CN102835313A - 充分分离植物组织的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于快速分离适于转化或组织培养的单子叶植物胚的方法和装置。本发明包括充分分离用作可转化外植体的植物胚的机械装置。本发明还提供适于分离植物胚的培养基及其制备方法。

Description

充分分离植物组织的方法和装置

本申请是申请日为2008年8月29日、申请号为200880108777.2、发明名称为“充分分离植物组织的方法和装置”的发明专利申请的分案申请。

发明背景

本申请要求2007年8月31日提交的美国临时申请60/969,287的优先权，本文完整引入其公开作为参考。

技术领域

本发明一般地涉及充分分离适于遗传转化或组织培养的目标植物组织，如胚。

背景技术

制备用于植物繁殖、再生和转化的组织耗时费工，尤其是因为它通常包括手工切除可转化或可培养的植物组织。例如，在玉米(Zeamays)中，通常手工切除单个的未成熟胚以提供可遗传转化的外植体。胚性组织(embryogenic tissue)的手工切除费力，且具有对工人造成人体工程学损伤的风险。此外，当高通量的转化和植物生产需要较大量的可转化的植物组织时，必须雇用和培训更多的工人以满足增加的需求。此外，获得的植物组织的质量可以存在明显的差异，这取决于工人个人的技术水平、小心、注意力和疲劳程度。

在分离可转化的植物组织的先前技术中，组织差异和缺乏自动化的可行性造成了问题，因为质量差的组织负面影响随后的组织培养、遗传转化和植物繁殖。然而，甚至为生产适于商业开发和农业使用的单个转基因植物，也可能有必要完成单一品种的数以万计的单个转化事件。因此，在本领域中非常需要改良的制备目标植物组织的方法，其更有效，减少工人的整体劳动负担，减少处理植物材料所需的劳动量，和/或其产生比手工生产的组织具有更高、更一致的质量的植物组织。

发明内容

在一个方面，本发明提供了获得适于组织培养和/或遗传转化的胚的方法，包括在基本上由水和/或具有大约0mOsm/kg至大约600mOsm/kg的摩尔渗透压浓度(osmolality)的渗透剂组成的液体培养基中从植物种子至少部分地切除胚，其中，在从植物种子切除胚后，胚仍然保持进行组织培养和/或遗传转化的活性。渗透剂可进一步是惰性渗透剂。在进一步的实施方式中，该方法包括在液体培养基中从植物种子或穗的群体至少部分地切除多个胚。渗透剂可以选自甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖或其它渗透剂。在特别的实施方式中，培养基基本上由水和/或浓度为大约0.05M至大约0.5M的甘露醇或浓度为大约0.05M至大约0.5M的蔗糖组成。该方法可进一步包括遗传转化所述胚和从转化的胚再生转基因植物的步骤。

在该方法的某些实施方式中，胚遗传转化的步骤包括使用包括杀菌剂的共培养培养基。在特别的实施方式中，杀菌剂是羧苄青霉素。在更另外的实施方式中，共培养培养基包含大约0.5-1.5mg/L的2，4-D。

胚可以是禾本科(Poaceae)成员，如玉米、水稻、小麦或小米。在特别的实施方式中，胚是玉米胚或小米胚。在其它的实施方式中，胚可以是大豆胚、棉花胚或另一种双子叶植物的胚。

在另一种实施方式中，该方法包括在包括以下部分的培养基制备系统中制备液体培养基：(a)水的入口；(b)渗透剂的入口；和(c)用于混合水和渗透剂以产生液体培养基的室，其中，水的入口和渗透剂的入口连接到混合室上以使水和渗透剂输送到混合室。在某些实施方式中，水的入口和/或渗透剂的入口连接到容纳水和/或渗透剂的一个或多个室。该方法可以进一步包括连接混合室和流体喷射装置。在其它的实施方式中，该方法进一步包括用选自过滤器、紫外辐射源或γ辐射源和灭菌热源的灭菌装置对液体培养基灭菌。灭菌装置可以在水和/或渗透剂进入混合室之前对其灭菌。或者，灭菌装置在液体培养基进入混合室的同时和/或之后对其进行灭菌。在再另一种实施方式中，该方法包括在液体培养基离开混合室后对其进行灭菌。

该方法可以进一步包括测量容纳水的室、容纳渗透剂的室或混合水和渗透剂的室中的一个或多个的填充水平。在进一步的实施方式中，该方法包括控制水和渗透剂向用于混合水和渗透剂的室的输送。在特别的实施方式中，该方法包括通过电子感应水和/或渗透剂的输送来控制输送。

在另一个方面，用于制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚的方法包括：(a)将包括植物胚和/或种皮的植物种子组织置于水性环境中；(b)将所述组织与选择性地附着到胚或种皮上的试剂接触；和(c)根据试剂对胚或种皮的选择性附着分离至少第一胚。在某些实施方式中，所述试剂包括气泡。在特别的实施方式中，气泡具有大约100微米至大约1mm的最大平均尺寸。在某些实施方式中，气泡可能包含选自空气、氧气、氮气及其组合的气体。此外，在某些实施方式中，步骤(c)包括根据胚的浮力分离第一胚。

该方法也可以包括：在水性环境中包含表面活性剂，其可以减少气泡彼此之间的聚并。在某些实施方式中，表面活性剂选自聚醚、PPG(聚(丙二醇))和PEG(聚(乙二醇))。在特别的实施方式中，PPG具有大约340至大约3500道尔顿的分子量，而PEG具有大约100道尔顿至大约9000道尔顿的分子量。

在更其它的实施方式中，所述试剂包括与水性环境不混溶的第二液体。第二液体可以选自与胚的存活和转化相容的植物油(如菜籽油)、矿物油或其它疏水液体。

在某些实施方式中，植物种子组织包括通过在基本上由水和/或具有大约0mOsm/kg至大约600mOsm/kg的摩尔渗透压浓度的渗透剂组成的液体培养基(水性环境)中从植物种子至少部分地切除胚而产生的胚，其中，在胚从植物种子切除后，胚仍然保持进行组织培养和/或遗传转化的活性。在特别的实施方式中，水性环境基本上由包含水和/或具有大约7mOsm/kg至大约500mOsm/kg的摩尔渗透压浓度的渗透剂的培养基组成。该方法可以包括将植物种子组织置于水性环境中而不先将胚与非胚组织分离。在特定的实施方式中，植物种子组织是玉米植物种子组织。在其它实施方式中，植物种子组织是大豆植物种子组织或棉花植物种子组织。

在另一个方面，本发明提供了用于制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚组织的装置，包括：(a)用于在水性环境中保持包括多个植物胚和非胚组织(如植物种子皮)的植物种子组织的容器；和(b)用于向水性环境输送选择性地附着到胚或种子上的试剂的至少第一喷嘴，其中，喷嘴产生具有大约0.1mm至大约1mm的平均直径的气泡。在某些实施方式中，本发明提供一种装置，其中，容器填充培养基和包括胚和非胚组织的植物种子组织。在特别的实施方式中，该装置进一步包括用于根据胚在水性环境中的浮力分离胚组织的收集器。在更其它的实施方式中，气泡可能包含选自空气、氧气、氮气及其组合的气体。

在更另外的一个方面，本发明提供用于制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚的方法，包括：(a)将第一液体培养基流引到玉米粒或包含植物胚的其它组织上以从玉米粒或组织提取胚乳；和(b)将第二液体培养基流引到玉米粒或组织上以从玉米粒或组织提取胚。在某些实施方式中，液体培养基基本上由水或具有大约7mOsm/kg至大约500mOsm/kg的摩尔渗透压浓度的渗透剂组成。在特定的实施方式中，玉米粒可以包括在玉米穗上。在某些实施方式中，该方法可以进一步包括相对于第一和第二液流移动玉米穗，以从玉米粒连续除去胚乳和胚。在某些实施方式中，第一和/或第二液流构成小于玉米粒宽度的宽度。在特别的实施方式中，第一和/或第二液流构成大约0.003”的宽度和大约1”的高度，且第一和/或第二液流在大约30PSI至大约75PSI的压力下产生。

在某些实施方式中，第一和/或第二液流可以由在离喷嘴至少2.5”的距离处产生稳定的层状流体流的喷嘴引出。在更其它的实施方式中，玉米粒可以位于距喷嘴尖端大约1³/₄-2”处。在某些实施方式中，第一和/或第二液流以基本上同样的力量接触穗上的一排玉米粒中的各个玉米粒。

在另一个方面，本发明提供了获得适于组织培养和/或遗传转化的玉米或其它植物胚的装置，包括：(a)用于将培养基引到玉米粒或含有植物胚的其它组织之上的至少第一流体喷射口；和(b)用于保持玉米粒或其它组织在培养基的路径中的装置。玉米粒可以包含在玉米穗上。在某些实施方式中，用于保持玉米粒或其它组织的装置包括薄片(sheet)或圆筒形薄片。在其它实施方式中，用于保持玉米粒或其它组织的装置包括网状物或多个狭槽；或向待保持的组织施力的压力凸轮或螺杆。种子或果实组织可以通过机械力、摩擦力、离心力或吸力保持在用于保持玉米粒或其它组织的装置上。在特定的实施方式中，保持器可以包括压力凸轮、螺丝推运器(auger)或螺杆。在某些实施方式中，用于保持玉米粒或其它组织的装置悬置在气相中、液相中或部分地悬置在气相和液相中。在其它实施方式中，用于保持玉米粒或其它组织的装置相对于流体力固定或可相对于流体力移动。

本发明的另一个方面包括制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚的方法，其中，用于保持玉米粒或其它组织的装置在容器中离心以向玉米粒或其它组织施力。

该装置可进一步设计为包括第一和第二流体喷射口。此外，在某些实施方式中，用于保持玉米粒的装置包括用于相对于第一和第二流体流移动玉米穗以控制第一和第二流体流与玉米粒之间的接触角的装置。在特别的实施方式中，该装置进一步包括检测器以鉴别切除的胚乳组织和胚。

在某些实施方式中，该装置进一步包括至少第一分离器以将胚与非胚组织分离。在特别的实施方式中，通过选自尺寸排阻、差别密度和差别疏水性的方法将适于组织培养的胚与非胚组织分离。该装置可以进一步设计为包括根据大小将胚与非胚组织分离的筛子。在特别的实施方式中，用于保持玉米粒的装置包括用于相对于流体喷射口移动玉米穗或相反的第一电动机。

因此，本发明具体涉及：

1.一种获得适于组织培养和/或遗传转化的胚的方法，包括在基本上由水和/或具有大约0mOsm/kg至大约600mOsm/kg的摩尔渗透压浓度的渗透剂组成的液体培养基中从植物种子至少部分地切除胚，其中，在从植物种子切除胚后，所述胚仍然保持进行组织培养和/或遗传转化的活性。

2.如第1项所述的方法，其中，所述渗透剂选自甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖。

3.如第2项所述的方法，其中，所述培养基基本上由水和浓度为大约0.05M至大约0.5M的甘露醇组成。

4.如第2项所述的方法，其中，所述培养基基本上由水和浓度为大约0.05M至大约0.5M的蔗糖组成。

5.如第1项所述的方法，进一步包括遗传转化所述胚的步骤。

6.如第5项所述的方法，其中，所述遗传转化步骤包括使用包括杀菌剂的共培养培养基。

7.如第6项所述的方法，其中，所述杀菌剂是羧苄青霉素。

8.如第5项所述的方法，其中，所述遗传转化步骤包括使用包含大约0.5-1.5mg/L的2，4-D的共培养培养基。

9.如第5项所述的方法，进一步包括从转化的胚再生转基因植物。

10.如第1项所述的方法，进一步包括在液体培养基中从植物种子或穗的群体至少部分地切除多个胚。

11.如第1项所述的方法，其中，所述胚是玉米胚、小米胚、大豆胚或棉花胚。

12.如第1项所述的方法，包括在包括以下部分的培养基制备系统中制备液体培养基：

(a)水的入口；

(b)渗透剂的入口；和

(c)用于混合水和渗透剂以产生液体培养基的室，其中，所述水的入口和所述渗透剂的入口与混合室连接，以使水和渗透剂输送到混合室。

13.如第12项所述的方法，其中，所述入口中的一个或多个接收来自容纳水的室或容纳渗透剂的室的水和/或渗透剂。

14.如第13项的方法，进一步包括测量容纳水的室、容纳渗透剂的室或混合水和渗透剂的室中的一个或多个的填充水平。

15.如第12项的方法，进一步包括将所述混合室与流体喷射装置连接。

16.如第12项所述的方法，进一步包括用选自过滤器、紫外辐射源或γ辐射源和灭菌热源的灭菌器对液体培养基进行灭菌。

17.如第16项所述的方法，其中，所述灭菌器在水和/或渗透剂进入混合室之前对其进行灭菌。

18.如第16项所述的方法，其中，所述灭菌器在水、渗透剂和/或液体培养基进入混合室的同时和/或之后对其进行灭菌。

19.如第12项所述的方法，其中，在所述液体培养基离开混合室后对其进行灭菌。

20.如第12项所述的方法，进一步包括控制水和渗透剂向混合水和渗透剂的室的输送。

21.如第20项所述的方法，其中，控制输送包括电子感应水和/或渗透剂的输送。

22.一种用于制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚的方法，包括：

(a)将包括种皮和植物胚的植物种子组织置于水性环境中；

(b)将所述组织与选择性地附着到胚或种皮的试剂接触；和

(c)根据试剂对胚或种皮的选择性附着分离至少第一胚。

23.如第22项所述的方法，其中，所述试剂包括气泡。

24.如第23项所述的方法，其中，所述气泡具有大约100微米至大约1mm的最大平均尺寸。

25.如第24项所述的方法，其中，所述气泡包含选自空气、氧气、氮气及其组合的气体。

26.如第22项所述的方法，其中，所述步骤(c)包括根据胚的浮力分离第一胚。

27.如第24项所述的方法，包括在所述水性环境中包含减少气泡彼此之间的聚并的表面活性剂。

28.如第27项所述的方法，其中，所述表面活性剂选自聚醚、PPG(聚(丙二醇))和PEG(聚(乙二醇))。

29.如第28项所述的方法，其中，所述PPG具有大约340至大约3500道尔顿的分子量。

30.如第28项所述的方法，其中，所述PEG具有大约100道尔顿至大约9000道尔顿的分子量。

31.如第22项所述的方法，其中，所述试剂包括与所述水性环境不混溶的第二液体。

32.如第31项所述的方法，其中，所述第二液体选自与胚的存活和转化相容的植物油、矿物油或其它疏水液体。

33.如第22项所述的方法，其中，所述植物种子组织包括按照第1项所述的方法产生的胚。

34.如第22项所述的方法，其中，所述水性环境基本上由包括水和/或具有大约0mOsm/kg至大约600mOsm/kg的摩尔渗透压浓度的渗透剂的培养基组成。

35.如第34项所述的方法，其中，所述渗透剂选自甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖。

36.如第35项所述的方法，其中，所述培养基基本上由水和浓度为大约0.05M至大约0.5M的甘露醇组成。

37.如第35项所述的方法，其中，所述培养基基本上由水和浓度为大约0.05M至大约0.5M的蔗糖组成。

38.如第22项所述的方法，包括将植物种子组织置于所述水性环境中而不先分离胚和非胚组织。

39.如第22项所述的方法，其中，所述植物种子组织是玉米植物种子组织、棉花植物种子组织或大豆植物种子组织。

40.一种用于制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚组织的装置，包括：

(a)用于保持包括多个植物胚的植物种子组织在水性环境中的容器；和

(b)用于向所述水性环境递送选择性地附着到胚的试剂的至少第一喷嘴，其中，所述喷嘴产生具有大约100微米至大约1mm的平均直径的气泡。

41.如第40项所述的装置，其中，所述容器填充培养基和包括胚和非胚组织的植物种子组织。

42.如第40项所述的装置，进一步包括用于根据胚在所述水性环境中的浮力分离胚组织的收集器。

43.如第40项所述的装置，其中，所述气泡包含选自空气、氧气、氮气及其组合的气体。

44.一种制备适于组织培养和/或遗传转化的玉米胚的方法，包括：

(a)将第一液体培养基流引到玉米粒上，以从玉米粒提取胚乳；和

(b)将第二液体培养基流引到玉米粒上，以从玉米粒提取胚。

45.如第44项所述的方法，其中，所述液体培养基基本上由水或具有大约0mOsm/kg至大约600mOsm/kg的摩尔渗透压浓度的渗透剂组成。

46.如第45项所述的方法，其中，所述培养基包括选自甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的渗透剂。

47.如第46项所述的方法，其中，所述培养基基本上由水和浓度为大约0.05M至大约0.5M的甘露醇组成。

48.如第46项所述的方法，其中，所述培养基基本上由水和浓度为大约0.05M至大约0.5M的蔗糖组成。

49.如第44项所述的方法，其中，所述玉米粒包括在玉米穗上。

50.如第44项所述的方法，包括相对于第一和第二流移动玉米穗，以从玉米粒连续地除去胚乳和胚。

51.如第44项所述的方法，其中，所述第一和/或第二流构成小于玉米粒宽度的宽度。

52.如第44项所述的方法，其中，所述第一和/或第二流构成大约0.003”的宽度和大约1”的高度。

53.如第44项所述的方法，其中，所述第一和/或第二流在大约30PSI至大约75PSI的压力下产生。

54.如第44项所述的方法，其中，所述第一和/或第二流由产生在离喷嘴至少2.5”的距离处稳定的层状流体流的喷嘴引出。

55.如第44项所述的方法，其中，所述玉米粒位于距喷嘴尖端大约1³/₄-2”处。

56.如第44项所述的方法，其中，所述第一和/或第二流以基本上同样的力量接触在玉米穗上一排玉米粒中的各个玉米粒。

57.一种制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚的方法，其中，用于保持籽粒或其它组织的装置在容器中离心，以向籽粒或其它组织施力。

58.一种获得适于组织培养和/或遗传转化的植物胚的装置，包括：

(a)用于将培养基引到玉米粒或含有植物胚的其它组织之上的至少第一流体喷射口；和

(b)用于保持玉米粒或其它组织在培养基的路径中的装置。

59.如第58项所述的装置，其中，所述胚包含在玉米粒中。

60.如第59项所述的装置，其中，所述玉米粒包含在玉米穗上。

61.如第58项所述的装置，其中，所述装置进一步设计为包括第一和第二流体喷射口。

62.如第60项所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒的装置包括用于相对于第一和第二流体流移动玉米穗以控制第一和第二流体流与玉米粒之间的接触角的装置。

63.如第58项所述的装置，进一步包括检测器以鉴别切除的胚乳组织和胚。

64.如第58项所述的装置，进一步包括至少第一分离器以将胚与非胚组织分离。

65.如第58项所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒或其它组织的装置包括薄片或圆筒形薄片。

66.如第58项所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒或其它组织的装置包括网状物或多个狭槽；或向所述组织施力的压力凸轮或螺杆。

67.如第58项所述的装置，其中，所述种子或果实组织通过机械力、摩擦力、离心力或吸力保持在用于保持玉米粒或其它组织的装置上。

68.如第58项所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒或其它组织的装置悬置在气相中、液相中或部分地悬置在气相和液相中。

69.如第58项所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒或其它组织的装置相对于流体力固定。

70.如第58项所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒或其它组织的装置可相对于流体力移动。

71.如第64项所述的装置，其中，所述分离器通过选自尺寸排阻、差别密度和差别疏水性的方法将适于组织培养的胚与非胚组织分离。

72.如第71项所述的装置，进一步设计为包括根据大小将胚与非胚组织分离的筛子。

73.如第60项所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒的装置包括用于相对于流体喷射口移动玉米穗的第一电动机。

附图说明

图1描述如实施例4所述的使用正机械压力充分分离胚的本发明装置的一种实施方式。

图2描述如实施例7所述的使用流体喷射正压力从种子移出胚的本发明装置的一种实施方式。图例：(A)在X、Y和Z维上运动的机械手，(B)旋转玉米穗的电动机，(C)抓紧器(grasper)，(D)保持玉米穗的手柄，(E)阻止材料向上飞溅的挡板，(F)阻止材料向上飞溅的凸缘(flange)，(G)引导流体流动的孔，(H)透明管，(I)玉米穗，(J)震动筛，(K)干酪包布(cheesecloth)或其它多孔材料，和(L)废料容器。

图3描述如实施例7所述的使用磁性“手柄”的安装机构的一种实施方式，玉米穗可通过该磁性“手柄”固定到机械臂上。

图4描述如实施例7所述的可用于本发明某些方面的喷嘴的一种实施方式。该喷嘴产生基本上均匀的、平板样流体射流。

图5描述如实施例13所述的可用于本发明方法的装置的一种实施方式。该装置包括用于产生基本上扁平的流体射流的喷嘴和任选的吸入头。图5(上)描述了这种装置的一种实施方式的横截面图，显示了喷嘴、任选的吸入头和玉米穗如何相对于彼此定位。图5(下)示意地描述定位于装置中的玉米穗。图例：(A)基部，(B)喷嘴，C)连接穗的基部的轴，(D)吸入头，(E)玉米穗，和(F)引导流体流的孔。

图6描绘如实施例13中详细描述的可用于在本发明方法中的用于施加负压的部件的一种实施方式。图例：(A)一个或多个引导流体流的孔。

图7A-C描绘如实施例13中详述的使用力的组合并可用于本发明的某些方面中的装置的实施方式的不同视图。该装置包括具有能够向之前已打开或截断果皮的玉米粒的基部施加预定量的机械压力的前缘(leading edge)的头和用于施加负流体压力的部件。该装置可以进一步包括用于分配流体或引导流体流的装置。

图8描述了其中圆柱体的顶部全部、部分或主要被略小于玉米穗和玉米穗所附着的手柄的直径的软质材料膜或薄片覆盖的本发明实施方式。具体而言，显示了来自McMaster-Carr(McMaster-Carr，Atlanta，GA；例如，cat.#9010K11)的硅橡胶膜防溅板(1/32”厚度)。在膜中形成1”直径的孔。玉米穗能够通过该开口向下移动，也能够通过它向上返回。

图9描述底部切断的1升聚甲基戊烯量筒。3个流体喷射口穿入筒壁中的切孔。整个装置可以在使用前高压灭菌。为了进行操作，筒顶部可以安装防溅板，且玉米穗可降入筒中以使得流体射流驱出各个玉米粒的内容物。驱出的材料然后落在筒底部之外以进行进一步处理。

图10描述玉米穗轴，显示了胚在单个玉米粒中的位置。还显示本发明的一种实施方式，其中，液体射流引向玉米粒的向基(basipetal)侧，与胚所在的向顶(acropetal)侧相反。

图11图示说明本发明提供的培养基制备系统的实施方式。

图12图示说明本发明提供的培养基制备系统的混合室的全图。

图13图示说明混合室下端的近视图，具有定位板和快速连接装配件。

图14描述混合室下端的近视图，具有定位装置和支撑板。

图15描述工作状态的培养基制备系统下部的近视图。

图16描述工作状态的培养基制备系统上部的近视图。

图17包括用于玉米胚的相分离的装置的横截面视图。

图18图示说明螺旋形椴木(limewood)泡分配装置。

图19图示说明漂浮在由螺旋状椴木泡分配装置产生的泡沫顶部的胚。

图20图示说明通过使用浮选过程分离胚乳和胚。

图21描述用于在胚分离器的空气-流体界面的表面从泡沫收获胚的真空过滤装置。

图22包括如实施例19所述的胚分离装置的示意图

图23描述如实施例20所述的用于通过浮选分离胚的替代装置。

图24图示说明与用于从组织培养提取和分离玉米胚组织的装置组合的胚提取器的顶视图。

图25描述用于旋转多个穗并提取胚的提取器的端视图。

图26图示说明胚分离器的侧视图。

图27图示说明示例性的液位调节器。

图28图示说明用于种子和/或果实组织的示例性网状或狭槽保持器。

图29描述种子或果实保持器的薄片和圆筒形的实施方式。

图30图示说明包括压力凸轮或螺杆的种子或果实保持器的实施方式。

图31图示说明用于棉花胚发生组织分离的包括椴木泡分配装置的外植体分离器。

图32描述漂浮在如图31所示的微泡分配装置中产生的泡沫顶部的棉花外植体。

图33显示经切除和筛选(左)或切除、筛选并另外使用微泡技术纯化(右)产生的棉花外植体的纯度比较。

具体实施方式

除非另有规定，本文所用的所有科技术语在本说明书的上下文环境中出现时，具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的意思。在说明书文字与通过引用并入材料不一致的地方，则采用本说明书提供的定义和意思。本文所使用的命名以及下文所述的生产或实验室方法为本专业的技术人员公知和常用的。

短语“充分分离的”或“提取的”指处理存在于较大组织复合体(例如，种子)中或形成为其部分的目标组织(例如，胚或其它组织外植体)以使得目标组织与较大复合体的至少一半物理分离。在某些实施方式中，充分分离的目标组织可能与较大复合体的至少大约20％、30％、40％、50％、60％、70％、85％、90％、95％、97％、98％或99％或其任何分数的部分分离。在其它实施方式中，目标组织与较大复合体的超过大约80％至大约100％、大约90％至大约100％、或大约99％至大约100％，或其间的任何分数的部分物理分离。在某些实施方式中，目标组织可以会与较大复合体的大约100％物理分离。

虽然充分脱离的目标组织与较大复合体的某一百分比的部分物理分离，但是它不必从该复合体纯化。换句话说，充分分离的目标组织可以与较大的组织复合体保持在一起，只要目标组织与复合体物理分离(如上所述)。然而，在某些实施方式中，可能需要从充分分离的目标组织中除去分离的复合体的一部分或全部。所有这些实施方式都在本发明的范围之内。

短语“目标植物组织”指打算充分分离的植物组织或种子的一部分。在本发明中，目标植物组织指可以充分分离并用于遗传转化或组织培养的植物或植物种子的任何部分。在某些实施方式中，目标植物组织是胚，例如单子叶植物如玉米的不成熟胚。在其它实施方式中，目标植物组织来自双子叶植物如大豆(大豆属(Glycine sp.)，包括大豆(Glycine max))或棉花(棉属(Gossypium sp.)，包括棉花(G.hirsutum))。

短语“适于遗传转化”和“适于组织培养”指有能力分别在合适的植物培养条件下转化或生长的植物组织。本领域的技术人员可以通过使用常规实验很容易地确定特定的目标组织是否适于遗传转化或组织培养。例如，可以在合适的植物培养基(本领域的技术人员也已知)上培养来自一批充分分离的目标组织中的样品以确定这些组织是否能够生长和再生。相似地，充分分离的目标组织的样品可以进行转化，并筛选异源核酸分子的存在。这些技术是常规的，并且可以快速确认哪些组织能够转化或组织培养，以及哪些(如果有的话)不能。

充分分离目标植物组织

本发明提供了充分分离适于遗传转化和/或组织培养的目标植物组织的方法。在某些实施方式中，目标植物组织是胚。在一种实施方式中，胚是单子叶植物的胚，如来自玉米。在某些实施方式中，充分分离的目标组织可以整体或部分分离。例如，一批充分分离的不成熟胚的可以包括完整的胚、部分的胚或其混合物。优选地，该完整的和/或部分的组织适于遗传转化、组织繁殖、植物再生和其它组织培养应用。

在组织正通过使用，例如选定的培养基流分离时，可以提供收集容器。在某些实施方式中，为了提高装置效率，减少混乱，防止喷射流的不需要飞溅和/或限制提取的组织在收获过程中的任何逸失，向这种收集容器提供覆盖是有利的。可以使用任何合适的容器或容器盖。在本申请的其它地方给出实例，且这些也是本领域技术人员已知的。

容器的合适盖子可以包括那些由金属、木材、玻璃、丝网、织物、塑料、橡胶、胶乳、丙烯酸树脂和功能上相当的材料制成的盖子。在某些实施方式中，材料是柔性的以使得允许玉米穗的穿透和移除而同时在提取过程中保持玉米穗周围基本的水密封。该材料可以提供允许玉米穗进入与移除的合适的开口。在某些实施方式中，该材料是固体，并包含用于在提取过程中接收和保持玉米穗的柔性孔。在其它实施方式中，该材料是柔性的。这种柔性材料可以在容器上拉伸以形成液密配合，但是允许玉米穗通过穿透该材料或通过提供接受玉米穗的开口插入。在更另外的实施方式中，该材料是丝网或具有柔性开口的筛网。

盖子可以是可移动的或半永久性连接的。在某些实施方式中，该材料由弹性带或等同的固定装置固定。在其它的实施方式中，盖子通过重物、摩擦环、钩、夹子或其它功能等同的固定装置保持定位。

盖子可以由柔性材料制成，并且可以具有不同的厚度。这些因素可以变化以实现玉米穗的插入和提取的预期效果。下表(表1)说明某些硅树脂盖的一些硬度和厚度参数。但是，本发明决不限于这些少数的选择。

表1.盖子的硬度和厚度参数。

在一种实施方式中，收集容器用略小于玉米穗和玉米穗所附着的手柄的直径的软质材料膜或薄片覆盖。在一种可选择的实施方式中，在膜上形成小切口以提供更高的柔性。膜可以通过诸如弹性带或摩擦配合环(friction fit collar)等的装置连接在筒上。图8说明如上所述的盖和连接装置的实施方式。

在某些实施方式中，材料是可高压灭菌的。可高压灭菌的材料是本领域技术人员公知的。例如，可以使用如软硅橡胶片的软质材料。本领域技术人员了解可在提供减少提取的组织逸失和防止不需要的飞溅的收集容器的同时允许进行提取的可能材料和物理配置。

植物组织培养和再生的合适方法是本领域的技术人员公知的。参见，例如，Adams等人的美国专利5,550,318、Lundquist等人的美国专利5,780,708、Duncan等人的美国专利申请公开2004/0210958、Lowe等人的美国专利申请公开2004/0016030和Cai等人的美国专利申请公开2004/0244075，它们公开了可用于玉米的转化方法，以及Cheng等人的美国专利申请公开2003/0024014，其公开了可用于小麦的转化方法，本文通过完整引入所有这些文献作为参考。组织培养应用可以包括选自转化、愈伤组织形成、分化植物组织的形成、至少一种成熟植物的形成、至少一种可繁殖成熟植物的形成的至少一种方法及这些方法的组合。从提取的不成熟胚再生的植物可以例如，通过去分化组织(愈伤组织)的分化再生。再生植物可以生长到成熟以提供成熟的植物，包括可繁殖的成熟植物。提取的不成熟胚和提取的非胚组织也可以用于其它目的，例如但不仅限于，遗传或生化分析。

本发明的方法和装置可以应用于任何目标单子叶植物。优选的单子叶植物包括但不限于禾本科的成员，包括谷类作物，诸如玉米(玉蜀黍)、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱、小米和水稻。尤其优选的单子叶植物包括玉米(Zea)种，包括玉米(Zea mays)和小米(如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、狗尾草属(Setaria sp.)、黍属(Panicum sp.))，其在穗中具有通常成排保持的多个籽粒(种子)。

在一般情况下，目标组织与其充分分离的单子叶植物种子以任何合适的方式提供。例如，种子可以附着在种子在其上生长的穗或头上；在某些实施方式中，单子叶植物的种子可以在充分纯化目标组织之前从穗或头上移除。

在某些实施方式中，在单子叶植物种子的果皮或种皮中形成开口。这可以通过任何合适的技术完成，例如，但不限于，用针、锥，刀片或其它合适的工具形成孔、穿孔或切口。在本方法的某些应用中，不需要除去果皮组织；在其它实施方式中，果皮的开口可能包括除去果皮和可能的某些非胚组织(例如，胚乳)的至少一部分。优选地，开口足以从种子充分分离胚。在某些实施方式中，它可能只需要充分地弱化果皮(例如，通过磨损、或通过其它物理、化学或酶处理)，以使得施加到种子上的力导致目标组织如胚的充分分离。

在这种方法中，一般向种子施加足以充分地分离目标组织(如不成熟胚)的力，其中，充分分离的目标组织适于遗传转化和组织培养。可以连续或同时地向多个种子施力。施加的力可以是连续或不连续的(例如，如脉冲式的或波浪式的力)，且一般机械地施加，也就是，通过使用器具或机器而非通过人手。施加的力的大小优选足以克服目标(例如，胚)和非目标(例如，非胚组织，如胚乳)彼此的粘附力，从而允许目标组织和非目标组织的分离。可以使用一个或多个任何合适的力从种子移除目标组织，且多个力可以组合、顺序或同时应用。合适的力包括但不限于：流体射流正压、液体射流正压、机械正压、负压、离心力、线性加速、线性减速、流体剪切力、流体湍流、吸力和流体层流。流体力可以通过任何流体施加，例如，气体或液体或两者的组合。

由于玉米胚位于玉米粒的向顶侧，有可能将液体射流引向玉米粒的向基侧以(如果需要的话)成功地排出胚(参见，例如，图10)。在这样的配置中，射流的全部力一般不直接冲击胚。而是，大部分的力只是间接地施加于胚自身。因此，装置中可应用较强的力以加速胚的除去而基本上不增加对于除去的胚的破坏。

可以通过迫使更大量的液体流过本发明的装置来提供更大的冲击力。然而，在某些实施方式中，可以产生更大的冲击力而不需要更多的液体。例如，在某些实施方式中，减小喷射口的大小以使得可以以较高的速度使用相同体积的液体。由于运动物体的能量与速度的平方成正比，相同体积的射流可以具有大得多的能量。运动物体动能的一次方程等于(1/2)(m)(v²)。液体射流的实际冲击能量的计算也要考虑本领域技术人员已知的其它因素。此外，一些实施方式可以结合使用增加流体和改变喷射口大小的方式以达到预期的力或能量。

例如，具有大约0.01至大约0.25、或大约0.01至大约0.2，或大约0.01至大约0.1，或大约0.01至大约0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02或0.015，或在这些数量之间的任何全整数或分数的gpm参数的喷嘴可以用于本发明中。在某些实施方式中，可以使用具有低gpm参数如0.033或0.021gpm的喷嘴。当在较高压力下使用这种喷嘴，但引向玉米粒的与胚相反的一侧时，可以在避免伤害胚的同时实现加速的胚收获。

在某些实施方式中，在本发明的装置中提供多个射流。这种装置可用于平衡流体射流施加的力，同时减少从玉米穗收获胚所需的时间。

在某些实施方式中，该装置可按照需要具有2、3、4、6、8、10或更多的喷射口/喷嘴以用于传递流体力。在一种实施方式中，有三个开口。这种装置如图9中所描绘。在某些实施方式中，开口设置为水平定向的窄角平流喷射口。然而，在本申请的其它地方提供了喷射口的其它实施方式。直接连接到图9所描述的聚甲基戊烯量筒内的不锈钢喷嘴组件如表2中所示：

表2.喷嘴组件

其余部件主要是用于照片的右侧(图9)的流体源处具有凸式快卸配件的管件和配件。

本发明的方法和装置可以进一步用于从相关的非胚组织(如胚乳、颖片、种皮或果皮组织)分离充分分离的目标组织(如不成熟胚)。可以通过一种或多种合适的技术完成分离，包括但不限于，通过尺寸排阻分离(例如，通过一个或多个过滤步骤进行过滤)、基于疏水性、亲水性或其它力的分离和通过质量或密度差异的分离(例如，通过离心、沉降和倾析的分离)。在例如用于组织培养中不需要另外对完整的或部分的胚进行分离的情况下，一个或多个分离步骤是任选的。

本发明特别适合于其中必须提供大量目标组织的应用，例如，在高通量处理或筛选中，或遗传转化或组织培养的批处理中。该方法的自动化是可能的，例如，通过采用机械手或机械处理玉米穗或种子，打开果皮，对种子施加作用力，或任选的分离步骤。这种自动化可以使用光学或机械传感器以帮助相对于一种或多种施加的作用力或在分离步骤中定位玉米穗或种子。在一种实施方式中，该方法以以下速度提供充分分离的胚：每天大约250至50,000或更多的胚，或每天大约500至大约100,000，或大约250至大约50,000，或大约250至大约20,000，或大约250至大约10,000，或大约250至大约5000，或大约250至大约3000，或大约250至大约1000个胚；或每天大约1000至大约50000个胚等，包括如上所述任何范围之间的任何分数或整数。如上面指出的，本发明克服了胚人工切除的明显产量限制。

用于充分分离目标植物组织的装置

本发明也提供了一种用于充分分离适于遗传转化或组织培养的目标组织(如玉米胚)的装置。在一种用于分离玉米胚的实施方式中，这种装置可以包括至少一个引导流体流的孔，其中，流体流接触玉米穗上的玉米粒并从玉米粒充分分离胚。一般来说，优选流体流在给定的一定时期内尽可能方便地接触尽可能多的玉米粒，以便更快地分离胚。所述孔可以包括单孔或多孔(例如，单个或多个喷嘴)，其可以包括产生扁平、圆形、椭圆形、扇形或其它形式的流体射流的喷嘴，和可调整的移动或固定喷嘴，并可以产生任何合适的类型和介质的流体流。流体可以是气体，如空气、氮气或气体混合物；液体，例如水、生理盐水或各种培养基，如下所述的介质或组合。合适的流体流包括但不限于流体射流，如单个或多个柱状射流；扁平的、锥形的或扇形的射流或喷雾；和片状射流、层状流体流和湍流流体流。合适的流体流可产生各种力以从其玉米粒除去胚，包括正压或负压或两者；这些力可以是均匀或不均匀的、连续或不连续(如脉冲式或波浪式力)的，或其任何组合。

本发明的装置可以进一步包括相对地移动充分纯化的目标组织和流体流的装置。例如，可以移动含有种子的玉米穗或流体流，或两者。装置的各种实施方式可用于单个或多个完整或部分玉米穗。例如，一个或多个玉米穗可以固定于保持器或抓紧器上，其相对于流体流移动。但是，在其它实施方式中，一个或多个玉米穗不需要单个固定在保持器上，而是可以自由移动以使多个玉米粒被所用的力接触而从玉米粒除去胚。用于相对于流体流移动至少一个玉米穗的装置可以相对地旋转玉米穗和孔，或可以沿着玉米穗的纵轴移动液体流，或可以提供玉米穗和孔相对于彼此的任何适当的三维运动，如旋转和纵向运动的组合。

本发明进一步提供了用于将目标组织与非目标组织分离的分离器。例如，胚可以与非胚组织分离，其中，分离的胚包含至少部分适于遗传转化或组织培养的玉米胚。分离器可以通过包括但不限于以下的机制工作：通过尺寸排阻(例如，使用丝网、筛、穿孔表面或其能排除特定大小的物体的装置)分离、基于疏水性或其它引力(例如，使用能够吸引或排斥胚的固体或液体材料)的分离和通过质量或密度差异的分离(例如，使用离心机或使用用于差异沉淀的溶液)。在某些实施方式中，分离器可以是任选的，例如，在用于遗传转化或组织培养中不需要另外分离完整的或部分的胚的情况下。

如上所述，充分分离的不成熟胚包括至少部分适于组织培养应用、转化、愈伤组织形成、直接的胚形成、分化的植物组织的形成、至少一种成熟植物的形成、至少一种可繁殖成熟植物的形成，以及这些方法的组合的胚，例如不成熟的完整或部分的胚。充分分离的不成熟胚和非胚组织也可以用于其它目的，例如但不仅限于，遗传或生化分析。

本发明进一步提供了用于以机械方法从至少一个不成熟的玉米穗分离多个适于遗传转化或组织培养的玉米胚的装置。在一种实施方式中，该装置包括选自以下的至少一个组件：(a)至少一个用于向不成熟玉米穗的玉米粒外部施加机械正压的固体表面；(b)用于引导流体流的孔，其中，流体流与玉米穗上的玉米粒接触；和(c)用于施加接触玉米穗上的玉米粒的负流体压的孔；其中，该组件施加足以从玉米粒充分分离适于遗传转化或组织培养的胚的力。可以以连续或非连续的方式顺续或同时地向多个种子施加力，且通常机械地施加而非通过手动施加。多个力可顺序地或同时组合使用。合适的力包括但不限于：流体射流正压、液体射流正压、机械正压、负压、离心力、线性加速、线性减速、流体剪切力、流体湍流和流体层流。流体力可以通过任何流体(气体或液体或两者的组合)施加。

本发明的组合装置可以任选地包括用于相对于分离胚或其部分的一个或多个作用力源移动至少一个玉米穗的装置。一个或多个穗可以相对于作用力源移动，以使得一个或多个力在一定时间内尽可能便利地接触尽可能多的玉米粒，以便能更迅速地分离胚。

本发明的组合装置可以进一步包括至少一种用于进一步分离适于遗传转化或组织培养的充分分离的不成熟胚的装置。分离器可以通过包括但不限于以下的机制发挥作用：通过尺寸排阻分离、基于引力进行分离和通过质量或密度差异进行分离。

用于切除玉米或者其它植物胚的液体培养基

在一种实施方式中，本发明提供了用于充分分离适于遗传转化或组织培养的目标植物组织的培养基和方法。例如，流体喷射装置利用液体切除胚，需要大量的液体用于切除。因此，例如，从一个玉米穗切除胚可能需要大约20L的液体培养基。因此，该培养基优选很容易制备(基本上由一种或两种成分组成)、可灭菌(例如，通过在线过滤单位)，且可以流过在大约30-75psi(例如大约40-60psi)压力下操作的流体喷射装置。此外，优选在使用前不需要调节pH。为了节省资源和费用，也优选可重复使用。

培养基如Lynx #1013接种培养基和Lynx #1902(半强度Lynx#1013)已成功地用于切除用于组织培养的玉米胚的自动化方法和装置中。然而，这些培养基具有多种成分，并需要在使用之前调整pH。因此，本发明者已开发了优化可以用于组织培养胚的自动胚切除方法的效率的培养基。令人吃惊的是，本发明者特别发现基本上由水和/或具有大约0mOsm/kg至大约600mOsm/kg的摩尔渗透压浓度的渗透剂组成的培养基是有用的。

在某些实施方式中，对渗透剂而言，优选大约0mOsm/kg至大约600mOsm/kg的摩尔渗透压浓度，包括大约7mOsm/kg至大约500mOsm/kg、大约13mOsm/kg至大约300mOsm/kg、大约25mOsm/kg至大约300mOsm/kg、大约50mOsm/kg至大约300mOsm/kg、大约13mOsm/kg至大约200mOsm/kg、大约13mOsm/kg至大约100mOsm/kg或大约100mOsm/kg至大约300mOsm/kg。在特定的实施方式中，提供的培养基基本上由无菌蒸馏水、稀释氯化钙(例如大约10ppm)、0.05％的MES，pH 5.4-5.8、大约5％蔗糖+/-MS盐或大约0.05-0.5M的甘露醇(包括0.1-0.2M的甘露醇溶液)组成。虽然通过使用部分这种液体培养基切除的植物胚的转化频率(TF)在某种程度上比使用例如Lynx #1013接种培养基时的转化频率降低，但由于使用较简单的培养基产生的显著的时间和成本效率可以通过使用相同量的资源产生较多的外植体胜过TF的任何降低。

在本发明的特定实施方式中，切除培养基包括渗透剂甘露醇和/或蔗糖，例如基本由0.05-0.5M甘露醇组成的培养基。据发现，这种培养基能产生有活性的外植体。在特别的实施方式中，切除培养基基本上由大约0.1-0.2M的甘露醇组成。例如，0.2M的甘露醇水溶液的摩尔渗透压浓度是例如大约225mOsm/kg。在其它实施方式中，也发现无菌蒸馏水以及5％的蔗糖(w/v)是适用于本发明的简单而有效的培养基。

培养基制备系统

与流体喷射装置一起使用的培养基制备系统(MPS)是本发明的另一种实施方式。例如，MPS可以用来提供上述的切除培养基。MPS可由外壳(MPSH)和混合室(MC)组成。MPS可由合适的材料制成，如铝(如7075航空级铝)或钢。混合室一般包括具有上端和下端的罐，并可以包括凸缘和盖板。盖板一般具有一个或多个O形环或其它密封混合室的密封装置。盖板包括用于插入和除去液体和其它培养基成分的开口。液体和其它培养基成分可以通过混合室中包括的一个或多个入口加入，所述入口可与容纳和/或传输成分供应源的室和/或管线相通。盖板也可以包括用于感应制备的培养基的特定体积的电子传感器。混合室可以定位于支撑板上，并通过保持装置(如安装销和定位支架)固定于工作位置。支撑板可滑动地连接于MPSH。在某些实施方式中，混合室连接到流体喷射装置，例如通过钢或聚碳酸酯管。

混合器组件可以连接到混合室的盖板或其它部分。该组件可以包括安装在悬挂装置(如高温滚珠轴承)上的叶轮和轴杆。混合器可在使用前高压灭菌。MPS可以进一步包括与传感器通讯的可编程逻辑控制器(Programmable Logic Controller)(PLC)以监测成分进入、培养基制备和随后的培养基移除，例如通过连接到液体喷射装置的流体流出管。一个或多个流体流入和流出管可以包括在线过滤单位以对制备的培养基除菌。

用于胚的相切除的装置

用于制备多个适于组织培养的胚的方法和装置是本发明的实施方式，其中，所述方法包括使用用于从种核充分提取胚和胚乳的至少两个流体流，所述装置包括用于引导从种核充分提取胚的第一流体流和第二流体流的至少一个孔。该装置可以进一步包括用于相对于第一和第二流体流移动至少一个种穗的装置。在某些实施方式中，种穗或种核是玉米穗或玉米粒。

流体流可以是气体流或液体流。在某些实施方式中，流体流包括液体，且在特定的实施方式中，液体基本上由蒸馏水、大约5％的蔗糖或大约0.05M-0.5M的甘露醇(例如大约0.1-0.2M的甘露醇)组成。流体流可以施加用于充分提取胚的力，包括一种或多种选自流体射流正压、液体射流正压、机械正压、负压、离心力、线性加速、线性减速、流体剪切力、流体湍流和流体层流的力。流体流可以是连续的或脉冲式的。在某些特定实施方式中，流体流是无菌的。

为进行自动化处理，本发明的装置可以进一步包括用于检测切除的胚乳和胚组织的装置以及用于为胚乳或胚提供通道的装置。用于检测的装置和用于提供通道的装置可以进行连接(例如电气连接)以有助于自动化。本发明的装置也可以包括用于从非胚组织分离胚的至少一个分离器，其中，分离的胚是适于组织培养的胚。分离器可以通过差别的疏水性、通过尺寸排阻、或通过差别的密度将胚与非胚组织分离。胚组织可以培养、转化和/或再生以产生至少一个可繁殖的植物。在特别的实施方式中，胚是玉米胚，且植物是玉米植物。

通过浮选法分离胚

本发明进一步提供了基于选择的试剂相对于非胚种子组织的差异亲和力分离胚的装置和方法。在某些实施方式中，胚(如通过流体射流切除方法产生的玉米胚)通过疏水作用接触和附着于气泡。在其它实施方式中，种皮接触并附着于气泡。气泡可以包含选自下面的一种或多种气体：无机气体，如氩气、空气、氧气、氮气；和共价有机气体，如甲烷、乙烷或丙烷，它们对切除的胚的生存性和可转化性不产生严重影响。

据发现，泡的大小对分离过程的效率具有重要作用。在实践中，可以产生表现出一定大小范围的(气)泡。然而，适用于附着到胚或种皮上并使它们上升到流体表面的任何泡大小属于本发明的范围。

气泡的大小分布可能随许多因素而变化，例如：

玻璃料(frit)均匀性：组成玻璃料的微粒之间的开口可能发生变化，使得形成各种大小的气泡。

气流速度：气体通过产生气泡的玻璃料的气流速度也影响气泡的大小-如快速气体流产生较大的气泡。

表面活性剂及其浓度：培养基添加剂(如甘露醇和PEG)以及从破坏的玉米粒中释放的具有表面剂活性剂性能的蛋白质和其它物质可能会影响气泡的大小。

气泡合并：随着气泡上升到罐的顶端，其中某些气泡与其它气泡合并。

静水压力：在浮选罐的底部附近的气泡由于槽底的较高压力而平均略小，虽然鉴于浮选槽的尺寸，这种影响是微小的。

此外，不需要单一气泡携带单个胚或种皮一直到达表面。相反，胚或种皮可以仅仅被单一气泡部分携带到表面，以进一步被其它气泡的顺次附着而携带。另外，胚或种皮可能不达到表面，而是第一次嵌入周围泡沫中，但可以在到达空气和液相(例如“泡沫”)界面前循环多次。

例如，大约1毫米直径(即，如果是球形，其为直径；或如果是非球形，则其为最大尺寸)或更大的大气泡由于几个原因而不能得到很好的分离。举例来说，这样的气泡移动足够快以致于它们液动地将胚及碎片推开。因此，这样的大气泡往往不能充分接触到胚。这种气泡与胚或种皮也没有足够的接触时间以实现有效的气泡附着。最后，这样的气泡到达流体表面时会产生足够大的剪切力，以致于附着于气泡的任何胚往往在到达表面之前脱离。

小气泡，如直径是大约100微米或更小的气泡，附着于碎片以及胚。这是因为气泡穿过流体足够慢地移动以致于它们不能把较小的材料(如胚乳碎片)推开。因此，这样的气泡接触并附着于胚以及其它较小的碎片。最后，这样的气泡不能产生足够的剪切力以有效地驱除附着的碎片。

中等大小的气泡(大小在100μm和1mm之间)在实现胚纯化中相对比较有效。这种气泡明显地产生足够低的流体动力学位移，从而允许气泡与胚接触，因此发生附着。此外，这种气泡不产生足够的剪切力以驱除附着的胚。

分离过程的另一方面涉及到气泡中存在的气体的物理性质，即气泡对于胚或种皮的选择性。空气是大约21％的氧和78％的氮。氧和氮都是共价键合的双原子分子，并对于胚(如棉花胚)的类似地共价(非极性)蜡样部分有强的亲和力。相反地，这种气体在与保持漂浮在培养基中的相对极性的胚乳碎片的附着方面效率较低。简言之，该气泡与水性流体(例如水或甘露醇/水)竞争附着到胚的蜡样表面。因为氧和氮分子的共价性超过水分子，所以它们优先附着于胚表面。因此，氧气和氮气的相对亲脂性和水性介质的相对亲水性解释了气泡与例如，棉花胚表面的亲脂性部分的结合。或者，据发现气泡有效附着于上升到在液-气界面的“泡沫”的大豆种皮上，而据发现大豆胚(包括大豆胚轴和子叶)保留在液相中。因此，差异性地附着于各种种子成分以及将它们引导到不同位置、相或部分的试剂可以用来在给定的位置、相或部分富集种子成分(如胚或胚的一部分)。

在一种实施方式中，空气用于制备气泡。在实施本发明中可用的其它气体包括氧气或氮气，以及除氧气或氮气以外的共价无机气体，包括惰性气体如氩气。共价有机气体，如甲烷、乙烷和丙烷，及其它不严重影响玉米胚的生存性和可转化性的亲脂性气体或气体混合物也可以使用。

在最广泛的意义上说，“气泡”可以由任何对胚显示优先结合的材料制成，包括选择性地附着于胚表面的固体或液体或其混合物。可以利用胚选择性附着的形状，如移动的平面表面，例如带或盘。在一种实施方式中，漂浮在液体培养基表面上的胚优先附着在疏水性滤纸(Whatman PS水排斥相分离纸，用硅氧烷浸渍)片上。在另一种实施方式中，与胚和碎片悬浮液混合的菜籽油优先附着于胚上，并在油上升到表面时将它们携带至表面。

彼此接触的气泡可以在毫秒时间内合并。在气泡上升时稳定气泡保持了合适的气泡大小分布，并在浮选液体顶部产生稳定的泡沫。已证明几种表面活性剂可以用于防止聚并和稳定气泡。优选地，表面活性剂是离子表面活性剂或非离子表面活性剂，如聚醚。聚醚可以是PEG。PEG可以具有大约100、300、400、600、900、1000、1450、3350、4500、8000和9000的平均分子量。优选地，PEG具有大约8000的平均分子量。PEG以足以防止气泡过早聚并的水溶液浓度使用。另一种合适的聚醚是PPG。PPG具有大约340至大约3500的平均分子量。优选地，PPG具有340的分子量。PPG可以足够防止气泡聚并的水溶液浓度使用。

在一种实施方式中，可以通过烧结的细孔玻璃分散管(Chemglass，NJ，USA)产生气泡，所述细孔玻璃分散管连接用于通过除菌过滤器泵送空气并使空气进入用于产生气泡的玻璃分散管的潜水泵。分散管可以放置在含有悬浮的胚和碎片混合物的容器中，如量筒或烧杯。然而，由该设备所产生的大群气泡所产生的强对流产生相当大的剪切力而降低胚与碎片分离的效率。或者，气泡可通过另一种方法产生，例如多点源气泡发生器(如，利用椴木碎片的泡沫分散装置，或具有孔的陶瓷表面)。

在某些实施方式中，表面活性剂可用于稳定气泡并防止其聚并。表面活性剂可以是离子型或非离子型表面活性剂。表面活性剂以足以防止气泡聚并的水溶液浓度使用。在某些实施方式中，表面活性剂是聚醚。在特定的实施方式中，表面活性剂可以是PEG或PPG。PEG表面活性剂的分子量可以是大约100至大约9000道尔顿，例如大约100、300、400、600、900、1000、1450、3350、4500、8000或9000道尔顿。或者，表面活性剂可以是PPG，且PPG的分子量可以是大约340至大约3500道尔顿，例如，大约340道尔顿。

可以通过产生和分散气泡的装置产生气泡。例如，细孔玻璃分散管或起泡装置可以连接到潜水泵并放置在容纳有悬浮的胚和碎片混合物的容器中。在某些实施方式中，气泡产生和分散装置包括多点气泡源，如椴木的单个碎片。碎片可以插入到基质中，如硅树脂管的长度，并任选地盘绕成螺旋和固定。

当胚已被气泡携带到液体界面时，它们可以通过合适的装置从表面泡沫除去，例如通过重力溢流，或除沫器(skimmer)或真空装置。该装置可以是自动的。

用于提取和分离胚的组合装置和方法

在进一步的实施方式中，本发明提供了用于提取和分离适于组织培养的胚的组合装置。提取器可以与分离器连通，或者它们可以单独操作。提取器包括一个或多个用于从种子提取胚(如玉米胚)的流体喷射口。种子可能是玉米穗轴上的玉米粒。一个以上液体喷射口可以指向单一穗轴，且一个以上穗轴可以同时放置在提取器中。

从籽粒提取胚后，胚和碎片可能会落入或被转送到胚分离器中，所述分离器包括，例如，浮选室。用于转送到浮选室以及从浮选室输出的装置可以是一条或多条筛选传送带，或是可通过尺寸排阻将胚与碎片分离丝网。带或丝网可以是编织的或模制的热塑性塑料。在将胚加入浮选室后，胚优先与其它碎片分离，例如通过描述的气泡法，并漂浮到它们可以经开口或斜槽除去的表面。

因此，可以收获玉米穗，且可以使用流体射流切除胚。为了有助于通过液体射流切除胚，可以除去玉米粒的顶端，且可以通过射流将玉米粒内容物从穗充分除去。流体射流可以是包括所描述的具有大约0-600mOsm/kg的摩尔渗透压浓度的切除培养基的液体射流。在特定的实施方式中，切除培养基是无菌溶液，例如0.1-0.2M的甘露醇。可以通过射流从穗轴和玉米粒提取胚以及非胚(如胚乳)组织。随后，可从非胚组织充分分离胚，例如通过所公开的使用剪切力的分离方法和装置，包括胚的浮选，以及通过筛分等。然而，即使是胚或胚组没有与包括玉米粒的其它组织分离，也可以用于随后的组织培养，包括转化和转基因植物的再生。

如果浮选方法用于分离，可以将表面活性剂添加到分离胚的培养基中。表面活性剂，如PEG或PPG，减少气泡的聚并，从而保持有效的平均气泡的大小以促进胚与非胚组织的有效分离和胚在气液界面的沉积，胚可以在此处通过流体流、除沫器或真空装置等收获。通过这些方法，可以获得适于产生转化的组织和转化的植物的充分切除和分离的植物胚。

转化的植物以及生产它们的方法

本发明还提供通过以下步骤生产的转化植物，如玉米、棉花或大豆植物：(a)使用本文描述的一种或所有方法或装置提供至少一种可转化的目标组织；(b)将选择的核酸分子引入可转化的目标组织从而产生转化的外植体；和(c)从转化的外植体培养转化的单子叶植物。本发明的优选的植物包括禾本科的成员，包括谷类作物，诸如玉米(玉蜀黍)、小米、小麦和水稻；以及转化的双子叶植物，如棉花或大豆植物。

特别优选的单子叶植物包括转化的玉米类，如玉米。转化的玉米优选优选包含至少一种可以赋予转化的玉米需要的性状的异源核酸分子，如除草剂耐受性、抗虫性、冷发芽耐受性、水分缺乏耐受性、高产率、高产量等等。以下文献公开了用于产生本发明的转基因单子叶植物的可行的转化方法和材料(例如，各种培养基和接受体靶细胞，不成熟胚的转化及可繁殖转基因植物的随后再生)，例如，McElroy等人的美国专利6,194,636、McElroy等人的美国专利6,232,526、Houmard等人的美国专利申请公开2004/0216189、Cai等人的美国专利申请公开2004/0244075，它们公开了可用于玉米的方法，和Cheng等人的美国专利申请公开2003/0024014，其中公开了可用于小麦的方法，本文通过引入所有这些文献作为参考。单个或多个异源核酸分子可以用于转化本发明的单子叶植物；例如，用于基因表达的协调减少和增加的构建体在Van Eenennaam等人的美国专利申请公开2004/0126845中公开，本文引入该文献作为参考。许多转化其它植物(包括双子植物)的方法是本领域的技术人员公知的。举例来说，美国专利申请12/045,502或美国专利7,002,05描述了转化大豆和棉花植物的方法，本文引入这二者作为参考。

在某些实施方式中，例如，当利用土壤杆菌(Agrobacterium)-或其它细菌介导的遗传转化方法时，可以通过使用包含杀菌剂如羧苄青霉素和/或大约0.5-1.5mg/L的2，4-D的共培养培养基提高通过本发明的方法分离的胚发生组织的培养应答或转化频率。在特定的实施方式中，共培养培养基包含表9的培养基1898的成分。

可以收获所得到的本发明的转基因可繁殖植物的种子和用于培养基因组中包含异源核酸分子的转化植物的后代世代，包括杂种世代。因此，本发明包括原代转化植物(“R0”植物，通过转化按照本发明的方法提供的胚产生)及携带该异源核酸分子的其后代。这种后代转基因植物可以通过将本发明的具有异源核酸分子的转化单子叶植物与没有该构造体的第二植物杂交而获得。另外，本发明的转化单子叶植物可与具有赋予另一种性状的其它异源核酸分子的植物株系杂交以产生具有赋予多种性状的异源核酸分子的后代植物。

为了提供对于包括这些术语的给定范围的说明书和权利要求的清晰和一致的理解，现提供下列定义。

“胚”是种子的一部分，由叶、茎和根前体组织(分生组织)以及一个或多个子叶组成。一旦胚开始生长(发芽)，它成为幼苗植物。

“分裂组织”或“分生组织”由未分化细胞(分生细胞)组成，分生细胞分化以产生多种植物结构，包括茎、根、叶、芽和种子。分生组织细胞是用于获得转基因植物的转化的靶点。

“外植体”是用来指转化的靶材料的术语。因此，在本文的实施方式中，它可与“分生组织”或“胚”互换使用。

实施例

本领域的技术人员可以理解本发明提供的方法和组成(compositions)的许多优势。下面的实施例用来说明本发明的优选的实施方式。本领域的技术人员应该理解：实施例中公开的技术遵循本发明者发现在实施本发明时运行良好的代表技术，因而可以认为构成其实施的优选方式。然而，本领域的技术人员在参照本公开的情况下可以理解：可以在公开的具体实施方式中进行许多变化并仍然获得同样或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。本文提到的文献通过引用引入本文从而它们补充、解释本发明采用的方法、技术或组成、为其提供背景或教导。

实施例1：压出多个玉米胚的方法

本实施例描述使用来自挤压装置的机械正压产生适于组织培养和遗传转化的胚的方法。

用蔬菜去皮器(vegetable peeler)从玉米(zea mays)的不成熟穗无菌除去玉米粒的顶部。使用轻微的锯式运动将去皮器从玉米穗基端推向顶端，以实现玉米粒的快速、明确的截断。虽然在这个例子中，单个玉米粒被截断而暴露其内部组织，但在其它的实施方式中，可能只需要确保在果皮中形成开口(如穿刺或切开或磨损)而不实际去除果皮材料。在需要完整胚的情况下(例如，用于转化的完整胚)，优选任何开口的大小足以允许除去胚而不破坏它。可以通过使用任何合适的装置(包括但不限于刀片和研磨材料)实现果皮的开口。例如，蔬菜去皮器设计为相对安全和快速地使用；它具有调整的切削深度，且比用手术刀需要更少的技能。可以采用具有类似功能的其它工具。打开果皮的装置优选是灭菌的，例如通过高压灭菌或加热或通过化学灭菌。这些果皮处理过程可以自动实现，例如，可以使一个或多个刀片或者研磨机电动化。

对着截断的玉米粒的基部推动灭菌挤压器(在这种情况下，4mm直径的杆)。可以采用其它合适的挤压设备。优选地，这种装置应该具有能够向截断的玉米粒基部施加相对局部力的大小和形状，以排出胚和胚乳。优选地，施加的力量具有足够的强度，并以适当的方向施加，从而使得推进挤压装置不会“骑到”前方玉米粒上。挤压装置的后缘优选还具有排出的胚和胚乳积累于其上的表面；例如，可以使用具有圆形前沿的不锈钢平板。在本实施例中，从果皮轻轻地挤出胚，随后是胚乳。压出的胚和胚乳留置在前进的挤压杆的顶部，并在此过程中不被碾碎。

胚和胚乳混合物用水性流体介质(例如水、液体培养基或盐水)清洗到具有菱形开口(大约2x3mm)的丝网上。观察到胚乳大部分保留而将较小的胚及一些较小的胚乳碎片通过筛网清洗到收集容器中。收集的胚清洗两次以除去小碎片。

清洗的胚通过浮选过程进一步纯化。在浮选过程的第一步中，从收集容器彻底排出水性流体介质以使其简短干燥(例如，大约1分钟)，这样使得残留的水性介质与胚的蜡质表面分离，使它们直接暴露在空气中。加入新的水性介质，且大多数胚因为它们的蜡质表面没有被液体再湿润(rewet)而漂浮。非胚组织(如胚乳碎片)保持浸没在介质中，因而获得胚和非胚组织的清晰的分离。可以通过更迅速、完全或可重复在排出水性介质(如通过使用抽吸)或通过毛细管作用(例如，使用置于收集容器中的灭菌的吸收剂以将流体吸离压出的胚)改善压出胚的浮选。

在初步实验中分离大约100个胚的产量，其中，只处理了来自完整穗的胚-胚乳材料的一部分。这些结果表明，本发明的方法对于从玉米穗轴收获大量不成熟胚是实用和方便的。

通过本发明的方法分离的胚然后可以用于组织培养过程，例如，产生转基因玉米植物的再生方法。通过以下步骤很容易将分离的胚转移到培养基上：把尖端闭合的镊子放在漂浮的胚下方，用镊子将没有液体的胚举起并将它们放置在培养基上。另一种技术是可以用具有疏水表面的工具拾取分离的胚。另外的技术是通过疏水性转移胚，例如，通过小的空气气流或突然的机械运动使得它们的动能超过将它们保持在工具上的疏水力而将它们转移到培养基表面。

实施例2：胚大小的目视判定

本实施例描述如实施例1所述的本说明方法的一种实施方式的改进。使用如实施例1所述的方法，未成熟的玉米胚需要接近玉米粒的截断部分，以便最大量地排出。未成熟玉米胚的大小的差异是确定待去除的玉米粒顶部量的重要考虑因素。胚在穗的中间部分往往最大，向末端则稍小。较小的胚，例如长度小于大约1.5mm，更难以取出，除非它们接近截断部分。

确保从不同大小的胚上方切除足够的玉米粒部分的一种方法是在截断过程中在低放大倍率下观察穗轴。例如，使用低放大倍率护目镜(例如，配有7号透镜的Donegan Opti-VISOR双眼头戴放大镜，其提供2.75X的放大倍率)来帮助目视判定胚的大小和果皮的适当截断。如果第一次切割没有除去足够的玉米粒顶点，可以进行第二次切割。可以使用其它具有相同或类似的放大倍率的低放大倍率装置。例如，Opti-VISOR的可用透镜提供从1.5至3.5X的放大倍率。

实施例3：胚和胚乳的压出

本实施例描述如实施例1所述的本说明方法的一种实施方式的改进。动力装置可用于帮助胚和胚乳的压出。例如，配备有圆形挤压装置的电动铲刀如WeCheer 320电动铲刀(WeCheer IndustrialCo.，Taichung Hsien，Taiwan，R.O.C)可以用来减少个人用于排出胚和胚乳所需要的力。可以获得和类似地使用其它的动力装置。优选地，这种工具的“铲刀”部分(或该工具的任何可以接触胚的部分)可以方便地灭菌，例如，通过插入到珠灭菌器(bead sterilizer)中。

在一项实验中，不锈钢称量铲(weighing spatula)的刀片朝向其自身弯曲以提供具有圆形前缘的挤压装置。在插入WeCheer 320电动铲刀中后，大约10厘米长的部分从电动铲刀的夹具伸出。该组件用来从截断的玉米粒的单排排出胚和胚乳。随着挤压装置(改进的铲)沿玉米粒的排向下移动，观察到铲向左或向右滑离中心的轻微倾向；但是，这一趋势可以通过在各外缘上包括铲的小型龙骨样延伸部分来校正。

实施例4：机械化的胚压出

本实施例描述如实施例1所述的本说明方法的一种实施方式的改进。胚压出过程的机械化可以通过合适的装置实现，例如但不限于本文中所描述和图1中示意性描绘的装置。该装置包括两个电动机。第一电动机(D)是步进电动机，其可以旋转玉米穗(A)以使得新的玉米粒排暴露于两个压出杆(G)，压出杆(G)施加作用力以将胚和胚乳挤压出其果皮。

杆(G)方便地位于穗的相对侧以平衡相对于穗的纵轴施加于穗的压力。但是，可以使用单个杆或两个以上的杆；在使用多个杆时，优选它们定位以使得将产生的机械压力均匀分布在穗周围。杆不需要是直杆；在该装置的一种实施方式中，使用围绕穗周的柔性“环(collar)”而不是刚性杆。在另一种实施方式中，多个短杆或辊以可以沿穗的纵轴滑动的灵活的圆形配置排列，从而同时向许多或所有玉米粒排施加机械压力。

第二电动机连接到与齿条(rack)(F)连接的小齿轮(piniongear)(E)上以使得穗可以上下直线运动。穗的基部通过从手柄向下延伸进入穗的基部的螺杆牢固地保持在手柄(B)上。手柄的窄的中部是方的以使得它不会旋转，除非它所附着的保持器(C)由步进电动机(D)旋转。

在插入到机器之前，如实施例1所述截断玉米粒的顶部以使得胚和胚乳可以被挤出。要启动这一过程中，降低穗到直至2个杆(G)靠近恰好在手柄(B)下方的穗基部。然后杆压靠穗的两侧，并且齿条和小齿轮组牵引穗向上。出现这种情况时，胚和胚乳从一对玉米排中取出，向下落入停在基部(I)上的收集盘(H)，并收集成堆(J)。当杆接近穗轴的顶端时，穗轴向上撤回到原来的起始位置，并由步进电动机稍稍旋转直至新的玉米粒的排进入位置。

本机器的各种程度的自动化是可能的，包括传感器以自动调节垂直起点及终点位置以及旋转的开始和结束位置。齿条和小齿轮并不是可以获得直线运动的唯一方法。对于某些应用优选使用气动装置或液压装置。可以通过适当的机构自动打开杆(G)。当负载新的穗时，优选将穗升到足够高的位置以清洁杆。

实施例5：胚的疏水分离

本实施例描述如实施例1所述的本说明方法的一种实施方式的变型。在分离应用中，目标材料经常出现在不同相(例如，在水性和亲脂溶剂之间)的界面处。从这样的界面除去目标材料可能会产生问题，且在过去一直是涉及提取剂和待提取材料密封接触的手工过程。通常成功分离出组分的唯一途径是使用相同极性或疏水性/亲水性的材料。在通过本发明的方法压出的不成熟玉米胚的情况下，胚在水性/空气界面处存在。玉米胚的表面是蜡性的，即亲脂或疏水的，且当胚表皮与具有类似的疏水性的物质接触时，胚往往会粘附到疏水性表面上。胚的疏水性降低了它周围水的表面张力，这有助于胚“漂浮”在水性/空气界面的表面上。

利用这些物理特性的优势的一种方法是，使漂浮的胚与疏水性材料如疏水滤纸(Whatman No.1 PS纸)接触，其是用硅氧烷(Whatman plc，Brentford，Middlesex，U.K.)浸渍的水排斥相分离纸。在一种实施例中，一片灭菌的疏水滤纸可以下降到漂浮胚的整个容器上，并将它们一次性取出。在另一种实施例中，小片的疏水滤纸可以用来依次取出许多胚，并将它们转移到下一个容器。在第三种实施例中，小片疏水性纸或疏水吸量管尖端可以用于接触和取出单独的胚，然后用来自吸移管管理器(pipettor)的气流分配它们。还可以通过将吸量管插入一小段疏水管(例如硅橡胶管)来修饰普通吸量管以用于这样的用途；胚然后可以通过疏水吸引到疏水管远端而取出，接着通过分配来自吸移管的空气流而释放。疏水胚周围降低的表面张力有助于它们浮在水性表面上，而漂浮的胚也可以通过在水性表面上移动(例如，通过指向胚的空气射流)来转移。可以使用已有装置(如设计用于挑取菌落或在染色的二维蛋白质凝胶上回收蛋白点的机器)的改进使胚的获得和分配自动化。

实施例6：排出或压出胚的进一步的方法

本发明的方法包括使用各种类型的力或力的组合将胚与种子分离。本实施例描述了进一步的实施方式。在如实施例1所述的一种基本方法中，向截断的种子(如玉米粒)的基部施加机械正压以通过截断的种子顶部排出胚。

在另一种实施方式中，离心力可以用来排出胚。例如，玉米穗(其玉米粒已经被预先截断)可以绕其纵轴以足以沿径向轨迹排出胚和/或胚乳的速度旋转。可以通过任何适当的技术实现旋转，例如但不限于，使玉米穗顶端接触自由旋转的锥体，其中穗的旋转保持在有限的纵向范围内，例如，通过穗的基端连接到手柄上，手柄随后插入其可以在其中旋转的保持器内。在一种使用离心力的示例性实施方式中，用手术刀除去玉米穗上各个玉米粒的顶端的大约三分之一，并且穗在表面上滚动以使玉米粒中的胚和胚乳松弛。穗被折断成为两段，各大约750mm长。将各段放置于具有大约100毫升水的250毫升离心瓶中。以5000rpm离心15分钟以排出胚。离心后检查穗表明，在穗的某些部分已通过离心除去所有的胚，而在其它区域，很少或根本没有胚除去。排出的材料进行离心，并去除上清液以留下浆体，其包含完整的胚(估计包括胚总数的大约20％)。在另一个实施例中，收获不成熟的玉米穗(通常是授粉后大约10至大约14天)。对穗除虫，并在无菌条件下切去各个玉米粒的顶部。将穗安置在电钻(或类似装置)的钻头上，且穗被大的无菌收集容器(例如，大玻璃烧杯)环绕。以足以排出不成熟胚的转动速度旋转穗，且由无菌容器收集排出的组织。收集不成熟胚，例如，通过人工收集，或通过用无菌组织培养基清洗容器并回收含有胚的富集部分(例如，通过筛分，通过使用液体密度梯度，或通过本公开中的其它地方所描述的将胚与非胚组织分离的其它方法)。不成熟胚(或源于不成熟胚的愈伤组织)可以随后用于转化。可以通过常规试验确定优选的离心时间和速度获得使用这些和其它离心方法的改善的结果。

另一种实施方式采用玉米粒大块浸渍。收获不成熟的玉米穗(通常是授粉后大约10至大约14天)。对穗除虫。在无菌条件下打开果皮或玉米粒可以保持完整。通过任何合适的方法从穗轴除去玉米粒，包括但不限于，使用手术刀或其它刃状工具。该玉米粒一旦与穗轴分离，就被放置在组织培养培养基中。可以使用合适的切割设备(例如但不限于，搅拌器)对玉米粒-培养基混合物进行进一步的组织破坏。收集不成熟胚，例如，通过人工收集，或通过用无菌组织培养基清洗容器并回收含胚的富集部分(例如，通过筛分，通过液体密度梯度，或通过本公开中其它地方所描述的将胚与非胚组织分离的其它方法)。不成熟胚(或源于不成熟胚的愈伤组织)可以随后用于转化。

在进一步的实施方式中，流体射流(气体或液体或其组合的射流)可以用来驱去胚。该方法的一个例子是以逐步或连续的方式自动旋转玉米穗经过固定的喷射口，收集含有胚的排出的材料，且必要时，进一步在丝网或筛网等上通过粒析分离胚。在玉米穗垂直取向(相对于其纵轴)时，可能优选以向上的螺旋方向旋转穗，或以其它方式相对于喷射口移动穗以使得提取的胚倾向于冲洗向下。

在再另一种实施方式中，线性减速或线性加速可以用来驱去或排出胚。例如，可以给予玉米穗平行于穗的纵轴方向且具有足以排出胚和胚乳的力的冲击。玉米穗可以封闭在合适的无菌、高抗冲击的保持器中，所述保持器可以产生突然加速或减速，例如，通过强烈的碰撞(例如，来自锤)。

另一项对该方法的改进是帮助胚从截断的种子排出或压出。例如，可以通过向完整的种子的顶部施加作用力(例如，通过应用向完整穗中成排玉米粒的顶部施力的辊或其它装置或在截断玉米粒的顶部之前在表面上滚转或按压穗本身)使胚松动或驱出其在种子中的原始位置。也可以通过应移置振动(例如通过超声)使胚在种子中松动。另一种方法是在胚排出或压出之前除去其它的非胚组织，如另外的侧壁(果皮)材料。例如，V形刀或其它工具可用于除去穗中的成排玉米粒的部分侧壁。

实施例7：使用流体射流正压的自动胚分离

本实施例描述了本发明的进一步的实施方式。在本实施例中，自动设备使用流体射流正压从种子驱出胚。参考图2，自动抓紧器C(优选能够通过机械手A和电动机B或通过等效的工具进行三维运动)在对于机械手平台上的齿条的规定位置拾取玉米穗I(通过具有挡板E的手柄D)。机械手将玉米穗插入在低于凸缘F的起始位置的管H(任选地由便于目测的透明材料制成)。通过孔G引入流体射流正压，且穗同时上升(沿Y维度)和分别通过机械手A和电动机B旋转，优选导致各个玉米粒被流体射流冲击，使得胚和胚乳被驱出。流过孔G的流体可以是至少一种气体、至少一种液体或其任何组合。流体射流可以连续或不连续地(例如，脉冲式)施加作用力。由于胚和胚乳被来自孔G的流体射流正压驱出，它们落向震动筛J，其保留胚乳而允许胚通过下落到达下面的收集表面K(例如，无菌干酪包布)。过量的流体可以任选地收集在废物或回收容器L中。在对于各玉米穗完成胚除去过程后，可以手动或通过凸缘F上方或下方的自动喷射口短时地冲洗管的内部。

实施例8：处理粗胚制品的方法

通过如实施例1至7所述的方法获得的胚制品可能包括完整的胚和部分的胚，其可能伴有非胚组织，如胚乳和颖片。某些应用可能不需要进一步的处理或分离步骤，例如，在这样“粗”胚制品的大量转化中，其中胚(完整或部分)不需要与非胚组织分离。例如，源自完整或部分不成熟玉米胚的愈伤组织可以用于可繁殖转基因植物的转化、再生和生产。因此，完整和部分胚可作为转化外植体发挥功能而不需要彼此分离。但是，在其它情况下，可能需要从粗的胚制品进一步纯化胚。

其中在处理粗胚制品中可能遇到一些困难的程序包括：(1)清洗掉非胚组织(例如，细胞碎片、淀粉粒、不需要的蛋白质)，(2)在使用液体压出或清洗后，有效地从胚除去过量的液体，和(3)加入具有最小湍流的液体以使得胚漂浮而不被淹没。

多孔材料用于将胚与非胚组织分离。可以采用任何合适的多孔材料，优选具有足够小的网眼或孔大小以保留胚但让较小的非胚组织或碎片通过，并能够进行灭菌(例如，通过高压灭菌、热、辐射、或化学灭菌)。材料的适用性很容易由本领域的技术人员通过简单的实验判断或测试。合适的材料的例子包括包干酪布或其它织物材料，以及其它丝网或筛网。在某些实施方式中，可以使用穿孔固体材料中，包括穿孔的陶瓷、聚合物、金属或玻璃(例如，布氏(Büchner)或类似的分液漏斗的形式)。例如，适当规格的包干酪布具有足够小的网眼大小以保留胚但允许较小的碎片通过并且它是耐高压加热的。包干酪布可以附着到框架或环(例如，图2中和实施例7中所描述的保持胚收集表面K的框架)上，以使包干酪布和所有保留的胚同时浸没而便于冲洗。例如，包干酪布可以很容易地通过弹性带等(如硅胶管)连接到框架；例如，这样的框架很容易由切成段的由耐高压加热材料(例如，聚丙烯、聚甲基戊烯、聚碳酸酯或耐高压加热玻璃)制成的烧杯或量筒制造。包干酪布具有强的毛细作用，从而使液体有效地吸离胚，因而使它们的蜡性表皮在浮选前暴露于空气中。在浮选步骤，包干酪布只是浸没在水性液体中，从而使胚浮起。

实施例9：使用流体射流充分分离胚

本实施例描述了本发明的进一步的实施方式。在本实施例中，通过流体射流正压从种子驱出多个胚。

在最简单的实施例中，200微升的吸量管尖端连接具有

的垂直水槽喷嘴(vertical sink nozzle)。当打开自来水时，具有相当大力量的射流从吸量管尖端形成。自来水压力估计为大约每平方英寸60磅。这种流体(液体)射流瞄准不成熟的玉米穗(包含在烧杯中)，其中玉米粒如实施例1中所述已被截断。由于射流冲击各个玉米粒，胚乳和胚排出并在烧杯中收集。由于这个阶段的胚乳是相对软的组织，它可以被碎裂成许多更小的碎片，而胚似乎保持完整。

直接将射流驱出的胚乳和胚组织倒于60号包干酪布(可以用其它合适的多孔材料取代，如具有适当网眼大小的亲水性丝网)上。可以获得不同“等级”的包干酪布(例如，10、20、30、40、50、60、70、80和90级，其中，网开口随等级升高而减小)，且很容易通过简单的实验选择适于给定类型的胚的平均大小和形状的等级和网眼大小。胚和较大的胚乳碎片保留在包干酪布上表面上。在下一步骤前，通过芯吸掉过量的流体使得包干酪布部分干燥。这将液体从组织吸除并将胚表面暴露于空气中。当降低包干酪布到水性液体中时，因为胚的蜡样表皮没有再湿润，所以胚漂浮起来。

在简单的设置中，在将包含粗胚制品的液体通过包干酪布倾倒时，包干酪布(或其它合适的多孔材料)可以手动拉伸或保持在容器或废物容器上。对于灭菌工作，包干酪布可以附着到刚性框架上，该刚性框架可以在使用前高压灭菌。也可以在本方法中使用具有手柄的搭扣连接(snap-together)的筛网，例如在厨房设备商店出售的那些。

实施例10：使用流体射流提取胚的装置

本实施例描述用于机械地制备适于组织培养的多个玉米胚的装置的各种实施方式。

一种实施方式包括使用流体射流制备多个玉米胚的装置，一般类似于图2所示的装置。通过切除耐高压加热的聚甲基戊烯(PMP)1升量筒的末端得到透明的、末端开放圆筒。吸量管尖端(例如1250微升Gilson

，逐渐变细以避免形成反压力)固定到圆筒的侧面并用作用于引导作为射流的流体流通过圆筒壁中形成的孔的孔隙。将流体(在这种情况下是水)从PharMed

高压耐高压加热的蠕动泵管通过吸量管尖端输送。水从实验室水槽水龙头输送，但可能是从泵或其它来源输送的水性流体。当例如发现灭菌培养基或灭菌盐溶液作为用于充分分离胚的液体优于水时，优选使用能够输送灭菌流体的泵。合适的泵的例子是具有高压L/S泵头(Cole-ParmerInstrument Co.，Vernon Hills，IL)的

泵，其在使用高压管时可以输送高达100psi的灭菌液体。

手动将具有预先去顶的玉米粒的玉米穗定位于圆筒内。一旦穗适当地定位于圆筒内，各个玉米粒受到来自水射流的正压。这导致胚和非胚组织从玉米粒压出。这一处理后对穗的检查表明胚从玉米粒有效地去除。将压出的材料沿着圆筒的内壁冲洗到位于圆筒下方的胚收集器中。胚收集器包括：(1)热融合到上述的Tri-Pour^TM塑料烧杯的切断的顶部并堆叠于其上的粗塑料筛网(较大的碎片被截留在其上)，(2)用弹性带固定到第二Tri-Pour^TM塑料烧杯的切断的顶部并堆叠其上的较细筛网(60级包干酪布，压出的胚被截留在其上)，(3)废料收集烧杯或其它容器(其中收集细碎片、非胚组织和废液)。

本领域的技术人员很容易修改这些及类似的实施方式。例如，对于定位玉米穗或种子以施加流体射流，可以手动地保持穗定位，或优选通过能够三维移动穗的可移动支架牢固地安置在圆筒内。例如，穗可以安置在螺纹金属或聚合物杆(如聚丙烯杆)上，其可用于沿其纵轴移动穗以及旋转穗。图3描绘了安置机制的另一种实施例，其说明了磁性“手柄”，穗可以通过所述磁性“手柄”固定在机械臂上。

但是在其它的实施方式中，一个或多个玉米穗不需要单独固定到保持器上，而是可以自由移动，以使得多个玉米粒可以被用于从玉米粒去除胚的力接触。例如，至少一个穗或多个穗可以承载或保持在至少一个支架上，例如但不限于，至少一个平面、框架、格栅、筛网、丝网、平台、辊、导引线或杆，及带式、轮式或辊式输送器。这种支架可以是可移动的或可以导致一个或多个穗移动，例如，通过振动、滚动、重力或其它机制。如果平台是多孔的(如，由丝网制成的)，充分分离的胚可以通过平台本身。一个或多个穗也可以以允许每个穗在漂流时转动或以其它方式自由移动的方式漂浮在流体中。流体，如含有充分分离的胚的液体，可以任选地通过过滤或沉淀装置连续排出，或收集用于离心。

用于获得沿玉米穗纵轴的运动的装置包括但不限于，滚珠螺杆驱动的滑块(slides)或皮带驱动的滑块，例如可从各生产商如Techno，Inc.(New Hyde Park，NY；techno-isel.com)购得的装置。要获得旋转玉米穗的旋转运动，可以使用步进电动机，例如，连接到滑板的步进电动机。旋转运动也可以由滚动装置提供，例如，通过平行的圆形或管状辊轮，玉米穗保持在其间并旋转。

流体射流的形状可以根据需要的应用有利地进行改变。例如，具有均匀直径的窄柱状射流用于一次从一个种子除去胚。需要提高胚充分分离的速度时，可以通过流体射流同时从多个种子中除去多个胚；例如，可以通过使用覆盖较大面积的至少一个单流体射流，通过同时使用多个射流做到这一点。在一种实施方式中，多个射流，例如多个平行的、窄的柱形射流(例如，由类似于实施例9中使用的喷嘴的并任选地通过总管相连的多个喷嘴产生的)用于引导流体射流正压到多个种子上以几乎同时充分分离它们的胚。这些和其它设备的自动化可以进一步包括光学或质量传感器以帮助穗和流体射流相对于彼此定位。

在另一种实施方式中，可以使用至少一个覆盖较大面积的流体射流(例如，其中，流体射流同时冲击多个玉米粒或玉米穗上的多排玉米粒)。这种射流的规格优选允许射流进入玉米粒并冲洗出胚。通常情况下，用于遗传实验的玉米胚是不成熟的，且一般是在大约1.8至大约2.2mm的长度范围内；含有这些不成熟胚的玉米粒一般是大约4至大约5mm宽度的大小范围内。对于这种大小的胚，适当的流体射流可以是，例如宽度大约0.5至大约1mm。

可以使用任何用于生产这种较大的流体射流的适当装置，例如，但不限于产生非柱状流体射流的喷嘴。合适的喷嘴的例子包括但不限于，产生扁平喷雾模式的喷嘴和产生扇形或锥形喷雾模式的喷嘴。在一个实施例中，使用市售的具有

L/S泵(型号77250-62)的扇形喷雾喷嘴(编号23990-1/4-04，Spraying Systems Co.，Dillburg，PA)以1升/分钟和30psi泵送液体；在这些条件下从玉米穗切除胚。优选的喷嘴的另一个例子是以扁平的流体“片”形式产生流体射流的喷嘴，如图4中所描述。这种喷嘴优选能够产生均匀的扁平流体射流，其在至少足以允许流体流同时接触多个种子(优选几个种子)的距离内维持连贯的、均匀的片状流。图4中描述的新型喷嘴设计为产生均匀的平片式射流，其厚度为大约0.5至大约1mm、宽度大于20mm，且在距喷嘴的孔大约15至大约30mm的距离内保持平片状流。后一距离使得射流针对玉米粒表面和喷嘴的孔之间的距离差异仅需要最小的调整而沿玉米粒排移动。

无论液体流过的喷嘴或孔产生的射流或喷雾的面积或形状如何，喷嘴或孔优选使用足以产生足以从种子驱出胚而不破坏胚的流体力的流速和压力。在某些实施方式中，优选使用较低的流速和可能的较大压力，以最小化流体(例如培养基)的消耗以及最小化废物产生。

实施例11：使用气体射流以充分分离胚

本实施例描述用于机械制备多种适于遗传转化或组织培养的玉米胚的方法和设备的进一步实施方式。如实施例6所述，气体射流也可用于充分分离多个胚。改造类似于实施例10中所述的装置以使其使用气体。将1毫升吸量管尖端(Marsh Bio Products-ABGene，Rochester，NY；目录编号TN1300RS)固定在1升聚甲基戊烯量筒的侧面，且吸量管用作引导作为射流的气体流通过圆筒壁中形成的孔的孔隙。由压缩机供应的空气加压到大约60至大约100Psi。为了方便，空气阀定位在压缩机和吸量管之间的管线上。这一吸量管尖端形成的空气射流用于从制备好的玉米穗驱出胚。对经受空气射流的玉米粒的检查表明，厚的果皮仍然保持在原位，且被纸样颖片包围，而果皮内含物(胚和胚乳)已被除去。对等级60包干酪布保留的组织的检查表明，其包括驱出的胚以及高压空气射流驱出的一些颖片。玉米的颖片具有像胚的蜡样表面，且也按照浮选过程漂浮。使用较低的空气压力可减少颖片污染。

实施例12：使用其它流体力充分分离胚

本实施例描述用于机械制备适于遗传转化或组织培养的多个玉米胚的方法和设备的进一步实施方式。除了流体射流的正流体压力以外的流体施加的力可以用来充分分离胚。在一项实验中，从放置在包含无菌蒸馏水的瓶中并用手剧烈摇晃的玉米穗上除去玉米粒的顶部。这导致从穗的200个胚中充分分离出90个。另一项实验重复上述程序，除了摇动是在机械涂料混合器中进行。在这项实验中，从穗的190个胚中充分分离出56个。在第三项实验中，进行类似的程序，除了在211培养基(1升：来自Duchefa的N6基础盐混合物：l pkg(即3.952g)(Gold Biotechnology Inc，St.Louis，MO，U.S.A.)；2，4-D(1mg/ml)：1毫升；硫胺素(0.5mg/ml)：2毫升；烟酸(0.5mg/ml)：1毫升；L-天冬酰胺一水合物：0.91g；肌醇：100mg；MES：0.5g；MgCl26H2O：1.6g；酪蛋白水解物：100mg；脯氨酸：0.69g；蔗糖：20g；琼脂：2g，pH 5.8)中预先浸泡玉米穗，且摇动在涂料混合器中进行。在这项实验中，从穗的210个胚中充分分离出109个。在这些情况下，来自玉米穗周围的液体运动的非射流流体力导致胚的充分分离；流体力可以包括流体湍流、流体层流、流体流的剪切力、负流体压力(例如，导致气蚀)或其组合。作用力还可以包括通过声学技术产生的力，如在气相或液相中的一种或多种声波(脉冲或连续)产生的力。

前述实施例(包括实施例9-11)描述了流体射流用于从不成熟的穗除去胚。在这些程序中，观察到流体射流一般还导致至少部分胚乳从玉米粒释放。观察到胚乳组织比胚更柔软、易碎，而且往往不同程度地碎裂(与胚相反，胚往往保持完整)。有可能胚乳在暴露于流体射流产生的剪切力时碎裂。据信这种剪切力是不均匀，导致观察到的碎裂程度的差异，然而，大部分充分碎裂的胚乳材料通过包干酪布，留下由胚的半纯制品组成的滞留物。

当将普通的实验室喷瓶产生的低压射流对准包干酪布滞留物时，更多的残留胚乳组织进一步碎裂，并被冲洗通过包干酪布，留下相对更纯的胚制品。因此，可以合理地预测，如果滞留物均匀地暴露于适当强度的剪切力，全部或绝大部分残留的胚乳都应该碎裂并通过包干酪布。这样的剪切力可以由任何适当的工具产生，例如但不限于：单射流、多射流、片状或帘状射流、快速移动的射流和胚乳的加速或减速。此外，如果将用于最初释放玉米粒内容物的射流设计为在排出过程中接触较大比例的待剪切的胚乳，那么可以获得最初的较高纯度的胚制品。

应用剪切力以进一步纯化胚的非限制性的实施方式如下。一旦胚和部分碎裂的胚乳从穗轴释放，其余的胚乳可以由均匀且同时冲击胚乳的流体流快速粉碎，例如，来自喷嘴的流体流。喷嘴的一种合适的类型是全锥形喷嘴。全锥形喷嘴产生完全充满液滴的射流模式。喷嘴内的内部叶片在液体离开孔之前赋予液体可控的湍流，使形成该喷雾模式。可商购的喷嘴具有圆形、方形或椭圆形的喷雾模式。适合的全锥形喷嘴的例子已知为“UniJet

喷嘴，标准喷嘴，小容量”(Spraying Systems Co.，Wheaton，IL；part number TG-SS0.3)。

实施例13：使用组合力的设备

本实施例描述本发明的方法的一些另外的实施方式，其使用组合力以从种子充分分离多个胚。

图5说明使用较大的流体射流(如实施例10所述)的设备。

该设备包括产生如较大的流体射流(例如扁平流体射流)的流体流的喷嘴，和任选地包括吸入头或施加负流体压力(例如，通过真空或抽吸)的组件，以用于驱出胚和/或收集脱落的胚。图5A(上)描述了这种设备的实施例的横截面图，显示了喷嘴、任选的吸入头和玉米穗如何相对于彼此定位。玉米穗、喷嘴和任选的吸入头可以相对于彼此移动；例如，玉米穗可以是固定的，而喷嘴和任选的吸入头移动，或喷嘴和吸入头可以是固定的，而玉米穗移动。图第5B(下)示意性地描述定位于设备中的玉米穗，且显示喷射定位以产生扁平流体射流，其中射流冲击成排的多个玉米粒。

图6描述合适的吸入头或施加负流体压力(例如，通过真空或抽吸)的组件的实施方式，例如，其任选地用于图5的设备中，且其也可以单独使用以充分分离胚。吸入头可以包括应用负流体压力的一个或多个孔。吸入头还可以包括分配流体(如气体或液体，例如水或培养基)的装置，例如，吸入头中的多个孔。为用于玉米，吸入头优选成形为遵循典型的玉米穗的轮廓，且优选能够从多个玉米粒或多排玉米粒捕获胚。可以预见，吸入头可以由刚性材料(如不锈钢或其它金属)制造，或由柔性材料制造以允许吸入头更容易地配合玉米穗的轮廓，或由其组合制造。可以通过机械正压(例如，由吸入头的前缘施加)、负流体压力(例如，吸入或真空)和流体力(例如但不限于，从玉米粒的内部捕获材料的流体射流、流体湍流和流体层流的正压)的任何组合充分分离胚。

用于应用充分分离胚的力的设备，例如，如实施例1、3、4、6、7、9、10和本实施例(包括但不限于图5和6所示的设备)中所述，可以相对于玉米穗移动。穗可以是固定的，或者设备可以是固定的，或两者都可以移动。由于玉米种子通常以平行于玉米穗的纵轴排列的相对均匀的排的形式出现，设备通常移动(相对于穗)以使得设备平行于玉米穗的纵轴并沿一排或多排的玉米粒运行。不过，这种设备相对于穗的运动可以沿穗的圆周，或可以是随机的，或可以是合适的运动的任何组合。

图7A至7C描述使用力的组合以从种子(在本实施例是玉米)充分分离多个胚的装置的实施方式的不同视图。该装置包括具有能够向之前已打开或截断果皮的玉米粒的基部施加预定量的机械压力的前缘的头部，以使得以类似于实施例1、3和4所述的方式从玉米粒压出胚。该装置进一步包括用于施加驱出胚和/或收集脱落的胚的负流体压力(例如，通过真空或抽吸)的部件。压出的胚(和伴随的非胚组织)因而与玉米穗分离，且可以通过施加负流体压力来收集。如果需要，收集的胚和非胚组织可以进一步通过适当的方法分离，如通过大小分离、疏水性分离或差速离心。这种装置的变化可以包括用于分配流体(如液体，例如水或培养基)的工具，例如，在吸入头中的多个孔。

如图5、6和7所示的胚提取装置是示例性的实施例而非限制性的。这些及其它这样的设备可以包括其它组件，例如，用于将胚与非胚组织或在充分分离的过程中使用的流体分离的装置。

实施例14：生存力数据

通过使用本发明的方法和设备提供的多个单子叶植物胚最优选是适于遗传转化或组织培养应用(如植物的转化和再生)的胚。本实施例进一步说明本发明方法在提供多种可生存且适于遗传转化或组织培养的单子叶植物胚方面的用途。在本实施例中，通过不同的切除方法获得的不成熟玉米胚的质量在它们对于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化的反应方面进行比较。

使用玉米转化的领域已知的标准方法(例如，Cai等人，美国专利申请公开2004/0244075)转化使用这种装置和方法切除的玉米胚。进行了四个实验(分别指定为A、B、C和D)。各个实验胚比较通过手工切除获得的胚和通过本发明的方法获得的胚：通过液体射流切除(实验A、B和D)或通过气体射流切除(实验C)。实验A和B中的液体射流使用普通自来水和由吸量管尖端制成的喷嘴。实验C测试使用来自压缩空气泵的空气的气体射流和由吸量管尖端制成的喷嘴。实验D中的液体射流使用¹/₂强度MSPL培养基(参见Cai等人的美国专利申请公开2004/0244075的表1)作为液体和具有0.020英寸等效孔径的固体流喷嘴(目录编号TP000050，AgriculturalDivision of Spraying Systems Co.，Wheaton，IL)。

授粉后12天收获玉米穗，并通过在80％乙醇的1升瓶中浸泡3分钟灭菌。通过用手术刀切断玉米粒的三分之一顶部并使用窄铲从玉米粒除去胚来手动切除胚。将收集的胚切入单个微量离心(Eppendorf)管中的1毫升¹/₂ MSPL培养基中。除去培养基，并用1毫升如下所述制备的根瘤土壤杆菌取代。

也按照类似于实施例10和11所述的程序使用流体(液体或气体)射流充分分离胚。流体射流用于在用手术刀除去玉米粒的三分之一顶部后切除在穗上剩余的胚。穗定位以使得流体射流瞄准相继的切割玉米粒，以驱出胚和非胚组织(胚乳)。将从穗中除去的玉米粒内容物通过粗筛，以除去大块的胚乳，并在灭菌包干酪布上收集胚。使用小铲将胚从包干酪布转移到含有1毫升¹/₂ MSPL培养基的微量离心管中。在收集所有的胚之后，除去¹/₂ MSPL培养基，并由1毫升根瘤土壤杆菌接种液取代。

由不同切除方法制备的胚进行同样的接种、选择和再生程序。对于使用草甘膦选择和GFP作为报道分子进行植物转化的合适的程序(包括培养基和试剂的描述)已在Cai等人的美国专利申请公开2004/0244075中披露。

用1.0毫升的根瘤土壤杆菌接种胚5分钟。将微量离心管的内容物倾倒在共培养培养基平板上，用吸量管除去过量的土壤杆菌，并在23摄氏度共培养内容物18小时。将胚转移到诱导MS培养基上，并在30摄氏度培养13天。再生前，在27摄氏度培养来自转化的愈伤组织11天。此时，使用荧光显微镜对GFP阳性的部分计数。为了进行再生，将来自各胚的愈伤组织单独转移到MS/6 BA培养基中，并光照室中培养7天，之后，将各个发绿愈伤组织转移到MSOD培养基中，并送回到光照室中培养另外的17天。将产生的嫩芽(shoot)转移到含有Phytagel^TM的再生培养基(由在水中制成1升的2.165g MS基础盐、5毫升100X MS维生素和20g蔗糖组成，并高压灭菌，用KOH调节pH至5.8，通过与3g Phytagel^TM一起高压灭菌固化，并加入0.75毫升的1毫克/毫升的吲哚-3丁酸、0.51毫升的1毫克/毫升的1-萘乙酸和0.2毫升的0.5摩尔草甘膦)中。大约3周后，通过将生根的枝移栽到含有土壤混合物的泥炭盆中使转基因植物转移到露天并在摄氏26度生长。

表3 总结这些实验的结果。由GFP阳性胚的数量估计可转化的胚的数量。

表3.切除的胚的生存力和转化频率

n/a：没有数据。

给出作为由接种的胚再生的GFP阳性植物的百分比的总转化和再生频率。这些结果表明，本发明的各种方法和设备可用于提供多种适于遗传转化或组织培养的多个单子叶植物胚。

实施例15.用于切除玉米胚的液体培养基的开发

流体射流装置需要大约为20L液体用于从一个穗切除胚，因此需要开发易于制备的切除培养基：其制备简单(即，只包含一种或两种成分)，优选可通过在线过滤装置过滤灭菌，可以在优选的40-60psi操作压力下流过流体射流装置，而且不需要在使用前调整pH。这种培养基及其制备会降低成本，减少培养基的制备时间，并允许自动化。本实施例提供了一些这样的培养基。

培养基，如Lynx 1013(接种培养基)和Lynx 1902(半强度Lynx 1013)已成功地用于使用流体射流装置切除用于转化的玉米胚。Lynx 1013包含(每升)：MS基础盐(Phytotech；PhytoTechnologyLaboratories，Shawnee Mission，KS)：2.165g；MS维生素(100X；Phytotech)：10毫升；葡萄糖(Phytotech)：36g；蔗糖(Phytotech)：68.5g；脯氨酸(Fisher)：0.115g。用KOH调节该培养基至pH5.4，然后过滤灭菌。尽管这些培养基运作良好，它们含有许多成分，其中一些必须过滤灭菌。这些培养基还需要在使用前调整pH。

测试了一些其它的液体培养基(表4)用于从玉米穗切除可转化的玉米胚。然后根据说明书中其它地方所述的方法，切除的胚用于转化，并确定各测试的切除培养基的转化频率(TF)。TF定义为再生成为植物的独特转化事件的数目除以用土壤杆菌接种的胚的数目。

所有测试的培养基(包括水)能够产生可转化的玉米胚(见表4)。然而，包含甘露醇的培养基产生与对照培养基Lynx 1902相当的TF。甘露醇培养基是只有两种成分(甘露醇和水)的简单培养基，不需要在使用前调整pH，且可以过滤灭菌，从而使之更具成本效益且使用方便..

培养基中的甘露醇浓度是大约0.05M至大约0.5M。优选地，培养基中的甘露醇浓度是大约0.1M。最优选，培养基中的甘露醇浓度是大约0.2M。但是，用于切除培养基的甘露醇的合适的浓度可以由植物组织培养领域的技术人员通过简单地改变甘露醇浓度来确定。

在表4可以发现选定的培养基的代表性的渗透势测量值。使用Wecor 5100C蒸汽压渗透仪(Wecor，Logan，UT，USA)读数，使用100、290和1000mOsm/k的标准溶液校准。具有大约0mOsm/kg到500mOsm/kg的渗透势(即重量摩尔浓度)的培养基适于切除用于组织培养的玉米胚，包括例如大约7mOsm/kg至大约300mOsm/kg。例如，0.2M的甘露醇水溶液具有222-230mOsm/kg的摩尔渗透压浓度，而0.05％MES的水溶液具有大约7mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。这种渗透势范围优选通过添加一种或两种化合物以制备培养基，如Lynx培养基#1937、#1932和#1162而获得。优选地，这些化合物对于切除的胚的组织培养性和可转化性没有明显的不利影响。

表4.用于分离胚的示例性溶液的渗透势测量值

n/a＝没有进行

实施例16：用于流体射流切除的培养基制备系统的构建

本实施例描述用于流体射流装置的培养基制备系统(MPS)。测试的流体射流装置需要大约20升培养基，这需要时间和劳动来制造和使用。本发明的MPS可以快速制备大量培养基。它也允许制备用于特定大小的玉米穗的指定体积的培养基。

MPS包括混合室(MC)和MPS外壳(MPSH)。MC设计为使得能够容易地与MPSH脱离而便于高压灭菌。MC和MPSH都可以由任何合适的材料制成。优选地，它们由如钢或铝的材料制成。如图11和12所示，MC包括具有上端和下端的槽、附着到槽的上端的凸缘和覆盖上端和密封混合室的盖板。优选地，槽通过凸缘提供的O形环用盖板密封。盖板优选由7075航空器级、耐腐蚀铝制成，以减轻混合室的重量。在一种实施方式中，槽在低端具有3个销，各如图12所示在三个侧面上，用于槽在混合室支撑板上定向和定位。在工作位置中，如图12和14所示，三个销与在支撑板上提供的定位支架啮合。也在槽底(前侧)提供定位板(图12，13)，用于保持槽在混合室支撑板上的工作位置中。优选地，定位板具有用于安装携带具有手柄的定位臂的快速连接器的¹/₄”NPT螺纹(图14)，以在支撑板上固定混合室(例如，图13)。

盖板具有用于插入引进用于制备培养基的液体(如水，)的管的开口、用于插入引出制备的培养基并与流体射流装置连接的管的开口、用于插入添加培养基成分到混合室中的管(优选是不锈钢制成)的开口(例如图12)。在工作位置中，单独的O型环密封各种管和开口。盖板还具有用于插入包含用于感应需要制备的特定体积培养基的超声波传感器的外壳的开口。优选地，在盖板的一侧提供用于超声波传感器外壳的开口。在工作位置中，混合室盖板上提供的各种开口连接到外壳的上平台的下表面提供的相应的管上(图11)。这些管子优选由钢制成。各种开口连接混合室，如图11所示，例如通过连接管。管道系统优选由聚碳酸酯制成。

培养基混合组件连接到盖板下端，使得组件悬挂在优选槽的中心。组件包括两刃折叠叶轮、由盖板中的0形环密封的不锈钢轴杆、适于在高压灭菌过程中出现的高温下(如400°F以上)运转的高温滚珠轴承和用于在MPSH中结合具有电动机的组件的辐式连接器(spider coupler)(图16)。

滚珠螺母安装块安装在混合室支撑板的下侧，并可连接在外壳下平台的上表面提供的滚珠轴承中安装的滚珠螺杆。支撑板也可通过四个轮滑动连接如图15所示的MPS外壳的4个腿。轮沿4个腿的t形狭槽滚动，以便于混合室在MPSH下平台的下表面提供的步进电动机打开时上下移动。

高压灭菌后，混合室通过三个销和定位板定位在支撑板上。将具有手柄的定位臂插入快速连接器。推下臂并在手柄的帮助下顺时针转90度，以定位和固定混合室在支撑板上。定位臂连接凸轮，和安装在焊接到支撑板的弹簧上。弹簧推动臂和凸轮向上。当放置于合适的位置时，混合室的后销推动电开关，它向可编程序逻辑控制器(PLC)发出信号。该信号通知PLC：混合室定位于混合室支撑板上。外壳的下平台上提供的步进电动机然后向推动混合室，其中，在工作位置中，混合室的盖板上提供的各种开口在外壳的上平台处与外壳的上平台的下表面提供的相应的管连接(图16)。

在收到操作者的信号后，PLC打开连接水系统的电磁阀以用水填充混合室。超声波传感器监测混合室中的水位。当水位达到混合室中的指定水平时，PLC关闭水电磁阀，并等待来自操作员的表明切除培养基的成分在混合室中的信号。当PLC收到该信号时，它开动在MPSH的上平台上表面上提供并可操作地连接到混合器组件的电动机。因此，混合器组件开始混合培养基。一旦培养基预备好，根据PLC程序使用齿轮泵通过培养基出口管向流体射流装置泵送培养基。

在一种实施方式中，连接到流体射流装置的制备培养基出口/供应装置具有在培养基用于切除胚的流体射流装置中之前对培养基灭菌在线过滤单元如0.2微米的绝对FiberFlo中空纤维囊过滤器(Minntech Filtration Technologies Group，Minneapolis，MN)。

实施例17：通过相切除分离胚

本实施例描述用于从玉米穗上的玉米粒制备多个适于组织培养的多个玉米胚的装置，包括至少一个用于在第一时间点引导用于从玉米粒充分提取胚乳的第一流体流和在第二时间点引导用于从玉米粒充分提取胚的第二流体流的孔，所述提取的胚适于组织培养。该装置进一步包括用于相对于第一和第二流体流移动至少一个玉米穗的装置。用于相对于第一和第二流体流移动至少一个玉米穗的装置相对地旋转至少一个玉米穗和至少一个孔。用于相对于第一和第二流体流移动至少一个玉米穗的装置沿至少一个玉米穗的纵轴移动流体流。在装置的这个特定的实施方式中，各流体流是液体流。例如，液体流可以基本上由甘露醇和水组成，甘露醇浓度为大约0.05M至大约0.5M。或者流体流可以是气体流。该装置可以进一步包括用于检测切除的胚乳和胚的工具。该装置也可进一步包括用于引导切除的胚乳或胚的工具，以使得胚与胚乳分离。该装置进一步包括电气连接用于检测切除的胚乳和胚的工具和用于引导切除的胚乳和胚的工具的装置以实现自动化。该装置可以进一步包括至少一个用于从非胚组织分离胚的分离器，其中，分离的胚包括适于组织培养的玉米胚。分离器可以包括尺寸排阻设备。另外，分离器可以通过差别的疏水性或密度差从非胚组织分离胚。

本实施例还描述提供适于组织培养的单子叶植物胚的方法，包括：(a)提供在种子果皮中具有开口的含有胚的单子叶植物种子；和(b)在第一时间点施加第一作用力以用于从种子充分提取胚乳，并在第二时间点施加第二作用力以用于从种子充分提取胚，所述提取的胚适于组织培养。作用力包括一个或多个选自流体射流正压、液体射流正压、机械正压、负压、离心力、线性加速、线性减速、流体剪切力、流体湍流和流体层流的力。该方法进一步包括通过选自尺寸排阻、疏水性分离和密度差分离的方法从非胚组织分离胚。单子叶植物种子在至少一个穗上提供。单子叶植物可以禾本科，如玉米种(如玉米)。组织培养的步骤可以包括一个或多个转化和再生的步骤，产生至少一个可繁殖的转化植物。

如图17所示，装置具有用于产生扁平层流(6)的扁平射流喷嘴(1)、两个由可编程序逻辑控制器(PLC)控制的步进电动机和数字齿轮泵。步进电动机旋转穗(2)，使得其中已除去冠以利于切除的玉米粒安置在密封室(3)中的轴上，且第二电动机沿轴输送穗以使得流作用于各个玉米粒上基本上相同的时间。数字式齿轮泵按照PLC速度和压力迫使液体培养基通过喷嘴。喷嘴(1)产生大约0.003“宽和大约1”高的液体流。一般来说，流的宽度小于玉米粒的宽度。在30-75PSI的测试压力范围中，层流在距离喷嘴(1)达2.5-3”处是稳定的，且不会在到达穗之前散开。穗(2)可以定位于离开喷嘴(1)1³/₄”-2”处，使得液体流以基本上同样的力作用于成排的各个玉米粒。可以通过改变喷嘴中的液体的压力、通过调整穗和喷嘴的距离和喷嘴板之间的空隙以及其它参数(如液体流进入玉米粒的入角和穗旋转的速度)控制力的大小和持续时间。

在第一阶段中，根据PLC的程序，PLC为了通过胚乳收集阀门(5)打开通道(4)，并通过向数字齿轮泵发送控制信号设置通过喷嘴(1)的压力和流速，并通过两个步进电动机旋转和推进穗(2)。PLC控制的液体流(6)首先冲洗出玉米粒(7)的胚乳(8)，留下附着于玉米粒(7)的胚(9)。可以根据胚乳大小、在玉米粒冠中的切割程度及穗和玉米粒的大小差异以及其它参数调整冲洗出胚乳所需的时间和力量。和通道(4)中收集的液体培养基和胚乳的混合物可以通过过滤系统泵送。过滤后，液体培养基可以在切除过程重复使用。

在第二阶段中，根据PLC程序，PLC通过胚乳收集阀门(5)关闭通道(4)并打开通道(10)，设置通过喷嘴(1)的压力和流速，并旋转和推进穗。液体流(6)从玉米粒(7)冲洗出胚(9)和剩余的胚乳(8)。如果需要，可以使用其它地方描述的分离器进行进一步的胚分离。可以根据胚大小、在玉米粒冠中的切割程度及穗和玉米粒的大小差异以及其它参数调整冲洗出胚所需的时间和力量。通道(10)中收集的液体培养基和胚的混合物送到分离设备(如实施例18)，以将胚与碎片和液体分离，且液体可以通过过滤系统泵送，以在切除过程重复使用。

室(3)可以任选地随意具有发射器(11)和通过用于在切除后检测排出的液体培养基中的胚的通过光束传感器(through beamsensor)(12)。在第一阶段中，确认排出培养基中胚出现的信号指示PLC完成第一阶段。在第二阶段中，确认排出培养基中胚消失的信号提示PLC完成第二阶段，并可进一步指示PLC关闭装置。

使用玉米转化的领域已知的标准方法(例如Cai等人，美国专利申请公开2004/0244075)转化使用这种装置和方法切除的玉米胚。对于切除胚，所有处理使用Lynx # 1986(0.2M甘露醇，未灭菌)。代表性的转化频率(TF)列于表5中，表明通过该装置和方法产生的胚是可转化的，并获得转基因植物。

表5.通过阶段流体射流装置和方法切除的玉米胚的转化

“FJ(流体射流)阶段w/胚乳”指收集后与胚乳一起接种并留在同一培养板中(胚和胚乳一起)的胚。“FJ阶段w/o胚乳”指收集后转移到新的培养板的胚，而不带胚乳。

实施例18：胚分离程序

本实施例描述用于从通过流体射流切除程序产生的混合物分离胚的浮选程序。本文描述有效分离的参数。在这个过程中，气泡在流体中产生，并附着到流体中存在的切除玉米胚上。气泡浮到表面(即流体-空气界面)，使胚被优先收集，并留下胚乳物质和其它碎片。

为了减少每单位体积的气泡数量并产生更均匀的气泡场以使得产生更小的剪切力，构建了包含多个气泡点源的装置。通过将各个椴木碎片插入一段硅胶管(

silicone tubing C-96400-16，Cole-Parmer)的预冲压孔中构建该装置。将椴木碎片插入硅胶管后，管的一端塞入不锈钢轴承。然后，将管盘绕为螺旋，并如图18所示用金属丝固定。螺旋形椴木空气分散装置与使用PEG作为表面活性剂结合已经表明如图19所示从几乎全部胚乳纯化了95％的胚。图20说明通过使用螺旋形椴木空气分散装置和PEG的气泡浮选从胚部分分离的胚乳的量。可以构建或从例如水族馆供应商购买其它椴木基气泡器。在图20左侧的培养皿显示，当没有使用浮选程序时，大量胚乳与胚混合。相比之下，右侧的培养皿显示当使用本发明的浮选程序时，与胚共分馏(co-fractionating)的胚乳的量减少。气泡也可以由具有各种孔径的陶瓷材料制成。

为了从产生它们的源材料脱离气泡，需要源材料在极性度方面(即疏水性)具有与泡沫相反的性质。由于气泡是共价性质的，它们将倾向于容易地与极性材料分离。相反，从共价性质的表面(像多孔塑料起泡装置)产生的气泡往往会附着到该表面，并聚并和在分离前生长到较大的尺寸。在这方面，Chemglass起泡装置、椴木 陶瓷都是理想的选择。椴木的表面由纤维素、半纤维素和木质素组成，它们是极性的，因此是亲水性的，烧结玻璃起泡装置和陶瓷材料也是这样的。

在一个例子中，一旦胚由气泡携带到表面并沉积在泡沫中，通过撇去泡沫收获它们，然后冲去泡沫。在另一项实验中，真空过滤装置(如图21)用于从泡沫表面收获胚。

在一项实验中，使用流体射流(FJ)装置从供体穗切除胚和胚乳，并用包干酪布(CC)收集。然后将胚和胚乳的混合物置于填充Lynx 1013和20μl的20％ PPG(聚丙二醇单丁醚-平均分子量340；Aldrich Cat.No.438103；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的量筒中，并由潜水泵(起泡器)泵送通过烧结的细孔玻璃分散管(Chemglass)的空气产生泡沫。如上所述收集分离的胚，基本没有胚乳材料和其它碎片。通过使用如上所述的玉米转化领域已知的标准方法，分离的胚用于玉米的土壤杆菌介导转化。转化频率如表6所示。

表6.通过使用由PPG稳定的气泡浮选分离的玉米胚的转化

在另一项实验中，基于椴木的起泡器用于从由流体射流装置切除的胚乳分离胚。一般来说，将基于椴木的起泡器放置在灭菌层流净化罩中的烧杯中。起泡器的管在一端连接空气过滤器。空气过滤器的另一端是连接到潜水泵。然后将分离培养基(具有20μl的20％PEG(平均分子量8000，Sigma No.P21390)的0.2M甘露醇)加到起泡器上的烧杯中。从流体射流装置收集胚和胚乳，并转移到烧杯中。空气通过起泡器产生气泡。将漂浮的胚转移到小培养皿中，并使用如上所述的玉米转化领域已知的标准方法进行转化。转化频率如表7所示。

表7.通过使用由PEG稳定的气泡浮选分离的玉米胚的转化

实施例19：通过浮选分离胚的装置

图22显示用于通过浮选分离胚的装置，包括浮选柱(E)，浮选柱(E)连接位于柱的上端的用于加入胚、胚乳和其它碎片的混合物的入口管(A)，位于柱的下端的用于产生提升胚的气泡的空气扩散管(G)和也位于柱的下端用于调节液位和用于从柱的底部除去碎片的出口管(H)。柱的底部优选倾斜，以促进除去不漂浮的碎片。浮选柱还具有用于收集含有胚的泡沫的溢流槽(C)。空气扩散管还具有阀(F)，以防止柱液体回流进入空气扩散管。

为操作该装置，浮选柱填充与随后的胚转化和组织培养相容的液体培养基，直到液面达到溢出管(D)。溢出管具有顶部对空气开放的抗虹吸管(B)。向液体培养基中加入表面活性剂以防止气泡过早聚并，并稳定泡沫以附着胚、将胚提高到浮选柱的顶部。

装置的操作中的下一步是打开向空气扩散管的空气供应。扩散管中的小孔足够小以产生足够缓慢地上升的气泡，以至于它们与胚的疏水表面接触时间足够长而使气泡附着于胚。

接下来，由流体射流装置产生的包含所需浓度的表面活性剂(如百万分二十的浓度的PEG)的胚、胚乳和碎片的混合物被送入入口管。由于浆液进入浮选柱，悬浮微粒遇到来自空气扩散设备的气泡柱。气泡首先附着在胚上，且优先提高胚到浮选柱的表面，它们在此处成为泡沫的一部分。随着泡沫累积，它通过出口槽(C)离开浮选柱。

在操作过程中，浮选柱可以以小角度偏离垂直而朝向开口槽倾斜，使得上升的气泡集中在柱的后壁处，并倾向于推动泡沫向前并推出到出口槽外。另外，以朝向出口槽的向上角度倾斜的盖可以引导泡沫到出口槽。

不漂浮的富含胚乳的碎片下降到浮选柱底部，并在倾斜底部的低点积累。当在操作开始时胚和胚乳碎片的浆液最初送入进料漏斗时，这些碎片在柱的自动液位调整过程中被转移出柱，或可能在浮选柱操作结束时除去。

在另一种实施方式中，浮选槽中的液位保持与出口槽的水平一致，且上升到表面的泡沫不断扫入槽中。通过使更多的气泡上升到浮选槽中远离出口槽的一侧有助于这一作用，以便产生在远离出口槽的一侧升起而在出口槽的同一侧沉下的循环。

在另一种实施方式中，可以保持浮选槽中的液位低于出口槽的水平，直至积累足量的泡沫和胚，然后提高液位以使泡沫和胚溢流到出口槽中。

实施例20：通过浮选分离胚的替代装置

本实施例描述设计为通过使用气泡和表面活性剂的浮选程序用于从玉米胚乳分离玉米胚的装置的另一种实施方式。该装置可以与胚切除的装置，如本申请的其它地方描述的流体射流装置一起使用。

在这一装置中(图23)，胚和胚乳流入提供有用于产生气泡的装置的室中。气泡可以通过强制空气通过起泡装置产生。优选气泡大小(直径)为大约100μm至500μm。也可以加入浓度为大约1至大约100ppm、例如20ppm的气泡稳定剂，如聚乙二醇(PEG)。胚优先通过疏水相互作用附着到气泡上，且泡沫将附着的胚提升到室的表面。PEG的加入使气泡能够携带它们的胚“负载”到表面。PEG也有助于在表面的顶部产生泡沫层，且胚在泡沫层的顶部收集，它们在泡沫层的顶部被携带进入溢流出口。机动化的除沫器装置可用于进一步帮助含有胚的泡沫流入出口，在那里它们通过成像位置或用于计算胚的数量的计数装置并按需要收集在容器中。可以提供可操作地与成像位置或计数装置连接的开关臂以分配所需数量的胚进入不同的容器。这些容器可以连接到真空歧管装置以除去液体而留下进一步使用的胚。

该装置还提供了用于将液体引入和引出室的工具。室中的液位可以通过液位调节装置控制。非选择性地附着到气泡上的胚乳和其它碎片可以通过在容器的底部提取液体的装置(如废物流出管)丢弃。用于切除胚的同种液体培养基可以用于填充用于分离胚的室。从该装置流出的培养基可以再循环用于切除和分离过程中。

实施例21：用于切除和分离用于组织培养的玉米胚的组合设备

本实施例说明组合设备或集成设备，包括如图24-25所示的胚提取器和如图26所示的胚分离器。优选地，胚提取器与分离器连通。但是，胚提取器或分离器可以单独操作，且胚提取器的输出可以是胚分离器的输入。

参考顶视图图24，胚提取器具有至少一个用于从各穗轴(B)提取胚的流体喷射口(C)。多个流体射流可以指向单个穗轴。通过在穗轴一端的弹簧加载的固定器(A)和在另一端的由皮带机构(E)驱动的动力固定器(D)将图24中的各穗轴保持定位。装置的侧视图如图25所示。通常情况下，穗轴上的玉米粒的冠已部分或全部除去以利于胚提取。

任何液体培养基可用于产生例如如实施例15所述的射流(C)。因为胚开始与水接触和浸泡在浮选槽中的培养液中这二者之间的时间很短，无菌水可用于切除。过滤器可以用来对水灭菌。或者，液体培养基包括甘露醇或其它如上所述的具有合适的渗透强度的溶质。

如图26所示，在从玉米粒提取胚之后，胚和碎片任选地落在或加到包括连接到浮选室的双筛输送带系统的胚分离器上。双筛输送带具有捕捉粗材料的移动的粗筛(A)，但允许胚和其它细小的材料通过到达保留胚和类似大小的材料的细筛(H)，但细筛允许非常细的材料和液体通过到达废液槽(W)。在粗筛上收集的材料在粗筛洗槽(F)中清洗松散，由液流帮助洗到废液槽(W)中，并通过粗筛洗槽溢流(E)和洗槽排水管(G)流出排水管。在细筛(H)上收集的材料在新鲜培养基的帮助下在优选具有发泡剂通过入口(M)的细筛洗槽(N)中清洗松散。如果胚没有从细筛(H)驱动进入细筛洗槽(N)，可以使用搅拌。例如，细筛捕捉的胚被驱动进入浮选培养基中，由于它们通过辊(K)周围且也受通过(M)添加的组成培养基的冲击。调节新鲜培养基和起泡剂的输送以使得在浮选室中积聚的碎片通过液位调节进口(U)和出口管(V)连续地除去。

非编织的模制热塑性塑料网可以优选在该装置中使用，因为它们不会散开。可以获得具有各种筛网(股线)厚度、股线宽度和网开口大小的这种网(如McMaster-Carr，Atlanta，GA)。也优选聚丙烯制成的网，因为它们可以高压灭菌。可以由操作者凭经验根据引入分离器的胚和碎片的预期大小选择精确的网尺寸。

参考图26，粗筛(A)和细筛(H)可以由辊支持。优选地，粗筛(A)由动力辊(B)、从动辊(C)和洗辊(D)支撑。细筛(H)可以由动力辊(I)、从动辊(J)、洗辊(KD)和提升辊(L)支撑。辊可以是直圆柱，或非直圆柱，优选凹圆柱，因为它们允许使用通常比平带具有较少的沿其边缘的产品损失的槽(troughed)带。槽带可以允许更高的带速和斜度。一个或多个辊可能是装有动力的，例如辊(B)，并且可以使其表面带有织纹以更牢固地抓住筛网。可能只需要直接动力驱动一个辊，而使其它辊，例如辊(C)，通过皮带或齿轮从第一个辊获得动力。可能需要在粗筛和细筛下的侧面和中心支架或引导装置以防止液体沿着筛边缘的流挂和损失。附加的支持辊可能也是需要的。

细筛(H)上收集的材料在细筛洗槽(N)中驱出后，它越过气泡偏转器(O)落下并进入浮选室(P)，在其中它遇到由例如空气分散管(T)产生的上升气泡(S)。在这一点上，气泡优先附着到胚的疏水性表面，从而携带它们到达表面，在那里它们沉积在通过浮选室侧开口(Q)和胚输送(泡沫)槽(R)的泡沫中。如果在浮选室(P)中下降的胚没有充分接触气泡，可以在室(P)的下部提供混合设备如磁力搅拌器，以改善接触。

通过从入口(M)输入新鲜培养基和发泡剂和通过包括入U口管和出口管(V)的液面调节系统(例如图27)调节浮选室中的液位，其中，过量的液体连同碎片进入管U并排出管(V)。U形管连接(U)和(V)以使得管中的最高水平达到液体需要保持的水平。U形管的顶部也提供了抗虹吸开口。可以设想其它液面调节装置，如那些基于浮标的、基于光学装置的、基于电导率的和基于电的装置，来调节该设备中的液体水平。

实施例22：用于从种子和果实分离可转化组织的装置

本发明的组成、方法和装置可以用来分离可转化的组织，例如，来自其它单子叶和双子植物(包括但不限于，玉米、小麦、大麦、大豆、向日葵、棉花、油菜、胡椒、西红柿、树莓和草莓等)的种子和果实的胚。

本发明提供了合适的保持器，例如，具有适于保持各种形状和大小的种子或果实的孔和/或狭槽的薄片(例如图28)。保持器可以由合适的材料如塑料或金属制成。保持器可以是平板或卷成如图29所示的圆筒，且可以悬置在气相(如空气)或液相中，或可以部分悬置在气相和液相中。可以通过合适的力(如机械力和/或吸力)保持种子和果实在保持器上。保持器可以相对于流体力(如实施例15所述的培养基液体流)固定，或可相对于流体力移动。

在图30所示的另一实施方式中，在圆筒的一端插入压力凸轮或螺杆例如钻头以在种子和果实上施加压力以进一步促进胚分离。可以通过本说明书的其它地方描述的一些方法将分离的胚与碎片分离。

在本发明的另一种实施方式中，可以在容器中离心薄片或圆筒以在保留的种子或果实施力，从而分离胚。

可以如实施例18-20所述将胚与其它组织分离，并用于转化和再生各种植物物种。例如，使用美国专利7,002,058描述的方法可以转化大豆胚。其它植物的转化方法是本领域已知的。

实施例23：用于分离棉花和大豆胚的方法

本实施例说明本发明从种子组织分离棉花和大豆胚的组合物、方法和装置的用途，从而表明更广泛的实用性。通过2008年3月10日提交的美国专利申请12/045,502和美国专利申请公开20050005321所描述的方法和装置破碎棉花和大豆种子，并使用如图31所显示的装置将它们加入到具有用于分离棉花胚的0.0012％ PEG8000和用于分离大豆胚的大约0.003％ PEG 8000的0.2M甘露醇溶液中。例如，如实施18例所述产生气泡。如图32-33所示，发现大部分棉花胚轴与气泡聚积在一起。使用美国专利申请12/045,502中所描述的方法制备用于转化的棉花胚。在大豆的情况下，发现破碎的胚(胚轴和子叶)在容器底部，而大部分种皮随气泡上浮到顶部。然后通过密度差异方法进一步分离胚轴和子叶。例如，在20％蔗糖的6.5％水溶性聚蔗糖(Ficoll)溶液中，胚轴上升到表面而子叶沉入容器底部。可以使用美国专利7,002,058所描述的方法转化大豆胚。

实施例24：用于提高转化频率的共培养培养基的开发

在一些实验中，在利用通过流体射流方法制备和通过浮选法分离的胚的玉米转化过程中使用共培养培养基1233(美国专利申请公开2004/00244075)导致转化频率(TF)的较低。为了保持或提高转化频率，测试了称为“1898”的新的共培养培养基，并意外地发现TF提高。

进行了几组实验以比较共培养培养基1233和共培养培养基1898。除了其它成分差异(见表9)，共培养培养基1898特别具有较低水平的2，4-D，且具有羧苄青霉素。如上面的实施例所述从玉米穗切除和分离不成熟胚。将分离的胚分成两组处理。用包括gus和CP4表达盒的植物转化载体pMON97367接种两种处理的胚。处理1的胚在培养基1233上共培养，处理2的胚在培养基1898上共培养。经过过夜共培养，通过美国专利申请公开2004/00244075所述的方法处理胚。

表8显示使用共培养培养基1898导致与使用共培养培养基1233相比，所有关键性能指标(如培养响应、产生的事件、转移到phytatray的事件、转移到土壤的事件和％TF)都得到改善。表9给出所用的培养基的组成。

表8.共培养培养基1898对转化频率的提高

表9.本发明中使用的培养基组成。培养基1233、1278、1073、1071、1084来自Cai等人；美国专利申请公开2004/00244075。培养基1898来自美国专利申请公开2008/0124727。

*包含1250mg/L的烟酸(Sigma)、250mg/L的盐酸吡哆醇(Sigma)、250mg/L的盐酸硫胺素(Sigma)和250mg/L的泛酸钙(Sigma)。

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本领域的技术人员按照上述公开的指示可以制造和使用本文公开和要求保护的所有材料和方法而不需过度的实验。虽然已根据优选的实施方式和示例性的实施例描述了本发明的材料和方法，但以下对于本领域的技术人员是显而易见的：在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的材料和方法进行变化。所有对于本领域的技术人员明显的这些类似的替换和修改被认为在附加的权利要求进一步限定的本发明的概念、精神和范围之内。

参考文献

本文特别引入以下文献作为参考，它们对本文提出的方法提供补充性的示例性的程序或其它细节。

美国专利5,550,318

美国专利5,780,708

美国专利6,194,636

美国专利6,232,526

美国专利7,002,058

美国专利7,150,993

美国专利申请10/710,067

美国专利申请11/613,031

美国专利申请12/045,502

美国专利公开2003/0024014

美国专利公开2004/0016030

美国专利公开2004/0126845

美国专利公开2004/0210958

美国专利公开2004/0216189

美国专利公开2004/0244075

美国专利公开2005/0246786

美国专利公开2008/0124727

美国临时专利申请60/894,096

美国临时专利申请60/915,066

Claims (39)

1.一种用于制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚的方法，包括：

(a)将包括种皮和植物胚的植物种子组织置于水性环境中；

(b)将所述组织与选择性地附着到胚或种皮的试剂接触；和

(c)根据试剂对胚或种皮的选择性附着分离至少第一胚。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述试剂包括气泡。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述气泡具有大约100微米至大约1mm的最大平均尺寸。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述气泡包含选自空气、氧气、氮气及其组合的气体。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(c)包括根据胚的浮力分离第一胚。

6.如权利要求3所述的方法，包括在所述水性环境中包含减少气泡彼此之间的聚并的表面活性剂。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述表面活性剂选自聚醚、PPG(聚(丙二醇))和PEG(聚(乙二醇))。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述PPG具有大约340至大约3500道尔顿的分子量。

9.如权利要求7所述的方法，其中，所述PEG具有大约100道尔顿至大约9000道尔顿的分子量。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述试剂包括与所述水性环境不混溶的第二液体。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述第二液体选自与胚的存活和转化相容的植物油、矿物油或其它疏水液体。

12.如权利要求1所述的方法，其中，所述植物种子组织包括按照权利要求1所述的方法产生的胚。

13.如权利要求1所述的方法，其中，所述水性环境基本上由包括水和/或具有大约0mOsm/kg至大约600mOsm/kg的摩尔渗透压浓度的渗透剂的培养基组成。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述渗透剂选自甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述培养基基本上由水和浓度为大约0.05M至大约0.5M的甘露醇组成。

16.如权利要求14所述的方法，其中，所述培养基基本上由水和浓度为大约0.05M至大约0.5M的蔗糖组成。

17.如权利要求1所述的方法，包括将植物种子组织置于所述水性环境中而不先分离胚和非胚组织。

18.如权利要求1所述的方法，其中，所述植物种子组织是玉米植物种子组织、棉花植物种子组织或大豆植物种子组织。

19.一种用于制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚组织的装置，包括：

(a)用于保持包括多个植物胚的植物种子组织在水性环境中的容器；和

(b)用于向所述水性环境递送选择性地附着到胚的试剂的至少第一喷嘴，其中，所述喷嘴产生具有大约100微米至大约1mm的平均直径的气泡。

20.如权利要求19所述的装置，其中，所述容器填充培养基和包括胚和非胚组织的植物种子组织。

21.如权利要求19所述的装置，进一步包括用于根据胚在所述水性环境中的浮力分离胚组织的收集器。

22.如权利要求19所述的装置，其中，所述气泡包含选自空气、氧气、氮气及其组合的气体。

23.一种制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚的方法，其中，用于保持籽粒或其它组织的装置在容器中离心，以向籽粒或其它组织施力。

24.一种获得适于组织培养和/或遗传转化的植物胚的装置，包括：

(a)用于将培养基引到玉米粒或含有植物胚的其它组织之上的至少第一流体喷射口；和

(b)用于保持玉米粒或其它组织在培养基的路径中的装置。

25.如权利要求24所述的装置，其中，所述胚包含在玉米粒中。

26.如权利要求25所述的装置，其中，所述玉米粒包含在玉米穗上。

27.如权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步设计为包括第一和第二流体喷射口。

28.如权利要求26所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒的装置包括用于相对于第一和第二流体流移动玉米穗以控制第一和第二流体流与玉米粒之间的接触角的装置。

29.如权利要求24所述的装置，进一步包括检测器以鉴别切除的胚乳组织和胚。

30.如权利要求24所述的装置，进一步包括至少第一分离器以将胚与非胚组织分离。

31.如权利要求24所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒或其它组织的装置包括薄片或圆筒形薄片。

32.如权利要求24所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒或其它组织的装置包括网状物或多个狭槽；或向所述组织施力的压力凸轮或螺杆。

33.如权利要求24所述的装置，其中，所述种子或果实组织通过机械力、摩擦力、离心力或吸力保持在用于保持玉米粒或其它组织的装置上。

34.如权利要求24所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒或其它组织的装置悬置在气相中、液相中或部分地悬置在气相和液相中。

35.如权利要求24所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒或其它组织的装置相对于流体力固定。

36.如权利要求24所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒或其它组织的装置可相对于流体力移动。

37.如权利要求30所述的装置，其中，所述分离器通过选自尺寸排阻、差别密度和差别疏水性的方法将适于组织培养的胚与非胚组织分离。

38.如权利要求37所述的装置，进一步设计为包括根据大小将胚与非胚组织分离的筛子。

39.如权利要求26所述的装置，其中，所述用于保持玉米粒的装置包括用于相对于流体喷射口移动玉米穗的第一电动机。

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