MX2012000271A - Introduccion de dna en celulas de planta. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona medios y métodos para la introducción simple y eficiente de material genético foráneo en la célula de planta. Particularmente, la presente invención combina el cebado de semilla y constructos de DNA basados en virus para la introducción eficiente de DNA heterólogo en plantas.

Description

INTRODUCCIÓN DE DNA EN CÉLULAS DE PLANTA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al campo de biología molecular de plantas, particularmente a medios y métodos para la introducción simple y eficiente de material genético exógeno en la célula de planta.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plantas que llevan uno o más genes heterólogos expresables tienen una variedad de ventajas potenciales. Las plantas que llevan un cásete de expresión de gen pueden llevar uno o más genes que confieren atributos deseados, incluyendo por ejemplo, tolerancia al herbicida, pesticida o insectos; tolerancia al estrés; sabor aumentado y/o vida en anaquel del producto fresco (fruta, vegetales, semillas, etc.), así como la habilidad para amplificar la síntesis de proteínas endógenas y/o foráneas de plantas útiles, azúcares, ácidos grasos o metabolitos secundarios para el consumo para el hombre y/o animales y para uso como materias primas en una variedad de industrias (cosméticos, farmacéuticos, nutracéuticos , alimentos, papel, fibras, etc.).

Las tecnologías de transformación actuales proporcionan' una oportunidad para diseñar plantas con atributos deseados, y avances mayores en la transformación de plantas se han presentado en años recientes. La tecnología más común es mediada por Agrobacterium turnefaciens . Otros i métodos de transformación son la transferencia de DNA directa que incluyen microinyección, electroporación, bombardeo de partículas y vectores virales (Birch R G. 1997. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol . 48:297-326) . Con excepción de los vectores virales, la aplicación de las técnicas anteriores da por resultado la penetración de DNA foráneo, en las células/tejido tratado, su integración en el genoma de planta tratado y la regeneración de plantas transgénicas . Sin embargo, en muchas plantas de cultivos mayores, todavía existen ciertas limitaciones de genotipo. La transformación de algunas plantas de cultivo agrícolamente importantes continua siendo difícil y consumidora de tiempo. Además, en todas las tecnologías mencionadas en lo anterior, la transformación se conduce con tejidos vegetativos (incluyendo embriones) la eficiencia de transformación es pobre, se requieren marcadores para selección, y el porcentaje de regeneración exitosa de una planta a partir de la célula o tejido transformado es más bien baja.

La integración del DNA foráneo en el genoma de planta no siempre es deseable, particularmente cuando las plantas genéticamente modificadas (GMO) se someten a problemas ambientales y políticos. En estos casos, los métodos que habilitan la expresión del gen (es) heterólogo que no se incorpora en el genoma hospedero son requeridos.

La publicación de solicitud internacional (PCT) No.

WO 2007/141790 de algunos de los inventores de la presente invención divulga constructos basados en Gemnivirus modificado capaz de la dispersión de una célula de planta a la otra dentro de la planta tratada y la introducción concomitante del DNA foráneo en las células de planta, sin ejercer los síntomas del virus patológico. Este DNA foráneo se expresa en los tejidos de planta pero no se integra en su genoma . Los constructos (también referidos como vectores de expresión, IL-60 que es un ejemplo) comprenden la secuencia de polinucleótido heteróloga que interrumpe los genes de replicasa de Gemnivirus tal que es flanqueada por una secuencia de ácido nucleico no contigua que codifica una replicasa de Gemnivirus o proteínas asociadas o replicadas.

El cebado de semilla es un proceso para tratar semillas de planta que les permite someterse a la germinación más rápida y más uniforme en el sembrado o plantación comparada con las semillas no tratadas. Adicionalmente, el. cebado ofrece un tratamiento simultáneo opcional con fungicida/pesticida/fertilizantes u otras sustancias químicas (por ejemplo, recubrimiento, formación de pelotillas, coloración como una marca comercial y más) que proporciona protección y/o que facilita la germinación, el establecimiento de emergencia y plántulas.

El cebado permite a las semillas absorber bastante agua para permitir sus procesos metabólicos pre-germinativos benignos y luego los define en esta etapa. La cantidad de agua absorbida (con o sin sustancias químicas benéficas) se debe controlar cuidadosamente, como también simplemente permitirá la semilla germinal y muy poco dará por resultado el envejecimiento de la semilla. Una vez que la cantidad correcta de agua sea absorbida, las semillas pueden ser sembradas o secadas nuevamente al contenido de agua original para el almacenamiento. Las semillas cebadas usualmente germinan y emergen más rápidamente y uniformemente y el vigor de la plántula es típicamente más alto comparado con las semillas no cebadas, particularmente bajo condiciones sub-óptimas. Los beneficios ganados por el cebado, tal como la velocidad y uniformidad de germinación son usualmente atribuidas a la iniciación de los procesos de reparación del DNA, la activación de enzima de hidratación de proteína y procesos adicionales que ocurren en las etapas tempranas de germinación .

Las tres técnicas mayores utilizadas para controlar la captación de agua incluyen el cebado con soluciones acuosas, con sistemas particulados sólidos hidratados o mediante la hidratación controlada con agua. El cebado con solución está basado en la inmersión de las semillas en solución osmótica, típicamente soluciones de PEG caracterizadas por potencial osmótico que permiten el empapamiento limitado que es insuficiente para la hidratación completa y la germinación de la semilla. Alternativamente, el mismo efecto se logra al mezclar las semillas con el medio absorbente hidratado tal como arcilla o turba (por ejemplo, la patente norteamericana No. 4,912,874). La hidratación controlada con soluciones acuosas se puede lograr, por ejemplo, al utilizar membranas semi-permeable para mediar la transferencia de agua desde una solución de ' una presión osmótica dada a la semilla (patente norteamericana No. 5,992,091). El cebado se realiza bajo una variedad de temperaturas y métodos de aireación (por ejemplo, revolvimiento, agitación, burbujeo, etc.) utilizando cualquiera de las técnicas para la captación de agua controlada (Taylor A G. y colaboradores 1998. Seed Science Technology 8:245-25.6).

La combinación entre las técnicas de transformación comunes descritas anteriormente en la presente y el cebado de semillas se han divulgado. Por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,646,181 · divulga un método para introducir genes en plantas que comprende sincronizar la etapa de desarrollo de la planta en una etapa que incluye cantidades grandes de 4C DNA en semillas de las plantas y transfectar las células de las semillas, en la cual la sincronización de la etapa de desarrollo comprende mezclar un material de matriz sólida particulado y una cantidad de cebado de semilla de agua, con aireación de semillas, durante un tiempo y a una temperatura suficiente para causar que un número sustancial de las células de las semillas alcance una i etapa deseada de un ciclo celular.

La publicación de solicitud de patente norteamericana No. 2006/0005273 divulga explantas de maíz adecuadas para la transformación. Las explantas comprenden una semilla de maíz dividida a la mitad longitudinalmente, en donde la división expone el escutelo, el anillo coleoptilar y el meristerma apical de retoño, cada uno de los cuales son independientemente adecuados para la transformación. El cebado de la semilla antes de la división con ya sea el medio de cebado de callo en el retoño incrementan la frecuencia de inducción del callo y retoño después de la transformación.

La solicitud de patente norteamericana No. 20100154083 divulga composiciones y métodos para clasificar, identificar, seleccionar, aislar y/o regenerar eventos de integración dirigidos utilizando el cebado de semilla. El cebado de semilla proporciona la identificación de una semilla que tiene establemente incorporada en su genoma una integración mediada por recombinasa especifica de sitio de un marcador seleccionable en un sitio objetivo operablemente enlazado a un activo de promotor en la semilla.

Estos métodos de combinación emplean los métodos conocidos de transformación y se dirigen en incrementar la eficacia de la integración del gen foráneo en el genoma de planta. Como es descrito anteriormente en la presente, los métodos disponibles tienen limitaciones con respecto a la aplicabilidad y eficacia. Además, la integración del DNA foráneo al genoma de la planta no siempre es deseable.

Hay una necesidad reconocida para, y seria altamente ventajoso tener medios y métodos para la introducción simple y eficiente de DNA en células de planta que permitan además la regeneración de planta eficiente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona medios y métodos para el suministro simple y eficiente de DNA heterólogo en una célula de planta, parte, tejido, órgano o el organismo completo, particularmente a las células de un embrión de semilla dentro de una semilla intacta.. La semilla que comprende el DNA heterólogo introducido fácilmente es cultivada a una planta madura bajo condiciones de crecimiento estándares, sin la necesidad de cultivos de regeneración y condiciones de endurecimiento.

La presente invención está basada en parte en el descubrimiento inesperado de que la introducción del DNA heterólogo en semillas de planta es posible durante el cebado de la semilla al suplementar el medio de cebado con un constructo de DNA basado en virus, particularmente con un constructo de expresión basado en Geminivirus. Como es ejemplificado enseguida en la presente, la presente invención ahora muestra que la suplementacion de un medio de cebado con un constructo basado en Geminivirus designado IL-60, que comprende ' la secuencia de polinucleótido heteróloga flanqueada por secuencias de ácido nucleico no contiguas que codifican una replicasa de Geminivirus . o proteínas asociadas a replicasa, da por resultado la captación, replicación y dispersión sin indicios del constructo de DNA dentro de las células de semilla.

Las enseñanzas de la presente invención son ventajosas sobre los métodos previamente conocidos para la transformación de células de planta b introducción de DNA foráneo en que el DNA se introduce en el embrión de la semilla intacta que es naturalmente capaz del desarrollo en una planta completa. Las enseñanzas de la presente invención para la introducción de DNA no involucra el daño a las células (como ocurre cuando se emplea la transferencia de DNA directa, particularmente por la vía del bombardeo) o el funcionamiento de las células. Además, cuando se emplean constructos de expresión basados en Geminivirus, el DNA heterólogo no se incorpora en el genoma de planta, nuevamente previniendo el trauma que acompaña la introducción de DNA en la célula que típicamente conduce a la detención del ciclo celular y apoptosis o muerte celular programada. Un método simple de la presente invención se puede emplear con semillas de cualquier planta de interés, y es rápido y altamente eficiente. Cuando el cónstructo de DNA utilizado es tal que el DNA heterologo no se incorpora en el genoma de planta, el método además es ventajoso ya que la planta expresa el producto deseado pero no se define como genéticamente modificada.

Asi, de acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un método para introducir DNA heterologo y por lo menos una célula de un embrión de semilla de planta que comprende poner en contacto una semilla de planta con un medio de cebado que contiene un cónstructo de DNA basado en virus que comprende el DNA heterologo bajo condiciones que permiten el cebado para de esta manera obtener el embrión de semilla que comprende el DNA heterologo.

De acuerdo con ciertas modalidades, el método además comprende la etapa de proporcionar condiciones adecuadas para la germinación de la semilla subsecuente y el crecimiento para obtener una planta o parte de la misma que comprende el DNA heterologo.

De acuerdo con ciertas modalidades, el cónstructo de DNA basado en virus comprende genes virales o partes del mismo que permiten la replicación y dispersión sin indicios del cónstructo en las células de planta adyacentes.

De acuerdo con modalidades típicas, el cónstructo de DNA es un cónstructo basado en Geminivirus, De acuerdo con estas modalidades, el constructo comprende el DNA heterólogo flanqueado por secuencias de ácido nucleico no contiguas que codifican la replicasa de Geminivirus o proteina asociada replicasa .

De acuerdo con otras modalidades, el constructo además comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína de un recubrimiento de Geminivirus modificado (CP) . De acuerdo con modalidades típicas, la proteína de recubrimiento de Geminivirus modificada que codifica un polinucleótido comprende una mutación o supresión de nucleótidos que codifican los 100 aminoácidos N-terminales .

De acuerdo con modalidades típicas adicionales el constructo de expresión además comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína V2 de Geminivirus modificada.

De acuerdo con modalidades típicas adicionales el constructo de expresión además comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína C4 de Geminivirus modificada. De acuerdo con estas modalidades, la proteína C4 de Geminivirus modificada incluye una mutación o supresión, De acuerdo con ciertas modalidades el constructo de expresión además comprende una secuencia de polinucleótido bacteriana.

De acuerdo con ciertas modalidades actualmente preferidas, el Geminivirus es el Virus de Hoja Ondulada Amarilla de Tomate (TYLCV) . De acuerdo con estas modalidades, el constructo basado en Geminivirus se selecciona del ¡grupo que consiste de IL-60 que tiene la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID N0:1 e IL-60-BS que tiene la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con ciertas modalidades, el constructo de DNA se diseña como un constructo de expresión tal que el DNA heterólogo se expresa en la célula de planta. De acuerdo con estas modalidades, el constructo de DNA además comprende por lo menos un elemento regulador seleccionado del grupo que consiste de un aumentador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción.

De acuerdo con modalidades adicionales, el constructo de DNA además comprende un marcador para identificar las semillas y/o plantas que comprenden el DNA heterólogo.

El DNA heteróloogo puede codificar cualquier producto deseado, incluyendo péptidos, polipéptido, proteínas y RNAs. Las proteínas o RNAs pueden ser de origen de planta o de otro origen, incluyendo pero no limitado a origen bacteriano y mamífero. De acuerdo con ciertas modalidades, el DNA codifica un RNA inhibidor seleccionado del grupo que consiste de RNA de antisentido, dsRNA, siRNA y los similares, tal que la expresión de un gen objetivo es silenciada. · De acuerdo con otras modalidades, el DNA heterólogo codifica un producto de la expresión de la cual confiere un atributo agronómico deseable que incluye, pero no limitado a, resistencia a estrés biótico o abiótico, rendimiento incrementado, calidad de rendimiento incrementado, patrón de crecimiento preferido y los similares. De acuerdo con modalidades adicionales, los productos. de proteina codificados son útiles en la industria cosmética o farmacéutica. De acuerdo con todavía modalidades adicionales, la proteína codifica aumenta la producción de metabqlitos deseados dentro de las células y tejidos de planta.

De acuerdo con todavía otras modalidades el DNA heterólógo no codifica un producto deseado sino que está presente meramente como una etiqueta al origen de la semilla, o a la planta cultivada de la semilla, por ejemplo para prevenir la distribución ilegal de semillas, plantas y tejidos patentados.

El DNA heterólógo puede ser expresado transientemente en las células y las células derivadas de las mismas, o se puede incorporar en el genoma de la célula. El DNA heterólógo puede estar presente en el citoplasma de la célula de planta, en sus organelas o en el nucléolo como una secuencia de DNA integrada o no integrada.

De acuerdo con ciertas modalidades actualmente preferidas el constructo de DNA es un constructo basa:do en Geminivirus diseñado tal que el DNA heterólógo no es incorporado en el genoma de célula sino que el constructo es capaz de replicarse y dispersarse dentro de las células de la planta cultivada de la semilla que comprende el! DNA heterólogo .

Cualquier sistema de cebado y condiciones como es conocido para una persona experta en la técnica se puede utilizar de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, incluyendo sistemas que comprenden soluciones acuosas con potencial osmótico adecuado y sistemas que comprenden materiales particulados sólidos. El potencial del agua del medio permite la captación de agua que sea insuficiente para empapamientos de semilla completos, y permite solamente las etapas iniciales de germinación pero no la emergencia de radículas (completación de germinación) . El sistema y las condiciones típicamente se seleccionan de acuerdo con las especies de la semilla de planta.

De acuerdo con todavía modalidades adicionales, la presente invención proporciona una semilla producida por los métodos de la invención, la semilla comprende un constructo de DNA basado en virus que comprende el DNA heterólogo, y plantas o partes de las mismas producidas de la semilla.

De acuerdo con ciertas modalidades, la semilla de planta es de un origen de monocotiledónea . De acuerdo con otras modalidades, la semilla de planta es de un origen de dicotiledónea .

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención llegarán a ser claros a partir de la siguiente descripción y dibujos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 demuestra el efecto del cebado de semilla en la uniformidad de germinación.

La FIG. 2 es una ilustración de los constructos basados en Geminivirus utilizados en los experimentos de cebado de semilla descritos en la presente. Fig 2A: IL-60-BS. Fig. 2B: pIR-GUS.

La FIG. 3 muestra la presencia de secuencias GUS en hojas de tomate reales después del cebado de semilla en la presencia del constructo basados en Geminivirus, detectada por PCR. Las flechas de guiones y sólidas indican la posición de un marcador de tamaño de 1, 500 bp y la posición de GUS (aproximadamente 1,800 bp) respectivamente (franja 1). La franja 8 y 12 son controles negativos: PCR de plantas cultivadas de semillas no tratadas y de planta de semillas empapadas en constructo de DNA, respectivamente.

La FIG. 4A y 4B muestra secciones cruzadas de hojas de tomate manchadas para la actividad de GUS después del cebado de semilla en la presencia de IL-60-BS y pIR-GUS (Fig. 4B amplificación X40) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones - El término "cebado" como se utiliza en la presente i se refiere al tratamiento de hidratación restringido de pre-sembrado de las semillas para mejorar la germinación y establecimiento de la plántula y a los procesos bioquímicos, fisiológicos y biológicos que ocurren con la semilla antes de la hidratación completa y germinación. El proceso de cebado controla y manipula la disponibilidad del agua a las semillas tal que la disponibilidad del agua será suficiente para iniciar y afectar los eventos tempranos de germinación, pero no es suficiente para permitir la emergencia de radícula. Dependiendo de la especie de planta y recubrimiento dé los cultivadores, la hidratación controlada descrita en lo anterior es subsecuentemente seguida por el secado parcial o completo, tal que las semillas pueden ser almacenadas adicionalmente durante períodos de tiempo cortos o largos hasta el sembrado.

Como se utiliza en la presente, el término "medio de cebado" se refiere a ya sea a soluciones (inorgánicas, por ejemplo, sales/nutrientes, u orgánicas, por ejemplo PEG) o a sistemas particulados sólidos (por ejemplo que comprenden caolín) que dan por resultado hidratación controlada con agua. Ejemplos de tales medios se especifican en Taylor G P. y colaboradores (1998. Seed Science Technology 8:245- 256).

El término "condiciones que permiten el cebado" se refiere a las condiciones adecuadas de la composición del medio (por ejemplo, PEG osmótico u otras soluciones de componentes, absorbentes de agua sólidos, y más) ; duración; temperaturas; regímenes de luz/oscuridad; y aireación (por ejemplo, revolvimiento, agitación, burbujeo, etc.) para inducir el cebado de semilla utilizando cualquier técnica como se conoce en el arte para la captación de agua controlada.

El término "plantas tratadas" se refiere a plantas en las cuales el DNA heterólogo se ha introducido,, sin considerar si se ha integrado en el genoma de planta, en sus organelas, o permaneció libre en el citoplasma, o residió como un episoma en el núcleo sin integración.

El término "planta" se utiliza en la presente en su sentido más amplio. Este incluye, pero no está limitado a, cualquier especie de planta leñosa, herbácea, perenne o anual. Este también se refiere a una pluralidad de células de planta que son grandemente diferenciadas en una estructura que está presente en cualquier etapa de desarrollo de una planta. Tales estructuras incluyen, pero no están limitadas a, una raíz, tallo, retoño, hoja, flor, pétalo, fruto, cualquier órgano de almacenamiento (por ejemplo, tubérculo, bulbo, tallo bulboso, tallo falso, hojas, etc.). El término "tejido de planta" incluye tejidos diferenciados y no diferenciados de plantas que incluyen aquellos presentes en raíces, retoños, hojas, polen, semillas y tumores, así como células en cultivo (por ejemplo, células individuales, protoplastos , embriones, callos, etc.)- Te ido de planta puede estar dentro de la planta, en el cultivo de órgano, cultivo de tejido o cultivo de célula. El término "parte de planta" como se utiliza en la presente se refiere a un órgano de tejido de planta.

El término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, DNA o RNA) que comprende secuencias de codificación necesarias para la producción de RNA o un polipéptido. El término comprende genes naturales asi como diseñados por el hombre (sintético) . Un polipéptido puede ser codificado con una secuencia de codificación de longitud completa o por cualquier parte de la misma. Los términos "partes de la misma" cuando se utiliza en referencia a un gen se refiere a fragmentos de ese gen que varían de tamaño de unos pocos nucleótidos a la secuencia de gen completa menos un nucleótido. Así, "una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos una parte de un gen" puede comprender fragmentos del gen o el gen completo, El término "gen" también abarca las regiones de codificación de un gen estructural incluye secuencias localizadas adyacentes a la región de codificación en ambos de los extremos 5' y 3' por una distancia de aproximadamente 1 kb o sobre cualquiera. Las secuencias que están localizadas 5' de la región de codificación y que están presentes en el mRNA son referidas como secuencias no traducidas 5' (o sin traducir) (5' UTR) . Las secuencias que están localizadas 3' o corriente debajo de la región de codificación y que están presentes en el mRNA son referidas como secuencias no traducidas 3' (o sin traducir) (3' UTR) .

El término "ácido nucleico" como se utiliza en la presente se refiere a RNA o DNA que es lineal o ramificado, de una sola o doble hebra, o un híbrido del mismo. El término también abarca híbridos de RNA/DNA.

Los términos "DNA heterólogo" o "DNA exógenos" se refieren a un polinucleótido que no está presente en su ambiente natural (es decir, ya sea alterado por la mano del hombre) . Por ejemplo, un DNA heterólogo incluye un polinucleótido de una especie introducida en otra especie. Un DNA heterólogo también incluye un polinucleótido nativo a un organismo que se ha alterado en alguna manera (por ejemplo, mutado, adicionado en múltiples copias, enlazado a un promotor no nativo o secuencia aumentadora, etc. El término heterólogo puede comprender secuencias de gen origen de bacteria y plantas mamíferas. Las secuencias de gen pueden comprender formas de cDNA de un gen; las secuencias del cDNA pueden ser expresadas en ya cualquier sentido (para producir mRNA) u orientación de antisentido (para producir un transcripto de RNA de antisentido que es complementario al transcripto de mRNA) .Los genes de planta heterólogos se distinguen de los genes de planta endógenos y que las secuencias de gen heterólogas típicamente se unen a secuencias de nucleótidos que comprenden elementos reguladores tales como promotores que no se encuentran naturalmente asociados con el gen para la proteína codificada por el gen heterólogo o con secuencias de gen de planta en el cromosoma, que están asociados con porciones del cromosoma no encontradas en la naturaleza (por ejemplo, genes expresados en sitios donde el gen no es normalmente expresado) .

El término "constructo" se utiliza en la presente en su sentido amplio, refiriéndose a una molécula de ácido nucleico artificialmente ensamblada o aislada que incluye el DNA heterólogo de interés. En general un constructo puede incluir el DNA heterólogo, típicamente un gen de interés, un gen marcador que en algunos casos también puede ser el gen de interés y secuencias reguladoras apropiadas, Se va a apreciar, que en la inclusión de secuencias reguladoras en un constructo es opcional, por ejemplo, tales secuencias no pueden ser requeridas en situaciones donde las secuencias reguladoras de una célula hospedera van a ser utilizadas. El término constructo incluye vectores pero no se deben observar como que son limitados a los mismos.

El término "operablemente enlazado" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico sobre un fragmento de ácido nucleico individual de modo que la función de uno es regulada por el otro. Por ejemplo, un promotor es operablemente enlazado con una secuencia de codificación cuando es capaz de regular .la expresión de esa secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias de codificación pueden ser operablemente enlazado a secuencias reguladoras en una orientación de sentido o antisentido .

Los términos "elemento promotor", "promotor" o "secuencia promotora" como se utiliza en la presenté, se refiere a una secuencia de DNA que está localizada en el extremo 5' (es decir, precede) la región de codificación de proteina de un polímero de DNA. La localización de la mayoría de los promotores conocidos en la naturaleza precede la región transcrita, El promotor funciona como una conmutación, que activa la expresión de un gen. Si el gen es activado, se dice que es transcripto, o que participa para la transcripción. La transcripción involucra la síntesis de rtiRNA del gen. El promotor, por lo tanto, sirve como un elemento regulador transcripcional y también proporciona un sitio para la iniciación de transcripción del gen del mRNA., Los promotores pueden ser derivados en su totalidad de un gen nativo, o ser compuesto de elementos diferentes derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, p aun comprender segmentos de DNA sintético. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de célula, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Además se reconoce puesto que la mayoría de los casos los limites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de DNA de alguna variación pueden tener actividad de promotor idéntica. Los promotores que causa que un gen sea expresado en la mayoría de tipos de célula en la mayoría de las veces son comúnmente referidos como "promotores constitutivos". Nuevos promotores de v'arios tipos útiles en células de planta están constantemente siendo descubiertos; numerosos ejemplos se pueden encontrar en Okamuro J K and Goldberg R B (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82.

Como se utiliza en la presente, el término un "aumentador" se refiere a una secuencia de DNA que puede estimular la actividad del promotor, y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para aumentar el nivel o especificidad del tejido de un promotor.

El término "expresión", como se utiliza en la presente, se refiere a la producción de un producto final funcional, por ejemplo, un mRNA o una proteína.

Modos preferidos para llevar a cabo la invención La presente invención proporciona métodos para introducir DNA heterólogo en células o tejido de planta. Los métodos de la invención permiten una manera simple, fácil de usar, poco costosa, ampliamente accesible y eficiente para producir semillas y plantas qu.e comprender DNA exógeno. De acuerdo con los métodos de la invención el DNA deseado se introduce en las semillas y luego las plantas se cultivan a partir de las semillas, asi incrementando considerablemente la eficiencia y la introducción del DNA y el ahorro en el proceso de regeneración de planta costoso y algunas veces difícil .

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un método para introducir DNA heterologo en por lo menos una célula de un embrión de semilla de planta que comprende poner en contacto la semilla de planta con un medio de cebado que contiene un constructo de DNA basado en virus que comprende el DNA heterologo bajo condiciones que permiten el cebado, para de esta manera obtener un embrión de semilla que comprende el DNA heterologo.

De acuerdo con ciertas modalidades, el constructo de DNA basado en virus comprende genes virales o partes de los mismos que permiten la replicación y dispersión sin indicios del constructo en células de planta adyacentes.

De acuerdo con ciertas modalidades, el método además comprende proporcionar las condiciones adecuadas para germinación de semilla subsecuente y el crecimiento para obtener una planta o parte de la misma que comprende el DNA heterólogo.

El término "que comprende el DNA heterólogo" cuando se utilizan se refiere a una planta o semilla que contiene por lo menos un DNA heterólogo en una o más de sus células. El término se refiere ampliamente a una planta, una estructura de planta, un tejido de planta, una semilla de planta o una célula de planta que contiene por lo menos un DNA heterólogo en por lo menos una de sus células. Este término incluye la célula primaria a la cual el DNA se introdujo y los cultivos y plantas derivados de esta célula sin considerar el número de transferencias. Toda la progenie no puede ser precisamente idéntica en el contenido de DNA, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie mutante que tiene la misma funcionalidad, como es clasificado en la célula originalmente a la cual el DNA se introdujo se incluyen en la definición del transformante.

La introducción de un DNA heterólogo en una célula puede ser estable o transiente. El término "transiente" se refiere a la introducción de uno o más polinucleótidos exógenos en una célula en la ausencia de integración del polinucleótido exógeno en el genoma de la célula hospedera. Este tipo de introducción de DNA también puede ser referido como "transformación transiente". El término "transformante transiente" asi se refiere a una célula que se ha incorporado transientemente uno o más polinucleótidos exógenos. Las células transientemente transformadas son típicamente referidas como "no transgénicas" o "no modificadas genéticamente (no-GMO)". En contraste, la introducción del DNA estable es referida como "transformación estable" dando por resultado la célula o tejido "establemente transformada" y se refiere a la introducción de integración de uno ó más polinucleotidos exógenos en el genoma de una célula. El término "transformante estable" se refiere a una célula que integrada establemente uno o más polinucleotidos exógenos en el DNA genómico u organelar (cloroplasto y/o mitocondrio) . Las plantas o partes de las mismas que comprenden célula establemente transformada con DNA exógeno son típicamente referidas como "plantas transgénicas", "célula de planta transgénica" o, en el contexto de la presente invención "semillas transgénicas".

El constructo de DNA basado en virus de la presente invención es capaz de la dispersión sistémica, sin indicios en la planta a la cual se introdujo. Como se utiliza en la presente, el término "dispersión sistémica, sin indicio" se refiere a la habilidad del vector basado en virus para dispersarse, por ejemplo, de la célula de embrión a las células de hoja en desarrollo, sin inducir los síntomas patogénicos característicos del virus. El constructo de DNA además puede ser transmitido a la descendencia de la planta que comprende el DNA heterologo. Sin desear que sea limitado por alguna teoría específica o mecanismo de acción, la transferencia puede resultar de la dispersión del constructo de DNA basado en virus en las células reproductivas de la planta .

De acuerdo con cierta modalidad actualmente preferida, el constructo de DNA está basado en los componentes genéticos de Geminivirus, como es divulgado en la publicación de solicitud internacional (PCT) No. WO2007/141790 incorporado en la presente en su totalidad por referencia. El constructo comprende la secuencia de polinucleótido heteróloga flanqueada por secuencias de ácido nucleico no contiguas que codifican una replicasa de Geminivirus .

De acuerdo con otras modalidades, el constructo además comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína de recubrimiento de Geminivirus modificada (CP) . De acuerdo con modalidades típicas, la proteína de recubrimiento de Geminivirus modificada tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. De acuerdo con modalidades adicionales, la proteína de recubrimiento de Geminivirus modificada que codifica el polinucleótido comprende una mutación o supresión de nucleótidos que codifican los 100 aminoácidos N-terminales .

De acuerdo con modalidades típicas adicionales, el constructo de expresión además comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína V2 de Geminiyirus modificada. De acuerdo con modalidades típicas, la proteína V2 de Geminivirus modificada tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4.

De acuerdo con modalidades típicas adicionales el constructo de expresión además comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína C4 de Geminivirus modificada. De acuerdo con modalidades típicas, la proteína C4 de Geminivirus modificada tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. De acuerdo con estas modalidades, la proteína C4 de Geminivirus modificada incluye una mutación o supresión.

Va a ser explícitamente entendido que otro constructo basado en virus que lleva polinucleótidos heterólogos largos y capaz de la replicacion y dispersión sin indicios también está abarcada dentro de las enseñanzas de la presente invención. Como se utiliza en la presente, el término "polinucleótidos heterólogos largos" se refiere a polinucleótidos de por lo menos 1 kb de largo, típicamente por lo menos 5 kb de largo más típicamente 6 kb de largo.

De acuerdo con ciertas modalidades típicas, el constructo de DNA está basado en el virus de hoja ondulada amarilla de tomate (TYLCV) . Ejemplos de tales constructos son IL-60-BS (que tiene una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 2) y pIR-GUS (que tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 8) como es descrito en la Figura 2.

El constructo basado en Geminivirus utilizado de acuerdo a las enseñanzas de la presente invención se introduce en las células de embrión de semilla, y no se integra en el genoma de las células. La planta cultivada de la semilla que comprende el DNA heterólogo y la planta cultivada de la misma asi son referidas como planta no genéticamente modificada.

El uso agrícola de plantas genéticamente modificadas es una materia de debate público y en muchos países es inaceptable por la ley o la regulación. Las consideraciones principales consideradas contra el uso de plantas transgénicas son la ausencia de selección apropiada de un linaje transgénico (debido a efectos posicionales perjudiciales enmascarados) , fertilización cruzada posible con malas hierbas y otros cultivos, alteraciones de genoma adicionales debido a la recombinación (especialmente cuando se adicionan copias de genes endógenos) y transducción posible de las secuencias foráneas a microorganismos de planta y del suelo. La introducción de genes resistentes a antibiótico al alimento y el ambiente también es un problema mayor.

La bio-seguridad y aspectos ambientales solamente se pueden concluir en las siguientes pruebas en campo actuales, cuidadosamente controladas a través del tiempo. La evacuación para conducir tales experimentos depende de la evaluación basada en datos de laboratorio difíciles. Una ventaja de los métodos de la presente invención surge del descubrimiento de que los constructos basados en TYCLV aparecen para ser ambientalmente favorables y listos para las pruebas en campo de bioevaluación de seguridad. Los Geminivirus no son transmisibles a la semilla (Kashina y colaboradores 2003. Phytoparasitica 31:188-199). El vector forma IL-60-BS y pIR que no son transmisibles por los insectos aun cuando las plantas fueron colonizadas con un número grande de vectores de insecto. Así, los constructos TYCLV son altamente adecuados para transformación de planta.

La presencia del DNA heterólogo en la célula de una semilla tratada, ya sea expresada transientemente o establemente integrado, se puede verificar al emplear cualquier método adecuado como es conocido para una persona experta en la técnica. La transformación estable de una célula puede ser detectada al aislar el DNA genómico y al emplear la hibridación de manchado de Southern con secuencias de ácido nucleico que son capaces de enlazar a uno o más de los polinucleótidos exógenos o empleando la reacción en cadena de polimerasa con cebadores apropiados para amplificar las secuencias de polinucleótido exógenas. La expresión del DNA transformado se puede detectar, por ejemplo, mediante el ensayo inmunosorbente enlazado a enzimas (ELISA) , que la presencia de un polipéptido codificado por uno o más de los polinucleótidos exógenos o al detectar la actividad de la proteina codificada por el polinucleotido exógeno.

Alternativamente, el DNA exógeno puede comprender un marcador. Un marcador proporciona la identificación y/o selección de una célula, planta y/o selección de una célula, planta y/o semilla que expresa el marcador. Un marcador puede codificar un producto, que cuando se expresa en un nivel suficiente, confiere resistencia a un agente selectivo. Tales marcadores y sus agentes aditivos correspondientes incluyen, pero no están limitados a, genes de resistencia a herbicida y herbicidas; genes de resistencia a antibiótico y antibióticos; y otros genes de resistencia química con los agentes químicos correspondientes. Los genes de resistencia fármaco bacteriano incluyen pero no están limitados a, neomicina fosfotransferasa II (nptll) . que confiere resistencia a canamicina, paromicina, neomicina y G418, e higromicina fosfotransferasa (hph) que confiere resistencia a higromicina B. La resistencia también puede ser conferida a herbicidas de varios grupos, incluyendo inhibidores de síntesis de aminoácido, inhibidores de fotosíntesis, inhibidores de lípido, reguladores de crecimiento, interruptores de membrana celular, inhibidores de pigmento, inhibidores de crecimiento de plántula, incluyendo pero no limitados a imidazolinonas, sulfonilureas, triazolopirimidinas, glifosato, setoxidim, fenoxaprop, glufosinato, fosfinotricina, triazinas, bromoxinilo y los similares .

El tipo adicional de marcador es un marcador en el cual la expresión puede ser detectada al seguir una reacción bioquímica que de preferencia produce color, al proporcionar un sustrato apropiado. Ejemplos son el sistema reportador GUS (beta-glucuronidasa) , luiderina-luciferasa, sistema de proteína fluorescente verde (GFP) y los similares.

De acuerdo con ciertas modalidades, el constructo de DNA demás comprende elemento regulador que incluye, pero no limitado a, un promotor, un aumentador, y una señal de terminación .

Entre los promotores mucho más comúnmente utilizados están el promotor de nopalina sintasa (NOS) (Ebert y colaboradores, 1987 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 84:5745-5749), el promotor de octapina sintasa (OCS), promotores de caulimovirus tal como el promotor 19S de virus de mosaico de coliflor (CaMV) (Lawton y colaboradores, 1987 Plant Mol Biol. 9:315-324), el promotor CaMV 35S (Odell y colaboradores, 1985 Nature 313:810-812), y el promotor 35S del virus de mosaico de esclofularia, el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de rubisco, el promotor Adh (Walker y colaboradores, 1987 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 84:6624-66280), el promotor de sacarosa sintasa (Yang y i colaboradores, 1990 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 87: l44-4148), el promotor de complejo de gen R (Chandler y colaboradores, 1989 Plant Cell 1:1175-1183), el promotor de gen de proteina de enlace a/b de clorofila. Otros promotores comúnmente utilizados son, los promotores para los genes ADPGPP de tubérculo de papa, el promotor de sacarosa sintasa, el promotor de almidón sintasa enlazado a gránulo, el promotor de gen de glutelina, el promotor ceroso de maíz, el promotor de gen Brittle y el promotor de Shrunken 2, el promotor del gen de quitinasa ácida, y los promotores de gen de zeina (15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, y 27 kD; Perdersen y colaboradores 1982 Cell 29:1015-1026). Una abundancia de promotores se describe en la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 00/18963.

Las "secuencias de no codificación 3'" se refiere a unas secuencias de DNA localizadas corriente abajo de una secuencia de codificación e incluye secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento de mRNA o la expresión génica. La señal de poliadenilación usualmente se caracteriza al afectar la adición de tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de mRNA. El uso de diferentes secuencias de no codificación 3' se ejemplifica por Ingelbrecht I L. y colaboradores (1989. Plant Cell 1:671-680).

El método de la presente invención se puede utilizar para introducir cualquier polinucleótido, la presencia y/o expresión del cual es de interés, incluyendo dar la propiedad (es) deseada de la planta tal como (a) resistencias a condiciones de estrés biótico y abiótico, por ejemplo, a insectos, nematodos, enfermedades causadas por pestes virales, bacterianas, fúngales y otros patógenos, resistencia a herbicida (s) especifico (b) adaptación a condiciones hostiles tal como la tolerancia a la sal, tolerancia a la sequía, tolerancia al frío y al calor; (c) atributos de calidad de rendimiento mejorados, incluyendo pero no limitados a pigmentación, firmeza, tipo y contenido de ingredientes que incluyen azúcares, volátiles, aceites, ácidos grasos y/o ácidos, tamaño, tasa de crecimiento, hábito de crecimiento enano,. tiempo de emergencia, tiempo de aparición de fruto y maduración; valor nutricional o comercial; (d) producción mejorada de rendimientos comestibles, o de metabolitos secundarios, para las industrias biofarmacéuticas y cosméticas ya sea en la forma de una proteína, metabolitos secundarios e (e) obtención de un hábito de crecimiento deseado, incluyendo vigor de la planta determinado, semideterminado e indeterminado (por ejemplo, para tomate) , enano y normal (por ejemplo, para maíz) y vigor de planta. El DNA introducido también pude conferir silenciamiento del gen tal que el DNA heterólogo está en la forma de antisentido, siRNA, dsRNA; o ! para producir materias primas para industrias, que incluyen 1 pero no limitadas a fibra, madera, aceites, resinas, etc. asi como otros atributos de la planta gobernados por factores genéticos y/o interacción por genes y el medio ambiente.

La secuencia de polinucleotido expresada puede codificar una molécula que protegería la planta de los factores de estrés abiótico tales como sequía, calor o enfriamiento. Ejemplos incluyen polipéptidos anticongelación de Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512) o M. octodecemspinosus, el factor de transcripción de Arabidopsis thaliana CBF1, glutamato deshidrogenasas (WO 97/12983, WO 98/11240) , genes de proteína quinasa dependiente de calcio (WO 98/26045), calcineurinas (WO 99/05902), caseína quinasa de levadura (WO 02/052012), farnesiltransferasas (WO 99/06580), ferritina (Deak M. y colaboradores 1999. Nature Biotechnology 17:192-196), oxalato oxidasa (WO 99/04013), factor DREBIA (Kasuga M. y colaboradores 1999. Nature Biotech 17:276-286), genes de síntesis de of manitol o trehalosa tal como trehalosa-fosfato sintasa o trehalosa-fosfato fosfatasa (WO 97/42326) o al inhibir genes tal como trehalasa (WO 97/50561 ) .

La secuencia de polinucleotido expresada podría ser una enzima metabolizable para el uso en un sector de alimentos y de alimentación. Ejemplos incluyen fitasas (GenBank Ace. No. :A 19451) y celulasas.

La secuencia de polinucleótido expresada puede conferir resistencia a virus, hongos, insectos, nematodos y otros patógenos y enfermedades, al atacar directamente el patógeno, volver a las defensas del hospedero o al conducir a una acumulación de ciertos metabolitos a proteínas. Ejemplos incluyen glucosinolatos (defensa contra herbívoros) , quitinasas o glucanasas y otras enzimas que destruyen la pared celular de parásitos, proteínas de inactivación de ribosomas (RIPS) y otras proteínas de la resistencia de planta y reacción de estrés como son inducidas cuando las plantas son lesionadas o atacadas por microbios, o químicamente, mediante, por ejemplo, ácido salicílico, ácidos jasmónico o etileno, o lisozimas de fuentes no de planta tales como, por ejemplo, T4-lisozima o lisozima de una variedad de mamíferos, proteínas insecticidas tal como endotoxina de Bacillus thuringiensis, inhibidor de -amilasa o inhibidor de proteasa (inhibidor de tripsina de caupís), lectinas tal como alutinina de germen de trigo, siRNA, RNA de antisentido, TNAsas o ribozimas. Ejemplos adicionales son ácidos nucleicos que codifican la endotiquinasa chit42 de Trichoderma harzianum (GenBank Ace. No.:S78423) o la proteína P-450 de citocromo multifuncional (CYP79) N-hidroxilante de Sorghum bicolor (GenBank Ace. No.: U32624), o equivalentes funcionales de las mismas.

La resistencia a pestes tales, por ejemplo, la peste de arroz Nilaparvata lugens en plantas de arroz se puede lograr al expresar la lectina aglutinina de capadilla de invierno {Galanthus nivalis) (Rao y colaboradores 1998. Plant J 15 (4) : 469-77) .

La expresión de genes sintéticos crylA(b) y crylA(c) , que codifican delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis específicos de lepidóptera puede dar origen a una resistencia a pestes de insectos en varias plantas (Goyal R K. y colaboradores 2000. Crop Protection 19 (5) : 307-312) .

Los genes adicionales que son adecuados para la defensa de patógenos comprenden la "proteína de inhibición de poligalacturonasa" (PGIP) , traumatina, invertasa y péptidos antimicrobianos tal como lactoferrina (Lee T J. y colaboradores 2002. J er Soc Horticult Sci 127 (2 ): 158-16 ) . La secuencia de polinucleótido expresada puede originar una acumulación de sustancias químicas tales como tocoferoles, tocotrienoles o carotenoides . Un ejemplo de tal polinucleótido es fitoeno desaturasa. Se prefieren ácidos nucleicos que codifican el fitoeno desaturasa de Narcissus pseudonarcissus (GenBank Ace. No.: X78815) o equivalentes funcionales de la misma. La secuencia de polinucleótido expresada se puede utilizar para la producción de nutracéuticos tales como, por ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados (ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico o ácido docosahexaenoico) mediante elongasas y/o desaturasas de ácido graso, o para la producción de proteínas con valor nutricional mejorado, tal como, por ejemplo, con un alto contenido de aminoácidos esenciales (por ejemplo, el gen de albúmina 2S de alto contenido de metionina de la nuez de Brasil) . Se prefieren secuencias de polinucleótido que codifican la albúmina 2S de alto contenido de metionina de Bertholletia excelsa (GenBank Ace. No..??044391) , la delta .6. acil-lípido desaturasa de Physcomitrella patens (GenBank Ace. No.: AJ222980), la delta-6-desaturasa de Mortierella alpina (Sakuradani y colaboradores 1999. Gene 238:445- 53), la delta-5-desaturasa de Caenorhabditis elegans (Michaelson y colaboradores 1998, FEBS Letters 439:215-218), la A5-ácido graso desaturasa de Caenorhabditis elegans (des- 5) (GenBank Ace. No. : AF078796) , la delta-5-desaturasa de i Mortierella alpina (Michaelson y colaboradores JBC 1 273: 19055-19059), la delta-6-elongasa de Caenorhabditis elegans (Beaudoin y colaboradores 2000. PNAS 97:6421-6426), la delta-6-elongasa de Physcomitrella patens (Zank y colaboradores 2000. Biochemical Society Transactions 28:654-657), o equivalentes funcionales de estas.

La secuencia de polinucleótido expresada se puede utilizar para la producción de proteínas de alta calidad y enzimas para propósitos industriales (por ejemplo enzimas, tales como lipasas) o como sustancias farmacéuticas (tales como, por ejemplo, anticuerpos, factores de coagulación de sangre, interferonas, linfoquinas, factor de estimulación de colonia, activadores de plasminógeno, hormonas o vacunas, como es descrito, por ejemplo, por Hood E E. y colaboradores (1999. Curr Opin Biotechnol 10(4):382-60 y Ma J K. y colaboradores (1999. Curr Top Microbiol Immunol 236:275-92) . Por ejemplo, ha sido posible producer avidina recombinaríte de albumen de pollo y P-glcorinasa bacteriana (GUS) en una gran escala en plantas de maíz transgénicas (Hood y colaboradores 1999. Adv Exp Med Biol 464:127-47; Review) .

La secuencia de polinucleótido expresada también se puede utilizar para obtener una almacenabilidad incrementada en células que normalmente comprenden menos proteínas de almacenamiento o lípidos de almacenamiento, con el propósito de incrementar el rendimiento de estas sustancias por ejemplo acetil-CoA carboxilasa. Las secuencias de polinucleótido preferidas son aquellas que codifican la acetil-CoA carboxilasa de Medicago (accase) (GenBank Ace . No.:L25042), o equivalentes funcionales de la misma.

Ejemplos adicionales de polinucleótidos expresables incluyen el antígeno de superficie de Hepatitis B (Kumar GBS y colaboradores 2005. PLANTA 222 (3) : 484-493) , resistencia a herbicida (Duke, S O. 2005. Pest Management Science 61(21):1-218), interferona (Edelbaum, O. y colaboradores, 1992. J.

Interferon Res. 12:449-453), T7-RNA polimerasa (Zeitoune y colaboradores 1997. Plant Science 141:59-65).

Ejemplos adicionales de secuencia de polinucleótido que se puede expresar en las plantas transformadas de la presente invención son mencionadas por ejemplo en Dunwell J M. 2000. J Exp Bot. 51:487-96.

El DNA heterólogo transformado en la célula de planta de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención también se puede emplear para la reducción (supresión) de transcripción y/o traducción de genes objetivo. Asi, el constructo de DNA puede comprender DNA heterólogo la expresión de la cual origina PTGS ( silenciamiento dé gen post-transcripcional) o efectos de TGS (silenciamiento transcripcional ) y asi una reducción de la expresión de genes endógenos. Tal reducción se puede lograr por ejemplo mediante la expresión de un RNA de antisentido o de un RNA de doble hebra, cada uno de los cuales tiene homología con el gen objetivo endógeno que es suprimido. También, la expresión de un sentido adecuado puede causar una reducción de expresión de genes endógenos, por medio de lo que se conoce como co-supresión (publicación de solicitud europea No. 0465572) . Particularmente se prefiere la expresión de un RNA de interferencia pequeña de doble hebra (siRNA) para reducir la expresión de gen de un gen objetivo por la vía de la interferencia de RNA (RNAi) . Los métodos para inhibir genes objetivo individuales utilizando RNA con estructura de doble hebra, desde el gen objetivo y la región del dúplex de1 RNA tienen por lo menos identidad parcial son conocidos para una persona experta en la técnica.

Lo siguiente proporciona ejemplos para aplicaciones donde la reducción de la expresión génica se puede obtener al transformar la semilla de planta con un DNA heterólogo apropiado de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención .

La maduración de fruto retardado o un genotipo de maduración modificado (maduración prolongada, senescencia posterior) se puede lograr por ejemplo al reducir la expresión génica de genes seleccionado del grupo que consiste de poligalacturonasas, pectina esterasas, ß-1, 4 ) glucanasas (celulasas) , ß-galactanasas (ß-galactosidasas) , o genes de biosintesis de etileno tal como 1-aminociclopropano-l-carboxilato sintasa, adenosilmetionina hidrolasa (SAMase) , aminociclopropano-l-carboxilato deaminasa, aminociclopropano-1-carboxilato oxidasa, genes de biosintesis y de carotenoide tal como, por ejemplo, genes de biosintesis de p-fitoeno o biosintesis de fitoeno, por ejemplo, fitoeno desaturasas, y o-metiltransferasas , proteina portadora de acilo (ACP) , factor de alargamiento, gen inducido por la auxina, ciseina (tiol ) proteinasas, almidón fosforilasas , piruvato decarboxilasas, calcona reductasas, proteina quinasas, gen relacionado con auxina, transportadores de sacarosa, gen del patrón de meristema. Genes ventajosos adicionales1 se describen por ejemplo en las publicaciones de solicitudes internacionales (PCT) Nos. WO 91/16440, O 91/05865; WO 91/16426, WO 92/17596, WO 93/07275 o WO 92/04456. Particularmente se prefiere la reducción de la expressión de poligalacturonasa para la prevención de la degradación de célula y pulposidad de plantas y frutas, por ejemplo, tomates. Las secuencias de ácido nucleico tales como aquellas del gen poligalacturonasa de tomate (GenBank Ace. No.:xl4074) o sus homólogos se pueden utilizar de preferencia para este propósito .

La reducción de la expresión génica de genes que codifican proteínas de almacenamiento tienen numerosas ventajas, tales como, por ejemplo, la reducción del potencial alergénico o composición que considera la modificación o cantidad de otros metabolitos, tales como, por ejemplo, contenido de aceite o almidón.

La resistencia a patógenos de planta tales como arácnidos, hongos, insectos, nematodos, protozoarios, virus, bacterias y enfermedades se puede lograr al reducir la expresión génica de genes que son esenciales para el crecimiento, supervivencia, ciertas etapas de desarrollo (por ejemplo, pulpación) o la multiplicación de un patógeno específico. Tal reducción puede originar una inhib'ición completa de las etapas mencionadas en lo anterior, o bien un retardo de las mismas. Ellos pueden tomar la forma de genes de planta que por ejemplo hacen posible la penetración del patógeno, pero también pueden ser genes de patógeno homólogos. La secuencia de ácido nucleico transformada y heteróloga expresada (por ejemplo, el RNA de doble hebra) se dirige contra genes del patógeno, tal que el ciclo de vida de patógeno es interrumpido.

La resistencia de virus se puede lograr por ejemplo al reducir la expresión de una proteina de recubrimiento viral, una replicasa viral, una proteasa viral y los similares. Un gran número de virus de planta y genes objetivo adecuados son conocidos para la persona experta.

La reducción de constituyentes de planta indeseados, alergénicos o tóxicos tales como, por ejemplo, glucosinolatos o patatina. Los genes objetivo adecuados se describen (en O 97/16559, inter alia) . Los genes objetivo que son preferidos para la reducción de proteínas alergenicas son descritos por ejemplo por Tada Y y colaboradores (1996) FEBS Lett 391 (3) : 341-345 o Nakamura R (1996) Biosci Biotechnol Biochem 60 ( 8 ): 1215-1221.

Signos retardados de senescencia. Los genes objetivo adecuados son, inter alia, cinnamoil-CoArNADPH i reductasas o cinnamoil-alcohol ' deshidrogenasas . Genes objetivo adicionales son descritos (en WO 95/07993, inter alia) .

El incremento de contenido de metionina al reducir la biosintesis de treonina, por ejemplo, al reducir la expresión de treonina sintasa (Zeh y colaboradores 2001. Plant Physiol 127(3): 92-802).

Una semilla de planta es una unidad reproductiva autocontenida completa que consiste generalmente de un embrión cigótico que resulta de la fertilización sexual o a través de la reproducción de semilla asexual (apomixis), reservas de almacenamiento de nutrientes en las estructuras referidas como cotiledones, endospermo megagametofitos, y un recubrimiento de semilla protector que abarca las reservas de almacenamiento del embrión. En la naturaleza, la maduración de las semillas de planta usualmente se realiza por la pérdida gradual de agua durante un periodo de tiempo a niveles entre 5-35% de contenido de humedad. Una vez qüe se logran estos bajos niveles de humedad, las semillas de planta se pueden almacenar durante periodos prolongados.

La germinación de semillas de planta cigóticas y apomiticas sexuales es generalmente activada por uno o más puntos ambientales tal como la presencia de agua, oxigeno, temperatura óptima o tratamiento con frio/calor, y la exposición a la luz y su duración. Las semillas germinan por medio de una serie de eventos que comienzan con la captación de agua (empapamiento) mediante una semilla seca quiescente y luego procede subsecuentemente ' a través de varios eventos biofisicos, bioquímicos y fisiológicos que finalmente dan por resultado en el alargamiento del embrión a lo largo de su eje y el desarrollo de la descendencia.

El proceso continuo de germinación de semilla se puede dividir en tres fases. La fase uno es referida como empapamiento o inhibición y se caracteriza por una captación inicial rápida de agua en la semilla. Otros eventos significantes que ocurren en la fase uno son la iniciación de la reparación del DNA nuclear y mitocóndrico, que puede haber ocurrido durante la desecación de la semilla y/o el proceso de maduración, y el comienzo subsecuente de la síntesis de proteína facilitada por mRNA existente.

La fase dos se caracteriza por una reducción significante en la velocidad de captación de agua (es decir, se ha completado el empapamiento) . Esto se realiza mediante la activación o síntesis de novo de enzimas que se especializan en hidrolizar las reservas de almacenamiento complejas de carbohidratos, proteínas y lípidos en el embrión y en los cotiledones o megagametofitos . La hidrólisis de esta reserva de almacenamiento compleja proporciona los sustratos requeridos para la respiración y crecimiento de los embriones de semilla.

La fase tres se caracteriza por un segundo incremento rápido en la velocidad de captación de agua. El agua absorbida durante la fase tres se utiliza principalmente para la iniciación de la división celular meristemática en la raíz y ápices de retoño del embrión, y para la captación en las células a lo largo del eje embrional. Cuando se toma por las células axiales del embrión se aplica presión turgorosa que da por resultado alargamiento de la célula axial. El efecto neto es que el embrión se alarga al puntp de emergencia a través del recubrimiento de semilla. La protuberancia de un retoño o radícula de raíz a través de recubrimiento de semilla significa la completación de la germinación y el inicio del crecimiento y desarrollo de la plántula.

La velocidad y éxito para la germinación de semillas varía considerablemente dependiendo de varios factores tales como la influencia residual de condiciones ambientales en las cuales se desarrolló y maduró la semilla, la cantidad de compuestos de reserva de almacenamiento sintetizado durante el proceso de maduración de semilla, la duración de almacenamiento, la calidad del ambiente de almacenamiento (por ejemplo, temperatura y humedad) y las condiciones ambientales que prevalecen durante el proceso de germinación) . Desde una perspectiva comercial, es deseable reducir el riesgo de falla de germinación y asegurar que las semillas emerjan y germinen rápidamente y uniformemente.

La necesidad comercial para el desempeño de germinación de semilla óptimo ha conducido al desarrollo de procesos conocidos en la técnica para semillas cigóticas i como "cebado de semilla". Este término se puede definir como la captación limitada de agua que es suficiente para iniciar los eventos tempranos de germinación, pero no suficiente para permitir la protuberancia de radícula, de preferencia seguida por el secado. Varias técnicas principales se utilizan comercialmente para realizar el cebado de semilla. Sin considerar el método particular utilizado, los principios fundamentales del cebado de semilla son que: (1) las etapas preliminares de germinación se activan específicamente y exclusivamente a través del control de la disponibilidad de agua a las semillas, (2) los procesos de germinación iniciaron a través de un proceso de cebado externo que son subsecuentemente detenidos por una etapa de desecación o de desecación parcial.

Inesperadamente, la presente invención ahora muestra que la inclusión de un constructo de DNA basado en virus en el medio de cebado de semilla da por resultado la captación de DNA por la semilla tal que el DNA entra en las células de semilla. Sin desear que sea limitado por alguna teoría específica o mecanismo de acción, este fenómeno puede ser atribuido a los elementos virales que permiten la introducción del DNA heterologo en las células de semilla.

Cualquier método para el sembrado de semilla como es conocido para una persona experta en la técnica se puede utilizar de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. El cebado se puede realizar bajo una variedad de temperaturas y aireación (por ejemplo, revolvimiento, agitación, burbujeo, etc.) utilizando cualquiera de las técnicas para la captación de agua controlada: cebado con soluciones (inorgánicas, por ejemplo, sales/nutrientes, u orgánicas, por ejemplo, PEG) o con sistemas particulados sólidos o mediante la hidratación controlada con agua como es descrito, por ejemplo, en Taylor, A G. y colaboradores, 998. Seed Science Technology 8:245-256).

Una matriz de cebado se caracteriza por su potencial osmótico efectivo. Un potencial osmótico efectivo típicamente disminuye el potencial de agua disponible para los empapamientos de semilla que permiten o que causan que una cantidad limitada de agua se mueva en la semilla a un nivel suficiente para iniciar las etapas de germinación sin protuberancia real de radical, es decir, cebar la semilla. La terminación de semillas ocurre solamente cuando el' agua disponible de la semilla alcanza un potencial suficiente para el desarrollo fisiológico, que varía de las especies de plantas. Típicamente este valor cae entre 0 y -2 mPa. Muchas matrices de cebado que proporciona un potencial osmótico apropiado están siendo utilizadas, incluyendo agua, agua con uno o más solutos, matrices sólidas y los similares. Por ejemplo, la matriz de cebado puede comprender una solución aireada de material osmótico, de naturaleza orgánica tal \ como polietilenglicol (PEG) (ver la patente norteamericana* No. 5,119,598), glicerol, manitol o sal inorgánica (o combinación de sales) tales como fosfato de potasio, nitrato de potasio y los similares. Alternativamente, las semillas se pueden cebar utilizando una matriz sólida. Un material de matriz sólida debe tener una alta capacidad de contención de agua para permitir que las semillas se empapen. En este método, la matriz de cebado puede comprender un medio absorbente tal como arcilla, vermiculita, perlita, polvo de aserrín, o elotes de maíz y/o turba para absorber agua y luego transferirla a las semillas (por ejemplo, patente norteamericana No. 4,912,874). El grado de hidratación se controla al alterar al contenido de agua del medio 'y la relación de medio/semilla. También se conocen métodos para empapar semillas en una suspensión de PEG 6000 y vermiculita, u otras matrices (por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,628,144). En todavía otros métodos, el cebado emplea una membrana semipermeable que media la transferencia de agua a partir de una solución caracterizada por una presión osmótica dada a la semilla (por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,873,197). En otros métodos, se puede utilizar energía ultrasónica para ayudar en el proceso de cebado (por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,453,609). Opcionalmente una variedad de aditivos, sustancias químicas, y/o compuestos se pueden incluir en la matriz de cebado, incluyendo surfactantes , agentes selectivos, fungicidas, agentes para modificar el potencial osmótico, protectores osmóticos, agentes para ayudar al secado o proteger las semillas durante el secado, agentes para aumentar el procesamiento de semilla, agentes para prolongar la vida en anaquel del almacenamiento, agentes para aumentar el recubrimiento y/o perfusión, agentes para aumentar la germinación de la semilla y los similares. Los fungicidas se pueden incluir en la matriz de cebado, por ejemplo, tiram, captan, metalaxil, pentacloronitrobenceno, fenaminosulf, bactericidas u otros conservadores. Además, varios reguladores de crecimiento u hormonas, tal como giberelinas o ácido giberélico, citoquininas, inhibidores deácido abscísico, 2- (3, 4-diclorofenoxi) trietilamina (DCPTA) , nitrato de potasio y etafon también pueden estar presentes en la matriz de cebado. Otros agentes opcionales incluyen glicerol, polietilenglicol, manitol, DMSO, Tritón X-100, Tween-20, NP-40, compuestos iónicos, compuetos no iónicos, surfactantes, detergentes y los similares. Un tiempo suficiente para producir una semilla cebada permite que los procesos metabólicos pregerminativos tomen lugar dentro de la semilla hasta cualquier nivel que incluye la emergencia de radícula inmediatamente precedente. El tiempo para producir una semilla cebada es dependiente de la variedad de semilla específica, su estado o condición, y el potencial de agua de la matriz de cebado. Mientras que cantidades de agua típicas y agua de medio potencializan los tipos de semilla dado son generalmente ya conocidos para algunas semillas, es frecuentemente mejor probar una muestra pequeña en una nueva semilla sobre un intervalo fácilmente determinado de potenciales osmóticos y temperaturas para determinar qué condiciones de temperatura, potencial de agua y tiempo proporciona el empapamiento apropiado de la semilla y los eventos de pre-germinación resultantes. La temperatura en la cual los métodos de cebado se llevan a cabo puede variar con las semillas que son tratadas, pero típicamente está entre 18°C a 30°C. Las semillas cebadas pueden ser retenidas en la matriz de cebado a través de la germinación como es determinado por la emergencia radical. La semilla producida por este método además puede ser secada (por ejemplo, como en la patente norteamericana No. 4,905,411).

Métodos para determinar si una semilla se ha cebado son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la optimización de tratamientos de cebado se puede realizar al llevar a cabo ensayos de germinación. (Ver, por ejemplo, Jeller H. y colaboradores 2003. Braz J Biol 63:61-68). Además, se conocen marcadores moleculares de germinación y/o cebado. Ver, por ejemplo, Job y colaboradores 2000. Seed Biology: Advances and Applications, Eds . Black y colaboradores, CABI International, Wallingford, UK, pp. 449-459; De Castro R D. y colaboradores 2000. Plant Physiol 122:327-336; Bradford y colaboradores 2000. Seed Biology: Advances and Applications, Eds . Bláck y colaboradores, CABI International, Wallingford, UK pp. 221-251; y Gallardo K. y colaboradores 2001 Plant Physiol 126: 835-848.

Después del cebado, las semillas se pueden dejar germinar, o las semillas cebadas se pueden secar. Las condiciones apropiadas (temperatura, humedad relativa y tiempo) para el proceso de secado variarán dependiendo de la semilla y se pueden determinar empíricamente (ver, por ejemplo, Jeller y colaboradores 2003. ibid) . El secado de la semilla cebada incluye un secado superficial de la semilla o, alternativamente, el secado de la semilla nuevamente su contenido de agua original. Las semillas secas se pueden germinar inmediatamente o se pueden almacenar bajo condiciones apropiadas. Las condiciones de germinación para varias semillas son conocidas. Un factor en determinar las condiciones de germinación apropiadas es el intervalo de temperatura de germinación de umbral, que es el intervalo de temperaturas para una especie dentro de la cual las semillas de esa especie germinarán en un nivel de humedad predeterminado y con oxígeno adecuado. Otro factor es el intervalo de humedad de germinación de humedad, que es el intervalo de humedad para una especie dentro del cual la semilla de la especie germinará a una temperatura dada y con oxigeno adecuado. El intervalo de temperatura de germinación de umbral y/o los valores de intervalo de temperatura de germinación de umbral son conocidos para varias semillas, como son los métodos para determinar empíricamente estas condiciones para cualquier semilla dada y variedad.

El método de la invención grandemente reduce el tiempo requerido para la introducción de gen (es) heterólogo en las- células de planta, generación, selección y propagación de las plantas de interés. El potencial para la variación somaclonal causada por la des-diferenciación de tejido en el cultivo es nulificado. Cuando se utiliza el constructo basado en Geminivirus, las plantas contienen DNA foráneo, ya que cada tejido infectado con microorganismos benignos lo hace, y todavía las plantas tratadas no son genómicamente modificadas. El método de la invención puede cortar drásticamente el tiempo y costo de reproducción, puesto que facilita la expresión de gen (es) de interés en cualquier variedad de planta deseada, de esta manera adicionando atributos necesarios tal como resistencia/tolerancia a condiciones de estés biótico/abiótico, mejorando el rendimiento y calidad para cualquier ambiente dado y mercado y los similares, mientras que los genes que controlan el atributo deseado son conocidos. De manera similar, el DNA heterólogo introducido de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención puede dar por resultado el silenciamiento de ciertos procesos cuando es asi requerido (por ejemplo, desarrollo de parte posterior verde en el fruto de tomate es deseado en Italia pero es inaceptable en los Estados Unidos) .

Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más completamente algunas modalidades de la invención. Ellos sin embargo, no deben ser considerados de ninguna manera como limitantes del alcance amplio de la invención. Un experto en la técnica puede idear fácilmente muchas variaciones y modificaciones de los principios divulgados en la presente sin apartarse del alcance de la invención .

EJEMPLOS E emplo 1 : Cebado utilizando un medio de cebado sin DNA foráneo El cebado de semilla de tomate en la presencia de polietilenglicol (PEG) se llevó a cabo como es descrito previamente (Khan, A A. 1992. In: Horticultural Reviews, Vol. 14, ed. J. Janick. New York: John Wiley, pp. 131-181; Taylor G. y colaboradores 1998. Seed Science Technology 8:245-256), con algunas modificaciones.

Lotes de 50 semillas de tomate se empaparon en una solución compuesta de Ca(N03)2 0.1 M, MES (ácido 4-morfolinoetansulfónico) ; MgCl2 15 mM y (solución T2 25%) o (solución T3) 20% de PEG 8000. La presión osmótica de las soluciones T2 y T3 fue -1.25 mPa y -1.2 mPa respectivamente. Las semillas secas sin tratar de la misma variedad de cultivo, el mismo lote de semillas se utilizaron como control. El tratamiento se llevó a cabo bajo temperatura constante de 20°C con un régimen de luz de 12 horas diario, y se agitó levemente durante 4 o 6 días para obtener la aireación apropiada. Las semillas luego se colocaron en papel filtro 3M suplementado con 3 mi de agua estéril y las velocidades de germinación se registraron diariamente. Los datos demuestran (Figura 1) un incremento significante en la uniformidad de germinación de la semilla cebada en comparación con el control (cebado exitoso) .

Ejemplo 2: introducción de constructos IL-60 en semillas al utilizar el medio de cebado Semillas de tomate se cebaron con una solución de cebado que contiene PEG al 25% y se germinaron como es descrito en el Ejemplo 1 anterior en la presencia de 20, 40 y 60 ]iq de cada uno de los constructos de DNA IL-60-BS (SEQ ID NO:2) y pIR-GUS (SEQ ID NO:8). Los constructos ilustran la Figura 2A y 2B, respectivamente. Los constructos también se describen en la publicación de solicitud de patente internacional (PCT) No. O 2007/141790, incorporada en la presente por referencia. Las semillas secas sin tratar y las semillas cebadas en las mismas condiciones pero sin el constructo de DNA sirvieron como control.

Seis días después de la germinación las plántulas se transplantaron en macetas que contienen 10 litros de tierra y se colocaron en un invernadero a 25 °C. Veintiún dias después de la plantación, el DNA se extrajo de las hojas reales (la cercera hoja real o arriba) y se sometieron a PCR con los siguientes cebadores para el ensayo de GUS: Cebador delantero: ATTGATCAGCGTTGGTGGGA (SEQ ID NO: 6) y cebador trasero: TGCGGTCGCGAGTGAAGATC (SEQ ID NO : 7 ) diseñados para amplificar el gen gus completo presente dentro del constructo de DNA pIR-GUS. La reacción de PCR positiva confirmó la presencia de la secuencia de DNA de GUS en las hojas reales. Estos resultados muestran que los constructos de DNA de los vectores basados en IL-60 se introdujeron a la célula (s) de semilla utilizando un procedimiento de cebador anterior. El DNA introducido se replicó, se dispersó y se expresó por todo el sistema de planta. Un ejemplo de los resultados de tal ensayo se muestra en la Figura 3.

Ejemplo 3: Expresión de los genes foráneos Los constructos de DNA de la familia IL-60 como es detallado en el Ejemplo 2 anterior (IL-60-BS en combinación con pIR-GUS) facilitaron la expresión del gen gus foráneo presente dentro del constructo de DNA pIR-GUS y se introdujo por la vía del cebado.

Las hojas de tomate de la planta obtenidas como es descrito en el Ejemplo 2 anterior se mancharon para beta-glucoronidasa (GUS) de acuerdo con Jefferson R Á. y colaboradores (1987. EMBO J 6: 3901-3907) .

El manchado de color azul del tejido de hoja claramente denota la expresión de la proteína GUS (Figura 4A-B) .

Ejemplo 4: expresión del DNA especifico de los vectores IL-60 bajo condiciones de cebado modificadas El cebado se condujo como en el Ejemplo 2 con la solución de cebado básica que contiene PEG al 5% y la adición de dimetilsulfóxido (DMSO) al 75% para obtener el potencial osmótico final de -0.131 mPa (1.296 Atm. , de acuerdo con Christopher y colaboradores, Macromolecules 2003. 36:6888-6893) . En esta solución de cebado modificada, el DNA de IR-GUS se introdujo y se replicó como es indicado por la expresión GUS como es descrito en los Ejemplos 2 y 3 anteriores .

La descripción- anterior de las modalidades específicas de esta manera completamente revelarán la naturaleza general de la invención que otros al aplicar el conocimiento actual, pueden fácilmente modificar y/o adaptar para varias aplicaciones de tales modalidades específicas sin experimentación indebida sin apartarse del concepto genérico, y, por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones -deben ser y son propuestas para ser comprendidas dentro del significado e intervalo de equivalentes de las modalidades divulgadas. Se va a entender que la fraseología o terminología empleada en la presente es para el proposito de i descripción y no de limitación. Los medios, materiales y etapas para llevar a cabo varias funciones divulgadas pueden tomar una variedad de formas alternativas sin apartarse de la invención .

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para introducir DNA heterologo en por lo menos una célula de un embrión de semilla de planta, caracterizado porque comprende poner en contacto una semilla de planta con un medio de cebado que contiene un constructo de DNA basado en virus que comprende el DNA heterologo, bajo condiciones que permiten el cebado, la semilla de planta que comprende un recubrimiento de semilla, para de esta manera obtener el embrión de semilla que comprende el DNA heterologo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la etapa de proporcionar condiciones adecuadas para la germinación de semilla subsecuente y el crecimiento para obtener una planta o parte de la misma que comprende el DNA heterologo.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el constructo de DNA basado en virus comprende genes virales o partes de los mismos que permiten la replicación y dispersión sin síntomas del constructo en células de planta adyacentes.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el constructo de DNA es un constructo basado en Geminivirus.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el constructo de DNA comprende el DNA heterólogo flanqueado por secuencias de ácido nucleico no contiguas que codifican replicasa de Geminivirus o proteínas asociadas a replicasa.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-5, caracterizado porque el Geminivirus es el Virus de Hoja Ondulada Amarilla de Tomate (TYLCV) .

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el constructo de DNA es un constructo basado en Geminivirus seleccionado del grupo que consiste de IL-60 y tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta en1 la SEQ ID NO:l e IL-60-BS que tiene la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el DNA heterólogo se expresa transientemente en por lo menos una célula del embrión de semilla y las células derivadas del mismo.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el DNA heterólogo se incorpora en el genoma de por lo menos una célula del embrión de semilla y las células derivadas del mismo.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cebado tiene un potencial de agua que permite los empapamientos de semilla pero sin emergencia de la radícula.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el medio de cebado es una solución acuosa.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el medio de cebado es una matriz sólida .

13. Una semilla, caracterizada porque comprende un constructo de DNA basado en virus que comprende el DNA heterólogo, en donde el DNA heterólogo se introdujo en la semilla al poner en contacto la semilla de planta que comprende el recubrimiento de semilla con un medio de cebado que contiene el constructo de DNA basado en virus que comprende el DNA heterólogo bajo condiciones que permiten el cebado .

14. Una planta o parte de la misma cultivada de la semilla de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la planta o parte de la misma comprende el constructo de DNA basado en virus que comprende DNA heterólogo.