MX2009002248A - Metodos para producir plantas transgenicas. - Google Patents

Metodos para producir plantas transgenicas.

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Brenda Lowe
Michael T Mann
David F Duncan
Anisha Akula
William L Petersen
Jyoti R Rout
David D Songstad
Joel B Wilks
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Abstract

Se demuestra un método para producir una planta de maíz transformada de manera estable en un solo recipiente; este método permite la automatización del procedimiento de transformación y reduce los costos del trabajo, material y ergonómicos asociados con los sistemas de cultivos de tejido de plantas tradicionales.

Description

METODOS PARA PRODUCIR PLANTAS TRANSGENICAS ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional de E.U.A. No. de Serie 60/841 ,519, presentada en Agosto 31 , del 2006, la descripción completa de la cual se incorpora en la presente como referencia.
CAMPO DE LA INVENCION La micropropagación de plantas se ha hecho de manera rutinaria en grandes lotes y de manera automática. En la micropropagación, usualmente un explante se toma y se coloca en un medio de regeneración que debe mantenerse fresco toda la duración del procedimiento de regeneración para producir una serie de plantas. Esto está en contraste con los procedimientos de transformación, que están diseñados para producir nuevos eventos transgénicos, y requieren la integración de ADN extraño en una célula de planta. La automatización del procedimiento de cultivo del tejido de la planta, particularmente el procedimiento de transformación, ha sido difícil. Los tejidos de planta pasan a través de diferentes etapas que requieren diferentes clases de medios de crecimiento y condiciones. Los procedimientos de transformación requieren múltiples pasos y múltiples medios. Por ejemplo, en la transformación mediada por Agrobacterium, el procedimiento empieza con el aislamiento de un explante que es regenerable y transformable. A continuación, el explante se inocula con Agrobacterium en un medio de inoculación. Después de la inoculación, el exceso de Agrobacterium se retira típicamente y el explante y el Agrobacterium se cocultivan juntos para permitir la transferencia del ADN. Después del cocultivo, la presencia del Agrobacterium es dañina para el cultivo del tejido de la planta (por ejemplo, causa contaminación indeseada durante los pasos posteriores de manejo y cultivo del tejido), de manera que, típicamente, los explantes se mueven a medio fresco que contiene antibióticos para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Este medio puede o no contener agentes de selección. Si no lo hace, entonces se llama un medio de retardo o de descanso. Los explantes pueden colocarse en el medio de retardo para permitir que crezcan durante algún tiempo antes de colocarse opcionalmente en el medio de selección. Otros protocolos colocan los explantes directamente en el medio de selección para la selección de los eventos transgénicos. Los regímenes de selección varían ampliamente, dependiendo del agente de selección y del sistema del explante. Con frecuencia, se utilizan múltiples pasos de selección y pueden ser necesarias cantidades variables del agente de selección en los diferentes pasos. Después de la selección de los eventos transgénicos, los eventos transgénicos vivientes se mueven a continuación al medio de regeneración para la regeneración de plántulas que pueden moverse entonces al suelo. Hasta el momento presente, los procedimientos de transformación han sido tardados y laboriosos, y no son capaces de hacerse a gran escala. Un procedimiento de transformación automatizado permitiría que se produjeran grandes números de plantas transgénicas con un trabajo, material y carga ergonómica reducidos. La presente invención ha superado las limitaciones previas en la transformación, proporcionando métodos y aparatos que realizan algunos o todos los pasos de la transformación, y opcionalmente algunos de los pasos de la regeneración, en un solo recipiente. Así, los métodos presentes superan las deficiencias de los protocolos de transformación actuales, eliminando los pasos tardados requeridos para subcultivar el tejido de la planta y cambiar el medio. Los métodos y aparatos son particularmente adecuados para la automatización de la transformación, la automatización de la regeneración y/o la producción a gran escala de células, tejidos y plantas transformados. La invención de la genómica ha permitido la identificación y aislamiento de un gran número de genes y ha requerido la necesidad de sistemas de producción de la transformación confiables y eficientes de alto rendimiento, para probar la utilidad de estos genes, transformándolos en cosechas económicamente importantes tales como el maíz. Los métodos de transformación maíz actuales requieren, al menos, cuatro pasos de transferencia desde el paso de seleccionar una célula transformada al paso de transferir las plantas transgénicas al suelo, requiriendo por lo tanto, costos de materiales más altos, por ejemplo, placas y medios de cultivo y costos de trabajo. Varias transferencias manuales de tejidos también elevan el riesgo de una lesión ergonómica debido a los movimientos repetidos.
Así, existe la necesidad en la técnica de la transformación del maíz para un sistema automatizado de altos rendimiento para la transformación, selección y regeneración de plantas, que pueda producir un gran número de plantas transgénicas para probar los genes y crear plantas útiles, mientras que disminuyen los costos del material y del trabajo. También existe la necesidad en la técnica de métodos que puedan disminuir el riesgo de lesiones ergonómicas, haciendo al lugar de trabajo más seguro. En la presente, los inventores proporcionan un método de transformación del maíz para seleccionar y regenerar plantas de maíz transformadas, adecuadas para un sistema de automatización del ato rendimiento. El método emplea una matriz de soporte adecuada, en combinación con un medio líquido de selección y regeneración. El uso de este método de cultivo líquido, elimina la necesidad de múltiples transferencias que se requieren normalmente cuando se utiliza un medio sólido para los pasos de selección y regeneración. Además, este método permite la regeneración avanzada, que ha sido un problema en el medio de cultivo líquido hasta ahora. Todavía más, el paso de seleccionar una célula transformada y la regeneración puede lograrse en un solo recipiente, tal como copas para helado, hasta que las plantas se transfieren al suelo.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona métodos novedosos para automatizar los procedimientos de transformación de plantas, proporcionando un método para transformar de manera estable, y opcionalmente, seleccionar y regenerar parcialmente una planta en un recipiente. En algunas modalidades, puede utilizarse un solo recipiente para realizar los métodos de la presente invención. En otras modalidades, pueden proporcionarse múltiples recipientes (por ejemplo, un sistema de recipientes interconectados), para facilidad de uso y optimización de la presente invención. En un aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una planta de maíz transgénica. El método comprende obtener un explante de maíz transformable; transformar el explante de maíz transformable; seleccionar una célula de maíz transformada del explante de maíz transformable en un medio de selección y regenerar la célula transformada en una planta en un medio de regeneración, en donde la transformación, selección y regeneración se hacen en el mismo recipiente. Opcionalmente, la selección en el recipiente puede omitirse, y la plántula transgénica o la planta transgénica pueden someterse a selección después de colocarse en el suelo (por ejemplo, rociada con un agente selectivo). El recipiente puede ser un biorreactor, una caja de Petri, una placa con múltiples pozos, un matraz, frasco, botella, jarra, PlantCon™ , sistema de emersión temporal y una combinación de los mismos, y se proporciona con un medio para proporcionar y eliminar el medio. En algunas modalidades, el recipiente es una caja de Petri, una placa con múltiples pozos, PlantCon, o un sistema de emersión temporal. El explante puede seleccionase del grupo que consiste de callos, embriones y una suspensión celular. El medio puede ser un medio líquido, un medio sólido o una combinación de los mismos. En una modalidad, el medio de selección es un medio sólido y el medio de regeneración es un medio líquido, superpuesto sobre el medio de selección sólido. El explante puede estar en contacto con el medio temporalmente. En una modalidad, el explante se pone en contacto con el medio de selección y el medio de regeneración durante aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos, aproximadamente cada 12 a 24 horas. En aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para obtener un explante para producir una planta de maíz transgénica. El método comprende dividir un callo en piezas del callo más pequeñas. En una modalidad, el callo es un callo del tipo I. En aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar una suspensión celular de Agrobacterium para inocular un explante. El método comprende cultivar una reserva congelada de glicerol con Agrobacterium directamente en el medio de inducción.
En aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un cultivo de células de maíz que comprende células transformables y embriogénicas. En aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un cultivo de células de maíz transformables y embriogénicas. El método comprende obtener un callo de embriones de maíz y cultivar el callo durante aproximadamente 5 días a 30 días en un medio líquido, para producir el cultivo celular. En una modalidad, el callo es un callo del tipo II.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1. Mapa del plásmido ejemplar de pMON301 13.
DESCRIPCION DETALLADA Las siguientes definiciones ayudarán al entendimiento de la descripción de la invención. "Callo", se refiere a una masa de células o tejido proliferante no diferenciado. "Explante", se refiere a una parte de la planta que es capaz de transformarse y regenerarse posteriormente en una planta transgénica. Los explantes típicos incluyen embriones inmaduros, callos, cotiledones, meristemos, hojas o tallos. "Medio de cultivo del tejido", se refiere a un medio liquido, semisólido o sólido, utilizado para sustentar el crecimiento y desarrollo de la planta en un medio que no es el suelo. El medio de cultivo del tejido de la planta adecuado, es conocido por alguien con experiencia en la técnica, como se discute con detalle posteriormente. Los componentes del medio pueden obtenerse de proveedores diferentes a aquéllos identificados en la presente, y pueden optimizarse para el uso por aquellos con experiencia en la técnica, de acuerdo con sus requisitos. "Secuencia codificante", "región codificante" o "marco de lectura abierto", se refiere a una región de tripletes de ácidos nucleicos secuenciales continuos que codifican una proteína, polipéptido o secuencia peptídica. "Endógeno", se refiere a materiales que se originan del interior del organismo o célula. "Exógeno", se refiere a materiales que se originan del exterior del organismo o célula. Se refiere a moléculas de ácidos nucleicos utilizadas en la producción de células y plantas hospederas transformadas o transgénicas. Como se utiliza en la presente, exógeno pretende referirse a cualquier ácido nucleico que se introduce en una célula receptora, sin importar si un ácido nucleico similar pueda ya estar presente en tal célula. "Genoma", se refiere al ADN cromosomal de un organismo. El genoma se define como un conjunto haploide de cromosomas de una especie diploide. Para el propósito de esta solicitud, genoma también incluye el genoma del organelo. "Monocot" o "monocotiledónea", se refiere a plantas que tienen un solo cotiledón. Los ejemplos incluyen cereales tales como maíz, arroz, trigo, avena y cebada. "Acido nucleico", se refiere al ácido desoxirribonucleico (ADN) o al ácido ribonucleico (ARN). "Fenotipo", se refiere a un rasgo exhibido por un organismo, que resulta de la interacción del genotipo y el medio ambiente. "Señal de poliadenilación" o "señal polyA", se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos localizada en el extremo 3' de una región codificante, que fomenta la adición de los nucleótidos de adenilato al extremo 3' del ARNm transcrito de la región codificante. "Promotor" o "región promotora", se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos, usualmente encontrada en el extremo 5' de una secuencia codificante, que controla la expresión de la secuencia codificante, controlando la producción del ARN mensajero (ARNm), proporcionando el sitio de reconocimiento para la ARN polimerasa u otros factores, necesarios para el inicio de la transcripción en el sitio correcto. "Vector de ácido nucleico recombinante" o "vector", se refiere a cualquier agente tal como un plásmido, cósmido, virus, secuencia que se replica de manera autónoma, fago o segmento de nucleotido de ADN o ARN lineal o circular de una sola o de doble hebra, derivado de cualquier fuente, capaz de la integración genómica o la replicación autónoma, que comprende una molécula de ácido nucleico en la cual una o más secuencias de ácidos nucleicos se han enlazado de una manera funcionalmente operativa. Tales vectores o constructos de ácidos nucleicos recombinantes, son capaces de introducir una secuencia reguladora o región promotora 5' y una secuencia de ADN para un producto génico seleccionado, en una célula, de tal manera que la secuencia de ADN se transcribe en un ARNm funcional, que se traduce posteriormente en un polipéptido o proteína. "Regeneración", se refiere al procedimiento de cultivar una planta a partir de una célula de planta. "Medio de regeneración", se refiere a un medio de cultivo del tejido de la planta, requerido para contener un agente de selección. "Callos regenerables", se refiere a callos de los cuales pueden producirse plantas completas, pero en donde el modo de regeneración (embriogénesis u organogénesis) no se ha determinado o no es pertinente para la discusión. "Marcador seleccionable" o "marcador clasificable", se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos cuya expresión confiere un fenotipo que facilita la identificación de las células que contienen la secuencia de ácidos nucleicos. "Selección", se refiere a poner en contacto un explante inoculado con un medio de selección, para obtener una célula, tejido o planta transformado.
"Medio de selección", se refiere a un medio de cultivo del tejido de la planta que contiene un agente de selección. "Transcripción", se refiere al procedimiento de producir una copia de ARN de una plantilla de ADN. "Transformación", se refiere a un procedimiento para introducir una secuencia de ácidos nucleicos exógena (vector o constructo) en una célula o protoplasto, en la cual ese ácido nucleico exógeno se incorpora en el ADN nuclear, el ADN del plástido, o es capaz de la replicación autónoma. "Transgénico", se refiere a organismos en los cuales se ha integrado una secuencia de ácidos nucleicos exógena. "Explante transformable", se refiere a cualquier parte de una planta que es receptiva a la transformación. La presente invención proporciona un sistema en el cual la transformación estable puede llevarse a cabo en un solo recipiente. El procedimiento de transformación empieza con la inoculación del explante transformable con Agrobacterium, y resulta en una plántula transformada de manera estable con raíces adecuadas para la transferencia al suelo. Existen muchos recipientes que pueden utilizarse para este propósito. Pueden utilizarse biorreactores, incluyendo el sistema de inmersión temporal. Muchos recipientes diferentes se han utilizado para el cultivo del tejido de planta en líquido, incluyendo, de manera no exclusiva, cajas de Petri de varios tamaños, placas con múltiples pozos, matraces, frascos, botellas, jarras y PlantCons. Estos recipientes se proporcionan usualmente con medios tales como una entrada y una salida, para proporcionar el medio fresco y eliminar el medio gastado. Una pluralidad de recipientes pueden conectarse para obtener un sistema de alto rendimiento. Estos recipientes pueden incluir algún soporte para el explante. Ese soporte puede ser, de manera no exclusiva, papel filtro, fieltro, plataformas, perlas de vidrio, perlas de zirconia/sílice, espuma o un medio sólido. El medio líquido se coloca usualmente en el recipiente, y a continuación se intercambia conforme se necesite. Este intercambio puede hacerse de manera manual o mecánica. Los recipientes pueden contener muchos explantes a un tiempo, o pueden ser suficientemente pequeños para contener un solo explante. En el caso de placas con múltiples pozos, un arreglo de pozos pequeños, cada uno que contiene un explante, se utiliza para cultivar grandes números de explantes. Las ventajas de las placas con múltiples pozos incluyen el aislamiento de cualesquier explantes contaminados. Los explantes pueden prepararse de manera manual o mecánica. El propósito de la invención es tener un sistema que sea fácilmente automatizable desde el inicio al término; sin embargo, cualquiera de estos sistemas de cultivo en líquido y recipientes, pueden utilizarse en combinación con otros pasos de transformación, selección y regeneración conocidos por alguien con experiencia en la técnica. Un sistema de transformación de alto rendimiento puede desarrollarse, en el cual los recipientes pueden manipularse por brazos robóticos en una mesa de trabajo configurable libremente, que puede incluir incubadoras y agitadores, además de material de laboratorio estándar. Varias herramientas de manejo del líquido, equipadas con una o más puntas pipeteadoras, pueden utilizarse para proporcionar el medio fresco y retirar el medio gastado. La mesa de trabajo, los brazos robóticos y las herramientas para manejar el líquido pueden controlarse por un programa vía una computadora. De manera alterna, el medio líquido para seleccionar y regenerar la célula transformada, puede proporcionarse al recipiente vía uno o más tubos conectados a un recipiente de almacenamiento del medio, y retirarse vía uno o más tubos conectados a un recipiente de desecho. La provisión y retiro del medio puede controlarse de manera manual o mecánica. Para iniciar un procedimiento de transformación de acuerdo con la presente invención, es necesario primero seleccionar los componentes genéticos a ser insertados en las células o tejidos de la planta. Los componentes genéticos pueden incluir cualquier ácido nucleico que se introduce en una célula o tejido de planta, utilizando el método de acuerdo con la invención. Los componentes genéticos pueden incluir ADN que no es de planta, ADN de planta o ADN sintético. En una modalidad preferida, los componentes genéticos se incorporan en una composición de ADN tal como una molécula de un plásmido o vector recombinante, de doble hebra, que comprende al menos uno de los siguientes tipos de componentes genéticos: (a) un promotor que funciona en las células de la planta para causar la producción de una secuencia de ARN, (b) una secuencia de ADN estructural que causa la producción de una secuencia de ARN que codifica un producto de utilidad agronómica, y (c) una secuencia de ADN no traducido 3' que funciona en las células de la planta para causar la adición de los nucleótidos poliadenilados en el extremo 3' de la secuencia de ARN. El vector puede contener varios componentes genéticos para facilitar la transformación de la célula o el tejido de la planta, y regular la expresión de los genes deseados. En una modalidad preferida, los componentes genéticos están orientados para expresar un ARNm, que en una modalidad, puede traducirse en una proteína. La expresión de una secuencia codificante estructural de la planta (un gen, ADNc, ADN sintético u otro ADN), que existe en la forma de doble hebra, involucra la transcripción del ARN mensajero (ARNm) de una hebra del ADN mediante la enzima ARN polimerasa, y el procesamiento posterior del transcripto primario de ARNm dentro del núcleo. Este procedimiento involucra una región no traducida 3', que agrega los nucleótidos poliadenilados a los extremos 3' del ARNm. Los medios para preparar los plásmidos o vectores que contienen los componentes genéticos deseados, son bien conocidos en la técnica. Los vectores consisten típicamente de varios componentes genéticos, incluyendo, de manera no exclusiva, elementos reguladores tales como promotores, líderes, intrones y secuencias terminadoras. Los elementos reguladores también son referidos como elementos cis o trans reguladores, dependiendo de la proximidad del elemento a las secuencias o genes que controlan. La transcripción del ADN en el ARNm se regula por una región de ADN, referida usualmente como el "promotor". La región promotora contiene una secuencia de bases que indica a la ARN polimerasa, que debe asociarse con el ADN, e iniciar la transcripción en el ARNm, utilizando una de las hebras del ADN como una plantilla, para hacer una hebra complementaria correspondiente del ARN. Varios promotores que son activos en células de plantas se han descrito en la literatura. Tales promotores incluirían, de manera no exclusiva, los promotores de nopalina sintasa (NOS) y octopina sintasa (OCS), que son portados en los plásmidos que inducen el tumor, de Agrobacterium tumefaciens, los promotores de colimovirus, tales como los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el promotor 35S virus del mosaico de la escrofularia (FMV), el promotor CaMV35S mejorado (e35S), el promotor inducible con la luz de la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido de planta muy abundante). Todos estos promotores se han utilizado para crear varios tipos de constructos de ADN que se han expresado en plantas. Los híbridos del promotor también pueden construirse para mejorar la actividad transcripcional (Patente de E.U.A. 5,106,739), o para combinar la actividad transcripcional, la inducibilidad y especificidad del tejido o la especificidad del desarrollo, deseadas. Los promotores que funcionan en plantas incluyen, de manera no exclusiva, promotores que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos, como se describió, y reguladores temporalmente, regulados espacialmente y regulados espaciotemporalmente. Otros promotores que son mejorados para el tejido, específicos del tejido o regulados por el desarrollo, también son conocidos en la técnica y se considera que tienen utilidad en la práctica de esta invención. Los promotores pueden obtenerse de una variedad de fuentes, tales como plantas y viruses de ADN de plantas e incluyen, de manera no exclusiva, los promotores CaMV35S y FMV35S y los promotores aislados de los genes de plantas, tales como los genes de ssRUBISCO. Como se describe a continuación, se prefiere que el promotor particular seleccionado, sea capaz de causar suficiente expresión para resultar en la producción de una cantidad efectiva del producto génico de interés. Los promotores utilizados en los constructos de ADN (por ejemplo, genes de plantas quiméricas/recombinantes) de la presente invención pueden modificarse, si se desea, para afectar sus características de control. Los promotores pueden derivarse por medio de la ligadura con regiones operadoras, mutagénesis aleatoria o controlada, etc. Además, los promotores pueden alterarse para contener múltiples "secuencias mejoradoras", para ayudar a elevar la expresión del gen. El ARNm producido por un constructo de ADN de la presente invención, también puede contener una secuencia líder no traducida 5'. Esta secuencia puede derivarse del promotor seleccionado para expresar el gen, y puede modificarse de manera específica, para incrementar la traducción del ARNm. Las regiones no traducidas 5' también pueden obtenerse de ARN virales, de genes eucarióticos adecuados, o de una secuencia génica sintética. Tales secuencias "mejoradoras", pueden ser deseables para incrementar o alterar la eficiencia traduccional del ARNm resultante. La presente invención no está limitada a constructos, en donde la región no traducida se deriva de la secuencia no traducida 5' que acompaña la secuencia promotora. En su lugar, la secuencia líder no traducida puede derivarse de promotores o genes no relacionados (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. 5,362,865). Otros componentes genéticos que sirven para mejorar la expresión o afectar la transcripción o traducción de un gen, también son considerados como componentes genéticos. La región no traducida 3' de los constructos quiméricos deberá contener un terminador transcripcional, o un elemento que tenga una función equivalente, y una señal de poliadenilación que funcione en plantas, para causar la adición de los nucleótidos poliadenilados al extremo 3' del ARN. Los ejemplos de regiones 3' adecuadas son (1 ) las regiones 3' transcritas, no traducidas, que contienen la señal de poliadenilación de los genes del plásmido que inducen el tumor (Ti) de Agrobacterium, tales como el gen de la nopalina sintasa (NOS), y (2) genes de plantas tales como los genes de la proteína de almacenamiento de la soya, y la subunidad pequeña del gen de la ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO). Un ejemplo de una región 3' preferida es aquélla del gen ssRUBISCO E9 del chícharo (Solicitud de Patente Europea 0385 962). Típicamente, las secuencias de ADN localizadas unos cuantos cientos de pares de bases, corriente abajo del sitio de poliadenilación, sirven para terminar la transcripción. Las secuencias de ADN son referidas en la presente como regiones que terminan la transcripción. Las regiones se requieren para la poliadenilación eficiente del ARN mensajero (ARNm) transcrito, y son conocidas como regiones no traducidas 3'. La ARN polimerasa transcribe una secuencia de ADN codificante a través de un sitio en donde ocurre la poliadenilación. En una modalidad preferida, el vector contiene un gen marcador seleccionable, clasificable o calificable. Estos componentes genéticos también son referidos en la presente como componentes genéticos funcionales, puesto que producen un producto que sirve para la función en la identificación de una planta transformada, o un producto de utilidad agronómica. El ADN que sirve como un dispositivo de selección, funciona en un tejido de planta regenerable, para producir un compuesto que conferiría resistencia al tejido de la planta a un compuesto tóxico de otra manera. Los genes de interés para uso como un marcador seleccionable, clasificable o calificable, incluirían, de manera no exclusiva, GUS, proteína fluorescente verde (GFP), genes relacionados con la biosíntesis de la antocianina (C1 , Bperu), luciferasa (LUX), antibióticos como kanamicina (Dekeyser et al., 1989), y herbicidas como el glifosato (Della-Cioppa et al., 1987). Otros dispositivos de selección también pueden implementarse, incluyendo, de manera no exclusiva, tolerancia a la fosfinotricina, bialafos, dicamba y mecanismos de selección positivos y caerían todavía dentro del alcance de la presente invención. La presente invención puede utilizarse con cualquier plásmido o vector de transformación de la planta, adecuado, que contenga un marcador seleccionable o clasificable, y elementos reguladores asociados como se describió, junto con uno o más ácidos nucleicos expresados de una manera suficiente, para conferir un rasgo particular. Los ejemplos de genes estructurales adecuados de interés agronómico, considerados por la presente invención, incluirían, de manera no exclusiva, genes para la tolerancia a insectos o plantas, tolerancia a herbicidas, genes para mejoras de la calidad tales como el rendimiento, mejoras nutricionales, tolerancias ambientales o a las agresiones, o cualesquier cambios deseables en la fisiología, crecimiento, desarrollo, morfología de la planta o productos de la planta. De manera alterna, las secuencias codificantes del ADN pueden afectar estos fenotipos, codificando una molécula de ARN no traducible, que causa la inhibición dirigida de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo, vía mecanismos mediados por el antisentido o la cosupresion (véase, por ejemplo, Bird et al., 1991 ). El ARN podría ser también una molécula de ARN catalítica (por ejemplo, una ribozima), diseñada para escindir un producto del ARNm endógeno deseado (véase, por ejemplo, Gibson y Shillitoe, 1997). Más particularmente, para una descripción de la regulación antisentido de la expresión del gen células de plantas, véase la Patente de E.U.A. 5,107,065, y para una descripción de la supresión de genes en plantas mediante la transcripción de un ARNds, véanse la Patente de E.U.A. 6,506,559, la Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2002/0168707 A1 , y las Solicitudes de Patente de E.U.A. Nos. de Serie 09/423,143 (véase la WO 98/53083), 09/127,735 (véase la WO 99/53050) y 09/084,942 (véase la WO 99/61631 ), todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. Así, cualquier gen que produzca una proteína o ARNm que exprese un cambio del fenotipo o la morfología de interés, es útil para la práctica de la presente invención. Los ácidos nucleicos ejemplares que pueden introducirse mediante los métodos abarcados por la presente invención incluyen, por ejemplo, secuencias de ADN o genes de otras especies, o incluso genes o secuencias que se originan con, o están presentes en algunas especies, pero están incorporados en células receptoras, mediante métodos de ingeniería genética, más que las técnicas de reproducción o crianza clásicas. Sin embargo, el término exógeno también pretende referirse a genes que no están normalmente presentes en la célula que se está transformando, o tal vez simplemente no están presentes en la forma, estructura, etc., como se encuentra en el segmento de ADN o gen transformante, o genes que normalmente están presentes pero que uno desea, por ejemplo, sobreexpresar. Así, el término gen o ADN "exógeno", pretende referirse a cualquier gen o segmento de ADN que se introduce en una célula receptora, sin importar si un gen similar pueda ya estar presente en tal célula. El tipo de ADN incluido en el ADN exógeno puede incluir ADN que ya está presente en la célula de planta, ADN de otra planta, ADN de un organismo diferente, o un ADN generado de manera externa, tal como una secuencia de ADN que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una secuencia de ADN que codifica una versión sintética o modificada de un gen. A la luz de esta descripción, otros numerosos posibles genes marcadores seleccionares o clasificables, elementos reguladores y otras secuencias de interés, serán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica. Por lo tanto, la discusión anterior pretende ser ejemplar, más que exhaustiva. Las tecnologías para la introducción del ADN en las células son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica, y pueden dividirse en categorías, incluyendo, de manera no exclusiva: (1 ) métodos químicos; (2) métodos físicos tales como microinyección, electroporación y bombardeo con microproyectiles; (3) vectores virales; (4) mecanismos mediados por el receptor y 5) métodos de transformación de plantas mediados por Agrobacterium. Para la transformación mediada por Agrobacterium, después de la construcción del vector o constructo de transformación de la planta, la molécula de ácido nucleico, preparada como una composición de ADN in vitro, se introduce en un hospedero adecuado, tal como E. coli, y se hace coincidir en otro hospedero adecuado tal como Agrobacterium, o se transforma directamente en Agrobacterium competente. Estas técnicas son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica, y se han descrito para varios sistemas de plantas, incluyendo soya, algodón y trigo (véanse, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,569,834 y 5,159,135, y la WO 97/48814, incorporadas en la presente como referencia en su totalidad). La presente invención abarca el uso de cepas bacterianas para introducir uno o más componentes genéticos en las plantas. Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán la utilidad de los métodos de transformación mediados por Agrobacterium. Varias cepas del tipo silvestre y desarmadas de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes que alojan los plásmidos Ti o Ri, pueden utilizarse para la transferencia génica en plantas. De manera preferida los hospederos de Agrobacterium contienen los plásmidos Ti y Ri desarmados, de manera que no contienen los oncogenes que causan la tumorigénesis o la rizogénesis, respectivamente, que se utilizan como los vectores, y contienen los genes de interés, que se introducen posteriormente en las plantas. Las cepas preferidas incluirían, de manera no exclusiva, la cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens, una cepa del tipo nopalina que se utiliza para mediar la transferencia del ADN en una célula de planta, las cepas del tipo octopina, tales como LBA4404 o las cepas del tipo succinamopina, por ejemplo, EHA 01 o EHA105. Otras bacterias tales como Sinorhizobium, Rhizobium y Mesorhizobium, que interactúan con las plantas de manera natural, pueden modificarse para mediar la transferencia del gen a vahas plantas diversas. Estas bacterias simbióticas asociadas con las plantas, pueden hacerse competentes para la transferencia del gen mediante la adquisición del plásmido Ti desarmado y un vector binario adecuado (Broothaerts et al, 2005). El uso de estas cepas para la transformación de plantas se ha reportado y los métodos son familiares para aquellos con experiencia en la técnica. Los explantes pueden ser de un solo genotipo o de una combinación de genotipos. Cualquier semilla de maíz que pueda germinar es un material inicial viable. En una modalidad preferida, los explantes superiores de híbridos de planta pueden utilizarse como explantes. Por ejemplo, una línea celular que crece rápidamente con una alta respuesta al cultivo (frecuencia mayor de formación de callos embriogénicos, velocidad de crecimiento, frecuencia de regeneración de la planta, etc.), puede generarse utilizando embriones híbridos que contienen varios genotipos. En una modalidad preferida, un híbrido F1 o la descendencia de primera generación de una fecundación cruzada puede utilizarse como una planta donadora y cruzarse con otro genotipo. Aquellos con experiencia en la técnica están conscientes de la heterosis, también referida en la presente como "vigor híbrido", que ocurre cuando dos endógamos se cruzan. La presente invención abarca, por lo tanto, el uso de un explante que resulte de una cruza de tres vías, en donde al menos uno o más de los endógamos es altamente regenerable y transformable, y la frecuencia de transformación y regeneración del explante de la cruza de tres vías excede las frecuencias de los endógamos de manera individual. Otros tejidos también están considerados como que tienen utilidad en la práctica de la presente invención. Los explantes pueden incluir embriones maduros, embriones inmaduros, meristemos, tejido del callo o cualquier otro tejido que sea transformable y regenerable. Cualquier medio de cultivo de planta adecuado puede utilizarse durante el procedimiento de transformación. Los ejemplos de un medio adecuado incluirían, de manera no exclusiva, medio basado en MS (Murashige y Skoog, 1962) o medio basado en N6 (Chu et al., 1975), suplementado con reguladores adicionales del crecimiento de la planta, incluyendo, de manera no exclusiva, auxinas tales como picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y dicamba (ácido 3,6-dicloroanísico); citocininas tales como BAP (6-bencilaminopurina) y cinetina; ABA; y giberelinas. Otros aditivos para el medio pueden incluir, de manera no exclusiva, aminoácidos, macroelementos, hierro, microelementos, inositol, vitaminas y compuestos orgánicos, carbohidratos, componentes del medio indefinidos tales como hidrolisados de caseína, antagonistas de etileno, incluyendo nitrato de plata con o sin un agente gelificante apropiado, tal como una forma de agar, tal como agarosa de bajo punto de fusión o Gelrite®, sí se desea. Aquellos con experiencia en la técnica, están familiarizados con una variedad de medios de cultivo del tejido, que cuando se suplementan de manera apropiada, sustentan el crecimiento y desarrollo del tejido de la planta y son adecuados para la transformación y regeneración de la planta. Estos medios de cultivo del tejido pueden comprarse como una preparación comercial o pueden prepararse y modificarse a la medida. Los ejemplos de tales medios incluirían, de manera no exclusiva, Murashige y Skoog (1962), N6 (Chu et al., 1975), Linsmaier y Skoog (1965), Uchimiya y Murashige (1962), medio de Gamborg (Gamborg et al., 1968), medio D (Duncan et al., 1985), medio para plantas leñosas de McCown (McCown y Lloyd, 1981 ), Nitsch y Nitsch (1969), y Schenk y Hildebrandt (1972) o derivaciones de estos medios suplementados en consecuencia. Aquellos con experiencia en la técnica, están conscientes de que el medio y los suplementos del medio, tales como nutrientes y reguladores del crecimiento, para utilizarse en la transformación y regeneración y otras condiciones de cultivo, tales como la intensidad de la luz durante la incubación, pH, y las temperaturas de incubación, pueden optimizarse para la variedad particular de interés. Una vez que el tejido de la planta transformable se aisla, el siguiente paso del método es introducir los componentes genéticos en el tejido de la planta. Este procedimiento también se refiere en la presente como "transformación". Las células de la planta se transforman y cada célula de planta transformada de manera independiente se selecciona. Los transformantes independientes se refieren como eventos transgénicos. Se han reportado varios métodos y pueden utilizarse para insertar componentes genéticos en el tejido de la planta transformable. El bombardeo con microproyectiles y el suministro del gen mediado por Agrobacterium, son dos métodos de transformación de plantas utilizados más comúnmente, pero se conocen otros métodos. Aquellos con experiencia en la técnica están conscientes de los pasos típicos en el procedimiento de transformación de la planta. Aquellos con experiencia en la técnica, están familiarizados con los procedimientos para el crecimiento y las condiciones de cultivo adecuadas para Agrobacterium, así como de los procedimientos de inoculación posteriores. La densidad del cultivo de Agrobacterium utilizado para la inoculación y la relación de células de Agrobacterium a explantes, puede variar de un sistema al siguiente, y por lo tanto, se espera la optimización de estos parámetros para cualquier método de transformación. El Agrobacterium también puede inducirse directamente de reservas congeladas, o puede cultivarse de múltiples maneras conocidas por alguien con experiencia en la técnica. La siguiente etapa del procedimiento de transformación es la inoculación. En esta etapa, los explantes y las suspensiones celulares de Agrobacterium se mezclan juntos. Esto puede lograrse incubando los explantes en una suspensión celular de Agrobacterium. En otras modalidades descritas en la presente, los explantes se inocularon mientras que estaban todavía unidos al tejido donador, mientras se retiraban los explantes del tejido donador, después de plantar los explantes en el medio de selección, o mediante una combinación. La duración y condición de la inoculación y la densidad celular de Agrobacterium variarán dependiendo del sistema de transformación de la planta.
Después de la inoculación, cualquier suspensión de Agrobacterium en exceso puede eliminarse y el Agrobacterium y el material de la planta objetivo se cocultivan. El cocultivo se refiere al tiempo posterior a la inoculación y antes de transferir a un medio de retardo o selección. Cualquier número de medios de cultivo tejido de plantas puede utilizarse para el paso de cocultivo. Los tejidos de la planta después de la inoculación con Agrobacterium, pueden cultivarse en un medio líquido o semisólido. El cocultivo se realiza típicamente durante aproximadamente uno a tres días a una temperatura de aproximadamente 18°C-30°C. El cocultivo puede realizarse en la luz, o en condiciones que limitan la luz. Las condiciones de iluminación pueden optimizarse para cada sistema de planta como se conoce por aquellos con experiencia en la técnica. Después del cocultivo con Agrobacterium, los explantes típicamente pueden colocarse directamente en el medio selectivo. De manera alterna, después del cocultivo con Agrobacterium, los explantes podrían colocarse en medio sin el agente selectivo y colocarse posteriormente en el medio selectivo. Aquellos con experiencia en la técnica están conscientes de que numerosas modificaciones en los regímenes selectivos, medios y condiciones de crecimiento pueden variarse dependiendo del sistema de la planta y del agente selectivo. Los agentes selectivos típicos incluyen, de manera no exclusiva, antibióticos tales como geneticina (G418), kanamicína, paromomicina u otros compuestos químicos tales como glifosato, fosfinotricina, bialafos y dícamba. Los componentes del medio apropiados adicionales, pueden agregarse al medio de selección o de retardo para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Tales componentes del medio pueden incluir, de manera no exclusiva, antibióticos tales como carbenicilina o cefotaxima. En una modalidad, los pasos de inoculación, cocultivo y selección se combinaron en un solo paso, emplacando los explantes inoculados directamente en un medio que contiene los agentes selectivos para la supresión del crecimiento de Agrobacterium, y destruyendo las células de los explantes no transformados para mejorar la eficiencia del sistema de producción de la transformación. Los cultivos son transferidos posteriormente a un medio adecuado para la recuperación de las plántulas transformadas. Aquellos con experiencia en la técnica están conscientes del número de métodos para recuperar las plantas transformadas. Una variedad de requisitos de los medios y de transferencia pueden implementarse y optimizarse para cada sistema de plantas, para la transformación de las plantas y la recuperación de las plantas transgénicas. En consecuencia, tales condiciones del medio y de cultivo descritas en la presente invención, pueden modificarse o sustituirse con componentes nutricionalmente equivalentes, o con procedimientos similares para la selección y recuperación de eventos transgénicos, y todavía caer dentro del alcance de la presente invención. La presente invención incluye todos los pasos descritos previamente; sin embargo, se hacen modificaciones conforme sea apropiado, para facilitar el procedimiento en un solo recipiente. El cultivo en líquido en varios tipos de soportes se utiliza para facilitar el cambio del medio de un paso a otro paso. Un biorreactor de un sistema de inmersión temporal u otro dispositivo que proporcione resultados similares, puede utilizarse para el reemplazo del medio. En el caso de los callos como el explante, los callos pueden picarse utilizando varios dispositivos, incluyendo, de manera no exclusiva, una prensa para ajos, tijeras, escalpelos u otros dispositivos cortantes. Los callos pueden picarse muy finos para ajustarse en un sistema de placas con múltiples pozos pequeños, en donde la expectativa es obtener un solo evento en cada pozo. Estas modificaciones proporcionan alivio ergonómico y pueden utilizarse para recuperar muchos eventos transgénicos a partir de una sola pieza de callo. Los transformantes producidos son analizados posteriormente para determinar la presencia o ausencia de un ácido nucleico particular de interés, contenido en el vector de transformación. Los análisis moleculares pueden incluir, de manera no exclusiva, Southern blots (Southern, 1975), o análisis con PCR (reacción en cadena de la polimerasa), enfoques con inmunodiagnóstico y evaluaciones en el campo. Estos y otros métodos bien conocidos pueden realizarse para confirmar la estabilidad de las plantas transformadas producidas mediante los métodos descritos. Estos métodos son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, y se han reportado (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989).
Aquellos con experiencia en la técnica, apreciarán las muchas ventajas de los métodos y composiciones proporcionados por la presente invención. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Deberá apreciarse por aquellos con experiencia en el campo, que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen, representan técnicas descubiertas por los inventores, que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto, puede considerarse que constituyen los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos con experiencia en la técnica, a la luz de la presente descripción, deberán apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen, y todavía obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan aquí como referencia al grado en que suplementan, explican, proporcionan una base para, o enseñan la metodología, técnicas o composiciones empleadas en la presente.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan con el propósito de ilustrar varias modalidades de la invención, y no pretenden limitar la presente invención de ninguna manera. Alguien con experiencia en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como aquellos objetos, fines y ventajas inherentes a la presente. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en la presente, son actualmente representativos de las modalidades preferidas, son ejemplares, y no pretenden limitar el alcance de la invención. Los cambios en los mismos y otros usos que están abarcados dentro del espíritu de la invención, como se define por el alcance de las reivindicaciones, se les ocurrirán a aquellos con experiencia en la técnica.
EJEMPLO 1 Fuente del explante y condiciones de cultivo Los callos de ocho días de edad (ocho días postsubcultivo), obtenidos de embriones de maíz inmaduros, se cultivaron en medio 21 V gelificado (mezcla de sal basal de N6, 1 mg/L de 2-4-D, 1 mg/L de Tiamina HCL, 1 mg/L de Acido Nicotínico, 0.91 g/L de Monohidrato de L-Asparagina, 0.1 g/L de mioinositol, 0.5 g/L de MES, 1 .6 g/L de MgCI2 6H20, 0.1 g/L de hidrolisado de caseína, 0.69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarosa, nitrato de plata 0.1 mM, 6 g/L de agar Phyta). Cada vez que el uso de medio gelificado se mencione, se utilizaron cajas de Petri de 25 X 100 mm que contienen 50 mL de medio con 12 explantes por placa, y todas las transferencias se hicieron manualmente. El medio líquido consistió de 212V (sales básales de N6 con 2 mg/L de 2-4-D, 1 mg/L de Tiamina HCL, 1 mg/L de Acido Nicotínico, 0.91 g/L de Monohidrato de L-Asparagina, 0.1 g/L de mioinositol, 0.5 g/L de MES, 1.6 g/L de MgCI2 6H2O, 0.1 g/L de hidrolisado de caseína, 0.69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarosa, nitrato de plata 0.01 mM, pH ajustado a 5.8, y se sometió a autoclave a 121°C y 105 kPa durante 20 minutos. Posterior al autoclave, se agregó Carbenicilina y Paromomicina esterilizadas por filtración a 250 mg/L o 500 mg/L y 100 mg/L o 200 mg/L de concentración al medio, como un agente selectivo. Para el cultivo en líquido, se utilizó un recipiente de un Sistema de Inmersión Temporal (TIS), cajas de Petri de 240 x 240 mm de largo, o cajas de Petri de 25 x 100 mm, o placas con múltiples pozos. Todos los cultivos se incubaron a 27-28°C en la oscuridad en un gabinete de crecimiento (Serie 101 US de Percival scientific).
Infección y cocultivo con Aprobacterium tumefaciens Callos de ocho días de edad, que crecen de manera activa, de tamaño uniforme, se seleccionaron e inocularon con una suspensión de Agrobacterium (0.25 X 109 cfu/mL) durante 30 minutos. Los callos se lavaron con medio líquido 212V que contiene AgNO3 0.1 mM y se transfirieron a un recipiente TIS o a una capa de Petri de 25 X 100 mm, que contiene papel filtro o una caja de Petri poco profunda grande (240 X 240 mm), que contiene dos capas de fieltro de poliéster (220 X 220 mm). Los tratamientos de cocultivo se llevaron a cabo en la oscuridad a 23°C.
Cepas y plásmidos de A. tumefaciens La cepa de Agrobacterium ABI C58 se utilizó para mediar la transferencia del ADN en las células de la planta. El plásmido pMON301 13 (Figura 1 ), contenía el gen de la neomicina fosfotransferasa II (NPTII) como el marcador seleccionábale y un gen de la proteína fluorescente verde (GFP) como el marcador clasificable dirigido por el promotor 35S.
EJEMPLO 2 Sistema de inmersión temporal (TIS) Un TIS modificado se construyó como sigue. Dos cámaras de una unidad de filtro de 250 mL, que se puede someter a autoclave (Nalge Nunc Intl., Rochester, NY), se conectaron mediante la inserción de un tubo de vidrio en la base de la placa de soporte, utilizada normalmente para sostener el filtro de la membrana. Se conectaron mangueras de aire a las dos cámaras. El flujo de aire se esterilizó mediante el paso a través de filtros de membrana de PTFE hidrofóbicos, de 50 mm de diámetro, de 0.2 pm de tamaño de poro (Millipore, Billerica, MA). El medio líquido se colocó en la cámara inferior y los materiales de los explantes se colocaron en un disco de soporte en la cámara superior. El aire se bombeó hacia la cámara inferior para desplazar el medio líquido a través del tubo de vidrio hacia la cámara superior, sumergiendo los callos. El aire bombeado a la cámara superior, obligó al medio a regresar a la cámara inferior (únicamente una película delgada del medio líquido permanece en los tejidos). Un cronómetro electrónico se utilizó para operar los solenoides que controlan el flujo de aire a la cámara superior o inferior. El cronómetro se programó para un flujo de aire hacia la cámara inferior, un flujo de aire hacia la cámara superior o un "tiempo libre" (sin flujo de aire). Los tiempos de flujo de aire se ajustaron de 1 a 5 minutos cada uno, mientras que el tiempo libre podía variar. El programa se ajustó entonces para correr en un ciclo continuo a través de las diferentes etapas del procedimiento de transformación. En esta manera, los tejidos se sumergieron completamente durante aproximadamente 1 -5 minutos a intervalos de tiempo fijos. Esto es llamado la frecuencia del ciclo de inmersión.
Optimización de las frecuencias del ciclo de inmersión El tejido se cultivó a una sumersión de 1 minutos de duración y se probaron cuatro diferentes frecuencias del ciclo de inmersión (una vez cada 6 horas, 8 horas, 12 horas y 24 horas) cada una, durante un periodo de 8 semanas. Como un control, la mitad de los callos derivados de la misma espiga se cultivaron en medio gelificado 21 1 V con selección. Se encontró que el intervalo de tiempo de la inmersión tiene un impacto significativo en la velocidad de proliferación de los callos en el TIS. La velocidad máxima de proliferación de los callos y el incremento de la biomasa ocurrió utilizando una frecuencia de inmersión de 12 horas o 24 horas. Con estas dos frecuencias del ciclo de inmersión, 70-80% de los callos produjeron sectores positivos a GFP. Al incrementar la frecuencia de la inmersión a un ciclo cada 6 u 8 horas, no se observó ningún signo de proliferación de los callos y en el transcurso de 10 a 14 días, los callos se volvieron marrones, y finalmente murieron.
Efecto de la carbenicilina en el crecimiento de A. tumefaciens Los callos se inocularon con pMON30113 como se describió anteriormente. Después de la inoculación, los callos infectados se transfirieron al medio de proliferación de los callos (2 2V) suplementado con 0, 100, 250, 500 ó 1000 mg/L de carbenicilina. El crecimiento de Agrobactehum se evaluó visualmente observando la turbidez del medio líquido en la cámara inferior del aparato TIS. Una unidad TIS separada, con un tratamiento de control no inoculado, se incluyó. Un control adicional de callos no inoculados, también se cultivó en medio gelificado suplementado con carbenicilina (21 1 V), para estudiar el efecto de la carbenicilina en los cultivos de callos. No se notó una diferencia significativa en la calidad de los callos cuando los callos no inoculados cultivados en medio 21 1V (gelificado) y 212V (liquido) suplementado con o sin carbenicilina, indicaron que no hay un efecto negativo de la carbenicilina en el crecimiento y desarrollo de los callos no inoculados. Sin embargo, se observaron diferencias en el crecimiento de A. tumefaciens y sectores positivos a GFP conforme la concentración de la carbenicilina se incrementó de 0.0 a 1000 mg/L. La carbenicilina a una concentración de 100 mg/L no pudo suprimir el crecimiento de Agrobacterium en el medio líquido o gelificado. Se encontró que la concentración óptima de la carbenicilina es de 500 mg/L para el medio gelificado y líquido.
Efecto de la paromomicina en la proliferación de los callos y brotes Para inhibir la proliferación de los callos no transgénicos, los medios de cultivo gelificado (control) y líquido, se suplementaron con el agente selectivo paromomicina (25, 50, 75, 100 ó 200 mg/L). Los tratamientos del control fueron (1 ) callos no inoculados en medio selectivo, (2) callos no inoculados en medio libre de selección, y (3) callos inoculados en medio libre de selección. El medio del cultivo básico consistió de 21 1V o 212V. Para este experimento, se utilizaron cajas de Petri de 25 X 100 mm de profundidad. Con el cultivo en líquido, dos capas de 60 X 60 mm de fieltro se utilizaron para sostener los explantes. El agente selectivo para el cultivo inoculado con Agrobacterium contenía carbenicilina y paromomicina. La paromomicina a bajas concentraciones, inhibió de manera más efectiva el crecimiento de los callos embriogénicos y la regeneración de las plantas en el medio líquido que el medio gelificado. No se obtuvieron plantas de los callos no inoculados del medio líquido, que contiene tan poco como 50 mg/L de paromomicina, mientras que 50% de los callos produjeron plántulas en el medio gelificado a la misma concentración de paromomicina.
La paromomicina a una concentración de 100 mg/L inhibió el crecimiento de los callos con el medio líquido y gelificado.
Optimización de la cantidad de medio líquido utilizado en el TIS Los callos en desarrollo se cultivaron en una de cuatro diferentes cantidades de medio líquido (20 mL, 30 mL, 50 mL y 100 mL/recipiente).
Selección y regeneración en el TIS Después de 3 días de cocultívo en TIS, 20 mL del medio de selección 212VRT (sales básales de N6 con 2 mg/L de 2,4-D, 1 mg/L de Tiamina HCL, 1 mg/L de Acido Nicotínico, 0.91 g/L de Monohidrato de L-Asparagina, 0.1 g/L de mioinositol, 0.5 g/L de MES, 1 .6 g/L de MgCI2 6H2O, 0.1 g/L de hidrolisado de caseína, 0.69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarosa, nitrato de plata 0.01 mM, 500 mg/L de Carbenicilina y 100 mg/L de Paromomicina), se inyectaron en la cámara inferior del TIS. Los callos se sumergieron durante un minuto una vez cada 12 horas. Después de dos semanas de incubación, el medio 212VRT se aspiró de la cámara inferior utilizando una bomba de vacío y se reemplazó con 20 mL de medio 212RT (sin nitrato de plata). Los callos se sumergieron durante un minuto una vez cada 24 horas durante dos semanas más. Después de terminar las 4 semanas de la fase de selección, el medio de selección se reemplazó con medio BAP-impulso 217A (sales básales de N6 con 1 mg/L de Tiamina HCL, 1 mg/L de Acido Nicotínico, 3.52 mg/L de BAP, 0.91 g/L de Monohidrato de L-Asparagina, 0.1 g/L de mioinositol, 0.5 g/L de MES, 1 .6 g/L de MgCI2 6H20, 0.1 g/L de hidrolisado de caseína, 0.69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarosa, 250 mg/L de Carbenicilina). Los callos se trataron con medio 217A durante 7 días con un minuto de inmersión una vez cada 12 horas. Para la regeneración de las plantas, el medio 217A se reemplazó con medio 632AG (mezcla de sales de MS, vitaminas MS, 50 mg/L de mioinositol, 60 g/L de sacarosa, 50 mg/L de paromomicina y 250 mg/L de carbenícilina). El medio se inyectó en la cámara superior del TIS y se realizaron dos corridas rápidas de un minuto de inmersión para diluir cualquier medio 217A residual. Las luces en el Percival se encendieron a un ciclo de 16 horas encendidas/8 horas apagadas. El TIS se dejó libre (sin ninguna inmersión) durante 72 horas, y posteriormente, los callos se sumergieron una vez cada 24 horas, hasta que las raíces se desarrollaron al tamaño de 5-20 mm. Después de 10-12 semanas de selección y regeneración en un recipiente, se obtienen plantas transgénicas. Se alcanzó una frecuencia de transformación de 5.9% en el TIS. Esto se compara con el 17.7% en el control.
EJEMPLO 3 Uso de capas de Petri Los callos obtenidos como en el Ejemplo 1 , se lavaron con medio líquido 212V que contiene AgNO3 0.1 mM y se transfirieron a una caja de Petri de 25 x 100 mm que contiene papel filtro o una caja de Petri poco profunda grande (240 x 240 mm), que contiene dos capas de fieltro acrilico (220 X 220 mm). Los explantes se cultivaron entonces como se describió en el TIS en el Ejemplo 2, con la diferencia de que los intercambios del medio líquido se hicieron a mano. El medio líquido se comparó con el medio gelificado. En la caja de Petri más pequeña, el medio líquido proporcionó una frecuencia de transformación de 4.2% en comparación con 6.6% con el medio gelificado. En la caja de Petri más grande, el medio líquido proporcionó una frecuencia de transformación de 7.8% en comparación con 1 1 .5% con el medio gelificado. Esto demuestra que el medio liquido es una alternativa viable para los protocolos con medio sólido estándar. El medio líquido permitirá una automatización mayor.
EJEMPLO 4 Uso de placas con múltiples pozos como el recipiente Las placas con múltiples pozos también pueden utilizarse como el sistema de un solo recipiente. Los experimentos se hicieron como se describió anteriormente, excepto por el uso de placas con múltiples pozos en lugar de cajas de Petri. Se utilizaron placas con múltiples pozos de Costar (Corning Life Sciences, Acton, MA), con o sin sus insertos Transwell™ . El tamaño de los poros de la membrana utilizada (0.1 µ), permiten que el medio se filtre a través de la membrana al tejido del maíz conforme se necesite, sin inundar el tejido. El puerto de acceso para la punta de la pipeta permite que el medio se retire rápidamente y se agregue en los pozos para los cambios del medio. Durante las transferencias del medio, el medio dentro de los pozos se cambió mediante aspiración del medio viejo con una manguera de vacío y pipeteando el medio nuevo. Las placas con múltiples pozos utilizadas en esta invención vienen en un tamaño de 24 pozos separados (con insertos) por placa. De manera alterna, pueden utilizarse placas con múltiples pozos con un depósito del medio común, en oposición a uno separado. Las placas son envueltas típicamente con Nescofilm® o Parafilm™ , o se dejan sin envolver y se almacenan en incubadoras (27°C) de la misma manera que se hace con la selección con medio sólido. El hecho de que los pozos estén separados unos de otros, es particularmente benéfico, debido a que la contaminación bacteriana no se dispersa a otros explantes, como podría ser el caso en los depósitos comunes del medio, selección con líquido con fieltro, o selección con medio sólido. El vector pMON 68410 se utilizó para la transformación, y contiene el gen npt\\ como un marcador seleccionable y gfp como un marcador calificable. El tejido de callos de LH244 se utilizó como un explante. Los pasos de la transformación fueron los mismos como se describió en el Ejemplo 8. Los experimentos también se hicieron en las placas con múltiples pozos Costar con y sin diferentes matrices para proporcionar soporte al explante en el medio líquido. Se utilizaron perlas de vidrio, perlas de silicio, fieltro, espuma y medio sólido, con medio líquido adicional. Los tratamientos de control fueron: cultivo en medio sólido en cajas de Petri (tratamiento #1 ; Cuadro 1 ), y únicamente medio líquido en placas con múltiples pozos (tratamiento #2; Cuadro 1 ). Las diferentes matrices se utilizaron en cuatro experimentos por cuatro personas diferentes. Todos los tratamientos proporcionaron plantas transgénicas. Sin embargo, el uso de una matriz de perlas de silicio y los fieltros pequeños estuvo a la par con el tratamiento de control del cultivo en medio sólido en cajas de Petri.
CUADRO 1 Uso de las placas con múltiples pozos con y sin matrices para producir plantas de maíz transgénicas a partir de explantes de callos Tratamiento # Matriz/Medio # de piezas de callos %de TF por cada Experimento Experimento Experimento Experimento Total experimento 1 2 3 4 1 Gel/sólido en 48 39.6 50.0 50.0 25.0 41 .1 caja de Petri 2 Ninguno/Líquido 24 4.2 25.0 16.7 8.3 13.5 3 Perlas de 24 25.0 12.5 33.3 16.7 21 .9 vidrio/líquido 4 Perlas de 24 33.3 25.0 29.2 50.0 34.4 silicio/líquido 5 Fieltro 24 41 .7 25.0 54.2 29.2 37.5 pequeño/líquido 6 Espuma 24 0.0 16.7 0.0 4.2 5.2 7 Medio sólido 24 16.7 16.7 12.5 4.2 12.5 con medio líquido adicional El Cuadro 2 muestra que el sistema con múltiples pozos con (tratamiento # 3 a 5) y sin (tratamiento # 6) matrices, también puede utilizarse para producir plantas de maíz transgénicas, utilizando embriones inmaduros como explantes y glifosato como un agente selectivo. El vector pMON 92690 para este estudio, contenía los genes cp4 y gus. La transferencia del medio en los múltiples pozos se hizo en una base semanal.
CUADRO 2 Uso de placas con múltiples pozos con y sin matrices para producir plantas de maíz transgénicas a partir de explantes de embriones EJEMPLO 5 Uso de una sola caja de Petri con medio sólido, seguido por medio líquido Otro ejemplo de un sistema de un solo recipiente es el uso de una sola caja de Petri con un medio sólido, y agregar posteriormente medio líquido para facíltar la selección y regeneración en la única placa sin reemplazar el medio viejo. Los callos de maíz se obtuvieron e inocularon como se describe en el Ejemplo 7. Los callos se cocultivaron entonces en una caja de Petri profunda de 25 X 100 que contiene un papel filtro Whatman y 100 pL de medio 1/2 MSPL a 23°C. Después de 3 días, los callos se transfirieron al medio sólido 850QRT (4.33 g/L de sales de MS, 0.5 mg/L de tiamina HCI, 0.5 mg/L de piridoxina HCI, 0.5 mg/L de ácido nicotínico, 00 mg/L de mioinositol, 0.5 g/L de hídrolisado de caseína, 1.38 g/L de prolina, 30 g/L de sacarosa, 0.5 mg/L de 2,4-D, 10 pg/L de BAP, AgN03 20 µ?, 500 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de paromomicina, pH 5.8, 6 g/L de agar). Después de 14 días, 7-10 mL de medio 850QRTT fresco (850QRT sin el agar y con 200 mg/L de paromomicina), se agregaron y las placas se incubaron en luz tenue. Después de 14 días adicionales, 7-10 mL de medio 850RT fresco (4.33 g/L de sales de MS, 0.5 mg/L de tiamina HCI, 0.5 mg/L de piridoxina HCI, 0.5 mg/L de ácido nicotínico, 100 mg/L de mioinositol, 0.5 g/L de hídrolisado de caseína, 1.38 g/L de prolina, 30 g/L de sacarosa, 0.5 mg/L, 10 pg/L de BAP, 500 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de paromomicina, pH 5.8) se agregaron, y las placas se incubaron adicíonalmente en luz tenue. Después de otros 14 días, los brotes regenerados se transfirieron a medio 632AT (4.33 g/L de sales de MS, 0.5 mg/L de tiamina HCI, 0.5 mg/L de piridoxina HCI, 0.5 mg/L de ácido nicotínico, 50 mg/L de mioinositol, 60 g/L de sacarosa, 250 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de paromomicina, pH 5.8, 6 g/L de agar). Las plantas regeneradas se transfirieron a continuación a Phytatrays que contienen el mismo medio después de 14 días, y a continuación se transfirieron al suelo en 2 semanas. Las plantas seleccionadas y regeneradas en el medio sólido, produjeron aproximadamente 46% de plantas transformadas útiles, en comparación con 47% de plantas transformadas útiles del método de control utilizando medio líquido en un soporte de fieltro.
EJEMPLO 6 Transformación mediada por Agrobacterium de maíz utilizando un método de cultivo en suspensión novedoso Se conoce en la técnica que la generación de un cultivo en suspensión de células transformables es tardada, y con frecuencia resulta en la generación de células no embriogénicas. Este ejemplo describe un método altamente reproducible (referido en la presente como "cultivo en suspensión corto" o "SSC"), para producir un cultivo en suspensión rápido que es altamente embriogénico y muy competente para la transformación del gen mediada por Agrobacterium. El SSC como un explante, combina las características deseables de los callos (embriogén icos y fáciles de utilizar), y de los cultivos en suspensión (uniforme, altamente regenerable y susceptible para una producción de alto rendimiento). En este ejemplo no limitante, se empleó la neomicina fosfotransferasa II (npfll) como un marcador selecciónatele y un sistema de un vector binario estándar se utilizó para la selección y regeneración eficiente de los eventos transgénicos estables mediados por Agrobacterium en el maíz.
Cepa, plásmido y cultivo de Agrobacterium Se utilizó Agrobacterium tumefaciens desarmado EHA 101 que aloja el vector binario pMON25457 en este experimento. pMON25457 contiene los genes seleccionable (npfll) y reportero (u/dA), cada uno accionado por un promotor 35S mejorado ("e35S") y seguido por un intrón hsp70 no traducido. El gen uidA tiene un intrón adicional dentro de su secuencia codificante para reducir al mínimo la expresión bacteriana. Los plásmidos se introdujeron en la cepa de Agrobacterium mediante la electroporacion con un Pulsador Génico Bio-Rad operado a 2.5 kV y 400 Ohms. Las colonias transformadas se seleccionaron en medio de Luria-Bertani (LB) sólido (Sambrook y Russell, 2001 ), que contiene 100 mg/L de cada una de kanamicina y gentamicina.
Inducción y crecimiento de Agrobacterium Las células de Agrobacterium utilizadas para la transformación se preindujeron con acetosiringona (200 µ?) y glucosa (2%) en medio de inducción basado en AB MES 0.1 M, NaH2P04 0.5 mM, glucosa al 2%, 1 g/L de NH4CI, 300 mg/L de MgSO4«7H2O, 150 mg/L de KCI, 10 mg/L de CaCI2 anhidro, 2.5 mg/L de FeS04»7H20, pH ajustado a 5.4 con NaOH). Sigue un procedimiento general para inducir las células de Agrobacterium. Un asa de colonias bacterianas se recolectó de una placa fresca y se cultivó a 28°C en 50 ml_ de medio LB que contiene los antibióticos apropiados. La densidad óptica a 660 nm del cultivo bacteriano después de 15 a 24 horas de cultivo fue de aproximadamente 1 .4. Una alícuota de 10 mL de cultivo se transfirió en 50 mL de medio LB fresco, que contiene los antibióticos apropiados, y se cultivó durante 6 a 8 horas adicionales hasta una densidad óptica a 660 nm de aproximadamente 1 .2. Las células de Agrobacterium se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos a 3250x g. El granulo resultante se resuspendió en el medio de inducción hasta una densidad óptica final de 660 nm de aproximadamente 0.2 y se incubó a 28°C durante aproximadamente 12 a 15 horas. Antes del uso para la transformación, las células de Agrobacterium se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos a 3250x g. Después de decantar el sobrenadante, el gránulo se resuspendió en medio 1/2 MSVI (2.2 g/L de sal de MS (Gibco), 1 mL/L de una reserva 1000x de vitaminas MS, 15 mg/L de prolina, 10 g/L de glucosa, 20 g/L de sacarosa, pH 5.4, esterilizado con filtración), y suplementado con acetosiringona 200 µ?. Al menos 100 mL del medio 1/2 MS VI suplementado con acetosiringona 200 µ?, se utilizó para cada 1 L de suspensión de Agrobacterium. Se tomaron alícuotas de las células resuspendidas en volúmenes más pequeños, se centrifugaron a 4 grados C durante 10 minutos a 3250x g, el sobrenadante se descartó y los gránulos se almacenaron en hielo hasta el uso (hasta 4 horas). Los gránulos se resuspendieron a una densidad óptica deseada con medio 1/2 MS VI suplementado con acetosiringona 200 µ?, con una suspensión de aproximadamente 109 células/mL, que proporciona una densidad óptica a 660 nm de aproximadamente 0.2.
Cultivo de las plantas de reserva y formación de callos Los genotipos Hi-ll y FBLL de maíz se cultivaron en el invernadero a un día de 16 horas de duración. Se hicieron las cruzas que involucran estos genotipos y los embriones inmaduros se escindieron en un medio N6 modificado (Chu et al., 1976), suplementado con 1 .0 mg/L de 2,4-D, 1 mg/L de tiamina HCI, 0.5 mg/L de ácido nicotínico, 0.91 g/L de monohidrato de L-asparagina, 100 mg/L de mioinositol, 0.5 g/L de MES, 1.6 g/L de MgCI26H20, 100 mg/L de hidrolisado de caseína, 0.69 g/L de prolina y 20 g/L de sacarosa; el medio N6 modificado se solidificó con 2 g/L de Gelgro (número de catálogo 150180, ICN Biomedicals) y el pH del medio se ajustó a pH 5.8 con KOH (antes del autoclave). Las mismas condiciones de cultivo se utilizaron para el genotipo RBDQ2 selecto. El híbrido FBLL x Hi-ll y las líneas de callos RBDQ2 se subcultivaron a intervalos de 2 semanas y se mantuvieron a 28°C en la oscuridad, hasta durante meses en el mismo medio. Este protocolo de subcultivo también funcionó con las líneas Hi-ll y FBLL-MAB.
Formación del cultivo en suspensión corto (SSC) Sigue un protocolo general para generar el SSC a partir de callos. Para iniciar la formación del SSC, aproximadamente 2 g de callos, 2 semanas posteriores al subcultivo, se transfirieron a un matraz con deflectores de 250 mL, que contienen 80 mL de medio de Fromm MS suplementado con 2.0 mg/L de 2,4-D, 20 g/L de sacarosa, 150 mg/L de L-asparagina, 100 mg/L de mioinositol, 1 mL de reserva de vitaminas 1000x Fromm MS que contienen 650 mg/L de ácido nicotínico, 125 mg/L de piridoxina HCI, 125 mg/L de tiamina HCI y 125 mg/L de pantotenato de calcio (el pH del medio se ajustó a 5.8 con KOH). El SSC se generó en un agitador giratorio ajustado a 170 rpm y 28 grados C. Durante cada transferencia posterior, los tejidos se dejaron asentar brevemente en el fondo de los matraces, con el fin de eliminar los tipos celulares indeseables (por ejemplo, células que eran alargadas, con pared gruesa, bajas en contenido citoplásmico o que no se dividen), antes de que la suspensión se transfiriera con una pipeta desechable estéril Falcon™ de boca ancha. En el día 1 posterior al inicio, el tejido del matraz se transfirió a un matraz fresco que contiene 80 mL de medio MS modificado, y se cultivó durante dos días más; este paso de transferencia se repitió en el día 3 posterior al inicio. En el día 5 posterior al inicio, el tejido se dividió igualmente entre dos matraces, proporcionando aproximadamente 2.5 mL de un volumen celular empacado (PCV) por matraz. Posteriormente, el medio se reemplazó cada 3 días. Para el día 14 posterior al inicio, el volumen celular empacado resultante en cada matraz, fue de aproximadamente 6 mL (aproximadamente 4 g por matraz, o aproximadamente un incremento de cuatro veces en el PCV total en el transcurso de 2 semanas). Estas células ("SSC") se transfirieron a medio fresco en el día 14 posterior al inicio, y la transformación se inició en el día 15 posterior al inicio. El cambio relativamente frecuente del medio a través de este procedimiento SSC permitió una rápida proliferación del tejido. Una ventaja adicional del procedimiento SSC fue que no se requiere una selección visual de los tejidos en cada paso de transferencia, haciendo este sistema tanto práctico como reproducible.
Inoculación y cocultivo Tres matraces que contienen un total combinado de aproximadamente 18 mL de PCV se utilizaron en un estudio de transformación de explantes SSC híbridos FBLL x Hi-ll. Los experimentos piloto se realizaron para mejorar los parámetros involucrados en los varios pasos de transformación. Se utilizó una técnica de cocultivo modificada, como se describe por Cheng et al. (2003), que se incorpora en la presente como referencia. Se empleó un paso de desecación posterior a la infección con Agrobacterium, que se encontró que incrementa en gran medida la transferencia del T-ADN, así como que incrementa la recuperación de los eventos transgénicos. El tejido SSC Híbrido FBLL x Hi-ll de cada matraz junto con algún medio líquido se dividió igualmente y se transfirió a dos pozos de un recipiente de cultivo de tejido de seis pozos (Corning CoStar™ , no tratado, número de parte 9088), o, de manera alterna, a una caja de Petri de 20 X 60 mm. El medio líquido se retiró de cada pozo o recipiente. Se agregaron cinco mL de suspensión de Agrobacterium (OD660 nm -0.5) en medio 1 /2 MS VI suplementado con acetosiringona 200 µ? a cada pozo o recipiente, seguido por un periodo de inoculación de 1 hora. Al final de periodo de inoculación, la mayoría de la suspensión de Agrobacterium se retiró suavemente y las células SSC inoculadas se lavaron con 5 mL de medio 1/2 MS VI suplementado con acetosiringona 200 µ?. Las células de cada pozo o recipiente se transfirieron a una caja de Petri que contiene 3 capas de papel filtro estéril para absorber el exceso de líquido de las células, y a continuación se dividieron igualmente y se transfirieron a dos cajas de Petri de 60 X 20 mm, cada una que contiene una pieza de un papel filtro estéril de 5.5 cm de diámetro (Baxter). Un total de 12 recipientes de cocultivo que contienen papel filtro se obtuvieron así (4 de cada matraz original). Las células transferidas se arreglaron en 6 a 8 aglomerados en el papel filtro. Se realizó un cocultivo de un día bajo desecación, utilizando el protocolo modificado de Cheng et al. (2003), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Se agregaron cien pL de medio 1/2 MS VI suplementado con acetosiringona 200 µ? a cada papel filtro, y las placas se envolvieron con Parafilm™ y se incubaron en la oscuridad a 23 grados C. La frecuencia de la transformación se calculó como el número de eventos independientes regenerados por mL de PCV. Los experimentos de transformación se realizaron de manera similar con los explantes SSC RBDQ2, utilizando tres volúmenes de células empacadas replicados (4.5 ml_ cada uno). El procedimiento de transformación fue generalmente el mismo que aquél utilizado con los explantes SSC híbridos FBLL x Hi-ll, excepto que, para uno de los dos pozos por matraz, se utilizó medio 1/2 MS VI suplementado con acetosiringona 200 µ? y que contiene AgNÜ3 20 µ? durante los pasos de inoculación y lavado.
Selección y regeneración de las plantas transgénicas El protocolo para la transformación de SSC con nptll utilizando la selección con paromomicina involucró un soporte de papel simple para transferir los explantes durante la selección, lo cual redujo al mínimo el trabajo, aseguró una eliminación rápida de Agrobacterium, incrementó la velocidad de crecimiento del tejido y resultó en una selección más rápida. Este procedimiento se realizó en SSC híbrido FBLL x Hi-ll como sigue. En el día 0 de la transformación (esto es, al final del paso de cocultivo), se llevó a cabo un paso de lavado con 5 mL de medio de Fromm MS suplementado con 1000 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, 100 mg/L de vancomicina, y AgNO3 40 mM, que se agregó directamente a cada una de las placas de cocultivo, y los aglomerados celulares se golpearon suavemente utilizando una espátula estéril para asegurar la sumersión. El medio de lavado se retiró de las placas, y los papeles filtro que portan las células se transfirieron a cajas de Petri que contienen el medio de "D" de Duncan sólido fresco, que contiene 3.0 mg/L de 2,4-D suplementado con 1000 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, y AgNO3 40 micromolar como un medio de retardo. El medio "D" de Duncan contiene sales básales y vitaminas del medio "D" como se describe por Duncan et al. ( 1985), que se incorpora como referencia en la presente; generalmente, 500 ml_ de una reserva 2X de este medio se prepararon y agregaron a 500 mL de agua destilada estéril sometida a autoclave que contiene 6 g de Phytagar. Las células se mantuvieron en medio de retardo durante 6 d ías. En el día 6 de la transformación, se realizó un primer paso de selección con los papeles filtro que portan las células transferidos a cajas de Petri que contienen medio "D" de Duncan con 1 .5 mg/L de 2,4-D suplementado con 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, AgNO3 40 micromolar y 50 mg/L de paromomicina como un primer medio de selección. Dos semanas después del final de paso de cocultivo, se realizó un segundo paso de selección con los papeles filtro que portan las células transferidos a las cajas de Petri que contienen medio "D" de Duncan con 1 .5 mg/L de 2,4-D suplementado con 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, AgNO3 40 micromolar, y 100 mg/L de paromomicina como un segundo medio de selección. Tres semanas después del final del paso de cocultivo, se realizó un tercer paso de selección con aglomerados de tejido del tamaño de un chícharo, retirados de cada papel filtro y emplacados en un medio "D" de Duncan sólido con 1 .5 mg/L de 2,4-D suplementado con 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, y 100 mg/L de paromomicina como un tercer medio de selección. Hubo aproximadamente 4 a 6 aglomerados de células resultantes emplacados de cada papel filtro, y en adelante, cada aglomerado celular se trató de manera individual en los experimentos. Un aglomerado emplacado por papel filtro se probó histoquímicamente para el tamaño del sector transgénico, que se encontró que es de aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro. Cuatro semanas después del paso de cocultivo, se realizó un cuarto paso de selección con cada aglomerado transferido a cajas de Petri que contienen el medio "D" de Duncan suplementado con 1 .5 mg/L de 2,4-D suplementado con 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, y 100 mg/L de paromomicina. Al final de este cuarto ciclo de selección, se obtuvo un total de 232 líneas híbridas FBLL x Hi-ll resistentes a la paromomicina. Siete semanas después del final del paso de cocultivo, se llevó a cabo un paso de selección y prerregeneración con los callos resistentes transferidos a cajas de Petri profundas (20 X 100 mm), que contienen 3.52 mg/L de 6-BAP, 500 mg/L de carbenicilina, y 100 mg/L de paromomicina durante una semana. Finalmente, los tejidos regenerantes se transfirieron a un medio de regeneración MS durante dos semanas en cajas de Petri, seguido por la transferencia a una Phytatray durante tres semanas adicionales. El medio de regeneración MS consistió de medio MS modificado suplementado con 10 g/L de glucosa, 20 g/L de sacarosa, 100 mg/L de mioínositol, 150 mg/L de L-asparagina, y 1 mL/L de reserva de vitaminas 1000x de Fromm MS que contienen 650 mg/L de ácido nicotínico, 125 mg/L de piridoxina HCI, 125 mg/L de tiamina HCI, y 125 mg/L de pantotenato de calcio, y 6 g/L de Phytagar; el pH del medio se ajustó a 5.8 con KOH antes del autoclave, y 250 mg/L de carbenicilina y 100 mg/L de paromomicina se agregaron posteriores al autoclave. Trece semanas después del final del paso de cocultivo, las plántulas resultantes se transfirieron al suelo.
Análisis de la progenie de las plantas transgénicas La actividad uidA se probó a varias etapas de la selección y la transformación, siguiendo el procedimiento histoquímico descrito por Jefferson ( 1987), que se incorpora como referencia en la presente, a varias etapas de la transformación y el cultivo de las plantas. La detección y el análisis del número de copas de nptll se realizó con ensayos INVADER® (Third Wave Technologies, Madison, Wl). Al menos bajo las condiciones experimentales descritas anteriormente, se encontró que un paso de retardo seguido por un incremento paso a paso en la presión de la selección, es necesario para recuperar los sectores transgénicos de los explantes SSC. En general, se encontró que la competencia de la transformación mediada por Agrobacterium de las células de maíz mejoró incorporando los callos a al menos una fase liquida corta antes de iniciar la transformación. Por ejemplo, se encontró que los explantes SSC híbridos FBLL x Hi-ll son altamente competentes a la transferencia de T-ADN entre aproximadamente 5 días a aproximadamente 14 días posteriores al inicio de SSC con 80% de los tejidos que expresan a gus a los 3 días postransformación. Se encontró que los cultivos SSC más antiguos (2 meses), son competentes para la transformación, con aproximadamente 20% de los explantes que exhiben la tinción histoquímica para la actividad de uidA 3 días postransformacíón. En contraste, se encontró que los callos híbridos FBLL x Hi-ll mantenidos en medio N6 modificado con 21 1 son competentes de manera deficiente, con menos del 20% de los explantes que exhiben tinción histoquímica para la actividad UidA 3 días postransformación. En el caso del genotipo híbrido FBLL x Hi-ll, se obtuvo un total de 232 líneas resistentes a la paromomicina de los tres matraces originales. De 76 líneas de callos resistentes probadas, se encontró que 56 (aproximadamente 74%) expresan a uidA. Un subconjunto de 35 líneas resistentes a la paromomicina se regeneró; de éstas, se encontró que 24 de 25 eventos que se regeneraron en plantas contienen a uidA. Los ensayos Southern e histoquímicos de plantas que surgen de varios experimentos SSC, confirmaron la integración del transgen en la generación R1 , y la herencia de los transgenes por las generaciones R0 y R1 . En el caso del genotipo RBDQ2, 3 matraces replicados (cada uno que contiene aproximadamente 4 mL de PCV), proporcionaron un total de 37 eventos putativos resistentes a la paromomicina, positivos a uidA. La frecuencia de la transformación se subestimó debido a que algunos tejidos se sacrificaron para los ensayos histoquímicos de UidA. En este genotipo, el uso de AgNO3 durante la inoculación o el lavado, no mejoró la frecuencia de la transformación, sugiriendo que la supresión del crecimiento de Agrobacterium por la desecación fue suficiente para reducir al mínimo la toxicidad del Agrobacterium. Se generaron un total de 29 callos putativos resistentes a la paromomicina, de los cuales 18 eventos putativos se transfirieron al suelo. Se encontró que diecisiete de los 18 eventos eran positivos a uidA mediante los ensayos histoquímicos del tejido de la hoja. Así, la frecuencia de la transformación de SSC RBDQ2 (basándose en los eventos putativos), se estimó como de aproximadamente 1 .4 eventos/1 mi de PCV (17 eventos/12 ml_ de PCV). Este procedimiento SSC fue capaz por lo tanto, de establecer rápidamente cultivos en suspensión del tipo II regenerables, adecuados para la transformación estable mediada por Agrobacterium, para los genotipos del híbrido FBLL x Hi-ll y RBDQ2 élite patentado. Los explantes SSC pueden ser especialmente útiles en el desarrollo de un sistema de evaluación del gen de alto rendimiento.
EJEMPLO 7 Preparación del Agrobacterium para la transformación mediante la inoculación directa de una reserva de glicerol congelada con Agrobacterium en un medio de inducción Este es un ejemplo no limitante de un método para preparar el Agrobacterium para la transformación. De manera más específica, este ejemplo describe la inoculación directa de una reserva de glicerol congelada con Agrobacterium en caldo de inducción vir. La transferencia del T-ADN en las células de planta utilizando el plásmido Ti requiere la activación de los genes vir que codifican las proteínas VirA y VirG. Las señales para la activación de VirA incluyen, por ejemplo, pH ácido, compuestos fenólicos (por ejemplo, acetosiringona), y ciertos azúcares que actúan de manera sinergística con los compuestos fenólicos. De manera convencional, la preinduccion de los genes vir involucra el cultivo de las células de Agrobacterium (usualmente de una reserva congelada), en un medio de crecimiento durante un periodo de tiempo variable, medir la densidad de Agrobacterium, ajustar a una densidad deseada, cultivar en medio de inducción mínimo AB u otro medio adecuado para la inducción, centrifugar y lavar las células, y finalmente ajustar el cultivo de Agrobacterium a una densidad deseada antes de la inoculación. El número de pasos involucrados requiere un tiempo y esfuerzo considerables, y proporciona oportunidades para una variabilidad indeseada en los experimentos. Se describe en la presente, un procedimiento rápido de inducción directa con Agrobacterium de un solo paso, que reduce el tiempo, esfuerzo y variabilidad en los experimentos de transformación. La reducción en el número de pasos requeridos para la inducción también es ventajosa para propósitos de control de calidad y la reducción de la carga ergonómica. En las modalidades no limitantes descritas en la presente, se utilizó el vector pMON 70801 que porta un gen (cp4) para la resistencia al glifosato (véase la Patente de E.U.A. 5,633,435, que se incorpora como referencia en su totalidad en la presente); sin embargo, muchos otros vectores de Agrobacterium pudieron utilizarse, como se conoce en la técnica. Las densidades ópticas (OD), se midieron a 660 nanómetros. Los procedimientos adecuados adicionales, incluyendo las descripciones del medio y los reactivos, para la transformación de plantas utilizando la selección con glifosato, se han descrito, por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. 2004/0244075, de Cai et al. , que se incorpora como referencia en su totalidad en la presente.
Inducción directa con medio de inducción MS modificado En una modalidad no limitante, el procedimiento puede involucrar la preinducción de una reserva de glicerol con Agrobacterium congelada en un medio de inducción MS que contiene los componentes de inducción vir necesarios. Después de la preinducción, las células de Agrobacterium se utilizaron directamente en los experimentos de transformación. El Agrobacterium se cultivó de una reserva congelada hecha con medio MS (sales de ½MS, MES 100 µ?, glucosa al 2% con 25% (volumen/volumen) de glicerol). La reserva congelada hecha con las sales de MS se resuspendió en un caldo de inducción MS modificado que contiene acetosiringona (sales de ½MS, MES 100 µ?, glucosa al 2% suplementada con antibióticos apropiados (Espec/Estrep 50 pg/mililitro, Kanamicina 50 pg/mililitro, y Cloramfenicol 25 microgramos/mililitro, y acetosiringona 200 µ?). Siguió un total de 5 horas de inducción con una OD inicial de 0.4. Para la inducción, se utilizó un matraz (matraz con deflectores de 250 ml_), con 50 mililitros del medio de inducción. Al final de la inducción, la suspensión de Agrobacterium se utilizó directamente para la inoculación y se suplemento con AgNÜ3 20 µ? justo antes de la inoculación.
El protocolo de inducción directa con MS modificado descrito anteriormente, se comparó con un protocolo convencional que involucra los siguientes pasos: el Agrobacterium se cultivó de una reserva congelada durante 8 horas en líquido LB con los antibióticos apropiados (Espec/Estrep 100 microgramos/mililitro, kanamicína 100 microgramos/mililitro, y cloramfenicol 25 microgramos/mílílitro). El Agrobacterium se centrifugó y se resuspendió en un caldo de inducción mínimo AB con los antibióticos apropiados (Espec/Estrep 50 microgramos/mililitro, kanamicína 50 microgramos/mililitro, y cloramfenicol 25 microgramos/mililitro), y acetosiringona 200 micromolar. Siguió un total de 13 horas de inducción con una OD inicial de 0.2. Para la inducción, se utilizó un matraz (matraz con deflectores de 1 litro), que contiene 300 mililitros de medio de inducción. Al final de la inducción, el Agrobacterium se centrifugó y resuspendió con 1/2MSVI suplementado con acetosiringona 200 micromolar a una OD de 0.4. Se agregó AgNO3 a una concentración final de 20 micromolar justo antes de la inoculación. Los explantes para este estudio fueron callos derivados de una línea de maíz casi élite subcultivada en un medio fresco 8 días antes del inicio de la transformación en medio 201 basado en N6. La inoculación se realizó en recipientes profundos de 25x100 milímetros. Aproximadamente 6 gramos de callos se transfirieron a un recipiente profundo que contiene 50 mililitros de 1/2 MS VI (un recipiente por tratamiento). Los explantes se lavaron y todo el líquido se retiró. Veinte mililitros de suspensión de Agrobacterium (OD 0.4) suplementada con acetosiringona (concentración final 200 micromolar) y AgNO3 (concentración final de 20 micromolar), y se realizó una inoculación de 1 hora. La suspensión de Agrobacterium se retiró después de la inoculación, y los explantes se lavaron con 15 mililitros de un medio ½ MSVI suplementado a una concentración de AgN03 20 micromolar y acetosiringona 200 micromolar. Los callos de cada recipiente de inoculación se transfirieron a un recipiente profundo que contiene 10 papeles filtro (7.5 milímetros; número de catálogo Baxter 28313-046) para retirar el exceso de líquido. Aproximadamente 0.5 gramos (peso húmedo) o aproximadamente 2.5 gramos (peso drenado) de callos se transfirieron a una sola placa de cocultivo (25 x 60 milímetros), que contiene un solo papel filtro (5.5 milímetros; número de catálogo Baxter 28297-868). Los explantes se colocaron en cuatro grupos hacía el borde de la placa de cocultivo. El cocultivo se realizó con o sin desecación (se agregó 1 mililitro de V2 MSVI) a 23°C durante 18 horas. Para cada tratamiento, es decir, la inducción convencional o la inducción con MS modificado, se utilizaron siete replicas (4 sin desecación, 3 con desecación). No se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los dos protocolos de inducción. El protocolo de inducción directa con MS modificado mostró producir aproximadamente el número de eventos putativos que el protocolo convencional más largo.
Inducción directa con medio de inducción AB En otra modalidad no limitante, el procedimiento involucró la preinducción de una reserva de glicerol con Agrobacterium congelada, en un medio de inducción AB que contiene los componentes de inducción vir n necesarios. Después de la preinducción, las células de Agrobacterium se ajustaron a la densidad deseada y se utilizaron directamente en los experimentos de transformación. El Agrobacterium se cultivó de una reserva congelada de LB regular con una densidad óptica (OD) de Agrobacterium de 3.0 medida a 660 nanómetros (concentración final). Se preparó un cultivo de Agrobacterium y se dividió en dos porciones. Una porción se cultivó durante 4.5 horas adicionales a una OD -0.6 en 36 mililitros de medio 2XYT, se centrifugó, se resuspendió a una OD -3.0 en medio mínimo AB que contiene glicerol al 20%, y se congeló para utilizarse en un protocolo de inducción directa. Para la inducción, 5 mililitros de la reserva congelada se descongelaron, se agregaron a 70 mililitros de medio mínimo AB que contiene acetosiringona, y se indujeron durante la noche. La segunda porción del cultivo de Agrobacterium se veteó en placas y se incubó 3 días; un primer cultivo de siembra preparado de estas placas se cultivó durante la noche. Esto fue seguido por un segundo cultivo de siembra preparado del primer cultivo de siembra, cultivado durante un día e inducido durante la noche a una OD -0.2 en un medio mínimo AB que contiene acetosiringona. Las dos preparaciones de Agrobacterium inducidas se utilizaron para inocular embriones de maíz en experimentos paralelos. Los embriones de maíz de la mitad de cada espiga se escindieron en cada una de las preparaciones de Agrobacterium (OD -1.0) durante 15 minutos, y a continuación se dejaron asentar durante 5 minutos. Los embriones se retiraron y colocaron en placas de cocultivo. Utilizando el protocolo convencional, un total de 883 embriones se inocularon, resultando en un total de 174 (20%) plantas al suelo y una frecuencia de transformación promedio de 17% (desviación estándar = 1 1 .4). Utilizando el protocolo de inducción directo, un total de 814 embriones se inocularon, resultando en un total de 153 (19%) plantas al suelo y una frecuencia de transformación promedio de 19% (desviación estándar = .6). Se encontró que el número de copias del transgen cp4 es similar entre los tratamientos.
EJEMPLO 8 Métodos para preparar callos de maíz para el subcultivo mediante medios mecánicos Uno de los procedimientos con mayor carga ergonómica y tardado de un sistema de producción de transformación del maíz es el establecimiento y mantenimiento de los callos embriogénicos para la transformación mediada por Agrobacterium, que requiere el rompimiento manual de los callos durante el paso de subcultivo. Además, durante el procedimiento de transformación, muchas células se transforman en un solo embrión inmaduro o una sola pieza de callo. Sin embargo, las prácticas actuales de selección y regeneración tratan cada población de células transformadas en un solo embrión inmaduro o pieza de callo como un solo evento, regenerando usualmente una planta por pieza de tejido. Con el fin de aliviar la carga ergonómica creada por la captación manual mediante pinzas de los callos, especialmente los callos del tipo I, varios medios mecánicos tales como trituradores de café, molinos para comida de bebe, trituradores de granos de pimienta, trituradores de hierbas, cortadores de ajos y cuchillos para guarnición, se probaron como un medio para romper o cortar los callos para el subcultivo. Entre estos medios, se encontró que el triturador de hierbas y el cuchillo para guarnición son los más adecuados para romper o cortar los callos y para producir piezas de callos adecuados para el subcultivo y la transformación. El uso de medios mecánicos para preparar los callos de maíz para el subcultivo, también puede utilizarse para separar muchas células transformadas dentro de una unidad dada de tejido, cortando o rompiendo el tejido en unidades más pequeñas de células transformadas individualmente, de las cuales una planta transformada puede regenerarse, obteniendo asi más plantas transgénicas de la misma unidad de tejido. Los callos para este ejemplo se derivaron cultivando los embriones de maíz inmaduros en medio para callos 1074 (Cuadro 3), que se aislaron de granos en desarrollo aproximadamente 10 días después de la polinización. Los callos de cinco a nueve semanas se trataron con un triturador de hierbas y se pusieron en contacto con Agrobacterium que contiene un vector que porta al gen nptil para la selección hasta por 60 minutos. Los callos inoculados se secaron y se cocultivaron/desecaron durante 2-3 días a 23°C en la oscuridad. El tejido de los callos se transfirió entonces a piezas de fieltro en el medio de selección líquido 1086 (Cuadro 3), que contiene aproximadamente 50 mg/L de paromomicina y se cultivaron hasta por 30 días a 27-28°C en la oscuridad, para seleccionar el tejido transformado que contiene el gen marcador selecciona le npt\\. El tejido transformado se regeneró entonces en plantas cultivando el tejido que sobrevive a la selección en el medio para los brotes 1087 (Cuadro 3), que contiene BAP para inducir los brotes durante 5-7 días a 27-28°C en 16 horas de luz. El tejido que crece se incubó en medio 1067 (Cuadro 3) durante 2-3 semanas adicionales para inducir las raíces. Los brotes sanos con o sin raíces se transfirieron a Phytatrays que contienen medio 1067 y posteriormente al suelo para el cultivo.
CUADRO 3 Composiciones del medio utilizado Componentes del medio/L (Proveedor) 1074 1086 1087 1067 Sales básales de MS (Phytotech) 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 Vitaminas MS (100X) (Phytotech) 10 mL 10 mL 0 0 Vitaminas Fromm MS (1000X)* 0 0 1 mL 1 mL BAP (Sigma) 0 0 3.5 mg 0 Tiamina HCL (Sigma) 0.5 mg 0.5 mg 0 0 2,4-D (Phytotech) 0.5 mg 0.5 mg 0 0 Sacarosa (Phytotech) 30 g 30 g 30 g 0 Glucosa (Phytotech) 0 0 0 10 g Maltosa (Phytotech) 0 0 0 20 g Prolina (Sigma) 1 .38 g 1.38 g 1 .38 g 0 Casaminoácidos (Difco) 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0 Monohidrato de asparagina (Sigma) 0 0 0 0.15 g Mioinositol (Sigma) 0 0 0 0.1 g Phytagel (Sigma) 3 g 0 3 g 0 Phytagar (Gibco) 0 0 0 6 g Carbenicilina (Phytotech) 0 500 mg 250 mg 250 mg Picloram (Sigma) 2.2 mg 2.2 mg 0 0 Paromomicina (Phytotech) 0 100 mg 100 mg 100 mg Nitrato de plata (Sigma) 3.4 mg 3.4 mg 0 0 pH 5.8 5.8 5.8 5.8 comprende 1250 mg/L de ácido nicotínico (Sigma), 250 mg/L de piridoxina HCI (Sigma), 250 mg/L de tiamina HCI (Sigma), y 250 mg/L de pantotenato de calcio (Sigma).
Los resultados indican que el triturador de hierbas puede utilizarse de manera exitosa para romper los callos en piezas adecuadas para el subcultivo y la transformación (Cuadro 4).
CUADRO 4 Uso del triturador de hierbas para romper las piezas de callos para el subcultivo y la transformación No. de piezas de Gramos de callos callos puestas para No. de plantas Experimento Tratamiento y descripción utilizados la selección producidas TF (%) 1 . Escindidos a mano, subcultivados a mano 2.5 192 53 27.6 2. Escindidos a mano, subcultivados de manera 1 mecánica 2.5 185 39 21 .1 1 . Escindidos a mano, subcultivados a mano 1 .5 144 9 6.3 2. Escindidos a mano, subcultivados de manera 2 mecánica 1 .5 1 16 17 14.7 Un cuchillo para guarnición (Rebanador de Pepinillos, #4428 de International Culinary, Mystic, CT), también se utilizó como un medio para cortar los callos para reducir la carga ergonómica de los métodos de subcultivo a mano. El cuchillo para guarnición consistió de 8 hojas paralelas unidas a un extremo de un mango de plástico. El cuchillo se esterilizó con un remojo en blanqueador suave, seguido por un remojo en etanol, y a continuación se dejó secar durante aproximadamente 30 minutos. Mientras el cuchillo se estaba secando, los callos de 4 semanas de edad (subcultivados a mano a las 2 semanas), se colocaron en una caja de Petri de 150 x 15 mm, y se dividieron en 3 a 4 pilas más pequeñas dentro del recipiente, cada una que contiene aproximadamente 40-60 piezas de callos. Trabajando con una pila a la vez, el cuchillo se utilizó para cortar a través de los callos. Con un implemento estéril, los callos que se habían recolectado entre las hojas se sacaron del cuchillo a la placa, en donde se cortaron una segunda vez. Otras pilas de callos se trataron de la misma manera. Los callos cortados se utilizaron para el subcultivo y la transformación. Los datos de varios experimentos con cuchillos para guarnición mostraron una frecuencia de la transformación de 13.16%. En pruebas adicionales, la frecuencia de la transformación de los callos subcultivados a mano de 21 .5% fue comparable con los callos preparados con el cuchillo para guarnición (18.9%). En aún otros 74 experimentos que utilizan un cuchillo para guarnición como un medio para cortar los callos, por 5 usuarios diferentes, las frecuencias de la transformación promedio en todos los usuarios fue de 19.4%, indicando la utilidad de este método.
EJEMPLO 9 Métodos para inocular los explantes con Agrobacterium para la transformación Los métodos actuales para la transformación mediada por Agrobacterium, por ejemplo, de embriones inmaduros de maíz, utilizan muchos pasos que involucran escindir un embrión a la vez de los granos, incubarlos en una suspensión de Agrobacterium, retirar la suspensión de Agrobacterium, transferir los embriones a una placa de cocultivo para que ocurra la infección, orientar los embnones y colocarlos con el lado del escutelo hacia arriba, y finalmente transferir los embriones a un medio de selección o de retardo para las manipulaciones adicionales, tales como la selección y la regeneración. Muchos de estos pasos son ergonómicamente hostiles, y también pueden causar la posibilidad de dañar los embriones escindidos y una incidencia incrementada de muerte de las células relacionadas con Agrobacterium, resultando por lo tanto en una frecuencia de la transformación reducida. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de la transformación del maíz, de simplificar el paso de inoculación, de manera que sea ergonómicamente amigable y resulte en una frecuencia de la transformación más alta.
Los inventores han simplificado ahora el paso de inoculación reduciendo el número total de pasos, inoculando los explantes transformables, por ejemplo, el embrión inmaduro, mediante 1 ) sumergir una espátula en la suspensión de Agrobacterium antes de escindir el embrión con la espátula; 2) remojar la espiga de maíz con la suspensión de Agrobacterium antes de escindir el embrión; o 3) combinar los dos pasos, por ejemplo, remojando la espiga de maíz con una suspensión de Agrobacterium, seguido por la escisión de los embriones por una espátula sumergida en la suspensión de Agrobacterium. En general, se utilizó el siguiente método de transformación. Los embriones de maíz inmaduros de una línea de maíz receptora se disecaron de granos en desarrollo aproximadamente 10 días después de la polinización y se inocularon mediante incubación, espátula sumergida (18.0%), o remojando la espiga con Agrobacterium que contiene el constructo. Los embriones inoculados se cocultivaron en medio de cocultivo 1514 (Cuadro 5) durante aproximadamente 24 horas a 23°C en la oscuridad. Los embriones se transfirieron entonces para la selección en medio de selección 1278 (Cuadro 5), que contiene glifosato 0.1 mM para seleccionar el tejido transformado que contiene el gen marcador seleccionable cp4 y 500 mg/L de Carbenicilina para inhibir el crecimiento de Agrobacterium, incubando durante 2-3 semanas a 27°C en la oscuridad. El tejido de maíz transformado se regeneró entonces en plantas, transfiriendo las piezas de callos transformados en el primer medio de regeneración 1073 (Cuadro 5) y se cultivó durante 5-7 días con un fotoperiodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad y 27°C de temperatura. El tejido se transfirió entonces al segundo medio de regeneración 1071 (Cuadro 5) durante aproximadamente 2 semanas. Los brotes regenerados se transfirieron al medio de enraizamiento 1084 (Cuadro 5) en Phytatrays. Las plántulas en desarrollo se transfirieron entonces al suelo, se endurecieron en una cámara de cultivo a 27°C, 80% de humedad, y a baja intensidad de luz, durante aproximadamente 1 semana, y a continuación se transfirieron a un invernadero y se cultivaron bajo las condiciones estándar del invernadero. El plásmido que porta Agrobacterium pMON 92689, que contiene un gen aroA CP4 modificado para la selección con glifosato (Patente de E.U.A. 5,627,061 ), se cultivó para la inoculación de una reserva congelada hecha con medio de inducción S, como se describió en el Ejemplo 7. Los granos en la mazorca se esterilizaron con etanol al 80% y se cortaron en la corona, y a continuación se lavaron con 100 mi de ½ MSVI y se les aplicaron 20 mi de suspensión de Agrobacterium. Una espátula se sumergió en la suspensión de Agrobacterium y los embriones inmaduros se escindieron y emplacaron en el medio de cocultivo 1514 durante 24 horas a 23°C en la oscuridad. Estos tratamientos se compararon con un tratamiento estándar, en donde los embriones se escindieron uno a la vez, y se incubaron con suspensión de Agrobacterium hasta por 5 minutos. El tamaño del embrión fue de 1.5-1 .8 mm. Sin embargo, se encontró que el método funciona bien con otros tamaños de embriones también, por ejemplo, tamaños de embriones que varían de 1.4 a 2.2 mm. Los eventos transgénicos pueden obtenerse inoculando directamente los explantes con Agrobacterium, mientras que los explantes están todavía unidos al tejido materno, e inoculando los explantes mientras se retiran de la fuente. Se obtuvieron las siguientes frecuencias de transformación para cada tratamiento: inoculación mediante incubación (20.7%), inoculación mediante espátula sumergida (18.0%), e inoculación remojando la espiga (17.0%). Otros medios para poner en contacto los explantes con Agrobacterium y la duración del contacto pueden anticiparse por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse un cuchillo sumergido en suspensión de Agrobacterium para la inoculación, cortando el tejido de la hoja o los callos en piezas más pequeñas o puede utilizarse una aguja sumergida para inocular el tejido de la planta, insertando la aguja en el tejido de la planta. Se ha encontrado que el método mejora la frecuencia de la transformación, permitiendo una manipulación del tejido reducida y una muerte celular relacionada con Agrobacterium reducida. Con 6 diferentes constructos, el método con la espátula sumergida produjo una TF promedio de 14.3% con respecto al método de incubación estándar que produjo una TF de 9.2%.
CUADRO 5 Composiciones del medio utilizado Componentes del medio/L (Proveedores) 1233 1278 1514 1524 1073 1071 1084 Sales básales de MS (Phytotech) 2.165 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 2.165 g Vitaminas MS (100X) (Phytotech) 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 0 0 0 Vitaminas Fromm MS (1000X)* 0 0 0 0 1 mL 1 mL 0 BAP (Sigma) 0 0.01 mg 0 0 3.5 mg 0 0 Tiamina HCL (Sigma) 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg 0 0 0 2,4-D (Phytotech) 3 mg 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg 0 0 0 NAA (Sigma) 0 0 0 0 0 0 0.5 mg IBA (Sigma) 0 0 0 0 0 0 0.75 mg Sacarosa (Phytotech) 20 g 30 g 30 g 30 g 30 g 0 20 g Glucosa (Phytotech) 10 g 0 0 0 0 10 g 0 Maltosa (Phytotech) 0 0 0 0 0 20 g 0 Prolina (Sigma) 1 15 mg 1 .38 g 1 .38 g 1 .38 g 1 .38 g 0 0 Casaminoácidos (Difco) 0 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.05 g 0.5 0 Monohidrato de asparagina (Sigma) 0 0 0 0 0 0.15 0 Mioinositol (Sigma) 0 0 0 0 0 0.1 g 0 Agarosa baja en EEO (Sigma) 5.5 g 0 0 0 0 0 0 Componentes del medio/L (Proveedores) 1233 1278 1514 1524 1073 1071 1084 Phytagel (Sigma) 0 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g Acetosiringona (Aldrich) 200 uM 0 0 0 0 0 0 500 Carbenicilina (Phytotech) 500 mg 500 mg 500 mg mg 250 mg 250 mg 0 0.1 Glifosato (Gateway Chemical) 0 0.1 mM 0.1 mM mM 0.1 mM 0.1 mM 0.1 mM Nitrato de plata (Sigma) 3.4 mg 3.4 mg 3.4 mg 3.4 mg 0 0 0 pH 5.2 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 "Comprende 1250 mg/L de ácido nicotínico (Sigma), 250 mg/L de piridoxina HCI (Sigma), 250 mg/L de tiamina HCI (Sigma), y 250 mg/L de pantotenato de calcio (Sigma). Para el medio líquido, el Phytagel se excluyó de la composición.
EJEMPLO 10 Transformación mediada por Agrobacterium de maíz al realizar la inoculación, cocultivo y selección en un solo paso Normalmente, los métodos de transformación mediados por Agrobacterium involucran 3 diferentes pasos: inoculación de un explante con Agrobacterium, cocultivo del explante inoculado en un medio ausente de un antibiótico, para permitir la supervivencia del Agrobacterium y mejorar la infección del explante, y la selección de la célula transformada en un medio que contiene un agente selectivo, tal como kanamicina y glifosato. Existe siempre la necesidad de reducir el número de pasos requeridos en un método de transformación para mejorar las eficiencias de la producción. Los inventores han proporcionado ahora, un método para la transformación mediada por Agrobacterium del maíz, en donde los pasos de inoculación, cocultivo y selección pueden combinarse en un solo paso, emplacando los explantes inoculados directamente en un medio que contiene los agentes selectivos, para suprimir el crecimiento de Agrobacterium, y destruir las células del explante no transformadas, permitiendo por lo tanto la inoculación, cocultivo y selección en un solo paso, mejorando así las eficiencias del sistema de producción de la transformación. En general, se utilizó el método de transformación descrito en el Ejemplo 9. El Agrobacterium que contiene pMON65375, que contiene un gen aroA CP4 modificado para la selección con glifosato (Patente de E.U.A. 5,627,061 ) para la inoculación, se preparó a partir de una reserva congelada hecha en medio de inducción mínimo AB, como se describió en el Ejemplo 7. La espátula se sumergió en la suspensión de Agrobacterium antes de escindir cada embrión y los embriones escindidos se emplacaron en medio de cocultivo 1233 y a continuación en el medio de selección 1278 o se emplacaron directamente en el medio de selección 1278. Los resultados muestran que la transformación puede hacerse combinando la inoculación, cocultivo y selección en un solo paso, con una variedad de concentraciones de Agrobacterium y tamaños del embrión. En otra modalidad, la transformación también puede lograrse cultivando primero los embriones en un medio de selección, y a continuación aplicando la suspensión de Agrobacterium inmediatamente a los embriones, más que aplicar primero al Agrobacterium, y a continuación cultivar los embriones en el medio de selección. También pueden obtenerse plantas transgénicas aplicando Agrobacterium adicional durante el cocultivo y selección.
EJEMPLO 11 Selección de las células transformadas en Sorbarods y desarrollo de un sistema de alto rendimiento Los explantes adecuados tales como los callos y los embriones inmaduros pueden obtenerse vía medios de escisión mecánicos y manuales conocidos en la técnica, y pueden inocularse con Agrobacterium que contiene un plásmido, que comprende cualquier gen de interés conocido en la técnica. En una modalidad, la selección de una célula transformada se hace en una pieza de fieltro colocada en el medio líquido y la regeneración se hace en un tapón de Sorbarod™ (Baumgartner Papiers SA, Crissier-Lausanne, Suiza), colocado en el medio líquido. En otra modalidad, tanto la selección como la regeneración de la célula transformada se hace en un tapón de Sorbarod™ colocado en el medio líquido. La utilidad de estas modalidades se demuestra mediante varios ejemplos de los datos proporcionados en el Cuadro 6. Las composiciones del medio utilizado se muestran en el Cuadro 5, excepto que el medio líquido Phytagel se excluyó. Los embriones de maíz inmaduros de la línea receptora se disecaron de los granos en desarrollo y se inocularon con Agrobacterium que contienen el vector binario pMON42073, que comprende un gen CP4 para la selección con glifosato. Los embriones inoculados se cocultivaron en el medio de cocultivo 1514 (véase el Cuadro 5 para la composición) durante aproximadamente 24 horas a 23°C en la oscuridad. Los embriones inoculados se transfirieron entonces a una pieza de fieltro cuadrada de 5 X 5 cm (Consumer Products Enterprises (CPE) Inc., Union, Carolina del Sur) o a un tapón Sorbarod (ILACON Limited, Kent, RU), colocado en el medio líquido de selección 1278 (véase el Cuadro 5 para la composición), que contiene glifosato 0.1 mM para seleccionar el tejido transformado. Después de este paso, el medio líquido de selección 1278 utilizado, se retiró y reemplazó con el primer medio de regeneración 1073 (véase el Cuadro 5 para la composición). El tejido se cultivó durante 5-7 días con 16 horas de luz a 27°C. Normalmente, este paso requiere transferir el tejido seleccionado al primer medio sólido de regeneración para el cultivo adicional. Este método elimina este paso. El tejido parcialmente regenerado del primer medio líquido de regeneración se transfirió entonces a un tapón de Sorbarod colocado en un segundo medio líquido de regeneración (véase el Cuadro 5 para la composición) en una copa para helado para la regeneración completa. Este paso de transferencia se elimina si los embriones inoculados se cultivaron directamente en el tapón de Sorbarod para empezar. En tal caso, el primer medio líquido de regeneración se retiró simplemente y se reemplazó con el segundo medio líquido de regeneración. El tejido se cultivó durante aproximadamente 2 semanas. Normalmente, este paso requiere transferir el tejido regenerante del primer medio sólido de regeneración al segundo medio sólido de regeneración para el cultivo adicional. Este método elimina este paso. Las plántulas de maíz más pequeñas completamente regeneradas en el tapón de Sorbarod se transfirieron al suelo directamente. Normalmente, este paso requiere transferir una plántula más pequeña completamente regenerada del segundo medio sólido de regeneración al medio de enraizamiento sólido 1084 (véase el Cuadro 5 para la composición) para el cultivo adicional. Este método elimina este paso. Las plántulas en desarrollo se endurecieron en una cámara de cultivo a 27°C, 80% de humedad, y con baja intensidad de luz durante aproximadamente 1 semana, y a continuación se transfirieron a un invernadero y se cultivaron bajo las condiciones estándar del invernadero, y se probaron para la presencia del gen CP4. El Cuadro 6 muestra la producción de maíz transgénico, utilizando el cultivo líquido en combinación con fieltro y el tapón de Sorbarod y eliminado varios pasos de transferencia. Un sistema de transformación de alto rendimiento para el maíz se desarrolló, en el cual los recipientes se manipulan por brazos robóticos en una mesa de trabajo configurable libremente, que incluye incubadoras y agitadores útiles, además de material de laboratorio estándar. Varias herramientas de manejo del líquido, equipadas con una o más puntas de pipeteo se utilizaron para proporcionar el medio fresco y retirar el medio gastado. La mesa de trabajo, los brazos robóticos y las herramientas que manejan el líquido son controlados por un programa vía una computadora. De manera alterna, el medio líquido para la selección y regeneración de la célula transformada puede proporcionarse al recipiente vía uno o más tubos conectados a un recipiente de almacenamiento del medio, y se retira vía uno o más tubos conectados a un recipiente de desecho. La provisión y retiro del medio líquido se controla de manera manual y mecánica.
CUADRO 6 Frecuencia de la transformación del maíz (TF) utilizando el medio líquido en combinación con diferentes matrices. La frecuencia de la transformación se calcula como el por ciento de embriones cultivados que producen plantas trans énicas # de # de plantas Medio Matriz Condiciones del cultivo durante la selección explantes regeneradas % de TF Espiga 1 Sólido Ninguno 14-21 días, 27°C en la oscuridad 20 2 10 Sólido Ninguno 10 días, 30°C en la oscuridad; 7 días, 28°C en luz 20 3 15 Líquido tapón 10 días, 30°C en la oscuridad; 7 días, 28°C en luz 72 5 6.9 Líquido fieltro/tapón 10 días, 30°C en la oscuridad; 7 días, 28°C en luz 63 5 7.9 Sólido Ninguno 14-21 días, 27°C en la oscuridad 20 2 10 Sólido Ninguno 10 días, 30°C en la oscuridad; 7 días, 28°C en luz 20 4 20 Espiga 2 Líquido tapón 10 días, 30°C en la oscuridad; 7 días, 28°C en luz 72 7 9.7 Líquido fieltro/tapón 0 días, 30°C en la oscuridad; 7 días, 28°C en luz 63 8 12.7 Sólido Ninguno 14-21 días, 27°C en la oscuridad 30 6 20 Sólido Ninguno 10 días, 30°C en la oscuridad; 7 días, 28°C en luz 30 9 30 Líquido tapón 10 días, 30°C en la oscuridad; 7 días, 28°C en luz 70 7 10 Espiga 3 Líquido fieltro/tapón 10 días, 30°C en la oscuridad; 7 días, 28°C en luz 63 8 12.7 Referencias Las siguientes referencias, al grado en que proporcionan el procedimiento ejemplar u otros detalles suplementarios a aquellos expuestos en la presente, se incorporan de manera específica en la presente como referencia. Patente de E.U.A. 5,159,135 Patente de E.U.A. 5,362,865 Patente de E.U.A. 5,569,834 Patente de E.U.A. 5,106,739 Patente de E.U.A. 5,107,065 Patente de E.U.A. 5,627,061 Patente de E.U.A. 5,633,435 Patente de E.U.A. 6,506,559 Publicación de la Solicitud de E.U.A. 2002/0168707 Publicación de la Solicitud de E.U.A. 2004/0244075 Solicitud de E.U.A. No. de Serie 09/423,143 Bird et al., Biotech Gen. Engin. Rev., 9:207-227, 1991 . Broothaerts et al, Nature, 433:630, 2005. Cheng et al., Dev. Biol.-Plant, 39:595-604, 2003. Chu et al., Scientla. Sínica., 18:659, 1975. Dekeyser et al., Plant Physiol., 90:217-223, 1989. Della-Cioppa et al., Bio/Technology, 5 579-584, 1987. Duncan et al., Planta, 165:322-332, 1985.
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Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- Un método para producir una planta de maíz transgénica, que comprende los pasos de: a) obtener un explante de maíz transformable; b) transformar el explante de maíz transformable; c) seleccionar una célula de maíz transformada del explante de maíz transformable en un medio de selección; y d) regenerar la célula transformada en una planta en un medio de regeneración, en donde los pasos b), c) y d) se hacen en el mismo recipiente. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el recipiente se selecciona del grupo que consiste de un biorreactor, caja de Petrí, placa con múltiples pozos, matraz, frasco, botella, jarra, PlantCon, sistema de emersión temporal, copa de helado y una combinación de los mismos. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el recipiente se proporciona con un medio para proporcionar y retirar el medio. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el explante se selecciona del grupo que consiste de un callo, un embrión y una suspensión celular. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio es un medio líquido. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio de selección es un medio sólido y el medio de regeneración es un medio líquido superpuesto sobre el medio de selección sólido. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el explante se pone en contacto con el medio de manera temporal. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el explante se pone en contacto con el medio de selección y de regeneración durante aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos, aproximadamente cada 12 a aproximadamente 24 horas. 9. - Un método para obtener un explante para producir una planta de maíz transgénica, que comprende dividir un callo en piezas del callo más pequeñas. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el callo es un callo del tipo I. 1 1 . - Un método para preparar una suspensión celular de Agrobacterium para inocular un explante, que comprende cultivar una reserva de glicerol congelada de Agrobacterium directamente en un medio de inducción. 12. - Un cultivo de células de maíz que comprende células transformables y embriogénicas. 13.- Un método para producir un cultivo de células de maíz transformables y embriogénicas, que comprende: a) obtener un callo de los embriones de maíz; y b) cultivar el callo durante aproximadamente 5 días a 30 días en un medio líquido, para producir el cultivo celular. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el callo es un callo del tipo II. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el paso c) y d) se hacen en una matriz, en donde la matriz se selecciona del grupo que consiste de fieltro, tapón Sorbarod y una combinación de los mismos. 16. - Un método para producir una planta transgénica, que comprende: a) cocultivar un explante de una planta regenerable con Agrobacteria recombínante, que comprende un gen de un marcador seleccíonable que confiere tolerancia a un agente selectivo y un medio que comprende una cantidad del agente selectivo, que es selectivo para las células del explante, que son transformadas con el gen marcador seleccionable; y b) regenerar una planta transgénica que comprende el marcador seleccionable del explante. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el explante comprende un embrión inmaduro. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el explante es de una planta de maíz. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el medio comprende un agente que suprime el crecimiento de Agrobacteria. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el cocultivo del explante de la planta regenerable con Agrobacteria recombinante, comprende poner en contacto el explante con una espátula que comprende Agrobacteria, seguido por la colocación del explante en el medio.
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