KR20010012147A - 내인성 트레할라제 수준 억제에 의한트레할로스-6-포스페이트의 수준 변경에 의한 대사의 조절 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포의 대사 중의 탄소 흐름을 조절하는 분야에 관한 것이다. 사카라이드 트레할로스-6-포스페이트 (T-6-P)의 세포내 가용성 변화의 유도에 의해 체내 세포, 조직 및 기관의 발생 및(또는) 조성이 변경될 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 변화는 트레할로스를 2개의 글루코스 잔기로 가수분해시킬 수 있는 내인성 효소 트레할라제를 억제함으로써 유도될 수 있다.

Description

내인성 트레할라제 수준 억제에 의한 트레할로스-6-포스페이트의 수준 변경에 의한 대사의 조절{Regulating Metabolism by Modifying the Level of Trehalose-6-Phosphate by Inhibiting Endogenous Trehalase Levels}
당분해는 문헌에 생화학적 과정이 상세하게 기재되어 있는 제1 대사 과정 중의 하나이다. 유기체에서의 탄수화물의 일반적인 경로는 공지되어 있고 당분해 경로(들)의 모든 효소가 규명되었지만, 당분해 자극에 의한 대사의 유도를 결정하는 시그날은 밝혀지지 않았다. 특히, 효모의 경우를 기초로 한 몇가지 가설이 제시되었지만, 어느 것도 완전히 입증되지 않았다.
탄수화물 분배의 방향에 대한 영향은 당분해 및 탄수화물 저장의 세포 과정에 직접적인 영향을 미칠 뿐만 아니라, 세포 분열, 생물량 생성 및 저장 화합물의 축적과 같은 2차적 또는 파생된 과정에도 영향을 끼쳐 이에 의해 성장 및 생산성을 측정할 수 있다.
특히, 식물에서 조직의 특성은 종종 탄수화물의 존재에 의해 직접적으로 영향받고, 탄수화물 분배의 조정은 실질적인 차이를 발생시킬 수 있다.
식물의 성장, 발생 및 생산은 식물이 광합성 동안 이산화탄소 고정으로부터 유도할 수 있는 에너지에 의해 좌우된다. 광합성은 1차적으로 잎에서 발생하고 줄기에서는 작은 수준으로 발생하지만, 다른 식물 기관, 예를 들어 뿌리, 종자 또는 괴경은 본질적으로 광동화 과정에 기여하지 않는다. 이들 조직은 그 성장 및 영양 공급을 위해 광합성 활성 기관에 전적으로 의존한다. 이것은 광합성에 의해 생성된 생산물 ("광합성 생산물"로 통칭함)이 식물의 광합성 불활성 부분으로 유입됨을 의미한다.
광합성 활성 부분은 "공급원"으로 명명되고, 광합성 생산물의 순수한 제공처로서 정의된다. 광합성 불활성 부분은 "수용부"로서 명명되고, 광합성 생산물의 순수한 수용원으로서 정의된다.
식물에서의 광합성 효율 뿐만 아니라 탄수화물 분배도 필수적인 것으로 생각된다. 유엽 (幼葉)과 같은 새로 발생중인 조직 또는 뿌리 및 종자와 같은 다른 부분은 공급원에서의 광합성에 전적으로 의존한다. 탄수화물 분배에 영향을 미칠 가능성은 식물의 표현형, 예를 들어 높이, 마디 사이 거리, 잎의 크기 및 형태 및 근계의 크기 및 구조에 대해 큰 영향을 줄 것이다.
또한, 광동화 생산물의 분포는 식물 생물량 및 생산물의 생산량에 매우 중요하다. 그 일례는 지난 세기에 걸친 밀의 개발이다. 그의 광합성 용량은 크게 변화되지 않았지만 밀 입자의 생산량은 상당히 증가되었다. 즉, 수확 지수 (수확가능 생물량/총 생물량의 비율)이 증가되었다. 근원적인 이유는 수용부 대 공급원 비율이 통상의 교배에 의해 변화되어 수확가능 수용부, 즉 종자 부분이 증가하였기 때문이다. 그러나, 동화 생산물의 분포를 조절하여 수용부 및 공급원의 형성을 조절하는 메카니즘은 아직 알려지지 않았다. 메카니즘은 탄수화물 대사 경로 및 그의 조절 부위 어딘가에 존재할 것으로 생각된다. 최근의 연구에서, 헥소키나제가 대사산물 시그날링 및 대사 경로의 조절에서 중요한 기능을 수행할 수 있다는 것이 명백해졌다. 헥소키나제 활성의 조절을 위한 많은 메카니즘이 가정되었다 [Graham et al., (1994), The Plant Cell 6: 761; Jang ＆ Sheen (1994), The Plant Cell 6, 1665; Rose et al. Eur. J. Biochem. 199, 511-518, 1991; Blazquez et al. (1993), FEBS 329, 51; Koch, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. (1996) 47, 509; Jang et al. (1997), The Plant Cell 9, 5]. 효모에 대해서 가설을 제시한 헥소키나제 조절 이론 중의 하나는 트레할로스 및 그의 관련 단당류를 언급하고 있다 (Thevelein ＆ Hohmann (1995), TIBS 20, 3). 그러나, 트레할로스 합성이 특정 종에 제한되는 것으로 생각되기 때문에 상기 이론이 일반적인 메카니즘인 것으로 보기는 어렵다. 국제 특허 출원 공개 제 WO 97/42326호는 둘 모두 트레할로스 합성 경로에 존재하는 트레할로스 포스페이트 신타제와 트레할로스 포스페이트 포스파타제를 사용하여 식물을 형질전환시킬 경우 대사적 변화를 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 수준이 중요하다는 것을 상기 출원은 보여주고 있다.
트레할로스-6-포스페이트에 영향을 미침으로써 체내 세포, 조직 및 기관의 발생 및(또는) 조성의 변경을 지시할 수 있는 다른 메카니즘에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 체내 세포, 조직 또는 기관의 발생 및(또는) 조성을 변경시키는 방법에 관한 것이다. 이들의 일부는 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 세포 내의 당분해 경로로의 탄소의 유입을 억제하는 방법, 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 광합성을 자극하는 방법, 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 수용부 관련 활성을 자극하는 방법, 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 세포 또는 조직의 성장을 억제하는 방법, 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 냉 감미화 (cold sweetening)를 억제하는 방법, 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 수확 후의 사탕무의 인버타제를 억제하는 방법, 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 추대 (bolting)를 유도하는 방법 및 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 식물의 생산량을 증가시키는 방법이다. 내인성 트레할라제 수준의 억제 효과는 세포내 트레할로스-6-포스페이트 수준의 증가에 의해 발생하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명은 또한 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 가용성을 증가시키는 방법을 제공한다.
내인성 트레할라제 수준의 억제는 트레할라제 억제제의 존재 하에 상기 세포, 조직, 기관 또는 식물의 배양 또는 성장의 결과이다. 상기 억제제는 상기 세포, 조직, 기관 또는 식물에 의해 흡수되기 적합한 형태의 발리다마이신 A일 수 있으며, 상기 발리다마이신 A의 농도는 바람직하게는 수용액 중의 100 nM 내지 10 mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1 mM이다. 또다른 방법은 내인성 트레할라제 수준의 억제제로서 상기 세포, 조직, 기관 또는 식물에 의해 흡수되기에 적합한 형태의 바퀴벌레 (페리플라네타 아메리카나 (Periplaneta americana))의 86 kD 단백질을 사용하는 것이다.
또한, 본 발명은 트레할라제 억제제의 유전 정보를 세포, 조직, 기관 또는 식물에 제공하는 것이다. 이것은 미국 바퀴벌레 (페리플라네타 아메리카나)의 86 kD 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환시킴으로써 수행될 수 있다. 별법으로, 내인성 트레할라제를 코딩하는 유전자에 의해 생산된 RNA에 적어도 부분적으로 상보성인 RNA를 발현할 수 있는 DNA 서열을 사용한 형질전환 또는 내인성 트레할라제를 코딩하는 DNA 서열과 동일한 효소 트레할라제를 코딩하는 DNA 서열을 사용한 형질전환을 이용할 수 있다.
구체적으로, 내인성 트레할라제를 코딩하는 DNA 서열은 서열 4의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 서열 6의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 서열 8의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열 10의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 보다 구체적으로는, 내인성 트레할라제를 코딩하는 DNA 서열은 서열 3의 뉴클레오티드 서열, 서열 5의 뉴클레오티드 서열, 서열 7의 뉴클레오티드 서열 및 서열 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
정의
헥소키나제 활성은 헥소스의 헥소스-6-포스페이트로의 반응을 촉매화하는 세포에서 발견되는 효소 활성이다. 헥소스는 글루코스, 프럭토스, 갈락토스 또는 다른 6탄당을 포함한다. 상기 생화학적 반응에서 일부의 역할을 수행할 수 있는 많은 이소엔자임이 존재한다는 사실이 인정되고 있다. 상기 반응을 촉매화함으로써 헥소키나제는 헥소스 (글루코스) 시그날링에서 중요한 효소를 형성한다.
헥소스 시그날링은 세포가 헥소스 (글루코스)의 가용성을 감지하도록 하는 조절 메카니즘이다.
당분해는 글루코스를 피루베이트로 전환시키면서 ATP를 생산하는 반응 과정이다.
자원 물질의 저장은 1차 생산물인 글루코스가 세포 또는 특정 조직에서 저장에 적합한 분자 형태로 대사되는 과정이다. 이들 형태는 다이버(diver)일 수 있다. 식물계에서 저장은 대부분 탄수화물 및 다당류, 예를 들어 전분, 프럭탄 및 셀룰로스 또는 프럭토스, 수크로스 및 말토스와 같은 보다 간단한 일당류 및 이당류의 형태로, 아라킨산 또는 올레인산 오일과 같은 오일의 형태로 및 크루시페린, 나핀 및 평지씨 내의 종자 저장 단백질과 같은 단백질의 형태로 발생한다. 동물 세포에서도 글리코겐과 같은 중합체 탄수화물이 형성되지만, 다량의 에너지 풍부 탄소 화합물은 지방 및 지질로 전이된다.
생물량은 생물학적 물질의 총 질량이다.
도 1은 35S 꽃양배추 모자이크 바이러스 프로모터 (P35S) 및 터미네이터 (T35S)가 좌우에 위치한 선택 마커로서의 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 유전자 (NPTII), 완두 플라스토시아닌 프로모터 (pPCpea) 및 노팔린 신타제 터미네이터 (Tnos)를 포함하는 발현 카세트, 우측 (RB) 및 좌측 (LB) T-DNA 경계 서열 및 세균 카나마이신 내성 (KanR) 마커 유전자를 포함하는 플라스미드 pVDH275의 개략도이다.
도 2는 pMOG1027 (35S as-트레할라제) 유전자도입(transgenic) 감자의 괴경에서의 트레할로스 축적을 나타낸 그래프이다.
도 3은 22개의 독립적인 야생형 에스. 튜베로숨 (S. tuberosum) 클론의 괴경 생산량을 도시한 그래프이다.
도 4는 야생형 감자와 비교하여 pMOG1027 (35S as-트레할라제) 및 pMOG1027 (845-11/22/28) (35S as-트레할라제 pat TPS) 유전자도입 감자의 괴경 생산량을 도시한 그래프이다.
도 5는 야생형 감자와 비교하여 pMOG1027 (35S as-트레할라제) 및 pMOG1027 (845-11/22/28) (35S as-트레할라제 pat TPS) 유전자도입 감자의 전분 함량을 도시한 그래프이다. 모든 식물체의 순서는 도 4와 동일하다.
도 6은 야생형 감자와 비교하여 pMOG1028 (pat as-트레할라제) 및 pMOG1028 (845-11/22/28) (pat as-트레할라제 pat TPS) 유전자도입 감자의 생산량을 도시한 그래프이다.
도 7은 도 6에 도시한 야생형 감자와 비교하여 pMOG1092 (PC as-트레할라제) 유전자도입 감자의 생산량을 도시한 그래프이다.
도 8은 도 6에 도시한 야생형 감자와 비교하여 pMOG1130 (PC as-트레할라제 PC TPS) 유전자도입 감자의 생산량을 도시한 그래프이다.
본 발명자들은 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의해 트레할로스를 생성시키는 합성 경로의 변화를 유도함으로써 체내 세포, 조직 및 기관의 발생 및(또는) 조성을 변경시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 내인성 트레할라제 수준의 억제는 내인성 트레할라제 mRNA에 안티센스인 mRNA를 생산하는 DNA 구조체로 세포를 형질전환시킴으로써 달성하는 것이 바람직하다. 트레할라제의 억제는 당분해 경로로의 탄소 유입의 억제, 광합성의 자극, 수용부 관련 활성의 자극 및 자원 물질의 저장 증가를 야기한다.
또한, 본 발명은 식물의 공급원-수용부 관계 및 자원 물질 분배를 변경하는 능력을 제공한다. 공급원 조직에서의 동화물 생산 및 공급원 조직에서의 이용을 포함하여 식물의 전체 탄소 경제는 변경될 수 있고, 이것은 수확된 생산물의 생물량 수율을 증가시킬 수 있다. 상기 방법을 사용하여 생산량 증가 및 수확 지수 및 생산 품질의 개선을 실현할 수 있다. 공급원 조직에서의 상기 변화는 예를 들어 광합성 생산물의 유출 증가에 의해 수용부 조직의 변화를 유도할 수 있다. 반대로, 수용부 조직의 변화는 공급원 조직의 변화를 유도할 수 있다.
유기체의 세포 기관, 조직 또는 다른 부분에서의 특이적 발현은 상기한 일반적인 효과를 특정 국소 부분에 적용할 수 있도록 만든다. 이러한 특이적 발현은 특이 프로모터의 조절 하에 트레할라제에 대한 안티센스 유전자를 위치시킴으로써 달성될 수 있다.
특이 프로모터를 이용함으로써, 일시적인 차이를 만들 수도 있다. 이를 위해 식물 부분의 기관 발생의 특정 기간 동안 특이적으로 활성인 프로모터를 사용할 수 있다. 이 방법에서, 발생될 기관의 일정량에 대해 먼저 영향을 준 후 이들 기관을 전분, 오일 또는 단백질과 같은 저장 물질로 충전시킬 수도 있다.
별법으로, 본 발명의 유전자의 발현을 선택적으로 개시 또는 중지시킬 수 있는 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 유도는 예를 들어 병원체, 스트레스, 화학물질 또는 명/암 자극에 의해 달성할 수 있다.
본 발명은 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 체내 대사를 변경시킬 수 있다는 사실에 대한 발견에 관한 것이다.
상기 변경은 헥소키나제의 시그날링 기능에 영향을 주는 T-6-P 수준의 변화에 의해 확립될 수 있다. 글루코스-6-포스페이트에서 반응하는 헥소키나제를 통한 유입의 증가 (즉, 글루코스 양의 증가)는 식물에서 광합성 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 헥소키나제를 통한 유입의 증가는 당분해 및 세포 분열 활성을 자극할 것이다.
탄소 대사의 트레할로스-6-포스페이트 조절의 이론
정상 식물 세포에서 탄수화물의 형성은 CO2가 고정되고 인산화된 헥소스로 환원되어 최종 생성물로서 수크로스를 갖는 광합성 과정에서 일어난다. 통상적으로, 이 수크로스는 세포 밖에서 수크로스의 흡수를 통하여 대사를 위한 구성 물질로서 탄수화물을 이용할 수 있거나 또는 예를 들어 전분과 같은 탄수화물을 저장할 수 있는 세포 또는 조직으로 이송된다. 이러한 면에서, 식물에서 광합성하여 탄수화물을 생산할 수 있는 세포는 공급원으로서 명명되는 반면, 탄수화물을 소비하거나 또는 저장하는 세포는 수용부로서 불리운다.
동물 및 대부분의 미생물 세포에서는 광합성이 일어나지 않으며 탄수화물은 사카라이드로부터의 직접적인 흡수에 의해 (예를 들면, 효모 및 다른 미생물) 또는 탄수화물의 분해에 의해 (동물) 외부 공급원으로부터 얻어져야 한다. 이들 유기체에서 탄수화물 이송은 일반적으로 세포막에 걸쳐 활발히 이송되는 글루코스의 형태로 일어난다.
세포로의 유입 후에, 대사 경로의 제1 단계 중의 하나는 효소 헥소키나제에 의해 촉매화되는 글루코스의 글루코스-6-포스페이트로의 인산화이다. 식물에서 헥소키나제 (HXK)에 의해 인산화되는 당은 광합성에 관련된 유전자의 발현을 조절하고 있음이 입증되었다 (Jang ＆ Sheen (1994), The Plant Cell 6, 1665). 그러므로, HXK는 이중 기능을 가질 수 있으며 유전자 발현의 탄수화물 매개된 조절의 중요한 센서 및 시그날 전달자로서 작용할 수 있다고 제안되었다. 이 조절은 통상적으로 출발 생성물, 즉 글루코스의 가용성에 관해 세포를 시그날링하는 것으로 생각된다. 유사한 효과는 T-6-P의 수준에 영향을 미치는 TPS 또는 TPP의 도입에 의해 관찰된다. 또한, 시험관내에서, T-6-P 수준은 헥소키나제 활성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. T-6-P의 수준을 증가시킴으로써, 그 세포는 탄수화물 투입이 부족하다는 시그날을 인식한다. 반대로, T-6-P의 수준의 감소는 글루코스가 풍부하여 광합성이 하향 조절되는 시그날을 나타내며, 그것은 당분해 및 결과로서 세포 성장 및 세포 분열과 같은 과정을 위한 에너지 공급에 대한 기질이 충분히 이용가능하다는 것을 시그날링한다. 이 시그날링은 헥소키나제를 통한 유입의 증가에 의해 개시되는 것으로 생각된다 (J.J. Van Oosten, public lecture at RijksUniversiteit Utrecht dated April 19, 1996).
식물에서의 헥소키나제 시그날링이 트레할로스-6-포스페이트의 수준의 변화를 통해 조절될 수 있다는 이론은 모든 식물이 시그날 분자 트레할로스-6-포스페이트를 생성하고 분해할 수 있는 효소계의 존재를 필요로 한다는 것을 암시할 것이다. 트레할로스가 통상적으로 각종 진균류, 세균류, 효모 및 조류 (藻類) 및 일부 무척추동물에서 발견되긴 하지만, 매우 제한된 범위의 유관속 식물 만이 이러한 당을 합성할 수 있는 것으로 제안되었다 (Elbein (1974), Adv. Carboh. Chem. Biochem. 30, 227). 지금까지 이해되지 않았던 현상은 트레할로스 합성 효소의 명백한 결핍에도 불구하고 모든 식물이 트레할로스를 2개의 글루코스 분자로 분해할 수 있는 효소인 트레할라제를 함유하는 것으로 보이는 것이다.
트레할로스의 대사 경로의 존재에 대한 간접적인 증거는 발리다마이신 A와 같은 트레할라제 억제제를 이용한 본 명세서에 제시된 실험 또는 안티센스 트레할라제에 의한 형질전환에 의해 얻어진다. 이 데이타는 현재의 생각과는 대조적으로, 대부분의 식물이 그들이 T-6-P를 합성할 수 있게 하는 트레할로스-포스페이트-신타제를 코딩하는 유전자를 함유한다는 것을 나타낸다. TPS 발현 식물에서의 트레할로스의 축적에 의해 입증되는 바와 같이, 식물은 또한 T-6-P를 트레할로스로 탈인산화할 수 있는 비특이적 또는 특이적인 포스파타제를 함유한다. 모든 식물에서의 트레할라제의 존재는 트레할로스의 전환을 실시하기 위한 것일 수 있다.
효모에서, 글루코스 유도된 시그날링의 주요 역할은 대사를 신생/호흡 방식에서 발효 방식으로 전환시키는 것이다. 몇가지 시그날링 경로는 이 현상에 포함된다 (Thevelein and Hohmann, (1995) TIBS 20, 3). 헥소키나제 시그날링의 가능한 역할 이외에, RAS-시클릭-AMP (cAMP) 경로는 글루코스에 의해 활성화되는 것으로 밝혀졌다. 글루코스에 의한 RAS-cAMP 경로의 활성화는 글루코스 인산화를 필요로 하지만, 더이상의 글루코스 대사는 필요로 하지 않는다. 지금까지는, 이 경로가 트레할라제 및 6-포스포프럭토-2-키나제를 활성화 (그에 의해 당분해를 자극)하는 것으로 밝혀진 반면, 프럭토스-1,6-비스포스파타제는 cAMP-의존성 단백질 인산화에 의해 억제 (그에 의해 글루코스 신생합성 억제)된다. 이 시그날 형질도입 경로 및 그것이 일으킬 수 있는 대사 효과는 트레할로스-6-포스페이트의 수준에 의해 영향받는 것으로 밝혀진 헥소키나제 시그날링 경로와 병행하여 작용하는 것으로서 예상될 수 있다.
식물에서, 효소 TPP의 발현 (또는 효소 TPS의 억제)을 통한 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 농도의 감소에 의한 풍부한 시그날의 생성은 당분해 경로로의 탄소의 유입을 증가시키고 광합성을 억제하기 위해 모든 세포계를 시그날링할 것이다. 이것은 국제 특허 출원 공개 제WO 97/42326호에 상세하게 기재되어 있으며, 예를 들어 실험 2에는 효소 TPP가 발현되어 잎 크기가 증가되고, 분지가 증가되고 엽록소의 양이 감소된 유전자도입 담배 식물이 기재되어 있다. 그러나, 글루코스가 충분히 공급되지 않는 상태에서 "풍부한" 시그날이 발생되기 때문에, 세포내의 탄수화물의 푸울은 쉽게 고갈된다.
따라서, 인위적인 "풍부한" 시그날이 지속된다고 가정할 때, 탄수화물의 감소는 결국 성장 및 세포 분열에 대해 제한하게 될 것이다. 즉, 그 세포는 그들의 모든 저장 탄수화물을 다 써버리고 "결핍 (hunger)" 단계가 될 것이다. 따라서, 잎은 소량의 저장된 탄수화물로 형성된다. 한편, T-6-P의 세포내 양을 증가시키는 TPS를 코딩하는 유전자로 구조체를 발현시키는 식물은 잎 크기의 감소, 더 진한 녹색의 잎, 엽록소 양의 증가를 나타내었다.
본 발명에 기재된 바와 같이, 진녹색 잎과 같은 as-트레할라제가 나타내는 유사한 현상을 발현하는 유전자도입 식물은 TPS 유전자를 발현할 때 관찰되는 바와 같이 생산량을 증가시켰다. 내인성 트레할라제 수준의 억제는 트레할로스의 분해를 중단시킬 것이며 트레할로스 농도의 증가의 결과로서 효소 TPP가 억제될 수 있고, 결과적으로 T-6-P 수준이 증가된다. 이것은 트레할라제의 억제가 TPS의 과발현과 유사한 효과를 갖는 이유를 설명할 것이다. 또한 이중 구조체 내의 as-트레할라제의 발현은 TPS의 발현에 의해 발생되는 효과를 증강시키는 것 같다. 트레할라제 활성은 예를 들어 식물, 해충, 동물, 진균 및 세균에 존재하는 것으로 밝혀졌지만, 트레할로스는 제한된 수의 종에서만 축적된다.
트레할라제가 거의 모든 식물 종에 존재하긴 하지만, 식물 내의 이 효소의 역할은 지금까지 알려지지 않았다. 그것은 식물 병원체 상호작용 및(또는) 식물 방어 반응에 관련된 것으로 제안되었다. 본 발명자는 감자 트레할라제 유전자를 분리하여 감자 잎 및 괴경 조직의 트레할라제 활성의 억제가 괴경 생산율의 증가를 유도함을 밝혀냈다. TPS 발현을 겸하는 토마토에서의 as-트레할라제의 과일 특이적 발현은 과일 발육을 크게 변화시킨다.
트레할라제의 억제는 기본적으로 2가지 방법으로, 즉 외생적으로 트레할라제 억제제를 투여하여, 또한 내생적으로 트레할라제 억제제를 생산하여, 예를 들면 트레할라제 억제제를 코딩하는 DNA 서열을 이용하여 식물을 형질전환시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 제1 실시태양에 따라서, 트레할라제 억제제는 식물계에 외생적으로 투여된다. 본 발명에 따라서 그러한 방법에 사용될 수 있는 트레할라제 억제제의 예로는 미크로모노스포라속 균주 SANK 62390에서 생성되는 트레하졸린 (Ando et al., 1991, J. Antibiot. 44, 1165-1168), 발리독실아민 A, B, G, D-글루코-디히드로발리독실아민 A, L-ido-디히드로발리독실아민 A, 데옥시노지리마이신 (Kameda et al., 1987, J. Antibiot. 40 (4), 563-565), 5epi-트레하졸린 (트레할로스타틴) (Kobayashi Y. et al., 1994, J. Antiobiot. 47, 932-938), 카스타노스페르민 (Salleh H.M. ＆ Honek J.F. March 1990, FEBS 262 (2), 359-362) 및 미국 바퀴벌레 (페리플라네타 아메리카나)의 86 kD 단백질 (Hayakawa et al., 1989, J. Biol. Chem. 264 (27), 16165-16169)가 있다. 본 발명에 따른 바람직한 트레할라제 억제제는 발리다마이신 A (1,5,6-트리데옥시-3-o-β-D-글루코피라노실-5-(히드록시메틸)-1-[[4,5,6-트리히드록시-3-(히드록시멘틸)-2-시클로헥센-1-일]아미노]-D-키로-이노시톨)이다. 발리다마이신을 이용한 각종 피자식물아문 (Angiospermae)의 유합조직의 균등질 및 현탁 배양액에서의 트레할라제 활성의 억제는 문헌 (Kendall et al., 1990, Phytochemistry 29, 2525-2582)에 기재되어 있다.
트레할라제 억제제는 식물, 식물 부분 또는 배양액에 의해 흡수되기에 적합한 형태로 식물 또는 식물 부분, 또는 식물 세포 배양액에 투여된다. 전형적으로, 트레할라제 억제제는 활성 성분의 100 nM 내지 10 mM, 바람직하게는 0.1 내지 1 mM의 수용액 형태이다. 수용액은 잎 위에 살포되고, 살수되고, 그것을 수배지에 첨가함으로써 식물 또는 식물 부분에 가해질 수 있다. 발리다마이신의 다른 적당한 제제는 시판되는 농업용 제제인 솔라콜 (Solacol)(Takeda Chem. Indust., Tokyo)이다.
별법으로, 또는 외생적으로 투여된 트레할라제 억제제를 이용하는 것 이외에, 트레할라제 억제제는 그에 대해 코딩하는 유전 정보를 도입함으로써 제공될 수 있다. 그러한 인-빌트 트레할라제 억제제의 한 형태는 상기 내인성 전사 정보와 상호작용하기 위해 트레할라제를 코딩하는 내인성 RNA에 충분히 상보성인 RNA의 생성을 야기시키고, 그에 의해 상기 전사 정보의 발현을 억제하는 유전적 구조체를 포함할 수 있다. 소위 "안티센스 방법"은 당 업계에 잘 알려져 있다 (특히 EP 0 240 208 A 및 WO 95/01446에 기재된 SPS를 억제하는 것에 관한 실시예 참조). 동종 안티센스 유전자가 이종 유전자 보다 더 효율적일 때에는 동종 안티센스 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하지 못한 효소적 활성의 합성을 차단하는 또다른 방법은 식물 숙주에 존재하는 내인성 유전자의 추가의 카피를 식물 숙주의 게놈으로 도입하는 것이다. 유전자의 그러한 추가의 카피가 내인성 유전자를 억제시키는 것이 종종 관찰되며, 이 효과는 문헌에서 동시 억압 효과, 또는 동시 억압으로서 언급된다. 기질 가용성을 향상시키는 방법은 본 명세서에 참고로 인용된 WO 95/01446의 실시예에 상세히 기재되어 있다.
내인성 트레할라제 수준을 억제하는 또다른 방법은 트레할라제를 코딩하는 내인성 유전자를 돌연변이시키는 것이다. 효과적인 돌연변이는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 돌연변이된 유전자 서열을 도입함으로써 이루어질 수 있다 (예를 들면, WO 91/02070에 기재된 바와 같음).
본 발명의 또다른 실시태양에 따라서, 특히 식물은 유전적으로 변화되어 식물의 특정 부분에 상기 안티센스 유전자를 생성시키고 축적시킬 수 있다. 바람직한 발현 부위는 잎 및 식물의 저장 부분이다. 특히 감자 괴경은 적합한 식물 부분으로 고려된다. 감자의 미소 괴경 및 괴경에서의 선택적인 발현을 이루기에 바람직한 프로모터는 감자의 파타틴 유전자의 오픈 리딩 프레임의 업스트림 영역으로부터 얻을 수 있다.
특이적 발현에 대한 또다른 적합한 프로모터는 식물의 광동화 부분에 대해 특이적인 플라스토시아닌 프로모터이다. 또한, 식물 부분내의 특이적 발현은 식물 성장 및 재생 또는 상기 식물의 경제적인 이용을 위한 바람직한 효과를 나타낼 수 있다고 예상된다. 이러한 면에서 유용한 프로모터의 예로는 과일 특이적인 E8-프로모터 (EP 0 409 629) 및 2A11-프로모터 (van Haaren and Houck (1993), Plant Mol. Biol., 221, 625); 종자 특이적인 쿠르시페린 프로모터, 나핀 프로모터 및 ACP 프로모터; PAL-프로모터; 꽃 특이적인 칼콘-이소머라제 프로모터; 잎 특이적인 SSU 프로모터 및 페레독신 프로모터; 뿌리 특이적인 TobRb7 프로모터; 체관부에 특이적인 Ro1C 프로모터; 및 분열 조직에 특이적인 HMG2 프로모터 (Enjuto et al. (1995), Plant Cell 7, 517) 및 벼 PCNA 프로모터 (Kosugi et al. (1995), Plant J. 7, 877)가 있다.
본 발명에서의 또다른 선택은 유도성 프로모터를 사용하는 것이다. 병원체에 의해, 스트레스에 의해, 화학물질에 의해 또는 명/암 자극에 의해 유도가능한 프로모터가 알려져 있다. 특정 현상, 예를 들어 발아, 추대, 종자 아주심기, 저장 조직의 충전의 유도를 위해서 외부 자극에 의해 본 발명의 유전자의 활성을 유도하는 것이 유리할 수 있는 것으로 예상된다. 이것은 식물의 정상적인 발달 및 조절하에 바람직한 현상의 유도가능성의 편의를 가능하게 한다. 그러한 방식에 사용하기에 적합한 프로모터는 DE 4446342 (진균류 및 옥신 유도 PRP-1), WO 96/28561 (진균류 유도 PRP-1), EP 0 586 612 (선충류 유도), EP 0 712 273 (선충류 유도), WO 96/34949 (진균류 유도), PCT/EP96/02437 (선충류 유도), EP 0 330 479 (스트레스 유도), US 5,510,474 (스트레스 유도), WO 96/12814 (한랭 유도), EP 0 494 724 (테트라사이클린 유도), EP 0 619 844 (에틸렌 유도), EP 0 337 532 (살리실산 유도), WO 95/24491 (티아민 유도) 및 WO 92/19724 (빛 유도)에 기재된 병원체 유도성 프로모터이다. 다른 화학물질 유도성 프로모터는 EP 0 674 608, EP 637 339, EP 455 667 및 US 5,364,780에 기재되어 있다.
숙주 세포는 헥소키나제 시그날링의 변경이 T-6-P의 수준의 변화를 통해 이루어질 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 따라서, 모든 진핵 세포는 본 발명에 적용된다. 경제적인 면에서, 대사 화합물의 생산에 가장 적합한 세포가 본 발명에 가장 적합하다. 이들 유기체는 그중에서도 특히 식물, 동물, 효모, 진균류이다. 그러나, 진화된 동물 세포 (예를 들면, 췌장 베타-세포 및 지방 세포)에서의 발현도 예상된다.
종자식물문 (Spermatophytae) 중에서 바람직한 식물 숙주는 피자식물아문 (Angiospermae), 특히 대표적인 과로서 가지과 (Solanaceae)를 포함하는 쌍자엽식물강 (Dicotyledoneae) 및 대표적인 과로서 풀과 (Gramineae)를 포함하는 단자엽식물강 (Monocotyledoneae)이다. 본 발명의 명세서에 정의된 바와 같은 적합한 숙주 식물은 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의해 변경된 수준의 T-6-P를 함유하는 식물 (및 상기 식물의 부분 및 세포) 및 그의 후대를 포함한다. 본 발명에 따른 작물은 꽃, 예를 들면 꽃양배추 (브라시카 올레라세아 (Brassica oleracea)), 아티초크 (시나라 스콜리무스 (Cynara scolymus)), 컷 플라워, 예를 들면 카네이션 (디안투스 카르요필루스 (Dianthus caryophyllus)), 장미 (로자 종 (Rosa spp.)), 국화, 피튜니아, 알스트로메리아, 솜나물, 글라디올러스, 백합 (릴리움 종 (Lilium spp.)), 홉 (후물루스 루풀루스 (Humulus lupulus)), 브로콜리, 화분 식물, 예를 들면 철쭉, 진달래, 달리아, 베고니아, 퓨셔, 제라늄 등; 과일, 예를 들면 사과 (말루스 (Malus), 예를 들면 도메스티쿠스 (domesticus)), 바나나 (무사 (Musa), 예를 들면 아쿠미나타 (Acuminata)), 살구 (프루누스 아르메니아카 (Prunus armeniaca)), 올리브 (올리바 사티바 (Oliva sativa)), 파인애플 (아나나스 코모수스 (Ananas comosus)), 코코넛 (코코스 누시페라 (Cocos nucifera)), 망고 (망기페라 인디카 (Mangifera indica)), 키위, 아보카도 (페르세아 아메리카나 (Persea americana)), 장과 (예를 들면 까치밥나무 열매, 리베스 (Ribes), 예를 들면 루브룸 (rubrum)), 체리 (예를 들면, 스윗 체리, 프루누스 (Prunus), 예를 들면 아비움 (avium)), 오이 (쿠쿠미스 (Cucumis), 예를 들면 사티부스 (sativus)), 포도 (비티스 (Vitis), 예를 들면 비니페라 (vinifera)), 레몬 (시트루스 리몬 (Citrus limon)), 멜론 (쿠쿠미스 멜로 (Cucumis melo)), 겨자 (시나피스 알바 (Sinapis alba) 및 브라시카 니그라 (Brassica nigra)), 견과 (예를 들면, 호두나무 열매, 주글란스 (Juglans), 예를 들면 레지아 (regia); 땅콩, 아라키스 히포게애 (Arachis hypogeae)), 오렌지 (시트루스 (Citrus), 예를 들면 맥시마 (maxima)), 복숭아 (프루누스 (Prunus), 예를 들면 페르시카 (persica)), 서양배 (피라 (Pyra), 예를 들면 코무니스 (Communis)), 후추 (솔라눔 (Solanum), 예를 들면 캅시쿰 (capsicum)), 플럼 (프루누스 (Prunus), 예를 들면 도메스티카 (domestica)), 딸기 (프라가리아 (Fragaria), 예를 들면 모스카타 (moschata)), 토마토 (리코페르시콘 (Lycopersicon), 예를 들면 에스쿨렌툼 (esculentum)); 잎, 예를 들면 자주개자리(메다카고 사티바 (Medicago sativa)), 양배추 (예를 들면 브라시카 올레라세아 (Brassica oleracea)), 엔디브 (시코레움 (Cichoreum), 예를 들면 엔디비아 (endivia)), 리크 (알리움 포룸 (Allium porrum)), 상추 (락투카 사티바 (Lactuca sativa)), 시금치 (스피나시아 올레라세애 (Spinacia oleraceae)), 담배 (니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum)), 풀, 예를 들면 페스투카, 포아, 독보리 (예를 들면, 롤리움 페렌네 (Lolium perenne), 롤리움 멀티플로룸 (Lolium multiflorum) 및 아레나테룸 종 (Arrenatherum spp.)), 부드러운 풀, 잔디, 해초, 치커리 (치커리움 인티부스 (Cichorium intybus)), 차 (페아 시넨시스 (Thea sinensis)), 셀러리, 파슬리 (페트로셀리눔 크리스품 (Petroselinum crispum)), 체빌 및 다른 풀잎; 뿌리, 예를 들면 칡 (마란타 아룬디나세아 (Maranta arundinacea)), 비트 (베타 불가리스 (Beta vulgaris)), 당근 (다우쿠스 캐로타 (Daucus carota)), 카사바 (마니호트 에스쿨렌타 (Manihot esculenta)), 인삼 (파낙스 진셍 (Panax ginseng)), 순무 (브라시카 라파 (Brassica rapa)), 무 (라파누스 사티부스 (Raphanus sativus)), 참마 (디오스코레아 에스쿨렌타 (Dioscorea esculenta)), 고구마 (이포모에아 바타타스 (Ipomoea batatas)), 타로토란; 종자, 예를 들면 콩 (파세올루스 불가리스 (Phaseolus vulgaris)), 완두콩 (피숨 사티붐 (Pisum sativum)), 콩 (글리신 맥스 (Glycin max)), 밀 (트리티쿰 에스티붐 (Triticum aestivum)), 보리 (호르데움 불가레 (Hordeum vulgare)), 옥수수 (제아 메이스 (Zea mays)), 벼 (오리자 사티바 (Oryza sativa)), 강낭콩 및 잠두 (비시아 파바 (Vicia faba)), 목화 (고시피움 종 (Gossypium spp.)), 커피 (커피아 아라비카 (Coffea arabica) 및 씨. 카네포라 (C. canephora)); 괴경, 예를 들면 구경양배추 (브라시카 올레라세애 (Brassica oleraceae)), 감자 (솔라눔 튜베로숨 (Solanum tuberosum)); 구근상 식물, 예를 들면 양파 (알리움 세파 (Allium cepa)), 골파, 튤립 (튤리파 종 (Tulipa spp.)), 나팔수선화 (나르시수스 종 (Narcissus spp.)), 마늘 (알리움 사티붐 (Allium sativum)); 줄기, 예를 들면 코르크 나무, 사탕수수 (사카룸 종 (Saccharum spp.)), 사이잘초 (사이잘 종 (Sisal spp.)), 아마 (리눔 불가레 (Linum vulgare)), 황마; 나무, 예를 들면 고무 나무, 오크 (퀘르쿠스 종 (Quercus spp.)), 너도밤나무 (베툴라 종 (Betula spp.)), 오리나무 (알누스 종 (Alnus spp.)), 양물푸레나무 (아세르 종 (Acer spp.)), 느릅나무 (울무스 종 (Ulmus spp.)), 야자, 양치 식물, 담쟁이 덩굴 등을 갖는 것이다.
효모 및 진균류 또는 동물 세포의 형질전환은 통상적으로 공지된 벡터계, 예를 들면 pBluescript, pUC 및 바이러스 벡터계, 예를 들면 RSV 및 SV40을 이용하여 통상적인 최첨단 형질전환 기술을 통해 행해질 수 있다.
유전자가 상기 식물 세포에서 발현되기만 하면 유전자를 수용 식물 세포로 도입하는 방법은 중요한 것이 아니다.
예를 들면, 일부 식물 종이 아직 유전적 형질전환에 대해 저항성이 있어서 본 발명의 실시태양의 일부가 현재 실시될 수 없긴 하지만, 그 자체로 유전적 형질전환을 실시하는 것은 본 발명의 기본 실시태양에 적절하지 않기 때문에 그러한 식물 종에서의 본 발명의 실시는 단지 시간 문제일 뿐 원리의 문제가 아니다.
식물 종의 형질전환은 이제는 단자엽식물강 (Monocotyledoneae) 뿐만 아니라 쌍자엽식물강 (Dicotyledoneae)을 포함한 많은 수의 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens et al. (1982), Nature 296, 72; Negrutiu et al. (1987), Plant Mol. Biol. 8, 363), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al. (1986), Mol. Gen. Genet. 202), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein et al. (1987), Nature 327, 70), 성숙 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테륨 투메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 (EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테륨 매개된 DNA 전이를 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
유전적 형질전환에 대해 어느 정도 더 저항성이 있는 것으로 고려되긴 하지만, 단자엽 식물은 형질전환에 따를 수 있고 생식 유전자도입 식물은 형질전환된 세포 또는 배, 또는 다른 식물 요소로부터 재생될 수 있다. 현재, 단자엽 식물의 바람직한 형질전환 방법은 배, 체외배양체 또는 현탁 세포의 현미경적영사 충격법, 및 직접적인 DNA 흡수 또는 (조직) 전기천공법이다 (Shimamoto, et al. (1989), Nature 338, 274-276). 유전자도입 옥수수 식물은 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (제초제 포스피노트리신을 불활성화시키는 효소)를 코딩하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 bar-유전자를 현미경적영사 충격법에 의해 옥수수 현탁 배양액의 배형성 세포로 도입함으로써 생산되었다 (Gordon-Kamm (1990), Plant Cell, 2, 603). 밀 및 보리와 같은 다른 단자엽 식물의 호분 (糊粉) 원형질체에 유전자 물질을 도입하는 것은 문헌에 보고되어 있다 (Lee (1989), Plant Mol. Biol. 13, 21). 밀 식물은 배형성 현탁 배양액의 형성을 위해 배형성의 유합조직을 선택함으로써 배형성 현탁 배양액으로부터 재생되었다 (Vasil (1990) Bio/Technol. 8, 429). 이 작물에 대한 형질전환계와의 혼합은 단자엽 식물에 대한 본 발명의 이용을 가능하게 한다.
벼 및 옥수수와 같은 상업적으로 중요한 작물을 포함한 단자엽 식물은 또한 아그로박테륨속 균주에 의한 DNA 전이에 적응할 수 있다 (WO 94/00977; EP 0 159 418 B1; Gould et al. (1991) Plant. Physiol. 95, 426-434 참조).
실제적으로 모든 식물은 배양된 세포 또는 조직으로부터 재생될 수 있는 것으로 알려져 있다. 재생 방법은 식물의 종에 따라 다르지만, 일반적으로 형질전환된 원형질체의 현탁액 또는 형질전환된 체외배양체를 함유하는 페트리 평판이 처음에 제공된다. 발아는 직접적으로, 또는 기관형성 또는 배형성을 통해 유합조직으로부터 간접적으로 유도되고 이어서 뿌리내려진다. 선택 마커에 이어서, 배지는 일반적으로 각종 아미노산 및 호르몬, 예를 들면 오옥신 및 사이토킨을 함유할 것이다. 또한, 특히 옥수수 및 자주개자리와 같은 종에 대해서는 글루탐산 및 프롤린을 배지에 첨가하는 것이 유리하다. 효율적인 재생은 배지, 유전자형 및 배양액의 처리에 좌우될 것이다. 이 세가지 변수가 조절된다면, 재생은 일반적으로 재현가능하고 반복가능하다. 형질전환된 유전자 서열을 유전자도입 식물에 안정하게 삽입시킨 후에, 그들에 의해 부여되는 특성은 유성 교잡에 의해 다른 식물로 전달될 수 있다. 교잡될 종에 따라 임의의 많은 표준 육종 기술이 이용될 수 있다.
식물 발현가능한 유전자 (마커 유전자 포함)의 발현을 조절하는데 적합한 DNA 서열, 예를 들면 전사 개시 영역, 인핸서, 비전사된 리이더 등은 식물 세포에서 발현되는 임의의 유전자로부터 유래될 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 예상되는 것은 각종 프로모터의 기능적인 부분, 또는 그의 합성 등가물을 포함하는 혼성체 프로모터이다. 구성 프로모터와 별개로 유도성 프로모터 또는 그의 발현 패턴에서 발생적으로 조절되는 또는 세포형 특이적인 프로모터는 본 발명에 따른 발현가능한 유전자의 발현을 조절하는데 이용될 수 있다.
형질전환된 세포를 선택하거나 또는 선별하기 위해서는 식물 세포로 전이될 본 발명에 따른 식물 발현가능한 유전자에 연결된 마커 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 식물 형질전환에서 적합한 마커 유전자의 선택은 일반적인 숙련인의 영역내에 들며, 통상적으로 사용되는 마커 유전자의 일부 예로는 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (EP-B 131 623), 글루타티온 유래된 제초제에 대한 내성을 부여하는 쥐 간으로부터 얻은 글루타티온-S-트랜스퍼라제 유전자 (EP-A 256 223), 포스피노트리신과 같은 글루타민 신테타제 억제제에 대한 과발현 내성을 부여하는 글루타민 신테타제 (WO 87/05327), 선택 제제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes)로부터 얻은 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 (EP-A 275 957), N-포스포노메틸글리신에 대한 내성을 부여하는 5-에놀시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS)를 코딩하는 유전자, 바이알라포스에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자 (예를 들면, WO 91/02071), 시안아미드에 대한 내성을 부여하는 cah 유전자 등이 있다. 마커의 실제적인 선택은 마커가 선택 식물 세포와 함께 기능적 (즉, 선택적)이기만 하면 중요한 것은 아니다.
연결되지 않은 유전자의 동시 형질전환 (미국 특허 제4,399,216호)은 또한 식물 형질전환에서 효율적인 과정이므로 마커 유전자 및 당해 유전자는 연결되어야 할 필요는 없다.
형질전환, 특히 쌍자엽 식물에 대해 바람직한 식물 요소는 쉽게 형질전환될 수 있고 우수한 재생 가능성을 갖는 잎 원반상 조직이다 (Horsch et al. (1985), Science 227, 1229).
동물 또는 인체에서, 대사 결함에 의해 야기되는 질환은 영향받은 세포내의 내인성 트레할라제 수준을 억제함으로써 극복될 수 있는 것으로 생각된다. 인체 세포에서, 많은 종양 세포의 증가된 글루코스 소비는 헥소키나제의 과발현에 의해 크게 좌우된다 (Rempel et al. (1986) FEBS Lett. 385, 233). 암 세포의 대사로의 글루코스의 유입은 트레할로스-6-포스페이트 합성 효소의 발현에 의해 또한 내인성 트레할라제의 억제에 의해 영향받을 수 있다고 생각된다. 또한, 헥소키나제 활성화는 cAMP/PKA (단백질 키나제 A 경로)에 의해 가능하게 된다고 밝혀졌다. 그러므로, 시그날 형질도입 경로의 불활성화는 글루코스 흡수 및 신생형성의 증식에 영향을 미칠 수 있다. 트레할로스-6-포스페이트 및 트레할로스를 합성하고 트레할로스를 분해할 수 있는 포유동물 세포내의 효소 활성은 예를 들면 토끼 신장 피질 세포에서 나타났다 (Sacktor (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 1007).
이미 이해된 바와 같이, 예를 들면 안티센스 트레할라제 구조체의 도입에 의한 내인성 트레할라제 수준의 억제는 TPS의 도입과 유사한 효과를 자극할 것이다. 이 효과는 성장 방해 또는 발육 저해 (특히, TPS의 고도의 발현에서)를 야기시키는 T-6-P의 양의 증가, 더욱 뾰족한 형태의 잎의 형성, 엽록소의 증가로 인한 더 진한 색 및 전분 함량의 증가인 것으로 밝혀졌다. 또한, TPS 및 as-트레할라제의 이중 구조체의 사용은 단일 구조체의 효과를 증강시킨다.
T-6-P의 수준의 증가는 또한 전분 및 수크로스와 같은 저장 탄수화물의 증가를 야기시킨다. 이것은 그후에 탄수화물이 저장된 조직이 더 많은 물질을 저장할 수 있을 것임을 의미한다. 이것은 식물에서 비트 (수크로스의 저장)에서와 같이 무성해진 뿌리 및 괴경과 같은 저장 기관의 증가된 생물량이 형성됨을 나타내는 실시예에 의해 예시될 것이다.
이것이 아주 유리한 작물은 감자, 사탕무, 당근, 치커리 및 사탕수수이다.
감자에서의 또다른 경제적으로 중요한 효과는 TPS 유전자를 코딩하는 DNA로 형질전환시킨 후에 (T-6-P가 증가됨), 한랭 조건 (4 ℃)에서 괴경을 수확 및 저장한 후에도 가용성 당의 양은 감소하는 것으로 밝혀졌다. 통상적으로, 더 한랭한 조건의 저장은 초기 발아의 방지에 필요할 것이지만, 그 결과 감자의 과도한 감미화가 일어난다. 환원당과 아미노산 사이에서 마일라르 반응이 일어나서 갈변화되기 때문에 감미된 감자 괴경 물질이 가공에 적합하지 않으므로 환원 당의 양의 감소는 식품 산업에서 중요한 문제이다.
동일한 방식의 인버타제 활성의 억제는 효소 TPS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의한 사탕무의 형질전환에 의해 이루어질 수 있다. 수확 후에 사탕무의 인버타제 활성의 억제는 경제적으로 매우 중요한 문제이다.
과일 및 종자에서도, 저장이 변화될 수 있다. 이 결과 저장 능력이 증가될 뿐만 아니라 저장된 화합물의 조성의 변화가 일어난다. 종자 생산율의 개선이 특히 중요한 작물은 옥수수, 벼, 곡물, 완두콩, 평지씨, 해바라기, 콩 및 콩과 식물 (legume)이다. 또한, 모든 과일열매 식물은 저장된 탄수화물의 양 및 조성의 변화를 나타내는 이용 분야에 중요하다. 특히, 과일의 경우 저장된 생산물의 조성은 충실성 및 견실성의 변화를 나타내고, 그것은 토마토, 바나나, 딸기, 서양배, 장과 및 포도와 같은 연한 과일에서 특히 중요하다.
T-6-P 수준의 감소에 의해 알려진 효과와 대조적으로, T-6-P 수준의 증가는 잎에서의 단백질/탄수화물의 비율을 감소시킨다. 이 효과는 마초 및 자주개자리와 같은 잎줄기 작물에서 중요하다. 또한, 잎은 부드러운 풀에서 중요할 수 있는 감소된 생물량을 갖지만, 비교적 증가된 에너지 함량을 갖는 것이 더욱 중요하다. 이 특성은 특히 양파, 리크 및 말실저장 옥수수와 같은 작물에 특히 유리하다.
또한, 종자의 생육성은 세포내 이용가능한 T-6-P의 수준에 의해 영향받을 수 있다.
식물의 한 부분의 T-6-P의 더 낮은 수준 및 식물의 다른 부분의 T-6-P의 증가된 수준의 혼합은 상승 작용하여 상기 효과를 증가시킬 수 있다. 특이 프로모터를 이용하여 발생 중에 순차적인 상기 감소 또는 증가를 유도하는 유전자를 발현시킬 수도 있다. 마지막으로, 유도성 프로모터의 조절하에 서열을 코딩함으로써 관련된 유전자 중의 어느 하나의 발현을 유도할 수도 있다. 기재된 바와 같은 이용 방법의 혼합은 당 업계의 숙련인에게 명백할 것으로 생각된다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 더 예시된다. 실시예는 본 발명의 특정 실시태양을 나타내지만, 이들 실시예의 변형 및 다른 식물 또는 발현계의 이용이 본 발명에 의해 포함되는 것이 분명하다는 것이 강조된다.
실험
DNA 조작
모든 DNA 절차 (이. 콜리로부터의 DNA 분리, 제한, 연결, 형질전환 등)는 표준 절차를 따라서 수행하였다 (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York).
균주
모든 실시예에서, 이. 콜리 K-12 균주 DH5α를 클로닝에 사용하였다. 식물 형질전환 실험에 사용된 아그로박테륨 투메파시엔스 균주는 EHA 105 및 MOG 101였다 (Hood et al. (1993) Trans. Research 2, 208).
아그로박테륨 균주 MOG101의 제조
아그로박테륨 균주 MG101의 제조는 WO 96/21030에 기재되어 있다.
이. 콜리 otsA 유전자의 클로닝 및 pMOG799의 제조
이. 콜리에서, 트레할로스 포스페이트 신타제 (TPS)는 오페론 otsBA에 위치된 otsA 유전자에 의해 코딩되었다. otsA 유전자의 클로닝 및 서열 결정은 본 명세서에 참고로 인용된 WO 95/01446의 실시예 I에 상세히 기재되어 있다. 식물 세포에서의 그의 발현을 실시하기 위하여, 오픈 리딩 프레임은 WO 95/01446의 실시예 I에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, CaMV 35S RNA 프로모터의 전사 조절 요소, ALMV 리더의 해독 인핸서 및 nos-유전자의 전사 터미네이터에 연결되어 pMOG799를 형성하였다. pMOG799를 포함하는 이. 콜리 균주의 샘플은 1993년 8월 23일 (Monday)에 부다페스트 협약(at the Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, The Netherlands) 하에 기탁되었으며, 국제 기탁 협회에 의해 부여된 수탁 번호는 CBS 430.93이었다.
파타틴 프로모터의 분리/pMOG546의 제조
파타틴 프로모터 단편을 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 솔라눔 튜베로숨 cv. 빈쩨 (Solanum tuberosum cv. Bintje)의 염색체 DNA로부터 분리하였다. 다음 서열을 포함하는, λpat21 파타틴 유전자 (Bevan et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14, 5564)의 업스트림 영역의 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드 세트를 합성하였다.
5' AAG CTT ATG TTG CCA TAT AGA GTA G 3' PatB33.2 (서열 1)
5' GTA GTT GCC ATG GTG CAA ATG TTC 3' PatATG.2 (서열 2)
이 프라이머를, 주형으로서 감자 cv. 빈쩨로부터 분리된 염색체 DNA를 이용하여 1123bp의 DNA 단편을 PCR 증폭시키는데 이용하였다. 증폭된 단편은 λpat21 파타틴 서열에 대해 고도의 유사성을 나타내며 EcoRI 링커를 이용하여 pUC18 벡터로 클로닝시켜 플라스미드 pMOG546을 형성하였다.
pMOG845의 제조
pMOG845의 제조는 WO 96/21030에 기재되어 있다.
pVDH318, 플라스토시아닌-TPS의 제조
플라스미드 pMOG798 (WO 95/01446에 기재됨)을 HindIII로 분해시키고 올리고뉴클레오티드 2사슬 TCV11 및 TCV12와 연결하였다 (pMOG845의 제조 참조). 형성된 벡터는 PstI 및 HindIII로 분해시키고 이어서 PotPiII 터미네이터를 삽입하여 pTCV118을 형성하였다. 플라스미드 pTCV118을 SmaI 및 HindIII로 분해하여 TPS 코딩 영역 및 PotPiII 터미네이터를 포함하는 DNA 단편을 형성하였다. BglII 링커를 첨가하고 형성된 단편을 BamHI으로 분해된 식물 이원 발현 벡터 pVDH275 (도 1)에 삽입하여 pVDH318을 형성하였다. pVDH275는 35S CaMV 프로모터의 조절하의 NPTII 선택 마커 및 완두콩 플라스토시아닌 (PC) 프로모터 및 nos 터미네이터 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 pMOG23의 유도체이다 (Sijmons et al. (1990), Bio/Technol. 8. 217). pVDH275에 존재하는 플라스토시아닌 프로모터는 문헌 (Pwee ＆ Gray (1993) Plant J. 3, 437)에 기재되어 있다. 이 프로모터는 PCR 증폭 및 적당한 클로닝 부위를 포함하는 프라이머를 이용하여 이원 벡터로 전달되었다.
다른 발현 벡터의 제조
상기 벡터의 제조와 유사하게, 선택 마커 유전자로서 NPTII 유전자 또는 하이그로마이신 내성 유전자를 갖는 이원 벡터를 이용하여 TPS, TPP 또는 트레할라제와 함께 다른 프로모터를 이용하여 유전자 구조체를 제조하였다. HPT 선택 마커를 포함하는 이원 벡터 pMOG22에 대해서는 문헌 (Goddijn et al. (1993) Plant J. 4, 863)에 설명되어 있다.
세어버이 교배
이원 벡터를 플라스미드 pRK2013을 함유하는 이. 콜리 균주 HB101 (Ditta et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347)에 의한 세어버이 교배에서 아그로박테륨 투메파시엔스 균주 MOG101 또는 EHA105에 동원하고 형질전환에 이용하였다.
담배 (니코티아나 타바쿰 cv. SR1 또는 cv. Samsun NN)의 형질전환
설명된 바와 같은 당해 이원 벡터를 함유하는 아그로박테륨 투메파시엔스 균주 MOG101과 식물 조직의 동시 배양에 의해 담배를 형질전환시켰다. 문헌 (Horsch et al. (1985) Science 227, 1229)에 설명된 바와 같이 담배 잎 원반상 조직의 동시 배양을 이용하여 형질전환을 실시하였다. 유전자도입 식물은 카나마이신을 함유하는 선택 배지 상에서 성장된 새싹으로부터 재생되고, 뿌리내려지고 토양으로 전달되었다.
감자의 형질전환
감자 (솔라눔 튜베로숨 cv. 카르달)를 당해 이원 벡터를 함유하는 아그로박테륨속 균주 EHA 105로 형질전환시켰다. 염기성 배지는 최종 pH가 5.8 (KOH로 조정됨)이고 8 g/l 다이친 한천이 갖추어질 때 고상화되는 0.5 g/l MES, MS염 (Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 14, 473), R3 비타민 (Ooms et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 73, 744), 30 g/l 수크로스를 함유하는 MS30R3 배지였다. 솔라눔 튜베로숨 cv. 카르달의 괴경의 껍질을 벗기고 96% 에탄올에서 5초 동안 태워서 표면을 멸균 처리하였다. 불꽃을 멸균수에서 소화시키고 약 2 ㎜ 두께로 잘라내었다. 원반상 조직을 유관속 조직으로부터 구멍을 갖도록 절단하고 이원 벡터를 포함하는 1-5 x 108세균/㎖의 아그로박테륨 EHA 105를 함유하는 MS30R3 배지에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 괴경 원반상 조직을 MS30R3 배지로 세척하고 고상화된 후배양 배지 (PM)에 전달하였다. PM은 3.5 ㎎/l 제아틴 리보사이드 및 0.03 ㎎/l 인돌 아세트산 (IAA)으로 보충된 M30R3 배지로 이루어졌다. 2일 후에, 200 ㎎/l 세포탁심 및 100 ㎎/l 반코마이신을 포함하는 새로운 PM 배지에 전달하였다. 3일 후에, 괴경 원반상 조직을 250 ㎎/l 카르베니실린 및 100 ㎎/l 카나마이신을 포함하는 PM 배지로 이루어진 발아 유도 배지 (SIM)에 전달하였다. 4 내지 8주 후에, 원반상 조직으로부터 나온 새싹을 절개하고 뿌리내림 배지 (100 ㎎/l 세포탁심, 50 ㎎/l 반코마이신 및 50 ㎎/l 카나마이신을 포함하는 MS30R3-배지) 상에 두었다. 새싹을 분열 조직 절단에 의해 순배양으로 증식시켰다.
라이코페르시콘 에스쿨렌툼 (Lycopersicon esculentum)의 형질전환
토마토 형질전환을 문헌 (Van Roekel et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 644)에 기재된 바와 같이 실시하였다.
미소 괴경의 유도
보조 분열조직을 갖는 시험관내 감자 식물의 줄기 단편을 미소 괴경 유도 배지에 전달하였다. 미소 괴경 유도 배지는 R3 비타민로 보충된 1 x MS염, 8 g/l 다이친 한천으로 고상화되는 0.5 g/l MES (최종 pH = 5.8, KOH로 조정됨), 60 g/l 수크로스 및 2.5 ㎎/l 카이네틴을 함유한다. 24 ℃에서 어둠 속에서 성장시킨지 3 내지 5주 후에, 미소 괴경을 형성하였다.
발리다마이신 A의 분리
발리다마이신 A는 (IC50) 10-6M 내지 10-10M 범위의 각종 공급원으로부터의 트레할라제의 고특이적 억제제인 것으로 밝혀졌다 (Asano et al. (1987) J. Antibiot. 40, 526; Kameda et al. (1987) J. Antibiot. 40, 563). 그것은 트레할라제 이외에는 임의의 α- 또는 β-글리코히드롤라제 활성을 크게 억제하지 않는다. 발리다마이신 A는 문헌 (Kendall et al. (1990) Phytochemistry 29, 2525)에 기재된 바와 같이 시판되는 농업용 제제인 솔라콜 (Solacol)(Takeda Chem. Indust., Tokyo)로부터 분리되었다. 이 절차는 솔라콜의 3% 농업용 제제로부터의 이온 교환 크로마토그래피 (QAE-Sephadex A-25 (Pharmacia), bed vol. 10 ㎖, 평형 완충액 0.2 mM Na-Pi pH 7)를 포함한다. 컬럼 상에 솔라콜 1 ㎖를 부하시키고 물로 7 분획물로 용출시켜 실질적으로 모든 발리다마이신을 4 분획물로 회수하였다. 100% 회수를 기준으로, 이 절차를 이용하여 트레할로스 축적 시험에 사용하기 위해 발리다마이신 A의 농도를 MS-배지에서 1.10-3M로 조정하였다. 또한, 발리다마이신 A 및 B를 본 명세서에 참고로 인용된 문헌 (Iwasa et al. (1971) J. Antibiot. 24, 119)에 기재된 바와 같이 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 var. 리모네우스로부터 직접 정제할 수 있다.
탄수화물 분석
탄수화물을 펄스파 전기화학 검출법으로 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정량적으로 측정하였다. 균질화된 냉동 물질을 80% EtOH로 추출시켜 추출물을 제조하였다. 실온에서 15분 동안 추출한 후에, 가용성 분획물을 증발시키고 증류수에 용해시켰다. 샘플 (25 ㎕)을 4 x 250 ㎜ 디오넥스 35391 카르보팩 PA-1 컬럼 및 4 x 50 ㎜ 디오넥스 43096 카르보팩 PA-1 프리컬럼이 장치된 디오넥스 DX-300 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 1 ㎖/분에서 100 mM NaOH로 용출시키고 이어서 NaAc 구배시켰다. 당을 펄스파 전기화학 검출기 (Dionex, PED)로 검출하였다. 시판되는 탄수화물 (Sigma 제품)를 표준으로서 사용하였다.
트레할로스-6-포스페이트의 측정
1.1 ㎝ 직경의 잎 원반상 조직 (3개)을 액체 질소에서 냉동시키고 금속 막대를 이용하여 1.5 ㎖ MeOH (80% v/v)로 균질화시켰다. 샘플을 75 ℃에서 15분 동안 가열시키고 스피드백 (SpeedVac)에서 건조시켰다. 펠릿을 450 ㎕ 물을 이용하여 추출시키고 HPLC 상에 주입하기 전에 얼음 위에 저장하였다. 상기한 바와 같은 디오넥스 시스템을 다음 구배로 이용하였다: T = 0'-20' 75 mM NaOH로 평형화 (전체 전개 중에 일정함), T = 20'은 주입 시간, T = 40'-50' 1M NaAc의 0-10%의 선형 증가, T = 60'-100' 1M NaAc의 10-50%의 선형 증가, T = 120'은 전개의 종결. 확인된 피이크의 체류 시간 및 농도를 각각 비교하고 당 표준 용액을 이용하여 계산하였다.
전분 분석
전분 분석을 문헌 (Aman et al. (1994) Methods in Carbohydrate Chemistry, Volume X (eds. BeMiller et al.), pp 111-115)에 기재된 바와 같이 실시하였다.
발현 분석
각종 식물 종에 도입된 유전자의 발현을 노던 블롯 분석을 이용하여 모니터하였다.
실시예 1
트레할로스의 축적이 일어나게 하는 트레할라제 활성의 억제
감자 괴경 특이적 파타틴 프로모터에 의해 유도된 otsA 유전자 (pMOG845)를 갖는 유전자도입 감자 식물을 발생시켰다. 감자 솔라눔 튜베로숨 cv. 카르달 괴경 원반상 조직을 이원 벡터 pMOG845를 포함하는 아그로박테륨 투메파시엔스 EHA105로 형질전환시켰다. 빈 벡터 대조군에 비해 빈번한 형질전환으로 유전자도입체를 얻었다. 얻어진 모든 식물은 야생형 식물과 표현형으로 구별되지 않았다. 미소 괴경을 10-3M 발리다마이신 A로 보충된 미소 괴경 유도 배지 상에서 배양된 유전자도입 및 야생형 식물의 줄기 단편 상에 유도하였다. 대조용으로서, 미소 괴경을 발리다마이신 A가 없는 배지 상에 유도하였다. 발리다마이신 A를 갖는 배지 상에 유도된 미소 괴경은 발리다마이신 A가 없는 배지 상에서 성장시킨 미소 괴경에 비해 상승된 수준의 트레할로스를 나타내었으며 (표 1), 이것은 현재의 트레할라제 활성이 형성된 트레할로스를 분해하고 있음을 나타낸다. 야생형 식물에서의 소량의 트레할로스의 존재는 기능적 트레할로스 생합성 경로의 존재를 나타낸다.
트레할로스 (새로운 중량 %)
+발리다마이신 A -발리다마이신 A
845-2 0.016 -
845-4 - -
845-8 0.051 -
845-11 0.015 -
845-13 0.011 -
845-22 0.112 -
845-25 0.002 -
845-28 0.109 -
야생형 카르달 0.001 -
실시예 2
as-트레할라제에 대해 유전자도입된 감자 식물내의 트레할로스 축적
야생형 감자 식물을 35S CaMV 안티센스 트레할라제 구조체 (서열 3 및 4; pMOG1027은 WO 96/21030에 기재되어 있음)로 형질전환시켜 내인성 트레할로스 생합성 경로의 존재에 대한 증거를 얻었다. pMOG1027에 대해 유전자도입된 감자 싹은 트레할로스를 새로운 중량 기준으로 0.008%까지 축적하였음을 나타내었다. 관찰된 트레할로스 피이크의 동일성은 축적된 트레할로스를 효소 트레할라제로 특이적으로 분해시킴으로써 확인되었다. 일부 pMOG1027 유전자도입 괴경은 소량의 트레할로스를 축적하는 것으로 나타났다 (도 2).
dbEST ID. Genbank 수탁 번호 유기체 기능
680701 AA054930 브루기아 말라이 트레할라제
693476 C12818 카에노르하브디티스 엘레간스 트레할라제
914068 AA273090 브루기아 말라이 트레할라제
15008 T00368 씨. 엘레간스 트레할라제
401537 D67729 씨. 엘레간스 트레할라제
680728 AA054884 브루기아 말라이 트레할라제
694414 C13756 씨. 엘레간스 트레할라제
871371 AA231986 브루기아 말라이 트레할라제
894468 AA253544 브루기아 말라이 트레할라제
실시예 3
분리된 감자 트레할라제 cDNA와 상동성인 EST 클론의 확인
트레할라제를 코딩하는 감자 cDNA 클론의 분리는 WO 96/21030에 기재되어 있다. 감자 트레할라제 서열과 EST 서열 (발현된 서열 tags)과의 비교는 각종 유기체 내의 아주 상동성인 유전자의 존재를 나타낸다 (표 2 참조).
실시예 4
트레할라제를 코딩하는 담배 cDNA 클론의 분리
담배에서의 트레할라제 발현의 하향 조절을 연구하기 위하여, 담배 트레할라제 cDNA를 분리하였다. cDNA 라이브러리를 SMART PCR cDNA 제조 키트 (Clontech)를 이용하여 람다 ZAP에 제조하였다. 출발 물질로서 야생형 담배 잎의 총 RNA 1 ㎍을 사용하였다. 전부 106p.f.u.를 평판 배양하고 감자 트레할라제 cDNA와 혼성화하였다. 5개의 양성 클론을 확인하였다. ABLE C/K에서의 이들 클론 중의 하나의 생체내 삭제 결과 약 1.3 kb의 삽입체를 갖는 플라스미드 pMOG1261이 형성되었다. 핵산 서열화는 담배 트레할라제 cDNA (서열 5 및 6, 서열 7 및 8)의 동일성을 확인하는 감자 트레할라제 cDNA 서열에 대해 광범위한 상동성을 나타내었다.
실시예 5
TPS 및 as-트레할라제에 대해 유전자도입된 토마토 식물의 성능
토마토 형질전환 실험에 사용된 구조체는 PC-TPS, PC-TPS, as-트레할라제, E8-TPS, E8 TPS E8 as-트레할라제였다. 플라스토시아닌 프로모터 및 35S 프로모터에 의해 유도된 TPS 유전자에 대해 유전자도입된 식물은 작은 뾰족한 형태의 잎을 형성하지는 않았지만, 심하게 발육이 저해된 일부 식물은 작은 진녹색 잎을 형성하였다. PC-TPS 및 PC-as-트레할라제에 대해 유전자 도입된 식물은 대조용 식물에 비해 더 작고 더 진한 녹색의 잎을 형성하였다. 다른 작물 (WO 97/42326)에서 TPS 및 TPP에 대해 관찰되었던 바와 마찬가지로, 35S 또는 PC 유래된 TPS 유전자도입 식물의 색 및 잎 가장자리는 분명하게 구별될 수 있었다. 과일 특이적 E8 프로모터의 조절하에 TPS 유전자를 포함하는 일부 식물 만이 황색 껍질을 나타내었고 불완전하게 익었다. 이것은 E8 TPS E8 as-트레할라제에 대해 유전자도입된 다수의 식물이 황색 껍질을 나타내고 불완전하게 익은 바람직하지 못한 과일을 생산하는 것과 대조적이다.
실시예 6
as-트레할라제 및(또는) TPS에 대해 유전자도입된 감자 식물의 성능
구조체: 35S as-트레할라제 (pMOG1027) 및 35S as-트레할라제 Pat TPS (pMOG1027)(845-11/22/28).
35S as-트레할라제 및 pat-TPS를 동시에 발현하는 식물은 pat-TPS 계통 (카나마이신에 대해 내성임)를 35S as-트레할라제 구조체 및 하이그로마이신 내성 마커 유전자를 포함하는 구조체 pMOG1027로 재형질전환시킴으로써 생산되어 유전자형 pMOG1027 (845-11), pMOG1027 (845-22) 및 pMOG1027 (845-28)을 형성하였다. 미소 괴경은 시험관내에서 유도되었으며 미소 괴경의 새로운 중량이 측정되었다. 평균의 새로운 중량 수율은 pMOG1027 (845-11/22/28)를 포함하는 유전자도입 계통에 대해 증가되었다. pMOG1027 만에 대해 유전자도입된 계통으로부터 얻은 미소괴경의 새로운 중량 생물량은 야생형 대조군 식물 보다 약간 더 높았다. 형성된 식물을 온실에서 성장시키고 괴경 생산량을 측정하였다 (도 4). 35S as-트레할라제 또는 35S as-트레할라제 및 pat TPS의 혼합에 대해 유전자도입된 계통은 대조군 계통에 비해 상당히 더 많은 괴경 질량을 나타내었다. 전분 측정량은 더 높은 생산량을 갖는 식물에 의해 생산된 괴경의 전분 함량과 차이를 나타내지 않았다 (도 5). 다수의 1027(845-11/22/28) 계통은 잎 겨드랑이 싹이 떨어진 토양 위의 괴경을 생산하였으며, 이것은 식물 발달에 미치는 사용된 구조체의 충분한 영향을 나타내는 것이다. 35S as-트레할라제 만에 대해 유전자도입된 식물이 토양 위의 괴경을 형성하지 않았다.
구조체: Pat as-트레할라제 (pMOG1028) 및 Pat as-트레할라제 Pat TPS (pMOG1028)(845-11/22/28).
Pat as-트레할라제 및 Pat-TPS를 동시에 발현하는 식물은 Pat-TPS 계통 (카나마이신에 대해 내성임)를 Pat as-트레할라제 구조체 및 하이그로마이신 내성 마커 유전자를 포함하는 구조체 pMOG1028로 재형질전환시킴으로써 생산되어 유전자형 pMOG1028 (845-11), pMOG1028 (845-22) 및 pMOG1028 (845-28)을 형성하였다. 식물을 온실에서 성장시키고 괴경 생산량을 측정하였다 (도 6). 다수의 pMOG1028 유전자도입 계통은 대조군 계통에 비해 상당히 더 많은 괴경 덩어리를 생산하였다. Pat TPS 및 Pat as-트레할라제에 대해 유전자도입된 개개의 식물은 거의 생산량이 없는 것에서부터 대조군과 비교할 만하거나 또는 더 많은 생산량까지 가변적인 괴경 생산량을 나타내었다.
구조체: PC as-트레할라제 (pMOG1092)
pMOG1092에 대해 유전자도입된 식물을 온실에서 성장시키고 괴경 생산량을 측정하였다. 몇가지 계통은 대조군에 비해 더 진한 녹색의 잎을 형성하였다. 괴경 생산량은 유전자도입되지 않은 식물이 비해 상당히 증가되었다 (도 7).
구조체: PC as-트레할라제 PC-TPS (pMOG1130)
pMOG1130에 대해 유전자도입된 식물을 온실에서 성장시키고 괴경 생산량을 측정하였다. 몇가지 유전자도입 계통은 작은 진녹색 잎을 발생시키고 심각한 발육 저해를 나타내었으며, 이것은 식물이 TPS로 형질전환되었을 때 관찰된 표현형 효과가 as-트레할라제 유전자가 동시에 발현될 때 보다 더 심하다는 것을 나타낸다. 괴경 덩어리 생산량은 거의 생산량이 없는 것에서부터 대조 식물에 비해 상당히 더 많은 생산량까지 가변적이었다 (도 8).
실시예 7
N. 타바쿰에서의 감자 트레할라제 cDNA의 과발현
구조체: de35S CaMV 트레할라제 (pMOG1078)
pMOG1078에 대해 유전자도입된 일차 담배 형질전환체는 야생형 담배와 다른 표현형을 나타내었으며, 일부 유전자도입체는 식물 대사에 대한 트레할라제 유전자 발현의 영향을 나타내는 진녹색 잎 색 및 더 두꺼운 잎(잎의 형태는 뾰족한 형태가 아님)을 갖는다. 자가 수분시킨 일차 형질전환체의 종자를 파종하고 카나마이신 상에서 선택하였다. 표현형은 S1 세대에서 멘델 방식으로 분리하는 것으로 나타났다.
관련 pMOG### 및 pVDH### 클론의 목록
1. 이원 벡터1
pMOG23 NPTII 선택 마커를 포함하는 이원 벡터 (약 10 kb)
pMOG22 NPTII 유전자가 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 HPT-유전자로
대체된 pMOG23의 유도체.
pVDH 275 플라스토시아닌 프로모터-nos 터미네이터 발현 카세트를 포함하는,
pMOG23으로부터 유래된 이원 벡터
pMOG402 폴리링커에 KpnI 제한 부위가 존재하지 않는, NPTII-유전자내의
점 돌연변이가 회복된, pMOG23의 유도체.
pMOG800 폴리링커에 회복된 KpnI 부위를 갖는 pMOG402의 유도체.
2. TPS/TPP 발현 구조체
pMOG 799 35S-TPS-3'nos1
pMOG 845 Pat-TPS-3'PotPiII
pMOG 1093 플라스토시아닌-TPS-3'nos
pMOG 1140 E8-TPS-3'nos
3. 트레할라제 구조체
pMOG 1028 파타틴 as-트레할라제 3'PotPiII, 하이그로마이신 내성 마커
pMOG 1078 de35S CaMV amv 리더 트레할라제 3'nos
pMOG 1027 Hyg 마커를 갖는 상기한 바와 동일함
pMOG 1092 플라스토시아닌-as 트레할라제-3'nos
pMOG 1130 플라스토시아닌-as 트레할라제-3'nos 플라스토시아닌-TPS-3'nos
pMOG 1153 E8-TPS-3'nos E8-as 트레할라제-3'-PotPiII
pMOG 1261 담배 트레할라제 cDNA 단편
1모든 구조체는 달리 명시하지 않으면 NPTII 선택 마커를 포함한다.
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT:
(A) NAME: MOGEN International nv
(B) STREET: Einsteinweg 97
(C) CITY: Leiden
(E) COUNTRY: The Netherlands
(F) POSTAL CODE (ZIP): 2333 CB
(G) TELEPHONE: 31-(71)-5258282
(H) TELEFAX: 31-(71)5221471
(ii) TITLE OF INVENTION: Regulating metabolism by modifying the level
of trehalose-6-phosphate by inhibiting endogenous
trehalase levels.
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 10
(iv) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(vi) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: WO 97/42326
(B) FILING DATE: 02-MAY-1997
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(D) TOPOLOGY: linear
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AAGCTTATGT TGCCATATAG AGTAG 25
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 24 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
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GTAGTTGCCA TGGTGCAAAT GTTC 24
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2207 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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(A) ORGANISM: Solanum tuberosum
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Met Gly Lys Ala Ile
1 5
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Ile Phe Met Ile Phe Thr Met Ser Met Asn Met Ile Lys Ala Glu Thr
10 15 20
TGC AAA TCC ATT GAT AAG GGT CCT GTA ATC CCA ACA ACC CCT TTA GTG 271
Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro Thr Thr Pro Leu Val
25 30 35
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Ile Phe Leu Glu Lys Val Gln Glu Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Gly His
40 45 50
AAA GGG TTT GAT GCT AAA CTG TTT GTT GAT ATG TCA CTG AGA GAG AGT 367
Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met Ser Leu Arg Glu Ser
55 60 65
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Leu Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu Pro Arg Val Val Asn
70 75 80 85
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Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe Ile Gly Ser Tyr Leu
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AGT AGT CCT GAT AAG GAT TTG GTT TAT GTT GAG CCT ATG GAT TTT GTG 511
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GCT GAG CCT GAA GGC TTT TTG CCA AAG GTG AAG AAT TCT GAG GTG AGG 559
Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys Asn Ser Glu Val Arg
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GCA TGG GCA TTG GAG GTG CAT TCA CTT TGG AAG AAT TTA AGT AGG AAA 607
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150 155 160 165
TTG AAA AAT CCA GTT ATT ATA CCG GGA TCG CGT TTT AAG GAG GTT TAT 703
Leu Lys Asn Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg Phe Lys Glu Val Tyr
170 175 180
TAT TGG GAT TCT TAT TGG GTA ATA AGG GGT TTG TTA GCA AGC AAA ATG 751
Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu Leu Ala Ser Lys Met
185 190 195
TAT GAA ACT GCA AAA GGG ATT GTG ACT AAT CTG GTT TCT CTG ATA GAT 799
Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu Val Ser Leu Ile Asp
200 205 210
CAA TTT GGT TAT GTT CTT AAC GGT GCA AGA GCA TAC TAC AGT AAC AGA 847
Gln Phe Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Ser Asn Arg
215 220 225
AGT CAG CCT CCT GTC CTG GCC ACG ATG ATT GTT GAC ATA TTC AAT CAG 895
Ser Gln Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val Asp Ile Phe Asn Gln
230 235 240 245
ACA GGT GAT TTA AAT TTG GTT AGA AGA TCC CTT CCT GCT TTG CTC AAG 943
Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu Pro Ala Leu Leu Lys
250 255 260
GAG AAT CAT TTT TGG AAT TCA GGA ATA CAT AAG GTG ACT ATT CAA GAT 991
Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys Val Thr Ile Gln Asp
265 270 275
GCT CAG GGA TCA AAC CAC AGC TTG AGT CGG TAC TAT GCT ATG TGG AAT 1039
Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn
280 285 290
AAG CCC CGT CCA GAA TCG TCA ACT ATA GAC AGT GAA ACA GCT TCC GTA 1087
Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Glu Thr Ala Ser Val
295 300 305
CTC CCA AAT ATA TGT GAA AAA AGA GAA TTA TAC CGT GAA CTG GCA TCA 1135
Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr Arg Glu Leu Ala Ser
310 315 320 325
GCT GCT GAA AGT GGA TGG GAT TTC AGT TCA AGA TGG ATG AGC AAC GGA 1183
Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Ser Asn Gly
330 335 340
TCT GAT CTG ACA ACA ACT AGT ACA ACA TCA ATT CTA CCA GTT GAT TTG 1231
Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu
345 350 355
AAT GCA TTC CTT CTG AAG ATG GAA CTT GAC ATT GCC TTT CTA GCA AAT 1279
Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn
360 365 370
CTT GTT GGA GAA AGT AGC ACG GCT TCA CAT TTT ACA GAA GCT GCT CAA 1327
Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe Thr Glu Ala Ala Gln
375 380 385
AAT AGA CAG AAG GCT ATA AAC TGT ATC TTT TGG AAC GCA GAG ATG GGG 1375
Asn Arg Gln Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Asn Ala Glu Met Gly
390 395 400 405
CAA TGG CTT GAT TAC TGG CTT ACC AAC AGC GAC ACA TCT GAG GAT ATT 1423
Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp Thr Ser Glu Asp Ile
410 415 420
TAT AAA TGG GAA GAT TTG CAC CAG AAC AAG AAG TCA TTT GCC TCT AAT 1471
Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gln Asn Lys Lys Ser Phe Ala Ser Asn
425 430 435
TTT GTT CCG CTG TGG ACT GAA ATT TCT TGT TCA GAT AAT AAT ATC ACA 1519
Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser Asp Asn Asn Ile Thr
440 445 450
ACT CAG AAA GTA GTT CAA AGT CTC ATG AGC TCG GGC TTG CTT CAG CCT 1567
Thr Gln Lys Val Val Gln Ser Leu Met Ser Ser Gly Leu Leu Gln Pro
455 460 465
GCA GGG ATT GCA ATG ACC TTG TCT AAT ACT GGA CAG CAA TGG GAT TTT 1615
Ala Gly Ile Ala Met Thr Leu Ser Asn Thr Gly Gln Gln Trp Asp Phe
470 475 480 485
CCG AAT GGT TGG CCC CCC CTT CAA CAC ATA ATC ATT GAA GGT CTC TTA 1663
Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Ile Ile Glu Gly Leu Leu
490 495 500
AGG TCT GGA CTA GAA GAG GCA AGA ACC TTA GCA AAA GAC ATT GCT ATT 1711
Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Arg Thr Leu Ala Lys Asp Ile Ala Ile
505 510 515
CGC TGG TTA AGA ACT AAC TAT GTG ACT TAC AAG AAA ACC GGT GCT ATG 1759
Arg Trp Leu Arg Thr Asn Tyr Val Thr Tyr Lys Lys Thr Gly Ala Met
520 525 530
TAT GAA AAA TAT GAT GTC ACA AAA TGT GGA GCA TAT GGA GGT GGT GGT 1807
Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly Ala Tyr Gly Gly Gly Gly
535 540 545
GAA TAT ATG TCC CAA ACG GGT TTC GGA TGG TCA AAT GGC GTT GTA CTG 1855
Glu Tyr Met Ser Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Val Leu
550 555 560 565
GCA CTT CTA GAG GAA TTT GGA TGG CCT GAA GAT TTG AAG ATT GAT TGC 1903
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570 575 580
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AAATAAGCTG CAATGGTTTG CTGATAGTTT ATGTTTTGTA TTACTATTTC ATAAGGTTTT 2023
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TAAACAGCTT ACTATATTAA GTAAAAGAAA GATGATTCCT CTGCTTTAAA AAAAAAAAAA 2203
AAAA 2207
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 581 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
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1 5 10 15
Ile Lys Ala Glu Thr Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro
20 25 30
Thr Thr Pro Leu Val Ile Phe Leu Glu Lys Val Gln Glu Ala Ala Leu
35 40 45
Gln Thr Tyr Gly His Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met
50 55 60
Ser Leu Arg Glu Ser Leu Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu
65 70 75 80
Pro Arg Val Val Asn Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe
85 90 95
Ile Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu
100 105 110
Pro Met Asp Phe Val Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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Leu Ala Ser Lys Met Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu
195 200 205
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210 215 220
Tyr Tyr Ser Asn Arg Ser Gln Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val
225 230 235 240
Asp Ile Phe Asn Gln Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu
245 250 255
Pro Ala Leu Leu Lys Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys
260 265 270
Val Thr Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr
275 280 285
Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Arg Glu Leu Ala Ser Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg
325 330 335
Trp Met Ser Asn Gly Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Asp Asn Asn Ile Thr Thr Gln Lys Val Val Gln Ser Leu Met Ser Ser
450 455 460
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465 470 475 480
Gln Gln Trp Asp Phe Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Ile
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met Ser Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser
545 550 555 560
Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Leu Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp
565 570 575
Leu Lys Ile Asp Cys
580
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 515 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iii) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Nicotiana tabacum
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 52..515
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:
GAATTCGCGG CCCGCGTCGA CTACGGCTGC GAGAAGACGA CAGAAGGGGA T GCT CAG 57
Ala Gln
1
GGA TCG AAC CAT AGT TTG AGT CGA TAC TAT GCT ATG TGG AAT GAA CCC 105
Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn Glu Pro
5 10 15
CGA CCA GAA TCA TCA ACT ATT GAC AGT AAA ACA GCT TCC AAA CTC CCA 153
Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Lys Thr Ala Ser Lys Leu Pro
20 25 30
AAC ATC TGT GAA AAA AGA CAA TTT TAT CGC GAC TTG GCA TCA GCG GCA 201
Asn Ile Cys Glu Lys Arg Gln Phe Tyr Arg Asp Leu Ala Ser Ala Ala
35 40 45 50
GAA AGT GGA TGG GAT TTC AGC TCA AGA TGG ATG AGG AAT GAA CCT GAT 249
Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Arg Asn Glu Pro Asp
55 60 65
CTC ACA ACA ACT AGT ACA ACA TCA ATT CTA CCA GTT GAT CTG AAT GCA 297
Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu Asn Ala
70 75 80
TTC CTT CTG AAG ATG GAA CTG GAC ATA GCC TTT TTA GCA AAT ACT ATT 345
Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn Thr Ile
85 90 95
GGA GAA AGT AGC ACC GTT GCC CGA TTT ACA GAA GCT TCT CAA AAC AGA 393
Gly Glu Ser Ser Thr Val Ala Arg Phe Thr Glu Ala Ser Gln Asn Arg
100 105 110
CAA AGG GCC ATA AAC TGT ATC TTT TGG AAC GCG GAG ATG GGG CAA TGG 441
Gln Arg Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Asn Ala Glu Met Gly Gln Trp
115 120 125 130
CTT GAT TAC TGG CTT GGC GAC AGC AAC ACA TCC GAG GAT ATT TAT ATA 489
Leu Asp Tyr Trp Leu Gly Asp Ser Asn Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ile
135 140 145
TGG GAA GAT ATA CAC CAG AAC TCT CT 515
Trp Glu Asp Ile His Gln Asn Ser
150
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 154 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:
Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn
1 5 10 15
Glu Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Lys Thr Ala Ser Lys
20 25 30
Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Gln Phe Tyr Arg Asp Leu Ala Ser
35 40 45
Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Arg Asn Glu
50 55 60
Pro Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu
65 70 75 80
Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn
85 90 95
Thr Ile Gly Glu Ser Ser Thr Val Ala Arg Phe Thr Glu Ala Ser Gln
100 105 110
Asn Arg Gln Arg Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Asn Ala Glu Met Gly
115 120 125
Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Gly Asp Ser Asn Thr Ser Glu Asp Ile
130 135 140
Tyr Ile Trp Glu Asp Ile His Gln Asn Ser
145 150
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 580 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iii) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Nicotiana tabacum
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: unsure
(B) LOCATION: 13
(D) OTHER INFORMATION: /note= "can be a, c, g or t"
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: unsure
(B) LOCATION: 23
(D) OTHER INFORMATION: /note= "can be a, c, g or t"
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: unsure
(B) LOCATION: 219
(D) OTHER INFORMATION: /note= "can be a, c, g or t"
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: unsure
(B) LOCATION: 387
(D) OTHER INFORMATION: /note= "can be a, c, g or t"
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: unsure
(B) LOCATION: 459
(D) OTHER INFORMATION: /note= "can be a, c, g or t"
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 3..263
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:
AG ATC ATT GAA GAT TTC GCG AGA TTT GGA CTA GAA GAG GCA AGA GCC 47
Ile Ile Glu Asp Phe Ala Arg Phe Gly Leu Glu Glu Ala Arg Ala
1 5 10 15
TTA GCT AAC GAC ATT GTT ATC CGA TGG ATA AGA ACT AAC TAT GTA GCT 95
Leu Ala Asn Asp Ile Val Ile Arg Trp Ile Arg Thr Asn Tyr Val Ala
20 25 30
TAC AAG AAA ACC GGT GCA ATG TAT GAA AAA TAC GAC GTG ACA AAA TGT 143
Tyr Lys Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys
35 40 45
GGA GCA TAT GGA GAT GGT GGT GTG TAT GCA GCC CAA ACT GGT TTT GGA 191
Gly Ala Tyr Gly Asp Gly Gly Val Tyr Ala Ala Gln Thr Gly Phe Gly
50 55 60
TGG ACG AAT GGC GTT GTA CTG GCA CTT ATG GAG GAA TTT GGA TGG CCT 239
Trp Thr Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Met Glu Glu Phe Gly Trp Pro
65 70 75
GAA GAC TTG AAG ATT GAC TGC TAC TGAGCAGGCA GAGTAACCAT TCGAGCTGAC 293
Glu Asp Leu Lys Ile Asp Cys Tyr
80 85
GAAATTAGAA ATATTATCCG TGAATATATT GAACAATATA ATGGAGAAGT AAAGATTGTA 353
AATATTGGCA ATGTACTTTG CGATGATGTT GCTAGTATTC ACAGTTTTGA TAAAGTAATG 413
GTGGGTGAAT TAGGAGAAGC TGTAGAGGGG ACAATAAACA TTGCTATGAA TTTGGAATCA 473
AATAATGTTG GTGTTGTATT AATTGGCGAA CAACTTCAAT TAAAGTGAAA TTAGAAAAAA 533
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCGGCC GCTCGAATTC CCTCTCT 580
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 87 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:
Ile Ile Glu Asp Phe Ala Arg Phe Gly Leu Glu Glu Ala Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Asn Asp Ile Val Ile Arg Trp Ile Arg Thr Asn Tyr Val Ala Tyr
20 25 30
Lys Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly
35 40 45
Ala Tyr Gly Asp Gly Gly Val Tyr Ala Ala Gln Thr Gly Phe Gly Trp
50 55 60
Thr Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Met Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu
65 70 75 80
Asp Leu Lys Ile Asp Cys Tyr
85
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2940 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iii) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Arabidopsis thaliana
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: BAC T19F06
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: join(119..648, 801..920, 1012..1127, 1211..1311,
1398..1507, 1590..1662, 1755..1916, 2020..2083,
2163..2262, 2358..2571, 2671..2754)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:
CTTATCCTCT TCTCCATTCA ATCTCTTATT CTCTTTTCCT TCCTTCATAT ACCTTAAACA 60
GCAACGTTCT CTGTTCTTCT TCTTCTTTTT CTTCCTCTGT TTTTCTTTCA CAACTTCC 118
ATG TTG GAC TCG GAC ACA GAC ACG GAC TCA GGT CCT GTG GTT GCA ACA 166
Met Leu Asp Ser Asp Thr Asp Thr Asp Ser Gly Pro Val Val Ala Thr
1 5 10 15
ACC AAA CTC GTC ACT TTC CTC CAG CGT GTG CAG CAC ACG GCA CTT CGA 214
Thr Lys Leu Val Thr Phe Leu Gln Arg Val Gln His Thr Ala Leu Arg
20 25 30
TCA TAC CCT AAA AAA CAA ACG CCT GAT CCC AAA TCC TAC ATT GAT CTA 262
Ser Tyr Pro Lys Lys Gln Thr Pro Asp Pro Lys Ser Tyr Ile Asp Leu
35 40 45
TCT CTC AAA CGT CCC TAC AGT CTC TCC ACC ATC GAA TCA GCC TTC GAT 310
Ser Leu Lys Arg Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Ile Glu Ser Ala Phe Asp
50 55 60
GAT CTC ACG AGC GAG TCA CAT GAC CAG CCA GTG CCA GTG GAG ACG CTT 358
Asp Leu Thr Ser Glu Ser His Asp Gln Pro Val Pro Val Glu Thr Leu
65 70 75 80
GAA AAG TTC GTC AAG GAA TAT TTT GAC GGT GCA GGG GAG GAT CTG CTG 406
Glu Lys Phe Val Lys Glu Tyr Phe Asp Gly Ala Gly Glu Asp Leu Leu
85 90 95
CAC CAC GAA CCA GTA GAT TTC GTC TCA GAT CCC TCC GGC TTC CTC TCC 454
His His Glu Pro Val Asp Phe Val Ser Asp Pro Ser Gly Phe Leu Ser
100 105 110
AAC GTG GAG AAC GAA GAA GTC AGA GAA TGG GCG CGT GAG GTA CAC GGT 502
Asn Val Glu Asn Glu Glu Val Arg Glu Trp Ala Arg Glu Val His Gly
115 120 125
CTT TGG AGA AAT CTG AGC TGC AGA GTC TCT GAC TCA GTA AGA GAG TCT 550
Leu Trp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Ser Asp Ser Val Arg Glu Ser
130 135 140
GCC GAC CGG CAC ACG CTT CTA CCG TTG CCG GAA CCG GTT ATC ATT CCC 598
Ala Asp Arg His Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Pro Val Ile Ile Pro
145 150 155 160
GGT TCG AGA TTC AGA GAA GTC TAT TAC TGG GAT TCT TAT TGG GTC ATC AA 648
Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Lys
165 170 175
GTAAGTCATT GTTTCCAACT TTTAAATCAC AAATCAAATG TTTTTTGTTT TTTGTTATTA 708
AATTGATTTC CTCTCCTTTC GTGTTGACTA CGTAACACAA GCTAACGTGT CAGTATGTCA 768
CCGTCTTGTA ACACGTGCTT TTGCACATGC AG A GGA CTT ATG ACG AGT CAA 819
Gly Leu Met Thr Ser Gln
180
ATG TTC ACT ACC GCC AAA GGT TTA GTG ACG AAT CTG ATG TCA CTT GTG 867
Met Phe Thr Thr Ala Lys Gly Leu Val Thr Asn Leu Met Ser Leu Val
185 190 195
GAG ACT TAT GGT TAC GCT TTG AAC GGT GCT AGA GCT TAT TAT ACT AAC 915
Glu Thr Tyr Gly Tyr Ala Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Thr Asn
200 205 210 215
AGA AG GTAACTACAA CTCTTTGTCT CTATTTGAGA TTTGTCAATA ACGGAGAAAA 970
Arg Ser
TAAAATGTTT ATGAGATTTA TAATGTTTTT ATTGTTACAA G C CAA CCA CCT TTG 1024
Gln Pro Pro Leu
220
TTG AGC TCC ATG GTC TAT GAA ATT TAT AAT GTG ACA AAA GAT GAA GAA 1072
Leu Ser Ser Met Val Tyr Glu Ile Tyr Asn Val Thr Lys Asp Glu Glu
225 230 235
CTT GTG AGG AAA GCA ATC CCT CTG CTT CTC AAA GAG TAC GAG TTT TGG 1120
Leu Val Arg Lys Ala Ile Pro Leu Leu Leu Lys Glu Tyr Glu Phe Trp
240 245 250
AAC TCA G GTTAGTTATT TAGTTAGATA GTTTAGTAAC ACTAGTTTGG TTTAATTCTT 1177
Asn Ser
255
AGATTGAATA TTGTTATGTT TTCTTCTTTG TAG GA AAA CAT AAA GTG GTT ATT 1230
Gly Lys His Lys Val Val Ile
260
CGA GAC GCT AAT GGT TAT GAT CAC GTT TTG AGC CGT TAT TAT GCT ATG 1278
Arg Asp Ala Asn Gly Tyr Asp His Val Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met
265 270 275
TGG AAC AAG CCA AGG CCT GAA TCC TCT GTT TTC GTATGTTTCT TGTCTATTTA 1331
Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Val Phe
280 285
CAAACATGTT TTCTAATTTT ATTGCGAGAA AAAATGTTGA CTCTTTCTCT TCATGTGTTA 1391
CCACAG GAT GAA GAA TCT GCT TCA GGG TTC TCG ACT ATG TTA GAG AAA 1439
Asp Glu Glu Ser Ala Ser Gly Phe Ser Thr Met Leu Glu Lys
290 295 300
CAA CGG TTC CAT CGA GAT ATA GCC ACG GCT GCT GAA TCA GGA TGC GAT 1487
Gln Arg Phe His Arg Asp Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ser Gly Cys Asp
305 310 315
TTC AGC ACG CGA TGG ATG AG GTTCGATTAC TTAACAAACT AATCAAGTGT 1537
Phe Ser Thr Arg Trp Met Arg
320 325
AGTTCATGTT ACTACTGTCA CTTATACTTA AATTCTCAAA ATGATAATGC AG G GAT 1593
Asp
CCT CCT AAT TTC ACA ACG ATG GCT ACA ACA TCA GTG GTT CCT GTT GAT 1641
Pro Pro Asn Phe Thr Thr Met Ala Thr Thr Ser Val Val Pro Val Asp
330 335 340
CTA AAT GTT TTT CTT CTC AAG GTCTCCACTT TTCTTGATCA TAATTCTCTT 1692
Leu Asn Val Phe Leu Leu Lys
345 350
TGATTACTGT TCTTGCACAT ATATTATGTA GATAAACGAT GAATGTTATC TGTTTACCGT 1752
AG ATG GAA CTC GAT ATA GCG TTC ATG ATG AAG GTT TCT GGA GAT CAA 1799
Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Met Met Lys Val Ser Gly Asp Gln
355 360 365
AAT GGT TCA GAC CGT TTT GTG AAA GCG TCA AAA GCG AGA GAG AAA GCG 1847
Asn Gly Ser Asp Arg Phe Val Lys Ala Ser Lys Ala Arg Glu Lys Ala
370 375 380
TTT CAA ACC GTG TTT TGG AAC GAG AAA GCA GGG CAA TGG CTG GAT TAC 1895
Phe Gln Thr Val Phe Trp Asn Glu Lys Ala Gly Gln Trp Leu Asp Tyr
385 390 395
TGG CTT TCC TCC AGT GGT GAG GTAAGCTGTT ACAGAATCTT TGAATACAAT 1946
Trp Leu Ser Ser Ser Gly Glu
400
TTCGGATTTC TTGATGAGGA AGCTTTTGAA AACGTGTCTG TGTCTTCAGG AATCTGAGAC 2006
ATGGAAGGCT GAG AAC CAA AAC ACC AAC GTC TTT GCG TCT AAC TTT GCA 2055
Asn Gln Asn Thr Asn Val Phe Ala Ser Asn Phe Ala
405 410 415
CCA ATC TGG ATT AAT TCC ATC AAT TCA G GTAAAGTATC TCTACTTGTC 2103
Pro Ile Trp Ile Asn Ser Ile Asn Ser
420 425
TATGTATACA CTTTATATGT TGAATTATGT ATTTGAACGT TTAATTTTGC AACATGTAG AT 2164
Asp
GAA AAT CTT GTC AAG AAA GTT GTG ACA GCT CTT AAG AAC TCA GGG CTC 2212
Glu Asn Leu Val Lys Lys Val Val Thr Ala Leu Lys Asn Ser Gly Leu
430 435 440
ATT GCT CCC GCT GGA ATC CTA ACT TCT TTG ACA AAC TCA GGA CAA CAA TG 2262
Ile Ala Pro Ala Gly Ile Leu Thr Ser Leu Thr Asn Ser Gly Gln Gln Trp
445 450 455
GTAAATGAAG CTTGCGGTTC AAGTTTCATT TGGAATCTTG AAATTTACTT CACTAAGCAT 2322
ATTATCTTGA TACATATGTG GTTGCACTGG AACAG G GAT TCT CCG AAT GGA TGG 2376
Asp Ser Pro Asn Gly Trp
460 465
GCA CCG CAA CAA GAG ATG ATC GTC ACA GGG CTC GGA AGA TCG AGT GTA 2424
Ala Pro Gln Gln Glu Met Ile Val Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ser Val
470 475 480
AAA GAA GCT AAA GAG ATG GCA GAG GAT ATT GCA AGG AGA TGG ATC AAA 2472
Lys Glu Ala Lys Glu Met Ala Glu Asp Ile Ala Arg Arg Trp Ile Lys
485 490 495
AGC AAC TAT CTT GTC TAC AAG AAA AGT GGG ACT ATA CAT GAG AAG CTC 2520
Ser Asn Tyr Leu Val Tyr Lys Lys Ser Gly Thr Ile His Glu Lys Leu
500 505 510
AAA GTT ACA GAG CTT GGT GAA TAT GGT GGT GGA GGA GAA TAT ATG CCA 2568
Lys Val Thr Glu Leu Gly Glu Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met Pro
515 520 525
CAG GTCAACTTTT CTTCTTCAAC TTTCTTTTGA TTTCATGAGT TTTAGGGGTC 2621
Gln
530
CAAATAAAAG TTTCTTGTAA TGTTGACTTC ATGTTTCCAA AAAATGCAG ACC GGA 2676
Thr Gly
TTC GGA TGG TCA AAT GGA GTT ATC TTA GCA TTC TTG GAG GAA TAT GGA 2724
Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Ile Leu Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Gly
535 540 545
TGG CCC TCT CAT CTT AGC ATT GAA GCC TAGATTTACT AAGTTTATTG 2771
Trp Pro Ser His Leu Ser Ile Glu Ala
550 555
AAAGTTAAAT AACGGAATTA GACATTTTAT GTTACAAAAA CTTTGGTAGA TTTGATCGTA 2831
GTGGATTATT TCTTGGGGTT TTCTGTCAGA ACGTTTTAGA GTTACAAATG TTTTATGACC 2891
AAATATTGTA TATGCAAATA AAGTTAAATA TAATAAGCAT CTAATGGTA 2940
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 557 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:
Met Leu Asp Ser Asp Thr Asp Thr Asp Ser Gly Pro Val Val Ala Thr
1 5 10 15
Thr Lys Leu Val Thr Phe Leu Gln Arg Val Gln His Thr Ala Leu Arg
20 25 30
Ser Tyr Pro Lys Lys Gln Thr Pro Asp Pro Lys Ser Tyr Ile Asp Leu
35 40 45
Ser Leu Lys Arg Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Ile Glu Ser Ala Phe Asp
50 55 60
Asp Leu Thr Ser Glu Ser His Asp Gln Pro Val Pro Val Glu Thr Leu
65 70 75 80
Glu Lys Phe Val Lys Glu Tyr Phe Asp Gly Ala Gly Glu Asp Leu Leu
85 90 95
His His Glu Pro Val Asp Phe Val Ser Asp Pro Ser Gly Phe Leu Ser
100 105 110
Asn Val Glu Asn Glu Glu Val Arg Glu Trp Ala Arg Glu Val His Gly
115 120 125
Leu Trp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Ser Asp Ser Val Arg Glu Ser
130 135 140
Ala Asp Arg His Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Pro Val Ile Ile Pro
145 150 155 160
Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile
165 170 175
Lys Gly Leu Met Thr Ser Gln Met Phe Thr Thr Ala Lys Gly Leu Val
180 185 190
Thr Asn Leu Met Ser Leu Val Glu Thr Tyr Gly Tyr Ala Leu Asn Gly
195 200 205
Ala Arg Ala Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser Gln Pro Pro Leu Leu Ser Ser
210 215 220
Met Val Tyr Glu Ile Tyr Asn Val Thr Lys Asp Glu Glu Leu Val Arg
225 230 235 240
Lys Ala Ile Pro Leu Leu Leu Lys Glu Tyr Glu Phe Trp Asn Ser Gly
245 250 255
Lys His Lys Val Val Ile Arg Asp Ala Asn Gly Tyr Asp His Val Leu
260 265 270
Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Val
275 280 285
Phe Asp Glu Glu Ser Ala Ser Gly Phe Ser Thr Met Leu Glu Lys Gln
290 295 300
Arg Phe His Arg Asp Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ser Gly Cys Asp Phe
305 310 315 320
Ser Thr Arg Trp Met Arg Asp Pro Pro Asn Phe Thr Thr Met Ala Thr
325 330 335
Thr Ser Val Val Pro Val Asp Leu Asn Val Phe Leu Leu Lys Met Glu
340 345 350
Leu Asp Ile Ala Phe Met Met Lys Val Ser Gly Asp Gln Asn Gly Ser
355 360 365
Asp Arg Phe Val Lys Ala Ser Lys Ala Arg Glu Lys Ala Phe Gln Thr
370 375 380
Val Phe Thr Asn Glu Lys Ala Gly Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Ser
385 390 395 400
Ser Ser Gly Glu Asn Gln Asn Thr Asn Val Phe Ala Ser Asn Phe Ala
405 410 415
Pro Ile Trp Ile Asn Ser Ile Asn Ser Asp Glu Asn Leu Val Lys Lys
420 425 430
Val Val Thr Ala Leu Lys Asn Ser Gly Leu Ile Ala Pro Ala Gly Ile
435 440 445
Leu Thr Ser Leu Thr Asn Ser Gly Gln Gln Trp Asp Ser Pro Asn Gly
450 455 460
Trp Ala Pro Gln Gln Glu Met Ile Val Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ser
465 470 475 480
Val Lys Glu Ala Lys Glu Met Ala Glu Asp Ile Ala Arg Arg Trp Ile
485 490 495
Lys Ser Asn Tyr Leu Val Tyr Lys Lys Ser Gly Thr Ile His Glu Lys
500 505 510
Leu Lys Val Thr Glu Leu Gly Glu Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met
515 520 525
Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Ile Leu Ala Phe Leu
530 535 540
Glu Glu Tyr Gly Trp Pro Ser His Leu Ser Ile Glu Ala
545 550 555

Claims (20)

  1. 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의한 체내 세포, 조직 또는 기관의 발생 및(또는) 조성의 변경 방법.
  2. 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의한 세포 내의 당분해 경로로의 탄소 유입의 억제 방법.
  3. 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의한 광합성의 자극 방법.
  4. 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의한 수용부 관련 활성의 자극 방법.
  5. 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의한 세포 또는 조직의 성장 억제 방법.
  6. 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의한 냉 감미화 (cold sweetening)의 억제 방법.
  7. 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의한 수확 후 사탕무의 인버타제의 억제 방법.
  8. 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의한 추대 (bolting) 유도 방법.
  9. 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의한 식물 생산량의 증가 방법.
  10. 제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 트레할라제 수준의 억제 효과가 세포내 트레할로스-6-포스페이트 수준의 증가에 의해 발생되는 방법.
  11. 내인성 트레할라제 수준의 억제에 의해 트레할로스-6-포스페이트의 세포내 가용성을 증가시키는 방법.
  12. 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 트레할라제 수준의 억제가 트레할라제 억제제의 존재 하에 세포, 조직, 기관 또는 식물의 배양 또는 성장의 결과인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 트레할라제 억제제가 상기 세포, 조직, 기관 또는 식물에 의해 흡수되기 적합한 형태의 발리다마이신 A를 바람직하게는 수용액 중의 100 nM 내지 10 mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1 mM의 농도로 포함하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 트레할라제 억제제가 상기 세포, 조직, 기관 또는 식물에 의해 흡수되기에 적합한 형태의 바퀴벌레 (페리플라네타 아메리카나 (Periplaneta americana))의 86 kD 단백질을 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포, 조직, 기관 또는 식물이 트레할라제 억제제에 대한 유전 정보를 함유하도록 유전학적으로 변화되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 트레할라제 억제제에 대한 유전 정보가 미국 바퀴벌레 (페리플라네타 아메리카나)의 86 kD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 트레할라제 억제제에 대한 유전 정보가 내인성 트레할라제를 코딩하는 유전자에 의해 생산된 RNA에 적어도 부분적으로 상보성인 RNA를 발현할 수 있는 DNA 서열을 포함하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 트레할라제 억제제에 대한 유전 정보가 내인성 트레할라제를 코딩하는 DNA 서열과 동일한 효소 트레할라제를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 방법.
  19. 제17항 또는 18항에 있어서, 내인성 트레할라제를 코딩하는 DNA 서열이 서열 4의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 서열 6의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 서열 8의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열 10의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 내인성 트레할라제를 코딩하는 DNA 서열이 서열 3의 뉴클레오티드 서열, 서열 5의 뉴클레오티드 서열, 서열 7의 뉴클레오티드 서열 및 서열 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
KR19997010092A 1997-05-02 1998-05-04 내인성 트레할라제 수준 억제에 의한트레할로스-6-포스페이트의 수준 변경에 의한 대사의 조절 KR20010012147A (ko)

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