MX2011013595A - Metodos para obtener plantas resistentes a sequia. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee un método no tóxico para la selección de células transformadas de entre una población que consiste de células transformadas y no transformadas. El método comprende los siguientes pasos: a) introducir a una célula al menos una secuencia nucleotídica de interés y al menos una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una secuencia que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena; b) colocar la población con células transformadas y no transformadas en un medio de cultivo que contiene una sustancia osmoreguladora como el PEG 8000 y c) seleccionar las células transformadas de la población en base a la capacidad de las células transformadas de sobrevivir y desarrollarse en presencia de la sustancia osmoreguladora, confiriendo a las plantas derivadas de estos eventos de transformación genética, por ejemplo de capacidad de tolerancia a sequía y frío.

Description

Métodos para obtener plantas resistentes a sequía Campo de la invención.

La presente Invención pertenece al área de la ingeniería genética, específicamente a los procesos de transgénesis y cisgénesis de plantas y tejido de origen vegetal y más particularmente a métodos para seleccionar células vegetales genéticamente transformadas evitando utilizar como marcador de selección genes de resistencia a sustancias tóxicas, y sin necesidad de que la célula transformada produzca una proteína y/o un metabolito nuevo o diferente que tenga un efecto negativo potencial en la célula vegetal, en la planta o en sus consumidores finales e intermediarios. De esta manera, en el método de la presente invención se utiliza una secuencia nucleotídica de selección que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena, confiriendo a las plantas derivadas de este método de selección la capacidad de tolerancia a la sequía.

Antecedentes de la invención.

Se sabe que cuando un material genético se introduce en una población celular por medio de transformación, solamente cierto número de células será transformado exitosamente. Después de la transformación, las células transformadas deben de ser identificadas y seleccionadas de entre una población de células transformadas y no transformadas. La identificación y separación de las células transformadas se ha llevado a cabo tradicionalmente utilizando métodos de "selección negativa", donde las células transformadas son capaces de sobrevivir y crecer, mientras que las células no transformadas son sujetas a una inhibición del crecimiento o a su eliminación por una sustancia a la cual, las células transformadas, en virtud de su transformación, son capaces de tolerar. Generalmente para este propósito se introduce también a la célula un gen de selección, además del transgen de interés.

Este gen de selección típicamente provee resistencia a un antibiótico o a un herbicida, con la que las células genéticamente transformadas pueden ser identificadas. Después de la transformación, la población de células transformadas y no transformadas se cultivan entonces en un medio de cultivo que contiene el antibiótico o herbicida al cual las células transformadas son resistentes, en virtud del gen de selección, permitiendo así que las células no transformadas que no contienen el gen de resistencia al antibiótico o herbicida, queden sujetas a la inhibición del crecimiento, y solamente las células transformadas son capaces de sobrevivir y crecer debido a la presencia del gen de selección introducido. Entre estos ejemplos podemos citar las patentes US6174724 y EP0131623 que utilizan como marcador de selección el gen que codifica para la enzima neomicina fosfotransferasa tipo II {nptll), la cual confiere resistencia a ciertos antibióticos de la familia de los aminoglicosidos (kanamicina, neomicina, G418, paromomicina), así como la patente US4727028 que utiliza el gen de la higromicina fosfotransferasa (hpt) para dar resistencia al antibiótico higromicina.

A pesar de su efectividad observada, los métodos de selección negativa tienen ciertas desventajas. Por ejemplo, las células no transformadas mueren debido a la presencia de antibióticos o herbicidas en el medio de crecimiento, y como resultado existe el riesgo de que no solamente las células no transformadas sino también las células transformadas puedan morir, debido a que las células no transformadas dañadas o en proceso de eliminación pueden excretar compuestos tóxicos.

Otra desventaja de gran importancia es que generalmente el uso de tales genes de selección que proveen la resistencia a un compuesto tóxico no es recomendable, desde el punto de vista ambientalista y de seguridad alimentaria, para los cultivos transgénicos y cisgénicos que son introducidos y liberados a gran escala en el medio ambiente, particularmente los cultivos alimenticios.

Una desventaja adicional de la selección negativa es que las células o tejidos vegetales tratados con sustancias tóxicas se vuelven más susceptibles a la infección bacterial. Esto representa un problema cuando se utiliza Agrobacterium como vector de transformación, debido a que los tejidos o células algunas veces pueden tener sobre-crecimiento de la bacteria a pesar de que se utilizan antibióticos para prevenir el crecimiento.

Dentro de los métodos de selección positiva podemos citar las patentes US6444878 y US5767378 que emplean genes para el metabolismo de compuestos que resultan tóxicos para la célula. La primera patente describe el uso de una secuencia nucleotídica que codifica para la actividad glucosamina-6-fosfato desaminasa, como gen de resistencia de células genéticamente transformadas que crecen en un medio de cultivo que contiene el metabolito tóxico glucosamina o uno de sus derivados. La segunda patente describe el uso de un grupo de genes que codifican fosfomanoisomerasas, fosfomanomutasas, manosaepimerasas, etc., involucrados en el metabolismo de la mañosa, o de sus derivados o precursores; así como la adición de alguno de dichos compuestos tóxicos en el medio de cultivo de selección. En ambos casos, al igual que en el uso de genes de resistencia a antibióticos y herbicidas, se lleva a que la célula genéticamente transformada produzca una proteína extraña que además de que puede resultar ser un alérgeno implica un gasto metabólico para el organismo transformado que ya ha sido seleccionado y no requiere más de este producto.

Recientemente, en la patente US7449290 se describe un método de selección de células transformadas genéticamente donde se utiliza como marcador de selección una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína que tiene actividad de trehalasa, la cual cataliza la azúcar trehalosa o de sus derivados metilados o halogenados. En este método se sobreexpresa la enzima trehalasa para permitir a la célula genéticamente transformada sobrevivir a concentraciones tóxicas del metabolito agregado al medio de selección. Al igual que en los casos anteriores, el organismo genéticamente modificado presenta una sobreproducción de una proteína que le es innecesaria después del proceso de selección, e implica también la adición de un compuesto extra al medio de cultivo de selección.

Las desventajas mencionadas anteriormente pueden superarse, al menos de manera substancial, mediante una selección positiva con el método de acuerdo a la presente invención, la cual hace posible identificar y aislar células transformadas genéticamente sin eliminar por intoxicación a las células no transformadas de la población y sin la cointroducción de genes de resistencia a antibióticos, herbicidas y otros compuestos, además de suprimir la necesidad de agregar al medio de cultivo un compuesto extra. El método de acuerdo a la presente invención evita también la producción extra de una proteína o polipéptido, que al final del proceso de selección le resulta innecesaria.

En las patentes US7214858 y US7560613 se describen fragmentos de ácidos nucleicos que codifican enzimas que intervienen en el metabolismo de la trehalosa en las plantas y semillas con el fin de obtener plantas modificadas genéticamente. Se propone el uso de secuencias de genes como: trehalasa, trehalosa fosfato sintetasa y trehalosa 6-fosfato-fosfatasa. En dichos documentos solo se presentan evidencias experimentales en plantas transgénicas que expresan trehalosa 6-fosfato-fosfatasa, sin presentarse evidencias experimentales para el caso del gen que codifica para la trehalasa. A pesar de ello, Perry y colaboradores realizan análisis de alineamientos de secuencias de la enzima trehalasa de Glycine max, Neurospora crassa, maíz y soya y es a partir de estos estudios computacionales donde proponen el uso del gen de la trehalasa para producir plantas modificadas genéticamente donde el metabolismo de la trehalosa puede ser alterado en las plantas, pero sin sugerir siquiera su uso como un método de selección.

Por lo anterior, es necesario proporcionar métodos eficientes que permitan obtener células transformadas genéticamente sin la introducción de genes extraños, evitando con ello la producción innecesaria de proteínas y/o péptidos ajenos a dichas células y que le resultan innecesarias.

Breve descripción de las figuras.

Figura 1. Se observa un mapa de la unidad de expresión génica para transformar maíz.

Figura 2. Se observa la estrategia para generar plantas transgénicas de maíz tolerantes a PEG 8000 mediante el uso de callos embriogénicos y biobalística.

Figura 3. Se observa la selección de semillas tolerantes a PEG 8000 simulador de sequía en la T1 y comprobación de la inserción molecular de la unidad funcional correspondiente al 35S NPTII. Carril 1 y 2 corresponden a plantas de papaya transformadas con el mismo vector, en donde se aprecia la señal de 1 .8 Kb esperada; carril 3 control negativo de maíz; carril 4 línea de maíz T4; carril 5 línea T7; carril 6 línea T12; carril 7 línea T1 ; carril 8 línea 6; carril 9 DNA de la línea T4 sin digerir.

Figura 4. Se observa la amplificación del cisgen y un segmento del promotor utilizando oligonucleótidos específicos, a partir de DNA total de plantas Bt7 GM y control. Se muestra una amplificación representativa, sin embargo, todas las semillas que germinaron bajo estrés, dieron señal positiva al PCR.

Figura 5. Se observa la cuantificación por RT-PCR en tiempo real de la acumulación del mRNA del gen que codifica para la trehalasa WT, silvestre; T1 y T4, GMs; H20, irrigada; SEQ, sequía.

Figura 6. Se observan plántulas crecidas en macetas y tubos para observar un posible efecto del contenedor.

Figura 7. Se observan plantas dos meses después de germinadas, en tubos PVC diseñados para aplicar sequía a maiz y permitir mediciones fisiológicas y de suelo.

Figura 8. Se observan las diferencias de crecimiento entre las variedades de plantas.

Las plantas B73 GM tienen mayor talla cuando se comparan con la planta B73 control (panel izquierdo). Se observa una comparación de la talla, nótese que la hoja puede ser más ondulada o exuberante, manteniendo así mayor superficie fotosintética (panel derecho).

Figura 9. Se observa la floración masculina en la línea B73 T1 y T4 GM.

Figura 10. Se observa la apariencia de las mazorcas en ambas plantas GM, teniendo cada planta de 3 a 5 mazorcas. El fenotipo es sustancialmente idéntico al de las plantas control.

Figura H . Se observa la medición de crecimiento de la talla desde la siembra en cilindro hasta senescencia. Se indica el inicio de la sequía, que duró dos semanas para las líneas GM. Los criollos debieron regarse a la semana, por los síntomas desarrollados en esta aplicación de sequía severa.

Figura 12. Se observan comparaciones fisiológicas entre las variedades de plantas.

Figura 13. Se observa el fenotipo de plantas bajo tratamiento de sequía. Cada panel muestra a la planta sometida a sequía hacia la izquierda, mientras que a la derecha se encuentra la planta control crecida bajo irrigación. Los paneles superiores muestran a los criollos, donde las plantas con sequía perdieron turgor y talla. En los paneles inferiores se muestra en medio a la planta control, con una diferencia significativa de talla. Cabe señalar a la planta GM T1 , (extrema izquierda) la cual no mostró una reducción estadísticamente significativa respecto de su control bajo irrigación.

Figura 14. Se observa la comparación de la medición de fotosíntesis en condiciones de humedad y sequía en B73. Tiempo de las mediciones: Día 1 : Irrigación normal. Día 6: cinco días después del inicio de sequía. Día 13: trece días después del inicio de sequía y se suspende la sequía. Día 22: diez días después de suspendida la sequía.

Figura 15. Se observa la comparación de la medición de conductancia de agua en condiciones de humedad y sequía en B73.

Figura 16. Se observa la comparación de la medición de contenido de agua en condiciones de humedad y sequía en B73.

Figura 17. Se observa la comparación de la medición del porcentaje de humedad relativa en condiciones de humedad y sequía en B73 tanto en la planta como en el suelo.

Figura 18. Se observa la comparación de la medición de contenido de CO2 en condiciones de humedad y sequía en B73.

Figura 19. Se observa la comparación de la medición de transpiración en condiciones de humedad y sequía en B73.

Figura 20. Se observan los espectros de HPLC de los picos obtenidos de trehalosa en las muestras analizadas: (A) B73 control-1 , (B) B73 control-2, (C) B73 control-3, (D) B73 T1-1 , (E) B73 T1-2, (F) B73 T1-3, (G) B73 T4-1 , (H) B73 T4-2, (I) B73 T4.

Figura 21. Se observa una gráfica de los porcentajes de trehalosa presentes en las muestras vegetales analizadas por HPLC, observándose un aumento en las plantas genéticamente modificadas conforme a la invención respecto a lo detectado en las muestras de B73 control.

Figura 22. Se observan los niveles de producción de glucosa a partir de hidrólisis de trehalosa en un tiempo de incubación de 3 horas.

Figura 23. Se observa el perfil electroforético de LD-PCR (1 % agarosa; 80 volts; 7 µ?_ de muestra) amplificado sin mareaje (sin a32P-dCTP) con el fin de conocer si se lograba la amplificación a partir de los cDNA con los que se contaba. 1 : Control negativo NTC (sin DNA); 2: B73 T4 en humedad.

Figura 24. Se observan las señales obtenidas de hibridación de las membranas de nylon que contienen los plásmidos con las sondas marcadas radioactivamente de B73 control y plantas genéticamente modificadas (T1 y T4). (1 ) B73 control en humedad, (2) B73 control en sequía, (3) B73 T1 en sequía, (4) B73 T1 en humedad, (5) B74 T4 en humedad y (6) B73 T4 en sequía. Los plásmidos fueron colocados por duplicado en renglones y columnas. Las letras A, B, C, D y E muestran las columnas con los duplicados, mientras que los números 1 al 12 muestran los renglones o líneas horizontales donde se colocaron por duplicado los genes inducidos por sequía.

Figura 25. Se observa una gráfica del comportamiento de inducción o represión de genes involucrados en la respuesta a estrés abiótico detectados en plantas B73 control y genéticamente modificadas conforme a la invención.

Figura 26. Se observa una gráfica del comportamiento de inducción o represión de genes involucrados en la fotosíntesis detectados en plantas B73 control y genéticamente modificadas conforme a la invención.

Figura 27. Se observa una gráfica del comportamiento de inducción o represión de genes involucrados en la respuesta a estrés biótico detectados en plantas B73 control y genéticamente modificadas conforme a la invención.

Figura 28. Se observa una gráfica del comportamiento de inducción o represión de genes asociados al metabolismo de carbohidratos detectados en plantas B73 control y genéticamente modificadas conforme a la invención.

Figura 29. Se observa una gráfica del comportamiento de inducción o represión de genes clasificados como desconocidos y/o proteínas hipotéticas, detectados en plantas B73 control y genéticamente modificadas conforme a la invención.

Descripción detallada de la invención.

La presente invención describe un método para seleccionar células genéticamente transformadas en las que se ha incorporado una secuencia nucleotídica de interés que le da a las células transformadas una ventaja selectiva. La ventaja selectiva que poseen las células transformadas puede deberse a su mejor capacidad, en relación con las células no transformadas, para sobrevivir y desarrollarse en un medio con baja disponibilidad de agua para las células.

Uno de los objetivos de la presente invención es proveer un método de selección eficiente de transformantes, por ejemplo plantas, donde se eliminan las desventajas mencionadas anteriormente para los métodos que utilizan genes marcadores de selección. Para alcanzar dicho objetivo la presente invención provee un método para identificar y/o seleccionar células que tienen una ventaja metabólica como resultado de haber sido transformadas de entre una población de células transformadas y no transformadas, que son cultivadas sobre o dentro de un medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador, como por ejemplo polietilenglicol 8000 (PEG8000), manitol, sorbitol, NaCI o cualquier otro agente osmoregulador, donde el método comprende: a) introducir a una célula al menos una secuencia nucleotídica de interés y al menos una secuencia nucleotídica de selección para obtener una célula genéticamente transformada, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena, b) colocar la población de células transformadas y no transformadas en contacto con un medio de cultivo que comprende una concentración de un agente osmoregulador seleccionado del grupo que comprende polietilenglicol 8000 (PEG8000), manitol, sorbitol, NaCI o mezclas de los mismos, preferentemente a una concentración del 4% y c) seleccionar las células transformadas de la población en base a la capacidad de las células transformadas de sobrevivir y desarrollarse en presencia del agente osmoregulador.

Las células que tienen dicha ventaja metabólica son capaces de crecer en presencia del agente osmoregulador simulando estrés hídrico (sequía), mientras que se inhibe el crecimiento de las células no transformadas.

El polietilenglicol (PEG) es un polímero producido en un rango de pesos moleculares. En 1961 , Lagerwerff publicó que el PEG puede ser utilizado para modificar el potencial osmótico de una solución nutritiva en cultivo y de esa manera inducir un déficit de agua en las plantas en una manera relativamente controlada y apropiada para protocolos experimentales de sequía.

Las células, en particular las células vegetales, no pueden desarrollarse normalmente en un medio de cultivo en el cual está presente una concentración relativamente alta de PEG 8000 (4%) o mayor debido a que se les impide la captura de agua y nutrientes ocasionando la muerte celular. El método de acuerdo a la invención, se utiliza para seleccionar células transformadas. Para este propósito, las células son transformadas con la secuencia nucleotídica que comprende una secuencia que codifica para un producto que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena. La población de células transformadas y no transformadas se coloca entonces en contacto con un medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador, como por ejemplo PEG 8000. Las células transformadas pueden distinguirse entonces de las células no transformadas por la presencia en su genoma de una secuencia nucleotídica de selección que codifica para un producto que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena, lo cual le permite sobrevivir y desarrollarse en un medio con un agente osmoregulador como el PEG 8000. Una secuencia nucleotídica que promueve la inhibición de la función de la enzima trehalasa endógena puede ser una secuencia que codifique para una proteína que tenga un efecto inhibitorio sobre la actividad enzimática de la trehalasa, como por ejemplo, secuencias que codifican para la proteína de 85kD de la cucaracha {Periplaneta americana), o las proteínas involucradas en la síntesis de validamicina, trehazolina, trehalostatina, casteligina, suidatestrina, etc., así como de sus formas modificadas activas. Otra alternativa para alterar la enzima trehalasa endógena en la planta es el empleo de RNA antisentido. Esta estrategia consiste en introducir en las células de planta una construcción genética que produzca un RNA que sea lo suficientemente complementario al RNA endógeno que codifica para la enzima trehalasa, de modo que interactúe con el transcrito endógeno de la propia planta, impidiendo que el mRNA se traduzca en los ribosomas y degradando el RNA por silenciamiento génico post-transcripcional, inhibiendo por lo tanto la traducción de dicho transcrito. Esto se conoce como silenciamiento de genes, ya sea mediante la tecnología del antisentido o de RNA de interferencia (RNAi), los cuales a la fecha son ampliamente conocidos.

De este modo, la secuencia nucleotídica que promueve la inhibición de la enzima trehalasa endógena puede ser de preferencia una secuencia nucleotídica capaz de transcribirse que produce un RNA cuya secuencia es idéntica o al menos parcialmente complementaria a la del RNA producido por una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena. Dicha secuencia nucleotídica capaz de transcribirse le confiere a la célula una ventaja competitiva en el medio de cultivo con un agente osmoregulador como por ejemplo PEG 8000. La secuencia nucleotídica capaz de transcribirse puede también ser una secuencia nucleotídica que produce un RNA idéntico al RNA producido por una secuencia nucleotídica que codifica para la trehalasa endógena.

De acuerdo con la presente invención, la inhibición de la enzima trehalasa se obtiene transformando una planta con el antisentido del gen de la trehalasa de una secuencia que sea parcial o completamente homologa al gen endógeno de la trehalasa que se desea silenciar. De este modo, el antisentido o el RNA de interferencia de la secuencia génica de trehalasa que se utilice para la transformación de la célula, la población de células, el tejido o la planta, será parcial o completamente homólogo a su gen o a su RNA mensajero endógeno o a la secuencia de trehalasa descrita en la secuencia de trehalasa de alfalfa, identificada como secuencia del gen MSTRE, así como la secuencia de trehalasa de maíz, identificada como ZmTRE.

Por lo que en la presente invención se describe que la secuencia del gen MSTRE de la trehalasa de alfalfa (Medicago sativa), más específicamente del gen MSTRE1 de la trehalasa de alfalfa, puede utilizarse para inhibir la expresión de la trehalasa en maíz, debido a que la secuencia de alfalfa es homologa a otras secuencias de trehalasa de origen vegetal. De la misma manera, la secuencia de maíz tiene homología con trehalasa de otras plantas para ser utilizada en eventos de silenciamíento del gen que codifica para la trehalasa. Se vislumbra así que la secuencia de alfalfa o maíz pueden utilizarse en otras especies, considerando el hecho de que no se requiere un 100% de homología para silenciar el gen. Además, es suficiente expresar solo parte del gen homólogo en orientación antisentido o en un RNA de interferencia con el fin de lograr una inhibición efectiva de la expresión de la trehalasa endógena.

El cDNA aislado que codifica para la enzima que degrada trehalosa o parte de éste, así como secuencias nucleotídicas que transcriben RNA antisentido o RNA de interferencia, se fusionan subsecuentemente a una secuencia promotora de modo tal que la transcripción resulte en la síntesis de un RNA mensajero (RNAm) antisentido o un RNA de interferencia (RNAi).

Se entiende como RNA de interferencia (RNAi) a las moléculas de RNA involucradas en el silenciamíento postranscripcional de un gen mediante este mecanismo a saber, RNAs orquilla (hairpin RNA, por sus siglas en inglés: hpRNA), RNAs pequeños (small RNAs, por sus siglas en inglés: sRNA) y microRNAs (miRNA).

Las técnicas de transformación de células vegetales empleadas para llevar a cabo la presente invención, son conocidas por cualquier experto en la materia y pueden ser consultadas en cualquier bibliografía relacionada al tema.

El método para introducir a la planta la secuencia expresable que codifica para un inhibidor de la enzima trehalasa no es crucial para la presente invención, siempre que el gen se exprese en la célula vegetal, ya sea en una célula de planta mono o dicotiledónea. Los procesos para introducir dos o más genes en la misma planta pueden alcanzarse con alguno de los siguientes métodos ya conocidos en el estado de la técnica, que comprenden por ejemplo: (a) transformando la planta con una construcción multicopia que contenga más de un gen a ser introducido, (b) co-transformando la planta con diferentes construcciones simultáneamente, (c) mediante rondas subsecuentes de transformación de la misma planta con los genes a ser introducidos, (d) cruzando dos plantas, donde cada una de las cuales lleva un gen diferente para ser introducido en la misma planta, o (e) combinaciones de los métodos anteriores.

El término "célula" dentro del contexto de la invención incluye también protoplastos, y el término "población de células" incluye también tejidos, órganos o porciones de ellos, una población de células individuales en o dentro de un sustrato, o un organismo completo, por ejemplo, una planta.

El término "población de células" se entiende de acuerdo a la invención como una población de células individuales, así como también a células en tejidos, órganos o partes de ellos; o células en organismos completos, como por ejemplo plantas, donde la planta completa o partes de ella pueden consistir de células genéticamente transformadas.

El término "planta" se refiere a un organismo multicelular diferenciado capaz de llevar a cabo fotosíntesis, tales como las angiospermas y las algas.

El término "célula vegetal" incluye cualquier célula derivada de una planta e incluye tejido indiferenciado, tal como callo o tumor de corona, también como semillas de plantas, propágulos, polen y embriones vegetales.

La presente invención también incluye a las células transformadas que han sido seleccionadas utilizando el método de acuerdo a esta invención, en particular células vegetales, y a las plantas regeneradas de ellas, así como sus semillas y su progenie.

El método de acuerdo a la invención es usado preferiblemente para seleccionar células vegetales modificadas genéticamente. Ejemplos de plantas para las cuales puede utilizarse el método de acuerdo a la invención incluyen: cultivos frutales tales como tomate (Lycopersicum esculentum L), mango, durazno, manzana, pera, banana, melón, etc.; cultivos de campo tales como girasol, tabaco, caña de azúcar (Saccharum officinarum L), etc.; cereales de grano pequeño tales como trigo {Tritricum aestivum L), soya {Glycine max L), cebada, maíz (Zea mays L), algodón, etc.; vegetales tales como papa {Solanum tuberosum L), zanahoria, lechuga, calabaza, cebolla etc., plantas leguminosas tales como frijol, lenteja, haba, así como aquellas plantas que necesiten mejorar su tolerancia a sequía y/ó frío.

A través del método de la presente invención, las células transformadas podrán ser capaces de sobrevivir y crecer en condiciones de sequía y/ó frío, a la cual una célula vegetal es incapaz de sobrevivir y desarrollarse. De este modo las células transformadas conforme a la presente invención pueden ser así seleccionadas de entre la población total en base a su capacidad para sobrevivir y desarrollarse.

Ya que las plantas genéticamente modificadas son capaces de inhibir en algún nivel a la enzima trehalasa debido a la introducción de la secuencia nucleotídica de selección, la célula obtenida es capaz de modificar su flujo de glucosa y sobrevivir en un medio que carece de una concentración óptima de carbono disponible para la célula. Las plantas genéticamente modificadas podrán por lo tanto desarrollarse mientras que el desarrollo de las plantas no transformadas se inhibe. Cuando el método de acuerdo a la invención es utilizado para la selección genética de células en plantas, las plantas transformadas pueden ser identificadas visualmente.

Por lo tanto, el método de acuerdo a la invención provee un sistema de selección sencillo y ambientalmente amigable de células transformadas, particularmente para las células genéticamente transformadas. La capacidad de las células transformadas de sobrevivir y desarrollarse en un medio con baja disponibilidad de agua anula la necesidad de agregar al medio un compuesto marcador de selección, como antibióticos y herbicidas.

De acuerdo a la invención, puede utilizarse como secuencia nucleotídica de selección en las células transformadas genéticamente, cualquier secuencia nucleotídica que codifique para un producto que promueva la inhibición de la enzima trehalasa. Aunque pueden utilizarse secuencias nucleotídicas exógenas, como las pertenecientes a bacterias, levaduras o insectos, también pueden utilizarse secuencias nucleotídicas endógenas; teniendo la ventaja de no estar introduciendo material de otra especie.

Presenta una mayor ventaja el hecho de que la secuencia nucleotídica de selección codifique para un RNA homólogo o complementario a la secuencia de trehalasa endógena, debido a que su expresión provocará un mecanismo de silenciamiento postranscripcional del gen ya sea por RNA antisentido, por RNA de interferencia o por cosupresión, el cual al impedir la traducción del RNA mensajero, ya sea el endógeno ó el del transgen, impedirá la producción de una proteína adicional en la planta. A estas ventajas puede añadirse el uso conveniente de promotores inducibles o regulables para limitar el proceso de transcripción de la secuencia de selección al momento en que es requerido para seleccionar las células, cuando éstas se encuentran en cultivo después de habérseles introducido la o las secuencias nucleotídicas de interés junto a la secuencia de selección.

Con lo anterior se pueden crear plantas genéticamente modificadas a las que para los fines de la presente invención, denominaremos "cisgénicas", cuando las secuencias de nucleótidos provengan de la misma especie. Para esta invención, la secuencia en antisentido para la enzima trehalasa para el maíz provendrá de esta misma especie.

El transgen o cisgen deseado y la secuencia nucleotídica de selección pueden introducirse a la célula por transformación mediante técnicas estándar conocidas de biología molecular. Aunque no es esencial, el transgen y el gen de selección pueden estar unidos uno al otro, de modo que la presencia del gen de selección signifique que el transgen también está presente. Opcionalmente, el transgen y el gen de selección pueden formar parte de la misma construcción genética y ser introducidas a la célula mediante el mismo vector.

Dado que es necesario que las secuencias nucleotídicas introducidas sean expresadas en la célula transformada, una construcción genética que contenga las dos secuencias nucleotídicas contendrá típicamente secuencias regulatorias que posibiliten la expresión de las mismas, por ejemplo, promotores conocidos y terminadores de transcripción. Así la secuencia nucleotídica co-introducida estará típicamente asociada con un promotor, el cual pude ser constitutivo o regulable.

Muchas células, en particular las células de las plantas superiores como Glycine max y Arabidopsis thaliana, tienen en su genoma genes codificantes para la trehalasa endógena. En una modalidad deseable del método de acuerdo a la invención, la secuencia nucleotídica de selección comprende el DNA complementario (cDNA) de la enzima MSTRE de trehalasa de alfalfa (Medicago sativa), o una porción de éste, así como el gen ZmTRE de maíz o una porción de éste.

En otra modalidad adecuada de la invención la secuencia nucleotídica de selección comprende una secuencia complementaria al cDNA de la enzima MSTRE de trehalasa de alfalfa (Medicago sativa) o una porción de éste, así como el gen ZmTRE de maíz o una porción de éste.

En una modalidad adicional más del método de la invención, las células transformadas pueden ser seleccionadas utilizando una combinación de selección positiva y selección negativa. Para ello la secuencia nucleotídica de interés es co-introducida en las células transformadas con una secuencia nucleotídica, adicional a la secuencia de selección, que codifica para la resistencia a al menos un miembro seleccionado de un grupo que comprende toxinas, antibióticos y herbicidas, y el medio en o sobre el que las células son cultivadas comprende al menos un miembro seleccionado de un grupo que comprende toxinas, antibióticos y herbicidas a los cuales las células transformadas tienen existencia. Aunque por razones técnicas, las unidades de expresión; es decir, el promotor más el gen MSTRE o el promotor más el gen ZmTRE, deben propagarse en un vector bacteriano, por ejemplo en Escherichia coll, la unidad de expresión se aisla del vector a través de obtenerla por PCR o por digestión con enzimas de restricción en sus extremos. Una vez obtenida la unidad de expresión o DNA conteniendo el promotor y gen trehalasa en antisentido, éste se emplea en la transformación genética. De esta manera, las plantas generadas carecen de secuencias no deseables presentes en el vector bacteriano, tales como resistencia a antibióticos, origen de replicación, etc.

La presente invención se ilustra en los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden limitar el alcance de la invención, por lo que especialistas en el campo técnico podrán apreciar ciertas modificaciones que se puedan aplicar a la invención sin modificar su alcance y espíritu original.

Ejemplo 1. Materiales y métodos. a) Manipulación de ácidos nucleicos.

DNA plasmídico. Los procedimientos de aislamiento, restricción, ligación y transformación de DNA plasmídico bactenano se llevaron a cabo de acuerdo a protocolos estándar (Sambrook et al., 1989). Para la ligación de productos de PCR en el vector TOPO pCR2.1 R (Invitrogen, Inc.) se llevaron a cabo las recomendaciones del fabricante. La secuenciación de los fragmentos obtenidos por RT-PCR, 3'RACE y GeneRacerMR, se realizó a partir de una preparación a pequeña escala.

DNA vegetal. Para la clonación de la secuencia promotora rd29A de Arabidopsis thaliana se llevó a cabo una extracción fenohcloroformo de DNA genómico a partir de plantas de Arabidopsis de 10 días de germinación en medio MS agar 0.7%.

RNA vegetal. Para la clonación del cDNA del gen de la trehalasa de alfalfa, se procedió a una extracción de RNA total de tejido de plántulas de alfalfa {M. sativa cv. CUF-101 ) de 7 días de germinadas in vitro en medio MS agar 0.8%, utilizando el reactivo TRI ReagentMR (Molecular Research Center, Inc.), según las indicaciones del fabricante. La síntesis de cDNA de maíz se realizó a través de PCR ensamblado con oligonucleótidos complementarios largos.

Primers. Los primers utilizados fueron los siguientes: b) Material biológico.

Plásmidos. Para la ligación de productos de PCR se utilizaron los vectores pGEM-T Easy VectorMR (Promega, Inc.) y TOPO TA pCR2.1 MR (Invitrogen, Inc.). Para la construcción de los vectores de expresión en plantas se utilizó el vector pBI-121 MR (Clontech, Inc.).

Cepas bacterianas. Los plásmidos obtenidos de la ligación de fragmentos, se introdujeron por choque térmico a células calcio competentes de E. coli de las cepas DH5a, JM109, o de la cepa comercial One Shoot MR TOP 10F' (Invitrogen, Inc.).

Material vegetal. Para la extracción de RNA de alfalfa, se germinaron semillas de alfalfa variedad CUF-101 , en medio MS agar 0.7%. Para la extracción de DNA de Arabidopsis se germinaron semillas de Arabidopsis, en medio MS agar 0.7%. Para el bombardeo de tabaco se utilizaron explantes de hoja de tabaco Nicotiana tabacum L. cv Xhanti, creciendo de manera axénica en medio MS agar 0.7% suplementado con sacarosa al 2%. Los cultivos se mantuvieron bajo ciclos de 16 hrs. luz/8 hrs. oscuridad a 26°C, y se subcultivaron después de 30-40 días en medio fresco.

Ejemplo 2. Clonación del cDNA del gen MsTRE de alfalfa.

Debido a que no se encuentra reportada la secuencia que codifica para la trehalasa de alfalfa, la cual denominamos MsTREI (Ms: Medicago sativa; TRE: trehalasa), y con el fin de obtener el fragmento a utilizar en las construcciones para inhibir dicha enzima, se procedió a obtener la secuencia completa de su cDNA. Para ello se utilizaron protocolos basados en la amplificación de transcritos de este gen (RT) y su posterior amplificación por PCR (RT-PCR). a) Amplificación de un fragmento interno mediante transcripción reversa RT y PCR (RT-PCR).

Para la amplificación de fragmentos internos del cDNA se llevaron a cabo ensayos simples de RT-PCR, utilizando los oligonucleótidos degenerados Tre300 y Tre351 que fueron diseñados en base a una región conservada entre las secuencias codificantes reportadas en el banco de datos (Entrez, NCBI) para la enzima trehalasa de Arabidopsis {Arabidopsis thaliana; acceso AAF22127), papa {Solanum tuberosum; acceso A67882) y soya (Glycine max; acceso AAD22970). El alineamiento de las secuencias se hizo utilizando el método Clustal (Software DNA Star).

Para la reacción de transcripción reversa (RT) se utilizó el sistema Enhanced Avian HS RT-PCR (SIGMA, Inc.) y se requirió de 1 pg de RNA total de alfalfa de buena calidad, el cual se incubó a 70°C por 10 min con 1 µ?_ de Anchored Oligo (dT)23 R (0.5pg/pL) y 1 pide una mezcla de dNTPs (dideoxinucleótidos) (10 mM c/u), en un volumen final de 10 pL con agua bidestilada estéril, según las instrucciones del fabricante. La mezcla se colocó de inmediato en hielo después de la incubación en calor, y se le agregaron 6 pl_ de agua grado reactivo PCR, 2 pL de Buffer para AMV-RT 10X, 1 pL de inhibidor de RNasa (20U/pL) y 1 pL de enzima RT Enhanced AMV (20U/pL), en un volumen final de 20 µ?_. Esta mezcla se incubó a 42°C por 60 min, para permitir la síntesis de la primera cadena de DNA.

Para la amplificación por PCR se utilizaron 3 pL de la primera cadena sintetizada por RT, 1 pL de DNA Polimerasa JumpStart AccuTaq R (2.5U/pL), 5 pL de Buffer AccuTaqMR 10X, 1 pL de mezcla de dideoxinucleótidos (10 mM c/u), 2 pL del oligonucleótido sentido degenerado Tre300 (100 ng/pL) y 2 µ?_ del oligonucleótido reversa degenerado Tre351 (100 ng/µ?.), en un volumen final de 50 µ?_ con agua grado reactivo PCR. Con esta mezcla de reacción se realizó la polimerización en cadena, para amplificar un fragmento interno del cDNA de la trehalasa.

El fragmento obtenido por PCR se clonó en el vector pGEM-T Easy VectorMR, el cual se introdujo posteriormente por choque térmico de 45 seg a 42°C a bacterias DH5oc calcio-competentes. Las bacterias transformadas se caracterizaron por digestión enzimática EcoRI de su DNA plasmídico y se seleccionaron aquellas que liberaran el fragmento amplificado. La secuenciación de este fragmento nos proporcionó la secuencia nucleotídica sobre la cual se diseñaron los oligonucleótidos utilizados en los protocolos siguientes para la clonación de los extremos 5' y 3' del cDNA de la trehalasa de alfalfa. b) Amplificación del extremo 3' mediante el protocolo de 3'RACE.

Para el protocolo de 3'RACE se utilizó la primera cadena de DNA sintetizada inicialmente por transcripción reversa. Con este cDNA se procedió a una primera amplificación por PCR, utilizando los oligonucleótidos específicos 3Tre300 y 5T18HXS los cuales se diseñaron a partir de la secuencia obtenida para el fragmento interno. A esta amplificación siguió un PCR semianidado, utilizando los oligonucleótidos 5T18HXS y 3Tre320 siendo éste último diseñado a partir de una posición más interna de la secuencia obtenida para el fragmento interno. La secuencia amplificada se clonó en un vector TOPO TA pCR2.1 MR (Invitrogen, Inc.), originando el plásmido TOPO-3Tre, el cual fue purificado para su caracterización enzimática Eco Rl y su posterior secuenciación y manipulación. Debido a que en esta región se encuentran la mayoría de las regiones conservadas entre las secuencias de trehalasa de origen vegetal, este fragmento es suficiente para diseñar los vectores para inhibir la enzima trehalasa endógena. c) Amplificación del extremo 5' por GeneRacer.

Para la obtención del extremo 5' del cDNA de la trehalasa de alfalfa se utilizó el sistema GeneRacerMR. En este protocolo se partió de 3pg del RNA total manejado con anterioridad, siguiendo las indicaciones del fabricante para la desfosforilación del RNA, la remoción de la estructura CAP y su subsiguiente ligación al oligo de RNA proporcionado. A partir de este RNA mensajero modificado, se procedió a la síntesis de la cadena complementaria (cDNA) utilizando el sistema AMV-RT R (SIGMA, Inc.). La cadena complementaria obtenida se utilizó posteriormente como templado en la amplificación por PCR utilizando el oligonucleótido GeneRacer5,MR y el oligonucleótido reverso 5Tre350, diseñado a partir de la secuencia del fragmento interno obtenido por RT-PCR. La secuencia amplificada se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1 R, dando lugar al plásmido TOPO-5Tre, el cual fue purificado para su caracterización enzimática con la endonucleasa Eco Rl y para su posterior secuenciación.

A partir del alineamiento de los tres fragmentos obtenidos mediante esta estrategia, se obtuvo la secuencia completa del cDNA de la trehalasa de alfalfa (MsTREI ).

Ejemplo 3. Diseño de las secuencias TRE antisentido (TREas) y RNA de interferencia (TRE-RNAi). a) Amplificación y clonación del fragmento interno TRE con mayor homología entre especies.

Para expresar en plantas una secuencia de trehalasa en antisentido bajo los promotores 35S y rd29A, se seleccionó primeramente un fragmento (SEQ. ID. No. 18) que comprende un fragmento interno de 560 pb de la secuencia, que incluye pequeñas regiones conservadas entre las diferentes trehalasas de plantas. Para ello se diseñaron un par de oligonucleótidos específicos Tre333 y TreNsiRw que amplifican el fragmento interno (TRE) seleccionado a partir de DNA plasmídico del vector TOPO-3Tre. El oligo TreNsiRw introduce un sitio Xma I seguido de un sitio Nsi I en el extremo 3' de la secuencia. El producto amplificado fue clonado en el vector TOPO TA pCR2.1 MR, dando lugar a los plásmidos TOPO-tre560s y TOPO-tre560as, debido a la inserción bidireccional del fragmento en el vector. En estas dos construcciones el inserto queda flanqueado en un extremo por el sitio Sacl y en el otro lado por los sitios Xba I y Nsi I del vector, lo que nos permitió determinar la dirección del fragmento mediante digestión en el sitio Nsi I de la secuencia TRE, con respecto a estos sitios (dirección sentido: Sacl-Xbal; dirección antisentido: Xbal-Sacl). b) Construcción del vector intermediario TOPO-GUS.

En la construcción del RNA de interferencia para la trehalasa de alfalfa fue necesario contar con una secuencia "lazo" para unir las dos copias de la secuencia TRE. Para ello se utilizó un fragmento interno de 1 ,020 pb de la secuencia del gen de la b-glucuronidasa (GUS; gen uidA) de E. coli. Esta secuencia se amplificó por PCR utilizando los primers GUSSmaR y GUSNsiF, a partir de DNA plasmídico del plásmido pBI-121 . Los primers utilizados se diseñaron en base a la secuencia GUS incluida en la secuencia del vector pBI-121 (acceso AFA85783), e introducen en los extremos del fragmento amplificado un sitio Xma I y un sitio Nsi I, respectivamente. El producto de PCR se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1 MR, dando lugar a los plásmidos TOPO-GUSs y TOPO-GUSas, debido a la inserción bidireccional del fragmento en el vector, la cual se determinó mediante digestión Nsi I. c) Construcción del RNA de interferencia con el fragmento TRE.

Para la construcción del RNA de interferencia para la trehalasa, se colocaron dos copias del fragmento TRE colocadas en dirección opuesta una a la otra (cabeza con cabeza), y ligadas con el fragmento amplificado de 1 ,020 pb de la secuencia GUS. Para ello inicialmente se liberó el fragmento TRE del plásmido pTOPO-tre560as como fragmento Xba \-Nsi I, y se insertó en los mismos sitios del plásmido pTOPO-GUSs, dando lugar al plásmido pTOPO-GT (GUS:TRE). Posteriormente, el fragmento GT (GUS:TRE) se liberó de este plásmido mediante digestión Sacl -X/nal y se clonó en los mismos sitios del plásmido pTOPO-GUS AS, para dar lugar al plásmido pTOPO-TGT (TRE:GUS:TRE). Las clonas positivas para esta construcción se caracterizaron por doble digestión Sac \-Xba I, y por digestión sencilla Nsi\.

Ejemplo 4. Construcción de los vectores de control de expresión. a) Amplificación de la secuencia promotora rd29A.

La secuencia promotora rd29A se amplificó por PCR a partir de DNA genómico extraído de tejido foliar de plántulas de Arabidopsis. Las semillas fueron proporcionadas por el Instituto de Biotecnología de la UNAM-Cuernavaca. Para la amplificación se diseñaron los oligos Frd29Hind y Rrd29Xba, en base a la secuencia promotora reportada (acceso D13044). Este par de oligos amplifican el fragmento comprendido del nucleótido 4563 al 5504, y lo flanquean con los sitios Hind III y Xba I. El producto de PCR se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1 MR para dar lugar al plásmido TOPO-rd29. b) Construcción del vector control de expresión inducible en plantas: prd29A:GUS.

La secuencia promotora rd29A se liberó del vector TOPO-rd29 mediante una doble digestión enzimática con Hind \W-Xba I, y se subclonó en los mismos sitios del vector pBI-121 MR (Clontech, Inc.). En esta construcción, la secuencia rd29A sustituye al promotor 35S CaMV, dando lugar al plásmido prd29A:GUS. Este vector constituye el plásmido control de los vectores de expresión inducible para el antisentido y el RNA de interferencia de la trehalasa. c) Vector control de expresión constitutiva en plantas: pBI-121 (p35S:GUS).

La secuencia promotora rd29A se liberó del vector TOPO-rd29 mediante una doble digestión enzimática con Hind III y Xba I, y se subclonó en los mismos sitios del vector pBI-121 MR (Clontech, Inc.). En esta construcción, la secuencia rd29A sustituye al promotor 35S CaMV, dando lugar al plásmido prd29A:GUS. Este vector constituye el plásmido control de los vectores de expresión inducible para el antisentido y el RNA de interferencia de la trehalasa.

Ejemplo 5. Construcción de los vectores de expresión para el fragmento TRE antisentido (TREas) y RNA de interferencia (TRE-RNAi). a) Construcción del vector de expresión del fragmento TRE antisentido (TREas) bajo los promotores 35S y rd29A.

Para dirigir la secuencia de trehalasa en orientación antisentido en los plásmidos con los promotores 35S y rd29A, dicho fragmento de trehalasa se liberó del vector TOPO-tre560s mediante digestión Sac \-Xba I, y se subclonó en los mismos sitios de los plásmidos pBI-121 y prd29A:GUS, dando lugar a los plásmidos p35S:TREas y prd29:TREas, respectivamente. En ambos vectores, el fragmento antisentido sustituye al gen GUS y antecede a la región NOSter (región terminadora y de poliadenilación del gen que codifica a nopalina sintasa). b) Construcción del vector de expresión del cásete RNAi-TRE bajo los promotores 35S y rd29A.

Para la expresión en plantas de RNA de interferencia de la trehalasa (TRE-RNAi), este cásete se liberó del vector TOPO-TGT mediante una doble digestión Sac \-Xba I, y se subclonó en los mismos sitios de los plásmidos pBI-121 y prd29A:GUS, dando lugar a los plásmidos p35S:TRE-RNAi y prd29:TRE-RNAi, respectivamente. En ambos vectores, el cásete de RNAi sustituye al gen GUS y antecede a la región NOSter (región terminadora del gen de la nopalina sintasa).

Ejemplo 6. Obtención de plantas GMs de maíz conforme a la invención. a) Integración en el maíz de las construcciones para la expresión del fragmento TRE antisentido (TRE AS) bajo los promotores 35S y rd29A.

Para obtener plantas GMs de maíz de las líneas puras B73 y H99 que expresen el antisentido de la enzima trehalasa bajo el control de los promotores 35S o rd29A, los plásmidos p35S-TREas y prd29A:TREas, se integraron mediante biobalística y con el uso de callos embriogénicos creciendo en cultivo axénico. b) Preparación y bombardeo de micro partículas con DNA.

Para el bombardeo de las partículas/DNA se utilizó el sistema de Helio de alta presión PDS 1000-HeMR. La preparación de las partículas de tungsteno, el recubrimiento con el DNA y los parámetros de bombardeo se realizaron según protocolos conocidos utilizando 6 cajas por cada construcción de DNA bombardeada.

Ejemplo 7. Evaluación del sistema como marcador de selección.

Se realizó una selección en medio de cultivo con reguladores de crecimiento para inducir la formación de embriones somáticos (callos embriogénicos) suplementado con PEG-8000 al 4% con callos embriogénicos bombardeados con las construcciones antisentido para la trehalasa y sus controles, mantenidos en medio de cultivo MS suplementado con Dicamba 2 mg/L, adenina 40 mg/L, sacarosa 3% y PEG 8000 al 4% e incubados a 26°C y fotoperiodo de 16 horas luz/8 hrs. oscuridad.

Ejemplo 8. Construcción de una unidad de expresión de trehalasa de maíz.

Se seleccionó al gen que codifica para la enzima trehalasa de maíz, con el fin de generar una planta cisgénica. Este marco abierto de lectura (ORF) fue invertido y obtenido el complementario, para expresarlo bajo la regulación del promotor 35S simple, con la secuencia de poliadenilación del gen que codifica a la enzima nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens. La secuencia obtenida fue modificada en dos bases para eliminar dos sitios de restricción EcoRI internos, asimismo, se insertó una secuencia no codificante, misma que serviría de bandera (Tag) para identificar a este evento de transformación. Cabe señalar que el gen antisentido no contiene ningún marco abierto de lectura, por lo cual no hay síntesis de ninguna proteína al invertir dicho ORF. Existe un sitio de restricción para EcoRV natural asimétrico que nos sirve de referencia en ensayos de detección a través de otros métodos (figura 1 ).

Esta unidad de expresión se obtuvo por apareamiento de oligonucleótidos largos complementarios in vitro, asistido por PCR. El fragmento producido de 1802 pb fue clonado en un vector bacteriano pCR8 Topo (Qiagen). La digestión con EcoRI produjo un fragmento de 1.8 Kb, que fue purificado y utilizado en experimentos de biobalística sobre callos embriogénicos de maíz.

Ejemplo 9. Transformación genética de la línea pura de maíz B73 con el uso de callos embriogénicos y la biobalística.

Se indujeron callos embriogénicos de la línea pura de maíz B73 (ver figura 2) a partir de semillas maduras en un medio MS (Murashige y Skoog 1961 ) suplementado con Dicamba 2 mg/L, adenina 40 mg/L, sacarosa 3%, pH 5.8 y gelrite 2.5 g/L. Se utilizó una línea de callos embriogénicos con una capacidad de división celular alta, comparada con el resto de las líneas.

Callos embriogénicos de maíz se bombardearon con micropartículas de oro conteniendo el plásmido con la unidad de expresión de la trehalasa en antisentido (por ejemplo trehalasa de alfalfa conforme al ejemplo 3 ó trehalasa de maíz B73 conforme al ejemplo 8), y posteriormente fueron seleccionados en presencia de PEG 8000 al 4% durante dos meses (se llevaron a cabo tres subcultivos) hasta generar clonas tolerantes al PEG, mientras que los callos no bombardeados (al que denominamos controles negativos) presentaron muerte celular.

Las clonas transgénicas obtenidas se propagaron por un mes en medio con PEG, hasta obtener una masa suficiente para llevar cabo la regeneración de plantas en un medio de cultivo MS (Murashige y Skoog 1962) suplementado con BAP 0.2 mg/L, Cinetina 0.1 mg/L, sacarosa al 1 %, gelrite 2.5 g/L. Las plántulas regeneradas fueron transferidas a suelo y en condiciones de invernadero para promover su ciclo de vida hasta la obtención de semillas. Las semillas generadas fueron esterilizadas con gases clorinados para evitar futuras contaminaciones con hongos. Para monitorear la capacidad de tolerancia al PEG 8000, las semillas transgénicas, generación T1 , fueron sembradas en frascos conteniendo PEG 8000 al 7% y comparada su capacidad de sobrevivencia con semillas de la línea pura B73 sin transformar (silvestre). Las semillas transgénicas en la generación T1 mostraron una segregación para su capacidad de crecimiento en PEG 800 al 4% (25% tolerantes) mientras que los controles negativos no fueron capaces de germinar bajo estas condiciones. En esta fase las plantas transformadas mostraron su capacidad de sobrevivir en un ambiente con déficit hídrico. Las plantas tolerantes fueron transferidas al invernadero para obtener las generaciones subsecuentes T2, T3, siguiendo los procedimientos de selección en la fase de semillas con el PEG 8000, hasta generar una población que produjera mazorcas con 100% de semillas tolerantes a PEG 8000. Se seleccionaron dos líneas transgénicas a la que denominamos T1 y T4 para someterlas a evaluaciones de tolerancia a sequía. Estas líneas mostraron los mejores comportamientos agronómicos en su ciclo de vida (figura 8).

Las plantas resistentes al PEG 8000 al 7% se transfirieron a condiciones de invernadero para permitirles completar su ciclo de vida. Se aisló DNA de 5 eventos independientes de transformación genética para verificar la inserción de la unidad funcional 35S, gene neomicina fosfotransferasa tipo II NPTII presente en el plásmido bombardeado; como se observa en la figura 3, T1 y T4 contenían el fragmento esperado. Por su capacidad de crecimiento y su vigor seleccionamos las líneas T1 y T4 para futuros experimentos de tolerancia a sequía.

Ejemplo 10. Caracterización molecular de plantas de maíz tolerantes a sequía.

Se usaron para esta fase semillas derivadas de la tercera generación endogámica de las líneas transgénicas T1 y T4. Para esta fase, la selección de plantas para desarrollar el experimento consistió en germinar las semillas en una solución de PEG 8000 al 7%, lo cual representa un medio de estrés hídrico al no dejar el PEG al agua disponible para ser absorbida por la semilla. Las semillas que fueron capaces de germinar bajo este agente selectivo fueron crecidas posteriormente en condiciones de contención en invernadero y cuartos controlados de crecimiento. A las plantas se les tomó un segmento de 2 cm2 de hoja, de la cual se extrajo DNA total con el kit DNeasy de Qiagen. Este DNA fue utilizado como templado para amplificar al marco abierto de lectura del gen y un segmento interno del promotor 35S, utilizando oligonucleótidos específicos. Los productos fueron resueltos en un gel de agarosa al 1 %, donde se observa una banda en las plantas GM de aproximadamente 950 pares de bases, que corresponde al tamaño esperado. Como control se utilizó DNA de plantas control, mientras que como control negativo se realizó una reacción sin la adición del templado de DNA (figura 4).

Ejemplo 11. Detección del transcrito de trehalasa por RT-PCR cuantitativo (RT-PCR en tiempo real).

La estrategia molecular de atenuación del gen se realizó a través de la expresión del marco abierto de lectura en antisentido del gen que codifica a la enzima trehalasa. Debido a que esta estrategia no apaga la transcripción del gen de referencia, se calculó la proporción silenciada a través de cuantificar la acumulación de este gen. Como se muestra en la figura 5, en condiciones de sequía es donde se manifiesta la atenuación de la expresión, a través de la menor acumulación del transcrito de referencia en 86% y 76% del valor más alto que tienen las plantas cuando crecieron bajo irrigación normal. Esta atenuación consistente en la disminución de la acumulación del mRNA entre 14% y 24%, que es suficiente para proveer de un fenotipo de tolerancia a estrés a sequía a las plantas GMs.

Ejemplo 12. Cuantificación de glucosa total como medida de la actividad de la enzima trehalasa.

La trehalasa es una enzima que utiliza como sustrato a la trehalosa y en presencia de agua produce dos moléculas de glucosa. Se utilizó el método descrito por Freydiere et al. (2002) adaptado a maíz. 100 mg de tejido fresco fue macerado en un microtubo utilizando un pistilo. El homogeneizado fue centrifugado y el sobrenadante fue transferido a un tubo limpio. Se utilizó una microcelda con dispositivo electrónico de Accu-chek de Roche, precalibrado para glucosa. Los valores obtenidos de glucosa en plantas silvestres fueron de 64 mg/dL, mientras que las plantas GM expresando trehalasa en antisentido mostraron valores de 51 mg/dL. La trehalasa atenuada por la estrategia molecular impide hidrólisis a glucosa a partir de trehalosa, siendo cuantificada consistentemente en 79% de la concentración determinada en plantas silvestres. Estos resultados son consistentes con la acumulación del mRNA detectado por RT-PCR cuantitativo en tiempo real.

Ejemplo 13. Caracterización fisiológica de plantas de maíz tolerantes a sequía. a) Crecimiento de lineas B73 GMs.

Evaluación y selección de semillas.

Se colocaron a germinar semillas de las líneas cisgénicas B73-T1 y B73-T4 de maíz de la invención y maíces B73 silvestres como control, criollo negro y blanco, así como maíz blanco y cacahuazintle, en cajas petri con agua en una cámara de crecimiento a 26°C por 5 días. Después de la germinación, las plántulas fueron transferidas a un sustrato que contenía turba, suelo arenoso y agrolita, en tubos de PVC de 60 cm. de profundidad y 25 cm de diámetro. La tapa inferior contenía muchas perforaciones para permitir el drenado de agua, donde ésta tapa puede desprenderse para observar la parte radicular. Finalmente se realizó el seguimiento de su crecimiento vegetativo, aparición de anteras y flores femeninas, producción de semillas y senescencia. b) Medición de parámetros agronómicos en fase vegetativa (figuras 6 y 7).

Se emplearon como control interno de comparación a dos variedades de maíz criollo, conocidos por su capacidad de tolerancia a sequía. A dos meses de haber sembrado los maíces, los criollos mostraron mayor talla con respecto a las líneas transformadas, siendo las más pequeñas las B73 control. Cabe señalar que la talla de los maíces criollos es una característica genética de los criollos de referencia, que se manifiesta bajo cualquier hábitat. La figura 8 muestra los fenotipos obtenidos de crecimiento vegetativo bajo condiciones de irrigación.

En las imágenes de la figura 8, se ven claras diferencias en el crecimiento entre las variedades criollas que son más grandes, luego en tamaño siguen las transformadas B73 T1 y T4 y las más pequeñas las B73 control.

Se aplicó la sequía simplemente al detener el suministro de agua y solución mineral. Como se indicó, el sustrato está compuesto de turba y agrolita, que poseen una baja retención de agua, mostrándose los efectos de la sequía sobre la fase de mayor susceptibilidad de la planta, que es la etapa de producción de flores femeninas y masculinas, así como el número de mazorcas y llenado de grano. Se observa en las figuras 8 a 10 el efecto de la sequía sobre esta etapa fenológica. c) Floración: flor masculina (anteras y polen).

Las primeras plantas en producir espigas, que son componentes de la flor masculina fueron B73- T1 y T4, respecto a las plantas control B73 que fueron 25 días después. La aparición de espigas de las variedades criollas ocurrió 30 días después. Este retraso en la floración es una característica de plantas que tienen estrés hídrico, así como el aumento del intervalo de aparición de espigas y mazorcas (figura 9). d) Floración: flor femenina (mazorcas).

Las primeras plantas en inducir la formación de la flor femenina fueron las líneas B73- T1 y T4, respecto al control que fueron 17 días después. Muy notoriamente, las plantas silvestres criollo blanco y negro aunque produjeron espigas, no ocurrió la formación de flores femeninas o mazorcas, presumiblemente por el estrés al que fueron sometidas. Las plantas después del llenado de grano ingresaron al periodo de senescencia, característico de una disminución de fotosíntesis y turgencia en la planta (figura 10). e) Producción de semillas.

La producción de semillas se evaluó al colectar las mazorcas de cada una de las plantas analizadas y en las que se desarrollaron estas. Antes de la evaluación se secaron apropiadamente a 37°C por 8 días. Como se puede apreciar en la tabla 1 , hay un marcado incremento en las semillas de las plantas transformadas en relación con el control negativo. El número de semillas por hilera así como el de hileras y el peso promedio nos indica la marcada superioridad de las plantas de la invención en la producción de semillas. Los resultados son el promedio de 15 mazorcas por genotipo.

Tabla 1 f) Senescencia.

El estado de senescencia fue comparable en todos los tratamientos, independientemente de la formación de flores femeninas.

Ejemplo 14. Medición de parámetros agronómicos. a) Medición de crecimiento.

La figura 1 1 muestra la talla de la planta, medida desde su base hasta la zona de crecimiento apical, en una cinética desde la germinación de las semillas hasta la senescencia. Los puntos graficados muestran los promedios obtenidos de las plantas de cada tratamiento. Como se puede observar, las plantas de la línea B73, mostraron una menor tasa de crecimiento que las criollas. Sin embargo, la comparación de las BT73 GM y control mostraron mayor tasa en las GM. Lo que respecta a las variedades criollas, estas presentaron una mayor crecimiento y entre ellas éste fue muy similar, las cuales llegaron a sobrepasar los 3.5 metros de altura. Hay que resaltar que la línea B73 control aumentó su crecimiento antes de empezar la floración, ya que tuvo un mayor gasto de nutrientes en ese momento y a que los utilizó para crecer y florecer al mismo tiempo, situación contraria a las plantas transformadas que si fueron sincronizadas, creciendo primero y luego de un tiempo florecieron. Como se indicó, las plantas criollas estresadas por sequía fallaron en producir mazorcas, a pesar de haber alcanzado gran altura. b) Comparaciones fisiológicas.

Respecto a la comparación fisiológica entre las variedades, en la figura 12 podemos observar las diferencias en tamaño, color de las hojas y tallo, donde las variedades criollas presentan un mayor tamaño respecto a las B73 y su coloración es un verde pálido y poco brillante respecto a las B73 que tiene un verde fuerte y lustroso y sus hojas son mas carnosas. Para el caso de la forma y grosor del tallo, las criollas tienen un tallo más delgado y redondo y las B73 su tallo tiende a ser ovalado y grueso, lo cual le brinda una mayor resistencia y posibilidades de tener un crecimiento totalmente erecto al contrario de las criollas que después de los dos metros de altura su tallo se empezaba a arquear. Es necesario realizar una prueba en campo, pues el enraizamiento secundario del maíz se limita por las pruebas controladas en invernadero.

Ejemplo 15. Medición de parámetros fotosintéticos en condiciones de humedad y estrés por sequía. a) Inducción de sequía.

Las plantas se dividieron en dos grupos y se dejó de regar a un grupo, manteniendo al otro como control. La figura 13 muestra el fenotipo de estrés que mostraron las plantas después del estrés, observándose las características después de 13 días de haber detenido el riego.

En la figura 13 podemos observar la respuesta de las plantas al estrés de sequía respecto a las plantas que no fueron sometidas a este tratamiento. Las que mostraron una mayor afectación a sequía fueron las variedades criollas negras y blancas, donde se observó pérdida de turgor de sus hojas, marchitamiento y clorosis; siendo aun mas fuerte estos efectos en los criollos negros. Cabe aclarar que para las plantas criollas, la sequía se debió suspender a los 6 días de iniciada la sequía dado a que ya mostraban efectos severos de daños por este estrés. Plantas que permanecieron sin regar después de este tiempo alcanzaron su punto de marchitez permanente.

Para el caso de las plantas cisgénicas de la invención, solo se observaron efectos entre los 1 1 y 13 días después de inducida la sequía, en donde se vio un enrollamiento de sus hojas y una ligera clorosis. Las plantas que mostraron un mayor efecto fueron las T4 y estas también retardaron su crecimiento durante la aplicación de la sequía. Respecto a las plantas B73 control, estas no presentaron efectos muy notorios debido a que para ese momento su tamaño longitudinal era notablemente menor respecto a las transformadas, lo que le confiere un menor requerimiento de agua. b) Parámetros fotosintéticos.

La línea B73-T1 presentó una mayor tasa fotosintética en condiciones de humedad respecto a las variedades control y a la T4; en contraste, durante la sequía todas disminuyeron su fotosíntesis a los 6 días, pero solo la T1 tuvo un ligero aumento a los 13 días, donde se irrigaron las plantas (figura 14). La última barra de cada una de las series mostradas en la figura 14, indica la tasa fotosintética a la que regresan las variedades después de iniciar el riego.

La conductancia es una medida de la concentración de iones en las plantas, sea intra o intercelular. Para el caso de la medición de conductancia, la planta GM T1 dio una respuesta de disminución de la conductancia mayor del 50% a los 6 días y más del 100% a los 13 días de sequía. En comparación con la planta T4 que disminuyó esta conductancia a casi el 50% a los 6 días y el control solo a los 13 días, en donde disminuyó aproximadamente un 40% (figura 15). Lo que nos lleva a deducir que la T1 tiene una mayor respuesta de sobrevivencia y gasto de agua, que la T4 y las criollas.

La figura 16 muestra el contenido interno de agua de las plantas bajo ensayo, donde se puede observar que T1 es la que menor contenido de agua tiene respecto a la T4 y al control en la sequía. Las plantas T1 y T4 muestran una respuesta adaptativa notoria, ya que pueden almacenar significativamente más agua que la planta control después del régimen de estrés por sequía.

Un parámetro importante lo constituye la humedad relativa del sustrato donde crece la planta. Para corroborar la respuesta de la falta de agua, se midió el porcentaje de humedad relativa en planta y la del suelo, donde se observa que las plantas control iniciaron el periodo de sequía incluso con más agua que las plantas GM. Posteriormente, el contenido relativo de agua fue disminuyendo por efecto del tratamiento. A los 13 días las raíces habían absorbido el 50% del agua en la maceta a diferencia de las plantas control, lo cual pudo deberse a que las plantas control tuvieron un menor tamaño en el momento de la comparación y sus requerimiento de agua son menores (figura 17).

La medición de C02 intracelular refleja la apertura estomática, que es influenciada por la sequía. La apertura de las células encargadas de permitir el intercambio gaseoso es controlada por un mecanismo dependiente de ácido abscísico, el cual se produce por estrés hídrico, entre otros factores de estrés abiótícos. En la figura 18 se observa que a pesar de aplicar el estrés, las plantas GM de la invención continúan intercambiando gases, en contraste con el control que permanece con elevadas concentraciones de CO2 interno. La idea anterior se puede corroborar en la figura 19, que muestra la apertura estomática que hay en el momento de la medición, donde observamos que es cierto que la T1 tiene una menor tasa respiratoria ya que cierra sus estomas a más del 50%, mientras que T4 al inicio de la sequía tarda en dar una respuesta, pero después de 6 días disminuye su tasa de transpiración a más del 50%; respecto al B73 control, éste solo disminuye su tasa respiratoria a los 6 días más del 30% y a los 13 días a casi el 50%.

Ejemplo 16. Tolerancia a estrés por frío en las plantas con trehalasa en antisentido. Plantas de maíz control y con el gen de la trehalasa en antisentido obtenidas conforme a la presente invención fueron germinadas a 4°C por tres días y posteriormente fueron crecidas a 16°C. Las plantas silvestres no pudieron progresar en su crecimiento, en contraste a las genéticamente modificadas de la invención, que fueron transferidas a macetas para la progresión de su crecimiento vegetativo. En condiciones controladas de invernadero, se permitió la oscilación de temperatura en la estación invernal de hasta 2°C como temperatura mínima. Las plantas de la invención con el gen de trehalasa en antisentido progresaron en su crecimiento vegetativo, en contraste con las silvestres. Los datos in vitro y en invernadero son consistentes en que las plantas mejoradas con el gen de trehalasa en antisentido conforme a la presente invención tienen tolerancia al frío. Así mismo, las plantas de la invención obtenidas fueron capaces de desarrollar las primeras espigas bajo dichas condiciones, que son el órgano masculino generador de polen para iniciar su etapa reproductiva.

Existen tres posibles mecanismos que pueden explicar la capacidad protectora de la trehalosa sobre biomoléculas, tales como la disponibilidad de agua, la formación de cristales y la estabilidad química. Estos no son excluyentes y pueden tener efectos aditivos para producir los efectos de tolerancia a sequía y frío observados y generados conforme a la presente invención. Por ejemplo, la capa de hidratación formada por el agua interactuando con la molécula a través de puentes de hidrógeno puede estabilizar las moléculas e inhibir su desnaturalización irreversible (Roser et al., 1993; Clegg, 1985). El enlace glicosídico entre los dos residuos de D-glucosa muestra flexibilidad quiral, probablemente permitiendo a la trehalosa ¡nteractuar con otros grupos polares de diferentes moléculas. La trehalosa es el único azúcar que forma cristales amorfos estables en temperaturas extremas. Este disacárido ha sido propuesto como protector de actividad enzimática, estabilizador de enzimas, aditivo de alimentos, criopreservador de células, tejidos y órganos, y mejorador de la vida de almacén de flores (Eroglu et al., 2000; Guo et al., 2000).

Este disacárido también se ha descrito como una molécula señalizadora. Nuestra evidencias nos han permitido cuantificar a la trehalosa en la savia del floema, siendo que la reacción enzimática para su síntesis está compartamentalizada. Los tejidos productores o fotosintetizadores contienen a la enzima trehalosa fosfato sintasa, mientras que la trehalosa fosfato fosfatasa se encuentra en tejidos consumidores.

Ejemplo 17. Cuantificación de trehalosa por HPLC.

Las muestras fueron analizadas usando un cromatógrafo de líquidos con detector de índice de refracción, utilizándose tres muestras por tratamiento provenientes de B73 control, B73 T1 y B73 T4; durante la separación de los componentes en el extracto inyectado, el pico que corresponde a trehalosa es el que se obtiene aproximadamente en el tiempo de retención 17, esto basándonos en lo obtenido en el estándar de trehalosa comercial, aunque en ellas resultan otros picos que no corresponden al disacárido de nuestro interés, algunos de los cuales corresponden a glucosa y sacarosa y otros no identificados (figura 20).

- Contenido de trehalosa en las muestras vegetales.

Para la cuantificación de trehalosa, a partir de la figura 20 se calculó el área bajo la curva (?) y la biomasa en mg [?], tanto de la muestra (mtra) como del estándar (std), donde se utilizó una biomasa del estándar de 0.25 mg y de muestra vegetal de 100 mg, utilizando la fórmula (1 ) y obteniéndose los resultados de la tabla 2 para las muestras bajo ensayo: %Trehalosa = (Amtra/Astd)([D]std/[D]mtra)(100) (1 ) Tabla 2 [?]std = 0.25 mg [?]Mtra = 100 mg Conforme a lo anterior, se obtuvieron los valores de trehalosa en peso fresco en las muestras analizadas; en la tabla 3 se comparan estos valores con los reportados de este disacárido en plantas de maíz silvestres.

Tabla 3. Concentración de trehalosa (mg / g de peso fresco) presente en las muestras de B73 control y genéticamente modificadas conforme a la invención, analizadas por HPLC Como puede observarse, el valor obtenido en las plantas control fue muy similar a lo reportado previamente en plantas controles de maíz y equivaldría al 100% del total que tienen las plantas de maíz B73, por lo que los valores encontrados en las plantas genéticamente modificadas T1 y T4 conforme a la presente invención equivaldrían a una acumulación de al menos 68% y 74% mayor de trehalosa respectivamente en comparación con el control; dichos resultados sobresalen de los rangos reportados e indican que se logró la inhibición de la enzima trehalasa (figura 21 ).

Ejemplo 18. Medición de la actividad enzimática de trehalasa.

La cuantificación de la actividad enzimática de trehalasa se realizó a través de la cuantificación de glucosa producto de la hidrólisis de la trehalosa. Esto se realizó para comprobar los resultados obtenidos en el ejemplo 17 (tabla 4). Una unidad enzimática es igual a 1 pmol/l de trehalosa.

Tabla 4. Niveles de glucosa y de actividad de trehalasa detectados en los extractos de las plantas B73 control y genéticamente modificados (T1 y T4). * = 1 U trehalasa Mediante este experimento se pudo observar que no se originó producción de glucosa en las plantas genéticamente modificadas de la invención respecto a las plantas B73 controles (figura 22), indicándonos que si se logró la atenuación de la acción de trehalasa en trehalosa, corroborándose los datos que se obtuvieron de los niveles de trehalosa presentes en las plantas genéticamente modificadas (T1 y T4).

Ejemplo 19. LD-PCR de mareaje (Long-Distance PCR).

Obtenido el cDNA sintetizado previamente a partir de RNA total de hojas de maíz, se procedió a realizar un ensayo LD-PCR de mareaje utilizando 32P-dCTP, utilizando muestras tanto en condiciones de sequía como en humedad de B73 control, T1 y T4, en un total de 6 muestras que serían utilizadas en macroarreglos; al momento de realizar el ensayo, también se realizó una prueba sin mareaje utilizando como molde cDNA de T4 (en condición de humedad) con el fin de comprobar que la mezcla de reacción y las condiciones de amplificación fueran las correctas (figura 23), lo cual fue observado por medio de electroforesis en gel al 1 % de agarosa a 80 volts y visualizado en el foto-documentador Gel Logic 200 (Imaging system), Ejemplo 20. Cuantificación de expresión diferencial usando un macroarreglo.

Con el cDNA que se utilizó como molde para la síntesis de las sondas radiactivas conforme al ejemplo 19, se hibridaron con los plásmidos que se muestran en la tabla 5, goteados en las membranas de nylon y que contenían los fragmentos de DNA que se muestran en la tabla 5. Los plásmidos mencionados proceden de la construcción de bibliotecas de expresión diferencial de genes de respuesta a sequía reportados por Montalvo-Hernández (2007) y Barrera-Figueroa (2007), así como plásmidos que contienen genes de respuesta a sequía en frijol no publicados.

Tabla 5 Los plásmidos de la tabla 5 fueron goteados en un total de 400 ng (2 µ?: 1 µ? plásmidos + 1 µ? de NaOH), en una membrana de nylon para el respectivo macroarreglo de DNA; estas membranas fueron después hibridadas con las sondas radiactivas obtenidas a partir del mareaje radiactivo de cDNA sintetizado de RNA de las condiciones de sequía y humedad, y fueron expuestas a oscuridad en placas de rayos X a -80°C y reveladas un día después visualizando distintas intensidades de señales de hibridación (figura 24). Las señales obtenidas se analizaron con el programa Array Vision (GE), sustrayendo el fondo que rodea a cada señal y obteniéndose finalmente la intensidad asociada a cada una de ellas.

Ejemplo 21. Cuantificación de la inducción de genes.

En la tabla 6 se muestran los valores de intensidad de señal obtenidas en las muestras de B73 controles, T1 y T4 conforme al ejemplo 20, así como la sustracción de ambos valores respecto a su fondo, indicando el nivel de inducción de las señales; para el caso de los genes en que la sustracción es igual a cero, indica que este gen no se detectó, ya que la sustracción fue para conocer si se presentó una inducción o represión de genes en sequía conforme a la presente invención. Los valores iguales a cero indicaron que estos genes tuvieron una expresión fuera del umbral detectable conforme a la prueba.

Tabla 6. Valores de expresión diferencial calculados de los ensayos de hibridación a partir del coeficiente de sobre-regulación [R= Intensidad sequía (estresados) / Intensidad Humedad (regados) * 100 ] de muestra vegetal a partir de hoja de plantas B73 control, T1 y T4, bajo condiciones de sequía.

CLAVE B73 CONTROL B73 T1 B73 T4 HUM SEQ SUST. HUM SEQ. SUST. HUM SEQ SUST.

PV1 Desconocida 75 86 12.8 82 61.5 -33.3 69.5 51 -36.3 PV2 Desconocida 28.5 28.5 0.0 19 9.5 -100 12.5 55 77.3 PV3 Dehidrina 79 74 -6.8 79.5 ~ 85 5~ 7.0 66 51 -29.4 PV4 Respuesta a humedad 77.5 78 0.6 81 90 10 67 51 -31.4 PV5 Taumatina 74.5 81 8.0 78 81.5 4.3 61.5 51.5 -19.4 PV6 Acuaporina 81 78 -3.8 54.5 43 -26.7 22 53.5 58.9 PV8 Inducida por frío 83.5 84.5 1.2 77.5 38 -103.9 48 45.5 -5.5 PV9 Profilina 80.5 70 -15.0 81.5 82 0.6 61 47 -29.8 PV1(f Cinása SPK3 ~ 21.5 10.5 -104 0 0 0 3 23 87.0 PV11 proteína hipotética 15 7.5 -100 0 0 0 1.5 17.5 91.4 PV12 proteína hipotética 81.5 78.5 -3.8 53.5 28 -91.1 40.5 54 25 PV13 fosfoglucomutasa 77.5 74.5 -4.0 82 77 -6.5 62.5 54.5 -14.7 PV14 proteína de cloroplasto 33.5 29.5 -13.6 10 3.5 -185.7 9 47.5 81.1 PV16 proteína hipotética 75.5 72.5 -4.1 74.5 85 12.4 65.5 55.5 -18.0 PV17 proteína hipotética 2 0 0.0 0 0 0 0 1.5 0 PV20 proteína hipotética 81 81.5 0.6 84.5 56 -50.9 68.5 59 -16.1 PV21 precursor Hsp -6 0 0.0 0 0 0 0 6.5 0 PV22 proteína hipotética 4 0 0.0 0 0 0 0 21.5 0 PV23 proteína hipotética 84 78.5 -7.0" l.5~ 85.5 4.7 56.5 58 2.6 PV25 carboxil transferasa a -1 0 0 0 0 0 0 0 0 PV26 tioredoxina 1 0 (G 0 0 0 0 0 0 PV27 proteína hipotética 1 1.5 0 0 0 0 0 0 8.5 0 PV28 proteína hipotética 7.5 0 0 0 0 0 0 10.5 0 PV29 proteína hipotética 39.5 27.5 -43.6 9 0 0 5 62 91.9 PV30 proteína hipotética 83 72 -15.3 20 11 -81.8 100 64 72.7 L2 beta galactosidasa 1 0 0 0 0 0 0 3.5 0 L14 asparagina sintetasa 2.5 0 0 0 0 0 0 3.5 0 L90 transferencia de lipidos 5.5 4 -37.5 0 0 0 0 14.5 0 L89 Prot. Dominio BURP 0 0 0 0 0 0 0 14 0 L6 proteína senescencia 0 0 0 0 . 0 0 0 4 0 L13 proteína hipotética 5 7.5 33.3 0 0 0 0 21.5 0 L19 proteína hipotética 7 0 0 0 0 0 100 2 75 L26 proteína hipotética 7.5 0 0 0 0 0 100 4.5 66.7 L175 proteína hipotética 3 0 0 0 0 0 0 4 0 L8 transporte transmembranal de aa 2 0 0 0 0 0 0 4 0 L15mio-inositol P04 sintasa 6.5 8 18.8 0 0 0 0 5 0 L17 LEA 4 29 17.5 -65.7 4.5 4 -12.5 100 57.5 94.8 L65Dehidrina 1.5 0 0 0 0 0 0 14.5 0 L134 Metalotioneína 0 0 0 0 0 0 0 17 0 L54 Factor de elongación 1 A 1.5 0 0 0 0 0 0 4 0 L185 Factor inicio traducción 0 0 0 0 0 0 0 4 0 L92 Poliubiquitina 5.5 0 0 0 0 0 0 4.5 0 R4 proteína hipotética 7 6 -16.7 0 0 0 100 5.5 63.6 R16 LEA 3 0 0 0 0 0 0 0 2.5 0 R25 proteína hipotética 0 35 0 0 0 0 0 6.5 0 R160 actil CoA carboxilasa 1.5 0 0 0 0 0 0 13 0 R33 proteína hipotética 0 0 0 0 0 0 0 8.5 0 R247 enzima de glicosilación 2.5 0 0 0 0 0 0 6 0 R123 proteína hipotética -0.5 0 0 0 0 0 0 3.5 0 R169 proteína hipotética 0 0 0 0 0 0 0 8 0 R168 proteína hipotética 0 0 0 0 0 0 0 2.5 0 R188 choque térmico hsp 70 0 0 0 0 0 0 0 5 0 R250 proteína rica el leucina 0 0 0 0 0 0 0 2 0 R222 Zeaxantina epoxidasa 0 0 0 0 0 0 0 5 0 A Actina 0 0 0 0 0 0 0 5 0 B 26 S ribosomal 0 0 0 0 0 0 0 2 0 C vector pDRIVE 0 0 0 0 0 0 0 5.5 0 HUM Humedad; SEQ Sequía Sust Sustracción Ejemplo 22. Clasificación de los genes.

Entre los genes que presentaron señal inducción o represión en el macroarreglo conforme al ejemplo 21 , fueron clasificados funcionalmente; cabe resaltar que los genes que presentaron valores de cero al realizar la sustracción no se clasificaron porque este valor nos indica que estos genes no se detectaron en las plantas B73 control y genéticamente modificadas en condiciones de estrés por sequía. Conforme a lo anterior, en esta clasificación funcional encontramos varios genes asociados a distintas funciones en la célula, tal es el caso de los asociados o involucrados en la respuesta a estrés abióticos entre ellos a la sequía (tabla 7), tal es el caso de las Dehydrinas, pertenecientes a uno de los grupos de la familia de las proteínas LEA (Proteína abundante de embriogénesis tardía), las cuales son producidas como respuesta a las bajas temperaturas, salinidad y a sequía, para la protección de las membranas a los daños por estrés (Allagulova et al. 2003 and Puhakainen et al. 2004) donde su producción es inducida por el ácido .abscísico (ABA); también se observó la expresión de la proteína intrínseca de protoplasto, que es una proteína putativa de la Acuaporina, que está directamente relacionada con el uso del agua (Montalvo et al. 2007), al igual que la Protein cinasa SPK-3 que está involucrada en la inducción de genes en respuesta a ABA, a la activación de proteínas a nivel post-transduccional (Yoon et al. 1997) y a la expresión de LEA (Proteína abundante de embrlogénesís tardía) del grupo 4 que está involucrado en la protección de los componentes celulares (Montalvo et al. 2007).

Tabla 7. Genes clasificados dentro de la funcionalidad de respuesta a estrés abiótico y los niveles de supresión e inducción en B73 control y genéticamente modificados conforme a la presente invención.

CLAVE GEN B73 CONTROL B73 T1 B73 T4 PV3 Dehydrina (dhnl ) -6.75 7.01 -29.41 PV4 Respuesta humedad cDNA 0.64 10 -31.37 PV6 Proteína intrínseca de tonoplasto -3.84 -26.74 58.87 PV8 Inducida por frió 1.18 -103 -5.49 PV9 Profilina -15 0.61 -29.78 PV10 Protein kinase SPK-3 -104.76 0 86.95 L90 Proteína de transferencia de lípidos no especifica -37.5 0 0 L17 LEA grupo 4 -65.71 -12.5 94.78 Los genes clasificados como de respuesta a estrés abiótico, presentaron diferentes comportamientos en las plantas de B73; para el caso de los controles, estos presentaron principalmente una supresión de señal de genes asociados a respuesta de estrés por sequía, caso contrario a lo visto en las plantas genéticamente modificadas conforme a la presente invención (figura 25).

También se observaron intensidades de señal de genes que tienen funciones en la fotosíntesis, la cual se define como la serie de reacciones en las que se produce la síntesis de ATP por reacciones energizadas por luz y la fijación de CO2 en la conversión de energía lumínica a química; como un ejemplo podemos notar la importancia de la fosfoglucomutasa, que es una enzima que se encarga de convertir la glucosa-1 -fosfato a glucosa-6-fosfato, participando así en la glucogenólisis. Al igual que la presencia de proteínas de cloroplasto, el cual es un organelo citoplasmático encargado de llevar a cabo el proceso de fotosíntesis tanto en las células eucarióticas vegetales, en algas y en algunos protistas. Se observaron diferencias en la expresión de genes a nivel fotosintético, en especial de las plantas genéticamente modificadas respecto al control, donde las señales de estas fueron de baja expresión (tabla 8 y figura 26).

Tabla 8. Genes clasificados dentro de la funcionalidad de fotosíntesis y los niveles de supresión e inducción en B73 control y genéticamente modificados.

CLAVE GEN B73 CONTROL B73 T) B73 T4 PV13 Fosfoglucomutasa de cloroplasto -4.02 -6.5 -14.67 PV14 Proteína de cloroplasto -13.55 -185.7 81.05 L13 Proteína hipotética de cloroplasto 33.33 0 0 Por otra parte, se obtuvo un solo valor de intensidad de señal en las muestras control y genéticamente modificadas, clasificado en categoría funcional de respuesta a estrés biótico (tabla 9). La taumatina es una proteína que está involucrada en la defensa de las plantas ante patógenos conocida como Proteínas PR (pathogenesis-related) y a respuesta de estrés osmótico.

Tabla 9. Genes clasificados dentro de la funcionalidad de respuesta a estrés biótico y los niveles de supresión e inducción en B73 control y genéticamente modificados.

CLAVE GEN B73 CONTROL B73 T1 B73 T4 PV5 Proteína taumatina 8.02 4.29 -19.41 Cabe resaltar que se observó una disminución gradual de la señal de expresión respecto al control y las genéticamente modificadas, donde T4 presentó una supresión de señal, indicando que la planta aun no reconoce totalmente las señales de estrés dado a la modificación genética que presenta en su genoma (figura 27).

Las plantas acumulan distintos solutos compatibles, tanto para uso energético como para protección a respuesta a estrés, tal es el caso del mio-inositol clasificado en gen asociado al metabolismo de carbohidratos (tabla 10), que es un azúcar encargada del mantenimiento de la membrana celular y es sintetizado a partir del mio-inositol-1 -fosfato sintasa; del cual se pudo observar una supresión de la señal de este gen en las plantas de maíz genéticamente modificadas conforme a la presente invención (figura 28).

Tabla 10. Genes clasificados dentro de la funcionalidad de respuesta a estrés biótico y los niveles de supresión e inducción en B73 control y genéticamente modificados.

CLAVE GEN B73 CONTROL B73 T1 B73 T4 L15 io-inositol-1 -fosfato sintasa 18.75 0 0 En la tabla 1 1 y figura 29 se muestran los valores de intensidad de señales obtenidas de proteínas desconocidas o hipotéticas en B73 control y genéticamente modificadas; como se sabe, este tipo de proteínas son proteínas desconocidas de las que no se conoce aún su función e hipotéticamente se les asigna una funcionalidad dependiendo de su secuencia y similitud con otras ya reportadas. Conforme a la presente invención, se detectaron un total 12 proteínas hipotéticas que están involucradas en la respuesta a tolerancia a sequía en maíz y que se han reportado en otras especies del reino vegetal.

Tabla 11. Genes clasificados como desconocidos y/o proteínas hipotéticas, al igual que se indican los niveles de supresión e inducción en B73 control y genéticamente modificados.

CLAVE GEN B73 CONTROL B73 T1 B73 T4 PV1 Proteína hipotética 12.79 -33.33 -36.27 PV2 Proteína hipotética 0 -100 77.27 PV11 Proteína hipotética -100 0 91.42 PV12 Proteína hipotética -3.82 -91.07 25 PV16 Proteína hipotética -4.13 12.35 -18.101 PV20 Proteína hipotética 0.61 -50.9 -16.1 PV23 Proteína hipotética -7 4.67 2.58 PV29 Proteína hipotética -43.63 0 91.93 PV30 Proteína hipotética -15.27 -81.81 72.64 L 19 Proteína hipotética 0 0 75 L26 Proteína hipotética 0 0 66.66 R4 Proteína hipotética -16.66 0 63.63 Conforme a la presente invención, los ensayos de expresión de genes asociados a la respuesta a sequía muestran que las plantas control y genéticamente modificadas despliegan una respuesta diferente. Como se ha reportado, la trehalasa puede ser una molécula multifuncional, primero como osmoprotectora, de ahí la tolerancia a sequía que provee a las plantas y además su capacidad de señalización. Respecto a esta última propiedad, la trehalosa y su versión fosforilada son capaces de inducir una expresión diferencial como lo ha reportado Iturriaga et al., (2009).

Conforme a la presente invención, la identificación de la expresión de algunos de los genes involucrados en la tolerancia a sequía demuestra el carácter cuantitativo de la tolerancia a sequía. Por esta razón, el observar que diversos genes están siendo inducidos apoya la noción de que no solo la trehalosa y/o trehalosa fosfato son suficientes para proveer de tolerancia a estrés abiótico. En este sentido, consideramos que posiblemente el efecto de la acumulación de trehalosa conforme a la presente invención induce la expresión o represión de genes que en su conjunto generan un estado fisiológico de tolerancia a estrés abiótico, en combinación con un aumento de la tasa fotosintética. La capacidad de mantener la autotrofía aun en condiciones de estrés es una propiedad de plantas tolerantes y refleja que la planta todavía tiene un estatus hídrico adecuado para llevar a cabo la fijación de CO2.

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Claims (35)

Reivindicaciones.

1 . Un método para seleccionar células vegetales genéticamente transformadas de entre una población de células, sin el uso de genes de selección que codifiquen para la resistencia a antibióticos, herbicidas y/o sustancias tóxicas para la célula, caracterizado por comprender las siguientes etapas: a) introducir a una célula o población de células al menos una secuencia nucleotídica de interés y al menos una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena; b) colocar la población de células transformadas y no transformadas en contacto con un medio de cultivo que contenga un agente osmoregulador en cantidad suficiente para que ésta sobreviva; y c) seleccionar en base a la ventaja competitiva al menos una porción de células transformadas genéticamente sobre las células no transformadas, donde dichas células genéticamente transformadas llevan una secuencia nucleotídica que codifica para un inhibidor de la trehalasa dicha secuencia produce un RNA que es complementario a un RNA producido a partir de una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena, en donde el RNA producido por dicha secuencia nucleotídica introducida le confiere una ventaja competitiva en el medio de cultivo con el agente osmoregulador.

2. El método de acuerdo a la reivindicación 2, donde la secuencia nucleotídica de selección es una secuencia nucleotídica que codifica para una trehalasa, dicha secuencia produce un RNA que es complementario a un RNA producido a partir de una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena.

3. El método de acuerdo a las reivindicaciones 1 y 2, donde la secuencia nucleotídica de selección es el gen o una región del gen MSTRE de la trehalasa de alfalfa {Medicago sativa) y/o una secuencia que codifica para la trehalasa de maíz.

4. El método de acuerdo a las reivindicaciones anteriores, donde la secuencia nucleotídica de selección es complementaria, más específicamente, al gen o a una región del gen MSTRE1 de la trehalasa de alfalfa.

5. El método de acuerdo a las reivindicaciones anteriores, donde el RNA transcrito a partir de la secuencia nucleotídica de selección es complementaria en forma completa o parcialmente al RNA producido a partir de una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena.

6. El método de acuerdo a la reivindicación 5, donde la secuencia nucleotídica de selección introducida está modificada o truncada.

7. El método de acuerdo a la reivindicación 1 , dónde la secuencia nucleotídica de selección codifica para la proteína de 85kD de la cucaracha (Periplaneta americana), para una enzima involucrada en el metabolismo de la Validamicina A, la trehazolina, la trehalostatina, la casteligina, la sudatestrina, o cualquier inhibidor de la trehalasa o cualquiera de sus modificaciones, donde dicha secuencia nucleotídica de selección introducida permite a la célula una ventaja competitiva.

8. El método de la reivindicación 1 , donde el medio de cultivo comprende un agente osmoregulador seleccionado entre: Polietilenglicol 8000 (PEG8000), manitol, sorbitol, NaCI o cualquier otro agente osmoregulador.

9. El método de la reivindicación 8, donde el medio de cultivo comprende Polietilenglicol 8000 (PEG8000) como agente osmoregulador.

10. El método de la reivindicación 8, donde el medio de cultivo comprende PEG8000 a una concentración del 4 %.

1 1. El método de las reivindicaciones anteriores, dónde la célula vegetal genéticamente transformada se selecciona de plantas tales como: tomate (Lycopersicum esculentum L), mango, durazno, manzana, pera, banana, melón, girasol, tabaco, caña de azúcar {Saccharum officinarum L.) trigo (Triticum aestivum L), soya {Glycine max L), cebada, maíz (Zea mays L), algodón, papa {Solanum tuberosum L), zanahoria, lechuga, calabaza, cebolla, entre otras.

12. El método de las reivindicaciones 1-1 1 , dónde la célula seleccionada es una célula vegetal genéticamente transformada que tiene la ventaja competitiva de crecer en un medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador por lo que dicha célula es capaz de crecer y sobrevivir en condiciones de sequía.

13. El método de acuerdo a la reivindicación 1 , donde la célula o población de células es además transformada con una secuencia nucleotídica de interés.

14. El método de acuerdo a la reivindicación 13, donde la secuencia nucleotídica de interés introducida puede ser una secuencia que codifique para la enzima trehalosa-6- fosfato sintasa (TPS), para la enzima trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP), un inhibidor de la trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP) y/o una secuencia nucleotídica que codifique para la resistencia a toxinas, antibióticos, herbicidas u otros productos de interés biotecnológico.

15. El método de acuerdo la reivindicación 1 , donde la transformación de las células vegetales se lleva a cabo mediante una construcción o vector molecular que contiene un promotor vegetal operable unido al menos a una secuencia nucleotídica de interés y al menos a una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena.

16. El método de acuerdo a las reivindicación 1 y 15, donde la construcción o vector molecular una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena; una o dos copias de la misma, en un arreglo tal que inhiba la actividad trehalasa endógena, y donde dicha construcción puede comprender elementos adicionales como una secuencia de unión entre las copias de la secuencia introducida sea complementaria a la secuencia del DNA de la trehalasa endógena, como por ejemplo un RNA de interferencia (RNAi).

17. Una célula vegetal genéticamente transformada caracterizada por comprender una construcción o vector molecular que contiene un promotor vegetal operable unido al menos a una secuencia nucleotídica de interés y al menos a una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena.

18. La célula como se declara en la reivindicación 17, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa, siendo ésta la secuencia del gen de la trehalasa de alfalfa y/o la secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena de maíz, y donde dicha secuencia nucleotídica introducida produce un RNA que es complementario al RNA producido por una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena.

19. La célula de acuerdo a la reivindicación 17, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa, preferentemente a la secuencia del gen de la trehalasa de alfalfa MSTRE1.

20. La célula de acuerdo a la reivindicación 19, dónde la secuencia nucleotídica de selección introducida está modificada o truncada pero produce un RNA que es complementario en forma completa o parcialmente al RNA producido por una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena, confiriéndole a la célula transformada una ventaja competitiva en el medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador.

21. La célula según la reivindicación 18, donde la secuencia nucleotídica de selección es el gen o una región del gen MSTRE de la trehalasa de alfalfa y/o la secuencia nucleotídica o una región del gen de la trehalasa de maíz.

22. La célula según la reivindicación 17, donde la secuencia nucleotídica de selección codifica para la proteína de 85kD de la cucaracha (Periplaneta americana) o para una enzima involucrada en el metabolismo de la Validamicina A, la trehazolina, la trehalostatina, la casteligina, o cualquier inhibidor de la trehalasa o cualquiera de sus modificaciones, donde dicha secuencia nucleotídica de selección introducida permite a la célula una ventaja competitiva.

23. Una planta regenerada a partir de una célula vegetal genéticamente transformada conforme a las reivindicaciones 17-21 , la cual comprende una construcción o vector molecular que contiene un promotor vegetal operable unido al menos a una secuencia nucleotídica de interés y al menos a una secuencia nucleotídica de selección para obtener células genéticamente transformadas, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa endógena.

24. La planta conforme a la reivindicación 22, donde la planta tiene la ventaja competitiva de crecer en un medio de cultivo que contiene un agente osmoregulador por lo que dicha planta es capaz de crecer y sobrevivir en condiciones de sequía y/o frío.

25. Las semillas de una planta conforme a las reivindicaciones 22 y 23.

26. La progenie de una planta conforme a las reivindicaciones 22 y 23.

27. Un vector o construcción molecular para transformar genéticamente una o varias células vegetales, el cual comprende un promotor vegetal operable unido al menos con una secuencia nucleotídica de selección que codifica para un inhibidor de la trehalasa y/o al menos una secuencia nucleotídica de interés.

28. El vector de acuerdo a la reivindicación 27, donde la secuencia nucleotídica de selección comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa, dicha secuencia puede seleccionarse de una secuencia del gen MSTRE de la trehalasa de alfalfa y/o de la secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena como por ejemplo una secuencia nucleotídica que codifica para la trehalasa de maíz, y donde dicha secuencia nucleotídica de selección introducida, produce un RNA que es al menos parcialmente complementario al RNA producido por una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena.

29. El vector de la reivindicación 28, dónde la secuencia nucleotídica de selección codifica para un inhibidor de la trehalasa, la cuál tiene homología con la secuencia MSTRE1 .

30. El vector conforme a la reivindicación 28, dónde la secuencia nucleotídica de selección introducida está modificada o truncada pero produce un RNA que es complementario en forma completa o parcialmente al RNA producido por una secuencia de DNA que codifica para la trehalasa endógena.

31. El vector conforme a la reivindicación 27, donde la secuencia nucleotídica de selección codifica para la proteína de 85kD de la cucaracha (Periplaneta americana) o para una enzima involucrada en el metabolismo de la Validamicina A, la trehazolina, la trehalostatina, la casteligina, o cualquier inhibidor de la trehalasa o cualquiera de sus modificaciones.

32. El vector conforme a la reivindicación 27, el cual comprende además una secuencia nucleotídica que codifica genes involucrados a la resistencia a toxinas, antibióticos o herbicidas.

33. El vector de acuerdo a las reivindicaciones 27-31 útil para la transformación de células vegetales, para la selección de células genéticamente transformadas de entre una población de células transformadas y no transformadas y para la producción de plantas genéticamente transformadas.

34. Uso del Polietilenglicol 8000 (PEG 8000) para preparar un medio de cultivo osmoregulado para la selección de células vegetales genéticamente transformadas de entre una población de células transformadas y no transformadas, donde el genoma de las células transformadas comprende al menos una secuencia nucleotídica de selección que comprende una región que codifica para un inhibidor de la trehalasa.

35. El uso de la reivindicación 33 donde la concentración del Polietilenglicol 8000 es del 4%.