CN101528933B - 快速转化单子叶植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过简单快速的方案转化单子叶植物以获得能够在少至4-8周内移植到土壤的再生植物的方法。也提供了相关的细胞培养基和生长条件，以及通过该方法获得的植物和植物部分。此外，还提供通过本发明方法筛选顽拗植物基因型的可转化性的方法。还有，亦提供通过本发明方法扩展用以产生转基因植物的优先开发窗口的系统。

Description

快速转化单子叶植物的方法
发明背景
本申请要求2006年8月31日提交的第60/841,519号美国临时申请的优先权，该临时申请的全部公开内容通过引用结合到本文中。
1.发明领域
本发明主要涉及植物生物技术。更具体的说，本发明涉及改进了的用目的基因转化单子叶植物的方法。
2.相关技术的描述
植物生物技术中的基于基因组的方法已使得可以鉴定和分离大量的基因，并使得对这样的可靠且有效的高通量转化生产系统的需要成为必要，该系统用于通过将这些基因转化到经济上重要的单子叶植物如玉米中来试验它们的有用性。农杆菌(Agrobacterium)介导的单子叶植物如玉米、水稻和小麦的转化，是一种广泛使用的实验方法，这种方法往往使用分生组织如不成熟胚作为所选的外植体(例如Ishida等，1996；Zhao等，2001；Frame等，2002)。对于水稻，吸胀种子的转化也有报道(Toki等，2006)。到目前为止，在使细胞与农杆菌接触之后最普通方法包括：培养外植体组织如不成熟胚(“共培养”)，可能包括“延迟”或“静息”(非选择性)步骤在内，接着在含有植物生长素的选择培养基上进行培养，使细胞去分化以形成愈伤组织。在这个形成愈伤组织的时期，被转化的抗性愈伤组织在选择培养基上的适当选择剂的存在下得到选择。接着是使细胞在再生和生根培养基上，在能促进愈伤组织发生分化和愈伤组织再生成植株的条件下进行生长。这个方法通常需要至少10-12周才能产生出可转移到土壤进行进一步生长的植株。这个方法还需要在转化过程中手工进行几次组织转移，要使用到几种不同类型的培养基。
因此，使用标准的转化和再生方案是费时而低效的，会对转基因产品开发时间线(timeline)造成消极影响，因为基于初始研究期间获得的结果，作出关于哪些遗传构建物优先用于更大规模的转化工作的决策的“优先开发窗口(priority development window)”，通常是受季节限制的。因此，在单子叶植物转化领域存在这样的需求，即快速产生转基因植株，以为在优先开发窗口期间作出研究和产品开发决策提供更多的时间和灵活性。这种玉米转化的高通量系统会产生出大量的转基因植株供试验基因和创造有用植株，同时降低材料和人工成本。
此外，不同培育品系的胚发生培养响应(embryonenic cultureresponse)大不相同，这限制了可被转化的作物如玉米的基因型。因此，一些品系能容易地形成胚性愈伤，而一般来说许多品系不能形成任何胚性愈伤。这些品系通常被认为是“顽拗”品系。这可能会要求使用非精锐品系(non-elite line)来进行转化，因而会要求进行许多代的培育来产生农艺学上精锐的转基因品种。因此，还存在对这样的转化方法的需求，该方法能使至今为止“顽拗”的玉米基因型得到转化，使得产品开发用的可转化品系的选择范围更广，而且可以筛选这些基因型的潜在可转化性(transformability)。
发明概述
在一个方面，本发明提供产生转基因单子叶植株的方法，所述方法包括：a)用至少第一选定DNA转化外植体；b)将外植体在包含有效比例的细胞分裂素和植物生长素的第一培养基中进行培养，以促进能够形成根(root)和/或枝条(shoot)的可再生结构的发育；和c)将外植体在能支持根和枝条组织的同时生长的至少第二和/或第三培养基中进行培养，以产生出再生的转基因单子叶植株；其中再生的被转化单子叶植株在转化外植体的约4-8周之内产生。在一个实施方案中，所述方法还可包括将再生的转基因单子叶植株转移到植物生长培养基。在具体的实施方案中，生长培养基是非无菌基质(matrix)，包括包含在穴盘(plug)中的非无菌基质在内。
在某些实施方案中，可再生结构在转化外植体的约6-14天之内形成。在其他的实施方案中，步骤(b)在转化外植体的约6-14天之内完成。在另一个实施方案中，步骤(b)进行约6至约12天的时间。在还其他的实施方案中，进行步骤(a)和(b)，但在外植体的转化之后不增殖愈伤组织超过约10天至约两周。在某些实施方案中，第一培养基包含杀细菌化合物如羧苄西林或者其他能抑制用于转化外植体的根瘤菌(包括农杆菌在内)的生长的化合物。在其他的实施方案中，第二和/或第三培养基包含蔗糖，其浓度高于其在第一培养基中的浓度。在具体的实施方案中，第一培养基包含Lynx 1947。
在其他实施方案中，步骤(c)包括将外植体在能支持根和枝条组织同时生长的无添加植物生长调节剂的液体培养基中进行培养，以产生出再生的转基因单子叶植株。在具体的实施方案中，能支持根和枝条组织同时生长的培养基包含Lynx 2067。在另外的实施方案中，步骤(c)在转化外植体的约4-8周之内开始。
在某些实施方案中，第一培养基中细胞分裂素与植物生长素的比例为约0.005至约0.03(w/w)。在其他的实施方案中，以摩尔浓度计第一培养基中细胞分裂素与植物生长素的比例为约0.005至约0.03。在具体的实施方案中，细胞分裂素可选自BAP、玉米素、激动素和TDZ；植物生长素可选自IAA、2，4-D、NAA、IBA和麦草畏。在其他的实施方案中，第一培养基中的细胞分裂素和/或植物生长素可包含相当于以上所列细胞分裂素或植物生长素的这些数量和比例的植物生长调节作用。
在还其他的实施方案中，步骤(c)还包括将外植体在第二培养基中进行培养，该第二培养基包含的枝条形成生长调节剂(shoot forminggrowth regulator)与植物生长素的比例相对于第一培养基来说提高，以促进根和枝条的同时发育。在具体的实施方案中，步骤(c)的培养基是Lynx 2068和/或Lynx 2202。
本发明方法的某些实施方案还可包括将外植体在缺乏加入的植物生长调节剂的第二和/或第三培养基中进行培养。在一些实施方案中，在第二培养基中枝条形成生长调节剂与植物生长素的比例为约0.02至约0.06(w/w)。在具体的实施方案中，第二培养基是Lynx 2202或Lynx 2068。在某些实施方案中，在步骤(c)开始之后不加入新鲜的生长培养基。
在还其他的实施方案中，第一培养基包含约0.001mg/L至约10mg/L细胞分裂素和约0.1mg至约15mg/L植物生长素，例如约0.005mg/L细胞分裂素至约0.05mg/L细胞分裂素和约0.1mg/L植物生长素或0.2mg/L植物生长素至约0.5mg/L植物生长素。在还更多的实施方案中，还将外植体在第一培养基上的培养和第二培养基上的培养之间在第四培养基上进行培养，其中第四培养基包含有效量的植物生长素和细胞分裂素，以促进愈伤组织增殖。在具体的实施方案中，第四培养基是Lynx 2063。
在其他的实施方案中，还将外植体在第二培养基上的培养和第三培养基上的培养之间在第五培养基上进行培养，其中第五培养基包含能有效促进枝条生长量的细胞分裂素。在具体的实施方案中，第五培养基是Lynx 2066。
在某些实施方案中，对外植体的转化包括细菌介导的转化。在具体的实施方案中，细菌介导的转化是用选自农杆菌属(Agrobacteriumsp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)、中间根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)的细菌来进行。
在其他实施方案中，第二和/或第三培养基包含植物生长素(其量与在第一培养基中的量相比降低)、细胞分裂素、脱落酸或它们的组合。在具体的实施方案中，第二和/或第三培养基包含的植物生长素或植物生长素样植物生长调节剂活性不到第一培养基的一半。
在某些实施方案中，第一培养基和支持根和枝条组织的同时生长的培养基是液体培养基。在其他的实施方案中，第一培养基是半固体培养基。在具体的实施方案中，在第一培养基之后所用的每个培养基都是液体培养基。在某些实施方案中，步骤(b)和(c)在单个容器中进行。
在某些实施方案中，单子叶植物是玉米、水稻、高粱、小麦、黑麦、小米、甘蔗、燕麦、黑小麦、柳枝稷或草坪草植物。在具体的实施方案中，单子叶植物是玉米植物。
在另一个方面，本发明提供扩展用于生产转基因植物的优先开发窗口的系统，所述系统包括(a)至少部分基于在第一大田试验中收集到的数据，选择用于产生转基因植物的候选目的DNA区段；(b)通过权利要求1的方法制备包含候选DNA区段的转基因单子叶植物；和(c)在进行第一大田试验之后的生长季节所进行的至少第二大田试验中，对转基因植物进行所需表型和/或基因型的测定。在具体的实施方案中，第一大田试验或第二大田试验中的一个或两个在美国中西部进行。在某些实施方案中，对转基因植物的测定包括测量农艺性状。在具体的实施方案中，第二大田试验是杂交体产出试验。在还其他的实施方案中，第二大田试验在第一大田试验后进行两个生长季节。
本发明的又一个方面提供对作物植株的细胞进行可转化性方面的筛选的方法，所述方法包括(a)将作物植株外植体在能支持在约1-2周内产生枝条原基(shoot primordia)的生长培养基上进行培养；(b)将枝条原基在能支持枝条伸长的条件下在暗处进行培养至少约又一周，以获得生长中的枝条组织(shoot tissue)和/或小植株(plantlet)；和(c)将步骤(b)的组织或小植株在植物生长培养基上进行培养至少约又一周，以获得枝条芽(shoot bud)和/或植株(plant)；其中细胞的可转化性是通过枝条原基在步骤(c)之后产生枝条芽和/或植株的能力来测量。
附图简述
图1.对照(“BPD”)转化方法和两个示例性的本发明实施方案的线图，显示了培养步骤及组织转移和培养基转移/更换步骤的数目。一个小方块代表约一周时间。暗色箭头代表外植体向新容器的物理转移。带图案箭头代表抽吸和培养基更换。带条纹箭头代表在不抽吸下加入培养基。
图2.细胞分裂素在第一培养基中的存在通过促进枝条原基的产生使得能够进行有效和快速的转化。外植体在转化后10天进行gus表达的组织化学测定，它显示出大的转基因区(TS)和枝条原基(SP)。
图3.本发明方法所产生的四周龄(A)、六周龄(B)和七周龄(C)转基因玉米植株。
图4.显示培养步骤、组织转移步骤和培养基转移/更换步骤的数目的进一步减少的线图。一个小方块代表约一个星期时间。暗色箭头代表外植体向新容器的物理转移。带图案箭头代表抽吸和培养基更换。带条纹箭头代表在不抽吸下加入培养基。
图5.快速液体培养(RLC)方案对“优先开发窗口”期间的转化启动的影响。
发明详述
本发明提供改进的转化方法，它能极大地减少产生转基因植株所需的时间和扩展可被转化的基因型的范围。在一个实施方案中，液体培养基的使用结合上有效的植物处理程序和简化的培养基和培养步骤，提供了诸如更短的生产时间、更高的通量、更低的材料和劳动力成本及人类工程学安全好处方面的优点，同时保持转化频率(TF)在有用的水平，乃至提高TF。
此外，通过用这种快速方法产生出转化的玉米植株，现在有可能更有效地利用受季节影响的优先开发窗口，即在考虑了不同区域的种植季节的情况下，并基于在这些区域进行的大田试验的结果，作出有关转化构建物和事件的决策。这些区域包括例如美国玉米带，包括爱荷华州、印地安纳州、伊利诺伊州和俄亥俄州的全部或大部分，及南达科他州、内布拉斯加州、堪萨斯州、明尼苏达州、威斯康星州、密歇根州、密苏里州和肯塔基州的一部分。这能减少对基因构建物和植物转化事件研究进行规划和优先化的障碍。因此，将玉米转化方案从10-12周缩短到6-7周或更短时间，能有效扩展产品开发窗口5-6周，使一个时框(timeframe)内的转化能力提高达两倍，使得在优先开发窗口期间启动的对额外的转化株的大田试验，有可能在转化事件发生之后的第二个生长季节中进行。
在某些方面，本发明人发现，在各个步骤使用带基质的液体培养基(liquid media with a matrix)取代常用的半固体培养基会导致更低的TF。但是，将液体选择和再生培养基与含有细胞分裂素的延迟培养基一起使用，所产生的TF与半固体选择和再生培养基相似。因此，通过用一个培养基将之前分开的延迟和共培养步骤组合在一起，同时保持/提高TF，开发出了更快的方法。细胞分裂素在共培养和延迟培养基(第一培养基)中的存在，能引发早期再生应答，同时降低愈伤组织形成(callusing)或同时的愈伤组织形成和植物再生，从而导致更快的再生。羧苄西林这种杀细菌化合物在共培养培养基中的存在，能使外植体在通过农杆菌介导的转化进行的DNA递送后在同一培养基上进行长时间培养，即培养7-14天。此外，可取消传统的分开进行的愈伤组织增殖和选择步骤，同时还达到可接受的TF，因为可将外植体直接转移到能促进枝条芽原基生长和发育的第二和/或第三培养基。因此重要的是，通过使用本文所述的培养方案，之前的通过基于愈伤组织的程序证实胚发生应答和可转化性有限的“顽拗”基因型，现在可直接用作转化靶标，而无需对外植体材料作进一步的物理操作，即通过手工向不同培养基的转移进行的亚培养。
本文描述的转化方法提供了对本领域公知的当前转化方法的显著改进。通过使用这种方法出乎意料地发现，在将细胞与转化剂进行接触的4-6周之内可产生出转化植株，该植株现成可供移植到生长基质如穴盘和/或土壤中，且该植株可通过更有效的程序和以更宽范围的基因型来产生。在一些方面，所述方法还采用具有合适的支持基质(support matrix)的液体培养基。采用液体培养能将转移步骤数目从6次减少到少至2次或3次。还有，选择转化细胞和再生的步骤可在单个容器中完成，直到将植株转移到土壤。所述方法因此适合于高通量自动生产系统。
某些单子叶基因型对胚发生培养条件的应答差。也就是说，导致有效再生的胚或胚性愈伤在这些条件下没有得到产生。当尝试之前描述的方法时，这种“顽拗”基因型的转化频率为0或接近0。因此，本发明的可用来转化多种基因型特别是顽拗植株的方法，提供了更宽的可转化品系选择范围，代表了本领域的显著进步。
此外，评估单子叶作物植株系的细胞的可转化性的方法，通常是集中在测量给定品系在正确条件下产生胚性愈伤的能力。这些常规的筛选胚性愈伤形成的程序，利用的是被分离并在能够支持胚性愈伤形成的组织培养基上进行生长的不成熟胚。对于可转化性同样重要的是细胞系随时间推移维持这种胚性愈伤生长的能力，因为一些细胞系显示短暂爆发的愈伤形成，但随后并没有维持它们的胚发生潜力。
因此，本发明的一个实施方案包括对作物植株细胞进行可转化性筛选的新方法。这个方法在一个方面包括将外植体(例如玉米不成熟胚)在能够短时间内(例如1-2周内，例如1周内)产生枝条原基的培养基上进行培养。然后将组织转移到再生/伸长培养基在黑暗条件下保持约2-3周，然后放在生长培养基上再过约2-3周。若品系在这些条件下能够再生出枝条芽和/或植株，则表明它们能通过本发明方法进行转化，包括其中没有提供愈伤生长期的方法，或者其中愈伤生长期比之前的细胞培养再生方法大大缩短的方法。
本发明方法在一个实施方案中还包括将可转化的外植体暴露于转化剂。合适的外植体包括可转化的植物部分如愈伤、细胞和胚。在具体的实施方案中，外植体可以是授粉后(DAP)约8-14天长度约1.0-3.0mm的不成熟胚，例如胚大小可为长度约1.6-2.6mm之间，包括授粉后约10-12天约2.0mm的胚大小在内。玉米胚发育和形态的阶段已得到描述(例如Matthys-Rochon等，1998及其中的参考文献)。合适的转化剂包括携带待转移的DNA构建物的植物转化细菌。这种细菌的实例包括农杆菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、中间根瘤菌属和慢生根瘤菌属的细菌(例如Broothaerts等，2005；美国专利申请第11/749,583号)。还可通过直接摄取、微注射、电穿孔和微粒轰击，或者本领域技术人员公知的任何其他方法，使外植体暴露于DNA构建物。
通常，DNA构建物包括一个或多个表达单元(expression unit)。这些表达单元在5’至3’方向通常包含：启动子、编码有用性状或编码基因抑制的核酸、3’非翻译区。还通常加入几种其他的表达元件(expression element)如5’UTRs、细胞器转运肽序列和内含子(特别是对于单子叶植物)，以促进性状的表达。其他有助于增强表达或者影响基因在植物中的转录或翻译的遗传成分，也设想进行使用。
有多种植物启动子为本领域技术人员所熟知。这种启动子包括但不限于胭脂氨酸合酶(NOS)启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子(例如参见美国专利第5,352,605号)、增强型CaMV 35S启动子(e35S)、ssRUBISCO启动子和肌动蛋白启动子(例如水稻肌动蛋白启动子；参见美国专利第5,641,876号)等等。DNA构建物可包括第二表达单元，其中核酸编码用于选择、筛选或评价转化细胞的标记蛋白。
对于本发明的实施，制备和使用构建物和宿主细胞的组合物和方法是本领域技术人员熟知的，参见例如Sambrook，等(2000)。制备特别适合于植物转化的转化构建物的方法，包括但不限于美国专利第4,971,908号、第4,940,835号、第4,769,061号和第4,757,011号中描述的方法，所有这些专利都通过引用整体结合到本文中。
通常，将表达单元提供在转化构建物上的一个或多个T-DNA边界之间。转化构建物能使T-DNA边界之间的表达单元整合到植物细胞的基因组中。构建物还可含有能在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA区段，例如大肠杆菌复制起点如ori322，广宿主范围复制起点如oriV或oriRi和可选择标记的编码区域，如编码赋予对大观霉素或链霉素的抗性的Tn7氨基糖苷腺苷转移酶(aadA)的Spec/Strp，或者庆大霉素(Gm，Gent)可选择标记基因。对于植物转化，宿主细菌株往往是携带具有对表达单元具转移功能的质粒的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)ABI、C58、LBA4404、EHA101或EHA105。植物转化领域技术人员公知的其他菌株也可在本发明中发挥作用。
在使外植体与转化剂接触后，可将外植体在第一培养基(例如Lynx#1947)上进行培养，该培养基由于存在杀细菌化合物如羧苄西林，结合了共培养和延迟培养基的特性。这种培养基包含细胞分裂素和植物生长素。通过提供有效量的植物生长调节剂和适当比例的细胞分裂素与植物生长素或任何其他已知能影响愈伤形成和/或枝条芽形成的生长调节剂，这种培养基能使随后的组织(包括转化组织)再生不需要单独的愈伤增殖期或持续的胚发生应答就能开始。有效的生长调节剂浓度和/或细胞分裂素与植物生长素的比例，可随基因型和所用植物物种类型而异。在第一培养基之后，在某些实施方案中，可将外植体在无生长调节剂的培养基上进行培养，以促进植物再生。在某些实施方案中，这个培养基是液体培养基。
本发明提供的方法可用能够产生经典的胚性愈伤应答的基因型来进行，也可用顽拗的基因型来进行，该顽拗的基因型用其他之前已知的培养方法不能显示出可观量的(appreciable amount of)胚发生培养应答或者持续的培养应答。在第一培养基上的培育期可根据对特定TF的需求而改变。在一个实施方案中，在第一培养基上的培养期为约6或7天至约10-14天。较早的再生还能减少趋向于在愈伤形成后出现和会降低下游筛选效率的克隆(即姊妹)植株(包括非转化植株)的数目。可将细胞分裂素加到接种或共培养培养基。或者，细胞分裂素可通过转化株系的外植体当中的细胞分裂素合成基因如异戊烯基转移酶的基因(例如美国专利第6,294,714号)来产生。
适合单独使用或与本发明方法组合使用的各种细胞分裂素的实例，包括6-苄基氨基嘌呤(BAP)、激动素、玉米素、腺苷磷酸、赛苯隆(TDZ)和其他细胞分裂素样化合物。适合单独使用或与本发明方法组合使用的各种植物生长素的实例，包括IAA、2，4-D、NAA、IBA、麦草畏和其他植物生长素样化合物。植物细胞培养和转化领域的技术人员，会确定出适用于本发明的枝条形成植物生长调节剂和植物生长素的适当水平和两者的适当比例。例如，这些和其他的在玉米或在别的作物中具有与例如BAP和/或2，4 D功能上等同的活性水平的植物生长调节剂，其水平可这样来确定：在外植体在生长培养基中生长的时候，改变这种生长调节剂在培养基中存在的水平，并追踪研究外植体和从中衍生的组织的生长情况。因此，如果使用其他的植物生长调节剂，它们仍然会包含相当于以上所列细胞分裂素或植物生长素的这些设想数量和比例的植物生长调节作用。
包含至少一个枝条原基的去分化外植体可在第一培养基上共培养/延迟后产生，且可在第二培养基上进行培养，该第二培养基所包括的枝条形成生长调节剂(如细胞分裂素或ABA)与植物生长素的比例与第一培养基相比提高了。或者，第二和/或第三培养基包含的植物生长素量可比第一培养基减少，且可包含高于第一培养基的有效量的蔗糖，以减少愈伤的增殖和更快的再生。例如，可采用第二培养基中50g/L蔗糖和第三培养基中60g/L蔗糖。再或者，第二培养基和/或第三培养基可仅包含有效量的枝条形成生长调节剂如细胞分裂素和/或ABA，没有添加的植物生长素或植物生长素样活性。随后，可将外植体在包含极少的或不包含枝条伸长和根产生用的植物生长调节剂的第三培养基上进行培养。
在一个实施方案中，所述方法将传统的共培养和延迟培养基结合成第一培养基，从而将转化和随后的培养所需的培养基数目从5个减少到4个。在另一个实施方案中，所述方法取消了愈伤增殖/选择培养基、两个再生培养基、一个生根培养基，提供了可缺乏可观量的加入的植物生长调节剂的改良的再生/伸长培养基，从而将转化所需的培养基数目从6个减少到3个。在又一个实施方案中，所述方法仅使用第一培养基和第三培养基，从而将转化所需的培养基数目从6个减少到2个。
在其他的实施方案中，第一培养基是半固体培养基，其他的培养基是液体培养基。在又一个实施方案中，所有用到的培养基都是液体培养基。但是，根据需要而定，使用半固体培养基或液体培养基的组合和仅使用本文提供的修改方案中的一个或多个，这对于本领域技术人员会来说是显而易见的。
在一个具体的实施方案中，将外植体在第一培养基如Lynx#1947上培养约7-14天，在第二培养基如Lynx#2202上培养约7天，和在第三培养基如Lynx#2067上培养约14-28天。但是，本领域技术人员通过对转基因植物的生长情况的目视检查，可对在一个或多个培养基上的培养天数加以增加或减少。在另一个实施方案中，将外植体另外在第一和第二培养基之间在第四培养基上培养约14天，在第二和第三培养基之间在第五培养基上培养约7天。第四培养基如Lynx#2063可含有包括植物生长素、细胞分裂素和AgNO3在内的植物生长调节剂，是配制来支持愈伤增殖。第五培养基如Lynx#2066可含有细胞分裂素，但通常没有植物生长素，是配制来支持枝条生长和伸长。在某些实施方案中，所加入的第二、第三、第四和/或第五培养基可不包含有效量的植物生长调节剂，但还能促进再生植株的发育。第二培养基或后面的其他培养基可以是液体培养基、半固体培养基或固体培养基。在具体的实施方案中，在为了在转化后的4-8周内获得转化的再生植株的方法中，只采用两个培养基，即共培养/延迟培养基如Lynx 1947和随后一个缺乏可观量的植物生长素的培养基如Lynx 2067和Lynx 2066的衍生培养基(也分别称为“第三培养基”和“第五培养基”)(培养基组成参见例如表2、3)。
本领域技术人员通过对外植体的目视检查，可对在一个或多个培养基上的培养天数加以增加或减少。本发明因此提供这样的再生植株或其部分，它能够在产生它的外植体被转化剂接触(例如通过用选定的DNA来转化)后4-6周内，在基于土壤的培养基或任何其他非无菌基质中生长。在一个具体的实施方案中，将4-8周龄的再生植株移植到穴盘(Q Plugs，International Horticultural Technologies，Hollister，CA)中，以进行进一步的生长和发育及初始筛选，例如以确定它们的涉及目的转基因的基因型和/或表型。
在其他的实施方案中，第二、第三、第四和/或第五培养基还包括选择剂如除草剂草甘磷，用来终止或至少阻止大多数的其中没有导入DNA构建物的细胞、组织或器官的生长。可单独使用或组合使用的其他合适的选择剂，包括但不限于植物生长素样除草剂如麦草畏或2，4-D、MCPA、2，4-DB、草铵膦、乙酰乳酸合酶抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂和羟苯基丙酮酸-双加氧酶抑制剂、新霉素、卡那霉素、paramomycin、G418、氨基糖苷、大观霉素、链霉素、潮霉素B、博来霉素、腐草霉素、磺酰胺、链丝菌素、氯霉素、甲氨喋呤、2-脱氧葡萄糖、甜菜碱醛、S-氨基乙基L-半胱氨酸、4-甲基色氨酸、D-木糖、D-甘露糖、苄基腺嘌呤-N-3-葡糖苷酸酶。提供对这些选择剂的耐受性的基因的实例在Miki和McHugh，(2004)中公开。
已知有多种植物组织培养基若得到适当补加养分能支持植物组织生长和发育。这些组织培养基可作为商业制品购买得到，或者可由本领域技术人员进行定制和改良。试剂是可市售获得的，可从多个供应商购买(参见例如Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO和PhytoTechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS)。这种培养基的实例包括但不限于由Murashige和Skoog(1962)、Chu等(1975)、Linsmaier和Skoog(1965)、Uchimiya和Murashige(1962)、Gamborg等(1968)、Duncan等(1985)、McCown和Lloyd(1981)、Nitsch和Nitsch(1969)及Schenk和Hildebrandt(1972)描述的培养基，或者这些培养基相应补加养分所得的衍生培养基。本领域技术人员意识到，通常针对特定的感兴趣的目标作物或品种，对用于转化和再生的培养基和培养基补充物如营养物和生长调节剂进行优化。还可从一个或其他培养基选择不同的成分如基本盐类、维生素、碳源，以获得所需的生长和发育。用于现有方法(例如Cai等人，美国专利申请公开说明书20040244075(通过引用结合到本文中)的植物生长培养基，在表1中显示。用于本发明方法的优选培养基组成在表2和3中列出。本发明所用配方和单子叶植物转化的常规方法中所用的标准配方之间的差别，例如在于常规方法使用的培养基能进行愈伤增殖和选择，然后进行转基因事件的再生和生长。与此对比，本发明培养基能使枝条原基的形成所需的愈伤形成刚好足够，从而避免嵌合植物形成并使得能够通过同时愈伤形成和植物再生进行有效选择，从而可以进行高频率转化。
一般来说，第一培养基可起到共培养和延迟培养基的作用，包含植物生长调节剂如植物生长素(例如2，4-D)、细胞分裂素(例如BAP)和硝酸银以及乙酰丁香酮以促进农杆菌介导的转化。第一培养基还可含有杀细菌化合物如羧苄西林，它能使外植体与转化剂接触后能在同一培养基上长时间培养，即培养7-14天。第二培养基(例如2202)还可包含这些植物生长调节剂，但植物生长素减少。重要的是，第二培养基可起到再生培养基的作用。第三培养基(例如2067)缺乏生长调节剂，起到再生或枝条伸长培养基的作用。第四培养基(例如2063)包含与第一培养基相似数量的生长调节剂，可起到支持愈伤增殖的作用。还可存在低水平的选择剂，以利于转化组织的生长。第五培养基(例如2066)缺乏植物生长素和硝酸银，具有低水平的细胞分裂素，能支持再生。或者，在第一培养基之后所加的培养基可不包含有效量的植物生长调节剂，但还能支持再生植株的发育和生长。在一个具体的实施方案中，还可采用不含植物生长素但含一些细胞分裂素(例如2347、2348、2415、2414；参见表3)的不同第二培养基取代最初所述的第二培养基(即2202)，作为能支持再生和伸长的再生培养基。培养基2348、2415、2414与2066基本相同，但含有硝酸银，且含有不同数量的草甘磷。培养基2347与2067基本相同，但含有硝酸银和细胞分裂素。植物细胞转化和组织培养领域的技术人员可根据目标外植体组织的物种和基因型，对这些培养基作出修正，同时还能保持所述的细胞培养特性。
表1.之前的方法(Cai等人，美国专利申请公开说明书2004/00244075)中所用的培养基组成
*包含1250mg/L烟酸(Sigma)、250 mg/L盐酸吡哆辛(Sigma)、250mg/L盐酸硫胺(Sigma)和250mg/L泛酸钙(Sigma)。
表2.本发明的各个方面所用的培养基组成
表3.本发明中所用的其他类型的第二培养基的实例
为证实DNA构建物在再生植株中的存在，可进行多种测定。这些测定包括例如“分子生物学”测定如DNA印迹和RNA印迹和PCRTM；“生化”测定如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过酶功能来检测；植物部分测定，如叶或根测定；还有通过分析整株再生植株的表型来测定。
基因一旦用本发明方法导入到了植物中，该基因可通过杂交被导入到任何其他与第一植物性相容(sexually compatible)的植物，而无需直接转化该第二植物。因此，本文所用的术语“后代”指按本发明制备的亲本植株的任何一代的后代。“转基因植物”因此可以是任何一代。
本发明还提供由本发明方法产生的植物和植物部分。优选地，植物是单子叶植物。更优选地，单子叶植物是选自以下的作物植物：玉米、水稻、高粱、小麦、黑麦、小米、甘蔗、燕麦、黑小麦、草坪草和柳枝稷植物。在一个具体的实施方案中，单子叶植物是玉米植物。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠、花粉、叶子、茎干和根。在一个具体的实施方案中，植物部分是种子。本发明还包括和提供由本发明方法产生的植物细胞和组织。
以下实施例说明本发明方法的开发。
实施例
纳入以下实施例是为了说明本发明的实施方案。本领域技术人员应认识到，以下实施例中所公开的技术代表着本发明人所发现的能在本发明的实施中发挥良好作用的技术。但是，本领域技术人员根据本公开内容应能认识到，可不背离本发明的概念、精神和范围，对所公开的具体实施方案作出许多变化，但又能获得同样的或类似的结果。更具体的说，显而易见的是，某些在化学上和生理上相关的物质可取代本文所述的物质，但又能获得相同的或相似的结果。所有这些对本领域技术人员而言显而易见的相似替代和修改，都认为落入所述权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念。
实施例1
核酸构建物和转化剂
本实施例描述DNA构建物的制备和DNA构建物向用于转化玉米不成熟胚的ABI农杆菌菌株(可转化态C58菌株(disarmed C58strain))中的转化。质粒pMON 97367含有作为可选择标记的cp4基因和作为可筛选标记的gus基因，两基因分别由嵌合水稻肌动蛋白启动子和水稻肌动蛋白启动子驱动。农杆菌各菌株基本上按别处描述的程序(如Cai等人，美国专利申请公开说明书2004/00244075)制备以供转化。
实施例2
改进转化的通量
本实施例描述在愈伤增殖、选择期间和在再生步骤期间使用液体培养基的修正方法的开发，以开发出需要较少的组织处理工作和可自动化的简化高通量方法。图1显示这个8周液体培养方案(“液体穴盘”，图1的中图)的实验设计。表4显示与基本上是Cai等人的美国2004/00244075的方法(即图1的上图)比较的结果。该修正方法相对于实施例3中的方法也有修改，修改之处在于在第一培养基之后将外植体转移到第四培养基(Lynx 2063)于30℃下暗处保持1-2周，然后转移到修正的第二培养基(例如2068，即加有AgNO3的2202)，然后在第二培养基之后转移到第五培养基(例如Lynx 2066)于27℃下暗处保持1周。
如上所述，在美国专利申请公开说明书(Cai等人)中描述了某些玉米转化方法，其中还描述了所用的不同培养基组成。表4显示通过对Cai等人的方法作出修改，可在8周之内产生出转基因植株，修改之处包括在第一培养基上进行长时间培养，减少在第四培养基上所花的培养时间，减少在第五培养基上所花的培养时间，和减少在当前方法所用的生根培养基(表1)上所花的培养时间。因此，第一、第二、第三、第五培养基分别如下进行修改(参见表1和2)：加入细胞分裂素和减少植物生长素，大量减少细胞分裂素和加入少量的植物生长素和增加蔗糖量，除去所有的生长调节剂和增加蔗糖，加入少量的细胞分裂素和植物生长素和增加蔗糖。例如，用于Cai等人所描述的常规方法的Lynx 1233既不支持外植体的长时间生长和发育，也不象本发明的第一培养基(Lynx 1947)那样支持枝条原基形成。Cai等人的Lynx1278具有与本发明的Lynx 2063类似的功能。这两个系统的主要差别在于再生方面。Cai等人的方法的植物再生使用高细胞分裂素脉冲步骤(Lynx 1073)，接着是枝条伸长(Lynx 1071)，最后是小植株生根，伴随着在Lynx 1084上进一步生长和发育。与之对比，本发明方法的再生是通过用植物生长素逐步减少的程序(Lynx 2068和Lynx 2066)进行枝条和根的同时发育来实现的。小植株的最后生长和发育是在无生长调节剂的培养基Lynx 2067上实现。
表4.用液体培养基培养方法在8周内产生转基因植株。％TF是至少3个独立实验的平均值，是基于独立的转基因植物事件的％。
处理 转移到选择培养基的外植体数目# 所产生的事件数目# TF(％)
对照方法 150  55  36.7
液体培养基方法 210  125  59.5
实施例3
转化方法
本实施例描述包括再生步骤的转化方法(图1，“快速转化”方案，底图)，通过该法在少至约6周的生长后就在固体生长培养基(例如生长穴盘)中获得再生的植株。大体上说，将不成熟胚(IEs)进行手工切割或者通过流体射流装置(如美国专利第7,150,993号或美国专利申请公开说明书第2005/0246786号中所公开的)切割，接种上含有目的DNA构建物的农杆菌细胞。将接种的胚在第一培养基(Lynx 1947)上暗处培养约7天(任选至约14天)，其中23℃下1天，其余时间在30℃下，然后将外植体转移到含有载体如毛毡和/或滤纸(例如Ahlstromgrade 610，8.22cm；Ahlstrom Corp.，芬兰赫尔辛基)和10ml的第二培养基(Lynx 2202)的平板上，将平板在黑暗条件下30℃温育约1周。在第二培养基存在下1周后，将旧培养基抽吸出，加入10ml的第三培养基(Lynx 2067)，将平板在暗处30℃再温育1周。在初次向第三培养基转移后大约1周，将旧培养基抽吸出，再次加入约15-30ml的第三培养基，将平板在27-30℃下以16/8光亮-黑暗周期进行温育。在转化后的第6周后，将植株在非无菌条件下转移到含有固体生长培养基的穴盘使之茁壮(hardening)，然后转移到盆(pot)中在接着的2周内进行进一步的生长和发育。所用的培养基组成在表2中显示。
实施例4
细胞分裂素的使用能促进枝条和植株的快速产生
本实施例说明使用细胞分裂素来引发早期的枝条原基形成以更快地产生转基因植株。实验是在第一培养基中(成分见表2)在有和没有BAP情况下进行的，结果在表5中显示。图2显示枝条原基在第一培养基上的产生。结果还显示当在转化过程的这个步骤中使用细胞分裂素时转化频率有显著改进。
表5.在转化过程的第一个步骤中使用细胞分裂素能因为早期的枝条原基形成而提高转化频率。％TF是4个实验的平均值，是基于独立转基因植物事件的％。
 处理(1周) 进行选择的胚的数目# 所产生的事件的总数# ％TF平均值±SD
 Lynx 1898；No BAP 315 41 13.0±7.4
 Lynx 1947；BAP 365 179 49.0±2.3
实施例5
通过缩短愈伤增殖和选择期对方法进行简化
本实施例证明通过将花在Lynx 2063上的时间缩短1周从而限制愈伤增殖，可在7周和6周内产生转基因植株。实验概略和结果在表6中显示。结果提示可使用缩短的愈伤形成期，但却不影响TF。结果还提示可能可以进一步缩短或取消愈伤形成期，这可加速转基因植株产生的过程。
表6.通过缩短愈伤形成期在7周或6周内产生转基因植株。％TF是至少3个独立实验的平均值，是基于独立转基因植物事件的％。
步骤 处理1  处理2 处理3
共培养和延迟；8-10天 Lynx 1947  Lynx 1947 Lynx 1947
第1次转移，1周 Lynx 2063 Lynx 2063 Lynx 2063
第2次转移，1周 Lynx 2063 Lynx 2068 Lynx 2068
第3次转移，1周 Lynx 2068 Lynx 2066 Lynx 2067
第4次转移，1周 Lynx 2066 Lynx 2067 Lynx 2067
第5次转移，2周 Lynx 2067 Lynx 2067 穴盘(6周)
第6次转移，1周 Lynx 2067 穴盘(7周) N/A
步骤 处理1 处理2  处理3
第7次转移 穴盘(8周) N/A  N/A
TF(平均值±SD) 16.9±1.0 26.0±10.9  22.0±5.9
实施例6
通过取消选择过程中的愈伤增殖开发出六周转化方案
本实施例证明通过完全取消愈伤增殖和选择步骤(Lynx 2063，第四培养基)和第五培养基上的其中一个再生步骤，可在6周内产生转基因植株。实验设计和结果在表7中显示。这个实验包括在第四培养基上进行1周愈伤增殖/选择步骤的已经缩短的方法(处理1)，并将它与包括在所含2，4-D水平低于第一培养基的第二培养基上直接再生的方法进行比较。因此，除了降低植物生长素水平之外，还预期到枝条形成生长调节剂与植物生长素的比例提高。这个实施例证明在选择过程中对愈伤生长和增殖的需要(第四和第五培养基，例如2063和2066培养基)是可取消的，这对于在缩短的时间内获得转基因事件是至关重要的。
表7.通过取消愈伤增殖步骤来产生转基因植株。
％TF是至少3个独立实验的平均值，基于独立转基因植物事件的％。
步骤 处理1  处理2
共培养和延迟；8-10天 Lynx 1947 Lynx 1947
第1次转移，1周 Lynx 2063 Lynx 2202
第2次转移，1周 Lynx 2068 Lynx 2068
第3次转移，1周 Lynx 2066 Lynx 2067
步骤 处理1  处理2
第4次转移，1周 Lynx 2067 Lynx 2067
第5次转移，2周 Lynx 2067 Lynx 2067
第6次转移，1周 Lynx 2067 穴盘
第7次转移 穴盘
TF(平均值±SD) 18.8±9.4  40.9±18.7
实施例7
在共培养和延迟过程中的一些愈伤增殖对于提高TF是必要的
本实施例说明在共培养和延迟培养基(第一培养基)期间外植体的适当细胞增殖对TF的作用。外植体的愈伤生长通过共培养/延迟培养基中的2，4-D的水平来控制。如表8所示，试验了在第一培养基(例如2232、1947、2233或1898；表2)上培养1周然后进行6周转化方案的效果。从结果可见，再生之前的共培养/延迟期间的愈伤形成的量决定了TF。Lynx 2232中较低浓度的植物生长素水平(即0.2mg/L)产生0 TF，而在具有0.5mg/L的1947上培养的外植体产生约35％的TF。结果提示，在转到第二培养基上生长(包括再生)之前有一些愈伤增殖，对于使后面的枝条芽形成是必要的。愈伤形成的量可通过改变组织培养参数进行优化，所述参数包括培养基成分和生长的持续时间等等。
表8.共培养和延迟期间的最佳愈伤期会影响TF。％TF是至少3个独立实验的平均值，是基于独立转基因植物事件的％。
步骤 处理1 处理2 处理3 处理4
共培养和延迟；1周(7-10天) Lynx 2232 Lynx 1947 Lynx 2233 Lynx 1898
第1次转移，1周 Lynx 2202 Lynx 2202 Lynx 2202 Lynx 2202
第2次转移，1周 Lynx 2067 Lynx 2067 Lynx 2067 Lynx 2067
第3次转移，1周 Lynx 2067 Lynx 2067 Lynx 2067 Lynx 2067
第4次转移，1周 Lynx 2067 Lynx 2067 Lynx 2067 Lynx 2067
第5次转移，1周 穴盘  穴盘  穴盘  穴盘
TF  0  35.4  0.7  6.1
实施例8
对方案的进一步简化
本实施例说明对外植体在再生培养基(2202)上的生长时间进行缩短以进一步简化方法，同时仍可以在6周内获得植株，对TF又没有不利影响。在表9所示的本研究中，比较了在第二培养基(2202；2068)上各1周(处理1)与在第二培养基2202上仅1周(处理2和3)接着在第三培养基上进行伸长(2067)的效果。第二培养基2202与2068相同，例外的是2068不含3.4mg/L硝酸银。每隔一定时间加入第三培养基(2067)(处理2)或者是除去旧培养基加入新培养基(处理3)。用2067取代或稀释2202很可能会增强再生。这个方法所产生的植株的大小尺度足够移植到穴盘，存活率几乎为100％。用测定法对用于转化的DNA构建物的表达单元中存在的pin II转录终止序列基因的3’区域进行测定，所做出的对接近170个事件的拷贝数分析，揭示了约78％的植株含有1-2个拷贝，这表明可产生更高比例的有用植株，相比之下用当前的方法获得的含1-2个拷贝的植株通常仅为约60％。实验中仅有三个植株具有零拷贝，这表明能逃脱的极少。还可在少至4周内产生出转基因植株进行移植，如图3A所示。
表9.用新的再生和伸长培养基产生转基因植株。％TF是至少2个独立实验的平均值，是基于独立转基因植物事件的％。
步骤 处理1  处理2  处理3
共培养和延迟，1周(7-10天) Lynx 1947 Lynx 1947 Lynx 1947
第1次转移，1周 Lynx 2202 Lynx 2202 Lynx 2202
第2次转移，1周 Lynx 2068 Lynx 2067 Lynx 2067
第3次转移，1周 Lynx 2067 Lynx 2067 Lynx 2067
第4次转移，1周 Lynx 2067 Lynx 2067 Lynx 2067
第5次转移，1周 Lynx 2067 Lynx 2067 Lynx 2067
第6次转移 穴盘  穴盘  穴盘
TF 27.1  33.8  40.6
实施例9
备择的两步骤和三步骤方案
本实施例说明通过进一步减少转移步骤和/或培养基抽吸/加入步骤和/或培养基的数目来产生转基因植株，如图4中及表10和11中所示。本发明的一个重要组成部分在于愈伤期短而同时又能加速再生。在这个程序中，在共培养/延迟(第一培养基)之后，将组织转移到再生培养基(第二培养基；例如2202)保持1周，以加速再生过程(表10)。但是，这个步骤会妨碍这个方法的易自动操作性，因为在加入第三培养基(例如生长和延伸培养基2067)之前会需要除去包含能延迟伸长的植物生长素的这个第二培养基。这个问题这样得到了克服：鉴别不含任何植物生长素但含有一些细胞分裂素的不同第二培养基(例如2347、2348、2415、2414)来取代那个第二培养基(即2202)，作为能支持再生、伸长和生长的再生培养基，从而避免了需要抽吸出培养基。在处理2、3、4和5中，在第一次转移后，将无生长调节剂的2067加到容器中。处理5中所用的第二培养基是Lynx 2067的修正版本，因为它含有少量的BAP，可用于再生和伸长，因为它不含任何植物生长素(例如2347)，这由处理5的成功所证实。因此，如图4中的底图所示，获得了显示极好的TF、但仅由两个培养基步骤组成的快速且简单的植物转化方案。此外，由于能简单地加入培养基而无需抽吸出旧培养基，这使得系统可适于自动化操作。
表10：三个培养步骤产生转基因植株
实验编号 处理   进行选择的植株数目#   所产生的事件的总数# ％TF
  8205-1   8周-液体   110   46   41.8
  8205-2   6周-液体   100   38   38.0
8205-3   6周-液体三个步骤转化 48 20 41.7
如表11所示，所有的处理都实现了转化，这表明可以取消含植物生长素的培养基(2202)而不影响TF。另外，在共培养/延迟之后用不含植物生长素和含有一些细胞分裂素的再生和伸长培养基进行转化是可能的，这由含有括号中所示浓度的草甘磷的2347、2348、2414和2415证实。
表11.试验两步骤产生转基因植株的实验设计。培养基组成见表2和3。
实施例10
顽拗玉米基因型的转化
本实施例说明通过在如Cai等人所述的选择过程中包括单独的愈伤形成步骤的方法，用受体(recipient)精锐玉米品种产生转基因植株，该玉米品种被发现与常用于转化的对照精锐基因型相比具有差的胚发生培养应答(即被认为是“顽拗的”)。从采用约1172个外植体与对照植株的6个实验只获得一个转基因事件，而采用本发明的快速转化方法的两个研究产生了约16.9％和19.5％的TF，这表明这些方法能成功地应用于顽拗植株系。在表12中，％TF是4个独立实验的平均值，是基于独立转基因植物事件的％。在一些实验中，可获得约30-40％的TF。
表12.有助于在约6周内从精锐品种产生植株的修正的RLC
  步骤  处理3   处理4
  共培养和延迟  Lynx 1947   Lynx 1947
  第2次转移(黑暗30℃)  Lynx 2063(愈伤增殖和选择)   Lynx 2202(再生)
  第3次转移(黑暗30℃)  Lynx 2063(愈伤增殖和选择)   Lynx 2202(再生)
  第4次转移(黑暗30℃)  Lynx 2068(再生)   Lynx 2068(再生)
  第5次转移(光照27℃)  Lynx 2067(伸长和生长)   Lynx 2067(伸长和生长)
  第6次转移(光照27℃)  Lynx 2067(伸长和生长)   Lynx 2067(伸长和生长)
  到穴盘  到穴盘   到穴盘
  TF％  16.9   19.5
实施例11
评估玉米品系的可转化性的方法
本实施例说明用几个简单步骤对基因型进行转化能力的快速鉴定。在这个方法中，将外植体在能够短时间产生枝条原基的培养基(如1947；表2)上进行培养。培养后1周，将外植体转移到再生/伸长培养基(例如Lynx 2424；表13)，在黑暗条件下30℃保持2-3周。产生小植株的品系可转移到生长培养基(例如Lynx 2427；表13)保持2-3周的时间。能够通过这个筛选程序产生和/或再生枝条芽的品系，会适用于如上所述的快速转化程序，在它们的培养过程中无需单独的愈伤形成步骤。
表13.用于评估玉米品系的可转化性的培养基
实施例12
通过快速转化缩短产品开发周期
本发明还提供扩展的优先开发窗口进行转基因植物产品开发。这种产品开发是一个漫长的过程，从构想和基因到可出售给种植者的杂交玉米种子形式的商业产品，可能最少需要进行7-8年时间。植物生物技术特别是转基因玉米产品开发的领域竞争十分激烈，产品开发周期减少一年或多年，能公司带来市场份额和收益方面的巨大回报。
使用耗时约11-12周的植物(例如玉米)转化方案来产生转化植物，开发窗口通常是从11月下旬到1月上旬。在任何给定年份，在美国中西部进行了产出数据的收集和分析之后，由于图5中所示的后续工作，数据收集之后留待根据这些数据启动新的转化，同时能够进行对在第二后续中西部生长季节产生作为杂交体的转化体的产出试验的时间窗口被限制在不晚于1月上旬。这些后续工作包括种植R0代植物和进行事件表征，完成包括授粉和种子制备在内的R0植物开发，包括纯合体的鉴定和种子收集在内的R1植物开发，最后是再种植一代以产生杂合体和将种子分配到大田试验区域。
可这样实现转基因玉米产品开发的加速：缩短玉米转化所需的时间(从DNA导入细胞直到植物移植到土壤的时间)，使得玉米产品开发管线(pipeline)的产品开发周期可去掉整整一个日历年。这可通过将玉米转化方案从11-12周或更长时间缩短到6-7周或更短时间来实现，如图5中的蓝色所示。这就扩展了“优先开发窗口”，这个窗口定义为这样一段时间，即从任何特定生长季节中可获得美国中西部产出数据时起直到可启动转化的最后可能日期，从这些转化产生的转化品系可在转化时间之后的第二连续美国生长季节中作为杂交体在美国进行产出试验。在美国中西部产生的产出数据，不管产品是什么，对于美国产品开发都是至关重要的。使用6-7周转化方案能将优先开发窗口扩展5-6周(图5)，能使有更多时间来做出重要的商业决策，或者能在一个时框中在不增加转化资源的情况下使转化能力加倍，使得有可能在第二后续生长季节对在优先开发窗口启动的转化体进行大田试验(图5)，而不需等待一整个日历年来对这些转化体进行产出试验。
*    *    *
所有本文公开和要求权利的组合物和方法，都可根据本公开内容不需做太多实验就能作出和执行。虽然已在前文的示例性实施方案中对本发明的组合物和方法进行了描述，但本领域技术人员显然知道，可不背离本发明的真是概念、精神和范围，对本文所述的组合物、方法和方法步骤或方法步骤顺序作出改变、变化、修改和变动。更具体的说，显而易见的是，某些在化学上和生理上相关的物质可取代本文所述的物质，但又能获得相同的或相似的结果。所有这些对本领域技术人员而言显而易见的相似替代和修改，都认为落入所述权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念。
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Claims (37)

1.一种产生转基因单子叶植物的方法，所述方法包括：
a)用至少第一选定DNA转化外植体；
b)将外植体在包含有效比例的细胞分裂素和植物生长素的第一培养基中进行培养，以促进能够形成根和/或枝条的可再生结构的发育，其中第一培养基中细胞分裂素与植物生长素的比例为0.005至0.03w/w，并且所述第一培养基起共培养和延迟培养基的作用，其中第一培养基包含0.001mg/L至10mg/L的细胞分裂素和0.5mg至10mg/L的植物生长素；和
c)将外植体在能支持根和枝条组织的同时生长的至少第二和/或第三培养基中进行培养，以产生出再生的转基因单子叶植株，其中第二培养基含有其量与在第一培养基中的量相比降低的植物生长素，并且第二和/或第三培养基包含高于第一培养基的量的蔗糖；
其中所述单子叶植物是玉米植物，其中再生的被转化单子叶植株在转化外植体的4-8周之内产生。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括将再生的转基因单子叶植株转移到植物生长培养基。
3.权利要求2的方法，其中所述生长培养基是非无菌基质。
4.权利要求3的方法，其中所述非无菌基质包含在穴盘中。
5.权利要求1的方法，其中所述可再生的结构在转化外植体的6-14天内形成。
6.权利要求1的方法，其中步骤b)在转化外植体的6-14天内完成。
7.权利要求1的方法，其中进行步骤a)和b)，但不使愈伤组织增殖超过10天至两周。
8.权利要求1的方法，其中第一培养基包含杀细菌化合物。
9.权利要求1的方法，其中第二和/或第三培养基包含减少愈伤的增殖和更快地再生的有效量的蔗糖，其浓度高于第一培养基中的浓度。
10.权利要求1的方法，其中第一培养基是Lynx1947，其组成为：
。
11.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括将外植体在能支持根和枝条组织同时生长的无添加的植物生长调节剂的液体培养基中进行培养，以产生出再生的转基因单子叶植株。
12.权利要求11的方法，其中所述能支持根和枝条组织同时生长的培养基是Lynx2067，其组成如下：
。
13.权利要求1的方法，其中步骤(b)进行6天至12天的时间。
14.一种产生转基因单子叶植物的方法，所述方法包括：
a)用至少第一选定DNA转化外植体；
b)将外植体在包含有效比例的细胞分裂素和植物生长素的第一培养基中进行培养，以促进能够形成根和/或枝条的可再生结构的发育，其中第一培养基中细胞分裂素与植物生长素的比例为0.005至0.03w/w，其中第一培养基包含0.001mg/L至10mg/L的细胞分裂素和0.5mg至10mg/L的植物生长素；和
c)将外植体在能支持根和枝条组织的同时生长的至少第二和/或第三培养基中进行培养，以产生出再生的转基因单子叶植株，其中第二培养基含有其量与在第一培养基中的量相比降低的植物生长素，并且第二和/或第三培养基包含高于第一培养基的量的蔗糖；
其中所述单子叶植物是玉米植物，其中(c)在转化外植体的4-8周内开始。
15.权利要求1的方法，其中所述细胞分裂素选自BAP、玉米素、激动素和TDZ；所述植物生长素选自IAA、2，4-D、NAA、IBA和麦草畏。
16.权利要求1的方法，其中步骤(c)还包括将外植体在第二培养基中进行培养，该第二培养基包含的细胞分裂素与植物生长素之间的比例相对于第一培养基来说提高，以促进根和枝条的同时发育。
17.权利要求16的方法，其中步骤(c)的培养基是Lynx2202和/或Lynx2068，其组成如下：
。
18.权利要求1的方法，所述方法还包括将外植体在缺乏植物生长调节剂的第二和/或第三培养基中进行培养。
19.权利要求1的方法，其中第二培养基是Lynx2202或Lynx2068，其组成如下：
。
20.权利要求1的方法，其中在步骤(c)开始后不加入新鲜的生长培养基。
21.权利要求1的方法，其中在第一和第二培养基上的培养之间进一步将所述外植体在第四培养基上进行培养，其中第四培养基包含有效量的植物生长素和细胞分裂素，以促进愈伤组织增殖。
22.权利要求21的方法，其中第四培养基是Lynx2063，其组成如下：
培养基成分/L(供应商) 2063(第四) MS基础盐类(Phytotech) 4.33g MS维生素(100X)(Phytotech) 10mL 盐酸硫胺(Sigma) 0.5mg 2，4-D(Phytotech) 0.5mg 蔗糖(Phytotech) 30g 脯氨酸(Sigma) 1.38g 酪蛋白氨基酸(Difco) 0.5g pH 5.8 低EEO琼脂糖(Sigma) 0 过滤灭菌后添加剂 羧苄西林(Phytotech) 500mg 乙酰丁香酮(Aldrich) 0 BAP(Sigma) 0.01mg 草甘磷(Gateway Chemical) 0.2mM 硝酸银(Sigma) 3.4mg
。
23.权利要求21的方法，其中在第二和第三培养基上的培养之间进一步将所述外植体在第五培养基上进行培养，其中第五培养基包含能有效促进枝条生长量的细胞分裂素。
24.权利要求23的方法，其中第五培养基是Lynx2066，其组成如下：
培养基成分/L(供应商) 2066(第五) MS基础盐类(Phytotech) 4.33g MS维生素(100X)(Phytotech) 10mL 盐酸硫胺(Sigma) 0.5mg 2，4-D(Phytotech) 0 蔗糖(Phytotech) 50g 脯氨酸(Sigma) 0 酪蛋白氨基酸(Difco) 0.5g pH 5.8 低EEO琼脂糖(Sigma) 0 过滤灭菌后添加剂 羧苄西林(Phytotech) 500mg 乙酰丁香酮(Aldrich) 0 BAP(Sigma) 0.01mg 草甘磷(Gateway Chemical) 0.1mM 硝酸银(Sigma) 0
。
25.权利要求1的方法，其中对外植体的转化包括细菌介导的转化。
26.权利要求25的方法，其中所述细菌介导的转化是用选自农杆菌属(Agrobacterium sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)、中间根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)的细菌来进行。
27.权利要求16的方法，其中第二和/或第三培养基包含：植物生长素，其量与在第一培养基中的量相比降低；细胞分裂素；脱落酸或它们的组合。
28.权利要求27的方法，其中第二和/或第三培养基包含的植物生长素活性不到第一培养基的一半。
29.权利要求1的方法，其中第一培养基和能支持根和枝条组织同时生长的培养基是液体培养基。
30.权利要求1的方法，其中第一培养基是半固体培养基。
31.权利要求1的方法，其中在第一培养基之后所用的每个培养基都是液体培养基。
32.权利要求1的方法，其中步骤b)和c)在单个容器中进行。
33.一种扩展用于生产转基因植物的优先开发窗口的方法，所述方法包括：
(a)至少部分基于在第一大田试验中收集到的数据，选择用于产生转基因植物的候选目的DNA区段；
(b)通过权利要求1的方法制备包含候选DNA区段的转基因单子叶植物，其中所述单子叶植物是玉米；和
(c)在进行第一大田试验之后的生长季节所进行的至少第二大田试验中，对转基因植物进行所需表型和/或基因型的测定。
34.权利要求33的方法，其中第一大田试验或第二大田试验中的一个或两个在美国中西部进行。
35.权利要求33的方法，其中对所述转基因植物的测定包括测量农艺性状。
36.权利要求33的方法，其中第二大田实验是杂交体产出试验。
37.权利要求33的方法，其中第二大田试验在第一大田试验后进行两个生长季节。
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