CN1260001A - 通过抑制内源海藻糖酶水平来修饰海藻糖－6－磷酸水平从而调节代谢 - Google Patents

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Abstract

本发明在细胞代谢碳流调节领域内。已经发现导入细胞内糖类海藻糖－6－磷酸(T－6－P)有效来源的变化会诱导体内细胞、组织和器官的发育和/或组成的变化。这些变化可通过抑制内源海藻糖酶来诱导,该酶能够将海藻糖水解成两个葡萄糖组分。

Description

通过抑制内源海藻糖酶水平来修饰 海藻糖-6-磷酸水平从而调节代谢
发明领域
糖酵解是文献生化细节中最早描述的代谢过程之一。虽然生物中大致的碳水化合物流动是已知的并且所有糖酵解途径的酶已经阐明，但是通过刺激糖酵解来决定代谢诱导的信号还不清楚。已经提出了多个假说，特别是基于酵母中情况的假说，但是没有一个得到毫无疑问地证实。
对碳水化合物分配方向的影响不仅直接影响细胞糖酵解和碳水化合物贮存的过程，而且也可以用于影响次级或衍生过程如细胞分裂、生物量产生和贮存化合物的积累，由此决定生长和产量。
尤其在植物中，组织特性通常直接受碳水化合物存在的影响，并且控制碳水化合物的分配可带来实质不同。
植物的生长、发育和产量依赖于该植物在光合作用过程中可从CO2固定得到的能量。
光合作用主要发生于叶片并且以更低的程度发生于茎中，而其它植物器官如根、种子或块茎基本上对光同化过程不起作用。这些组织的生长和营养完全依赖于光合作用活性器官。那么这就意味着存在源自光合作用的产物(总称为“光合产物”)向植物无光合作用活性部分的流动。
将光合作用活性部分命名为“源”并且将其定义为光合产物的净输出者。将光合作用无活性的部分命名为“库”  并且将其定义为光合产物的净输入者。
一般认为植物中光合作用的效率以及碳水化合物的分配均是至关重要的。新的正在发育的组织如新叶片或其它部分如根和种子完全依赖于源中的光合作用。影响碳水化合物分配的可能性将对植物表型如其重量、节间距、叶片的大小和形状以及根系的大小和结构有重要影响。
此外，光同化作用产物的分布对植物生物量和产物的产量极为重要。一个实例是上个世纪对小麦的开发。其光合能力没有显著改变但小麦谷物的产量大大增加，即收获指数(可收获生物量/总生物量)增加。根本原因是通过常规育种改变了库-到-源的比例，使得可收获的库即种子部分增加。然而，调节同化作用产物分布以及随后库与源形成的机制仍不清楚。据认为此机制在碳水化合物代谢途径及其调节的某些环节起作用。在最近的研究中，越来越明确己糖激酶在代谢物信号形成和代谢流控制中起主要作用。已经提出调节己糖激酶活性的众多机制(Gram等，(1994)，植物细胞6：761；Jang & Sheen(1994)，植物细胞6：1665；Rose等，欧洲生化杂志199，511-518，1991；Blazquez等，(1993)，FEBS329，51；Koch，植物生理学和植物分子生物学年鉴(1996)47，509；Jang等，(1997)，植物细胞9，5)。已提出的酵母中己糖激酶调节的这些理论之一提到海藻糖及其相关单糖(Thevelein & Hohmann(1995)，TIBS 20，3)。然而，难以看到这将是普遍的机制，因为据信海藻糖合成只限于某些物种。WO 97/42326表明同时在海藻糖合成途径中的磷酸海藻糖合酶和磷酸海藻糖磷酸酶在转化入植物时可诱导代谢变化。在该申请中显示，细胞内海藻糖-6-磷酸水平被认为是关键的环节。
仍然存在了解其它机制的需要，这些机制可影响海藻糖-6-磷酸并且因此可指导体内细胞、组织和器官的发育和/或组成的变化。发明概述
本发明涉及通过抑制内源海藻糖水平来修饰体内细胞、组织或器官的发育和/或组成的方法。这些方法部分是通过抑制内源海藻糖水平来抑制细胞糖酵解方向中碳流的方法、通过抑制内源海藻糖水平刺激光合作用的方法、通过抑制内源海藻糖水平刺激库相关活性的方法、通过抑制内源海藻糖水平来抑制细胞或组织生长的方法、通过抑制内源海藻糖水平而防止冷冻甜化的方法、通过抑制内源海藻糖水平来抑制收获后甜菜中转化酶的方法、通过抑制内源海藻糖水平诱导抽苔的方法和通过抑制内源海藻糖水平增加植物产量的方法。可以设想对内源海藻糖水平的抑制效应是由细胞内海藻糖-6-磷酸水平的增加引起。因此，本发明也提供通过抑制内源海藻糖水平来增加细胞内海藻糖-6-磷酸有效来源的方法。
对内源海藻糖水平的抑制是在海藻糖酶抑制剂存在的情况下培养或生长所述细胞、组织、器官或植物的结果。该抑制剂可以是以适于所述细胞、组织、器官或植株吸收的形式的有效霉素A，优选地其中水溶液中有效霉素A浓度为100nM到10mM，更优选地0.1到1mM。另一选择是使用以适于所述细胞、组织、器官或植株吸收的形式的86kD美洲大蠊(periplaneta americana)蛋白作为内源海藻糖水平的抑制剂。
提供带有海藻糖抑制剂遗传信息的细胞、组织、器官或植株也是本发明的一部分。这可通过用编码美洲大蠊(periplaneta americana)86kD蛋白的基因转化来实现。选择性地，用能表达与编码内源海藻糖酶的基因所产生的RNA至少部分互补的RNA的DNA序列转化或者用编码海藻糖酶的DNA序列转化，该序列与编码内源海藻糖酶的DNA序列一致。
具体地，编码内源海藻糖酶的DNA序列选自包括编码SEQ ID NO：4蛋白的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：6蛋白的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：8蛋白的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：10蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列组，更具体地，编码内源海藻糖酶的DNA序列选自包括SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO：7中所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列的核苷酸序列组。定义
-  己糖激酶活性是存在于催化己糖转化为己糖-6-磷酸的反应的细胞中的酶活性。己糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖或任何其它C6糖。已认识到存在多种同功酶，它们都可能在所述生化反应中起部分作用。由于催化此反应，己糖激酶成为己糖(葡萄糖)信号转导中的关键酶。
-  己糖信号是细胞感受己糖(葡萄糖)有效来源的调节机制。
-  糖酵解是将葡萄糖转化成丙酮酸并同时产生ATP的反应系列。
-  源物质的贮存为一个这样的过程，其中原始产物葡萄糖代谢成适于在细胞或特定组织中贮存的分子形式。这些形式可以为歧化形式(divers)。在植物界中贮存最可能以碳水化合物和多聚碳水化合物形式发生如淀粉、果聚糖和纤维素，或者作为更简单的单糖或双糖如果糖、蔗糖和麦芽糖；以油的形式如花生油或油酸油以及以蛋白形式如cruciferin、napin和油籽油菜种子中的贮存蛋白。在动物细胞中也形成多聚碳水化合物如糖元形成，并且将大量富含能量的碳化合物转化为脂肪和脂类。
-  生物量为生物物质的总量。附图描述
图1.带有新霉素-磷酸转移酶基因(NPTII)作为选择性标记的质粒pVDH275的图示，NPTII侧翼为35S花椰菜花叶病毒启动子(P35S)和终止子(T35S)；包含豌豆质体蓝素启动子(pPCpea)和胭脂氨酸合酶终止子(Tnos)的表达元件盒；右端(RB)和左端(LB)T-DNA边界序列和细菌卡拿霉素抗性(KanR)标记基因。
图2.在pMOG1027(35S as-海藻糖酶)转基因马铃薯植株块茎中海藻糖的积累。
图3.22株独立野生型马铃薯(S.tuberosum)克隆的块茎产量。
图4.与野生型马铃薯株系相比，pMOG1027(35S as-海藻糖酶)和pMOG1027(845-11/22/28)(35S as-海藻糖酶pat TPS)转基因马铃薯株系的块茎产量。
图5.与野生型马铃薯株系相比，pMOG1027(35S as-海藻糖酶)和pMOG1027(845-11/22/28)(35S as-海藻糖酶pat TPS)转基因马铃薯株系的淀粉含量。所有所示株系的序列与图4相同。
图6.与野生型马铃薯株系相比，pMOG1028(35S as-海藻糖酶)和pMOG1028(845-11/22/28)(35S as-海藻糖酶pat TPS)转基因马铃薯株系的产量。
图7.与图6中所示的野生型马铃薯株系相比，pMOG1092(PC as-海藻糖酶)转基因马铃薯株系的产量。
图8.与图6中所示的野生型马铃薯株系相比，pMOG1130(PC as-海藻糖酶PC TPS)转基因马铃薯株系的产量。发明详述
现已经发现通过抑制内源海藻糖酶水平来修饰体内细胞、组织和器官的发育和/或组成从而诱导导致海藻糖形成的合成途径中的变化是可能的。对内源海藻糖酶水平的抑制优选地通过使用产生与内源海藻糖酶mRNA反义的mRNA的DNA构建体转化细胞来实施。海藻糖酶的抑制导致糖酵解方向中碳流的抑制、光合作用的刺激作用、库相关活性的刺激作用和能源贮存的增加。
本发明也提供了修饰植物中源-库关系和能源分配的能力。植物的完整碳机制包括源组织中的同化物产量和源组织中的利用可以得到修饰，这可导致收获产品生物量产率的增加。用这种方法，可以实现增加产量以及提高收获指数和产品质量的可能。源组织中的这些改变可通过例如增加光合产物输出而导致库组织中的变化。相反，库组织中的变化可导致源组织中的变化。
在生物细胞器、组织或其它部分中的特异性表达使上述的基本效应针对特定局部应用。此特异性表达可通过将海藻糖酶反义基因置于特异性启动子控制下来实现。
通过使用特异性启动子，建立时间差异也是可能的。为了此目的，可使用在植株部分器官发生的某一阶段特异性有活性的启动子。用这种方式，首先影响将要发育的器官的量并且然后使这些器官充满贮存物质如淀粉、油或蛋白是可能的。
选择性地，可以使用可诱导的启动子以选择性启闭本发明基因的表达。诱导可通过例如病原体、逆境、化学或光/黑暗刺激来实现。
本发明涉及代谢可通过抑制内源海藻糖酶水平进行体内修饰这样一发现。
这些修饰最可能通过改变T-6-P水平，继而影响己糖激酶的信号转导功能来建立。已经证明经过反应形成葡萄糖-6-磷酸的己糖激酶的流量增加(即葡萄糖量的增加)抑制植物中的光合活性。此外，经过己糖激酶的流量增加将不仅刺激糖酵解，而且刺激细胞分裂活性。碳代谢海藻糖-6-磷酸调节的理论
在正常植物细胞中，碳水化合物的形成发生于光合作用过程中，其中固定CO2并还原成磷酸化己糖且以蔗糖为终产物。通常将此蔗糖从细胞运出至其它细胞或组织，这些细胞或组织通过吸收此蔗糖可利用碳水化合物作为结构物质用于其代谢或能够贮存碳水化合物如淀粉。在这方面，在植株中，能光合作用并且因此产生光合产物的细胞命名为源，而消耗或贮存碳水化合物的细胞称为库。
在动物和大多数微生物细胞中无光合作用发生，并且碳水化合物不得不通过从糖类直接吸收(例如酵母和其它微生物)或通过消化碳水化合物(动物)从外部来源获取。在这些生物中碳水化合物运输通常以葡萄糖形式进行，葡萄糖被主动运送通过细胞膜。
进入细胞后，代谢途径中的一个起始步骤是己糖激酶催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸。已经证实，在植物中由己糖激酶(HXK)磷酸化的糖类控制参与光合作用的基因的表达(Jang & Sheen(1994)，植物细胞，6，1665)。因此，已经提出HXK可能具有双重作用并且并作用为碳水化合物介导的基因表达调节的关键感受器和信号介质。据信该调节一般向细胞发出有关起始产物即葡萄糖的有效来源信号。通过导入影响T-6-P水平的TPS和TPP观察到类似效应。此外，已经证明体外T-6-P水平影响己糖激酶活性。通过增加T-6-P水平使细胞接受碳水化合物输入不足的信号。相反，T-6-P水平的下降导致有足够葡萄糖的信号，从而引起光合作用的负调节：它发出信号即糖酵解的底物和随后供应细胞生长和细胞分裂过程的能量可以充足地得到。认为该信号是由经过己糖激酶的流量增加激发的(Van Oosten，1996年4月19日在RijksUniversiteit的公开报告)。
己糖激酶在植物中发信号可通过调节海藻糖-6-磷酸水平而加以调节的理论将意味着所有植物需要能产生和分解信号分子海藻糖-6-磷酸的酶系统存在。尽管海藻糖常见于多种真菌、细菌、酵母和藻类以及一些无脊椎动物，但是仅仅发现很有限范围的维管植物能合成该糖(Elbein(1974)，碳水化合物化学与生物化学进展30，227)。一个至今仍未理解的现象是尽管明显缺乏海藻糖合成酶，但看来所有植物含有海藻糖酶，即能将海藻糖分解为2个葡萄糖分子的酶。
通过此处列出的使用海藻糖酶抑制剂如有效霉素A的实验或用反义海藻糖酶转化的实验获得了海藻糖代谢途径存在的间接证据。
这些数据表明，与目前观念相反，大多数植物的确含有编码使它们能合成T-6-P的磷酸海藻糖合酶的基因。如通过表达TPS的植物中海藻糖的积累所证实的，植物也含有特异性或非特异性磷酸酶，能使T-6-P脱磷酸成为海藻糖。在所有植物中海藻糖酶的存在可能是为了实现海藻糖的更新。
在酵母中，葡萄糖诱导的信号的主要作用是将代谢从糖异生/呼吸模式转变成发酵模式。多个信号通路参与此现象(Thevelein和Hohamann，(1995)TIBS 20，3)。除了己糖激酶信号的可能作用外，已证明葡萄糖活化RAS-环AMP(cAMP)通路。葡萄糖对RAS-cAMP通路的活化需要葡萄糖磷酸化，但无须进一步的葡萄糖代谢。到目前为止，已证明此通路活化海藻糖酶和6-磷酸果糖-2-激酶(继而刺激糖酵解)，而果糖-1，6-二磷酸酶受cAMP依赖性蛋白磷酸化的抑制(继而抑制葡糖异生作用)。因此可以设想该信号转导途径及其可带来的代谢效应平行作用于已表明受海藻糖-6-磷酸水平影响的己糖激酶信号通路。
在植物中，通过表达TPP酶(或抑制TPS酶)降低细胞内海藻糖-6-磷酸浓度而产生的“大量”信号将对所有细胞系统发出信号以增加糖酵解碳流并且抑制光合作用。这方面内容详细显示于WO 97/42326中，其中例如实验2中描述表达TPP酶的转基因烟草植物具有增加的叶片大小、增加的分枝和叶绿素含量的下降。然而，由于此“大量”信号在缺乏充足葡萄糖供应时产生，故细胞中的碳水化合物库迅速耗竭。
因此，假设人为的“大量”信号继续维持，那么碳水化合物的减少将最终限制生长和细胞分裂，即细胞将用光其所有贮存的碳水化合物并将处于“饥饿”状态。因此，形成具有较低量贮存碳水化合物的叶片。另一方面，表达带有编码增加T-6-P细胞内含量的TPS的基因的构建体的植物表现叶片大小减小，同时叶片也变为更深的绿色，并且含有增加量的叶绿素。
如本发明中所述，表达as-海藻糖酶的转基因植物表现类似现象如墨绿色叶片、增加的产量，正如表达TPS基因时所观察到的情况。抑制内源海藻糖酶水平将终止海藻糖的降解，并且由于海藻糖浓度的增加，TPP酶可能受到抑制，从而导致T-6-P水平的增加。这将解释为何抑制海藻糖酶具有与TPS过量表达相似的效应。而且看来as-海藻糖酶在双构建体中的表达增强了TPS表达所引起的效应。已经证明海藻糖酶活性存在于例如植物、昆虫、动物、真菌和细菌中，但是海藻糖仅仅在有限数目的物种中积累。
到目前为止，尽管海藻糖酶存在于几乎所有植物种类中，但是其在植物中的作用仍然是未知的。已提出它参与植物病原体相互作用和/或植物防御反应。我们分离了马铃薯海藻糖酶基因并证明对马铃薯叶片和块茎组织中海藻糖酶活性的抑制导致块茎产量的增加。as-海藻糖酶在番茄中的果实特异性表达与TPS表达一起明显改变果实发育。
海藻糖酶的抑制基本上可以用2种方式进行：通过外源施用海藻糖酶抑制剂和通过内源产生海藻糖酶抑制剂，例如通过用编码海藻糖酶抑制剂的DNA序列转化植物。
根据本发明的第一个实施方案，将海藻糖酶抑制剂外源施用给植物系统。可用于根据本发明所述的方法的海藻糖酶抑制剂实例有小单胞菌菌株SANK62390产生的trehazolin(Ando等，1991，抗生素杂志44，1165-1168)、Validoxylamine A，B，G、D-gluco-DihydrovalidoxylamineA、L-ido-Dihydrovalidoxylamin A、Deoxynojirimycin(Kameda等，1987，抗生素杂志40(4)，563-565)、5epi-trehazolin(Trehalostatin)(Kobayashi Y.等，1994，抗生素杂志47.932-938)、栗籽豆素(castanospermin)(Salleh H.M.& Honek J.F.1990年3月，FEBS 262(2)，359-362)和来自美洲大蠊(Periplaneta americana)的86kD蛋白(Hayakawa等，1989，生物化学杂志264(27)，16165-16169)。
根据本发明优选的海藻糖酶抑制剂是有效霉素A(1，5，6-三脱氧-3-o-β-吡喃葡糖基-5-(羟甲基)-1-[[4，5，6-三羟基-3-(羟薄荷基)-2-环己烯-1-基]氨基]-D-手-肌醇)。用有效霉素A抑制愈伤组织匀浆物和各种被子植物悬浮培养物中海藻糖酶的活性由Kendall等，于1990年公开于植物化学29，2525-2582中。
将海藻糖酶抑制剂以适于植物、植物部分或植物细胞培养物吸收的形式施用给植物、植物部分或植物细胞培养物。一般地海藻糖酶抑制剂是以100nM到10mM之间、优选地0.1到1mM之间活性成分的水溶液形式。水溶液可以通过喷洒于叶片、浇灌、将其加入水性培养物的培养基中而施用给植物或植物部分。有效霉素的另一适当制剂为solacol，一种商业上可得到的农业制剂(Takeda化学工业公司，东京)。
选择性地或者除了用外源施用海藻糖酶抑制剂外，海藻糖酶抑制剂可通过导入编码此抑制剂的遗传信息来提供。这种内在海藻糖酶抑制剂的一种形式可以由引起RNA合成的遗传构建体组成，其中RNA与编码海藻糖酶的内源RNA充分互补从而与所述内源转录本相互作用，由此抑制所述转录本的表达。这种所谓的“反义方法”在本领域内是众所周知的(特别参见EP 0 240 208A和公开于WO 95/01446中有关抑制SPS的实施例)。优选的是使用同源反义基因，因为这些基因比异源基因更有效。阻断不必要酶活性合成的另一可选方法是向植物宿主基因组导入存在于宿主植物中的内源基因的另一拷贝。通常观察到这一额外的基因拷贝使内源基因沉默：此效应在文献中称为共抑制效应或共抑制。增加底物有效来源的方法细节在WO 95/01446的实施例中提供，在此引用作为参考。
抑制内源海藻糖酶水平的另一种方法是通过突变编码海藻糖酶的内源基因。有效的突变可通过定点诱变导入突变的基因序列来完成(例如在WO 91/02070中所述的)。
根据本发明的另一实施方案，尤其是可将植物进行遗传改变从而在植物的特定部分产生和积累上述的反义基因。优选的表达位点为植物的叶片和贮存部分。特别地，马铃薯块茎认为是适宜的植物部分。实现马铃薯小块茎和块茎中选择性表达的优选启动子可从马铃薯patatin基因开放阅读框的上游区域得到。
用于特异性表达的另一种适宜启动子是对植物光同化作用部分特异的质体蓝素启动子。此外，可以认为植物部分中的特异性表达可产生对植物生长和繁殖或对所述植物的经济使用有利的效应。用于此方面的启动子实例有：果实特异性E8-启动子(EP 0 409 629)和2A11启动子(vanHaaren和Houck(1993)，植物分子生物学，221，625)；种子特异性cruciferin启动子、napin启动子和ACP启动子；PAL启动子；花特异性查尔酮异构酶启动子；叶片特异性SSU启动子和铁氧还蛋白启动子；根特异性TobRb7启动子，韧皮部特异性RolC启动子以及分生组织特异性的HMG2启动子(Enjuto等，(1995)，植物细胞7，517)和水稻PCNA启动子(Kosugi等，(1995)，植物杂志7，877)。
本发明的另一选择是使用可诱导的启动子。已知有可以由病原体、逆境、化学或光/暗刺激诱导的启动子。可以想象为了诱导特定的现象如抽芽、抽苔、种子结实、贮存组织的充实，通过外部刺激诱导本发明基因活性是有利的。这使植物正常发育和所需现象可诱导性的优势控制成为可能。适用于这种方案的启动子有描述于DE 4446342(真菌和生长素可诱导的PRP-1)、WO 96/28561(真菌可诱导的PRP-1)、EP 0 586 612(线虫可诱导的)、EP 0 712 273(线虫可诱导的)、WO 96/34949(真菌可诱导的)、PCT/EP96/02437(线虫可诱导的)、EP 0 330 479(逆境可诱导的)、US 5,510,474(逆境可诱导的)、WO 96/12814(冷冻可诱导的)、EP 0 494 724(四环素可诱导的)、EP 0 619 844(乙烯可诱导的)、EP 0 337 532(水杨酸可诱导的)、WO 95/24491(硫胺素可诱导的)和WO 92/19724(光可诱导的)的病原体可诱导的启动子。其它化学可诱导的启动子描述于EP 0674 608、EP 637 339、EP 455 667和US 5,364,780中。
宿主细胞可以是任何己糖激酶信号的改变可以通过T-6-P水平的改变来实现的细胞。因此，所有真核细胞可用于本发明。从经济角度考虑，最适于代谢化合物合成的细胞最适于本发明。这些生物有植物、动物、酵母、真菌。然而，也见到在特定动物细胞(如胰脏β细胞和脂肪细胞)中的表达。
种子植物中优选的植物宿主是被子植物，尤其是特别包括茄科作为代表性科的双子叶植物和特别包括禾本科作为代表性科的单子叶植物。在本发明上下文中定义的适宜宿主植物包括含有通过抑制内源海藻糖酶水平而改变的T-6-P水平的植物(以及所述植物的部分和细胞)及其子代。根据本发明的作物包括有花作物如花椰菜(Brassica oleracea)、洋蓟(Cynara scolymus)，插花如康乃馨(dianthus caryophyllus)、玫瑰(Rosa spp)、菊花、矮牵牛花、六出花、幅郎花、唐菖蒲、百合(Lilium spp)、忽布花(humulus lupulus)、花茎甘蓝，盆载植物如杜鹃花、白杜鹃(Azalia)、大丽花、秋海棠、倒挂金钟、牻牛儿苗等；水果类如苹果(Malus，例如domesticus)、香蕉(Musa，例如Acuminata)、美洲李(Prunusameriaca)、橄榄(Oliva sativa)、菠萝(Ananas comosus)、椰子(Cocosnucifera)、芒果(Mangifera indica)、猕猴桃、油梨(Persea americana)、浆果(如currant、茶藨子属，例如红核)、李属植物(如甜李、樱桃属，例如avium)、黄瓜属植物(Cucumis，例如sativus)、葡萄属(Vitis，例如酿酒葡萄)、柠檬(Citrus limon)、甜瓜(Cucumis melo)、芥属(Sinapisalba和Brassica nigra)、坚果(如胡桃Juglans，例如regia；花生Arachishypogeae)、柑橘(Citrus，例如maxima)、桃(Prunus，例如persica)、梨(Pyra，例如Communis)、胡椒(Solanum，例如capsicum)、李(Prunus，例如domestica)、草莓(Fragaria，例如moschata)、番茄(Lycopersicon，例如esculentum)；叶子植物如紫苜蓿(Medicago sativa)、卷心菜(如Brassica oleracea)，菊苣(Cichoreum，例如endivia)、韭菜(Alliumporrum)、莴苣(Lactuca sativa)、菠菜(Spinacia oleraceae)、烟草(Nicotiana tabacum)；草本植物如羊茅、早熟禾、黑麦草(如Lolium perene，Lolium multiflorum和Arrenatherum spp.)、舒适草(amenity grass)、草皮、海藻、菊苣(Cichorium intybus)、茶(Thea sinensis)、旱芹、绉叶欧芹(Petroselinum crispum)、chevil和其它草本植物，根类植物如竹芋(Maranta arundinacea)、甜菜(Beta vulgaris)、胡萝卜(Daucuscarota)、木薯(Manihot esculenta)、人参(Panax ginseng)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、薯蓣(Dioscoreaesculenta)、番薯(Ipomoea batatas)、芋；种子植物如菜豆(Phaseolusvulgaris)、豌豆(Pisum sativum)、大豆(Glycin max)、小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryzasativa)、矮菜豆和蚕豆(Vicia faba)、棉花(Gossypium spp.)、咖啡(Coffea arabica和C.canephora)；块茎植物如甘蓝(Brassicaoleraceae)、马铃薯(Solanum tuberosum)；鳞茎植物如洋葱(Alliumcepa)、亚实基隆葱、郁金香(Tulipa spp.)、黄水仙(Narcissus spp.)、大蒜(Allium sativum)；茎杆植物如栓皮栎、甘蔗(Saccharum spp.)、西沙尔麻(Sisal spp.)、亚麻(Linum vulgare)、黄麻；乔木如橡胶树、栎树(Quercus spp.)、山毛榉(Betula spp.)、赤杨(Alnus spp.)、水曲柳(Acer spp.)、榆树(Ulmus spp.)、棕榈树、蕨类植物、长春藤等。
酵母和真菌或动物细胞的转化可用常规已知的载体系统如pBluescript、pUC以及病毒载体系统如RSV和SV40通过常规现有转化技术来完成。
只要基因在所述植物细胞中表达，将基因导入受体植物细胞的方法并非关键。
尽管本发明的有些实施方案目前是不可实施的，例如因为有些植物种类仍然难以进行遗传转化，但是在这些植物种类中实施本发明仅仅是时间问题而不是原则问题，因为遗传转化的可行性对于构成本发明实施方案的基础并无关系。
对众多植物种类包括双子叶以及单子叶植物，植物种类的转化目前是常规的。原则上，任何转化方法可用于将根据本发明所述的嵌合DNA导入适当祖细胞中。这些方法可适当选自对原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens等(1982)，自然296，72；Negrutiu等(1987)，植物分子生物学8，363，原生质体电穿孔(Shillito等(1985)生物/技术3，1099)，显微注射入植物材料(Crossway等(1986)，分子和普通遗传学202)，对各种植物材料进行的(DNA或RNA包被的)粒子轰击(Klein等，(1987)，自然327，70)，用(非整合型)病毒侵染，通过浸润成熟植物在植物中进行根瘤土壤杆菌介导的基因转移或者转化成熟花粉或小孢子(EP 0 301 316)等。根据本发明所述的优选方法包括土壤杆菌介导的DNA转移。尤其优选的是用EP A 120 516和美国专利4,940,838中公开的所谓双元载体技术。
虽然单子叶植物被认为有些更难以进行遗传转化，但是它可以转化并且可以从转化的细胞或胚胎或其它植物材料再生出可育的转基因植物。目前，优选的单子叶植物转化方法是微粒轰击胚、外植体或悬浮细胞和直接DNA吸收或(组织电穿孔)(Shimamoto等(1989)，自然338，274-276)。通过微粒轰击将编码膦丝菌素乙酰转移酶(使除草剂膦丝菌素失活的酶)的吸水链霉菌bar基因导入玉米悬浮培养物的胚发生细胞可获得转基因玉米植株(Gordon-kam(1990)，植物细胞，2，603)。已有报道将遗传物质导入其它单子叶作物如小麦和大麦的糊粉原生质体中(Lee(1989)，植物分子生物学13，21)。通过选择胚发生愈伤组织建立胚发生悬浮培养物，小麦植株已从胚发生悬浮培养物得到再生(Vasil(1990)生物/技术8，429)。与这些植物的转化系统结合使本发明能应用于单子叶植物。
单子叶植物包括商业上重要的作物如水稻和玉米也可通过土壤杆菌菌株进行DNA转移(见WO 94/00977；EP 0 159 418 B1；Gould等(1991)植物生理学95，426-434)。
已知实际上所有植物可以从培养的细胞或组织再生。这意味着再生在植物物种与物种间不同，但是一般首先提供转化的原生质体悬浮液或含有转化外植体的培养平板。芽可以直接诱导或者间接通过器官发生或胚发生从愈伤组织诱导并且随后生根。除了选择性标记，培养基将一般含有各种氨基酸和激素如生长激素和细胞分裂素。将谷氨酸和脯氨酸加入培养基尤其对诸如玉米和紫苜蓿的物种有利。有效的再生将依赖于培养基、基因型和载培史。如果这3个变量得到控制，再生一般是能繁殖和可重复的。转化基因序列稳定掺入转基因植物后，通过有性杂交可将由这些基因赋予的特征转移给其它植株。依据待杂交的物种，可以使用众多标准育种技术中的任何技术。
控制植物可表达基因(包括标记基因)表达的DNA序列如转录起始区、增强子、非转录前导序列等可以来自任何在植物细胞中表达的基因。同时值得注意的是结合不同启动子功能部分的杂交启动子或其合成相等物。除了组成性启动子外，可诱导启动子或以其表达方式如发育或细胞特异性受到其它调节的启动子可以用于控制根据本发明所述的可表达基因的表达。
为了选择或筛选转化细胞，优选的是包含与待转移入植物细胞的根据本发明所述的植物可表达基因连接的标记基因。在植物转化中适当标记基因的挑选在本领域一般技术人员的知识范围之内。一些常用标记基因的实例有赋予对卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因(EP-B 131623)、赋予对从谷胱甘肽衍生的除草剂抗性的来自大鼠肝脏的胱光甘肽-S-转移酶基因(EP-A 256 223)、赋予对谷氨酰胺合成酶抑制剂如膦丝菌素过量表达抗性的谷氨酰胺合成酶基因、赋予对选择试剂膦丝菌素抗性的绿色产色链霉菌乙酰转移酶基因(EP-A 275 957)、赋予对N-膦酰甲基甘氨酸耐受性的编码5-烯醇莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因、赋予对Bialaphos抗性的bar基因(例如WO 91/02071)、赋予对cyanamide抗性的cah基因等。只要其与所选植物结合是有功能的(即有选择性)，则标记的实际挑选并非关键。
标记基因和目的基因不一定必须互相连接，因为共转化未连接的基因(美国专利4,399,216)也是植物转化的有效方法。
用于转化的优选植物材料，尤其对于双子叶作物，是容易转化并且具有良好再生能力的叶盘(Horsch等(1985)，科学227，1229)。
可以设想在动物或人类中通过抑制受影响细胞的内源海藻糖酶水平可以克服由代谢缺陷造成的疾病。在人类细胞中，许多肿瘤细胞增加的葡萄糖消耗很大程度上依赖于己糖激酶的过量表达(Rempel等(1996)FEBS通讯385，233)。可以设想葡萄糖进入癌细胞代谢的流量可能受海藻糖-6-磷酸合成酶表达和抑制内源海藻糖酶的影响。同时已证明己糖激酶活化通过cAMP/PKA(蛋白激酶A通路)增强。因此，该信号转导通路的失活可能影响葡萄糖的吸收和肿瘤的增殖。已例如在兔肾皮质细胞中证实哺乳动物细胞中存在能合成海藻糖-6-磷酸和海藻糖以及降解海藻糖的酶活性(Sacktor(1968)美国国家科学院院报60，1007)。
正如上面已经认识到的，例如通过导入反义海藻糖酶构建体而抑制内源海藻糖酶水平也将刺激与导入TPS类似的效应。已经发现这些效应是T-6-P含量的增加，这导致矮化或生长延缓(尤其在TPS高表达时)、更尖形状叶片的形成、由于叶绿素增加所致的更深颜色和淀粉含量的增加。此外，使用TPS和as-海藻糖酶的双构建体增强单一构建体的效应。
T-6-P水平的增加也导致贮存碳水化合物如淀粉和蔗糖的增加。那么这将意味着其中贮存碳水化合物的组织将能够贮存更多的物质。这可通过实施例加以说明，这些实施例表明在植物中形成增加生物量的贮存器官如块茎和甜菜中增粗的根(蔗糖贮存)。
这些效应对其非常有利的作物有马铃薯、甜菜、胡萝卜、菊苣和甘蔗。
在马铃薯中其它经济上重要的效应是用编码TPS基因(产生T-6-P的增加)的DNA序列转化后，已发现可溶性糖含量下降，即使在低温条件(4℃)下收获和贮存块茎之后也是这样。虽然一般来说较低温的贮存对于防止早发芽是必要的，但是这将导致马铃薯过度甜化。还原性糖含量的减少对食品工业至关重要，因为甜化的马铃薯块茎材料不适于加工，这是因为还原性糖与氨基酸之间将要发生Maillard反应而导致变褐。
以相同方式，通过用编码TPS酶的多核苷酸转化甜菜也可得到对转化酶的抑制。收获后抑制甜菜中的转化酶活性在经济上是很重要的。
在果实和种子方面，也可以改变贮存。这不仅导致了增加的贮存能力，而且导致贮存化合物组成的变化。种子产量提高尤为重要的作物有玉米、水稻、谷物、豌豆、油籽油菜、向日葵、大豆和豆科植物。此外，改变贮存的碳水化合物的含量和组成对于所有结果实的植物是重要的。尤其对于果实来说，贮存产物的组成导致其硬度和坚固性的变化，这对于软果实如番茄、香蕉、草莓、桃、浆果和葡萄尤为重要。
与所见的T-6-P水平下降的效应相反，T-6-P水平的增加降低叶片中蛋白质/碳水化合物的比例。此效应对叶用作物如饲料草和紫苜蓿至关重要。此外，虽然叶片具有在舒适草中至关重要的减少的生物量，但是，更重要的是，它们具有相对增加的能量含量。该特性对于作物如洋葱、欧洲韭和青贮饲料玉米特别有利。
此外，种子的存活也受细胞内可利用的T-6-P水平的影响。
在植株的一部分较低水平的T-6-P结合该植株另一部分增加的T-6-P水平可协同增加上述的效应。在发育过程中通过使用特异性启动子依次表达引起所述增加或减少的基因也是可能的。最近，通过将编码序列置于可诱导启动子控制之下而诱导任意一个相关基因的表达也是可能的。可以认为所述应用方法的组合对于本领域技术人员是显而易见的。
本发明通过下面实施例得到进一步说明。应该强调这些实施例表示本发明的具体实施方案，但是应当清楚本发明也涵盖这些实施例的变化形式和其它植物或表达系统的使用。实验DNA操作
所有DNA操作(从大肠杆菌分离DNA、限制性酶切、连接、转化等)根据标准方法(Sambrook等(1989)分子克隆：实验手册，第2版。冷泉港实验室出版社，CSH，纽约)进行。菌株
在所有实施例中，将大肠杆菌K-12菌株DH5α用于克隆。用于植物转化的根瘤土壤杆菌菌株为EHA 105和MOG 101(Hood等(1993)转基因研究2，208)。土壤杆菌菌株MOG101的构建
壤杆菌菌株MOG101的构建描述于WO 96/21030中。大肠杆菌otsA基因的克隆和pMOG799的构建
大肠杆菌中海藻糖磷酸合酶(TPS)由位于操纵子otsBA中的otsA基因编码。otsA基因的克隆与序列测定详细描述于WO95/01446的实施例I中，在此引用作为参考。为了实现其在植物细胞中的表达，按照在WO95/01446中的实施例I中所述的将此开放阅读框与转录调节元件CaMV35S RNA启动子、ALMV前导序列的转录增强子和nos-基因的转录终止子连接，得到pMOG799。带有pMOG799的大肠杆菌菌株样品已根据布达佩斯条约于1993年8月23日星期一保藏于荷兰真菌菌种保藏中心，Oosterstraat 1，P.O.Box 273，3740 AG Baarn：国际保藏中心赋予的保藏号为CBS 430.93。patatin启动子的分离/pMOG546的构建
用聚合酶链式反应从马铃薯(Solanum tuberosum)cv.Bintjie染色体DNA分离patatin启动子片段。合成与λpat21 patatin基因(Bevan等(1986)核酸研究14，5564)上游区域序列互补的由下面序列组成的一套寡核苷酸：
5’AAG CTT ATG TTG CCA TAT AGA GTA G 3’PatB33.2(SEQIDNO：1)
5’GTA GTT GCC ATG GTG CAA ATG TTC  3’PatATG.2(SEQIDNO：2)
用从马铃薯cv.Bintjie分离的染色体DNA作为模板，用这些引物扩增1123bp的DNA片段。扩增到的片段表现具有与λpat21 patatin序列的高度相似性并且用EcoRI接头将其克隆入pUC18载体而得到质粒pMOG546。PMOG845的构建
PMOG845的构建描述于WO 96/21030中。PVDH318、质体蓝素-TPS的构建
将质粒pMOG798(描述于WO95/01446)用HindIII消化并且与寡核苷酸双链TCV11和TCV12(参见pMOG845的构建)连接。将得到的载体用PstI和HindIII消化然后插入PotPiII终止子得到pTCV118。将质粒pTCV118用SmaI和HindIII消化得到包含TPS编码区和PotPiII终止子的DNA片段。加入BgIII接头并且将得到的片段插入用BamHI消化的植物双向表达载体pVDH275(图1)中，得到pVDH318。PVDH275为pMOG23的衍生物(Sijmons等(1990)，生物/技术8，217)，pMDG23带有35S CaMV启动子控制下的NPTII选择性标记和包含豌豆质体蓝素(PC)启动子和nos终止子序列的表达元件盒。存在于pVDH275中的质体蓝素启动子已经由Pwee &Gray(1993)在植物杂志3，437中描述。此启动子已经用PCR扩增和含有适当克隆位点的引物转移入双元载体中。其它表达载体的构建
与上述载体的构建类似，可以制备其中使用不同启动子与TPS、TPP或海藻糖酶基因结合并且使用带有NPTII基因或潮霉素抗性基因作为选择性标记基因的双元载体的基因构建体。带有HPT选择性标记的双元载体pMDG22的描述在Goddijn等(1993)植物杂志4，863中给出。三亲交配
在用含有质粒pRK2013的大肠杆菌菌株HB101的三亲交配(Ditta等，(1980)美国国家科学院院报77，7347)中，将双元载体转移入根瘤土壤杆菌菌株MOG101或EHA105中并用于转化。烟草(Nicotiana tabacum cv.SR1或cv.Samsun NN)的转化
通过植物组织和含有所述目的双元载体的根瘤土壤杆菌菌株MOG101的共培养转化烟草。按照Horsch等(1985)科学227，1229中所述的用烟草叶片的共培养进行转化。转基因植株从在含有卡那霉素的选择培养基上生长的芽再生、生根并将其转移至土壤中。马铃薯的转化
用含有目的双元载体的土壤杆菌菌株EHA 105转化马铃薯(Solanumtuberosum cv.Kardal)。基本培养基为MS30R3培养基，由MS盐(Murashige和Skoog(1962)植物生理学14，473)、R3维生素(Ooms等(1987)应用遗传学理论，73，744)、30g/l蔗糖、0.5g/l MES组成，最终pH为5.8(用KOH调节)，必要时用8g/l Daichin琼脂固化。将Solanum tuberosumcv.Kardal的块茎削皮并且通过在96％乙醇中燃烧5秒钟对其表面消毒。用无菌水熄灭火焰并且将其切成约2mm厚的薄片。用钻孔从维管组织切下圆片并且在含有1-5×108个细菌/ml带有双元载体的土壤杆菌EHA105的MS30R3培养基中培养20分钟。用MS30R3培养基冲洗块茎片并且将其转移到固化的培养后培养基(PM)上。PM由补加3.5mg/ml玉米素核苷和0.03mg/l吲哚乙酸(IAA)的M30R3培养基组成。2天后，将块茎片转移到含有200mg/l头孢噻肟和100mg/l万古霉素的新鲜PM培养基上。3天后，将块茎片转移到芽诱导培养基(SIM)上，芽诱导培养基由含有250mg/l羧苄青霉素和100mg/l卡那霉素的PM培养基组成。4-8周后，切下从块茎片长出的芽并置于生根培养基(含有100mg/l头孢噻肟、50mg/l万古霉素和50mg/l卡那霉素的MS30R3培养基)上。通过分生扦插而纯性繁殖幼苗。番茄(Lycopersicon esculentum)的转化
番茄转化根据Van Roekel等(1993)植物细胞繁殖12，644中所述的进行。小块茎的诱导
将带有辅助分生组织的体外马铃薯植物茎段转移到小块茎诱导培养基上。小块茎诱导培养基含有1×MS盐，补加R3维生素、0.5g/l MES(最终pH＝5.8，用KOH调节)、60g/l蔗糖和2.5mg/l细胞分裂素并以8g/l的Daichin琼脂固化。于24℃在黑暗中培养3-5周后，形成小块茎。有效霉素A的分离
已经发现有效霉素A为来自各种来源的海藻糖酶高度特异性抑制剂，(IC50)从10-6M变化到10-10M(Asano等(1987)抗生素杂志40，526；Kameda等，(1987)抗生素杂志40，563)。除了海藻糖酶以外，它不明显抑制任何α-或β-糖基水解酶活性。按照Kendall等(1990)植物化学29，2525中所述的从商业农业制剂Solacol(Takeda化学公司，东京)分离有效霉素A。该方法包括对3％的Solacol农业制剂进行离子交换层析(QAE-Sephadex A-25(Pharmacia)，柱床体积10ml，平衡缓冲液为pH70.2mM的Na-Pi)。将1ml Solacol上样至层析柱上并且用水洗脱成7个组分，实际上所有的有效霉素A均回收在组分4中。基于用该方法100％的回收，将有效霉素A的浓度在MS-培养基中调至1.10-3M，用于海藻糖积累测试。选择性地，按照Iwasa等(1971)抗生素杂志24，119中所述的，有效霉素A和B可以直接从吸水链霉菌var.limoneus纯化，在此引入其内容作为参考。碳水化合物分析
通过阴离子交换层析用脉冲电化学检测定量测定碳水化合物。通过用80％EtOH抽提匀浆的冷冻材料而制备提取物。提取后于室温放置15分钟，蒸发可溶性成分并且溶解于蒸馏水中。在装有4×250mm Dionex35391 carbopac PA-1柱和4×50mm Dionex 40396 carbopac PA-1预柱的Dionex DX-300液相色谱中分析样品(25μl)。用100mM NaOH以1ml/min洗脱然后以NaAc梯度洗脱。用脉冲电化学检测器(Dionex，PED)测定糖。商业上可得到的碳水化合物(Sigma)用作标准。海藻糖-6-磷酸的测定
将1cm直径的叶片(3片)冷冻于液氮中并且用金属棒在1.5ml MeOH(80％ v/v)中匀浆。将样品于75℃加热15分钟并且于SpeedVac中干燥。用450μl水抽提沉淀并且在注射到HPLC上之前保存于冰上。以下面的梯度使用上述的Dionex系统：T＝0’-20’用75mM NaOH平衡(整个操作过程维持恒定)，T＝20’为注射时间，T＝40’-50’0-10％ 1M NaAc的线性增加，T＝60’-100’10-50％  1M NaAc的线性增加，T＝120’为操作结束。用糖标准液分别比较和计算滞留时间和鉴定到的峰浓度。淀粉分析
按照在：Aman等，(1994)碳水化合物化学方法，第X卷(BeMiller等编)，111-115页中所述的进行淀粉分析。表达分析
用Northern印迹分析检测导入不同植物种类中的基因表达。实施例1  抑制海藻糖酶活性导致海藻糖的积累制备带有otsA基因的转基因马铃薯植物，其中otsA基因由马铃薯块茎特异性patatin启动子(pMOG845)驱动。用带有双元载体pMOG845的根瘤土壤杆菌EHA105转化马铃薯Solamum tuberosum cv.Kardal块茎片。以与空载体对照相当的转化频率获得转基因。所有得到的植物在表型上不能与野生型植株区分。在培养于补加10-3M有效霉素A的小块茎诱导培养基上的转基因和野生型植株茎段上诱导小块茎。作为对照，在不含有效霉素A的培养基上诱导小块茎。与不含有效霉素A的培养基上培养的小块茎比较，在含有有效霉素的培养基上诱导的小块茎表现增高的海藻糖水平(表1)，表明存在的海藻糖酶活性正在降解形成的海藻糖。野生型植株中少量海藻糖的存在表明有功能海藻糖合成途径的存在。
表1.海藻糖(％鲜重)
    +有效霉素A     -有效霉素A
     845-2      0.016         -
     845-4       -         -
     845-8      0.051         -
     845-11      0.015         -
     845-13      0.011         -
     845-22      0.112         -
     845-25      0.002         -
     845-28      0.109         -
    野生型Kardel      0.001         -
实施例2  在as-海藻糖酶转基因马铃薯植株中海藻糖的积累
通过用35S CaMV反义海藻糖酶构建体(SEQ ID NO：3和4；pMOG1027描述于WO 96/21030中)转化野生型马铃薯植株而得到内源海藻糖生物合成途径存在的证据。pMOG1027转基因马铃薯芽表现积累高达0.008％鲜重的海藻糖。通过用海藻糖酶特异性分解积累的海藻糖而证实观察到的海藻糖峰值的特征。有些pMOG1027转基因株系的块茎表现积累少量的海藻糖(图2)表2
    DbEST ID.   Genbank录入号       生物     功能
    680701     AA054930   Brugia malayi     海藻糖酶
    693476     C12818   秀丽隐杆线虫     海藻糖酶
    914068     AA273090   Brugia malayi     海藻糖酶
    15008     T00368   秀丽隐杆线虫     海藻糖酶
    401537     D67729   秀丽隐杆线虫     海藻糖酶
    680728     AA054884   Brugia malayi     海藻糖酶
    694414     C13756   秀丽隐杆线虫     海藻糖酶
    871371     AA231986   Brugia malayi     海藻糖酶
    894468     AA253544   Brugia malayi     海藻糖酶
实施例3  与分离的马铃薯海藻糖酶cDNA同源的EST克隆的鉴定
编码海藻糖酶的马铃薯cDNA克隆的分离描述于WO 96/21030中。马铃薯海藻糖酶序列与EST序列(表达序列标签)的比较表明在多种生物中存在高度同源性的基因(见表2)。实施例4  编码海藻糖酶的烟草cDNA克隆的分离
为了能够研究烟草中海藻糖酶表达的负调节，分离烟草海藻糖酶cDNA。用SMART PCR cDNA构建试剂盒(Clontech)在入ZAP中构建cDNA文库。作为起始材料，使用1ug野生型烟草叶片的总RNA。铺板共106p.f.u并且与马铃薯海藻糖酶cDNA杂交。鉴定到5个阳性克隆。在ABLE C/K中体内切割这些克隆之一得到带有约1.3kb插入片段的质粒pMOG1261。核酸序列测定揭示具有与马铃薯海藻糖酶cDNA序列的高度同源性，证明了此烟草海藻糖酶cDNA(SEQ ID NO：5和6，SEQ ID NO：7和8)的性质。实施例5  TPS和as-海藻糖酶转基因番茄植株的表现
用于番茄转化实验的构建体：PC-TPC，PC-TPS as-海藻糖酶，E8-TPS，E8 TPS E8 as-海藻糖酶。由质体蓝素启动子和35S启动子驱动的TPS基因转基因植株没有形成小而尖形的叶片，尽管有些严重矮化的植株的确形成小而深绿的叶片。与对照植株相比，PC-TPS和PC-as-海藻糖酶转基因植株的确形成更小更深的绿叶。与在其它作物中对TPS和TPP观察到的情况(WO 97/42326)类似，35S或PC驱动的TPS转基因植株的颜色和叶缘不能明确区分。只有一些带有在果实特异性E8启动子控制下的TPS基因的植物产生黄色表皮和不完全成熟。这与大量E8 TPS E8 as-海藻糖酶转基因植株相反，后者产生具有黄色表皮和不完全成熟的异常果实。实施例6  as-海藻糖酶和/或TPS转基因马铃薯植株的表现构建体：35S as-海藻糖酶(pMOG1027)和35S as-海藻糖酶PatTPS(pMOG1027(845-11/22/28))
通过用带有35S as-海藻糖酶构建体和潮霉素抗性标记基因的构建体pMOG1027重新转化pat-TPS株系(对卡那霉素有抗性)而产生同时表达35S as-海藻糖酶和pat-TPS的植株，得到基因型pMOG1027(845-11)、pMOG1027(845-22)和pMOG1027(845-28)。在体外诱导小块茎并且测定小块茎的鲜重。对于带有pMOG1027(pMOG845-11/22/28)的转基因株系，平均鲜重产量增加。从pMOG1027转基因株系获得的小块茎鲜重生物量仅略高于野生型对照植物。将得到的植株培养于温室中并且测定块茎产量(图4)。与对照株系相比，35S as-海藻糖酶转基因株系或35S as-海藻糖酶与Pat TPS结合的转基因株系明显产生更多的块茎量。淀粉测定显示高产量植物株系产生的块茎的淀粉含量没有差异(图5)。大量1027(845-11/22/28)株系从叶片腋芽产生高出土壤的块茎，表明所用的构建体对植株发育有复杂的影响。只有35S as-海藻糖酶的转基因植物株系没有形成高出土壤的块茎。构建体：Pat as-海藻糖酶(pMOG1028)和Pat as-海藻糖酶PatTPS(pMOG1028(845-11/22/28))
通过用带有Pat as-海藻糖酶构建体和潮霉素抗性标记基因的构建体pMOG1028重新转化PAT-TPS株系(对卡那霉素有抗性)而产生同时表达Pat as-海藻糖酶和PAT-TPS的植株，得到基因型pMOG1028(845-11)、pMOG1028(845-22)和pMOG1028(845-28)。将植株培养于温室中并且测定块茎产量(图6)。与对照株系相比，许多pMOG1028转基因株系产生明显更多的块茎量。Pat TPS和Pat as-海藻糖酶的单个转基因植株表现不同的块茎产量：从几乎没有产量到与对照株系相当或更高的产量(图6)。构建体：PC as-海藻糖酶(pMOG1092)
将pMOG1092转基因植株培养于温室中并且测定块茎产量。与对照株系相比，几个株系形成更深的绿色叶片。与未转基因植株相比，块茎产量显著提高(图7)。构建体：PC as-海藻糖酶PC-TPS(pMOG1130)
将pMOG1130转基因植株培养于温室中并且测定块茎产量。几个转基因株系形成小而深绿色叶片并且严重阻碍生长，表明以TPS转化植株时观察到的表型效应比同时表达as-海藻糖酶基因时更为严重。与对照植株相比，块茎产量不同，从几乎无产量到显著更多的产量(图8)。实施例7  马铃薯海藻糖酶cDNA在烟草(N.tabacum)中的过量表达构建体：de35S CaMV海藻糖酶(pMOG1078)
pMOG1078转基因的烟草初级转化子表现与野生型烟草不同的表型，有些转基因植株具有深绿叶片颜色和更厚的叶片(叶片形态不是尖形)，表明海藻糖酶基因表达对植物代谢的影响。播种自交初级转化子的种子并且在卡那霉素上选择。表型在S1代中表现以孟德尔方式分离。有关pMOG###和pVDH###克隆的目录1.双元载体1pMOG23    带有NPTII选择性标记的双元载体(约10kb)pMOG22    pMOG23的衍生物，NPTII-基因由赋予对潮霉素抗性的HPT基因替换pVDH275   从pMOG23衍生的双元载体，带有质体蓝素启动子-nos终止子表达元件盒。pMOG402   pMOG23的衍生物，已修复NPTII-基因中的点突变，多接头中不存在KpnI限制性位点pMOG800   pMOG402的衍生物，在多接头中具有恢复的KpnI位点2.TPS/TPP表达构建体pMOG 799     35S-TPS-3’nos1pMOG 845     Pat-TPS-3’PotPiIIpMOG 1093    质体蓝素-TPS-3’nospMOG 1140    E8-TPS-3’nos3.海藻糖酶构建体pMOG1028   Patatin as-海藻糖酶3’PotPiII，潮霉素抗性基因pMOG1078   de35S CaMV amv前导序列海藻糖酶3’nospMOG1027   具有Hyg标记的idempMOG1092   质体蓝素-as海藻糖酶-3’nospMOG1130   质体蓝素-as海藻糖酶-3’nos质体蓝素-TPS-3’nospMOG1153   E8-TPS-3’nos E8-as海藻糖酶-3’PotPiIIpMOG1261   烟草海藻糖酶cDNA片段1除非另有说明，所有构建体带有NPTII选择性标记
                            序列表(1)基本信息
(i)申请人：
  (A)名称：MOGEN Internaitonal
  (B)街道：Einsternweg 97
  (C)城市：Leiden
  (E)国家：The netherlands
  (F)邮政编号(Zip)：2333 CB
  (G)电话：31-(71)-5258282
  (H)传真：31-(71)-5221471
(ii)发明名称：通过抑制内源海藻糖酶水平来修饰海藻糖-6-磷酸水平从而调节代谢
(iii)序列数：10
(iv)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)
(vi)在先申请资料：
(A)申请号：WO97/42326
(B)递交日：1997年5月2日(2)关于SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征
   (A)长度：25个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型  (ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：AAGCTTATGT TGCCATATAG AGTAG                                      25(2)关于SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GTAGTTGCCA TGGTGCAAAT GTTC                                       24(2)关于SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征
(A)长度：2207个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA至RNA(iii)假设：否(iii)反义：否(vi)来源：
  生物：马铃薯(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS  (B)位置：161..1906(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CTTTTCTGAG TAATAACATA GGCATTGATT TTTTTTCAAT TAATAACACC TGCAAACATT       60CCCATTGCCG GCATTCTCTG TTCTTACAAA AAAAAACATT TTTTTGTTCA CATAAATTAG      120TTATGGCATC AGTATTGAAC CCTTTAACTT GTTATACAAT ATG GGT AAA GCT ATA        175
                                        Met Gly Lys Ala Ile
                                          1               5ATT TTT ATG ATT TTT ACT ATG TCT ATG AAT ATG ATT AAA GCT GAA ACT        223Ile Phe Met Ile Phe Thr Met Ser Met Asn Met Ile Lys Ala Glu Thr
             10                  15                  20TGC AAA TCC ATT GAT AAG GGT CCT GTA ATC CCA ACA ACC CCT TTA GTG        271Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro Thr Thr Pro Leu Val
         25                  30                  35ATT TTT CTT GAA AAA GTT CAA GAA GCT GCT CTT CAA ACT TAT GGC CAT        319Ile Phe Leu Glu Lys Val Gln Glu Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Gly His
     40                  45                  50AAA GGG TTT GAT GCT AAA CTG TTT GTT GAT ATG TCA CTG AGA GAG AGT        367Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met Ser Leu Arg Glu Ser
 55                  60                  65CTT TCA GAA ACA GTT GAA GCT TTT AAT AAG CTT CCA AGA GTT GTG AAT        415Leu Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu Pro Arg Val Val Asn70                  75                  80                  85GGT TCA ATA TCA AAA AGT GAT TTG GAT GGT TTT ATA GGT AGT TAC TTG        463Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe Ile Gly Ser Tyr Leu
             90                  95                 100AGT AGT CCT GAT AAG GAT TTG GTT TAT GTT GAG CCT ATG GAT TTT GTG        511Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu Pro Met Asp Phe Val
        105                 110                 115GCT GAG CCT GAA GGC TTT TTG CCA AAG GTG AAG AAT TCT GAG GTG AGG        559Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys Asn Ser Glu Val Arg
    120                 125                 130GCA TGG GCA TTG GAG GTG CAT TCA CTT TGG AAG AAT TTA AGT AGG AAA        607Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys Asn Leu Ser Arg Lys
 135                140                 145GTG GCT GAT CAT GTA TTG GAA AAA CCA GAG TTG TAT ACT TTG CTT CCA        655Val Ala Asp His Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro150                 155                 160                 165TTG AAA AAT CCA GTT ATT ATA CCG GGA TCG CGT TTT AAG GAG GTT TAT        703Leu Lys Asn Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg Phe Lys Glu Val Tyr
            170                 175                 180TAT TGG GAT TCT TAT TGG GTA ATA AGG GGT TTG TTA GCA AGC AAA ATG        751Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu Leu Ala Ser Lys Met
        185                 190                 195TAT GAA ACT GCA AAA GGG ATT GTG ACT AAT CTG GTT TCT CTG ATA GAT        799Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu Val Ser Leu Ile Asp
    200                 205                 210CAA TTT GGT TAT GTT CTT AAC GGT GCA AGA GCA TAC TAC AGT AAC AGA        847Gln Phe Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Ser Asn Arg
215                 220                 225AGT CAG CCT CCT GTC CTG GCC ACG ATG ATT GTT GAC ATA TTC AAT CAG        895Ser Gln Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val Asp Ile Phe Asn Gln230                 235                 240                 245ACA GGT GAT TTA AAT TTG GTT AGA AGA TCC CTT CCT GCT TTG CTC AAG        943Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu Pro Ala Leu Leu Lys
            250                 255                 260GAG AAT CAT TTT TGG AAT TCA GGA ATA CAT AAG GTG ACT ATT CAA GAT        991Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys Val Thr Ile Gln Asp
        265                 270                 275GCT CAG GGA TCA AAC CAC AGC TTG AGT CGG TAC TAT GCT ATG TGG AAT       1039Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn
    280                 285                 290AAG CCC CGT CCA GAA TCG TCA ACT ATA GAC AGT GAA ACA GCT TCC GTA       1087Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Glu Thr Ala Ser Val
295                 300                 305CTC CCA AAT ATA TGT GAA AAA AGA GAA TTA TAC CGT GAA CTG GCA TCA       1135Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr Arg Glu Leu Ala Ser310                 315                 320                 325GCT GCT GAA AGT GGA TGG GAT TTC AGT TCA AGA TGG ATG AGC AAC GGA       1183Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Ser Asn Gly
            330                 335                 340TCT GAT CTG ACA ACA ACT AGT ACA ACA TCA ATT CTA CCA GTT GAT TTG       1231Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu
        345                 350                 355AAT GCA TTC CTT CTG AAG ATG GAA CTT GAC ATT GCC TTT CTA GCA AAT       1279Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn
    360                 365                 370CTT GTT GGA GAA AGT AGC ACG GCT TCA CAT TTT ACA GAA GCT GCT CAA       1327Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe Thr Glu Ala Ala Gln
375                 380                 385AAT AGA CAG AAG GCT ATA AAC TGT ATC TTT TGG AAC GCA GAG ATG GGG       1375Asn Arg Gln Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Asn Ala Glu Met Gly390                 395                 400                 405CAA TGG CTT GAT TAC TGG CTT ACC AAC AGC GAC ACA TCT GAG GAT ATT       1423Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp Thr Ser Glu Asp Ile
            410                 415                 420TAT AAA TGG GAA GAT TTG CAC CAG AAC AAG AAG TCA TTT GCC TCT AAT       1471Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gln Asn Lys Lys Ser Phe Ala Ser Asn
        425                 430                 435TTT GTT CCG CTG TGG ACT GAA ATT TCT TGT TCA GAT AAT AAT ATC ACA       1519Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser Asp Asn Asn Ile Thr
    440                 445                 450ACT CAG AAA GTA GTT CAA AGT CTC ATG AGC TCG GGC TTG CTT CAG CCT       1567Thr Gln Lys Val Val Gln Ser Leu Met Ser Ser Gly Leu Leu Gln Pro
455                 460                 465GCA GGG ATT GCA ATG ACC TTG TCT AAT ACT GGA CAG CAA TGG GAT TTT       1615Ala Gly Ile Ala Met Thr Leu Ser Asn Thr Gly Gln Gln Trp Asp Phe470                 475                 480                 485CCG AAT GGT TGG CCC CCC CTT CAA CAC ATA ATC ATT GAA GGT CTC TTA       1663Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Ile Ile Glu Gly Leu Leu
            490                 495                 500AGG TCT GGA CTA GAA GAG GCA AGA ACC TTA GCA AAA GAC ATT GCT ATT       1711Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Arg Thr Leu Ala Lys Asp Ile Ala Ile
        505                 510                 515CGC TGG TTA AGA ACT AAC TAT GTG ACT TAC AAG AAA ACC GGT GCT ATG       1759Arg Trp Leu Arg Thr Asn Tyr Val Thr Tyr Lys Lys Thr Gly Ala Met
    520                 525                 530TAT GAA AAA TAT GAT GTC ACA AAA TGT GGA GCA TAT GGA GGT GGT GGT       1807Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly Ala Tyr Gly Gly Gly Gly
535                 540                 545GAA TAT ATG TCC CAA ACG GGT TTC GGA TGG TCA AAT GGC GTT GTA CTG       1855Glu Tyr Met Ser Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Val Leu550                 555                 560                 565GCA CTT CTA GAG GAA TTT GGA TGG CCT GAA GAT TTG AAG ATT GAT TGC       1903Ala Leu Leu Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp Leu Lys Ile Asp Cys
            570                 575                 580TAATGAGCAA GTAGAAAAGC CAAATGAAAC ATCATTGAGT TTTATTTTCT TCTTTTGTTA     1963AAATAAGCTG CAATGGTTTG CTGATAGTTT ATGTTTTGTA TTACTATTTC ATAAGGTTTT     2023TGTACCATAT CAAGTGATAT TACCATGAAC TATGTCGTTC GGACTCTTCA AATCGGATTT     2083TGCAAAAATA ATGCAGTTTT GGAGAATCCG ATAACATAGA CCATGTATGG ATCTAAATTG     2143TAAACAGCTT ACTATATTAA GTAAAAGAAA GATGATTCCT CTGCTTTAAA AAAAAAAAAA     2203AAAA                                                                  2207(2)关于SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征
(A)长度：581个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Gly Lys Ala Ile Ile Phe Met Ile Phe Thr Met Ser Met Asn Met1               5                  10                  15Ile Lys Ala Glu Thr Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro
         20                  25                  30Thr Thr Pro Leu Val Ile Phe Leu Glu Lys Val Gln Glu Ala Ala Leu
     35                  40                  45Gln Thr Tyr Gly His Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met
 50                  55                  60Ser Leu Arg Glu Ser Leu Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu65                  70                  75                  80Pro Arg Val Val Asn Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe
             85                  90                  95Ile Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu
        100                 105                 110Pro Met Asp Phe Val Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys
    115                 120                 125Asn Ser Glu Val Arg Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys
130                 135                 140Asn Leu Ser Arg Lys Val Ala Asp His Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu145                 150                 155                 160Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Lys Asn Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg
            165                 170                 175Phe Lys Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu
        180                 185                 190Leu Ala Ser Lys Met Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu
    195                 200                 205Val Ser Leu Ile Asp Gln Phe Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala
210                 215                 220Tyr Tyr Ser Asn Arg Ser Gln Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val225                 230                 235                 240Asp Ile Phe Asn Gln Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu
            245                 250                 255Pro Ala Leu Leu Lys Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys
        260                 265                 270Val Thr Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr
    275                 280                  285Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser
290                 295                 300Glu Thr Ala Ser Val Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr305                 310                 315                 320Arg Glu Leu Ala Ser Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg
            325                 330                 335Trp Met Ser Asn Gly Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile
        340                 345                 350Leu Pro Val Asp Leu Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile
    355                 360                 365Ala Phe Leu Ala Asn Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe
370                 375                 380Thr Glu Ala Ala Gln Asn Arg Gln Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp385                 390                 395                 400Asn Ala Glu Met Gly Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp
            405                 410                 415Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gln Asn Lys Lys
        420                 425                 430Ser Phe Ala Ser Asn Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser
    435                 440                 445Asp Asn Asn Ile Thr Thr Gln Lys Val Val Gln Ser Leu Met Ser Ser
450                 455                 460Gly Leu Leu Gln Pro Ala Gly Ile Ala Met Thr Leu Ser Asn Thr Gly465                 470                 475                 480Gln Gln Trp Asp Phe Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Ile
            485                 490                 495Ile Glu Gly Leu Leu Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Arg Thr Leu Ala
        500                 505                 510Lys Asp Ile Ala Ile Arg Trp Leu Arg Thr Asn Tyr Val Thr Tyr Lys
    515                 520                 525Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly Ala
530                 535                 540Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met Ser Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser545                 550                 555                 560Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Leu Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp
            565                 570                 575Leu Lys Ile Asp Cys
        580(2)关于SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征
(A)长度：515个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA至RNA(iii)假设：否(iii)反义：否(vi)来源：
  生物：烟草(ix)特征：
  (A)名称/关键：CDS
  (B)位置：25..515(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GAATTCGCGG CCCGCGTCGA CTACGGCTGC GAGAAGACGA CAGAAGGGGA T GCT CAG        57
                                                     Ala Gln
                                                       1GGA TCG AAC CAT AGT TTG AGT CGA TAC TAT GCT ATG TGG AAT GAA CCC        105Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn Glu Pro
      5                  10                  15CGA CCA GAA TCA TCA ACT ATT GAC AGT AAA ACA GCT TCC AAA CTC CCA        153Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Lys Thr Ala Ser Lys Leu Pro
 20                  25                  30AAC ATC TGT GAA AAA AGA CAA TTT TAT CGC GAC TTG GCA TCA GCG GCA        201Asn Ile Cys Glu Lys Arg Gln Phe Tyr Arg Asp Leu Ala Ser Ala Ala35                  40                  45                  50GAA AGT GGA TGG GAT TTC AGC TCA AGA TGG ATG AGG AAT GAA CCT GAT        249Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Arg Asn Glu Pro Asp
             55                  60                  65CTC ACA ACA ACT AGT ACA ACA TCA ATT CTA CCA GTT GAT CTG AAT GCA        297Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu Asn Ala
         70                  75                  80TTC CTT CTG AAG ATG GAA CTG GAC ATA GCC TTT TTA GCA AAT ACT ATT        345Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn Thr Ile
     85                  90                  95GGA GAA AGT AGC ACC GTT GCC CGA TTT ACA GAA GCT TCT CAA AAC AGA        393Gly Glu Ser Ser Thr Val Ala Arg Phe Thr Glu Ala Ser Gln Asn Arg
100                 105                 110CAA AGG GCC ATA AAC TGT ATC TTT TGG AAC GCG GAG ATG GGG CAA TGG        441Gln Arg Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Ash Ala Glu Met Gly Gln Trp115                 120                 125                 130CTT GAT TAC TGG CTT GGC GAC AGC AAC ACA TCC GAG GAT ATT TAT ATA        489Leu Asp Tyr Trp Leu Gly Asp Ser Asn Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ile
            135                 140                 145TGG GAA GAT ATA CAC CAG AAC TCT CT                                     515Trp Glu Asp Ile His Gln Asn Ser
        150(2)关于SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征
(A)长度：154个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn1               5                  10                  15Glu Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Lys Thr Ala Ser Lys
         20                  25                  30Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Gln Phe Tyr Arg Asp Leu A la Ser
     35                  40                  45Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Arg Asn Glu
 50                  55                  60Pro Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu65                  70                  75                  80Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn
             85                  90                  95Thr Ile Gly Glu Ser Ser Thr Val Ala Arg Phe Thr Glu Ala Ser Gln
        100                 105                 110Asn Arg Gln Arg Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Asn Ala Glu Met Gly
    115                 120                 125Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Gly Asp Ser Asn Thr Ser Glu Asp Ile
130                 135                 140Tyr Ile Trp Glu Asp Ile His Gln Asn Ser145                150(2)关于SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征
  (A)长度：580个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA至RNA(iii)假设：否(iii)反义：否(vi)来源：
  生物：烟草(ix)特征：
  (A)名称/关键：不确切
  (B)位置：13
  (C)其它信息：/备注＝“可以是a，c，g或t”(ix)特征：
  (A)名称/关键：不确切
  (B)位置：23
  (C)其它信息：/备注＝“可以是a，c，g或t”(ix)特征：
  (A)名称/关键：不确切
  (B)位置：219
  (C)其它信息：/备注＝“可以是a，c，g或t”(ix)特征：
  (A)名称/关键：不确切
  (B)位置：387
  (C)其它信息：/备注＝“可以是a，c，g或t”(ix)特征：
  (A)名称/关键：不确切
  (B)位置：459
  (C)其它信息：/备注＝“可以是a，c，g或t”  (ix)特征：
  (A)名称/关键：CDS
  (B)位置：3..263(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：AG ATC ATT GAA GAT TTC GCG AGA TTT GGA CTA GAA GAG GCA AGA GCC          47Ile Ile Glu Asp Phe Ala Arg Phe Gly Leu Glu Glu Ala Arg Ala
 1               5                  10                  15TTA GCT AAC GAC ATT GTT ATC CGA TGG ATA AGA ACT AAC TAT GTA GCT         95Leu Ala Asn Asp Ile Val Ile Arg Trp Ile Arg Thr Asn Tyr Val Ala
             20                  25                  30TAC AAG AAA ACC GGT GCA ATG TAT GAA AAA TAC GAC GTG ACA AAA TGT        143Tyr Lys Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys
         35                  40                  45GGA GCA TAT GGA GAT GGT GGT GTG TAT GCA GCC CAA ACT GGT TTT GGA        191Gly Ala Tyr Gly Asp Gly Gly Val Tyr Ala Ala Gln Thr Gly Phe Gly
     50                  55                  60TGG ACG AAT GGC GTT GTA CTG GCA CTT ATG GAG G AA TTT GGA TGG CCT        239Trp Thr Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Met Glu Glu Phe Gly Trp Pro
 65                  70                  75GAA GAC TTG AAG ATT GAC TGC TAC TGAGCAGGCA GAGTAACCAT TCGAGCTGAC        293Glu Asp Leu Lys Ile Asp Cys Tyr80                  85GAAATTAGAA ATATTATCCG TGAATATATT GAACAATATA ATGGAGAAGT AAAGATTGTA       353AATATTGGCA ATGTACTTTG CGATGATGTT GCTAGTATTC ACAGTTTTGA TAAAGTAATG       413GTGGGTGAAT TAGGAGAAGC TGTAGAGGGG ACAATAAACA TTGCTATGAA TTTGGAATCA       473AATAATGTTG GTGTTGTATT AATTGGCGAA CAACTTCAAT TAAAGTGAAA TTAGAAAAAA       533AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCGGCC GCTCGAATTC CCTCTCT                     580(2)关于SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征
(A)长度：87个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Ile Ile Glu Asp Phe Ala Arg Phe Gly Leu Glu Glu Ala Arg Ala Leu1               5                  10                  15Ala Asn Asp Ile Val Ile Arg Trp Ile Arg Thr Asn Tyr Val Ala Tyr
         20                  25                  30Lys Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly
     35                  40                  45Ala Tyr Gly Asp Gly Gly Val Tyr Ala Ala Gln Thr Gly Phe Gly Trp
 50                  55                  60Thr Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Met Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu65                  70                  75                  80Asp Leu Lys Ile Asp Cys Tyr
             85(2)关于SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征
(A)长度：2940个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iii)反义：否(vi)原始来源：
  生物：拟南芥(vi)直接来源：
  克隆：BAC T19F06
(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS
(B)位置：连接(119..684，801..920，1012..1127，1211..1311，1398..1507，1590..1662，1755..1916，2020..2083，2163..2262，2358..2571，2671..2754)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CTTATCCTCT TCTCCATTCA ATCTCTTATT CTCTTTTCCT TCCTTCATAT ACCTTAAACA       60GCAACGTTCT CTGTTCTTCT TCTTCTTTTT CTTCCTCTGT TTTTCTTTCA CAACTTCC        118ATG TTG GAC TCG GAC ACA GAC ACG GAC TCA GGT CCT GTG GTT GCA ACA        166Met Leu Asp Ser Asp Thr Asp Thr Asp Ser Gly Pro Val Val Ala Thr1               5                  10                  15ACC AAA CTC GTC ACT TTC CTC CAG CGT GTG CAG CAC ACG GCA CTT CGA        214Thr Lys Leu Val Thr Phe Leu Gln Arg Val Gln His Thr Ala Leu Arg
         20                  25                  30TCA TAC CCT AAA AAA CAA ACG CCT GAT CCC AAA TCC TAC ATT GAT CTA        262Ser Tyr Pro Lys Lys Gln Thr Pro Asp Pro Lys Ser Tyr Ile Asp Leu
     35                  40                  45TCT CTC AAA CGT CCC TAC AGT CTC TCC ACC ATC GAA TCA GCC TTC GAT        310Ser Leu Lys Arg Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Ile Glu Ser Ala Phe Asp
 50                  55                  60GAT CTC ACG AGC GAG TCA CAT GAC CAG CCA GTG CCA GTG GAG ACG CTT        358Asp Leu Thr Ser Glu Ser His Asp Gln Pro Val Pro Val Glu Thr Leu65                  70                  75                  80GAA AAG TTC GTC AAG GAA TAT TTT GAC GGT GCA GGG GAG GAT CTG CTG        406Glu Lys Phe Val Lys Glu Tyr Phe Asp Gly Ala Gly Glu Asp Leu Leu
             85                  90                  95CAC CAC GAA CCA GTA GAT TTC GTC TCA GAT CCC TCC GGC TTC CTC TCC        454His His Glu Pro Val Asp Phe Val Ser Asp Pro Ser Gly Phe Leu Ser
        100                 105                 110AAC GTG GAG AAC GAA GAA GTC AGA GAA TGG GCG CGT GAG GTA CAC GGT        502Asn Val Glu Asn Glu Glu Val Arg Glu Trp Ala Arg Glu Val His Gly
    115                 120                 125CTT TGG AGA AAT CTG AGC TGC AGA GTC TCT GAC TCA GTA AGA GAG TCT        550Leu Trp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Ser Asp Ser Val Arg Glu Ser
130                 135                 140GCC GAC CGG CAC ACG CTT CTA CCG TTG CCG GAA CCG GTT ATC ATT CCC        598Ala Asp Arg His Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Pro Val Ile Ile Pro145                 150                 155                 160GGT TCG AGA TTC AGA GAA GTC TAT TAC TGG GAT TCT TAT TGG GTC ATC  AA    648Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile  Lys
            165                 170                 175GTAAGTCATT GTTTCCAACT TTTAAATCAC AAATCAAATG TTTTTTGTTT TTTGTTATTA      708AATTGATTTC CTCTCCTTTC GTGTTGACTA CGTAACACAA GCTAACGTGT CAGTATGTCA      768CCGTCTTGTA ACACGTGCTT TTGCACATGC AG A GGA CTT ATG ACG AGT CAA          819
                                  Gly Leu Met Thr Ser Gln
                                          180ATG TTC ACT ACC GCC AAA GGT TTA GTG ACG AAT CTG ATG TCA CTT GTG        867Met Phe Thr Thr Ala Lys Gly Leu Val Thr Asn Leu Met Ser Leu Val
185                 190                 195GAG ACT TAT GGT TAC GCT TTG AAC GGT GCT AGA GCT TAT TAT ACT AAC        915Glu Thr Tyr Gly Tyr Ala Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Thr Asn200                 205                 210                 215AGA  AG  GTAACTACAA CTCTTTGTCT CTATTTGAGA TTTGTCAATA ACGGAGAAAA        970Arg  SerTAAAATGTTT ATGAGATTTA TAATGTTTTT ATTGTTACAA G C CAA CCA CCT TTG        1024
                                            Gln Pro Pro Leu
                                                    220TTG AGC TCC ATG GTC TAT GAA ATT TAT AAT GTG ACA AAA GAT GAA GAA        1072Leu Ser Ser Met Val Tyr Glu Ile Tyr Asn Val Thr Lys Asp Glu Glu
        225                 230                 235CTT GTG AGG AAA GCA ATC CCT CTG CTT CTC AAA GAG TAC GAG TTT TGG        1120Leu Val Arg Lys Ala Ile Pro Leu Leu Leu Lys Glu Tyr Glu Phe Trp
    240                 245                 250AAC TCA  G GTTAGTTATT TAGTTAGATA GTTTAGTAAC ACTAGTTTGG TTTAATTCTT      1177Asn Ser
255AGATTGAATA TTGTTATGTT TTCTTCTTTG TAG  GA AAA CAT AAA GTG GTT ATT       1230
                                 Gly Lys His Lys Val Val Ile
                                                 260CGA GAC GCT AAT GGT TAT GAT CAC GTT TTG AGC CGT TAT TAT GCT ATG        1278Arg Asp Ala Asn Gly Tyr Asp His Val Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met
    265                 270                 275TGG AAC AAG CCA AGG CCT GAA TCC TCT GTT TTC GTATGTTTCT TGTCTATTTA      1331Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Val Phe
280                 285CAAACATGTT TTCTAATTTT ATTGCGAGAA AAAATGTTGA CTCTTTCTCT TCATGTGTTA      1391CCACAG GAT GAA GAA TCT GCT TCA GGG TTC TCG ACT ATG TTA GAG AAA         1439
   Asp Glu Glu Ser Ala Ser Gly Phe Ser Thr Met Leu Glu Lys
   290                 295                 300CAA CGG TTC CAT CGA GAT ATA GCC ACG GCT GCT GAA TCA GGA TGC GAT        1487Gln Arg Phe His Arg Asp Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ser Gly Cys Asp
305                 310                 315TTC AGC ACG CGA TGG ATG AG GTTCGATTAC TTAACAAACT AATCAAGTGT            1537Phe Ser Thr Arg Trp Met Arg320                 325AGTTCATGTT ACTACTGTCA CTTATACTTA AATTCTCAAA ATGATAATGC AG G GAT        1593
                                                        AspCCT CCT AAT TTC ACA ACG ATG GCT ACA ACA TCA GTG GTT CCT GTT GAT        1641Pro Pro Asn Phe Thr Thr Met Ala Thr Thr Ser Val Val Pro Val Asp
    330                 335                 340CTA AAT GTT TTT CTT CTC AAG GTCTCCACTT TTCTTGATCA TAATTCTCTT           1692Leu Asn Val Phe Leu Leu Lys
345                 350TGATTACTGT TCTTGCACAT ATATTATGTA GATAAACGAT GAATGTTATC TGTTTACCGT      1752AG ATG GAA CTC GAT ATA GCG TTC ATG ATG AAG GTT TCT GGA GAT CAA         1799Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Met Met Lys Val Ser Gly Asp Gln
               355                 360                 365AAT GGT TCA GAC CGT TTT GTG AAA GCG TCA AAA GCG AGA GAG AAA GCG        1847Asn Gly Ser Asp Arg Phe Val Lys Ala Ser Lys Ala Arg Glu Lys Ala
            370                 375                 380TTT CAA ACC GTG TTT TGG AAC GAG AAA GCA GGG CAA TGG CTG GAT TAC       1895Phe Gln Thr Val Phe Trp Asn Glu Lys Ala Gly Gln Trp Leu Asp Tyr
        385                 390                 395TGG CTT TCC TCC AGT GGT GAG GTAAGCTGTT ACAGAATCTT TGAATACAAT          1946Trp Leu Ser Ser Ser Gly Glu
    400TTCGGATTTC TTGATGAGGA AGCTTTTGAA AACGTGTCTG TGTCTTCAGG AATCTGAGAC     2006ATGGAAGGCT GAG AAC CAA AAC ACC AAC GTC TTT GCG TCT AAC TTT GCA        2055
           Asn Gln Asn Thr Asn Val Phe Ala Ser Asn Phe Ala
           405                 410                 415CCA ATC TGG ATT AAT TCC ATC AAT TCA  G GTAAAGTATC TCTACTTGTC          2103Pro Ile Trp Ile Asn Ser Ile Asn Ser
        420                 425TATGTATACA CTTTATATGT TGAATTATGT ATTTGAACGT TTAATTTTGC AACATGTAG AT   2164
                                                            AspGAA AAT CTT GTC AAG AAA GTT GTG ACA GCT CTT AAG AAC TCA GGG CTC       2212Glu Asn Leu Val Lys Lys Val Val Thr Ala Leu Lys Asn Ser Gly Leu
        430                 435                 440ATT GCT CCC GCT GGA ATC CTA ACT TCT TTG ACA AAC TCA GGA CAA CAA TG    2262Ile Ala Pro Ala Gly Ile Leu Thr Ser Leu Thr Asn Ser Gly Gln Gln Trp
    445                 450                 455GTAAATGAAG CTTGCGGTTC AAGTTTCATT TGGAATCTTG AAATTTACTT CACTAAGCAT     2322ATTATCTTGA TACATATGTG GTTGCACTGG AACAG G GAT TCT CCG AAT GGA TGG      2376
                                     Asp Ser Pro Asn Gly Trp
                                     460                 465GCA CCG CAA CAA GAG ATG ATC GTC ACA GGG CTC GGA AGA TCG AGT GTA       2424Ala Pro Gln Gln Glu Met Ile Val Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ser Val
            470                 475                 480AAA GAA GCT AAA GAG ATG GCA GAG GAT ATT GCA AGG AGA TGG ATC AAA       2472Lys Glu Ala Lys Glu Met Ala Glu Asp Ile Ala Arg Arg Trp Ile Lys
        485                 490                 495AGC AAC TAT CTT GTC TAC AAG AAA AGT GGG ACT ATA CAT GAG AAG CTC       2520Ser Asn Tyr Leu Val Tyr Lys Lys Ser Gly Thr Ile His Glu Lys Leu
    500                 505                 510AAA GTT ACA GAG CTT GGT GAA TAT GGT GGT GGA GGA GAA TAT ATG CCA       2568Lys Val Thr Glu Leu Gly Glu Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met Pro
515                 520                 525CAG GTCAACTTTT CTTCTTCAAC TTTCTTTTGA TTTCATGAGT TTTAGGGGTC            2621Gln530CAAATAAAAG TTTCTTGTAA TGTTGACTTC ATGTTTCCAA AAAATGCAG ACC GGA         2676
                                                  Thr GlyTTC GGA TGG TCA AAT GGA GTT ATC TTA GCA TTC TTG GAG GAA TAT GGA       2724Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Ile Leu Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Gly
    535                 540                     545TGG CCC TCT CAT CTT AGC ATT GAA GCC TAGATTTACT AAGTTTATTG            2771Trp Pro Ser His Leu Ser Ile Glu Ala
550                 555AAAGTTAAAT AACGGAATTA GACATTTTAT GTTACAAAAA CTTTGGTAGA TTTGATCGTA    2831GTGGATTATT TCTTGGGGTT TTCTGTCAGA ACGTTTTAGA GTTACAAATG TTTTATGACC    2891AAATATTGTA TATGCAAATA AAGTTAAATA TAATAAGCAT CTAATGGTA                2940(2)关于SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征
(A)长度：557个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Met Leu Asp Ser Asp Thr Asp Thr Asp Ser Gly Pro Val Val Ala Thr1               5                  10                  15Thr Lys Leu Val Thr Phe Leu Gln Arg Val Gln His Thr Ala Leu Arg
         20                  25                  30Ser Tyr Pro Lys Lys Gln Thr Pro Asp Pro Lys Ser Tyr Ile Asp Leu
     35                  40                  45Ser Leu Lys Arg Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Ile Glu Ser Ala Phe Asp
 50                  55                  60Asp Leu Thr Ser Glu Ser His Asp Gln Pro Val Pro Val Glu Thr Leu65                  70                  75                  80Glu Lys Phe Val Lys Glu Tyr Phe Asp Gly Ala Gly Glu Asp Leu Leu
             85                  90                  95His His Glu Pro Val Asp Phe Val Ser Asp Pro Ser Gly Phe Leu Ser
        100                105                  110Asn Val Glu Asn Glu Glu Val Arg Glu Trp Ala Arg Glu Val His Gly
    115                 120                 125Leu Trp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Ser Asp Ser Val Arg Glu Ser
130                 135                 140Ala Asp Arg His Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Pro Val Ile Ile Pro145                 150                 155                 160Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile
            165                 170                 175Lys Gly Leu Met Thr Ser Gln Met Phe Thr Thr Ala Lys Gly Leu Val
        180                 185                 190Thr Asn Leu Met Ser Leu Val Glu Thr Tyr Gly Tyr Ala Leu Asn Gly
    195                 200                 205Ala Arg Ala Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser Gln Pro Pro Leu Leu Ser Ser
210                 215                 220Met Val Tyr Glu Ile Tyr Asn Val Thr Lys Asp Glu Glu Leu Val Arg225                 230                 235                 240Lys Ala Ile Pro Leu Leu Leu Lys Glu Tyr Glu Phe Trp Asn Ser Gly
            245                 250                 255Lys His Lys Val Val Ile Arg Asp Ala Asn Gly Tyr Asp His Val Leu
        260                 265                 270Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Val
    275                 280                 285Phe Asp Glu Glu Ser Ala Ser Gly Phe Ser Thr Met Leu Glu Lys Gln
290                 295                 300Arg Phe His Arg Asp Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ser Gly Cys Asp Phe305                 310                 315                 320Ser Thr Arg Trp Met Arg Asp Pro Pro Asn Phe Thr Thr Met Ala Thr
            325                 330                 335Thr Ser Val Val Pro Val Asp Leu Asn Val Phe Leu Leu Lys Met Glu
        340                 345                 350Leu Asp Ile Ala Phe Met Met Lys Val Ser Gly Asp Gln Asn Gly Ser
    355                 360                 365Asp Arg Phe Val Lys Ala Ser Lys Ala Arg Glu Lys Ala Phe Gln Thr
370                 375                 380Val Phe Thr Asn Glu Lys Ala Gly Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Ser385                 390                 395                 400Ser Ser Gly Glu Asn Gln Asn Thr Asn Val Phe Ala Ser Asn Phe Ala
            405                 410                 415Pro Ile Trp Ile Asn Ser Ile Asn Ser Asp Glu Asn Leu Val Lys Lys
        420                 425                 430Val Val Thr Ala Leu Lys Asn Ser Gly Leu Ile Ala Pro Ala Gly Ile
    435                 440                 445Leu Thr Ser Leu Thr Asn Ser Gly Gln Gln Trp Asp Ser Pro Asn Gly
450                 455                 460Trp Ala Pro Gln Gln Glu Met Ile Val Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ser465                 470                 475                 480Val Lys Glu Ala Lys Glu Met Ala Glu Asp Ile Ala Arg Arg Trp Ile
            485                 490                 495Lys Ser Asn Tyr Leu Val Tyr Lys Lys Ser Gly Thr Ile His Glu Lys
        500                 505                 510Leu Lys Val Thr Glu Leu Gly Glu Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met
    515                 520                 525Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Ile Leu Ala Phe Leu
530                 535                 540Glu Glu Tyr Gly Trp Pro Ser His Leu Ser Ile Glu Ala545                 550                 555

Claims (20)

1.通过抑制内源海藻糖酶水平来修饰体内细胞、组织或器官的发育和/组成的方法。
2.通过抑制内源海藻糖酶水平来抑制糖酵解方向中碳流的方法。
3.通过抑制内源海藻糖酶水平刺激光合作用的方法。
4.通过抑制内源海藻糖酶水平刺激库相关活性的方法。
5.通过抑制内源海藻糖酶水平来抑制细胞或组织生长的方法。
6.通过抑制内源海藻糖酶水平来防止冷冻甜化的方法。
7.通过抑制内源海藻糖酶水平来抑制收获后甜菜中转化酶的方法。
8.通过抑制内源海藻糖酶水平诱导抽苔的方法。
9.通过抑制内源海藻糖酶水平增加植物产量的方法。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于对内源海藻糖酶水平的抑制效应由细胞内海藻糖-6-磷酸水平的增加引起。
11.通过抑制内源海藻糖酶水平来增加细胞内海藻糖-6-磷酸有效来源的方法。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其特征在于内源海藻糖酶水平的抑制是在海藻糖酶抑制剂存在的情况下培养或生长所述细胞、组织、器官或植株的结果。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于海藻糖酶抑制剂以适于所述细胞、组织、器官或植株吸收的形式包含有效霉素A，优选地其中水溶液中有效霉素A的浓度为100nM到10mM，更优选地0.1到1mM。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于海藻糖酶抑制剂以适于所述细胞、组织、器官或植株吸收的形式包含美洲蟑郎(Periplanetaamericana)86kD蛋白。
15.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其特征在于所述对细胞、组织、器官或植株进行了遗传改变从而含有海藻糖酶抑制剂的遗传信息。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于海藻糖酶抑制剂的遗传信息包括编码美洲蟑郎(Periplaneta americana)86kD蛋白的基因。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于海藻糖酶抑制剂的遗传信息包括能表达与由编码内源海藻糖酶的基因所产生的RNA至少部分互补的RNA的DNA序列。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于海藻糖酶抑制剂的遗传信息包括编码海藻糖酶的DNA序列，该序列与编码内源海藻糖酶的DNA序列一致。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于编码内源海藻糖酶的DNA序列选自包括编码SEQ ID NO：4蛋白的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：6蛋白的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：8蛋白的核苷酸序列和编码SEQ IDNO：10蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列组。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于编码内源海藻糖酶的DNA序列选自包括SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO：7中所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：9中所示的核苷酸序列的核苷酸序列组。
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