除酶的表达优选地是可诱导的(例如在如上所述可诱导的嵌合的转录调节性序列之一的控制下)，尽管未修饰的超级启动子的发育依赖性表达模式已经防止过早切除。
4.)表达切除酶的植物还可以充当亲代个体。在来自表达切除酶的植物与携带靶序列的植物之间杂交的子代中观察到所需要的靶序列切除(例如通过双链断裂和同源序列之间的重组)。
本发明的一个优选实施方案涉及这样的DNA构建体，其包含靶序列(例如包含选择标记的表达盒；第一表达盒)和用于切除酶的第二表达盒(例如与植物启动子连接的核酸内切酶编码序列或重组酶编码序列)，它们优选地处于如此形式，以至于所述第二表达盒与侧翼具有所述切除序列的所述第一表达盒连接在一起，这允许特定靶序列的缺失。
在另一个优选的实施方案中，可以以防止过早缺失/切除双功能标记的方式诱导或激活缺失/切除机制。因而优选地，可以诱导优选使用的切除酶的表达和/或活性，优选地通过选自以下方法诱导：
a)通过将编码所述切除酶(例如重组酶或核酸内切酶)的序列有效连接至诱导型启动子而可诱导的表达，
b)通过采用包含配体结合结构域的修饰的切除酶(例如重组酶或核酸内切酶)而可诱导的激活，其中所述修饰的切除酶的活性可以通过对所述配体结合结构域具有结合活性的化合物的处理进行调节。
编码切除酶的多核苷酸的表达优选地受切除启动子控制，该启动子允许以时间方式的表达以至于双功能标记在受到切除前可以执行其作为负选择标记的功能。例如在德国专利申请DE03028884.9中描述了合适的启动子。此类启动子可以具有例如对晚期发育阶段如繁殖组织的表达特异性。切除启动子可以选自下文的启动子之一。
2.3.3待切除的靶序列
虽然本文中构思了多种序列，其中切除可能是有利的，然而待切除的最优选靶序列是标记序列。在常用术语“标记序列”下包含可选择和可筛选的多种标记序列。因此，本发明的方法产生无标记的单子叶植物细胞或单子叶植物，术语“无标记”或“无选择标记”如本文中就细胞或生物方面所用，意指不能够表达功能性标记蛋白质的细胞或生物。编码所述标记蛋白质的序列可以部分地或优选地被全部缺失。
2.3.3.1标记基因
经常使用标记基因(例如可选择或可筛选的标记)以便改善鉴定转化体的能力。“标记基因”是这样的基因，该基因赋予表达该标记基因的细胞明显的表型并因此允许将这种转化细胞与不含标记的细胞区分开。此类基因可以编码可选择或可筛选的标记，这取决于标记赋予的性状是否可以通过化学方法即通过使用选择剂(例如除草剂、抗生素等)加以选择，或该性状是否可简单地由观察或检验即由‘筛选’(例如R-基因座性状、绿色荧光蛋白(GFP))加以鉴定的性状。当然，合适标记基因的众多实例是本领域中已知的并可以用于本发明的实施。该术语中包含的可选择或可筛选标记基因还是编码“可分泌标记”的基因，其中所述的可分泌标记可以作为鉴定或选择已转化细胞的方法受到检测。可分泌标记的实例包括编码可通过与抗体相互作用进行鉴定的可分泌抗原标记，或甚至是可以因其催化活性得到检测的可分泌酶。可分泌蛋白质分成多个类别，包括(例如通过ELISA)可检测的扩散性小分子蛋白；在细胞外溶液中可检测的小分子活性酶(例如α-淀粉酶、β-内酰胺酶、草铵膦乙酰基转移酶)和插入或截获于细胞壁中的蛋白质(例如包含如伸展蛋白或烟草PR-S的表达单元中存在前导序列的蛋白质)。
就可选择的可分泌标记而言，认为使用编码隔离于细胞壁中的蛋白质和包含独特表位的蛋白质的基因特别有利。这种分泌型抗原标记将理想地利用在植物组织内提供浅背景的表位序列和这样的启动子-前导序列，其赋予高效表达和穿过胞浆膜的高效定向，并将产生在细胞壁内束缚且抗体仍可接近的蛋白质。为包括独特表位进行修饰的正常分泌的细胞壁蛋白质将满足全部的此类要求。适合以这种方式修饰的蛋白质的一个实例是伸展蛋白或羟脯氨酸丰富的糖蛋白(HPRG)。例如，已经充分表征玉米HPRG(Steifel1990)分子的分子生物学、表达和蛋白质结构。然而，多种ultilane和/或甘氨酸丰富的细胞壁蛋白质(Keller1989)中的任一种蛋白质可以通过添加抗原性位点进行修饰以产生可筛选标记。
可分泌的可筛选标记的一个示例性实施方案涉及使用编码经修饰以包含来自小鼠白细胞介素前区域(pro-region)的一个15个残基表位的细胞壁蛋白质HPRG的玉米序列，然而，在此类实施方案中几乎可以采用任何可检测的表位，如从本领域技术人员已知的种类非常广泛的抗原-抗体组合中选择。随后独特的细胞外表位可以使用经生色附加物或荧光附加物标记的抗体直接检测。
本公开的元件可以通过使用bar和/或GUS基因并且还可通过使用多种的其它标记详细举例说明。当然，根据本公开，除本文以下所述的标记基因之外，众多其它可能的可选择和/或可筛选的标记基因对本领域技术人员是显而易见的。因此，可以理解的是如下讨论是示例性而非排他性的。根据本文中所公开技术和本领域中已知的常用重组技术，本发明有可能将任一基因(包括标记基因)导入受体细胞以产生转化植物。
标记序列可以通过在植物细胞中具有表达能力的任一转录调节性序列或启动子(合适的启动子序列在下文描述)表达。最优选的是在植物转化、筛选和选择中所用的标记序列。标记能够鉴定转化后的转基因细胞或转基因生物(例如植物或植物细胞)。它们可以分别分成正选择标记(赋予选择性优势)、负选择标记(弥补选择劣势)和反选择标记(赋予选择缺点)。此类标记可以包括但不限于：
2.3.3.1.1负选择标记
负选择标记赋予对杀生物性化合物如代谢抑制物(例如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸，WO98/45456)、抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(例如草铵膦或草甘膦)的抗性。表达标记基因的转化植物材料(例如细胞、组织或幼苗)能够在抑制未转化的野生型组织生长的相应选择化合物(例如抗生素或除草剂)的浓度存在下发育。尤其优选的负选择标记是赋予除草剂抗性的那些负选择标记。可以提到的负选择标记的实例是：
-草铵膦乙酰基转移酶(PAT；又称双丙氨抗性；bar；deBlock1987；Vasil1992，1993；Weeks1993；Becker1994；Nehra1994；Wan和Lemaux1994；EP0333033；US4,975,374)。优选来自吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因或来自绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的pat基因。PAT使除草剂双丙氨膦中的活性成分草铵膦(PPT)失活。PPT抑制谷氨酰胺合成酶(Murakami1986；Twell1989)，导致氨的迅速累积和细胞死亡。
-赋予草甘(N-(膦酰甲基)甘氨酸)抗性的改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Hinchee1988；Shah1986；Della-Cioppa1987)。在使用突变的EPSP合酶基因中，额外益处可以通过掺入合适的叶绿体转运肽CTP实现(EP-A10218571)。
-降解草甘的酶(草甘氧化还原酶；gox)，
-失活茅草的脱卤素酶(deh)，
-失活磺酰脲-和/或咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶(ahas或ALS；例如具有如S4、XI12、XA17和/或Hra突变的经突变的ahas/ALS变体(EP-A1154204)，
-降解溴苯的腈水解酶(bxn；Stalker1988)，
-编码例如新霉素磷酸转移酶(Fraley1983；Nehra1994)的卡那霉素抗性基因或庆大霉素(G418)抗性基因(NPTII；NPT或neo；Potrykus1985)，
-赋予2-脱氧葡萄糖抗性(Randez-Gil1995)的2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶(DOGR1-基因产物；WO98/45456；EP0807836)，
-介导潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)(VandenElzen1985)，
-赋予氨甲叶酸抗性(Thillet1988)的改变的二氢叶酸还原酶(Eichholtz1987)，
-赋予5-甲基色氨酸抗性的突变的邻氨基苯甲酸合酶基因。
细菌来源的赋予抗生素抗性的其它负选择标记基因包括赋予壮观霉素抗性的aadA基因、庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶(SPT)、氨基糖甙-3-腺苷酰基转移酶和博来霉素抗性决定子(Hayford1988；Jones1987；Svab1990；Hille1986)。
尤其优选这样的负选择标记，其赋予对D-氨基酸(例如D-丙氨酸和D-丝氨酸)所致的毒性效应的抗性(WO03/060133；Erikson2004)。作为本上下文中的负选择标记，尤其优选来自纤细红酵母(Rhodotorulagracilis)(红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides))的daol基因(EC：1.4.3.3：GenBank登录号：U60066)和大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)[EC：4.3.1.18；GenBank登录号：J01603)。
表达此类标记基因的经转化植物材料(例如细胞、组织或幼苗)能够在抑制未转化野生型组织生长的相应选择化合物(例如抗生素或除草剂)的浓度存在下发育。得到的植物可以以常规方式育种和杂交。应当培育两个或多个世代以确信基因组整合是稳定的且遗传的。描述了相应的方法(Jenes1993；Potrykus1991)。
此外，可以利用允许视观筛选的报道基因，这可能需要或可能不需要(取决于报道基因类型)补充作为选择化合物的底物。
可以对多种负选择标记基因采用多种时间方案。在抗性基因(例如抗除草剂或D-氨基酸)的例子中，优选地自始至终施加在整个愈伤组织导入期进行选择约4周并超过至少4周至再生。这种选择方案可以应用于全部选择计划。还有可能(虽然不是明确优选的)也在整个再生计划(包括生根)期间自始至终保持选择。
例如用膦丝菌素抗性基因(bar)作为选择标记，培养基中可以包含浓度从约1至50mg/L的膦丝菌素。例如，用dao1基因作为选择标记，培养基中可以包含浓度从约3至100mg/L的D-丝氨酸或D-丙氨酸。用于选择的常用浓度是20至40mg/L。例如，用突变的ahas基因作为选择标记，培养基中可以包含浓度从约3至100mg/L的PURSUITTM。用于选择的常用浓度是20至40mg/L。
2.3.3.1.2正选择标记
此外，可以使用正选择标记。正选择标记是这样的选择标记，它们不引起对杀生物性化合物的脱毒，但是通过增加或改善包含此种标记的细胞或生物的再生、生长、增殖、繁殖等而赋予优势。正选择标记的实例是异戊烯基转移酶(细胞分裂素生物合成的关键酶，该酶促进在无细胞分裂素的培养基上选择经转化植物细胞的再生；Ebinuma2000a；Ebinuma2000b；例如来自菌株：PO22；GenBank登录号：AB025109)。与未转化物细胞相比，对已转化物细胞赋予生长优势的其它正选择标记例如在EP-A0601092中描述。生长刺激选择标记可以包括(但是不应当限于)β-葡糖醛酸糖苷酶(与例如细胞分裂素葡糖苷酸组合)、甘露糖-6-磷酸异构酶(与甘露糖组合)、UDP-半乳糖-4-差向异构酶(与例如半乳糖组合)、其中尤其优选与甘露糖组合的甘露糖-6-磷酸异构酶。
2.3.3.1.3反选择标记
待切除的靶序列可以不仅包含负选择标记或正选择标记(以促进选择和分离已成功转化的植物)，而且还可以包含反选择标记以便评估成功的后续标记切除。在一个优选的实施方案中，正选择标记和/或正选择标记和反选择标记在侧翼具有切除序列并均通过切除酶的作用被缺失/切除。反选择标记尤其适合于选择这样的生物，该生物具有包含所述标记的经定义缺失的序列(Koprek1999)。反选择标记是编码能够使无毒化合物转化成有毒化合物的酶的序列。因此仅缺少所述反选择标记的细胞在用所述无毒化合物处理时存活下来，因而允许选择已经成功使序列(例如标记)缺失的细胞。本领域中已知的常用反选择标记是例如
a)与5-氟胞嘧啶(5-FC)组合的胞嘧啶脱氨酶(CodA)(WO93/01281；US5,358,866；GleaveAP等1999；PereraRJ等，1993；StougaardJ1993；EP-A1595837；MullenCA等，1992；KobayashiT等，1995；SchlamanHRM与HooykaasPFF1997；XiaohuiWangH等，2001；KoprekT等，1999；GleaveAP等，1999；GallegoME1999；SalomonS与PuchtaH1998；ThykjaerT等，1997；SerinoG1997；RisseeuwE1997；BlancV等，1996；CorneilleS等，2001)。
b)细胞色素P-450酶与磺酰脲除草剂原R7402(2-甲基乙基-2-3-二氢-N-[(4，6-二甲氧嘧啶-2-基)氨基羰基]-1，2-苯并异噻唑-7-磺酰胺-1，1-二氧化物)的组合(O’KeefeDP等，1994；TissierAF等，1999；KoprekT等，1999；O’KeefeDP1991)。
c)与萘乙酰胺(NAM)组合的吲哚乙酸水解酶(例如来自根癌农杆菌的tms2基因产物)(FedoroffNV与SmithDL1993；UpadhyayaNM等，2000；DepickerAG等，1988；Karlin-NeumannnGA等，1991；SundaresanV等，1995；CecchiniE等，1998；ZubkoE等，2000)。
d)来自养黄色杆菌GJ10(XanthobacterautotropicusGJI0)的与1，2-二氯乙烷(DCE)组合的卤烷脱卤素酶(dhlA基因产物)(NaestedH等，1999；JanssenDB等，1994；JanssenDB1989)。
e)与无环鸟苷、更昔洛韦或1，2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘尿嘧啶(FIAU)组合的(例如来自1型单纯疱疹病毒(TKHSV-1))的胸苷激酶(TK)(CzakoM和MartonL1994；WiglerM等，1977；McKnightSL等，1980；McKnightSL等，1980；Preston等，1981；Wagner等，1981；St.Clair等1987)。
本领域中已知其它数种反选择系统(见例如国际申请WO04/013333；第13至20页的概述；该文献本文中引用作为参考)。
2.3.3.1.4.可筛选标记
可以利用的可筛选标记(又称作报道基因或报道蛋白；SchenbornE，GroskreutzD.1999)包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS；Jefferson等(1987)EMBOJ6：3901-3907)或编码多种生色底物已知的酶的uidA基因；编码调节植物组织内花青苷色素(红颜色)产生的产物的R-基因座基因(Dellaporta1988)；编码已知多种生色底物的酶(例如PADAC，一种生色的头孢菌素)的β-内酰胺酶基因(Sutcliffe1978)；编码可以转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶的xylE基因(Zukowsky1983)；α-淀粉酶基因(Ikuta1990)；酪氨酸酶基因(Katz1983)，该基因编码能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌的酶，其中DOPA和多巴醌随后缩合形成可轻易加以检测的黑色素；编码存在生色底物的酶的β-半乳糖苷酶基因；允许生物发光检测的萤光素酶(lux)基因(Ow1986；Millar等(1992)PlantMolBiolRep10：324-414)，或甚至可以在钙敏感的生物发光检测中利用的水母发光蛋白基因(Prasher1985)，或绿色荧光蛋白基因(GFP)(Niedz1995；ChuiWL等，1996；LeffelSM等，1997；Sheen等，1995；Haseloff等，1997；Reichel等，1996；Tian等，1997)。
预计来自玉米R基因复合体的基因作为可筛选标记是特别有用的。R基因复合体在玉米中编码这样的蛋白质，所述蛋白质起到调节花青苷色素在大部分种子和植物组织中产生的作用。来自R基因复合体的基因应用于玉米转化，因为该基因在转化细胞内的表达不伤害细胞。因此，导入这种细胞的R基因将引起红色素的表达，并且，若R基因稳定整合，则可以以视观方式记分为红色区域。当玉米品系对编码花青苷生物合成途径中的酶中间体(C2、A1、A2、Bz1和Bz2)的基因为显性、但是在R基因座内携带隐性等位基因时，转化来自具有R的株系的任何细胞将导致红色色素形成。示例性株系包括含有rg-Stadler等位基因和TR112的Wisconsin22，其中TR112是K55衍生物(r-g、b、P1)。或者，可以利用任一基因型的玉米，只要同时导入等位基因C1和R。
还提出可以在嵌合构建体中利用R基因调节区域以便提供控制嵌合基因表达的机制。已知在R基因座处比任何其它基因座处存在更多样的表型表现(Coe1988)。预计从结构性R基因的5′区域中获得的调节区域具有指导基因(例如编码昆虫抗性、干旱抗性、除草剂耐受性或其它蛋白质的区域)表达的价值。为了本发明的目的，认为可以成功利用多种R基因的任一家族成员(例如P、S、Lc等)。然而，通常最优选Sn(特别是Sn：bol3)。Sn是R基因复合体的显性成员并且与R和B基因座功能相似，因为Sn控制花青苷色素在某些幼苗和植物细胞中的组织特异性沉积，因此，Sn的表型与R相似。
预计用于本发明中的另一种可筛选标记是由lux基因编码的萤火虫萤光素酶。lux基因在转化细胞内的存在可以使用例如X线胶片、闪烁计数、荧光分光光度法、微光摄影法、光子计数照相(photoncountingcameras)或多孔发光测量法(multiwellluminometry)进行检测。还预计可以开发此系统用于群体性生物发光筛选，如在组织培养皿上，或甚至用于筛选完整植物。在需要使用可筛选标记基因如lux或GFP时，益处可以通过产生可筛选标记基因与可选择标记基因之间的基因融合物(例如GFP-NPTII基因融合物)而实现。这可能允许例如选择转化的细胞，随后筛选转基因的植物或种子。
2.3.3.1.5.双功能标记
在本发明的一个优选的实施方案中，靶序列是双功能标记。术语“双功能标记”包含这样的标记，该标记在一个序列中组合了待用作负选择标记或反选择标记的可能。实现哪种效果的选择取决于筛选过程中采用的底物。双功能标记最优选地是D-氨基酸氧化酶。这种酶能够转化D-氨基酸。某些D-氨基酸对植物有毒并通过D-氨基酸氧化酶的作用脱毒。其它D-氨基酸对植物无害，但是通过D-氨基酸氧化酶转化成有毒化合物。
术语D-氨基酸氧化酶(缩写DAAO、DAMOX或DAO)指这样的酶，该酶通过(优选地)利用氧(O2)作为底物，将D-氨基酸转化成2-氧代酸并产生过氧化氢(H2O2)作为伴生产物(DixonM和KleppeK.Biochim.Biophys.Acta96(1965)357-367；DixonM和KleppeKBiochim.Biophys.Acta96(1965)368-382；DixonM和KleppeBiochim.Biophys.Acta96(1965)383-389；MasseyV等，Biochim.Biophys.Acta48(1961)1-9.MeisterA和WellnerD，黄素蛋白氨基酸氧化酶(Flavoproteinaminoacidoxidase).在：Boyer，P.D.，Lardy，H.和K.(编者)1963)
DAAO可以由国际生物化学与生子生物学联合学会命名委员会(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(IUBMB))描述，具有EC(酶委员会)编号EC1.4.3.3。通常，EC1.4.3.3类的DAAO酶是催化中性和碱性D-氨基酸氧化成其相应酮酸的FAD黄素酶。DAAO已经在真菌和脊椎动物中表征并测序，其中已知它们位于过氧化物酶体中。术语D-氨基酸氧化酶还包含D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(DASOX)(NegriA等，1992)，其中D-天冬氨酸氧化酶是与DAAO结构相似的酶，催化相同反应，但仅对二羧D-氨基酸有活性。在本发明中优选EC1.4.3.3类的DAAO。
在DAAO中，已经证实一个保守的组氨酸(MiyanoM等，1991)对于酶催化活性是重要的。在本发明的优选实施方案中，DAAO指包含以下共有基序的蛋白质：
[LIVM]-[LIVM]-H＊-[NHA]-Y-G-x-[GSA]-[GSA]-x-G-x5-G-x-A
其中括号内给出的氨基酸残基代表相应位置的备选残基，x代表任一氨基酸残基并且指示数字表示相应的连续氨基酸残基数。各氨基酸残基的缩写具有它们以上定义的标准IUPAC含义。表3中描述包含所述基序的其它潜在的DAAO酶。
表3.来自多种生物的合适D-氨基酸氧化酶。登录号指来自SwisProt数据库的蛋白质序列。
| 登录号 | 基因名称 | 描述 | 来源生物 | 长度 |
| Q19564 | F18E3.7 | 推定的D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO) | 秀丽隐杆线虫 | 334 |
| P24552 | D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO) | 腐皮镰刀茵(豌豆亚种))(Fusariumsolani)(subsp.pisi)(血红丛赤壳(Nectriahaematococca) | 361 | |
| P14920 | DAO，DAMOX | D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO) | 智人(Homosapiens)(人) | 347 |
| P18894 | DAO，DAO1 | D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO) | 小家鼠(Musmusculus)(小鼠) | 346 |
| P00371 | DAO | D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO) | 家猪(Sus scrofa)(猪) | 347 |
| P22942 | DAO | D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO) | 穴兔(Oryctolaguscuniculus)(兔) | 347 |
| O35078 | DAO | D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO) | 褐家鼠(Rattusnorvegicus)(大鼠) | 346 |
| P80324 | DAO1 | D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO) | 红冬孢酵母(酵母)(纤细红酵母) | 368 |
| U60066 | DAO | D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO) | 红冬孢酵母，菌株TCC26217 | 368 |
| Q99042 | DAO1 | D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO) | 三角酵母(Trigonopsisvariabilis)(酵母) | 356 |
| P31228 | DDO | D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(DASOX)(DDO) | 黄牛(Bos taurus)(牛) | 341 |
| Q99489 | DDO | D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(DASOX)(DDO) | 智人(人) | 341 |
| Q9C1L2 | NCU06558.1 | (AF309689)推定的D-氨基酸氧化酶G6G8.6(假设的蛋白质) | 粗糙脉孢霉(Neurospora crassa) | 362 |
| Q7SFW4 | NCU03131.1 | 假设的蛋白质 | 粗糙脉孢霉 | 390 |
| Q8N552 | 与D-天冬氨酸氧化酶相似 | 智人(人) | 369 | |
| Q7Z312 | DKFZP686F04272 | 假设的蛋白质DKFZp686F04272 | 智人(人) | 330 |
| Q9VM80 | CG11236 | CG11236蛋白质(GH12548p) | 黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇) | 341 |
| O01739 | F20H11.5 | F20H11.5蛋白质 | 秀丽隐杆线虫 | 383 |
| O45307 | C47A10.5 | C47A10.5蛋白质 | 秀丽隐杆线虫 | 343 |
| Q8SZN5 | CG12338 | RE73481p | 黑腹果蝇(果蝇) | 335 |
| Q9V5P1 | CG12338 | CG12338蛋白质(RE49860p) | 黑腹果蝇(果蝇) | 335 |
| Q86JV2 | 与黄牛(牛)D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(DASOX)(DDO)相似 | 盘基网柄菌(粘菌) | 599 | |
| Q95XG9 | Y69A2AR.5 | 假设的蛋白质 | 秀丽隐杆线虫 | 322 |
| Q7Q7G4 | AGCG53627 | AgCP5709(片段) | 冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)PEST株 | 344 |
| Q7PWY8 | AGCG53442 | AgCP12432(片段) | 冈比亚按蚊PEST株 | 355 |
| Q7PWX4 | AGCG45272 | AgCP12797(片段) | 冈比亚按蚊PEST株 | 373 |
| Q8PG95 | XAC3721 | D-氨基酸氧化酶 | 地毯草黄单胞柑桔致病变种(Xanthomonasaxonopodis(pv.citri)) | 404 |
| Q8P4M9 | XCC3678 | D-氨基酸氧化酶 | 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris (pv.campestris)) | 405 |
| Q9X7P6 | SCO6740，SC5F2A.23C | 推定的D-氨基酸氧化酶 | 天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor) | 320 |
| Q82MI8 | DAO，SAV1672 | 推定的D-氨基酸氧化酶 | 阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis) | 317 |
| Q8VCW7 | DAO1 | D-氨基酸氧化酶 | 小家鼠(小鼠) | 345 |
| Q9Z302 | D-氨基酸氧化酶 | 黑线仓鼠(Cricetulusgriseus)(中华仓鼠) | 346 | |
| Q9Z1M5 | D-氨基酸氧化酶 | 豚鼠(Caviaporcellus)(豚鼠) | 347 | |
| Q922Z0 | 与相似D-天冬氨酸氧化酶 | 小家鼠(小鼠) | 341 | |
| Q8R2R2 | 假设的蛋白质 | 小家鼠(小鼠) | 341 | |
| P31228 | D-天冬氨酸氧化酶 | 黄牛 | 341 |
D-氨基酸氧化酶(EC编号1.4.3.3)可以分离自多种生物，包括但不限于猪、人、大鼠、酵母、细菌或真菌。举例生物是热带假丝酵母(Candidatropicalis)、三角酵母、粗糙脉孢霉、小球藻(Chlorellavulgaris)和纤细红酵母。合适的D-氨基酸代谢多肽可以是真核生物的酶，例如来自酵母(例如纤细红酵母)、真菌或动物，或可以是原核生物的酶、例如来自细菌如大肠杆菌。代谢D-氨基酸的合适多肽的实例示于表4.
表4.来自多种生物的合适D-氨基酸氧化酶。登录号指来自SwisProt数据库的蛋白质序列。
| GenBank登录号 | 来源生物 |
| Q19564 | 秀丽隐杆线虫F18E3.7. |
| P24552 | 腐皮镰刀茵(豌豆亚种)(血红丛赤壳). |
| JX0152 | 腐皮镰刀茵 |
| P14920 | 智人(人) |
| P18894 | 小家鼠(小鼠) |
| P00371 | 家猪(猪) |
| P22942 | 穴兔(兔) |
| O35078 | 褐家鼠(大鼠) |
| P80324 | 红冬孢酵母(酵母)(纤细红酵母) |
| Q99042 | 三角酵母 |
| Q9Y7N4 | 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)SPCC1450 |
| O01739 | 秀丽隐杆线虫.F20H11.5 |
| Q28382 | 家猪(猪) |
| O33145 | 麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae) |
| Q9X7P6 | 天蓝色链霉菌.SCSF2A.23C |
| Q9JXF8 | 脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)(血清组B) |
| Q9Z302 | 黑线仓鼠(中华仓鼠) |
| Q921M5 | D-氨基酸氧化酶。豚鼠(Cavia parcellus) |
D-氨基酸氧化酶优选地从由选自下表5的核酸序列编码的酶或相应的氨基酸序列中选择：
表5：来自多种生物的合适D-氨基酸氧化酶。登录号指来自GenBank数据库的蛋白质序列。
| GenBank登录号 | 生物 |
| U60066 | 红冬孢酵母(酵母) |
| Z71657 | 纤细红酵母 |
| A56901 | 纤细红酵母 |
| AF003339 | 红冬孢酵母 |
| AF003340 | 红冬孢酵母 |
| U53139 | 秀丽隐杆线虫 |
| D00809 | 血红丛赤壳 |
| Z50019. | 三角酵母 |
| NC_003421 | 粟酒裂殖酵母(裂殖酵母) |
| AL939129. | 天蓝色链霉菌A3(2) |
| AB042032 | 波氏假丝酵母(Candida boidinii) |
DAAO是充分表征的酶，并且它的晶体结构及催化机制已经通过高分辨率X射线光谱分析加以确定(UmhauS.等，2000)。它是位于过氧化物酶体中的黄素酶，并且它在动物内已认识的功能是使D-氨基酸脱毒(PiloneMS2000)。此外，它能够使酵母利用D-氨基酸生长(YurimotoH等，2000)。如以上所示，来自数个不同物种的DAAO已经得以表征并在底物亲和性上显示略微不同(GablerM等，2000)，但是它们通常表现宽的底物特异性，使全部D-氨基酸氧化脱氨(除对EC1.4.3.3.类DAAO酶的D-谷氨酸和D-天冬氨酸以外；PiloneMS2000)。
在众多的真核生物中发现了DAAO活性(PiloneMS2000)，但是在植物中没有报道过DAAO活性。植物中代谢D-氨基酸的低能力对植物应答D-氨基酸的方式有重要影响。
在一个优选的实施方案中，从本发明的DNA构建体中表达的D-氨基酸氧化酶优选地对选自D-丙氨酸、D-丝氨酸、D-异亮氨酸、D-缬氨酸和其衍生物的至少一个氨基酸具有酶活性。
合适的D-氨基酸氧化酶还包括以上例所举多肽的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因。合适的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因是保留以上定义的D-氨基酸氧化酶的功能性特征的那些合适的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因。可以如此对序列改变以产生突变体、变体或衍生物，即通过在核酸中一次或多次地添加、插入、缺失或替换一个或多个核苷酸，导致所编码的多肽中添加、插入、缺失或替换一个或多个氨基酸。当然，还包括改变核酸而不改变所编码的氨基酸序列。
本发明的D-氨基酸氧化酶可以表达在植物细胞的细胞浆、过氧化物酶体或其它细胞区室内。D-氨基酸代谢多肽的区室化可以通过将编码DAAO多肽的核酸序列与编码转运肽的序列融合以生成融合蛋白而实现。没有这种转运肽的基因表达产物通常累积在细胞浆内。表达的DAAO在过氧化物酶体的定位产生可由H2O2降解酶即过氧化氢酶代谢的H2O2。可能需要较高水平的D-氨基酸以产生破坏性水平的H2O2。DAAO在过氧化氢酶活性水平较低的细胞浆内的表达降低了产生破坏性水平的H2O2所需要的D-氨基酸量。细胞浆内DAAO的表达可以通过从编码性核酸序列中去除过氧化物酶体靶向信号或转运肽而实现。例如，来自纤细红酵母(红冬孢酵母)的dao1基因(EC：1.4.3.3：GenBank登录号：U60066)如所述(WO03/060133)得到克隆。最后9个核苷酸编码指导蛋白质进入亚细胞器过氧化物酶体中的信号肽SKL。虽然在细胞浆表达的DAAO和过氧化物酶体表达的DAAO之间未观察到显著差异，然而就抑制DAAO转基因植物萌发的方面，发现在30mMD-Asn上，过氧化物酶体构建物比细胞浆形式构建物略微有效。然而，两种构建体均比野生型更显著地抑制并且因此可以用于条件性反选择。
双功能标记的其它修饰和用途在欧洲专利申请号04006358.8(SweTreeTechnologiesAB&BASF；IMPROVEDCONSTRUCTSFORMARKEREXCISIONBASEDONDUAL-FUNCTIONSELECTIONMARKER)及其它要求其优先权的国家申请和国际申请中公开。
2.3.4.标记基因和其他序列的表达
标记基因(或可以从本发明DNA构建体之一中表达的其它序列)可以由在植物中有功能的任一启动子表达。这些启动子包括但不限于组成型的、诱导型、时间性调节、发育调节、空间调节的、化学调节的、胁迫应答性、组织特异性、病毒性和合成性启动子。启动子可以是γ-玉米醇溶蛋白启动子、油质蛋白ole16启动子、球蛋白启动子、肌动蛋白I启动子、肌动蛋白cl启动子、蔗糖合成酶启动子、INOPS启动子、EXM5启动子、球蛋白2启动子、β-32，ADPG-焦磷酸化酶启动子、LtpI启动子、Ltp2启动子、油质蛋白ole17启动子、油质蛋白ole18启动子、肌动蛋白2启动子、花粉特异性蛋白质启动子、花粉特异性果胶酸裂合酶启动子、花药特异性蛋白质启动子、花药特异性基因RTS2启动子、花粉特异性基因启动子、绒毡层特异性基因启动子，绒毡层特异性基因RAB24启动子、邻氨基苯甲酸合酶α亚基启动子、α-玉米醇溶蛋白启动子、邻氨基苯甲酸合酶β亚基启动子、二氢吡啶二羧酸合酶启动子、Thil启动子、醇脱氢酶启动子、cab结合蛋白启动子、H3C4启动子、RUBISCOSS淀粉分支酶启动子、ACC酶启动子、肌动蛋白3启动子、肌动蛋白7启动子、调节性蛋白质GF14-12启动子、核糖体蛋白L9启动子、纤维素生物合成酶启动子、S-腺苷基-L-高半胱氨酸水解酶启动子、超氧化物歧化酶启动子、C-激酶受体启动子、磷酸甘油酸变位酶启动子、根特异性RCc3mRNA启动子、葡萄糖-6磷酸异构酶启动子、焦磷酸-果糖6-磷酸基磷酸转移酶启动子、遍在蛋白启动子、β-酮酰基-ACP合酶启动子、33kDa光合系统11启动子、放氧蛋白启动子、69kDa液泡ATP酶亚基启动子、金属硫蛋白样蛋白质启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、ABA诱导型样和成熟诱导型样蛋白启动子、苯丙氨酸脱氨酶启动子、腺苷三磷酸酶-腺苷基-L-高半胱氨酸水解酶启动子、α-微管蛋白启动子、cab启动子、PEPC酶启动子、R基因启动子、凝集素启动子、集光复合体启动子、热休克蛋白启动子、查尔酮合酶启动子、玉米醇溶蛋白启动子、球蛋白-1启动子、ABA启动子、植物生长素结合蛋白启动子、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因启动子、NTI启动子、肌动蛋白启动子、不透明2启动子、b70启动子、油质蛋白启动子、CaMV35S启动子、CaMV34S启动子、CaMV19S启动子、组蛋白启动子、膨压诱导型启动子、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子、Ti质粒甘露氨酸合酶启动子、Ti质粒胭脂碱合酶启动子、矮牵牛(petunia)查尔酮异构酶启动子、豆类甘氨酸丰富的蛋白质I启动子、CaMV35S转录物启动子、马铃薯patatin启动子或S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。
3.转基因表达的测定法
为证实在再生的植物中存在外源DNA，可以开展多种分析法。此类分析法包括例如分子生物学分析法如Southern印迹和RNA印迹和PCR；生物化学分析法如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过酶功能；植物部分的测定如叶或根测定；以及在某些情况下对完整的再生植物的表型分析。用于确定转基因表达和启动子功能的效率的其它分析法还包括，但不限于荧光原位杂交(FISH)、直接DNA测序、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析、单链构象分析(SSCA)、RNA酶保护分析、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、点印迹分析、变性梯度凝胶电泳、RT-PCR、定量RT-PCR、RFLP和PCR-SSCP。分析对于本领域技术人员是已知的(也见下文)。
4.本发明的转化(转基因)植物和制备方法
单子叶植物物种可以用本发明的DNA构建体通过本领域中已知的多种方法转化。可以转化能够随后克隆性增殖(无论通过器官发生或胚发生)的任一植物组织。术语“器官发生”如本文中所用意指从分生中心依次地发育枝条和根的过程；术语“胚发生”如本文中所用意指枝条和根(从体细胞或配子中)以协调的方式(不是依次)一同发育的过程。所选的特定组织取决于对所转化特定物种可用的并且是最适合的克隆增殖系统而不同。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、现有分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和ultilane分生组织)。
本发明的植物可以采取多种形式。植物可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；植物可以是克隆的转化体(例如所转化的全部细胞均含有表达盒)；植物可以包含转化及未转化组织的移植物(例如移植到柑桔(citus)物种中的未转化接穗上的已转化砧木)。转化的植物可以通过多种方法增殖，如通过克隆性增殖或传统育种技术。例如，第一世代(或T1)的转化植物可以自交以产生纯合的第二世代(或T2)转化植物并且T2植物通过传统育种技术进一步增殖。显性选择标记(如nptII)可以与表达盒组合以辅助育种。
因此，本发明以植物中(inplanta)或植物外(explanta)方式提供包含已转化的质体或其它器官(例如细胞核、线粒体或叶绿体)的转化(转基因)单子叶植物和单子叶植物细胞。本发明可以用来转化任一单子叶植物物种，包括但是不限于来自以上在“定义”部分中已详述植物物种的细胞。优选地，本发明的转基因植物是作物植物并且尤其是谷类(例如，玉米、苜蓿、稻、大麦、高粱、小麦、黍等)并且甚至更优选地是玉米、小麦和稻。本发明的其它实施方案涉及所述单子叶植物的细胞、细胞培养物、组织、部分(如植物器官、叶、根等)和繁殖材料(如种子)。
单子叶植物的转化可以用单种DNA分子或多种DNA分子(即共转化)开展并且这两种技术适用于本发明的表达盒。众多转化载体可用于植物转化并且本发明的表达盒可以与任一此类载体共同使用。载体的选择将取决于优选的转化技术和转化的目标物种。
本领域中技术人员可获得并知道用于将构建体导入植物细胞宿主的多种技术。这些技术通常包括利用根癌农杆菌或发根农杆菌(A.rhizogeneas)作为转化介质的DNA转化法、脂质体法、PEG沉淀法、电穿孔法、DNA注射法、直接DNA摄取法、微抛射体轰击法、粒子加速法等(见例如，EP295959和EP138341)。然而，除植物细胞以外的细胞也可以用本发明的表达盒转化。对植物表达载体和报道基因以及农杆菌和农杆菌介导性基因转移的一般描述可以在Gruber等(1993)中找到。
含有基因组片段或合成片段的表达载体可以导入原生质体或导入完整组织或分离的细胞。表达载体优选地导入完整组织。培养植物组织的一般方法例如由Maki等，(1993)以及由Phillips等(1988)提供。优选地，使用直接基因转移方法如微抛射体介导性递送法、DNA注射法、电穿孔法等，将表达载体导入玉米或其它植物组织。更优选地，使用微抛射体介导递送法，用生物射弹装置将表达载体导入植物组织。见，例如Tomes等(1995)。本发明的载体不仅可以用来表达结构基因，而且还可以用于外显子捕获(exon-trap)克隆、或启动子捕获(promotertrap)方法以检测多种组织中的差异性基因表达(Lindsey1993；Auch和Reth1990)。
特别优选使用农杆菌某些种的Ti和Ri质粒的双元型载体。Ti衍生的载体转化类型广泛的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物，如大豆、棉花、油菜、烟草和稻(Pacciotti1985：Byrne1987；Sukhapinda1987；Lorz1985；Potrykus，1985；Park1985：Hiei1994)。使用T-DNA转化植物细胞已经受到广泛研究并得到大量描述(EP120516；Hoekema，1985；Knauf，1983；和An1985)。为导入植物，可将本发明的嵌合基因插入如实施例中描述的双元载体。
本领域技术人员可获得其它转化方法，如外源DNA构建体直接摄取法(见EP295959)，电穿孔技术(Fromm1986)或使用以核酸构建体包被的金属粒子的高速生物射弹轰击法(Kline1987和US4,945,050)。一旦转化，细胞可以由本领域技术人员进行再生。
本领域中技术人员知道转化方法的选择将取决于预定转化的单子叶植物的类型。适合用于转化植物细胞的方法包括，但不限于微注射法(Crossway1986)、电穿孔法(Riggs1986)、农杆菌介导的转化法、直接基因转移法(Paszkowski1984)和其中使用可从Agracetus，Inc.，Madison，Wis.和BioRad，Hercules，Calif.获得的装置的生物射弹粒子加速法(见例如，US4,945,050；和McCabe1988)。还见Datta1990；(稻)；Klein1988(玉米)；Klein1988(玉米)；Klein1988(玉米)；Fromm1990(玉米)；和Gordon-Kamm1990(玉米)；Koziel1993(玉米)；Shimamoto1989(稻)；Christou1991(稻)；欧洲专利申请EP0332581(羊茅草(orchardgrass)和其它羊茅亚科(Pooideae))；Vasil1993(小麦)；Weeks1993(小麦)，Li1993和Christou1995(稻)；Osjoda1996(玉米，借助根癌农杆菌)，稻(Hiei1994)和谷物(Gordon-Kamm1990；Fromm1990)，其中全部文献在本文中引用作为参考。
在产生转化植物的方法中使用含有包含本发明表达盒的载体的根癌农杆菌细胞，其中所述的载体包含Ti质粒。植物细胞用如上所述的根癌农杆菌感染以产生转化的植物细胞并随后使植物从转化的植物细胞再生。已知用于实施本发明的众多农杆菌载体系统。可以采用多种农杆菌菌株，优选卸甲的根癌农杆菌菌株或发根农杆菌菌株。在优选的实施方案中，用于实施本发明的农杆菌菌株包括章鱼碱菌株(例如LBA4404)或农杆碱菌株(例如EHA101或EHA105)。适合用于DNA转移的根癌农杆菌菌株例如是EHA101[pEHA101](Hood1986)、EHA105[pEHA105](Li1992)、LBA4404[pAL4404](Hoekema1983)、C58C1[pMP90](Koncz&Schell1986)和C58C1[pGV2260](Deblaere1985)。其它合适的菌株是根癌农杆菌胭脂碱菌株C58。其它合适的菌株是根癌农杆菌C58C1(VanLarebeke1974)、A136(Watson1975)或LBA4011(Klapwijk1980)。在另一个优选的实施方案中，土源细菌是发根农杆菌菌株K599(NCPPB2659)的卸甲变体。优选地，这些菌株包含了提供T-DNA转移至植物细胞内的所需功能(例如vir基因)的Ti质粒或Ri质粒的卸甲质粒变体。在优选的实施方案中，用来转化与植物酚类化合物预培养的植物组织的农杆菌菌株含有L，L-琥珀碱型(succinamopinetype)Ti-质粒，优选地卸甲的L，L-琥珀碱型Ti-质粒，如pEHA101。在另一个优选的实施方案中，用来转化与植物酚类化合物预培养的植物组织的农杆菌菌株含有章鱼碱型Ti-质粒，优选地卸甲的章鱼碱型Ti-质粒，如pAL4404。当使用章鱼碱型Ti-质粒或辅助质粒时，优选使virF基因缺失或失活(Jarschow1991)。
本发明方法还可以与特定的农杆菌菌株组合使用以进一步增加转化效率，如其中vir基因的表达和/或其引入因存在突变性或嵌合的virA或virG基因而受到改变的农杆菌菌株(例如Hansen1994；Chen和Winans1991；Scheeren-Groot，1994)。优选根癌农杆菌菌株LBA4404(Hiei1994)与超强毒性质粒的进一步组合。这些质粒优选地是基于pTOK246的载体(Ishida1996)。
双元载体或其它任何载体可以通过常规DNA重组技术得以修饰，在大肠杆菌中增殖并通过例如电穿孔或其它转化技术(Mozo和Hooykaas1991)导入农杆菌。
农杆菌以类似Ishida(1996)所述的方式进行培养和使用。包含载体的农杆菌菌株例如可以在补充适宜抗生素(例如50mg/L壮观霉素)的YP培养基(5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/LNaCl、15g/L琼脂、pH6.8)上培育3日。细菌用接种环从固体培养基上收集并重悬。在本发明的优选实施方案中，以使用在-80℃冷冻的等分试样开始培养农杆菌。
农杆菌对靶组织(例如不成熟的胚)的转化可以通过仅将靶组织与农杆菌接触而实施。可能需要变动用于感染和共培养的农杆菌浓度。例如，制备农杆菌的细胞混悬液，其中所述的细胞混悬液具有大约105-1011、优选106至1010、更优选约108个细胞或cfu/ml的群体浓度并且将靶组织浸泡在这种混悬液内约3至10分钟。得到靶组织随后在固体培养基上与农杆菌一起培养数日。
优选地，以106至1010cfu/mL的浓度使用细菌。在对共培养步骤的优选实施方案中，在共培养介质中将约1至10μl的土源细菌(例如农杆菌)混悬液直接施加至每种靶组织外植体并进行空气干燥。这节省劳动力和时间并减少由于过量使用农杆菌所致的非故意的农杆菌介导的损伤。
对于农杆菌处理，将细菌重悬于植物兼容的共培养介质中。用可减少因植物防御应答(如酚氧化作用)所致的组织坏死的抗氧化剂(例如硝酸银)、酚吸收性化合物(如聚乙烯吡咯烷酮，Perl1996)或巯基化合物(例如二硫苏糖醇、L-半胱氨酸，Olhoft2001)对共培养介质补充还可以改善农杆菌介导的转化的效率。在另一个优选的实施方案中，共培养介质包含至少一种巯基化合物，该巯基化合物优选地选自硫代硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)和半胱氨酸。浓度优选地是在约1mM和10mM之间的L-半胱氨酸、0.1mM至5mMDTT和/或0.1mM至5mM硫代硫酸钠。优选地，在共培养期间使用的培养基包含约1μM至约10μM的硝酸银和约50mg/L至约1,000mg/L的L-半胱氨酸。这导致明显降低靶组织对农杆菌介导的损伤(如诱导的坏死)的脆弱性并明显改善整体转化效率。
多种载体系统可以与农杆菌组合使用。优选双元载体系统。常见双元载体基于“广宿主范围”质粒，如衍生自P-型质粒RK2的质粒如pRK252(Bevan1984)或pTJS75(Watson1985)。这些载体大部分是pBIN19(Bevan1984)的衍生物。多种双元载体是已知的，其中某些可商业地获得，例如pBI101.2或pBIN19(ClontechLaboratories，Inc.USA)。其它载体在大小和操作性方面得到改良(例如pPZP；Hajdukiewicz1994)。改良的载体系统还在WO02/00900中描述。
使用直接基因转移或农杆菌介导的转移形式的方法通常但不必需与选择标记一起实施，其中所述的选择标记可以提供对抗生素(例如卡那霉素、潮霉素或甲氨蝶呤)或除草剂(例如膦丝菌素)的抗性。然而，选择用于植物转化的选择标记对本发明不重要。
对于某些植物物种，可以优选不同的抗生素选择标记或除草剂选择标记。转化中常规使用的选择标记包括赋予卡那霉素抗性和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，1982；Bevan1983)、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White1990，Spencer1990)、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochlinger和Diggelmann)和赋予甲氨蝶呤抗性的dhfr基因(Bourouis1983)。
5.产生和表征稳定转化的植物。
随后将转基因植物细胞放置在适宜的选择性培养基中以选择转基因细胞，其中所述的转基因细胞随后培育成愈伤组织。从愈伤组织中培育出枝条。通过在生根培养基中培育从枝条生成小植物。多种构建体通常连接有在植物细胞中用于选择的选择标记。便利地，标记可以抵抗杀生物物质(特别是抗生素(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素、氯霉素)、除草剂等)。与缺乏已导入DNA的细胞比较时，所用的特定标记将允许选择转化的细胞。包括本发明转录盒的DNA构建体的成分可以从对宿主是天然(内源性)或外来(外源)的序列中制备。“外来的”意指在导入构建体的野生型宿主中找不到该序列。异源构建体将含有对衍生转录启动区的基因是非天然的至少一个区域。
为证实转基因细胞和转基因植物存在外源DNA，可以开展多种分析法。如此分析法例如包括本领域技术人员众所周知的“分子生物学”分析法，如Southern印迹和RNA印迹，原位杂交和基于核酸的扩增方法如PCR或RT-PCR或TaqMan；“生物化学”分析法，如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过酶功能；植物部分测定如种子测定；并且还包括分析完整的再生植物的表型，例如对疾病抗性或害虫抗性分析。
可以从细胞系或任一植物部分中分离DNA以便通过使用本领域技术人员众所周知的技术确定存在预选择的核酸节段。应当指出完整序列并非总是存在，其可能原因是所述序列在细胞内的重排或缺失。
可以通过聚合酶链式反应(PCR)确定由本发明方法所导入的核酸元件的存在。使用这些技术，扩增并通过凝胶电泳检测核酸的预期片段。这种类型的分析允许确定预选择的核酸节段是否存在于稳定的转化体，但是没有证明导入的预选择核酸节段整合至宿主细胞基因组中。此外，不可能使用PCR技术来确定转化体是否使外源基因导入基因组中的不同位点处，即转化体是否有独立的来源。考虑了使用PCR技术，将有可能克隆毗邻已导入的预选择DNA节段的宿主基因组DNA片段。
DNA整合至宿主基因组中和转化体独立身份的直接证据可以使用Southern杂交技术确定。使用该技术，可以鉴定导入宿主基因组并分布在宿主DNA序列侧翼的特定DNA序列。因此，给定转化体的Southern杂交模式充当该转化体的鉴定性特征。此外，有可能通过Southern杂交来证实已导入的预选择DNA节段存在于高分子量DNA中，即证实导入的预选择DNA节段已经整合至宿主细胞基因组中。Southern杂交技术提供了使用PCR所获得的信息，例如预选择DNA节段的存在，而且还证实基因组整合并表征每个单独的转化体。
认为使用作为Southern杂交技术的改良技术：点杂交或狭线印迹杂交技术可以获得从PCR中推导出的相同信息，例如预选择DNA节段的存在。
PCR和Southern杂交技术均可以用来证实预选择DNA节段传递至子代。在大多数情况下，对给定转化体的特征性Southern杂交模式将在子代中分离为说明基因稳定遗传的一个或多个孟德尔基因(Spencer1992)；Laursen1994)。通过生殖系传递和相同的DNA印迹分析杂交模式及转化性DNA在愈伤组织、R0植物和对所转化基因分离的R1子代中的密集度而显示愈伤组织和亲代转化体(R0)的非嵌合本质。
尽管DNA分析技术可以利用分离自植物任一部分的DNA进行，RNA可能仅表达于特定细胞或组织型并且因此需要从这些组织中制备用于分析的RNA。PCR技术还可以用于检测和定量从预选择的DNA节段中产生的RNA。在PCR的这种应用中，首先需要使用酶如逆转录酶，将RNA逆转录成DNA并随后利用常规PCR技术扩增DNA。在大多数情况下，尽管PCR技术有用，但它没有证实RNA产物的完整性。关于RNA产物本质的其它信息可以通过RNA印迹获得。该技术将证实RNA种类的存在并产生关于该RNA完整性的信息。RNA种类的存在或不存在还可以点印迹或狭线印迹Northern杂交确定。这些技术是RNA印迹法的修改并仅证实RNA种类的存在或不存在。
尽管DNA印迹分析和PCR可以用来检测预选择的所讨论DNA节段，然而它们不提供例如是否表达预选择的DNA节段的信息。表达可以通过特异性地鉴定预选择DNA节段的蛋白质产物或评估因这些蛋白质产物表达所致的表型改变进行评价。
用于特定蛋白质的产生和鉴定的分析法可以利用蛋白质的物理化学、结构、功能或其它特性。独特的物理化学特征或结构特性允许通过电泳方法(如天然凝胶或变性凝胶电泳或等电聚焦法)或色谱技术(如离子交换或凝胶排阻色谱)分离并鉴定蛋白质。各种蛋白质的独特结构提供在测定(如ELISA测定)中利用特定抗体来检测蛋白质存在的可能。可以采用具有甚至更强特异性的方法的组合，如在其中使用抗体来确定已通过电泳技术分离的各个基因产物的蛋白质印迹法。可以采用其它技术来绝对地证实目的产物身份，如通过纯化后的氨基酸测序评估。虽然这些方法属于最常见使用的方法，然而也可以使用其它方法。
测定方法还可以用来通过蛋白质功能、尤其酶催化包含特定底物和产物的特定化学反应的能力而鉴定蛋白质的表达。这些反应可以通过在反应中提供底物并由物理方法或化学方法测定底物的丧失或产物的生成而进行。实例随着待分析的酶而不同。
基因产物的表达最经常地通过评估基因产物表达的表型结果而确定。这些分析法还可以采取众多形式，包括但不限于分析植物的化学组成、形态学或生理特性的改变。形态学改变可以包括更大的株型或更厚实的茎。最经常的是在精心控制的条件定义的生物测定法中评估对所施加处理应答的植物或植物部分的改变。可以培育两个或多个世代以确信稳定维持和遗传所需要的表型特征在目的条件下的组织优先地表达。
6.转基因植物的用途
一旦将本发明的表达盒转化至特定的植物种中，则使用传统育种技术，可以在所述物种中增殖该表达盒或使之移动到相同物种的其它品种中，尤其包括商业品种。本发明特别优选的植物包括上文所列的农学重要的作物。工程化至以上所述的转基因种子或转基因植物中的遗传特性通过有性繁殖进行传递并且因此可以在子代植物中得到维持和增殖。本发明还涉及从转基因植物中获得的转基因植物细胞、组织、器官、种子或植物部分。本发明还包括植物的转基因后代以及从该后代中获得的转基因植物细胞、组织、器官、种子和植物部分。
优选地，转基因植物中的表达盒以有性方式传递。在一个优选的实施方案中，编码序列通过R0植物的完整正常有性周期以有性方式传递至R1世代。还优选表达盒在转基因植物细胞、组织、种子或植物中以这样的量表达，其中所述的量与差异仅在于缺少所述表达盒的植物细胞、组织、种子或植物中的量不同。因此，预期本文中产生的转基因植物用于多种商业目的和研究目的。可以产生转基因植物用在传统农业中，以便种植者获得益处(例如农学性状如水匮乏抗性、害虫抗性或提高的产量)，消费者从该植物中所收获的谷粒中获得益处(例如人食品或动物饲料内改善的营养含量；维生素、氨基酸和抗氧化剂含量增加，产生抗体(被动免疫)和营养品)或食品加工者获得益处(例如改善的加工性状)。在此类用途中，通常为在人食物或动物饲料中使用植物的谷粒而培育植物。此外，转基因植物中根特异性启动子的使用可以提供局限于(动物和人)可消费的植物根(如胡萝卜、欧防风(parsnips)和甜菜)中的有益性状。然而，植物的其它部分，包括茎、壳、营养部分等还可以具有用途，包括用作动物青贮饲料的部分或化妆品目的。通常提取玉米和其它作物的化学成分(例如油或淀粉)用于食品或工业用途，并且可以产生具有增强或改良的此类成分的转基因植物。
转基因植物还可以用于商业地制造蛋白质或其它分子，其中从植物部分或种子等中提取或纯化目的分子。还可以培养、体外生长或发酵来自该植物的细胞或组织以制造此类分子。转基因植物还可以在商业育种计划内使用或可以与相关的作物植物物种杂交或育种。由表达盒编码的改良可以例如从玉米细胞转移至其它物种的细胞，例如通过原生质体融合。
所述转基因植物可以在研究或育种中具有众多用途，包括通过插入性诱变而产生新的突变植物，以鉴定可能随后通过传统突变和选择法产生的有益突变体。实例是导入编码可用来生成遗传变异的转座元件的重组DNA序列。本发明方法还可以用来产生具有可用于鉴定专有品系或品种的独特“标签序列”或其它标记序列的植物。
因此，本发明的转基因植物和转基因种子可以用于旨在开发如此植物的植物育种中使用，其中所述植物具有由表达盒所赋予的改良特性，如对干旱、疾病或其它胁迫的耐受性。多种育种步骤由充分定义的人类干预加以表征，如选择待杂交的系、亲代系的定向授粉或选择适宜的后代植物。根据需要的特性，采用不同的育种措施。相关技术在本领域中是众所周知的并且包括但不限于杂交、近交、回交、并行育种(multilanebreeding)、品种混杂、种间杂交、非整倍体的技术等。杂交技术还包括通过机械方法、化学方法或生物化学方法致植物不育，以产生雄性不育或雌性不育植物。用不同品系的花粉对雄性不育植物交叉授粉确保雄性不育植物的基因组而非雌性能育植物的基因组均匀地获得两个亲代系的特性。因此，本发明的转基因种子和转基因植物可以用于对改良植物品系进行育种，例如因所述植物改良的遗传特性而增加常规方法如除草剂处理或杀虫剂处理的效率或允许替代所述方法。或者，可以获得具有改善的胁迫耐受性的新作物，所述的新作物因其优化的遗传“装置”而产生这样的收获产物，其质量比不能够耐受相当的不利发育条件的产物更好。
因此在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本申请的核酸分子用于优先地或特异性地在胚组织或胚细胞中表达目的基因的用途。
另外，在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的核酸分子用于增加胁迫条件下的植物中核酸分子转录的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生植物的方法，所述植物具有提高的产量和/或提高的胁迫耐受性和/或提高的营养品质和/或植物的种子或籽苗的提高或改善的油含量，其中所述方法包括步骤
A)向所述植物导入本发明的核酸分子、本发明的表达盒或本发明的表达载体，其中所述的核酸分子有效连接至至少一个核酸分子，所述的至少一个核酸分具有相对于所述第一或第二核酸序列是异源的序列并且能够向该植物赋予提高的产量和/或提高的胁迫耐受性、提高的营养品质和/或提高或改善的油含量；和
B)选择转基因植物，其中与野生型或无效分离子植物相比较，所述植物具有提高的产量和/或在胁迫条件下提高的胁迫耐受性，和/或提高的该植物种子或籽苗营养品质和/或提高或改善的油含量。
序列
_____________________________________________________________
编码拟南芥Cor78基因的转录调节性核苷酸序
SEQIDNO：1列的核酸序列
SEQIDNO：2pBPSMM368双元载体的核酸序列
SEQIDNO：3编码Os.BPSI.1内含子的核酸序列
SEQIDNO：4编码Zm.遍在蛋白内含子的核酸序列
SEQIDNO：5Cor78启动子正向引物
5’-gcaagaatctcaaacacggagatctca-3’
SEQIDNO：6Cor78启动子反向引物
5’-atttgtgagtaaaacagaggagggtctca-3’
SEQIDNO：7BPSI.1-5’引物
5’-cccgggcaccctgcggagggtaagatccgatcacc-3’
SEQIDNO：8BPSI.1-3’引物
5’-cggaccggtacatcttgcatctgcatgtac-3’
位于At.cor78第4-18位置的CCAF/CCA1.01基
SEQIDNO：9序
gccgcaagaatctca
SEQIDNO：9-138如表9中描述
SEQIDNO：139-144如图4a-4c和图5中描述
实施例
材料和通用方法
除非另外说明，实施例中的化学品和试剂从SigmaChemicalCompany(St.Louis，MO)获得，限制性核酸内切酶获自NewEnglandBiolabs(Beverly，MA)或Roche(Indianapolis，IN)，寡核苷酸由MWGBiotechInc.(HighPoint，NC)合成并且其它关于生物化学分析或分子生物学分析的修饰酶试剂盒来自Clontech(PaloAlto，CA)、PharmaciaBiotech(Piscataway，NJ)、PromegaCorporation(Madison，WI)或Stratagene(LaJolla，CA)。用于细胞培养基的材料从Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)或DIFCO(Detroit，MI)获得。如Sambrook(1989)所述实施用于本发明目的的克隆步骤，例如，限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、纯化DNA片段、转移核酸至纤维素和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、培养细菌、增殖噬菌体和重组DNA的序列分析。按照Sanger方法(Sanger1977)使用ABI激光荧光DNA序列仪来开展重组DNA分子测序。
为了产生转基因植物。将根癌农杆菌(菌株C58C1[pMP90])以多种启动子::GUS载体构建体(参见下文)转化。所得农杆菌菌株随后用来获得转基因植物。为此目的，将分离的经转化农杆菌菌落在28℃于4mL培养基(培养基：含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的YEB培养基)中孵育过夜。400ml相同的培养基用这种培养物接种并孵育过夜(28℃，220转/分钟)。细菌通过离心法沉淀(GSA转头，8000U/分钟，20分钟)并将沉淀物重悬在浸润培养基(1/2MS培养基；0.5g/LMES，pH5.8；50g/L蔗糖)中。将混悬液置于植物箱(Duchefa)内，并且添加100mLSILVETL-77(OsiSpecial-tiesInc.，目录号P030196)至终浓度0.02％。具有8-12株植物的植物箱置于干燥器内真空下10-15分钟，随后自然通风(扩散)。此过程重复2-3次。此后，将全部植物转移至含湿润土壤的花钵中并在长日照条件下培育(16小时日照；昼间温度22-24℃，夜间温度19℃；65％相对湿度)。6周后收获种子。
实施例1.载体构建
产生了含有BPSI.1内含子的拟南芥属植物cor78启动子构建体(pBPSMM368；图1)或不含有BPSI.1内含子的拟南芥属植物cor78启动子构建体(pBPSMM250)(表6)。出于比较目的，将BPSI.1内含子替换为玉米遍在蛋白内含子(pBPSMM346)。赋予内含子介导的增强作用(IME)的内含子如BPSI.1和Zm.遍在蛋白内含子亚克隆至表达盒的5’非翻译区(UTR)。
表6.GUS嵌合构建体
| 双元载体 | 表达盒的组成(启动子::内含子::报道基因::终止子) |
| pBPSMM250 | At.cor78启动子::GUS::NOS3’ |
| pBPSMM346 | At.cor78启动子::Zm.遍在蛋白内含子::GUS::NOS 3’ |
| pBPSMM368 | At.cor78启动子::BPSI.1内含子::GUS::NOS3’ |
实施例2.单子叶植物转化
也可以实施使用标准的转化和再生技术进行农杆菌介导的植物转化法，以转化作物植物(Gelvin1995；Glick1993)
玉米或其他单子叶植物的转化可以使用例如在US5,591,616中描述的技术实施。
使用粒子轰击法、聚乙二醇介导的DNA摄入法或通过碳酸硅纤维技术转化植物例如由Freeling和Walbot1993描述。
实施例3.报道基因表达的检测
为鉴定带来组织特异性的启动子的特征和该启动子的必需元件，需要将启动子自身及其多种片段置于允许测定表达活性的所谓报道基因的前面。可提到的实例是细菌的β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson1987a)。β-葡糖醛酸糖苷酶活性在植物中借助生色底物如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸于活性染色法(Jefferson1987b)中进行检测。为研究组织特异性，植物组织如(例如1991b)所述进行切割、包埋、染色和分析。
第二种分析法允许定量确定所研究组织中的GUS活性。为定量的活性确定，使用MUG(4-甲基伞形基-β-D-葡糖苷酸)作为β-葡糖醛酸糖苷酶的底物并且MUG被切割成MU(甲基伞形酮)和葡糖醛酸。
为做到这点，首先制备目的组织的蛋白质提取物并随后添加底物GUS至该提取物。底物可以仅在GUS已经得到反应后用荧光测定法测量。在多个时间点处收集随后于荧光计中得到测量的样品。该测定法可以用例如处于各种发育阶段(开花后21日，24日或30日)的亚麻籽胚实施。为此目的，在任何情况下，将一个胚在2mL反应容器在液氮中借助振动研磨机(型号：RetschMM2000)研磨成粉末。在添加100μL的EGL缓冲液(0.1MKPO4、pH7.8；1mMEDTA；5％甘油；1MDTT)后，将混合物在25℃和14,000xg离心10分钟。移走并再次离心上清液。再次将上清液转移至新的反应容器并在冰上保存直至进一步使用。25μL的这种蛋白质提取物用65μL的EGL缓冲液(无DTT)处理和用于GUS测定法中。现在添加10μL底物MUG(10mM4-甲基伞形基-β-D-葡糖苷酸)，涡旋混合该混合物并且立即取出30μL作为零值并用470μL终止缓冲液(0.2MNa2CO3)处理。该方法以30秒间隔重复用于全部样品。采集的样品贮藏在冰箱内直至进行测量。在1小时和在2小时后获得其它读数。对荧光测量法建立含有0.1mM至10mMMU(4-甲基伞形酮)浓度的校正系列。如果样品值在这些浓度之外，使用较少的蛋白质提取物(来自1∶10稀释的10μL、1μL、1μL)并且测量更短的间隔期(0小时、30分钟、1小时)。在FluoroscanII装置(Lab系统)中在365nm激发和445nm发射处实施测量。作为备选，底物切割可以如Bustos(1989)中所述以荧光测量方式在碱性条件下监测(在365nm激发，测量在455nm的发射；Spectro荧光计BMGPolarstar+)。全部样品通过Bradford(1976)蛋白质浓度测定方法测定蛋白质浓度，因此允许鉴定多种组织和植物中的启动子活性和启动子强度。
实施例4.玉米中的胚特异性表达
构建体pBPSMM368在胚、尤其在盾片中高度表达，而使用GUS组织化学测定法几乎检测不到在胚乳中的染色(图2)。这种强的胚特异性表达在萌发期间维持。构建体pBPSMM368在根或叶中不表达。然而，在At.cor78启动子与Zm.遍在蛋白内含子组合的构建体(pBPSMM346)中检测不到这种胚特异性表达。用pBPS346转化的转基因玉米植物显示组成型表达，不过整体上极为微弱。构建体pBPSMM250在分析的任意组织中不表达。
表7.受单子叶植物候选的组成型启动子控制的GUS表达
1作为组成型启动子的阳性对照(pBPSMM232＝Zm.遍在蛋白启动子::Zm.遍在蛋白内含子::GUS(PIV2)::NOS终止子；通过组织化学测定法测量的GUS表达水平范围(-至+++++)，ND：还未测定，2含有pBPSMM368的转基因植物在胚轴的第一节间结区中显示微弱表达，在胚轴其他区域中几乎不显示表达，所述的胚轴其他区域包括初生根、胚芽、茎、叶和胚芽鞘。3吸胀(萌发)3日(72小时)后，含有pBPSMM346的转基因植物在胚根和整个种子中显示表达，不过含有pBPSMM368的那些转基因植物显示主要限于盾片中的表达。
实施例5.干旱诱导的表达
含有pBPSMM250(不含赋予内含子介导的增强作用的内含子)的转基因玉米植物在干旱胁迫下不显示可诱导的表达(在5叶簇阶段、断水4日、8日、13日后)。为了增强转基因的表达，将Zm.遍在蛋白内含子添加至At.cor78启动子构建体的5’UTR以产生pBPSMM346构建体。含有pBPSMM346的5叶簇阶段转基因玉米植物用于干旱胁迫试验。使用定量RT-PCR在T0植物中检测到干旱诱导的表达。基于这种敏感测定法，在干旱胁迫下检测到3.5倍的诱导。当用定量PCR测定时，诱导达3.5倍(图3)。
实施例6.转基因作物的利用
pBPSMM368中的报道基因可以替换为旨在以胚特异性方式表达并赋予生物性和非生物性环境胁迫耐受性的目的基因。将嵌合构建体转化至单子叶植物。根据需要，可以使用本领域的标准转化方法。转化植物使用已知方法再生。测量了多种表型以确定改善了生物量、产量、脂肪酸组成、高油含量、疾病耐受性或与产量增强或产量稳定性关联的任一其它表型。在不同发育阶段上和在不同世代(T0至T2植物或其他世代)上测定基因表达水平。在植物中评价的结果导致确定与这种启动子组合以提高产量、改善疾病耐受性和/或改善非生物胁迫耐受性的合适基因。
实施例7.单子叶植物中选择标记基因的表达
pBPSMM368中的报道基因可以替换为一种选择标记基因并转化至单子叶植物如玉米、小麦、稻、大麦、黑麦、谷子、高粱、黑麦草或薏苡、小黑麦、甘蔗或燕麦，但不限于这些植物物种。根据需要，可以使用本领域的标准转化方法。经转化的植物在目的选择剂下选择并使用已知方法再生。在组织或组织培养细胞的发育早期阶段检验选择方案。可以在不同发育阶段上和在不同世代(T0至T2植物或其他世代)上测定基因表达水平。在植物中评价的结果导致确定与这种启动子组合的合适基因。
实施例8.缺失分析
克隆方法由Rouster(1997)和Sambrook(1989)描述。启动子的详细作图(即缩减到与启动子特异性有关的核酸节段)通过产生多种报道基因表达载体实施，其中所述的报道基因表达载体首先含有完整启动子区并且其次含有该完整启动子区的多种片段。首先，将完整启动子区或其片段克隆入含有GUS或其它报道基因的双元载体中。为此目的，首先使用这样的片段，所述片段通过使用识别全长启动子序列中的内部限制性切割位点的限制酶获得。其次，使用具有由引物导入的切割位点的PCR片段。使用本领域中的转化方法，将含有多种缺失型启动子的嵌合GUS构建体转化入玉米、拟南芥属植物和其它植物物种中。启动子活性通过使用GUS组织化学测定法或其它适宜方法分析不同发育阶段的多种组织和器官。根据需要，对所述启动子序列的修饰可以消除渗漏。
实施例9.体内诱变
技术人员熟知用于修饰启动子活性或鉴定重要启动子元件的多种方法。这些方法中的一种方法是基于随机突变，随后用如上所述的报道基因进行检测。微生物的体内诱变可以通过质粒(或另一种载体的)DNA经其中维持遗传信息完整性的能力被破坏的大肠杆菌或其它的微生物(例如芽孢杆菌某些种(Bacillusspp.)或酵母如酿酒酵母)传代而来实现。常用的突变菌株在用于DNA修复系统的基因(例如mutHLS，mutD，mutT等；参见Rupp1996)中具有突变。技术人员熟知这些菌株。这些菌株的使用例如由Greener(1994)阐述。优选地在选择和测试微生物之后将突变的DNA分子转移至植物中。如上所述产生并分析转基因植物。
实施例10.用于过量表达的载体构建和基因“敲除”实验
10.1过量表达
设计用于植物中全长目的“候选基因”表达(过量表达)的载体，以过量表达目的蛋白质，并且根据待用的植物转化方法，所述载体分为两个通用类型：生物射弹型(biolistic)和双元型。
对于生物射弹转化(生物射弹型载体)，要求如下：
1.主链，其具有细菌的选择标记(一般是抗生素抗性基因)和在大肠埃希氏菌中有功能的复制起点(大肠杆菌；例如ColE1)，和
2.植物特异性部分，其由以下部分组成：
a.由启动子(例如ZmUBIintMOD)、目的基因(一般是全长cDNA)和转录终止子(例如根癌农杆菌nos终止子)组成的基因表达盒；
b.植物选择标记盒，其由合适的启动子、选择标记基因(例如D-氨基酸氧化酶；dao1)和转录终止子(例如nos终止子)组成。
设计用于根癌农杆菌转化的载体(A.tumefaciens；双元载体)由以下部分组成：
1.主链，其具有携带在大肠杆菌和根癌农杆菌中均有功能的细菌选择标记(例如由aadA基因介导的壮观霉素抗性)和在每一前述细菌宿主中有功能的两个复制起点，以及根癌农杆菌virG基因；
2.如上文对生物射弹型载体所述的植物特异性部分，但是在这种情况下，例外的是该部分在侧翼具有根癌农杆菌右边界和左边界序列，其中所述序列介导侧翼具有这两个序列的DNA转移至植物。
10.2基因沉默载体
对应于用来下调基因表达的方法，设计用来降低或消除单个基因或基因家族或相关基因表达的载体(基因沉默载体)也分为两个通用类型：反义或双链RNA干扰(dsRNAi)。
(a)反义
对于反义载体，全长或部分基因片段(一般是cDNA的一部分)可以在对于全长表达所描述的相同载体中作为基因表达盒的部分使用。对于反义介导的基因表达下调，基因或基因片段的编码区将相对于所述启动子处于相反方向；因此，mRNA将在植物中从非编码(反义)链产生。
(b)dsRNAi
对于dsRNAi载体，在基因表达盒中使用部分基因片段(一般长300-500碱基对)，且所述片段以有义和反义两个方向表达，其中所述的部分基因片段由间隔区(一般是植物内含子，例如OsSH1内含子1或选择标记，例如赋予卡那霉素抗性的选择标记)隔开。设计这种类型的载体以形成双链mRNA茎，所述的双链mRNA茎因两个互补性基因片段在植物中碱基配对而产生。
设计用于过量表达或敲除的生物射弹载体或双元载体可以在众多方面不同，包括例如在植物和细菌中使用的选择标记、在基因表达盒和植物选择标记盒中所用的转录终止子和用于克隆目的基因或目的基因片段的方法学(一般是常用的限制性酶介导的方法或基于GatewayTM重组酶的克隆法)。
实施例11.At.Cor78启动子(SEQIDNO：1)的推定的转录因子结合位点分析
基于下文给出的Genomatix结果，潜在的TATA盒可位于SEQIDNO：1的第790-804位碱基对。
表8在如SEQIDNO：1所述的At.cor78启动子中鉴定到的启动子元件簇。
表9At.cor78(SEQIDNO：1)中鉴定的具有以下SEQIDNO的启动子基序和核心启动子基序
| 启动子基序名称 | 在At.cor78中的位置 | 序列 | 链 | SEQ ID NO： |
| AGP1/AGP1.01基序 | 18-28 | ggaGATCtcaa | (+) | 9 |
| AGP1/AGP1.01核心基序 | nnngatcnnn n | 10 | ||
| MYBL/MYBPH3.02基序1 | 55-71 | gtaagtTTGTtttgagt | (-) | 11 |
| MYBL/MYBPH3.02基序2 | 110-126 | aacattTTGTtacaaaa | (-) | 18 |
| MYBL/MYBPH3.02核心基序 | nnnnnnttgt nnnnnnn | 12 | ||
| MADS/AGL15.01基序1 | 66-86 | actTACGaaatttaggtagaa | (+) | 13 |
| MADS/AGL15.01核心基序1 | nnntacgnnn nnnnnnnnnn n | 14 | ||
| MADS/AGL15.01基序2 | 89-109 | aatTACAatataatgtatata | (-) | 15 |
| MADS/AGL15.01基序3 | 90-110 | ataTACAttatattgtaattt | (+) | 16 |
| MADS/AGL15.01核心基序2 | nnntacannn nnnnnnnnnn n | 17 | ||
| MADS/AGL15.01基序4 | 557-577 | actTACTattattagtagtcg | (-) | 89 |
| MADS/AGL15.01核心基序4 | nnntactnnn nnnnnnnnnn n | 90 | ||
| MADS/AGL15.01基序5 | 558-578 | gacTACTaataatagtaagtt | (+) | 91 |
| SEF4/SEF4.01基序 | 123-133 | tgTTTTtatta | (+) | 19 |
| SEF4/SEF4.01核心基序 | nnttttnnnn n | 20 | ||
| AHBP/HAHB4.01基序1 | 127-137 | tttattATTAt | (+) | 21 |
| AHBP/HAHB4.01核心基序 | nnnnnnatta n | 22 | ||
| AHBP/HAHB4.01基序2 | 130-140 | attattATTAt | (+) | 23 |
| AHBP/HAHB4.01基序3 | 300-310 | aagatcATTAt | (+) | 61 |
| AHBP/HAHB4.01基序4 | 563-573 | actattATTAg | (-) | 92 |
| GTBX/SBF1.01基序1 | 147-163 | ttactggTTAAattaaa | (+) | 24 |
| GTBX/SBF1.01核心基序 | nnnnnnntta annnnnn | 25 | ||
| GTBX/SBF1.01基序2 | 402-418 | cgtaaaaTTAAaattga | (-) | 75 |
| GAPB/GAP.01基序1 | 161-175 | aaaaATGAatagaaa | (+) | 26 |
| GAPB/GAP.01核心基序 | nnnnatgann nnnnn | 27 | ||
| GAPB/GAP.01基序2 | 215-229 | aaatATGAaaaaata | (-) | 40 |
| DOFF/PBOX.01基序1 | 166-182 | tgaatagaAAAGgtgaa | (+) | 28 |
| DOFF/PBOX.01核心基序1 | nnnnnnnnaa agnnnnn | 29 | ||
| DOFF/PBOX.01基序2 | 362-378 | tcctttgtAAATacaaa | (+) | 73 |
| DOFF/PBOX.01核心基序2 | nnnnnnnnaa atnnnnn | 74 | ||
| IBOX/IBOX.01基序 | 167-183 | gaataGAAAaggtgaat | (+) | 30 |
| IBOX/IBOX.01核心基序 | nnnnngaaan nnnnnnn | 31 |
| NCS1/NCS1.01基序6 | 172-182 | gAAAAggtgaa | (+) | 32 |
| NCS1/NCS1.01核心基序1 | naaaannnnn n | 33 | ||
| NCS1/NCS1.01基序1 | 246-256 | tAAAAgtttac | (+) | 51 |
| NCS1/NCS1.01基序3 | 426-436 | tAAAAgatcat | (+) | 80 |
| NCS1/NCS1.01基序4 | 649-659 | tAAAAgatata | (+) | 105 |
| NCS1/NCS1.01基序5 | 688-698 | aAAAAgatcaa | (+) | 109 |
| NCS1/NCS1.01基序2 | 200-210 | aAAATgtttac | (-) | 36 |
| NCS1/NCS1.01核心基序2 | naaatnnnnn n | 37 | ||
| OCSE/OCSL.01基序1 | 195-215 | agaagaaaatgtttACCTcct | (-) | 34 |
| OCSE/OCSL.01核心基序1 | nnnnnnnnnn nnnnacctnn n | 35 | ||
| OCSE/OCS L.01基序2 | 762-782 | agagataaagggacACGTatg | (-) | 128 |
| OCSE/OCSL.01核心基序2 | nnnnnnnnnn nnnnacgtnn n | 129 | ||
| MADS/SQUA.01基序 | 209-229 | ttcttctATTTtttcatattt | (+) | 38 |
| MADS/SQUA.01核心基序 | nnnnnnnatt tnnnnnnnnn n | 39 | ||
| MYBS/MYBST1.01基序 | 226-242 | taatttATCCtgaaaat | (-) | 41 |
| MYBS/MYBST1.01核心基序 | nnnnnnatcc nnnnnnn | 42 | ||
| IBOX/GATA.01基序1 | 229-245 | ttcagGATAaattattg | (+) | 43 |
| IBOX/GATA.01核心基序 | nnnnngatan nnnnnnn | 44 | ||
| IBOX/GATA.01基序2 | 318-334 | tagaaGATAaaagaagt | (-) | 64 |
| IBOX/GATA.01基序3 | 768-784 | agagaGATAaagggaca | (-) | 132 |
| AHBP/ATHB1.01基序 | 236-246 | taaATTAttgt | (+) | 45 |
| AHBP/ATHB1.01核心基序 | nnnattannn n | 46 | ||
| AHBP/ATHB5.01基序 | 236-246 | acaATAAttta | (-) | 47 |
| AHBP/ATHB5.01核心基序 | nnnataannn n | 48 | ||
| GTBX/GT3A.01基序1 | 239-255 | taaactTTTAcaataat | (-) | 49 |
| GTBX/GT3A.01核心基序1 | nnnnnnttta nnnnnnn | 50 | ||
| GTBX/GT3A.01基序2 | 570-586 | tagtaaGTTAcatttta | (+) | 95 |
| GTBX/GT3A.01核心基序2 | nnnnnngtta nnnnnnn | 96 | ||
| PSRE/GAAA.01基序 | 253-269 | aaatgGAAAtcttgtaa | (-) | 52 |
| PSRE/GAAA.01核心基序 | nnnnngaaan nnnnnnn | 53 | ||
| GTBX/S1F.01基序1 | 255-271 | tcaaATGGaaatcttgt | (-) | 54 |
| GTBX/S1F.01核心基序 | nnnnatggnn nnnnnnn | 55 | ||
| GTBX/S1F.01基序2 | 585-601 | taggATGGaataaatat | (+) | 99 |
| WBXF/WRKY.01基序1 | 263-279 | tccatTTGActagtgta | (+) | 56 |
| WBXF/WRKY.01核心基序 | nnnnnttgan nnnnnnn | 57 | ||
| WBXF/WRKY.01基序2 | 728-744 | tgactTTGAcgtcacac | (+) | 119 |
| MYBS/TAMYB80.01基序1 | 279-295 | gagaATATtcctcattt | (-) | 58 |
| MYBS/TAMYB80.01核心基序1 | nnnnatatnn nnnnnnn | 59 | ||
| MYBS/TAMYB80.01基序2 | 284-300 | aggaATATtctctagta | (+) | 60 |
| MYBS/TAMYB80.01基序3 | 337-353 | ttgtTTATtcctctact | (-) | 71 |
| MYBS/TAMYB80.01核心基序3 | nnnnttatnn nnnnnnn | 72 | ||
| LREM/ATCTA.01基序 | 312-322 | tcATCTacttc | (+) | 62 |
| LREM/ATCTA.01核心基序 | nnatctnnnn n | 63 | ||
| 热/HSE.01基序 | 319-333 | agaagataaaAGAAg | (-) | 65 |
| 热/HSE.01核心基序 | nnnnnnnnnn agaan | 66 | ||
| P$MADS/AGL1.01基序 | 329-349 | ttaTTCCtctactggtagaag | (-) | 67 |
| P$MADS/AGL1.01核心基序 | nnnttccnnn nnnnnnnnnn n | 68 | ||
| MADS/AGL1.01基序 | 330-350 | ttcTACCagtagaggaataaa | (+) | 69 |
| MADS/AGL1.01核心基序 | nnntaccnnn nnnnnnnnnn n | 70 | ||
| NACF/TANAC69.01基序 | 409-431 | cttttattttaTACGtaaaatta | (-) | 76 |
| NACF/TANAC69.01核心基序 | nnnnnnnnnn ntacgnnnnn nnn | 77 | ||
| HMGF/HMG_IY.01基序 | 417-431 | ctttTATTttatacg | (-) | 78 |
| HMGF/HMG_IY.01核心基序 | nnnntattnn nnnnn | 79 | ||
| AHBP/WUS.01基序 | 448-458 | ctcctTAATcg | (-) | 81 |
| AHBP/WUS.01核心基序 | nnnnntaatn n | 82 | ||
| GTBX/GT1.01基序 | 520-536 | catgtgGTCAttttacg | (-) | 83 |
| GTBX/GT1.01核心基序 | nnnnnngtca nnnnnnn | 84 | ||
| TCPF/ATTCP20.01基序 | 534-546 | attgGCCCatcat | (-) | 85 |
| TCPF/ATTCP20.01核心基序 | nnnngcccnn nnn | 86 | ||
| DREB/CRT_DRE.01基序1 | 551-565 | atggaCCGActacta | (+) | 87 |
| DREB/CRT_DRE.01核心基序 | nnnnnccgan nnnnn | 88 | ||
| DREB/CRT_DRE.01基序2 | 601-615 | tcataCCGAcatcag | (+) | 100 |
| DREB/CRT_DRE.01基序3 | 658-672 | tactaCCGAcatgag | (+) | 106 |
| DREB/CRT_DRE.01基序4 | 695-709 | tcaagCCGAcacaga | (+) | 110 |
| SPF1/SP8BF.01基序 | 564-576 | ctTACTattatta | (-) | 93 |
| SPF1/SP8BF.01核心基序 | nntactnnnn nnn | 94 | ||
| EINL/TEIL.01基序 | 574-582 | aTGTAactt | (-) | 97 |
| EINL/TEIL.01核心基序 | ntgtannnn | 98 | ||
| DOFF/PBF.01基序 | 617-633 | ttgaaagaAAAGggaaa | (+) | 101 |
| DOFF/PBF.01核心基序 | nnnnnnnnaa agnnnnn | 102 | ||
| TEFB/TEF1.01基序 | 624-646 | aaAAGGgaaaaaaagaaaaaa | (+) | 103 |
| TEFB/TEF1.01核心基序 | nnaaggnnnn nnnnnnnnnn n | 104 | ||
| DOFF/DOF3.01基序 | 671-687 | agttccaaAAAGcaaaa | (+) | 107 |
| DOFF/DOF3.01核心基序 | nnnnnnnnaa agnnnnn | 108 | ||
| CE3S/CE3.01基序 | 703-721 | tctctaCGCGtgtctgtgt | (-) | 111 |
| CE3S/CE3.01核心基序 | nnnnnncgcg nnnnnnnnn | 112 | ||
| CGCG/ATSR1.01基序1 | 708-718 | ctaCGCGtgtc | (-) | 113 |
| CGCG/ATSR1.01核心基序 | nnncgcgnnn n | 114 | ||
| CGCG/ATSR1.01基序2 | 709-719 | acaCGCGtaga | (+) | 115 |
| GBOX/TGA1.01基序1 | 727-747 | gtggtgTGACgtcaaagtcat | (-) | 116 |
| GBOX/TGA1.01核心基序 | nnnnnntgac nnnnnnnnnn n | 117 | ||
| GBOX/TGA1.01基序2 | 728-748 | tgacttTGACgtcacaccacg | (+) | 118 |
| OPAQ/RITA1.01基序 | 730-746 | actttgACGTcacacca | (+) | 120 |
| OPAQ/RITA1.01核心基序 | nnnnnnacgt nnnnnnn | 121 | ||
| 盐/ALFIN1.01基序 | 738-752 | ttttcGTGGtgtgac | (-) | 122 |
| 盐/ALFIN1.01核心基序 | nnnnngtggn nnnnn | 123 | ||
| GBOX/GBF1.01基序 | 757-777 | cgcttcatACGTgtcccttta | (+) | 124 |
| GBOX/GBF1.01核心基序 | nnnnnnnnac gtnnnnnnnn n | 125 | ||
| ABRE/ABRE.01基序 | 758-774 | gcttcatACGTgtccct | (+) | 126 |
| ABRE/ABRE.01基序 | nnnnnnnacg tnnnnnn | 127 | ||
| GAGA/GAGABP.01基序1 | 764-788 | actgagAGAGataaagggacacgta | (-) | 130 |
| GAGA/GAGABP.01核心基序1 | nnnnnnagag nnnnnnnnnn nnnnn | 131 | ||
| GAGA/GAGABP.01基序2 | 772-796 | atagagAGACtgagagagataaagg | (-) | 133 |
| GAGA/GAGABP.01核心基序2 | nnnnnnagac nnnnnnnnnn nnnnn | 138 | ||
| GAGA/GAGABP.01基序3 | 774-798 | ttatagAGAGactgagagagataaa | (-) | 134 |
| GAGA/GAGABP.01基序4 | 776-800 | gtttatAGAGagactgagagagata | (-) | 135 |
| TBPF/TATA.01基序 | 790-804 | tctcTATAaacttag | (+) | 136 |
| TBPF/TATA.01核心基序 | nnnntatann nnnnn | 137 |
实施例12.对至少一种胁迫因子的增强的抗性、种子或籽苗营养品质、产量、或选择标记切除的频率
pBPSMM368中的报道基因可以替换为
(1)非生物性胁迫抗性基因(14-3-3蛋白和磷酸肌醇特异性磷脂酶C：WO0177355和US6720477)，
(2)参与维生素E生物合成的基因(酪氨酸氨基转移酶(BT000782：WO02072848)，推定的胆色素原脱氨酶，推定的ω-3脂肪酸去饱和酶[NM185577])，
(3)生物性胁迫抗性基因(稻镰刀菌(OryzasativaFusarium)抗性蛋白质I2C-5-样[NM194161]，致病相关基因5的组成型表达因子(cpr5：NM185577))，GTP酶[WO03020939]，肌动蛋白解聚因子3[WO2004035798]，ROR2的t-SNARE相互作用因子和突触融合蛋白、SNAP34的相互作用因子[WO2004081217]，
(4)归巢核酸内切酶基因(例如编码归巢核酸内切酶I-SceI的序列)
以在萌发期间的胚中表达，因而改善例如针对非生物性环境胁迫耐受性、导致潜在产量增强作用的早期生长势、维生素E的量、针对生物的胁迫耐受性和标记切除的频率。所述嵌合构建体转化至单子叶植物。可以根据需要使用本领域中用于转化的标准方法。使用已知方法使转化的植物再生。测量多种表型以确定改善了生物量、产量、脂肪酸组成、高油、疾病耐受性或指示产量增强或产量稳定性的任何其它表型。测定在不同发育阶段和不同世代(T0至T2植物或其它世代)中的基因表达水平。植物中的评价结果导致鉴定与这种启动子组合而增加产量、改善疾病耐受性、改善非生物性胁迫耐受性和/或提高种子或籽苗营养品量的合适基因。
实施例13.表达转基因以改善单子叶植物中的饲用、食用或产量性状
当pBPSMM368转化至单子叶植物如稻、大麦、玉米、小麦或黑麦草，但不限于这些植物物种时，pBPSMM368中的报道基因可以替换为主要在胚中过量表达以改善胚营养价值的目的基因。所述目的基因可以是下调一个或多个靶基因的非编码序列(例如miRNA前体或ta-siRNA)。根据需要，可以使用本领域的标准转化方法。在目的选择剂下选择经转化的植物并使用已知方法再生。在组织或组织培养细胞的发育早期阶段检验选择方案。可以在不同发育阶段上和在不同世代(T0至T2植物或其他世代)上测定基因表达水平。在植物中评价的结果导致确定与这种启动子组合的合适基因。
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全部出版物、专利和专利申请在本文中引用作为参考。尽管在以上说明书中，本发明已经就其中某些优选的实施方案进行了描述，并且众多细节已经为说明目的而描述，对于本领域中技术人员而言显而易见的是本发明容易变成其它实施方案并且本文中所述的某些细节可以做明显变化而不脱离本发明的基本精神。
Claims (8)
1.由植物转录调节序列组成的分离的核酸分子，其中所述的转录调节序列是
i)作为干旱、寒冷应答性和/或ABA调节型基因的启动子序列的第一核酸序列，所述干旱、寒冷应答性和/或ABA调节型基因的启动子序列在下文中缩写为cor78启动子序列，
和与其有效连接的
ii)第二核酸序列，其是编码金属硫蛋白1的植物基因的第一内含子，所述金属硫蛋白1在下文中缩写为MET1，
其中所述第一核酸序列是如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列，和
其中所述第二核酸序列是如SEQIDNO：3所示的多核苷酸序列
其中由所述第一核酸分子和所述第二核酸分子组成的分离核酸分子调节有效连接的核酸序列的胚特异性表达。
2.由植物转录调节序列组成的分离的核酸分子，其中所述的转录调节序列是
i)作为干旱、寒冷应答性和/或ABA调节型基因的启动子序列的第一核酸序列，所述干旱、寒冷应答性和/或ABA调节型基因的启动子序列在下文中缩写为cor78启动子序列，
和与其有效连接的
ii)第二核酸序列，其是编码金属硫蛋白1的植物基因的第一内含子，所述金属硫蛋白1在下文中缩写为MET1，
其中所述第一核酸序列是如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列，和
其中所述第二核酸序列是如SEQIDNO：3所示的多核苷酸序列
以及iii)位于cor78启动子序列和所述内含子的第一核苷酸之间的0-100bp的接头序列，
用于调节有效连接的核酸序列的胚特异性表达。
3.由植物转录调节序列组成的分离的核酸分子，其中所述的转录调节序列是
i)作为干旱、寒冷应答性和/或ABA调节型基因的启动子序列的第一核酸序列，所述干旱、寒冷应答性和/或ABA调节型基因的启动子序列在下文中缩写为cor78启动子序列，
和与其有效连接的
ii)第二核酸序列，其是编码金属硫蛋白1的植物基因的第一内含子，所述金属硫蛋白1在下文中缩写为MET1，
其中所述第一核酸序列是如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列，和
其中所述第二核酸序列是如SEQIDNO：3所示的多核苷酸序列，
以及iii)位于cor78启动子序列和所述内含子的第一核苷酸之间的0-100bp的5’UTR，
用于调节有效连接的核酸序列的胚特异性表达。
4.权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述的第一内含子从源自单子叶植物的MET1的编码基因衍生。
5.权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述的cor78启动子衍生自双子叶植物。
6.表达盒，其包含
i)权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，
ii)和与其有效连接的一个或多个核酸分子。
7.表达载体，其包含权利要求1至5中任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的表达盒。
8.权利要求1至5中任一项所述的核酸分子的用途，用于在胚组织或细胞中特异性地表达目的基因。
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