CN103403168A - 获得抗旱植物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从由转化和未转化细胞组成的细胞群体中选择转化细胞的无毒方法。所述方法包含以下步骤：a）将至少一个相关核苷酸序列和至少一个选择核苷酸序列引入细胞中以获得遗传转化细胞，其中所述选择核苷酸序列包含促进内源性海藻糖酶抑制的序列；b）将所述转化和未转化细胞的群体放于含有如PEG8000等渗透压调节物质的培养基中；c）根据转化细胞在所述渗透压调节物质存在下的存活和生长能力从所述群体中选择转化细胞，所述转化细胞赋予了由这些遗传转化事件获得的植物例如抗旱能力和/或耐寒能力。
Description
技术领域
本发明是关于遗传工程，尤其是关于植物和植物来源的组织的转基因和同源转基因（cisgenesis）方法，并且更尤其是关于选择遗传转化植物细胞的方法，所述方法避免了使用抗性基因毒性物质作为可选择标记物并且使转化细胞不产生对所述植物细胞、植物或其最终使用者和中间物具有潜在副作用的蛋白质和/或新的或不同的代谢物。因此，本发明的方法使用了一种包含促进内源性海藻糖酶抑制的核酸序列的核苷酸序列，其赋予由这一选择方法获得的植物耐旱性。
背景技术
众所周知，当通过转化将遗传物质引入细胞群体中时，仅一定数目的细胞成功地转化。在转化后，必须从转化和未转化细胞群体中鉴别并且选出这些转化细胞。已使用传统方法“阴性选择（negative selection）”鉴别和分离转化细胞，在阴性选择中转化细胞可以存活和生长，而未转化细胞生长受到抑制或被由于转化而转化细胞可以耐受的物质消除。为了实现这一目的，通常细胞引入除相关转基因以外的选择基因。
这一选择基因通常提供抗生素或除草剂抗性，可以通过所述抗生素或除草剂抗性鉴别遗传转化细胞。在转化后，转化和未转化细胞群体接着在含有抗生素或除草剂的培养基中生长，转化细胞由于选择基因而对抗生素或除草剂具有抗性，因此使不含抗生素或除草剂抗性基因的转化细胞生长受到抑制，使得仅转化细胞由于存在引入的基因选择而能够存活和生长。
这些实例尤其包括专利US6174724和EP0131623，其使用编码酶II型新霉素（neomycin）磷酸转移酶（nptll）的基因作为选择标记物，此酶赋予对氨基糖苷（卡那霉素（kanamycin）、新霉素、G418、巴龙霉素（paromycin））家族中某些抗生素的抗性；以及专利US4727027，其使用潮霉素（hygromycin）磷酸转移酶基因（hpt）提供对潮霉素抗生素的抗性。
尽管观测到有效性，但阴性选择法具有一些缺点。例如，未转化细胞由于生长培养基中存在抗生素或除草剂而死亡，并且因此存在不仅未转化细胞并且转化细胞也可能死亡的风险，因为受损害的未转化细胞或在消除过程中可能分泌有毒化合物。
另一个极重要的缺点是根据环境和食品安全性观点，对于在环境中大规模引入和释放的遗传修饰和同源转基因的作物，尤其粮食作物，通常不推荐使用这些提供对有毒化合物的抗性的选择基因。
阴性选择的另一个缺点是用毒性物质处理的细胞或植物组织变得对细菌性感染更加敏感。这在使用土壤杆菌（Agrobacterium）作为转化载体的时候产生问题，因为虽然使用抗生素进行预防，但组织或细胞可能有时仍显示细菌过度生长。
在阳性选择法中，可提及专利US6444878和US5767378，其使用用于将对细胞具有毒性的化合物代谢掉的基因。第一份专利描述了使用一种核苷酸序列，其编码葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶基因作为在含有毒性代谢物葡萄糖胺或其衍生物的培养基中生长的遗传转化细胞的抗性基因。第二份专利描述了使用一组编码与甘露糖或其衍生物或前驱体代谢相关的磷酸曼诺异构酶（phosphomanoisomerases）、磷酸曼诺变构酶甘露糖表构酶等的基因，以及将任何这些毒性化合物添加到选择培养手段中。两种情况和使用抗生素和除草剂抗性基因都可以引起遗传转化细胞除产生异种蛋白，所述异种蛋白除产生过敏原外还会对已被选择和无需这一产物的转化有机体产生代谢成本。
最近，专利US7449290描述了一种遗传转化细胞的选择方法，其使用编码具有海藻糖酶活性的蛋白质的核苷酸序列作为选择标记物，所述蛋白质催化海藻糖或其甲基化或卤化衍生物。在这一方法中，海藻糖酶过度表达，使得遗传转化细胞能够历经有毒浓度的添加到选择培养基中的代谢物后存活。与前述情况相同，遗传修饰的有机体呈现出过度产生在选择过程后不必要的蛋白质，并且涉及将额外化合物添加到选择培养基中。
可使用本发明的方法通过阳性选择来克服（至少实质上）上文提及的缺点，本发明的方法允许在不通过使群体的未转化细胞中毒而进行消除下并且在不共同引入抗生素抗性基因、除草剂和其他化合物的情况下鉴别和分离遗传转化细胞，所述方法也避免了向培养基中添加额外化合物的需要。本发明的方法还避免了额外产生在选择过程结束时不必要的蛋白质或多肽。
专利US7214858和US7560613描述了编码与植物和种子中海藻糖代谢有关的酶的核酸片段，用以获得遗传修饰植物。其推荐使用如海藻糖酶、海藻糖磷酸合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酶等基因序列。这些文献仅展示在表达6-磷酸海藻糖磷酸酶的转基因植物中的实验证据，而没有提供编码海藻糖酶的基因的实验证据。但是，佩里（Perry）和科尔（col.）进行毛豆（Glycine max）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、玉米和大豆的海藻糖酶的序列对准分析。通过这些计算性研究，其推荐使用海藻糖酶基因产生遗传修饰植物（其中海藻糖代谢可在植物中改变），但未提出将其用作筛选方法。
因此，需要提供有效获得遗传转化细胞的方法，其不引入不必要的外源基因并且避免了不必要地产生与这些细胞无关的蛋白质和/或肽。
发明内容
无
附图说明
图1.展示用于转化玉米的基因表达单元的图。
图2.展示藉由使用胚性愈伤组织和基因枪产生对PEG8000耐受的转基因玉米的策略。
图3.展示选择对PEG8000耐受的种子作为T1情况下的模拟干旱测试和验证对应于35S NPTII的功能单元的分子插入。泳道1和2对应于用相同载体转化的木瓜植物，其中看到预期信号1.8Kb；泳道3是玉米的阴性对照；泳道4是玉米植株T4；泳道5是植株T7；泳道6是植株T12；泳道7是植株T1；泳道8是植株6；泳道9是未消化的T4植株的DNA。
图4.展示同源转基因和使用来自植物Bt7GM和对照物的全部DNA的特异性寡核苷酸进行的启动子扩增的区段。展示代表性扩增；然而，所有在应力下发芽的种子均产生阳性PCR信号。
图5.展示通过编码WT海藻糖酶（野生）、T1和T4、GM、H20（灌溉）、SEQ（干旱）的基因的mRNA的实时积聚进行的RT-PCR定量。
图6.展示在罐和管中生长以观测容器可能影响的幼苗。
图7.展示在设计用来施加玉米干旱和允许进行生理学和土壤测量的PVC管中发芽两个月后的植物。
图8.展示植物品种间的生长差异。B73GM植物与B73对照植物相比尺寸较大（左图）。展示尺寸比较；叶子可能呈波浪形或繁茂，因此保持更高光合面（右图）。
图9.展示B73T1和T4GM植物中的雄性开花。
图10.展示两种GM植物中玉米的穗的外观，每一植物具有3到5个穗。表型与对照植物实质上相同。
图11.展示圆筒中的种子到衰老的生长尺寸测量。指示干旱的开始，其对GM植株持续两周。一周后，必须向克里奥尔玉米（Creole maize）浇水，因为这一应用中发生严重干旱症状。
图12.展示植物品种间的生理学比较。
图13.展示在干旱处理中植物的表型。每一幅图左侧展示干旱植物，而右侧是在灌溉下生长的对照植物。上侧图展示克里奥尔玉米，其中干旱植物损失膨压和尺寸。下侧图在中间展示具有显著尺寸差异的对照植物。应注意植物GM T1（最左侧），其与其接受灌溉的对照物相比未展示统计上显著的降低。
图14.展示B73中潮湿和干燥条件下的光合作用测量比较。时间测量：第1天：正常灌溉。第6天：干旱开始后第5天。第13天：干旱开始后第13天并且干旱中止。第22天：干旱中止后第10天。
图15.展示B73中潮湿和干燥条件下水传导性的测量比较。
图16.展示B73中潮湿和干燥条件下水含量的测量比较。
图17.展示植物和土壤两者中，B73中潮湿和干旱条件下相对湿度百分比的测量比较。
图18.展示B73中潮湿和干燥条件下CO2含量的测量比较。
图19.展示B73中潮湿和干燥条件下蒸腾的测量比较。
图20.展示在所分析样品中获得的海藻糖峰的HPLC光谱：（A）B73对照-1，（B）B73对照-2，（C）B73对照-3，（D）B73T1-1，（E）B73T1-2，（F）B73T1-3，（G）B73T4-1，（H）B73T4-2和（I）B73T4。
图21.展示通过HPLC分析的植物中存在的海藻糖百分比的图表，其中本发明的遗传修饰植物中的海藻糖百分比相对于在来自对照物B73的样品中检测到的百分比增加。
图22.展示在3小时培育时间中由海藻糖水解产生的葡萄糖量。
图23.展示无标记（无α32P-dCTP）情况下扩增的LD-PCR（1%琼脂糖；80伏特；7微升样品）的电泳情况以知晓在所具有的东西的情况下是否实现从cDNA的扩增。NTC阴性对照（无DNA）；2：湿气中的B73T4。
图24.展示从含有尼龙薄膜的质粒与B73对照物和遗传修饰植物（T1和T4）的放射活性标记探针的杂交获得的信号。（1）湿气中的B73对照物，（2）干旱中的B73对照物，（3）干旱中的B73T1，（4）湿气中的B73T1，（5）湿气中的B74T4；和（6）干旱中的B73T4。字母A、B、C、D和E一式两份地表示色谱柱，而编号1到12表示行或水平行，其中由干旱诱导的基因一式两份地置放。
图25.展示与在对照物和根据本发明的遗传修饰B73植物中检测到的非生物应力反应有关的基因的诱导或抑制行为的图形。
图26.展示与在对照物和根据本发明的遗传修饰B73植物中检测到的光合作用有关的基因的诱导或抑制行为的图形。
图27.展示与在对照物和根据本发明的遗传修饰B73植物中检测到的生物应力反应有关的基因的诱导或抑制行为的图形。
图28.展示与在对照物和根据本发明的遗传修饰植物B73中检测到的碳水化合物代谢有关的基因的诱导或抑制行为的图形。
图29.展示分类为在对照物和本发明的遗传修饰B73植物中检测到的未知和/或假设蛋白质的基因的诱导或抑制行为的图形。
具体实施方式
本发明描述了一种选择合并有相关核苷酸序列的遗传转化细胞的方法，所述相关核苷酸序列赋予了转化细胞选择优势。转化细胞所具有的选择优势可使其与未转化细胞相比能够最好地在细胞可用水量较低的环境中存活和生长。
本发明的一个目标是提供一种有效选择转化株的方法，例如去除了上文关于使用可选择标记物基因的方法所提及的缺点的植物。为实现这一目标，本发明提供了一种从转化和未转化细胞群体中鉴别和/或选择具有由转化引起的代谢优势的细胞的方法，所述细胞在含有渗透压调节剂（如聚乙二醇8000（PEG800）、甘露糖醇、山梨糖醇、NaCl或任何其他渗透压调节剂）的培养基上或培养基中生长，其中所述方法包含：
a）将至少一个相关核苷酸序列和至少一个选择核苷酸序列引入细胞中以获得遗传转化细胞，其中所述选择核苷酸序列包含编码内源性海藻糖酶抑制因子的区域；
b）使转化和未转化细胞群体与包含一定浓度（优选4%浓度）的渗透压调节剂的培养基接触，所述渗透压调节剂是选自包含聚乙二醇8000（PEG8000）、甘露糖醇、山梨糖醇、NaCl或其混合物的群组；和
c）根据转化细胞在所述渗透压调节剂存在下存活和生长的能力，从所述群体中选择转化细胞。
具有这一代谢优势的细胞能够在模拟供水不足（干旱）的渗透压调节剂存在下生长，而未转化细胞的生长受到抑制。
聚乙二醇（PEG）是以一系列分子量产生的聚合物。1961年，拉格沃夫（Lagerwerff）报导PEG可以用于调节培养物中营养液的渗透势并且因此在实验干旱方案中按相对可控和适当的方式诱发植物的水分不足。
包括植物细胞在内的细胞通常无法在存在相对高浓度（4%或更高）的PEG8000的培养基生长，因为其被阻止摄取水和营养物，从而引起细胞死亡。根据本发明的方法是用于选择转化细胞。为达到这一目的，用核苷酸序列使细胞转化，所述核苷酸序列包含编码促进内源性海藻糖酶抑制作用的产物的序列。接着使转化和未转化细胞群体与含有渗透压调节剂（例如PEG8000）的培养基接触。可以通过基因组中选择核苷酸序列的存在来区分转化细胞和未转化细胞，所述选择核苷酸序列编码促进内源性海藻糖酶抑制作用的产物，从而使转化细胞能够在含有渗透压调节剂（例如PEG8000）的培养基中存活和生长。
促进酶功能抑制作用的核苷酸序列可以是编码对海藻糖酶的酶活性具有抑制作用的蛋白质的内源性海藻糖酶序列，例如编码蟑螂蛋白质85kD（美洲大蠊（Periplanetaamericana））或与维利霉素（validamycin）、海藻唑啉（trehazolin）、海藻糖抑素（trehalostatin）、卡斯利辛（casteligine）、苏达斯汀（suidastestine）等和其活性修饰形式的合成有关的蛋白质的序列。
另一种改变植物中内源性海藻糖酶的替代性方法是使用反义RNA。这一策略是将产生足够的与编码海藻糖酶的内源性RNA互补的RNA的基因构筑体引入植物细胞中，从而与植物本身的内源性转录物相互作用，防止核糖体处的mRNA翻译并且通过转录后基因沉默使RNA降解，从而抑制转录物翻译。此称为基因沉默，通过迄今普遍已知的反义技术或RNA干扰（RNAi）进行。
因此，促进内源性海藻糖酶抑制作用的核苷酸序列可优选是能够转录，产生序列与由编码内源性海藻糖酶的DNA序列产生的RNA相同或至少部分互补的RNA的核苷酸序列。此可转录的核苷酸序列赋予了细胞在具有渗透压调节剂（例如PEG8000）的培养基中的竞争优势。可转录的核苷酸序列也可以是产生与由编码内源性海藻糖酶的序列产生的RNA相同的RNA的核苷酸序列。
根据本发明，通过用具有与有待沉默的海藻糖酶内源性基因部分或完全同源的序列的海藻糖酶反义基因使植物转化来获得海藻糖酶抑制。因此，所述反义或RNA海藻糖酶干扰基因序列用于细胞、细胞群体、组织或植物的转化，其将与来自紫花苜蓿（alfalfa）的海藻糖酶序列中所描述的基因或其RNA信使或海藻糖酶内源性序列（鉴别为MSTRE基因序列）和玉米海藻糖酶序列（鉴别为ZmTRE）部分或完全同源。
因此本发明描述了紫花苜蓿海藻糖酶（紫苜蓿（Medicago sativa））的MSTRE基因（更确切地说，紫花苜蓿海藻糖酶的基因MSTRE1）的序列可以用于抑制玉米中海藻糖酶的表达，因为紫花苜蓿的序列与植物来源的海藻糖酶的其他序列同源。类似地，玉米序列与来自于编码海藻糖酶的基因的沉默事件中所用的其他植物的海藻糖酶同源。考虑到沉默基因无需100%同源性的事实，认为紫花苜蓿或玉米的序列可用于其他物种中。此外，仅表达反义定向或干扰RNA中同源基因的一部分便足以实现内源性海藻糖酶表达的有效抑制。
编码使海藻糖或其部分降解的酶的分离的cDNA和转录反义RNA或干扰RNA的核苷酸序列接着与启动子序列融合，使得转录引起反义信使RNA（mRNA）或干扰RNA（RNAi）的合成。
应了解，作为干扰RNA（RNAi）的是通过这一机制参与基因的转录后沉默的RNA分子，即发夹RNA（hpRNA）、小型RNA（sRNA）和微型RNA（miRNA）。
用于使植物细胞转化以进行本发明的技术已为所属领域的技术人员已知并且可在与主题有关的任何文献中查阅。
将编码海藻糖酶抑制因子的可表达序列引入植物中的方法对本发明并非关键，限制条件是基因表达于植物细胞（单子叶植物细胞或双子叶植物细胞）中。
可以通过现有技术中已知的任一种以下方法实现在同一植物中加入两个或多于两个基因的方法，所述方法包括（例如）：
（a）用含有多于一个有待引入的基因的多拷贝构筑体使植物转化；
（b）用不同构筑体同时共同使植物转化；
（c）用有待引入的基因进行相同植物的后续数轮转化；
（d）使两种植物杂交，其中每种植物携带有待引入同一植物中的不同基因；或
（e）组合上述方法。
本发明上下文中的术语“细胞”也包括原生质体并且术语“细胞群体”也包括组织、器官或其部分、基质内的个别细胞群体或完整有机体，例如植物。
根据本发明，术语“细胞群体”意谓单一细胞群体以及组织、器官或其部分中的细胞或完整有机体（如植物）中的细胞，其中完整植物或其部分可由遗传转化细胞组成。
术语“植物”是指能够进行光合作用的分化多细胞有机体，如被子植物和藻类。
术语“植物细胞”包括来源于植物的任何细胞并且包括未分化组织，如愈伤组织或冠状肿瘤和植物种子、繁殖体、花粉和植物胚胎。
本发明还包括使用本发明的方法选择的转化细胞，尤其是从这些转化细胞再生的植物细胞和植物以及其种子和其子代。
本发明的方法优选用于选择遗传修饰的植物细胞。可使用本发明的方法的植物的实例包括果实作物，如西红柿（Lycopersicum esculentum L.）、芒果、桃、苹果、梨子、香蕉、甜瓜等；农作物，如向日葵、烟草、甘蔗（Saccharum officinarum L.）等；小粒谷类作物，如小麦（Tritricum aestivum L.）、大豆（Glycine max L.）、大麦、玉米（Zea maysL.）、棉花等；蔬菜，如马铃薯（Solarium tubercosum L.）、胡萝卜、莴苣、南瓜、洋葱等；豆类，如菜豆、小扁豆、蚕豆和需要改良耐旱性和/或耐寒性的植物。
通过本发明的方法，转化细胞能够在植物细胞无法存活和生长的干旱和/或寒冷条件下存活和生长。因此，可根据存活和发育能力从整个群体中选择本发明的转化细胞。
因为遗传修饰植物由于引入了选择核苷酸序列而能够在一定程度上抑制海藻糖酶，所以获得的细胞可以改良葡萄糖流动并且在缺乏最佳细胞可用浓度的培养基中存活。因此遗传修饰植物可以发育，而未转化植物的发育受到抑制。当本发明的方法用于植物中细胞的遗传选择时，可在视觉上鉴别转化植物。
因此，本发明的方法提供了一种简单而环保的转化细胞（尤其遗传转化细胞）选择系统。转化细胞在低水可用性环境中存活和生长的能力消除了添加具有选择标记物化合物（如抗生素和除草剂）的培养基的需要。根据本发明，其可用作遗传转化细胞中的选择核苷酸序列，编码促进海藻糖酶抑制的产物的任何核苷酸序列。尽管可使用外源性核苷酸序列（如属于细菌、酵母或昆虫的核苷酸序列），但也可以使用内源性核苷酸序列，优点是避免引入来自另一物种的物质。
主要的优点是核苷酸序列编码与海藻糖酶序列同源或互补的RNA，因为其表达将通过反义RNA、RNA干扰或共同抑制引起基因沉默的转录后机制，从而通过阻止RNA信使（内源性或来自转基因）翻译来防止植物中产生其他蛋白质。除了这些优点外，还可以在需要选择细胞时（当这些细胞在引入相关核苷酸序列或序列以及选择序列后培养时）便利地使用可诱导或调节启动子来限制选择序列的转录过程。
由此，可能产生遗传修饰植物，其中出于本发明的目的，当核苷酸序列来源于相同物种时称为“同源转基因”。在本发明中，玉米海藻糖酶的反义序列将来自相同物种。
可使用分子生物学中已知的标准技术通过转化将所需同源转基因或转基因以及选择核苷酸序列引入细胞中。尽管并不是必需，但转基因和选择基因可彼此连接，使得选择基因的存在意味着也存在转基因。任选地，转基因和选择基因可成为同一构筑体的一部分并且使用相同载体引入细胞中。
因为需要引入的核苷酸序列在转化细胞中表达，所以含有两个核苷酸序列的基因构筑体通常含有可实现所述两个核苷酸序列表达的调节序列，如已知的转录启动子和终止子。因此，共同引入的核苷酸序列将通常与可以是组成性或调节性的启动子相联。
许多细胞，尤其是高等植物（如毛豆（Glycine max）和拟南芥菜（Arabidopsisthaliana）））在其基因组中具有内源性海藻糖酶的编码基因。
在本发明的方法的理想实施例中，选择核苷酸序列包含紫花苜蓿（紫苜蓿）的MSTRE酶或其一部分以及ZmTRE玉米基因或其一部分的互补DNA（cDNA）。
在本发明的另一个合适实施例中，核苷酸序列包含与紫花苜蓿（紫苜蓿）的MSTRE海藻糖酶或其一部分以及ZmTRE玉米基因或其一部分的cDNA互补的序列。
在本发明方法的另一实施例中，可使用阳性选择与阴性选择的组合来选择转化细胞。因此，将相关选择核苷酸与除选择序列以外的核苷酸序列一起共同引入转化细胞中，所述核苷酸序列编码对至少一个选自包含毒素、抗生素和除草剂的群组的成员的抗性，并且转化细胞存在于培养基中或其上。
尽管出于技术原因，表达单元（即启动子和MSTRE基因或启动子和ZmTRE基因）必须在细菌性载体中（例如在大肠杆菌（Escherichia coli）中）增殖，但通过在结束时由PCR获得或用限制酶消化来从载体分离表达单元。一旦获得了含有启动子和反义海藻糖酶基因的表达单元或DNA，则将其用于遗传转化。因此，所产生的植物不含细菌性载体中存在的不合需要的序列，如抗生素抗性、复制原点等。
以下实例说明本发明，其不欲限制本发明的范围，因为所属领域的技术人员将了解可以在不改变原始范围和精神下对本发明做出某些修改。
实例1.材料与方法
a）核酸操作
质粒DNA.根据标准方案（桑布鲁克等人,1989（Sambrook et al.,1989））进行细菌性质粒DNA的分离程序、限制、接合和转化。关于载体TOPO
（英杰公司（Invitrogen,Inc.））中PCR产物的接合，其是根据制造者的说明书进行。由小规模制备来进行通过RT-PCR、3'RACE和
获得的片段的测序。
植物DNA.为克隆拟南芥菜的启动序列（promoting sequence）rd29A，从在具有0.7%琼脂的MS培养基中发芽10天的芥菜（Arabidopsis）植物进行基因组DNA的苯酚:氯仿提取。
植物RNA.对于来自紫花苜蓿的海藻糖酶基因的cDNA克隆，根据制造者的说明书，使用TRI
（分子研究中心公司（Molecular Research Center,Inc.）），对来自在具有0.8%琼脂的MS培养基上体外发芽7天的紫花苜蓿（紫苜蓿栽培品种（M.sativa cv.）CUF-101）的幼苗的组织进行总RNA提取。使用组装有大的互补寡核苷酸的PCR进行玉米的cDNA合成。
引物.使用以下引物：
b）生物材料
质粒DNA.为接合PCR产物，使用载体pGEM-T Easy
（普洛麦格公司（Promega,Inc.））和TOPO TA
（英杰公司）。为构筑植物的表达载体，使用载体
（克罗泰克公司（Clontech,Inc.））。
菌株.由片段接合获得的质粒通过热休克引入大肠杆菌菌株DH5a、JM109或One
TOP10F'（英杰公司）市售菌株的钙感受态细胞中。
植物材料.为提取紫花苜蓿RNA，使来自CUF-101的紫花苜蓿种子在具有0.7%琼脂的MS培养基中发芽。为提取芥菜DNA，使芥菜种子在具有0.7%琼脂的MS培养基中发芽。对于烟草轰击，使用在具有0.7%琼脂的MS培养基（补充有2%蔗糖）中在无外来污染下生长的烟叶外植体烟草变种夏提（Nicotiana tabacum L.cv Xhanti）。培养物保持于26℃下16小时光照/8小时黑暗的循环下，并且在30到40天后在新鲜培养基中次培养。
实例2.MsTRE紫花苜蓿基因的cDNA克隆
因为未报导编码来自紫花苜蓿的海藻糖酶（称为MsTRE（Ms：紫苜蓿；TRE：海藻糖酶））的序列并且为了获得在抑制这一种酶的构筑体中所用的片段，着手获得其DNA的完整序列。因此使用：基于这一基因转录物的扩增（RT）和其后续PCR扩增（RT-PCR）的方案。
a）通过RT反转录和PCR（RT-PCR）进行内部片段扩增
为扩增cDNA内部片段，使用简并寡核苷酸Tre300和Tre351进行RT-PCR的简单测试，根据资料库（恩兹（Entrez），NCBI）中报导的芥菜海藻糖酶（拟南芥菜；寄存编号AAF22127）、马铃薯（马铃薯；寄存编号A67882）和大豆（大豆；寄存编号AAD22970）的编码序列中的保守区域进行设计。使用克拉斯德方法（Clustal method）（DNA Star软件（Software DNA Star））进行序列对准。
对于反转录反应（RT），使用增强型鸟类HS RT-PCR系统（Enhanced Avian HSRT-PCR system）（西格玛公司），并且需要1微克优质紫花苜蓿的总RNA，根据制造商的说明书将其与1微升Anchored Oligo(dT)
（0.5微克/微升）和1微升dNTPs（二脱氧核苷酸）混合物（各10毫摩尔）一起于10微升最终体积的无菌二次蒸馏水中在70℃下培育10分钟。在加热下培育后立即将混合物放于冰上并且添加6微升PCR试剂级水、2微升AMV-RT10X缓冲液、1微升RNAse抑制剂（每微升20U）和1微升RT增强型AMV酶（每微升20U），最终体积为20微升。此混合物在42℃下培育60分钟，从而合成DNA的第一股。
对于PCR扩增，使用含有3微升由RT合成的第一股、1微升DNA聚合酶JumpStart（每微升2.5U）、5微升
10X缓冲液、1微升二脱氧核苷酸混合物（各10毫摩尔）、2微升简并有义寡核苷酸Tre300（100毫微克/微升）和2微升反简并寡核苷酸Tre351（100毫微克/微升）的最终体积为50微升的PCR试剂级水。用此反应混合物进行PCR以扩增海藻糖酶cDNA的内部片段。
将通过PCR获得的片段克隆到pGEM-T Easy
中，接着通过42℃下热休克45秒引入钙感受态DH5a细菌中。
转化细菌的特征在于质粒DNA的EcoRI酶消化作用并且选择释放扩增片段的转化细菌。对此片段的测序得到核苷酸序列，由此核苷酸序列，可设计出后续克隆紫花苜蓿海藻糖酶的5'和3'cDNA端方案中使用的寡核苷酸。
b）通过3'RACE方案扩增3'端
对于3'RACE方案，使用最初通过反转录合成的第一DNA股。由此cDNA，使用特异性寡核苷酸3Tre300和5T18HXS进行初始PCR扩增，这些寡核苷酸其是根据所得内部片段序列来设计的。接着使用寡核苷酸5T18HXS和3Tre300进行半巢式PCR，这些寡核苷酸是根据所得内部片段序列的内部位置最终设计的寡核苷酸。将扩增序列克隆到TOPO TA
载体（英杰公司）中，产生质粒TOPO-3Tre，将其纯化以用于EcoRI酶表征以及后续测序和操作。因为在此区域中发现植物海藻糖酶序列之间的大部分保守区域，所以此片段足以设计出抑制内源性海藻糖酶的载体。
c）通过GeneRacer扩增5'端
为获得紫花苜蓿海藻糖酶cDNA的5'端，使用
系统。在此方案中，以早先处理的3微克总RNA开始，根据制造商关于RNA脱磷酸的说明书，获得CAP去除结构并进行其后续与所提供的寡聚RNA的结合。由此修饰的RNA信使，使用
系统（西格玛公司）着手合成互补股（cDNA）。接着使用所得互补股作为PCR扩增中的模板，所述PCR扩增使用寡核苷酸
和根据通过RT-PCR获得的内部片段的序列设计的反义寡核苷酸5Tre350。将扩增序列克隆到载体TOPO TA
中，产生质粒TOPO-5Tre，将其纯化以用于Eco RI核酸内切酶表征以及后续测序。
为将由此策略获得的三个片段进行对准，获得紫花苜蓿海藻糖酶（MsTRE1）的cDNA的完整序列。
实例3.设计反义TRE序列（TREas）和干扰RNA（Tre-RNAi）
a）在物种之间具有较大同源性的TRE内部片段的扩增和克隆。
为了在植物中在启动子35S和rd29A下表达海藻糖酶反义序列，首先选择包含560bp序列内部片段的片段（SEQ.ID.No.18），其包括在不同的植物海藻糖酶之间保守的小型区域。为此，设计一对特异性寡核苷酸Tre333和TreNsiRw，其扩增从载体TOPO-3Tre的DNA质粒中选出的内部片段（TRE）。TreNsiRw寡聚物将Xma I位点和Nsi I位点相继引入序列的3'端中。将扩增产物克隆到载体TOPO TA
中，由于片段双向插入载体中而产生质粒TOPO-tre560s和TOPO-tre560as。在这两个构筑体中，插入物在一端侧接载体的SacI位点并且在另一侧侧接Xba I和Nsi I位点，从而能够通过TRE序列中位点Nsi I相对于这些位点的消化来确定片段的方向（有义方向：SacI-XbaI；反义方向：XbaI-SacI）。
b）构筑中间载体TOPO-GUS
为构筑紫花苜蓿海藻糖酶的干扰RNA，需要具有使TRE序列的两个拷贝接合的“环”序列。使用大肠杆菌的b-葡萄糖甘酸酶（GUS；基因uidA）的基因序列的1,020bp内部片段。通过PCR使用GUSSmaR和GUSNsiF引物由pBI-121质粒中质粒DNA扩增此序列。根据载体pBI-121（寄存编号AFA85783）的序列中所包括的GUS序列设计出所用引物并将其插入片段末端Xma I位点和Nsi I位点中。将PCR产物克隆到载体TOPO TA
中，由于片段双向插入载体中而产生质粒TOPO-GUSs和TOPO-GUSas（通过Nsi I消化来确定）。
c）用TRE片段构筑干扰RNA
为构筑海藻糖酶的干扰RNA，将片段TRE的两个拷贝彼此对向放置（头对头）并且使其连接到扩增的GUS序列1,020bp片段。为此，质粒pTOPO-tre560as的片段TRE最初释放为片段Xba I-Nsi I并且插入质粒pTOPO-GUSs的相同位点中，产生质粒pTOPO-GT（GUS:TRE）。接着，通过SacI-XmaI消化从此质粒释放GT片段（GUS:TRE）并克隆到质粒pTOPO-GUS AS的相同位点中，产生质粒pTOPO-TGT（TRE:GUS:TRE）。此构筑体的阳性克隆的特征在于SacI-XmaI双重消化和NsiI简单消化。
实例4.构筑控制表达载体
a）rd29A启动子序列的扩增
通过PCR从提取自芥菜幼苗的叶组织的基因组DNA扩增启动子序列rd29A。种子是由位于库埃纳瓦卡的墨西哥国立自治大学生物技术研究所（Institute of Biotechnology,UNAM-Cuernavaca）提供。对于扩增，根据已报导的启动子序列（寄存编号D13044）设计寡聚引物Frd29Hind和Rrd29Xba。此对寡聚物扩增包含核苷酸4563到核苷酸5504的片段并且侧接位点Hind III和Xba I。将PCR产物克隆到载体TOPO TA
中以产生质粒TOPO-rd29。
b）构筑植物中的可诱导表达控制载体：prd29A:GUS
通过Hind III-Xba I双重酶消化从载体TOPO-rd29释放启动子序列rd29A并且亚克隆到载体（克罗泰克公司）的相同位点中。在此构筑体中，序列rd29A置换启动子35SCaMV，产生质粒prd29A:GUS。此载体是海藻糖酶的反义和干扰RNA的可诱导表达载体的控制质粒。
c）植物中的组成性表达控制载体：pBI-121（p35S:GUS）。
通过Hind III和Xba I双重酶消化从载体TOPO-rd29释放启动子序列rd29A并且亚克隆到载体
（克罗泰克公司）的相同位点中。在此构筑体中，序列rd29A置换启动子35S CaMV，产生质粒prd29A:GUS。此载体是海藻糖酶的反义和干扰RNA的可诱导表达载体的控制质粒。
实例5.构筑TRE反义片段（TREas）和海藻糖酶干扰RNA（TRE-RNAi）的表达载体
a）在启动子35S和rd29A下构筑TRE反义片段（TREas）的表达载体
为在质粒中使用启动子35S和rd29A在反义方向上引导海藻糖酶序列，通过SacI-Xba I消化释放载体TOPO-tre560s的海藻糖酶片段并且将其亚克隆到质粒pBI-121和prd29A:GUS的相同位点中，产生质粒p35S:TREas和prd29:TREas。在两种载体中，反义片段置换GUS基因并且位于NOSter区域（编码胭脂氨酸合成酶的基因的终止和聚腺苷酸化区域）之前。
b）在启动子35S和rd29A下构筑RNAi-TRE卡匣的表达载体
为在植物中表达海藻糖酶干扰RNA（TRE-RNAi），通过Sac I-Xba I双重消化从载体TOPO-TGT释放此卡匣并且亚克隆到质粒pBI-121和prd29A:GUS的相同位点中，产生质粒p35S:TRE-RNAi和prd29:TRE-RNAi。在两种载体中，RNAi卡匣置换GUS基因并且位于NOSter区域（胭脂氨酸合成酶基因的终止区域）之前。
实例6.获得本发明的GM玉米植物
a）在启动子35S和rd29A下将用于表达反义片段TRE（TRE AS）的构筑体整合到玉米中
为获得在35S或rd29A启动子控制下表达海藻糖酶反义的B73和H99自交株的GM玉米植物，通过基因枪并且使用在无菌培养物中生长的胚性愈伤组织整合质粒p35S-TREas和prd29A:TREas。
b）制备DNA并进行微粒子轰击
为进行DNA/粒子轰击，使用高压Helio PDS
系统。根据已知之方案，进行钨粒之制备、DNA涂布和轰击参数确定，每个受轰击DNA构筑体使用6个盒子。
实例7.评估作为选择标记物的系统
在具有生长调节剂的培养基中（补充有4%PEG-8000）进行选择以诱导体细胞胚胎（胚性愈伤组织）形成，用海藻糖酶反义构筑体和其对照物轰击胚性愈伤组织，保持于补充有2毫克/升麦草畏（Dicamba）、40毫克/升腺嘌呤、3%蔗糖和4%PEG8000的MS培养基中并且在26℃下和16小时光照/8小时黑暗的光周期中培育。
实例8.构筑玉米海藻糖酶表达单元
选择编码玉米海藻糖酶的基因以产生同源转基因植物。反转此开放阅读框架（ORF）并且获得补充物，使其在简单启动子35S调节下利用编码来自根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的胭脂氨酸合成酶的基因的聚腺苷酸化序列来表达。在两种碱基中修饰所得的序列以消除两个内部EcoRI限制位点；并且还插入非编码序列，其将充当标签（Tag）以鉴别此转化事件。必须注意，反义基因不含任何开放阅读框架，因此不存在反转此ORF的蛋白质合成。存在EcoRV的天然非对称限制位点，其充当通过其他方法的检测分析法中的参考（图1）。
通过PCR辅助的体外长互补寡核苷酸配对获得此表达单元。将所产生的1802bp片段克隆到细菌性载体pCR8Topo（凯杰公司（Quiagen））中。EcoRI消化产生1.8Kb片段，将其纯化并用于胚性玉米愈伤组织的基因枪实验中。
实例9.使用胚性愈伤组织和基因枪进行玉米自交株B73的遗传转化
在补充有2毫克/升麦草畏、40毫克/升腺嘌呤、3%蔗糖（pH5.8）和2.5公克/升格蕾特（gelrite）的MS培养基（村重和史库格1961（Murashige and Skoog1961））中从成熟种子诱导玉米自交株B73的胚性愈伤组织（参见图2）。使用与其余植株相比具有高细胞分裂能力的胚性植株。
用含有具有海藻糖酶（例如根据实例3的紫花苜蓿的海藻糖酶或根据实例8的B73玉米海藻糖酶）的反义表达单元的质粒的金微粒轰击玉米胚性愈伤组织，并且随后在4%PEG8000存在下选择两个月（进行3次继代培养）以产生耐受PEG的克隆，而受轰击愈伤组织（称为阴性对照）未显示细胞死亡。
所得转基因克隆在具有PEG的培养基中增殖1个月，直到量足以在补充有0.2毫克/升BAP、0.1毫克/升激动素、1%蔗糖、2.5公克/升格蕾特的MS培养基（村重和史库格1962）中进行植物的再生。将再生的小植物转移到温室条件下的土壤中以促进其生命周期从而获得种子。用氯化气体对所产生的种子灭菌以避免未来受真菌污染。为监测对PEG8000的耐受能力，转基因种子（T1代）在含有7%PEG8000的烧瓶中生长，将其存活能力与自交株B73的未转化（野生型）种子进行比较。T1代中的转基因种子在其在4%PEG8000下的生长能力（25%耐受性）方面显示差异，而阴性对照无法在这些条件下发芽。在此阶段中，转化植物展示其在水分不足环境中的存活能力。在利用PEG8000在种子期中进行选择程序，直到产生将产生具有100%PEG8000耐受性种子的穗的群体后，将耐受性植物转移到温室中以获得后代T2、T3。选择两个转基因植株（称为T1和T4）接受耐旱性评估。这些植株在其生命周期中展示最佳农业性能（图8）。
将对7%PEG8000具有抗性的植物转移到温室条件中以使其能够完成其生命周期。从5个独立遗传转化事件分离DNA以检验35S功能单元（存在于受轰击质粒中的II型新霉素磷酸转移酶NPTII基因）的插入；如图3中可见，T1和T4含有预期片段。对于其生长和活力能力，选择植株T1和T4进行未来耐旱性实验。
实例10.耐旱性玉米植物的分子表征
对于此方面，使用从第三代转基因自交株T1和T4衍生的种子。在此方面，进行实验的植物的选择由种子在7%PEG8000溶液中发芽组成，此溶液表示通过不允许PEG提供水来供种子吸收的供水不足培养基。能够在此选择性试剂下发芽的种子接着与生长对照物一起在温室条件和房间中生长。从植物叶子采集2平方厘米的区段，用DNeasy套组（凯杰）从其中提取总DNA。此DNA用为模板以使用特异性寡核苷酸扩增基因的开放阅读框架和35S启动子的内部区段。产物解析于1%琼脂糖凝胶中，其展示GM植物上对应于预期尺寸的约950bp条带。使用来自对照植物的DNA作为对照，而作为阴性对照，在不添加DNA模板下进行反应（图4）。
实例11.通过定量RT-PCR（实时RT-PCR）进行海藻糖酶转录物检测
使用编码海藻糖酶的基因的反义开放阅读框架表达进行基因衰减的分子策略。因为此策略不终止参考基因的转录，因此通过对此基因的积聚进行定量来计算沉默比例。图5展示在干旱条件下，通过参考转录物积聚降低，是在正常灌溉下生长的植物的值的86%和76%，显而易见表达衰减。由mRNA积聚降低14%到24%组成的此衰减足以提供GM植物中耐干旱应力的表型。
实例12.作为海藻糖酶活性的量度的总葡萄糖的定量
海藻糖酶是一种使用海藻糖作为底物的酶并且其在水存在下产生两个葡萄糖分子。使用适用于玉米的由弗蕾迪尔（Freydiere）等人（2002）描述的方法。使用杵将100毫克新鲜组织浸渍于微管中。将均质物离心并且将上清液转移到干净的管子中。使用针对葡萄糖预校准的罗氏Accu-chek电子微细胞装置（Roche's electronic micro cell device）。从野生型植物获得的葡萄糖值是64毫克/分升，而表达反义海藻糖酶的GM植物的值是51毫克/分升。通过分子策略衰减的海藻糖酶防止葡萄糖从海藻糖水解，一致地定量为野生型植物中测定的浓度的79%。这些结果与通过实时定量RT-PCR检测的mRNA积聚一致。
实例13.耐旱性玉米植物的生理学表征
a）B73植株GM的生长
种子评估和选择
将自本发明的同源转基因植株B73-T1和B73-T4以及作为对照的B73野生型玉米（克里奥尔黑和克里奥尔白）以及白色和卡氏玉米（cacahuazintle maize）的玉米种子放在26℃生长室中具有水的皮氏培养皿（petri dish）中发芽5天。在发芽后，将幼苗转移到60厘米深和25厘米直径PVC管中的含有泥煤阿戈利特砂土（agrolite sandy soil）的基质中。底盖含有多个孔洞以允许排水；可去除此盖以观测根部部分。最终，进行营养生长、花粉囊和雌花显现、种子产生和衰老的追踪。
b）测量营养期中的农学参数（图6和图7）
作为内部比较对照，使用两种已知耐旱性能力的克里奥尔玉米品种。玉米播种后两个月，克里奥尔的转化株显示更高的高度，最小的是B73对照物。显著地，克里奥尔玉米的尺寸是参考克里奥尔植株遗传特征，其在任何环境中都较明显。图8展示在灌溉条件下从营养生长获得的表型。
在图8的图像中，看到克里奥尔品种中明显的生长差异，其更大；尺寸其次的是转化B73T1和T4并且最小的是B73对照物。
简单地通过停止供应水和矿物质溶液来实现干旱。根据指示，基质由泥煤和阿戈利特（其具有低保水性）组成，展示了干旱对植物感受性增加期（其是雄花和雌花的产生阶段）以及穗数和籽粒灌浆的影响。图8到图10中观测到干旱对此物候阶段的影响。
c）开花：雄花（花粉囊和花粉）
与对照植物B73在25天后产生香料相比，第一个产生香料（其是雄花的成分）的植物是B73T1和T4。克里奥尔品种中在30天后出现穗。此开花延迟是供水不足且穗和穗轴出现范围增大的植物的特征。
d）花：雌花（穗）
与对照17天后诱导雌花形成相比，第一个诱导雌花形成的植物是植物株B73T1和T4。极引人注意的是，野生型植物克里奥尔白和克里奥尔黑尽管产生穗，但其未展示雌花形成或穗，可能是因为其受到应力。在籽粒灌浆后，植物进入衰老阶段，其特征是植物的光合作用和膨压降低（图10）。
e）种子产生
通过收集所分析的每种植物的穗和产生其的植物来评估种子产生。在评估前，其在37℃下适当干燥8天。如表1中所见，转化植物与阴性对照相比种子显著增加。每行的种子数和行数以及平均重量表示本发明植物产生种子的显著优越性。结果是每种基因型中15个穗的平均值。
表1
| 基因型 | 每个穗的行数 | 每行的种子数 | 100粒种子的平均重量（种子平均值（克）) |
| B73对照物 | 16 | 16.00 | 2.56 |
| B73T1GM | 18 | 19.43 | 3.64 |
| B7374GM | 20 | 22.27 | 3.90 |
f）衰老
与雌花形成无关，在所有处理中衰老状态均类似。
实例14.农学模式测量
a）生长测量
图11展示植物高度，是从其底部测量到顶端生长区域；从种子发芽到衰老的动力学。标绘点表示从每次处理的植物获得的平均值。可以发现，BT73株植物展示生长速率低于克里奥尔。然而，BT73GM与对照物的比较表明GM的速率较高。克里奥尔品种展示更大的生长并且其间极其类似；其超过3.5米高度。应强调，植株B73对照物在开始开花前生长增加，因为其中其具有更大的营养物消耗并且营养物同时用于生长和茂盛，这与转化植物相反，转化植物首先同步化、生长并且过一会儿茂盛。如所指示，受干旱应力的克里奥尔植物尽管达到大的高度，但未能产生穗。
b）生理学比较
关于品种之间的生理学比较，在图12中可以观测叶子和茎的尺寸、颜色差异，其中克里奥尔品种与B73相比尺寸增加，并且其色彩是淡绿色且亮度低于B73，B73具有强烈并且光亮的绿色，并且其叶子更加肥厚。关于茎的形状和厚度，克里奥尔具有更细而圆的茎，而B73的茎倾向于椭圆形并且粗厚，提供了更高的抗性和与其中茎在达到2米高度后开始弯曲的克里奥尔不同的完全直立生长的可能性。需要进行田间测试，因为玉蜀黍的次生根受到受控温室测试的限制。
实例15.在潮湿和干旱应力条件下测量光合参数
a）干旱诱导
将植物分为两组；一组停止灌溉，而另一组作为对照保持灌溉。图13展示应力后植物所显示的应力表型，并且可在停止灌溉后13天观测到特征。
在图13中，可以观测到与未经受此处理的植物相比，植物对干旱应力的反应。克里奥尔黑和克里奥尔白品种展示更大的干旱应力并且呈现叶子上的膨压损失、枯萎和萎黄病；这些作用在克里奥尔黑中更强。在克里奥尔植物中，必须在开始诱导后6天中止干旱，因为其已展示严重应力损害作用。
此时间后仍缺水的植物达到永久性枯萎点。
对于同源转基因植物，仅在诱导干旱后11天和13天发现影响；其叶子呈现卷曲和轻度萎黄病。展示更大影响的植物是T4，并且其也在干旱作用期间减缓其生长。关于B73植物，其未展示显著影响，因为其中其纵向尺寸显著小于转化植物，这使其需水量较低。
b）光合参数
与对照品种和T4相比，B73-T1植株在潮湿条件下具有更高光合速率；相反，在干旱期间，所有品种在第6天均降低其光合作用，但仅T1在植物受灌溉的第13天展示轻微增加（图14）。图14中展示的各系列的最后一个柱条表示这些品种在开始灌溉后恢复的光合速率。
电导率是植物中（无论细胞内还是细胞间）离子浓度的量度。在测量电导率时，与T4植物在第6天时电导率降低接近50%而对照物仅在第13天电导率降低约40%相比（图15），GM T1植物在干旱第6天展示电导率降低超过50%并且在干旱第13天降低超过100%的反应。此引导我们推断出，T1展示比T4和克里奥尔更高的存活反应和耗水量。
图16展示所测试植物的内部水含量，其中可以观测到T1与T4和干旱对照物相比具有最低水含量。T1和T4展示显著的适应反应，因为其与对照植物相比可以在干旱应力状态后储存显著更多的水。
一个重要参数是植物生长土壤的相对湿度。为确证对缺水的反应，测量植物和土壤中的相对湿度，并且观测到对照植物甚至在水分多于GM植物的情况下开始干旱期。接着，通过处理作用降低相对水含量。在第13天时，与对照植物相比，根部吸收罐中的50%水分，这种情形发生可能是因为对照植物在比较时具有更小尺寸并且其需水量更低（图17）。
细胞内CO2的测量反映了气孔开口，其受干旱影响。允许气体交换的细胞开口受到依赖于脱落酸的机制的控制，其是由供水不足和其他非生物应力因素引起。图18展示尽管施加应力，但与保持内部高CO2浓度的对照物相反，本发明的GM植物继续交换气体。
上述想法可在图19中确证，图19展示测量时的气孔开口，其中可以观测到T1确实具有更低的呼吸速率，因为其关闭超过50%气孔，而T4在干旱开始时的反应延迟；但在6天后，其与对照物B73在第6天呼吸速率仅降低超过30%并且在第13天降低约50%相比蒸腾速率降低超过50%。
实例16.具有反义海藻糖酶的植物中的寒冷应力耐受性
对照玉米植物和具有根据本发明获得的反义海藻糖酶基因的植物在4℃下发芽3天并且接着在16℃下生长。与本发明的GM相比，野生型植物无法进行生长，将其转移到罐中进行营养生长。在受控温室条件下，使冬季中的温度波动到至多2℃作为最低温度。与野生型植物相比，本发明的具有反义海藻糖酶基因的植物进行其营养生长。体外资料与温室资料一致，因为本发明的具有修饰的反义海藻糖酶基因的植物耐寒。所获得的本发明的植物还能够在这些条件下发展第一批穗，这些穗是开始生殖期的雄性器官花粉产生器。
存在三种可以解释海藻糖对生物分子的防护能力的可能机制，如水可用性、晶体形成和化学稳定性。这些机制并不排他的并且可以具有累加效应以产生所观测到的根据本发明产生的耐旱性和耐寒性。例如，由水与分子相互作用通过氢桥所形成的水化膜可以使分子稳定并且抑制不可逆变性（鲁斯等人，1993（Roser et al.,1993）；克莱格，1985（Clegg,1985））。
D-葡萄糖的两个残基之间的糖苷键展示手性挠性，可能允许海藻糖与不同分子的其他极性基因相互作用。海藻糖是唯一的在极端温度下形成稳定无定形晶体的糖。已提议将此双糖用作酶活性、酶稳定、食品添加剂、冷冻保存细胞、组织和器官的保护物并且改良花朵存放期（厄罗古鲁等人，2000（Eroglu et al.,2000）；郭等人，2000（Guo et al.,2000））。
此双糖也被称为信号传导分子。有证据允许对韧皮汁液中的海藻糖进行定量，其中划分用于其合成的酶促反应。生产型组织或光合组织含有磷酸海藻糖合成酶，而在消耗型组织中发现磷酸海藻糖磷酸酶。
实例17.通过HPLC对海藻糖进行定量
使用液相色谱法用折射率检测器分析样品，每次处理使用来自对照物B73、B73T1和B73T4的三种样品；在注射的提取物中的成分分离期间，在约17分钟的滞留时间获得对应于海藻糖的峰，此滞留时间是根据从标准市售海藻糖获得的资料，不过也产生其他对应于相关双糖的峰，其中一些对应于葡萄糖和蔗糖，并且未鉴别其他峰（图20）。
-植物样品中的海藻糖含量
为定量海藻糖，从图20计算出样品（mtra）和标准（std）的曲线下面积（Δ）和生物质量（毫克）[□]，其中使用0.25毫克的标准生物质量和100毫克的植物样品，使用式（1）并且获得表2中所测试样品的结果：
海藻糖%=(Δmtra/Δstd)([□]std/[□]mtra)(100) （1）
表2
Δstd=280950
[□]std=0.25mg
[□]Mtra=100mg
根据上述内容，从分析的样品获得鲜重海藻糖值；在表3中，比较这些值与野生型玉米植物中此双糖的报导值。
表3.通过HPLC分析的B73对照物样品和本发明的遗传修饰样品中的海藻糖浓度（毫克/公克鲜重）
| 野生型玉米 | B73对照物 | B73T1 | B73T4 |
| 3.78-5.20 | 3.98 | 6.70 | 7.13 |
如所示，在对照植物中获得的值与早先在玉米植物中报导的值类似，并且其等于B73玉米植物总值的100%，因此在本发明的T1和T4遗传修饰植物中发现的值与对照物相比将相当于至少68%和74%更高的海藻糖积聚；这些结果延伸到报导的范围外并且表示实现海藻糖酶抑制（图21）。
实例18.测量海藻糖酶的酶活性
通过对海藻糖的葡萄糖水解的定量进行对海藻糖酶的酶活性的定量。进行此实验以检验实例17中获得的结果（表4）。酶单位等于每升海藻糖1微摩尔。
表4.在对照物和遗传修饰B73植物（T1和T4）的提取物中检测到的葡萄糖含量和海藻糖酶活性
*=1U海藻糖酶
通过此实验可以观测到本发明的遗传修饰植物相对于B73对照植物不产生葡萄糖（图22），此表明实现海藻糖中海藻糖作用衰减，证实了从遗传修饰植物（T1和T4）中预定的海藻糖含量获得的资料。
实例19.标记LD-PCR（长距离PCR）
在获得先前从玉米叶的总RNA合成的cDNA后，使用32P-dCTP，使用干旱和湿润条件下对照物B73、T1和T4的样品，进行标记LD-PCR分析法，微阵列中将使用总共6份样品；在测试时还进行无标记测试作为T4的cDNA的模板（湿润条件下）以验证反应混合物和扩增条件是正确的（图23），通过80伏特下1%琼脂糖下凝胶电泳进行观测并且用照片文件管理器Gel Logic200（成像系统公司（Imaging System））进行观察。
实例20.使用微阵列对差异表达进行定量
利用根据实例19用作放射性探针合成的模板的cDNA，其与表5中展示的质粒杂交，在含有表5中展示的DNA片段的尼龙膜上印迹。所提及的质粒来自由蒙塔沃-赫兰德兹（Montalvo-Hernandez）（2007）和巴瑞拉-菲格罗拉（Barrera-Figueroa）（2007）报导的干旱响应基因差异表达文库的构筑以及含有未公布的豆子中的干旱响应基因的质粒。
表5
表5（续）
表5中的质粒共滴注400微克（2微升：1微升质粒+1微升NaOH），其在用于DNA的微阵列的尼龙膜上印迹；接着使用这些膜与从在干旱和湿润条件中合成的RNA的cDNA放射性标记所获得的放射性探针杂交并且在-80℃下暴露于X射线且在第二天显影，观察到杂交信号的不同强度（图24）。使用阵列视觉软件（Array Vision software）（GE）分析所得信号，减去每个信号周围的背景并且最终获得与其中每一者相关联的强度。
实例21.基因诱导定量
表6展示根据实例20在对照样品B73、T1和T4中获得的信号强度值和两个值关于其背景的减数，表示信号诱导水平；根据本发明，对于其中减数为零的基因，此表示未检测到此基因，因为进行减去以知晓在干旱条件下是否存在基因诱导或抑制。零值表示这些基因的表达在根据测试可检测的临限值的范围外。
表6.通过杂交分析法从干旱条件下来自B73对照物、T1和T4植物的叶子的植物样品的过度调节系数[R=强度干旱(应力)/强度潮湿(灌溉)×100]计算的差异表达值
表6（续）
HUM 潮湿
DRO 干旱
SUBST 减数
实例22.基因分类
在根据实例21的微阵列中展示诱导或抑制信号的基因中，将其按功能分类；值得注意的是，在进行减法时具有零值的基因不分类，因为此值表示在干旱应力条件下在对照植物B73和GM植物中未检测这些基因。根据上述内容，此功能分类发现若干种与细胞中的不同功能相关联的基因，例如与包括干旱在内的应力反应相关联或有关的基因（表7），脱水素即为如此，其属于LEA蛋白质（胚胎晚期富集蛋白质）家族群体，这些LEA蛋白质是对低温、盐度和干旱起反应而产生的，用于保护细胞膜免受应力损害（阿拉洛瓦等人，2003（Allagulova et al.,2003）；和普哈凯伦等人，2004（Puhakainen et al.,2004）），其中其产生是由脱落酸（ABA）诱导。还观测到原生质体固有蛋白质表达，此蛋白是水通道蛋白的假想蛋白质并且与水的使用直接有关（蒙塔沃等人2007）；以及激酶SPK-3蛋白质，其与对ABA、翻译后水平下的蛋白质活化（尹等人1997（Yoon et al.1997））和第4组中的LEA（胚胎晚期富集蛋白质）表达（其与细胞成分的保护有关（蒙塔沃等人2007））起反应的基因诱导有关。
表7.在对照物和本发明的遗传修饰植物中按照对非生物应力反应的功能性分类的基因以及抑制和诱导水平
| 图例说明 | 基因 | B73对照物 | B73T1 | B73T4 |
| PV3 | 脱水素（dhnl） | -6.75 | 7.01 | -29.41 |
| PV4 | 对潮湿cDNA起反应 | 0.64 | 10 | -31.37 |
| PV6 | 固有液泡膜蛋白质 | -3.84 | -26.74 | 58.87 |
| PV8 | 由寒冷诱导 | 1.18 | -103 | -5.49 |
| PV9 | 前纤维蛋白 | -15 | 0.61 | -29.78 |
| PV10 | 蛋白激酶SPK-3 | -104.76 | 0 | 86.95 |
| L90 | 非特异性脂质转移蛋白质 | -37.5 | 0 | 0 |
| L17 | 第4组LEA | -65.71 | -12.5 | 94.78 |
分类为非生物应力反应的基因在B73植物中展示不同行为；关于对照物，与在本发明的GM植物中观测到的相反，其主要展示了与干旱应力反应相关联的基因信号抑制（图25）。还观测到在光合作用中具有功能的基因的信号强度，光合作用定义为一系列反应，其中ATP的合成是由光激发反应和光能转化为化学能过程中CO2的固定产生；例如可注意到葡萄糖磷酸变位酶的重要性，葡萄糖磷酸变位酶是一种负责将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸的酶，因此其与糖原病有关。类似的是叶绿体蛋白的存在，叶绿体蛋白是一种在真核植物细胞、藻类和一些原生生物中负责进行光合作用的细胞质细胞器。观测到光合作用水平下基因表达的差异，尤其是GM与对照植物，其中这些基因的信号具有低表达量（表8和图26）。显著的是，在对照物和遗传修饰样品中获得单一信号强度值，按生物应力反应的功能类别归类（表9）。索马甜是一种与植物病原体防护（称为PR蛋白质（病原性相关））和渗透应力反应有关的蛋白质。
表8.在对照物和遗传修饰B73中按照光合作用的功能性分类的基因以及抑制和诱导水平
| 图例说明 | 基因 | B73对照物 | B73T1 | B73T4 |
| PV13 | 叶绿体葡糖磷酸变位酶 | -4.02 | -6.5 | -14.67 |
| PV14 | 叶绿体蛋白 | -13.55 | -185.7 | 81.05 |
| L13 | 叶绿体假想蛋白质 | 33.33 | 0 | 0 |
表9.在B73对照物和遗传修饰植物中按照生物应力反应的功能性分类的基因以及抑制和诱导水平
| 图例说明 | 基因 | B73对照物 | B73T1 | B73T4 |
| PV5 | 索马甜蛋白质 | 8.02 | 4.29 | -19.41 |
应指出，相对于对照物和GM，表达信号逐渐降低，其中T4展示信号抑制，表明植物由于其基因组中存在遗传修饰而尚未完全识别应力信号（图27）。
植物积聚各种相容溶质（既为了能量使用也为了保护应力反应）；正是所分类的与碳水化合物代谢相关联的肌醇基因（表10）的情况，并且其是负责维持细胞膜并且是从肌醇-1-磷酸合成酶合成的糖，可由其观测到本发明的GM玉米植物中此基因的信号抑制（图28）。
表10.在对照物和遗传修饰B73中按照对生物应力的功能性反应分类的基因以及抑制和诱导水平
| 图例说明 | 基因 | B73对照物 | B73T1 | B73T4 |
| L15 | 肌醇-1-磷酸合成酶 | 18.75 | 0 | 0 |
表11和图29展示了对照物和遗传修饰B73中从未知或假想蛋白质获得的信号强度值；就我们所知，这些蛋白质是未知蛋白质，其功能尚未知晓并且视其序列和与其他已报导蛋白质的相似性来指派其假设功能性。根据本发明，检测到总共12种假想蛋白质，其与玉米中的耐旱性反应有关并且已在植物界的其他物种中报导过。
表11.在对照物和遗传修饰B73中分类为未知和/或假想蛋白质的基因以及抑制和诱导水平的指示
| 图例说明 | 基因 | B73对照物 | B73T1 | B73T4 |
| PV1 | 假想蛋白质 | 12.79 | -33.33 | -36.27 |
| PV2 | 假想蛋白质 | 0 | -100 | 77.27 |
| PV11 | 假想蛋白质 | -100 | 0 | 91.42 |
| PV12 | 假想蛋白质 | -3.82 | -91.07 | 25 |
| PV16 | 假想蛋白质 | -4.13 | 12.35 | -18.101 |
| PV20 | 假想蛋白质 | 0.61 | -50.9 | -16.1 |
| PV23 | 假想蛋白质 | -7 | 4.67 | 2.58 |
| PV29 | 假想蛋白质 | -43.63 | 0 | 91.93 |
| PV30 | 假想蛋白质 | -15.27 | -81.81 | 72.64 |
| L19 | 假想蛋白质 | 0 | 0 | 75 |
| L26 | 假想蛋白质 | 0 | 0 | 66.66 |
| R4 | 假想蛋白质 | -16.66 | 0 | 63.63 |
根据本发明，对与干旱反应相关联的基因的表达分析法表明了对照物和遗传修饰植物显示不同的反应。如所报导，海藻糖可能是多功能分子，首先作为渗透保护剂；因此，其向植物提供耐旱性；和其信号传导能力。关于后一种性质，海藻糖和其磷酸化型式可诱导差异表达，如由伊图拉亚加等人（2009）（Iturriaga et al.(2009)）报导。
根据本发明，对一些与耐旱性有关的基因的表达的鉴别展示了耐旱性的定量特征。因此，观测到若干基因受到诱导不仅可支撑海藻糖和/或磷酸海藻糖足以提供非生物应力耐受性的想法。在此方面，还相信根据本发明海藻糖积聚的影响可能诱导基因表达或抑制，同时产生非生物应力耐受性的生理状态以及光合速率增加。甚至在应力条件下仍能保持自养的能力是耐受性植物的性质，并且反映了植物仍具有足以进行CO2固定的水分状态。
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Claims (35)
1.一种从细胞群体中选择遗传转化植物细胞的方法，其不使用编码所述细胞对抗生素、除草剂和/或毒性物质的抗性的选择基因，其中所述方法包含：
a）将遗传转化细胞的至少一个相关核苷酸序列和至少一个核苷酸选择序列引入细胞或细胞群体中，其中所述核苷酸选择序列包含编码内源性海藻糖酶的抑制因子的区域；
b）使所述转化和非转化细胞群体与含有足以使其存活的渗透压调节剂的培养基接触；和
c）根据优于未转化细胞的竞争优势来选择至少一部分遗传转化细胞，其中所述遗传转化细胞携带编码海藻糖酶抑制因子的核苷酸序列，所述核苷酸序列产生与从编码内源性海藻糖酶的DNA序列产生的RNA互补的RNA，其中由引入的所述核苷酸序列产生的所述RNA赋予在具有所述渗透压调节剂的所述培养基中的竞争优势。
2.根据权利要求2所述的方法，其中所述选择核苷酸序列是编码海藻糖酶的核苷酸序列；所述序列产生与从编码内源性海藻糖酶的DNA序列产生的RNA互补的RNA。
3.根据权利要求1和2所述的方法，其中所述引入的选择核苷酸序列是紫花苜蓿海藻糖酶（紫苜蓿（Medicago sativa））的基因或MSTRE基因的一个区域和/或编码玉米海藻糖酶的序列。
4.根据前述权利要求所述的方法，其中更确切地，所述引入的选择核苷酸序列与紫花苜蓿海藻糖酶的基因或MSTRE1基因的一个区域互补。
5.根据前述权利要求所述的方法，其中从所述选择核苷酸序列转录的所述RNA与从编码内源性海藻糖酶的DNA序列产生的所述RNA完全或部分互补。
6.根据权利要求5所述的方法，其中对所述引入的选择核苷酸序列进行修饰或截短。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择核苷酸序列编码蟑螂（美洲大蠊（Periplaneta americana））的85kD蛋白质、与维利霉素A（validamyzin A）、海藻唑啉（trehazoline）、海藻斯汀（trehalostine）、卡斯利辛（casteligine）、苏达斯汀（sudatestrine）或任何海藻糖酶抑制因子或其任何修饰物的代谢有关的酶，其中所述引入的选择核苷酸序列赋予所述细胞竞争优势。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含从聚乙二醇8000（PEG8000）、甘露糖醇、山梨糖醇、NaCl或任何其他渗透压调节剂中选出的渗透压调节剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述培养基包含聚乙二醇8000（PEG8000）作为渗透压调节剂。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述培养基包含4%浓度的PEG8000。
11.根据前述权利要求所述的方法，其中所述遗传转化细胞尤其是从例如西红柿（Lycopersicum esculentum L.）、芒果、桃、苹果、梨子、香蕉、甜瓜、向日葵、烟草、甘蔗（Saccharum officinarum L.）、小麦（Triticum aestivum L.）、大豆（Glycine max L.）、大麦、玉米（Zea mays L.）、棉花、马铃薯（Solanum tuberosum L.）、胡萝卜、莴苣、南瓜、洋葱等植物中选出。
12.根据权利要求1到11所述的方法，其中所述选择细胞是遗传转化植物细胞，其具有在含有渗透压调节剂的培养基中生长的所述竞争优势，使得所述细胞可在干旱条件下生长和存活。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞或细胞群体也使用相关核苷酸序列来转化。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述引入的相关核苷酸序列可以是编码海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）、海藻糖-6-磷酸酶（TPP）的序列和/或编码对毒素、抗生素、除草剂或其他生物技术相关产品的抗性的核苷酸序列。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞转化是使用用于获得遗传转化细胞的分子构筑体或载体进行，所述分子构筑体或载体含有与至少一个相关核苷酸序列和至少一个选择核苷酸序列可操作地连接的植物启动子，其中所述选择核苷酸包含编码内源性海藻糖酶抑制因子的区域。
16.根据权利要求1和15所述的方法，其中所述分子构筑体或载体是用于获得遗传转化细胞的选择核苷酸序列，其中所述选择核苷酸序列包含编码内源性海藻糖酶抑制因子的区域；其一个或两个拷贝，呈抑制内源性海藻糖酶活性的阵列形式，并且其中所述构筑体可包括额外元件，如所述引入的序列的所述拷贝之间的连接子序列，所述引入的序列与内源性海藻糖酶的所述DNA序列互补，例如干扰RNA（RNAi）。
17.一种遗传转化植物细胞，其包含含有与至少一个相关核苷酸序列和至少一个选择核苷酸序列连接的可操作植物启动子的用于获得遗传转化细胞的分子构筑体或载体，其中所述选择核苷酸序列包含编码内源性海藻糖酶抑制因子的区域。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述选择核苷酸序列包含编码海藻糖酶抑制因子的区域，其是紫花苜蓿的海藻糖酶基因的序列和/或编码内源性玉米海藻糖酶的DNA序列，并且其中所述引入的核苷酸序列产生与由编码所述内源性海藻糖酶的DNA序列产生的RNA互补的RNA。
19.根据权利要求17所述的细胞，其中所述选择核苷酸序列包含编码海藻糖酶抑制因子的区域，优选紫花苜蓿MSTRE1海藻糖酶的基因序列。
20.根据权利要求19所述的细胞，其中对所述引入的选择核苷酸序列进行修饰或截短，但产生与由编码所述内源性海藻糖酶的DNA序列产生的所述RNA完全或部分互补的RNA，赋予了所述转化细胞在含有渗透压调节剂的所述培养基中的竞争优势。
21.根据权利要求18所述的细胞，其中所述选择核苷酸序列是所述紫花苜蓿MSTRE海藻糖酶的基因或基因区域和/或所述来自玉米的海藻糖酶基因的核苷酸序列或区域。
22.根据权利要求17所述的细胞，其中所述选择核苷酸序列编码蟑螂（美洲大蠊）的85kD蛋白质或与维利霉素A、海藻唑啉、海藻糖抑素（trehalostatine）、卡斯利辛或任何海藻糖酶抑制因子或其任何修饰物的代谢有关的酶，其中所述引入的选择核苷酸序列赋予所述细胞竞争优势。
23.一种从根据权利要求17到21所述的遗传转化植物细胞再生的植物，其包含含有与至少一个相关核苷酸序列和至少一个选择核苷酸序列连接的可操作植物启动子的用于遗传转化细胞的分子构筑体或载体，其中所述选择核苷酸序列包含编码内源性海藻糖酶抑制因子的区域。
24.根据权利要求22所述的植物，其中所述植物具有在含有渗透压调节剂的培养基中生长的竞争优势，因此所述植物可以在干旱和/或寒冷条件下生长和存活。
25.一种植物的种子，所述植物是根据权利要求22和23所述的植物。
26.一种植物的子代，所述植物是根据权利要求22和23所述的植物。
27.一种分子载体或构筑体，其用于遗传转化一或多种植物细胞，其包含与至少一个编码海藻糖酶抑制因子的选择核苷酸序列和/或至少一个相关核苷酸序列连接的可操作植物启动子。
28.根据权利要求27所述的载体，其中所述选择核苷酸序列包含编码海藻糖酶抑制因子的区域；此序列可从紫花苜蓿MSTRE海藻糖酶的基因序列和/或例如编码玉米海藻糖酶的核苷酸序列等编码内源性海藻糖酶的DNA序列中选出，并且其中所述引入的选择核苷酸序列产生与由编码所述内源性海藻糖酶的DNA序列产生的RNA至少部分互补的RNA。
29.根据权利要求28所述的载体，其中所述选择核苷酸序列包含编码海藻糖酶抑制因子的区域，其与序列MSTRE1同源。
30.根据权利要求28所述的载体，其中对所述引入的选择核苷酸序列进行修饰或截短，但产生与由编码所述内源性海藻糖酶的DNA序列产生的所述RNA完全或部分互补的RNA。
31.根据权利要求27所述的载体，其中所述选择核苷酸序列是从包含以下物质的群组中选出：编码蟑螂（美洲大蠊）的85kD蛋白质或与维利霉素A、海藻唑啉、海藻糖抑素、卡斯利辛或任何海藻糖酶抑制因子或其任何修饰物的代谢有关的酶的核苷酸序列。
32.根据权利要求27所述的载体，其进一步包含编码与对毒素、抗生素或除草剂的抗性有关的基因的核苷酸序列。
33.根据权利要求27到31所述的载体，其适用于植物细胞转化以从转化和未转化细胞群体中选择遗传转化细胞，以及产生遗传转化植物。
34.一种聚乙二醇8000（PEG8000）的用途，其是用于制备渗透压调节培养基以从转化和未转化细胞群体中选择遗传转化植物细胞，其中所述转化细胞的基因组包含至少一个选择核苷酸序列，所述至少一个选择核苷酸序列包含编码海藻糖酶抑制因子的区域。
35.根据权利要求33所述的用途，其中所述聚乙二醇8000的浓度是4%。
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