JP4864701B2 - 植物におけるインスリンの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、植物遺伝子操作方法およびインスリンの製造に関する。より具体的には、本発明は、植物の種子におけるインスリンの製造方法に関する。
インスリンは、ヒトを含む哺乳動物および他の脊椎動物において血糖恒常性を維持するために必要とされる重要なペプチドホルモンである。健常個体では、血糖レベルの増加が膵臓のβ細胞を刺激してインスリンを分泌させる。次いで、インスリンポリペプチドは、筋肉、肝臓、および脂肪組織に存在する特異的受容体に結合し、これらの標的組織によるグルコース取り込みの増加、代謝の増加、肝臓のグルコース産生の減少を引き起こす。これらの応答の累積効果は、血糖濃度を一定レベルに保つ役目を果たす。
本発明は、植物におけるインスリン生産のための改善法に関する。特に、本発明は、種子におけるインスリンの生産方法に関する。
(a) 機能的に連結された成分として、5'から3'方向の転写において、
(i) 植物種子細胞における発現を調節することができる核酸配列、および
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸構築物を提供する段階;
(b) 植物細胞にキメラ核酸構築物を導入する段階;ならびに
(c) 植物細胞を、インスリンを発現する種子を生じることができる成熟植物に成長させる段階。
(a) 機能的に連結された成分として、5'から3'方向の転写において、
(i) 植物種子細胞における発現を調節することができる核酸配列、
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列、および
(iii) 膜に囲まれた細胞内区画中にインスリンポリペプチドを保持することができるポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸構築物を提供する段階;
(b) 植物細胞にキメラ核酸構築物を導入する段階;ならびに
(c) 植物細胞を、インスリンを発現する種子を生じることができる成熟植物に成長させる段階。
(a) 機能的に連結された成分として、5'から3'方向の転写において、
(i) 植物種子細胞における発現を調節することができる核酸配列、および
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列、
(iii) ERまたはER由来貯蔵小胞中にインスリンポリペプチドを保持することができるポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸構築物を提供する段階;
(b) 植物細胞にキメラ核酸構築物を導入する段階;ならびに
(c) 植物細胞を、インスリンを発現する種子を生じることができる成熟植物に成長させる段階。
(a) 機能的に連結された成分として、5'から3'方向の転写において、
(i) 植物種子細胞における発現を調節することができる核酸配列、および
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸構築物を提供する段階;
(b) 植物細胞にキメラ核酸構築物を導入する段階;
(c) 植物細胞を、種子を生じることができる成熟植物に成長させる段階;ならびに
(d) インスリンを含む種子を植物から採取する段階。
(a) 以下に機能的に連結された、植物種子細胞における発現を調節することができる第1核酸配列;
(b) インスリンポリペプチドをコードする第2核酸配列。
(a) 以下に機能的に連結された、植物種子細胞における発現を調節することができる第1核酸配列;
(b) インスリンポリペプチドをコードする第2核酸配列。
本明細書において上記したように、本発明は、トランスジェニック植物におけるインスリン生産のための改良された方法に関する。本発明者らは驚いたことに、植物の種子中でインスリンを組換え生産することによって、全細胞タンパク質の0.1%を超えるインスリン蓄積レベルが植物において達成され得ることを見い出した。この発現レベルはこれまでに達成されていたレベルの少なくとも10倍高いレベルであり、これによって生存植物におけるインスリンの商業生産が提供される。インスリンは所蔵種子からの抽出に際してその活性を保持するため、種子での生産によって、原料としてのインスリンの貯蔵および輸送の柔軟性が提供される。さらに、植物種子中に存在する水分含量は比較的低いため、抽出に供される必要のあるバイオマス量が限定される。
(a) 機能的に連結された成分として、5'から3'方向の転写において、
(i) 植物種子細胞における発現を調節することができる核酸配列、および
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸構築物を提供する段階;
(b) 植物細胞にキメラ核酸構築物を導入する段階;ならびに
(c) 植物細胞を、インスリンを発現する種子を生じることができる成熟植物に成長させる段階。
(a) 機能的に連結された成分として、5'から3'方向の転写において、
(i) 植物種子細胞における発現を調節することができる核酸配列、および
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列
(iii) 膜に囲まれた細胞内区画中にインスリンポリペプチドを保持することができるポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸構築物を提供する段階;
(b) 植物細胞にキメラ核酸構築物を導入する段階;ならびに
(c) 植物細胞を、インスリンを発現する種子を生じることができる成熟植物に成長させる段階。
別に定義する場合を除き、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味をもつ。許容される場合、本開示において言及するすべての特許、出願、特許出願、および他の刊行物、ならびにGenBank、SwissPro、および他のデータベースによる核酸およびポリペプチド配列は、その全体が参照により組み入れられる。
本明細書に提供する方法および組成物に従って使用され得るインスリンをコードする核酸配列は、任意のプロインスリンおよびプレプロインスリンを含む、インスリンポリペプチドをコードする任意の核酸配列であってよい。
B(1-29/30)-X1-X2-X3-Y1-A(1-21)
を含み、
式中、
X1は任意のアミノ酸配列であり;
X2は任意のアミノ酸配列であり;
X3はLysまたはArgであり;
Y1はペプチド結合または1〜17アミノ酸残基であり;
B(1-29/30)は、アミノ酸残基1〜29または1〜30を含むヒトインスリンB鎖のB鎖であり;および
A(1-21)は、アミノ酸残基1〜21を含むヒトインスリンA鎖のA鎖である。
B(1-27)-X2-X3-X1-Y-A(1-21)
によって表され得る分子を含み、
式中、
X1は、少なくとも1つの芳香族アミノ酸残基を含む1〜8アミノ酸残基のペプチドであり;
X2は、B鎖の28位においてPro、Asp、Lys、またはIleの1つであり;
X3は、B鎖の29位においてPro、Lys、Ala、Arg、またはPro-Thrの1つであり;
Y1はLysまたはArgであり;
B(1-27)は、アミノ酸残基1〜27を含むヒトインスリンB鎖のB鎖であり;および
A(1-21)は、アミノ酸残基1〜21を含むヒトインスリンA鎖のA鎖である。
(i) 植物種子細胞における発現を調節することができる核酸配列;および
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列。
本発明に従って、キメラ核酸配列を植物細胞に導入し、その細胞をインスリンポリペプチドを発現する種子を生じることができる成熟植物に成長させる。
(a) 機能的に連結された成分として、5'から3'方向の転写において、
(i) 植物種子細胞における発現を調節することができる核酸配列、および
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸構築物を提供する段階;
(b) 植物細胞にキメラ核酸構築物を導入する段階;
(c) 植物細胞を、種子を生じることができる成熟植物に成長させる段階;ならびに
(d) インスリンを含む種子を植物から採取する段階。
(a) 以下に機能的に連結された、植物種子細胞における発現を調節することができる第1核酸配列;
(b) インスリンポリペプチドをコードする第2核酸配列。
(a) 以下に機能的に連結された、植物種子細胞における発現を調節することができる第1核酸配列;
(b) インスリンポリペプチドをコードする第2核酸配列。
植物種子が得られたならば、当技術分野で周知である任意のタンパク質精製法を用いて、種子からインスリンタンパク質を精製することができる。したがって、本発明に準じて、植物種子からインスリンを精製する方法であって、以下の段階を含む方法を提供する:
(a) 機能的に連結された成分として、5'から3'方向の転写において、
(i) 植物種子細胞における発現を調節することができる核酸配列、および
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸構築物を提供する段階;
(b) 植物細胞にキメラ核酸構築物を導入する段階;
(c) 植物細胞を、インスリンを発現する種子を生じることができる成熟植物に成長させる段階;
(d) インスリンを発現する種子を採取する段階;ならびに
(e) 種子からインスリンを精製する段階。
以下の実施例は説明のために提供されるものであって、限定するために提供されるものではない。
トリプシン切断可能なプロペプチドを有するミニインスリン(MI)融合タンパク質として発現されるインスリンタンパク質の調製
pSBS4404: PRS-D9scFv-Klip27-MI-KDEL融合タンパク質の構築
研究した融合タンパク質の1つは、同時翻訳様式で、発現をERに標的するためのシグナルペプチドとして機能する、タバコ病原性関連配列(PRS)(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221)から開始した。そのすぐ下流は、D9scFvと表記される、アラビドプシス・サリアナの18 kDaオレオシンに対する種特異的親和性を有する一本鎖Fv抗体(scFv)をコードする配列であり、その後に、酵母のTA57プロペプチドに由来するトリプシン切断可能なプロペプチド(KLIP27)(Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121)が続いた。この後に、Kjeldsen et al. (2001)によって記載されるミニインスリン(MI)が続き、さらにポリペプチドのC末端にはKDEL ER保持シグナルが付加された。
を用いてD9scFV cDNAクローン(Sean Hemmingsen lab、未発表)をPCRすることにより、SphI-D9scFv-XhoI、SwaI、HindIII挿入配列を作製した。次いで、pSBS4011のSphI/HindIII部位においてこの断片を連結することにより、プラスミドpSBS4055を得た。
をそれらの相補的な20ヌクレオチド重複部位においてアニーリングし、伸長させてKlip27-MI融合物の5'末端を形成し、
を用いて同様のことを行い3'末端を形成した。この2つの部分をBsu36Iで制限消化した後に連結し、完全なKlip27-MIコード配列を生じた。
を用いてこの遺伝子融合物をPCRすることにより、5' XhoI制限エンドヌクレアーゼ切断部位ならびに3' KDEL DNA配列およびHindIII切断部位を付加し、次いで、XhoI/HindIIIで切断したpSBS4055に連結した。結果として、プラスミドpSBS4404(PRS-D9scFv-Klip27-MI-KDEL融合タンパク質をコードするDNA配列が、バイナリーベクター中でファゼオリンプロモーター/ターミネーターの発現調節下に位置する)が得られた。ファゼオリンプロモーターは、種子の発生過程において、導入遺伝子の時間特異的および組織特異的発現を調節する。4404インスリン融合タンパク質(PRS-D9ScFv-Klip27-MI-KDEL)の完全な核酸配列(配列番号:1)およびアミノ酸配列(配列番号:2)を図1に示す。
研究した2つめの融合タンパク質はアラビドプシス・サリアナの18 kDaオレオシンで始まり、その後にインフレームのキモシン切断可能なプロペプチド(Klip8)−配列番号:175が続いた。そのすぐ下流は、上記したようなTA57プロペプチドに由来するトリプシン切断可能なプロペプチド(Klip27)(Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121)であった。これが、上記のミニインスリン(MI)(Kjeldsen et al., 2001)に融合されていた。この融合タンパク質の発現は、胚の発生過程において形成される新生油体に標的された。
をそれらの相補的な20ヌクレオチド重複部位においてアニーリングし、伸長させてKlip27-MI融合物の5'末端を形成し、
を用いて同様のことを行い3'末端を形成した。この2つの部分をBsu36Iで制限消化した後に連結し、完全なKlip27-MIコード配列を生じた。
を用いてこの遺伝子融合物をPCRすることにより、5'XhoI制限エンドヌクレアーゼ切断部位および3'HindIII切断部位をそれぞれ付加し、次いで、XhoI/HindIIIで切断したpSBS4010に連結した。結果として、プラスミドpSBS4405(オレオシン-Klip8-Klip27-MI融合タンパク質をコードするDNA配列が、バイナリーベクター中でファゼオリンプロモーター/ターミネーターの発現調節下に位置する)が得られた。ファゼオリンプロモーターは、種子の発生過程において、導入遺伝子の時間特異的および組織特異的発現を調節する。4405インスリン融合タンパク質(OLEO-Klip8- Klip27-MI)の完全な核酸配列(配列番号:3)およびアミノ酸配列(配列番号:4)を図2に示す。
研究した別の融合タンパク質は、同時翻訳様式で、発現をERに標的するためのシグナルペプチドとして機能する、タバコ病原性関連配列(PRS)(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221)から開始した。そのすぐ下流はKljeldsen et al. (2001)によって記載されているミニインスリン(MI)をコードする配列であるが、ただし、ヒトインスリンのB(1-29)鎖とA(1-21)鎖との間のミニCプロペプチド領域(AAK−配列番号:146)が介在B30スレオチン-四塩基性部位(B30T-RRKR)(配列番号:149)配列で置換されていた。このすぐ後には2つめの四塩基性リンカーをコードする配列が続き、次いで、D9scFvと表記される、アラビドプシス・サリアナの18 kDaオレオシンに対する種特異的親和性を有する一本鎖Fv抗体(scFv)が続いた。ポリペプチドのC末端には、KDEL ER保持シグナルが付加されていた。
をそれらの相補的な20ヌクレオチド重複部位においてアニーリングし、伸長させてKlip27-MI融合物の5'末端を形成し、
を用いて同様のことを行い3'末端を形成した。この2つの部分をBsu36Iで制限消化した後に連結し、完全なKlip27-MIコード配列を生じた。
を用いてこの遺伝子融合物をPCRすることにより、5' SphI制限エンドヌクレアーゼ切断部位ならびに3' KDEL DNA配列およびHindIII切断部位を付加し、次いで、SphI/HindIIIで切断したpSBS4011に連結した。結果として、プラスミドpSBS4402(PRS-Klip27-MI-KDEL融合タンパク質をコードするDNA配列が、バイナリーベクター中でファゼオリンプロモーター/ターミネーターの発現調節下に位置する)が得られた。ファゼオリンプロモーターは、種子の発生過程において、導入遺伝子の時間特異的および組織特異的発現を調節する。この植物発現ベクター、pSBS4402を、インスリンのB鎖とA鎖の間およびMIとD9 Scfvの間に四塩基性部位を導入するための鋳型とした。
を用いてPCRすることにより、ヒトインスリンの確証的なB(1-29)鎖とA(1-21)鎖との間に介在四塩基性(B30T-RRKR)部位を配置した。pSBS3400を鋳型として使用し、得られた124 bp断片を
と組み合わせて用いた。pSBS3400は、HindIII制限部位を有するD9 scFv-KDEL断片を含むプラスミドであることに留意されたい。このPCR反応により、124 bp SphI-MI断片に四塩基性(RRKR)-D9 Scfv-KDEL-HindIIIが挿入された955 bp産物が作製された。次いで、この955 bp断片をpGEM-T(Progmega)に連結してサブクローニングし、pSBS3403を得た。あらかじめ切断した(SphI/HindIII)pSBS4402にSphI-MI(B30T-RRKR改変Cプロペプチドを有する)-RRKR-D9 Scfv-KDEL-HindIII断片全体を挿入し、pSBS4414を作製した。4414インスリン融合タンパク質(PRS-MI-四塩基性リンカー-D9Scfv-KDEL)の完全な核酸配列(配列番号:5)およびアミノ酸配列(配列番号:6)を図3に示す。
配列解析により融合タンパク質をコードするcDNAの完全性を確認した後、プラスミドpSBS4404、pSBS4405、およびpSBS4414を大腸菌株DH5αに形質転換し、高レベルの発現を可能にした。単離されたプラスミドDNA(100 ng)を、DH5αコンピテント細胞100μlと共に氷上で20分間混合した。次に、細胞に42℃で45秒間熱ショックを与え、氷に2分間戻した。次いで、SOC培地1 mlを添加し、細胞を225 rpmのエンビロ(enviro)シェーカー上で37℃にて1時間インキュベートし、その後、形質転換細胞をLB-スペクチノマイシンプレート(10 g/Lトリプトン、5 g/L酵母エキス、5 g/L NaCl、15 g/Lアガー)上にプレーティングして37℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを用いて、5 ml LB-スペクチノマイシンブロスに接種した。これらの培養物を37℃で一晩培養した。QIAprep(登録商標)Spin Miniprep Kit(Qiagen)に従って、一晩培養物1 mlから組換えプラスミドを単離した。次いで、単離されたプラスミドを用いて、エレクトロポレーション(25μF、2.5 kV、200Ω)によりコンピテントアグロバクテリウム株EH101(Hood et al., 1986; J. Bacteriol. 144: 732-743)を形質転換した。組換えアグロバクテリウムをAB-スペクチノマイシン/カナマイシン(20x AB塩、2 Mグルコース、0.25 mg/ml FeSo4・7H2O、1 M MgSo4、1 M CaCl2)上にプレーティングし、単一コロニーを用いてAB-スペクチノマイシン/カナマイシンブロス5 mlに接種した。これらの培養物を28℃で一晩培養した。次いで、組換えアグロバクテリウムを用いて、花浸漬法(Clough et al., 1998, Plant J., 16:735-743)によりアラビドプシス・サリアナ植物を形質転換した。すべての実験に、アラビドプシス・サリアナcv. (C24)を用いる。4インチポット中の土壌混合物(Redi-earth2/3およびパーライト1/3をpH = 6.7に調整)またはLehle Seedsによって供給されるアラビドプシス土壌混合物(パーライト、バーミキュライト、ピート、テラグリーンをpH = 5.5に調整)の表面上に、種子をまく。直径約2.5 cmの6〜8枚葉のロゼッタ期になるまで、実生を生育させる。冷却処理のためポットを4℃のドーム内に4日間置き、その後、約150μEの一定光および60〜70%相対湿度を有する24℃の生育室に移す。2〜3日おきに植物に水をやり、週に1度、1%のPeters 20-19-18を施肥する。各ポットは5〜6株の植物を含む。植物が約2 cmの高さに届いたならば、第2薹(bolt)および第3薹の成長を促進するために、第1薹を切断する。第1薹を切断してから4〜5日後に、植物をアグロバクテリウムで感染させることができる。アラビドプシス植物のポットを逆さにし、アラビドプシス植物を、関心対象の植物形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム一晩培養物の再懸濁液500 mlで20秒間感染させる。アグロバクテリウム培養物が5%スクロースおよび0.05%の界面活性剤Silwet L-77(Lehle Seeds)を含むことが重要である。次いで、より高い湿度を維持するために、ポットを透明なプラスチックドームで24時間覆う。植物が成熟するまで生育させ、非形質転換種子および形質転換種子の混合物を採取する。トランスジェニック系統を選択するために、70%エタノールで素早く洗浄し、次いで20%の市販の漂白剤中に15分間浸漬することにより推定形質転換種子を滅菌し、その後ddH2Oで少なくとも4回すすぐ。約1000個の滅菌種子を0.6%融解トップアガーと混合し、0.3%スクロースおよび80μMの除草剤フォスフィノスリシン(PPT)DLを含む半強度のMSプレート(Murashige and Skoog, 1962, Physiologia Plantarum 15: 473-497)上に均等に広げる。次に、24℃での8時間暗および16時間明という光管理形態の生育室中に、プレートを置く。7〜10日後、推定トランスジェニック実生は緑色をして生育しているのに対し、非形質転換実生は脱色されている。根が定着した後、推定形質転換実生を個々にポットに移植し(個々の植物には3日おきに水をやり、7日おきに1% Peters 20-19-18を施肥する)、成熟するまで生育させる。感受性の高い実生を保護するため、ポットを透明なプラスチックドームで覆う。7日後、散乱による種子の損失を防ぐために、Lehle Seedsによる種子採取システムで実生を覆う。これらのトランスジェニック植物による種子を個々に採取し、解析に備える。
アラビドプシス・サリアナにおけるインスリンの発現レベル
2つめの実施例では、トランスジェニックアラビドプシス・サリアナ成熟種子において、融合タンパク質D9scfv-KLIP27-MI-KDEL(4404)、OLEO-KLIP8-KLIP27-MI(4405)、およびPRS-MI-RRKR-D9Scfv-0KDEL(4414)の発現レベルを決定した。導入遺伝子産物は、成熟種子の細胞抽出物中に存在することが示された。約40個のトランスジェニックアラビドプシス・サリアナ種子を、50μlの50mM Tris-HCl pH8.0中で乳鉢および乳棒を用いて粉砕した。次いで、還元SDS-PAGE試料バッファー(6x SDS試料バッファー、0.35 M Tris-HCl pH 6.8、30%グリセロール、10% SDS、0.012%ブロモフェノールブルー、5% β-メルカプトエタノール)をスラリーに添加し、短時間ボルテックスすることにより混合した。次に、試料を短時間遠心し、99℃に10分間置いた。氷上で2分間冷却した後、試料を短時間遠心した。還元条件下で試料を泳動した(10μl−約7個の種子に相当する)。
pSBS4404の切断およびHPLC精製
油体からの溶出
3つめの実施例では、トランスジェニック種子1 gを12 ml抽出緩衝液(0.4 Mスクロース、0.5 M NaCl、50 mM Tris-HCl pH8.0)中でホモジナイズし、10 000gで10分間遠心し、脂肪パッドを取り除き1 mlの20 mM Na2HPO4、0.5 M NaCl中に入れ、上記の通りに再度遠心した。これを2回繰り返した後、750μl 20 mM Na2HPO4中で脂肪パッドを2回洗浄および遠心した。最終的な脂肪パッドを750μl 20 mMギ酸 pH 4.1中で5回洗浄し、各洗浄間に10 000 gでの遠心段階を行うことにより、4404融合タンパク質を油体から下層に溶出した。回収した溶出画分(下層)をプールし、2 N NaOHでpH 8.0に中和した、次いで、溶液全体を-80℃に置いて凍結し、一晩凍結乾燥して融合タンパク質を濃縮した。凍結乾燥試料を500μl 50 mM Tris-HCl pH 8.0中に再懸濁した。次に、再懸濁した4404融合タンパク質をNAP-5カラム(Amersham Pharmacia Biotech Ab、スウェーデン、ウプサラ)で脱塩し、緩衝液(50 mM Tris-HCl-pH8.0)で再交換した。次いで、脱塩した画分を再度凍結し、一晩凍結乾燥して濃縮した。最終的な濃縮試料を、最終量105μlの再蒸留H2Oに再懸濁した。溶出結果を図6に示す。図6は、溶出前の油体調製物(-OB)、ギ酸で溶出した後のOB調製物(-OB')、および濃縮溶出物質(-E)のクーマシー染色SDS-PAGE(15%)解析である。矢印は、移動する融合ポリペプチドの位置を示す。野生型対照は本質的に、溶出後に主要なタンパク質を含まないが、濃縮4404物質は、融合タンパク質、いくつかの切断産物(おそらく加水分解された融合タンパク質)、およびおそらく同時に溶出されたいくつかのアルブミンを含む。
濃縮試料を再蒸留水105μlに再懸濁し、BCAタンパク質アッセイにより、製造業者(Pierce、米国、イリノイ州、ロックフォード)に従ってタンパク質含量を評価した。次いで、トリプシンにより試料を切断した(50 mM Tris-HCl pH 8.0中で1:300トリプシン:全タンパク質比、氷上で90分間)。10倍モル過剰のTLCK(N-p-トシル-L-リジンクロロメチルケトン)により反応を停止した。次に、全反応物を0.2μmフィルター(0.2μm Supof(登録商標)膜を備えたAerodisc(登録商標)13 mmシリンジフィルター、Pall Corporation、米国、ミシガン州、アナーバー)でろ過し、C18カラム(Zorbax 300SB-C18、Agilent Technologies、ドイツ、ヴァルドブロン)を用いて逆相(RP)-HPLCにより解析した。試料をカラムに供し、0.1% (v/v) TFA中の5〜50% (v/v)アセトニトリルの19分の直線勾配を用いて、1.0 ml/分で溶出した。この解析によって得られたクロマトグラフを図7に示す。追跡により、カラム上でヒトインスリン標準物質とほぼ同じ性質を有する、4404融合タンパク質からのトリプシン切断産物が示される。(それぞれ17.011分および17.179分の保持時間)。17.0〜17.5分からHPLC画分を回収し、Voyager-DE STR質量分析計(Applied Biosystems)を用いてPSD MALDI-TOF質量分析によりこれを解析した。NRC-Plant Biotechnology Institute、カナダ、サスカチュワン州、サスカトゥーン)によって提供されるBioAnalytical Spectroscopyサービスにより、MS解析を行った。上記のようにHPLCによって精製した切断4404産物の分解を、図8Aに示すヒトインスリン標準物質と比較して図8Bに示す。トリプシンによって切断された4404融合タンパク質の観察される質量は、6191.51 Daであった。ヒトインスリン標準物質(図8A)と切断4404産物(図8B)との間の相違は、切断産物のA鎖上に保持されたKDELシグナルを有するDes-B30インスリン(Des-B30インスリン-KDEL)に相当する。
pSBS4405の切断およびHPLC精製
油体調製
融合タンパク質(OLEO-KLIP8-KLIP27-MI)は、以下に記載する通りに油体調製を行うことによって部分精製し得る。トランスジェニック種子約1 gを12 ml抽出緩衝液(0.4 Mスクロース、0.5 M NaCl、50 mM Tris-HCl pH8.0)中でホモジナイズし、10 000gで10分間遠心し、脂肪パッドを取り除き1 mlの50 mM Tris-HCl pH 8.0、0.5 M NaCl中に入れ、上記の通りに再度遠心した。これを2回繰り返した後、750μl 50 mM Tris-HCl pH 8.0中で脂肪パッドを2回洗浄および遠心した。油体調製により、バックグラウンドタンパク質の大部分が除去される。4405構築物を発現するトランスジェニックアラビドプシス種子からの油体調製の典型的なタンパク質プロファイルを図9に示す。
2% SDS、50 mM Tris-HCl pH 8.0で10倍に希釈し、5分間煮沸し、10 000 gで3分間遠心して調製物の画分(5μl)を可溶化することにより、再懸濁した油体からの全タンパク質含量を評価した。その後、BCAタンパク質アッセイにより、製造業者(Pierce、米国、イリノイ州、ロックフォード)に従ってタンパク質含量を評価した。トリプシンにより試料を切断し(50 mM Tris-HCl pH 8.0中で1:300トリプシン:全タンパク質比、氷上で90分間)、融合タンパク質からKlip27-MI断片を遊離させた。10倍モル濃度過剰のTLCK(N-p-トシル-L-リジンクロロメチルケトン)により反応を停止した。試料を10 000 gで10分間遠心し、全反応物の下層を0.2μmフィルター(0.2μm Supof(登録商標)膜を備えたAerodisc(登録商標)13 mmシリンジフィルター、Pall Corporation、米国、ミシガン州、アナーバー)でろ過した。図9は、野生型(非組換え)種子と比較した、4405を発現する系統からの抽出可能な種子全体のタンパク質および油体(OB)調製タンパク質のクーマシー染色SDS-PAGE(15%)解析を示す。矢印は、移動する融合ポリペプチドの位置を示す。C18カラム(Zorbax 300SB-C18、Agilent Technologies、ドイツ、ヴァルドブロン)を用いた逆相(RP)-HPLCにより、下層をさらに解析した。試料をカラムに供し、0.1% (v/v) TFA中の5〜50% (v/v)アセトニトリルの19分の直線勾配を用いて、1.0 ml/分で溶出した。この解析によって得られたクロマトグラフを図10に示す。追跡により、カラム上でヒトインスリン標準物質とほぼ同じ性質を有する、4405融合タンパク質からのトリプシン切断産物が示される。(それぞれ17.220分および17.179分の保持時間)。17.0〜17.5分からHPLC画分を回収し、Voyager-DE STR質量分析計(Applied Biosystems)を用いてPSD MALDI-TOF質量分析によりこれを解析した。NRC-Plant Biotechnology Institute、カナダ、サスカチュワン州、サスカトゥーン)によって提供されるBioAnalytical Spectroscopyサービスにより、MS解析を行った。図11に示すように、トリプシンによって切断された4405融合タンパク質の観察される質量は、5706.30 Daであった。ヒトインスリン標準物質(図8A)と切断4405産物(図11)との間の相違は、Des-B30インスリン産物(Des-B30インスリン)に相当する。Des-B30インスリンは、4405融合物の正確なトリプシン成熟から予測される産物である。
AKTA explorer(FPLC)を用いたトリプシン切断MIの精製
4405から切断されたMIの精製物はまた、AKTA explorer(Amersham Pharmacia)での陰イオン交換(Mono Q FF 1 mL、Amersham Pharmacia)によって、スケールアップした切断反応物から部分精製した。切断反応は、30 gまで増量したトランスジェニック種子から上記の通りに調製した4405油体において実施した。切断反応物の下層を0.2μmフィルターでろ過するか、またはSavand Speed Vacで凍結乾燥することにより濃縮した。ろ過した試料反応物はカラムに直接供し得たが、濃縮試料は、カラムに効率的に結合させるために塩を除去する必要があった。濃縮試料は、切断物質をPD-10カラム(Amersham Pharmacia)に通すか、透析するか、または5 mS/cmもしくはそれ以下の塩濃度まで希釈することによって脱塩し得た。脱塩した試料は、20 mM Tris-HCl pH 6.5で平衡化した。0〜40% NaClのNaClによる段階勾配を用いて、流速1 ml/分で試料を分離した。検出は214 nmで行った(インスリン中の芳香族アミノ酸の含量が低いため、280 nmでの検出は比較的低い)。溶媒Aは20 mM Tris-HCl pH 6.5であり、溶媒Bは20 mM Tris-HCl pH 6.5、1.0 M NaClであった。7〜35 mS/cmというRocheインスリン標準物質と同じ伝導度で溶出される画分(1 ml)を回収した(図12を参照のこと)。図12は、ヒトインスリン標準物質(実線)と比較した、トリプシン切断4405油体調製物(点線)のクロマトグラムを示す。インスリンの存在は、HPLC、ELISA、またはウェスタン解析により、回収された画分中に確認された(データは示さず)。次いで、回収した試料を凍結乾燥により濃縮し、実施例6に記載するインスリンバイオアッセイに用いた。
インスリン耐性試験:C57BI/6(B6)雄マウスにおけるバイオアッセイ
ヒトインスリンと比較した、トリプシン切断4405による組換え植物由来(DesB30 IN)のインビボ効果を判定するために、このバイオアッセイを行った。B6マウスのグルコース血漿レベルを、インスリン標準物質、陰性対照、およびSBSインスリンを腹腔内注射する前および後に決定した。Jackson Laboratories(メイン州、バー・ハーバー)から、約2月齢の雄C57BI/6(B6)を15匹購入した。血漿グルコースレベルは、自動グルコメーター(OneTouch Ultra、Lifescan、Johnson and Johnson)で測定した。陽性対照は、HumulinR(登録商標)(Eli Lilly)およびRocheによる酵母組換えヒトインスリンを含んだ。生理食塩水をプラセボとした。組換え4405トリプシン切断油体調製物と同様に処理した、野生型(非組換え)アラビドプシス種子から精製されたトリプシン切断油体を表す陰性対照も含めた。
pSBS4401: PRS-Klip27-MI融合タンパク質の構築
研究した融合タンパク質の1つは、同時翻訳様式で、発現をERに標的するためのシグナルペプチドとして機能する、タバコ病原性関連配列(PRS)(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221)から開始した。そのすぐ下流は、酵母のTA57プロペプチドに由来するトリプシン切断可能なプロペプチド(KLIP27)(Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121)であった。この後に、Kjeldsen et al. (2001)によって記載されるミニインスリン(MI)が続いた。
をそれらの相補的な20ヌクレオチド重複部位においてアニーリングし、伸長させてKlip27-MI融合物の5'末端を形成し、
を用いて同様のことを行い3'末端を形成した。この2つの部分をBsu36Iで制限消化した後に連結し、完全なKlip27-MIコード配列を生じた。
を用いてこの遺伝子融合物をPCRすることにより、5' SphIおよび3' HindIII制限エンドヌクレアーゼ切断部位部位を付加し、次いで、SphI/HindIIIで切断したpSBS4011に連結した(上記の通り)。結果として、プラスミドpSBS4401(PRS-Klip27-MI融合タンパク質(配列番号:189)をコードするDNA配列(配列番号:188)が、バイナリーベクター中でファゼオリンプロモーター/ターミネーターの発現調節下に位置する)が得られた。ファゼオリンプロモーターは、種子の発生過程において、導入遺伝子の時間特異的および組織特異的発現を調節する。
配列解析により融合タンパク質をコードするcDNAの完全性を確認した後、プラスミドpSBS4401を大腸菌株DH5αに形質転換し、高レベルの発現を可能にした。単離されたプラスミドDNA(100 ng)を、DH5αコンピテント細胞100μlと共に氷上で20分間混合した。次に、細胞に42℃で45秒間熱ショックを与え、氷に2分間戻した。次いで、SOC培地1 mlを添加し、細胞を225 rpmのエンビロシェーカー上で37℃にて1時間インキュベートし、その後、形質転換細胞をLB-スペクチノマイシンプレート(10 g/Lトリプトン、5 g/L酵母エキス、5 g/L NaCl、15 g/Lアガー)上にプレーティングして37℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを用いて、5 ml LB-スペクチノマイシンブロスに接種した。これらの培養物を37℃で一晩培養した。QIAgen mini prepに従って、一晩培養物1 mlから組換えプラスミドを単離した。次いで、単離されたプラスミドを用いて、エレクトロポレーション(25μF、2.5 kV、200Ω)によりコンピテントアグロバクテリウム株EH101(Hood et al., 1986; J. Bacteriol. 144: 732-743)を形質転換した。組換えアグロバクテリウムをAB-スペクチノマイシン/カナマイシン(20x AB塩、2 Mグルコース、0.25 mg/ml FeSo4・7H2O、1 M MgSo4、1 M CaCl2)上にプレーティングし、単一コロニーを用いてAB-スペクチノマイシン/カナマイシンブロス5 mlに接種した。これらの培養物を28℃で一晩培養した。次いで、組換えアグロバクテリウムを用いて、実施例1に記載した通りに花浸漬法(Clough et al., 1998, Plant J., 16:735-743)により、アラビドプシス・サリアナ植物を形質転換した。
pSBS4409: OLEO-ヒトプロインスリン(OLEO-hPIN)融合タンパク質の構築
この融合タンパク質はアラビドプシス・サリアナの18 kDaオレオシンで始まり、その後にインフレームのヒトプロインスリン(hPIN)をコードする遺伝子が続いた。この融合タンパク質の発現は、胚の発生過程において形成される新生油体に標的された。
およびベクターの既存のプロインスリン領域のHindIII部位を含む
に対するプライマーを使用し、pfu DNAポリメラーゼを用いて標準的なPCRを行うことにより、ヒトプロインスリン(hPIN)を作製した。利用可能なSphI部位
から、pSBS4400ベクター内のアラビドプシスオレオシン遺伝子の3'末端
までに対するプライマーを使用し、pfu DNAポリメラーゼによって、第2の断片を増幅した。PCRの後、産物をアガロースゲルで分離し、267 bp(hPIN-HindIII)および360 bp(SphI-OLEO(3'末端))断片に相当するバンドをゲル抽出キット(Qiagen)を用いてゲル精製した。627 bp SphI-OLEO(3'末端)-hPIN-HindIII断片を増幅するため、プライマー1455(配列番号:192)およびプライマー1458(配列番号:193)を0.001μMの重複架橋PCRプライマー
と組み合わせて使用し、Taq DNAポリメラーゼを用いて2ラウンド目のPCR増幅(アニーリング温度58℃で2サイクル、その後アニーリング温度52℃で31サイクル)を行うことにより、2つの断片を融合させた。次いで、627 bp SphI-OLEO(3'末端)-hPIN-HindIII断片を、pGEMT Easy Vector System(商標)(Promega)のT/Aオーバーハングに連結し、これを用いてDH5α細菌を形質転換し、pSBS3409(pGEMT-SphI-OLEO(3'末端)-hPIN-HindIII)を得た。
配列解析により融合タンパク質をコードするcDNAの完全性を確認した後、プラスミドpSBS4409を大腸菌株DH5αに形質転換し、高レベルの発現を可能にした。単離されたプラスミドDNA(100 ng)を、DH5αコンピテント細胞100μlと共に氷上で20分間混合した。次に、細胞に42℃で45秒間熱ショックを与え、氷に2分間戻した。次いで、SOC培地1 mlを添加し、細胞を225 rpmのエンビロシェーカー上で37℃にて1時間インキュベートし、その後、形質転換細胞をLB-スペクチノマイシンプレート(10 g/Lトリプトン、5 g/L酵母エキス、5 g/L NaCl、15 g/Lアガー)上にプレーティングして37℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを用いて、5 ml LB-スペクチノマイシンブロスに接種した。これらの培養物を37℃で一晩増殖させた。QIAgen mini prepに従って、一晩培養物1 mlから組換えプラスミドを単離した。次いで、単離されたプラスミドを用いて、エレクトロポレーション(25μF、2.5 kV、200Ω)によりコンピテントアグロバクテリウム株EH101(Hood et al., 1986; J. Bacteriol. 144: 732-743)を形質転換した。組換えアグロバクテリウムをAB-スペクチノマイシン/カナマイシン(20x AB塩、2 Mグルコース、0.25 mg/ml FeSo4・7H2O、1 M MgSo4、1 M CaCl2)上にプレーティングし、単一コロニーを用いてAB-スペクチノマイシン/カナマイシンブロス5 mlに接種した。これらの培養物を28℃で一晩培養した。次いで、組換えアグロバクテリウムを用いて、実施例1に記載した通りに花浸漬法(Clough et al., 1998, Plant J., 16:735-743)により、アラビドプシス・サリアナ植物を形質転換した。
上記の実施例2に概説した手順を使用し、トランスジェニックアラビドプシス・サリアナ成熟種子において、融合タンパク質OLEO-hPIN(4409)の発現レベルを決定した。オレオシン-hPIN融合タンパク質の移動(黒矢印で示す)を非形質転換(wt)アラビドプシスと比較する、2つの代表的な系統(4409-6および4409-8)からの油体タンパク質のクーマシー染色ゲル(図14)。デンシトメトリーにより発現レベルを決定し、平均して全種子タンパク質の約0.10%であると測定した。このレベルは、全種子タンパク質の約0.04%を構成する、非形質転換種子(wt)における同じ分子量の内因性タンパク質の共移動に加えて計算された。
ベニバナの形質転換
この形質転換手順は、Orlilcowska T. K. et al.((1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40: 85-91)によって概説されている手順と同様であるが、S-317を形質転換する点および選択マーカーとしてフォスフィノスリシンを使用する点で変更および改変してある。損傷、破損しておらず、かつ病気にかかっていないS-317カリフォルニア品種のベニバナ種子を、0.1% HCl2中で12分間除洗し、その後、滅菌蒸留水で4〜5回すすぐ。1%スクロースおよび0.25% ゲルライト(Gelrite)を添加したMS培地(Murashige T. & Skoog F (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497)上で暗所にて、滅菌種子を発芽させる。凍結グリセロール保存液からのアグロバクテリウム培養物を、選択のための抗生物質を添加したAB最少液体培地5 ml中に起こして、28℃で48時間増殖させる。この培養物のアリコートを、形質転換のための選択剤を添加したルリア(Luria)ブロス5 ml中で一晩培養する。細菌細胞6〜8 mlをAB培地で2回洗浄し、最終細胞密度が0.4〜0.5(OD600)になるように調整する。
アマの形質転換プロトコール
この形質転換手順は、Dong J.およびMcHughen A.(Plant Cell Reports (1991)10:555-560)、Dong J. and McHughen A.(Plant Sciences (1993) 88:61-71)、ならびにMlynarova et al.(Plant Cell Reports (1994) 13: 282-285)によって概説されている手順と同様である。損傷、破損しておらず、かつ病気にかかっていないアマ種子を、70%エタノール溶液中で5〜7分間、その後Tween 20(100 ml当たり3〜4滴)を添加した50%漂白溶液中で25分間、連続撹拌しながら除洗した。滅菌蒸留水で種子を5〜7回すすぐ。マジェンタ(Magenta)容器中の2%スクロースおよび0.3%ゲルライト(登録商標)を添加したMS培地(Murashige T. & Skoog F (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497)上で、明所にて、除洗した種子を発芽させる。形質転換のため、選択用の適切な抗生物質を添加したABブロス中で、アグロバクテリウム培養物を一晩培養する。一晩培養した細胞6〜8 mlを2回洗浄し、ABブロス5 ml中に再懸濁する;この保存液2 mlを98 mlの誘導培地(3%スクロース、5μM 6-ベンジルアミノプリン(BA)、および0.25μM α-ナフタレン酢酸(NAA)を添加したBS基礎培地)に添加し、最終OD600が1.0になるように調整する。
配列番号:1および2はそれぞれ、プラスミドpSBS4404中のPRS-D9scFv-KLIP27-MI-KDEL融合タンパク質のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
Claims (20)
- 以下の段階を含む、植物種子においてインスリンを発現させる方法であって、インスリンポリペプチドが植物細胞内の小胞体(ER)に蓄積する、方法:
(a) 機能的に連結された成分として、5'から3'方向の転写において、
(i) 種子選択的プロモーターを含む核酸配列、
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列、
(iii) 小胞体(ER)にインスリンポリペプチドを保持することができるポリペプチドをコードする核酸配列
(iv)ポリペプチドの発現をERに標的するためのシグナルペプチドをコードする核酸配列、及び、
(v)油体タンパク質に対する特異性を有する一本鎖抗体をコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸構築物を提供する段階;
(b) 植物細胞にキメラ核酸構築物を導入する段階;ならびに
(c) 植物細胞を、インスリンを発現する種子を生じることができる成熟植物に成長させる段階。 - ER中にインスリンポリペプチドを保持するポリペプチドが、KDEL、HDEL、DDEL、ADEL、およびSDELからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- ER中にインスリンポリペプチドを保持するポリペプチドが、配列番号:150、配列番号:151、配列番号:152、配列番号:153、および配列番号:154からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- シグナルペプチドが、タバコ病原性関連タンパク質(PR-S)シグナル配列である、請求項1記載の方法。
- シグナル配列が配列番号:161である、請求項4記載の方法。
- キメラ核酸配列が、核ゲノム組み込み条件下で植物細胞に導入される、請求項1記載の方法。
- 種子選択的プロモーターがファゼオリンプロモーターである、請求項1記載の方法。
- インスリンをコードする核酸配列が、ヒトインスリン、ブタインスリン、およびウシインスリンからなる核酸配列の群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 核酸がコードするインスリンがミニインスリンである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- インスリンをコードする核酸配列が、植物のコドン使用に関して最適化される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、インスリンを含む植物種子を取得する方法であって、インスリンポリペプチドが植物細胞内の小胞体(ER)に蓄積する、方法:
(a) 機能的に連結された成分として、5'から3'方向の転写において、
(i) 種子選択的プロモーターを含む核酸配列、
(ii) インスリンポリペプチドをコードする核酸配列、
(iii) 小胞体(ER)にインスリンポリペプチドを保持することができるポリペプチドをコードする核酸配列
(iv)ポリペプチドの発現をERに標的するためのシグナルペプチドをコードする核酸配列、及び、
(v)油体タンパク質に対する特異性を有する一本鎖抗体をコードする核酸配列
を含む、キメラ核酸構築物を提供する段階;
(b) 植物細胞にキメラ核酸構築物を導入する段階;
(c) 植物細胞を、種子を生じることができる成熟植物に成長させる段階;ならびに
(d) インスリンを含む種子を植物から採取する段階。 - 種子中に存在する全可溶性タンパク質の0.1%から1.15%がインスリンである、請求項11記載の方法。
- 5'から3'方向の転写において、
(a) 以下に機能的に連結された、種子選択的プロモーターを含む第1核酸配列、
(b) インスリンポリペプチドをコードする第2核酸配列、
(c) 小胞体(ER)にインスリンポリペプチドを保持することができるポリペプチドをコードする核酸配列
(d) ポリペプチドの発現をERに標的するためのシグナルペプチドをコードする核酸配列、及び、
(e)油体タンパク質に対する特異性を有する一本鎖抗体をコードする核酸配列
を含むキメラ核酸配列を含む種子を生じることができる植物であって、該種子がインスリンを含有し、インスリンポリペプチドが植物細胞内の小胞体(ER)に蓄積する、植物。 - キメラ核酸配列が植物の核ゲノム中に組み込まれた、請求項13記載の植物。
- シロイヌナズナ、アマ、またはベニバナ植物である、請求項13または14記載の植物。
- 5'から3'方向の転写において、
(a) 以下に機能的に連結された、種子選択的プロモーターを含む第1核酸配列、
(b) インスリンポリペプチドをコードする第2核酸配列、
(c) 小胞体(ER)にインスリンポリペプチドを保持することができるポリペプチドをコードする核酸配列
(d) ポリペプチドの発現をERに標的するためのシグナルペプチドをコードする核酸配列、及び、
(e)油体タンパク質に対する特異性を有する一本鎖抗体をコードする核酸配列
を含むキメラ核酸配列を含む植物種子であって、該種子がインスリンを含有し、インスリンポリペプチドが植物細胞内の小胞体(ER)に蓄積する、種子。 - 種子中に存在する全可溶性タンパク質の0.1%から1.15%がインスリンである、請求項16記載の植物種子。
- 小胞体(ER)にインスリンポリペプチドを保持することができるポリペプチドをコードする核酸配列、ポリペプチドの発現をERに標的するためのシグナルペプチドをコードする核酸配列、及び、油体タンパク質に対する特異性を有する一本鎖抗体をコードする核酸配列
に連結された種子選択的プロモーターを含む核酸配列に連結された、インスリンをコードする核酸配列を含むDNA。 - 種子選択的プロモーターがファゼオリンプロモーターである、請求項18記載の核酸配列を含むDNA。
- 実質的に純粋なインスリンを取得するための、請求項1〜12のいずれか一項に従って製造される植物種子の使用。
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