BRPI0716373B1 - "processes for production of a transgenic corn plant". - Google Patents

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BRPI0716373B1
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Akula Anisha
R. Duncan David
Lowe Brenda
T. Mann Michael
L. Petersen William
R. Rout Jyoti
D. Songstad David
B. Wilks Joel
Zhang Wanggen
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Monsanto Technology Llc
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO TRANSGÊNICA".
Fundamento da Invenção Este pedido de patente reivindica a prioridade do pedido de Patente U.S. provisório N® de Série 60/841.519 depositado em 31 de agosto de 2006, cuja descrição inteira é incorporada aqui como referência.
Campo da Invenção A micropropagação de plantas tem sido feita de forma rotineira em grandes bateiadas e de forma automatizada. Na micropropagação, um explante é geral mente coletado e colocado em um meio de regeneração que tem que ser mantido fresco para ao longo da duração do processo de regeneração para produzir uma série de plantas. Isto é contrasta com os processos de transformação, que são planejados para produzir novos eventos transgênicos e requerem a integração do DNA estranho dentro de uma célula vegetal. A automatização do processo de cultura de tecido vegetal, particularmente o processo de transformação, tem sido difícil. Os tecidos vegetais passam por estágios diferentes que requerem tipos diferentes de meios e condições de crescimento. Os processos de transformação requerem várias etapas e vários meios. Por exemplo, na transformação mediada por Agrobacterium, o processo começa com o isolamento de um explante que pode ser regenerado e transformado. Então o explante é inoculado com Agrobacterium em um meio de inoculação. Após a inocuiação, o excesso de Agrobacterium é tipicamente removido e o explante e o Agrobacterium são cocultivados juntos para permitir a transferência de DNA. Após o cocultivo, a presença de Agrobacterium é deletéria para a cultura de tecido vegetal (por exemplo, causa contaminação indesejada durante as etapas de manipulação e de cultura de tecido subsequentes), de forma que tipicamente os explantes são transferidos para meio fresco contendo antibióticos para inibir o crescimento de Agrobacterium. Este meio pode ou não conter agentes de seleção, Se não tiver, então é chamado de meio de retardo ou de repouso. Os explantes podem ser colocados em meio de retardo para permitir que durante algum tempo cresçam antes de serem opcionalmente colocados no meio de seleção. Outros protocolos colocam os explantes diretamente no meio de seleção para a seleção de eventos transgênicos. Os regimes de seleção variam amplamente dependendo do agente de seleção e do sistema do explante. Frequentemente são utilizadas várias etapas de seleção e quantidades variáveis de agente de seleção podem ser necessárias nas etapas diferentes. Após a seleção dos eventos transgênicos, os eventos transgênicos vivos são então transferidos para o meio de regeneração em plantículas que podem então ser transferidas para o solo. Até o momento atual, os processos de transformação têm sido demorados e trabalhosos e não são capazes de ser realizados em uma grande escala. A automatização do processo de transformação permitiría que números grandes de plantas transgêni-cas fossem produzidos com trabalho, material e sobrecarga ergonômica reduzidos. A presente invenção superou as limitações anteriores na transformação através do fornecimento de métodos e de aparatos para a realização de algumas ou de todas as etapas de transformação e opcionalmente algumas das etapas de regeneração, em um único recipiente. Assim, os presentes métodos superaram as deficiências dos protocolos de transformação atuais através da eliminação de etapas demoradas para o subcultivo de tecido vegetal e troca de meio. Os métodos e os aparatos são particularmente adequados para a automatização da transformação, para a automatização da regeneração e/ou para a produção em grande escala de células, tecidos e plantas transformados. A invenção de genômica possibilitou a identificação e o isolamento de um grande número de genes e tinha a necessidade de sistemas de produção de transformação de alto rendimento confiáveis e eficientes para testar a utilidade destes genes através da transformação dos mesmos em plantas de cultivo economicamente importantes tal como o milho. Os métodos de transformação de milho atuais requerem, pelo menos, quatro etapas de transformação desde a etapa de seleção de uma célula transformada até a etapa de transferência de plantas transgênicas para o solo requerendo assim custos materiais mais altos, por exemplo, placas e meios de cultura e custos de trabalho. Várias transferências manuais de tecidos também avaliam o risco de danos ergonômicos causados por movimento repetidos.
Assim, há uma necessidade na técnica de transformação de milho de um sistema automatizado de alto rendimento para a transformação, a seleção e a regeneração de plantas que produz um grande número de plantas transgênicas para testar genes e criar plantas úteis enquanto os custos de materiais e de trabalho são diminuídos. Há ainda uma necessidade na técnica de métodos que podem diminuir o risco de danos ergonômicos tornando o local de trabalho mais seguro.
Aqui, os inventores fornecem um método de transformação de milho para a seleção e para a regeneração de plantas de milho transformadas adequadas para o sistema de automatização de alto rendimento. O método emprega uma matriz de suporte adequada em combinação com meio de seleção e de regeneração líquido. O uso deste método de cultura líquido elimina a necessidade de várias transferências que são normalmente necessárias quando é utilizado um meio sólido para as etapas de seleção e de regeneração. Ainda, este método possibilita o aumento da regeneração que tem sido um problema no meio de cultura líquido até agora. Ainda adicionalmente, a etapa de seleção de uma célula transformada e a regeneração podem ser conseguidas em um único recipiente tal como um copo de sun-dae até as plantas serem transferidas para o solo.
Sumário da Invenção A presente invenção fornece novos métodos para a automatização de processos de transformação de plantas através do fornecimento de um método de transformação estável e opcionalmente de seleção e de regeneração parcial de uma planta em um recipiente. Em algumas modalidades, um único recipiente pode ser utilizado para realizar os métodos da presente invenção. Em outras modalidades, vários recipientes (por exemplo, um sistema de vasos interconectados) podem ser fornecidos para facilitar o uso e a otimização da presente invenção.
Em um aspecto da invenção, é fornecido um método para produção de planta de milho transgênica. O método compreende a obtenção de um explante de milho que pode ser transformado; a transformação do ex-plante de milho que pode ser transformado; a seleção de uma célula de milho transformada partindo do explante de milho que pode ser transformado em um meio de seleção; e a regeneração da célula transformada em uma planta em um meio de regeneração, em que a transformação, a seleção e a regeneração são realizadas no mesmo recipiente. Opcionalmente, a seleção no recipiente pode ser omitida e a plantícula transgênica ou a planta trans-gênica pode ser submetida à seleção após ser colocada no solo (por exemplo, borrifada com um agente de seleção). O recipiente pode ser um biorreator, uma placa de Petri, uma placa de várias cavidades, um frasco, uma jarra, uma garrafa, uma moringa, um PlantCon®, um sistema de emersão temporária e uma combinação dos mesmos e é fornecido com uma maneira de fornecer e de remover o meio. Em algumas modalidades, o recipiente é uma placa de Petri, uma placa de várias cavidades, uma PlantCon ou um sistema de emersão temporária. O explante pode ser selecionado do grupo que consiste em um calo, um embrião e uma suspensão de células. O meio pode ser um meio líquido, um meio sólido ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o meio de seleção é um meio sólido e o meio de regeneração é um meio líquido que cobre o meio de seleção sólido. O explante pode ser colocado em contato com o meio temporariamente. Em uma modalidade, o explante é colocado em contato com o meio de seleção e o meio de regeneração durante aproximadamente 1 até aproximadamente 5 minutos aproximadamente a cada 12 até 24 horas.
Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a obtenção de explante para a produção de uma planta de milho transgênica. O método compreende a divisão de um calo em pedaços de calo menores. Em uma modalidade, o calo é um calo do tipo I.
Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a preparação de uma suspensão de células de Agrobacte-rium para a inoculação de um explante. O método compreende o cultivo de um estoque em glicerol congelado de Agrobacterium diretamente em um meio de indução.
Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma cultura de células de milho que compreende células que podem ser transformadas e embriogênicas.
Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a produção de uma cultura de células de milho que podem ser transformadas e embriogênicas. O método compreende a obtenção de um calo partindo de embriões de milho e o cultivo do calo durante aproximadamente 5 dias até 30 dias em um meio líquido para produzir a cultura de células. Em uma modalidade, o calo é um calo do tipo II.
Breve Descrição do Desenho Figura 1 Exemplo de mapa de plasmídeo de pMON30113. Descrição Detalhada As definições a seguir auxiliarão o entendimento da descrição da invenção. “Calo” refere-se a uma massa proliferante desdíferenciada de células ou tecido. “Explante” refere-se a uma parte da planta que é capaz de ser transformada e subsequentemente regenerada em uma planta transgênica. Os explantes típicos incluem embriões imaturos, calos, cotilédones, meris-temas, folhas ou caules. “Meio de cultura de tecido” refere-se a meios líquidos, semilíqui-dos ou sólidos utilizados para sustentar o crescimento e o desenvolvimento da planta em um ambiente que não é o solo. Os meios de cultura de tecido vegetal adequados são conhecidos por um versado na técnica, como discutido em detalhes subsequentemente. Os componentes do meio podem ser obtidos em fornecedores sem ser os identificados aqui e podem ser otimizados para uso pelos versados na técnica de acordo com seus requerimentos. “Sequência codificadora”, “região codificadora” ou “quadro aberto de leitura” refere-se a uma região de tercetos de ácidos nucléicos sequenciais contínuos que codificam uma proteína, um polipeptídeo ou uma se- quência peptídica. “Endógeno” refere-se a materiais que se originam de dentro do organismo ou da célula. “Exógeno” refere-se a materiais que se originam da parte externa do organismo ou da célula. Refere-se a moléculas de ácidos nucléicos utilizadas na produção de células e plantas hospedeiras transformadas ou transgênicas. Como utilizado aqui, é pretendido que exógeno se refira a qualquer ácido nucléico que é introduzido em uma célula receptora, independentemente do fato de um ácido nucléico similar já poder estar presente em tal célula. “Genoma” refere-se ao DNA cromossômico de um organismo. O genoma é definido como um conjunto haplóide de cromossomos de uma espécie diplóide. Para as finalidades deste pedido de patente, o genoma inclui ainda o genoma das organelas. “Monocot” ou “monocotiledônea” refere-se a plantas que possuem um único cotilédone. Os exemplos incluem cereais tais como milho, arroz, trigo, aveia e cevada. “Ácido nucléico” refere-se ao ácido desoxirribonucléico (DNA) ou ao ácido ribonucléico (RNA). “Fenótipo” refere-se a uma característica exibida por um organismo que resulta da interação do genótipo e o ambiente. “Sinal de poiiadenilação” ou “sinal de poliA” refere-se a uma sequência de ácido nucléico localizada a 3’ de uma região codificadora que promove a adição de nucleotídeo adenilados na extremidade a 3’ do mRNA transcrito partindo da região codificadora. “Promotor” ou “região promotora” refere-se a uma sequência de ácido nucléico, geralmente encontrada a 5’ da sequência codificadora, que controla a expressão da sequência codificadora através do controle da produção de RNA mensageiro (mRNA) através do fornecimento do sítio de reconhecimento para a RNA polimerase ou outros fatores necessários para o início da transcrição no sítio correto. “Vetor de ácido nucléico recombinante” ou “vetor” refere-se a qualquer agente tal como um plasmídeo, um cosmídeo, um vírus, uma sequência de replicação autônoma, um fago um segmento de nucleotídeos de DNA ou de RNA de filamento simples ou de filamento duplo linear ou circular, derivado de qualquer fonte, capaz de se integrar no genoma ou de se replicar de forma autônoma, que compreende uma molécula de ácido nucléi-co em que uma ou mais sequências de ácidos nucléicos foram ligadas de uma maneira funcionalmente operacional. Tais vetores ou construtos de ácidos nucléicos recombinantes são capazes de introduzir uma sequência reguladora ou uma região promotora a 5’ e uma sequência de DNA para um produto gênico selecionado em uma célula de tal maneira que a sequência de DNA é transcrita em um mRNA funcional, que é subsequentemente traduzido em um polipeptídeo ou uma proteína. “Regeneração” refere-se ao processo de crescimento de uma planta partindo de uma célula vegetal. “Meio de regeneração” refere-se a um meio de cultura de tecido vegetal necessário para conter um agente de seleção. “Calo que pode ser regenerado” refere-se ao calo partindo do qual plantas inteiras podem ser produzidas, mas que o modo de regeneração (embriogênese ou organogênese) não foi determinado ou não é pertinente para discussão. “Marcador que pode ser selecionado” ou “marcador que pode ser verificado” refere-se a uma sequência de ácido nucléico cuja expressão confere um fenótipo que facilita a identificação de células que contêm a sequência de ácido nucléico. “Seleção” refere-se ao contato de um explante inoculado com um meio de seleção para a obtenção de uma célula, um tecido ou uma planta transformada. “Meio de seleção” refere-se a um meio de cultura de tecido vegetal que contém um agente de seleção. “Transcrição” refere-se ao processo de produção de uma cópia de RNA partindo de um molde de DNA. “Transformação” refere-se a um processo de introdução de uma sequência de ácido nucléico exógena (vetor ou construção) em uma célula ou um protoplasto, em que o ácido nucléico exógeno é incorporado no DNA nuclear, no DNA de plastóide ou é capaz de se replicar de forma autônoma. “Transgênico” refere-se a organismos nos quais uma sequência de ácido nucléico exógena foi integrada. “Explante que pode ser transformado” refere-se a qualquer parte de uma planta que é receptiva à transformação. A presente invenção fornece um sistema em que a transformação estável pode ser realizada em um único recipiente. O processo de transformação começa com a inoculação do explante que pode ser transformado com Agrobacterium e resulta em uma plantícula transformada de forma estável com raízes adequadas para a transferência para o solo. Há muitos recipientes que podem ser utilizados para esta finalidade. Biorreatores, incluindo o sistema de imersão temporária, podem ser utilizados. Muitos recipientes diferentes têm sido utilizados para a cultura líquida de tecidos vegetais, incluindo, mas não limitados a placas de Petri de vários tamanhos, placas de várias cavidades, frascos, jarras, garrafas, moringas e PlantCons. Estes recipientes são geralmente fornecidos com meios tais como uma entrada e uma saída para o fornecimento do meio fresco e para a remoção do meio gasto. Um grande número de recipientes pode ser conectado para a obtenção de um sistema de alto rendimento.
Estes recipientes podem incluir algum suporte para o explante. Tal suporte pode ser, mas não está limitado a papel de filtro, feltro, barque-tas, esferas de vidro, esferas de zircônia/sílica, espuma ou meio sólido. O meio líquido é geralmente colocado no recipiente e então trocado quando necessário. Esta troca pode ser feita manualmente ou mecanicamente.
Os recipientes podem conter muitos explantes de uma vez ou podem ser pequenos o suficiente para conterem apenas um único explante. No caso de placas de várias cavidades, um arranjo de cavidades pequenos cada um contendo um explante é utilizado para cultivar grandes números de explantes. As vantagens das placas de várias cavidades incluem o isolamento de quaisquer explantes contaminados. Os explantes podem ser prepara- dos manualmente ou mecanicamente. A finalidade da invenção é ter um sistema que pode ser facilmente automatizado desde o início até o fim; entretanto, qualquer um destes sistemas de cultura líquida e recipientes pode ser utilizado em combinação com outras etapas de transformação, seleção e regeneração conhecidas por um versado na técnica.
Pode ser desenvolvido um sistema de transformação de alto rendimento em que os recipientes podem ser manipulados por braços robó-ticos em uma tabela de trabalho que pode ser configurada livremente que pode incluir incubadoras e agitadores em adição a artigos para laboratório padronizados. Várias ferramentas de manipulação de líquidos equipadas com uma ou mais ponteiras de pipetagem podem ser utilizadas para fornecer o meio fresco e remover o meio gasto. A tabela de trabalho, os braços robóticos e as ferramentas de manipulação de líquidos podem ser controlados por software através de um computador. Alternativamente, o meio líquido para a seleção e para a regeneração da célula transformada pode ser fornecido ao recipiente através de um ou mais tubos conectados a um recipiente de armazenamento de meio e removido através de um ou mais tubos conectados a um recipiente de descarte. O fornecimento e a remoção do meio podem ser controlados manualmente ou mecanicamente.
Para iniciar um processo de transformação de acordo com a presente invenção, é necessário primeiro selecionar os componentes genéticos que serão inseridos nas células ou o nos tecidos vegetais. Os componentes genéticos podem incluir qualquer ácido nucléico que é introduzido em uma célula ou um tecido vegetal utilizando o método de acordo com a invenção. Os componentes genéticos podem incluir DNA sem ser de planta, DNA de planta ou DNA sintético.
Em uma modalidade preferida, os componentes genéticos são incorporados em uma composição de DNA tal como uma molécula de plas-mídeo ou de vetor de filamento duplo recombinante que compreende pelo menos um ou mais dos tipos a seguir de componentes genéticos: (a) um promotor que funciona nas células vegetais para causar a produção de uma sequência de RNA, (b) uma sequência de DNA estrutural que causa a produção de uma sequência de RNA que codifica um produto de utilidade agronômica e (c) uma sequência de DNA não traduzida a 3’ que funciona nas células vegetais para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados na extremidade a 3’ da sequência de RNA. O vetor pode conter um número de componentes genéticos para facilitar a transformação da célula ou do tecido vegetal e regular a expressão do(s) gene(s) desejado(s). Em uma modalidade preferida, os componentes genéticos ficam orientados de forma a expressar um mRNA, que em uma modalidade pode ser traduzido em uma proteína. A expressão de uma sequência codificadora estrutural de planta (um gene, um cDNA, um DNA sintético ou outro DNA) que existe na forma de filamento duplo envolve a transcrição do RNA mensageiro (mRNA) partindo de um filamento do DNA pela enzima RNA polimerase e o processamento subsequente do produto da transcrição primária do mRNA dentro do núcleo. Este processamento envolve uma região não traduzida a 3’ que adiciona nucleotídeos poliadenilados nas extremidades a 3’ do mRNA.
Os meios para preparar plasmídeos ou vetores que contêm os componentes genéticos desejados são bem conhecidos na técnica. Os vetores consistem tipicamente de um número de componentes genéticos, incluindo, mas não limitados a elementos reguladores tais como promotores, líderes, íntrons e sequências terminadoras. Os elementos reguladores também são referidos como elementos reguladores em cis ou em trans, dependendo da proximidade do elemento às sequências ou ao(s) gene(s) que controlam. A transcrição do DNA em mRNA é regulada por uma região de DNA geralmente referida como o “promotor”. A região promotora contém uma sequência de bases que sinaliza para a RNA polimerase se associar ao DNA e iniciar a transcrição em mRNA utilizando um dos filamentos de DNA como um molde para produzir um filamento complementar correspondente de RNA.
Um número de promotores que são ativos nas células vegetais foi descrito na literatura. Tais promotores incluiriam, mas não estão limitados aos promotores da nopalina sintase (NOS) e da octopina sintase (OCS) que são carregados em plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tume-faciens, os promotores de caulimovírus tais como os promotores 19S e 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) e o promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária (FMV), o promotor CaMV35S intensificado (e35S), o promotor que pode ser induzido pela luz da subunidade pequena da ribulose bis-fosfato carboxilase (ssRUBISCO, um polipeptídeo vegetal muito abundante). Todos estes promotores foram utilizados para criar vários tipos de construtos de DNA que foram expressas em plantas. Híbridos de promotores também podem ser construídos para aumentar a atividade transcricional (Patente U.S. Na 5.106.739) ou para combinar a atividade transcricional desejada, a capacidade de indução e a especificidade ao tecido ou a especificidade ao estágio de desenvolvimento. Os promotores que funcionam em plantas incluem, mas não estão limitados a promotores que podem ser induzidos, virais, sintéticos, constitutivos como descrito e regulados de forma temporal, regulados de forma espacial e regulados de forma espaço-temporal. Outros promotores que são intensificados no tecido, específicos ao tecido ou regulados em relação ao estágio de desenvolvimento também são conhecidos na técnica e previstos como possuindo utilidade na prática desta invenção.
Os promotores podem ser obtidos partindo de uma variedade de fontes tais como plantas e vírus de DNA de plantas e incluem, mas não estão limitados aos promotores CaMV35S e FMV35S e aos promotores isolados de genes de plantas tais como os genes da ssRUBISCO. Como descrito a seguir, é preferido que o promotor particular selecionado seja capaz de causar expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficiente do produto gênico de interesse.
Os promotores utilizados nos construtos de DNA (por exemplo, genes de plantas quiméricos/recombinantes) da presente invenção podem ser modificados, se desejado, para afetar suas características de controle. Os promotores podem ser derivados através da ligação com regiões operadoras, mutagênese aleatória ou controlada etc. Além disso, os promotores podem ser alterados para conter várias “sequências intensificadoras" para auxiliar no aumento da expressão gênica. O mRNA produzido por uma DNA construção da presente invenção também pode conter uma sequência líder não traduzida a 5’. Esta sequência pode ser derivada do promotor selecionado para expressar o gene e pode ser especificamente modificada de forma a aumentar a tradução do mRNA. As regiões não traduzidas a 5’ também podem ser obtidas partindo de RNAs virais, de genes eucarióticos adequados ou de uma sequência gênica sintética. Tais sequências “intensificadoras” podem ser desejáveis para aumentar ou para alterar a eficiência da tradução do mRNA resultante. A presente invenção não está limitada a construtos em que a região não traduzida é derivada da sequência não traduzida a 5’ que acompanha a sequência promotora. Ao invés disso, a sequência líder não traduzida pode ser derivada de promotores ou de genes não relacionados (ver, por exemplo, a Patente U.S. N2 5.362.865). Outros componentes genéticos que servem para aumentar a expressão ou para afetar a transcrição ou a tradução de um gene também são previstos como componentes genéticos. A região não traduzida a 3’ dos construtos quiméricos deve conter um terminador da transcrição ou um elemento que possui função equivalente e um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados na extremidade a 3’ do RNA. Os exemplos de regiões a 3’ adequadas são (1) as regiões não traduzidas transcritas a 3’ que contêm o sinal de poliadenilação dos genes plasmideais indutores de tumor de Agrobacterium (Ti), tal como o gene da nopalina sin-tase (NOS) e (2) os genes de plantas tais como os genes de proteína de armazenamento da soja e a subunidade pequena do gene da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO). Um exemplo de uma região a 3’ preferida é aquela do gene E9 da ssRUBISCO da ervilha (Pedido de Patente Europeu 0385 962).
Tipicamente, as sequências de DNA localizadas algumas centenas de pares de bases a jusante do sítio de poliadenilação servem para terminar a transcrição. As sequências de DNA são referidas aqui como regiões de término da transcrição. As regiões são requeridas para a poliadenilação eficiente do RNA mensageiro transcrito (mRNA) e são conhecidas como regiões não traduzidas a 3’. A RNA polimerase transcreve uma sequência de DNA codificadora através de um sítio em que ocorre a poliadenilação.
Em uma modalidade preferida, o vetor contém um gene marcador que pode ser selecionado, verificado e classificado. Estes componentes genéticos são também referidos aqui como componentes genéticos funcionais, uma vez que fornecem um produto que tem uma função na identificação de uma planta transformada ou de um produto de utilidade agronômica. O DNA que serve como um dispositivo de seleção funciona em um tecido de planta que pode ser regenerado para produzir um composto que conferiría ao tecido de planta resistência a um composto que seria de outra maneira tóxico. Os genes de interesse para uso como um marcador que pode ser selecionado, verificado ou classificado incluiríam, mas não estão limitados a GUS, proteína fluorescente verde (GFP), genes relacionados com a biossín-tese de antocianina (C1, Bperu), luciferase (LUX), antibióticos como a cana-micina (Dekeyser e outros, 1989) e herbicidas como glifosato (Della-Cioppa e outros, 1987). Outros dispositivos de seleção também podem ser implementados incluindo, mas não limitados a tolerância a fosfinotricina, biala-phos, dicamba e mecanismos de seleção positiva e se encaixariam ainda dentro do âmbito da presente invenção. A presente invenção pode ser utilizada com qualquer plasmídeo ou vetor de transformação de planta adequado que contém um marcador que pode ser selecionado ou que pode ser verificado e elementos reguladores associados como descrito, junto com um ou mais ácidos nucléicos expressos de uma maneira suficiente para conferir uma característica particular. Os exemplos de genes estruturais adequados de interesses agronômicos previstos pela presente invenção incluiriam, mas não estão limitados a genes para tolerância a insetos ou pragas, tolerância a herbicidas, genes para melhorias na qualidade tal como rendimento, melhorias nutricionais, tolerâncias ambientais ou a estresses ou quaisquer alterações desejáveis na fisiologia, no crescimento, no desenvolvimento, na morfologia da planta ou no(s) produto(s) da planta.
Alternativamente, as DNA sequências codificadoras podem afetar estes fenótipos através da codificação de uma molécula de RNA que não pode ser traduzida que causa a inibição direcionada da expressão de um gene endógeno, por exemplo, através de mecanismos mediados por antis-senso ou por co-supressão (ver, por exemplo, Bird e outros, 1991). O RNA poderia também ser uma molécula de RNA catalítica (por exemplo, uma ri-bozima) engenheirada para clivar um produto de mRNA endógeno desejado (ver, por exemplo, Gibson e Shillitoe, 1997). Mais particularmente, para uma descrição da regulação antissenso da expressão gênica em células vegetais, ver a Patente U.S. N2 5.107.065 e para uma descrição da supressão gênica em plantas através da transcrição de um dsRNA ver a Patente U.S. N2 6.506.559, a Publicação de Pedido de Patente U.S. N2 2002/0168707 A1 e os Pedidos de Patentes U.S. N— de Série 09/423.143 (ver WO 98/53083), 09/127.735 (ver WO 99/53050) e 09/084,942 (ver WO 99/61631), dos quais todos são incorporados aqui como referência. Assim, qualquer gene que produz uma proteína ou um mRNA que expressa um fenótipo ou uma alteração na morfologia de interesse é útil para a prática da presente invenção.
Os exemplos de ácidos nucléicos que podem ser introduzidos através dos métodos abrangidos pela presente invenção incluem, por exemplo, sequências de DNA ou genes de uma outra espécie ou ainda genes ou sequências que se originam de ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporados nas células receptoras através de métodos de engenharia genética ao invés de técnicas de reprodução ou de cruzamento clássicas. Entretanto, é também pretendido que o termo exógeno se refira a genes que não estão normalmente presentes na célula que será transformada ou talvez simplesmente que não estão presentes na forma, na estrutura etc., que é encontrada no segmento de DNA transformante ou a gene ou genes que estão normalmente presentes apesar do que é desejado, por exemplo, para serem superexpressos. Assim, é pretendido que o termo gene ou DNA “exógeno” se refira a qualquer gene ou segmento de DNA que é introduzido em uma célula receptora, independente do fato de um gene similar já poder estar presente em tal célula. O tipo de DNA incluído no DNA exógeno pode incluir o DNA que já está presente na célula vegetal, o DNA de uma outra planta, o DNA de um organismo diferente ou um DNA gerado externamente, tal como uma sequência de DNA que contém uma mensagem antissenso de um gene ou uma sequência de DNA que codifica uma versão sintética ou modificada de um gene.
Em consideração a esta descrição, vários outros genes marcadores que podem ser selecionados ou que podem ser verificados possíveis, elementos reguladores e outras sequências de interesse serão evidentes aos versados na técnica. Portanto, é pretendido que a discussão anterior seja um exemplo ao invés de completa.
As tecnologias para a introdução de DNA nas células são bem conhecidas pelos versados na técnica e podem ser divididas em categorias que incluem, mas não estão limitadas a: (1) métodos químicos; (2) métodos físicos tais como microinjeção, eletroporação e bombardeio de microprojé-teis; (3) vetores virais; (4) mecanismos mediados por receptores; e 5) métodos de transformação de plantas mediados por Agrobacteríum.
Para a transformação mediada por Agrobacteríum, após a construção do vetor ou do construto de transformação de plantas, a dita molécula de ácido nucléico, preparada na forma de uma composição de DNA in vitro, é introduzida em um hospedeiro adequado tal como E. coli e cruzada com um outro hospedeiro adequado tal como Agrobacteríum ou transformada diretamente em Agrobacteríum competente. Estas técnicas são bem conhecidas pelos versados na técnica e foram descritas para um número de sistemas de plantas incluindo soja, algodão e trigo (ver, por exemplo, as Patentes U.S. N— 5.569.834 e 5.159.135 e WO 97/48814, incorporadas aqui como referência em sua totalidade). A presente invenção abrange o uso de cepas bacterianas para a introdução de um ou mais componentes genéticos em plantas. Os versados na técnica reconheceríam a utilidade dos métodos de transformação mediada por Agrobacteríum. Um número de cepas do tipo selvagem e desarmadas de Agrobacteríum tumefaciens e Agrobacteríum rhizogenes que carregam os plasmídeos Ti ou Ri pode ser utilizado para a transferência gênica para plan- tas. Preferencialmente, os hospedeiros de Agrobacterium contêm plasmí-deos Ti e Ri desarmados que não contêm os oncogenes que causam tumo-rigênese ou rizogênese, respectivamente, que são utilizados como os vetores e contêm os genes de interesse que são subsequentemente introduzidos nas plantas. As cepas preferidas incluiríam, mas não estão limitadas a cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens, uma cepa do tipo nopalina que é utilizada para mediar a transferência de DNA para uma célula vegetal, cepas do tipo octopina tal como LBA4404 ou cepas do tipo succinamopina, por exemplo, EHA101 ou EHA105. Outras bactérias tais como Sinorhizobium, Rhizo-bium e Mesorhizobium que interagem com as plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência gênica para um número de plantas distintas. Estas bactérias simbióticas associadas às plantas podem ser tornadas competentes para a transferência gênica através da aquisição tanto de um plasmídeo Ti desarmado quanto de um vetor binário adequado (Broo-thaerts e outros, 2005). O uso destas cepas para a transformação de plantas foi relatado e os métodos são familiares aos versados na técnica.
Os explantes podem ser de um único genótipo ou de uma combinação de genótipos. Qualquer semente de milho que pode germinar é um material de partida viável. Em uma modalidade preferida, os explantes superiores de híbridos de plantas podem ser utilizados como explantes. Por e-xemplo, uma linhagem de células de crescimento rápido com uma resposta de cultura rápida (maior frequência de formação de calo embrionário, taxa de crescimento, frequência de regeneração de plantas etc.) pode ser gerada utilizando embriões híbridos contendo vários genótipos. Em uma modalidade preferida, um híbrido F1 ou a prole de primeira geração de cruzamento de indivíduos de origens diferentes pode ser utilizada como uma planta doadora e cruzada com um outro genótipo. Os versados na técnica estão cientes que a heterose, também referida aqui como “vigor do híbrido”, ocorre quando dois cruzamentos de indivíduos de mesma origem são cruzados. A presente invenção abrange ainda o uso de um explante resultante de um cruzamento em três vias, em que pelo menos um ou mais dos cruzamentos de indivíduos de mesma origem podem ser altamente regenerados e transformados e a frequência de transformação e de regeneração do explante de cruzamento em três vias excede as frequências dos cruzamentos de indivíduos de mesma origem individualmente. É também previsto que outros tecidos possuem utilidade na prática da presente invenção. Os explantes podem incluir embriões maduros, embriões imaturos, meristemas, tecido de calo ou qualquer outro tecido que pode ser transformado ou regenerado.
Qualquer meio de cultura de planta adequado pode ser utilizado durante o processo de transformação. Os exemplos de meios adequados incluiriam, mas não estão limitados a meios à base de MS (Murashige e Skoog, 1962) ou meios à base de N6 (Chu e outros, 1975) suplementados com reguladores de crescimento de planta adicionais incluindo, mas não limitados a auxinas tais como picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropico-línico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) e dicamba (ácido 3,6-dicloroanísico); citoquininas tais como BAP (6-benzilaminopurina) e cinetina; ABA; e giberelinas. Outros aditivos de meios podem incluir, mas não estão limitados a aminoácidos, macroelementos, ferro, microelementos, inositol, vitaminas e compostos orgânicos, carboidratos, componentes de meio indefinidos tais como hidrolisados de caseína, antagonistas de etileno incluindo nitrato de prata com ou sem um agente de formação de gel apropriado tal como uma forma de ágar, tal como uma agarose de baixo ponto de fusão ou Gelrite®, se desejado. Os versados na técnica estão familiarizados com a variedade de meios de cultura de tecido, que quando suplementados apropriadamente, sustentam o crescimento e o desenvolvimento do tecido de planta e são adequados para a transformação e para a regeneração da planta. Estes meios de cultura de tecido podem ser obtidos na forma de uma preparação comercial ou preparados e modificados pelo usuário. Os exemplos de tais meios incluiriam, mas não estão limitados a meios de Murashige e Skoog (1962), N6 (Chu e outros, 1975), de Linsmaier e Skoog (1965), de Uchimiya e Murashige (1962), de Gamborg (Gamborg e outros, 1968), meio D (Duncan e outros, 1985), meios de plantas Lenhosas de McCown (Mc-Cown e Lloyd, 1981), Nitsch e Nitsch (1969) e Schenk e Hildebrandt (1972) ou derivações destes meios suplementadas de forma correspondente. Os versados na técnica estão cientes que os meios e os suplementos de meios tais como nutrientes e reguladores de crescimento para uso na transformação e na regeneração e outras condições de cultura tais como intensidade da luz durante a incubação, pH e temperaturas de incubação podem ser otimizados para a variedade particular de interesse.
Uma vez que o tecido de planta que pode ser transformado é i-solado, a etapa seguinte do método é a introdução dos componentes genéticos no tecido da planta. Este processo é também referido aqui como “transformação”. As células vegetais são transformadas e cada célula vegetal transformada independentemente é selecionada. Os transformantes independentes são referidos como eventos transgênicos. Um número de métodos foi relatado e pode ser utilizado para inserir componentes genéticos no tecido de planta que pode ser transformado. O bombardeio de microprojéteis e o fornecimento gênico mediado por Agrobacterium são os dois métodos de transformação de plantas mais comumente utilizados, mas outros métodos são conhecidos.
Os versados na técnica estão cientes das etapas típicas no processo de transformação de plantas. Os versados na técnica estão familiarizados com os procedimentos para o crescimento e com as condições de cultura adequadas para Agrobacterium assim como com os procedimentos de inoculação subsequentes. A densidade da cultura de Agrobacterium utilizada para a inoculação e a proporção de células de Agrobacterium em relação ao explante podem variar de um sistema para o seguinte e, portanto, é esperada a otimização destes parâmetros para qualquer método de transformação. A Agrobacterium também pode ser induzida diretamente partindo de estoques congelados ou pode ser cultivada de várias maneiras conhecidas por um versado na técnica. O estágio seguinte do processo de transformação é a inoculação. Neste estágio, os explantes e as suspensões de células de Agrobacterium são misturados juntos. Isto pode ser conseguido através de incubação dos explantes na suspensão de células de Agrobacterium. Em outras moda- lidades descritas aqui, os explantes foram inoculados enquanto ainda estavam ligados ao tecido doador, enquanto os explantes eram removidos do tecido doador, após o plaqueamento dos explantes no meio de seleção ou através de uma combinação. A duração e a condição da inoculação e a densidade de células de Agrobacterium variarão dependendo do sistema de transformação de planta.
Após a inoculação, qualquer suspensão de Agrobacterium em excesso pode ser removida e a Agrobacterium e o material vegetal alvo são cocultivados. O cocultivo refere-se ao tempo pós-inoculação e antes da transferência para um meio de retardo ou de seleção. Qualquer número de meios de cultura de tecido de planta pode ser utilizado para a etapa de cocultivo. Os tecidos vegetais após a inoculação com Agrobacterium podem ser cultivados em um meio líquido ou em um semissólido. O cocultivo é tipicamente realizado durante aproximadamente um até três dias a uma temperatura de aproximadamente 18°C - 30°C. O cocultivo pode ser realizado na luz ou em condições de limitação de luz. As condições de luminosidade podem ser otimizadas para cada sistema de planta que é conhecido pelos versados na técnica.
Após o cocultivo com Agrobacterium, os explantes tipicamente podem ser colocados diretamente em meio seletivo. Alternativamente, após o cocultivo com Agrobacterium, os explantes poderíam ser colocados em meio sem o agente seletivo e subsequentemente colocados em meio seletivo. Os versados na técnica estão cientes das várias modificações nos regimes de seleção, nos meios e nas condições de crescimento que podem ser variados dependendo do sistema de planta e do agente seletivo. Os agentes seletivos típicos incluem, mas não estão limitados a antibióticos tal como geneticina (G418), canamicina, paromomicina ou outros compostos químicos tais como glifosato, fosfinotricina, bialaphos e dicamba. Os componentes de meios apropriados adicionais podem ser adicionaidos no meio de seleção ou de retardo para inibir o crescimento de Agrobacterium. Tais componentes do meio podem incluir, mas não estão limitados a antibióticos tal como carbeni-cilina ou cefotaxime.
Em uma modalidade, as etapas de inoculação, cocultivo e seleção foram combinadas em uma única etapa através do plaqueamento dos explantes inoculados diretamente sobre um meio que continha agentes seletivos para a supressão do crescimento de Agrobacterium e para matar células de explantes não transformadas para aumentar a eficiência do sistema de produção de transformação.
As culturas são subsequentemente transferidas para um meio adequado para a recuperação das plantículas transformadas. Os versados na técnica estão cientes do número de métodos para a recuperação das plantas transformadas. Uma variedade de meios e requerimentos de transferência pode ser implementada e otimizada para cada sistema de planta para a transformação de plantas e para a recuperação de plantas transgênicas. Consequentemente, tais meios e condições de cultura divulgados na presente invenção podem ser modificados ou substituídos por componentes nutricionalmente equivalentes ou processos similares para a seleção e para a recuperação de eventos transgênicos e ainda se encaixam dentro do âmbito da presente invenção. A presente invenção inclui todas as etapas descritas anteriormente; entretanto, são feitas modificações quando apropriado para facilitar o processo em um único recipiente. A cultura líquida em vários tipos de suporte é utilizada para facilitar a troca do meio de etapa para etapa. Um biorrea-tor com sistema de imersão temporária ou outro dispositivo que fornece resultados similares pode ser utilizado para a substituição do meio.
No caso do calo como o explante, o calo pode ser cortado finamente utilizando vários dispositivos incluindo, mas não limitados a um espremedor de alho, uma tesoura, bisturi ou outros dispositivos de corte. O calo pode ser cortado de forma muito fina para caber dentro de um sistema de placa de várias cavidades pequenas, em que a expectativa é a obtenção de um único evento em cada cavidade. Estas modificações fornecem alívio ergonômico e podem ser utilizadas para recuperar muitos eventos transgênicos partindo de um único pedaço de calo.
Os transformantes produzidos são subsequentemente analisa- dos para determinar a presença ou a ausência de um ácido nucléico particular de interesse contido no vetor de transformação. As análises moleculares podem incluir, mas não estão limitadas a análises de Southern blots (Southern, 1975) ou de PCR (reação em cadeia da polimerase), abordagens de diagnóstico imunológico e avaliações no campo. Estes e outros métodos bem conhecidos podem ser realizados para confirmar a estabilidade das plantas transformadas produzidas através dos métodos divulgados. Estes métodos são bem conhecidos pelos versados na técnica e foram relatados (ver, por exemplo, Sambrook e outros, 1989).
Os versados na técnica considerarão as muitas vantagens dos métodos e das composições fornecidos pela presente invenção. Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser considerado pelos versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionarem bem na prática da invenção e assim podem ser consideradas como constituindo os modos preferidos para a sua prática. Entretanto, os versados na técnica devem, à luz da presente descrição, considerar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades especificas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou similar sem sair do espírito e do âmbito da invenção. Todas as referências citadas aqui são incorporadas aqui como referência até a extensão que suplementam, explicam, fornecem um fundamento para ou ensinam uma metodologia, técnicas ou composições empregadas aqui.
Exemplos Os exemplos a seguir são fornecidos com a finalidade de ilustração de várias modalidades da invenção e não devem ser entendidos como limitantes da presente invenção de forma alguma. Um versado na técnica considerará facilmente que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objetivos e para obter as finalidades e as vantagens mencionadas, assim como os objetivos, as finalidades e as vantagens inerentes contidos aqui. Os presentes exemplos, junto com os métodos descritos aqui são agora representativos das modalidades preferidas, são exemplos e não são pretendidos como limitações do âmbito da invenção. As alterações contidas aqui e outros usos que são abrangidos dentro do espírito da invenção que é definido pelo âmbito das reivindicações ocorrerão aos versados na técnica. Exemplo 1 Fonte de Explantes e Condições de Cultura Calos de oito dias de idade (oito dias após o subcultivo) obtidos partindo de embriões imaturos de milho foram cultivados em meio 211V geli-ficado (mistura de sais basais de N6, 1 mg/L de 2-4-D, 1 mg/L de Tiamina HCI, 1 mg/L de Ácido Nicotínico, 0,91g/L de L-Asparagina Monoidratada, 0,1 g/L de myo-inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI26H20, 0,1 g/L de hidro-lisado de caseína, 0,69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarose, 0,1 mM de nitrato de prata, 6 g/L de Phyta ágar).
Sempre que o uso de meio gelificado for mencionado, foram utilizadas placas de Petri de 25 X 100 mm contendo 50 mL de meio com 12 explantes por placa e todas as transferências foram feitas manualmente. O meio líquido consistia de 212V (sais basais de N6 com 2 mg/L de 2-4-D, 1 mg/L de Tiamina HCI, 1 mg/L de Ácido Nicotínico, 0,91 g/L de L-Asparagina Monoidratada, 0,1 g/L de myo-inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI2 6H20, 0,1 g/L de hidrolisado de caseína, 0,69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarose, 0,01 mM de nitrato de prata, pH ajustado em 5,8 e autocla-vado a 121°C e 105 kPa durante 20 min. Após a autoclavação, a Carbenicili-na e a Paromomicina esterilizadas por filtração a 250 mg/L ou 500 mg/L e 100 mg/L ou 200 mg/L de concentração foram adicionadas ao meio como um agente seletivo.
Para a cultura líquida, foi utilizado um recipiente de Sistema de Imersão Temporária (TIS), placas de Petri de 240 x 240 mm de dimensão ou placas de Petri de 25 x 100 mm ou placas de várias cavidades.
Todas as culturas foram incubadas a 27-28°C na escuridão em uma câmara de crescimento (Percival scientific Series 101 US).
Infecção e cocultivo com Aorobacterium tumefaciens. Calos de oito dias de idade de tamanho uniforme em crescimento ativo foram selecionados e inoculados com uma suspensão de Agrobacterium (0,25 X 109 ufc/mL) durante 30 minutos. Os calos foram lavados com meio líquido 212V contendo 0,1 mM de AgN03 e transferidos para um recipiente TIS ou uma placa de Petri de 25 X 100 mm contendo papel de filtro ou uma placa de Pe-tri rasa grande (240 X 240 mm) contendo duas camadas de (220 X 220 mm) feltro de poliéster. Os tratamentos de cocultivo foram realizados na escuridão a 23°C.
Cepas e plasmídeos de A. tumefaciens. A cepa C58 ABI de Agrobacterium foi utilizada para mediar a transferência de DNA para dentro das células vegetais. O plasmídeo pMON30113 (figura 1) continha o gene da neomicina fosfotransferase II (NPTII) como o marcador que pode ser selecionado e um gene da proteína de fluorescência verde (GFP) como o marcador que pode ser verificado controlados pelo promotor 35S.
Exemplo 2 Sistema de Imersão Temporária (TIS) Um TIS modificado foi construído como a seguir. Duas câmaras de uma unidade de filtro de 250 ml_ que pode ser autoclavada (Nalge Nunc Intl., Rochester, NY) foram conectadas através da inserção de um tubo de vidro na base da placa de suporte normalmente utilizada para sustentar o filtro de membrana. Mangueiras de ar foram conectadas nas duas câmaras. O fluxo de ar foi esterilizado por passagem através de filtros de membrana PTFE hidrofóbicos com 50 mm de diâmetro e tamanho de poro de 0,2 pm (Millipore, Billerica, MA). O meio líquido foi colocado na câmara inferior e os materiais de explante foram colocados sobre um disco de suporte na câmara superior. O ar foi bombeado para dentro da câmara inferior para deslocar o meio líquido através do tubo de vidro até a câmara superior, cobrindo o calo com líquido. O ar bombeado para a câmara superior forçou o meio a retornar para a câmara inferior (apenas um filme fino de meio líquido permanece sobre os tecidos). Um cronômetro eletrônico foi utilizado para operar as sole-nóides que controlam o fluxo de ar para a câmara superior ou inferior. O cronômetro foi programado em relação ao fluxo de ar para dentro da câmara inferior, ao fluxo de ar para a câmara superior ou “tempo ocioso” (sem fluxo de ar). Os tempos de emissão de fluxo de ar foram ajustados em 1 até 5 min cada enquanto que o tempo ocioso podia variar. O programa foi então ajustado para rodar em um ciclo contínuo ao longo de estágios diferentes do processo de transformação. Desta maneira, os tecidos ficaram completamente imersos durante aproximadamente 1-5 min nos intervalos de tempo ajustados. Isto é chamado de frequência do ciclo de imersão.
Otimização das frequências do ciclo de imersão. O tecido foi cultivado em uma imersão com duração de 1 min e quatro frequências de ciclo de imersão diferentes (uma vez a cada 6 h, 8 h, 12 h e 24 h) cada, durante um período de 8 semanas foram testadas. Como um controle, metade dos calos derivados da mesma espiga foi cultivada em meio gelificado 211V com seleção.
Foi observado que o intervalo de tempo de imersão tem impacto significativo sobre a taxa de proliferação de calo no TIS. A taxa máxima de aumento de proliferação e de biomassa dos calos ocorreu utilizando uma frequência de imersão de 12 h ou 24 h. Com estas duas frequências de ciclo de imersão, 70-80% dos calos produziram setores positivos para GFP. Aumentando a frequência de imersão para um ciclo a cada 6 ou 8 horas, não foi observado qualquer sinal de proliferação de calo e dentro do período de 10 até 14 dias, o calo ficou marrom e eventualmente morreu.
Efeito da Carbenicilina sobre o Crescimento de A. tumefaciens. Os calos foram inoculados com pMON30113 como descrito anteriormente. Após a inoculação, os calos infectados foram transferidos para o meio de proliferação de calos (212V) suplementado com 0, 100, 250, 500 ou 1000 mg/L de carbenicilina. O crescimento de Agrobacteríum foi avaliado visualmente através da observação da turvação do meio líquido na câmara inferior do aparato do TIS. Uma unidade do TIS separada com o tratamento de controle não inoculado foi incluída. Um controle adicional de calo não inoculado também foi cultivado sobre meio gelificado suplementado com carbenicilina (211V) para estudar o efeito da carbenicilina sobre a cultura de calo. Não foi observada uma diferença significativa na qualidade do calo quando o calo não inoculado cultivado em meio 211V (gelificado) e 212V (líquido) com ou sem suplementação de carbenicilina, indicando que não há efeito negativo da carbenicilina sobre o crescimento e o desenvolvimento do calo não inoculado. Entretanto, foram observadas diferenças no crescimento de A. tumefaciens e setores positivos para GFP à medida que a concentração de carbenicilina era aumentada de 0,0 até 1000 mg/L. A carbenicilina a uma concentração de 100 mg/L não podia suprimir o crescimento de Agrobacteri-um em meio líquido ou gelificado. Foi observado que a concentração ótima de carbenicilina era de 500 mg/L para meio gelificado e líquido.
Efeito da Paromomicina sobre a Proliferação de Calos e de Brotos. Para inibir a proliferação de calos não transgênicos, os meios de cultura tanto gelificados (controle) quanto líquidos foram suplementados com o a-gente seletivo paromomicina (25, 50, 75, 100 ou 200 mg/L). Os tratamentos de controle eram (1) calo não inoculado em meio seletivo, (2) calo não inoculado em meio sem seleção e (3) calo inoculado em meio sem seleção. 0 meio de cultura básico consistia em 211V ou 212V. Para este experimento, foram utilizadas placas de Petri fundas de 25 X 100 mm. Com a cultura líquida, duas camadas de feltro de 60 X 60 mm foram utilizadas para apoiar os explantes. O agente seletivo para a cultura inoculada com Agrobacterium continha carbenicilina e paromomicina. A paromomicina em baixas concentrações inibia de forma mais eficiente o crescimento de calos embriogênicos e a regeneração da planta em meio líquido que em meio gelificado. Não foram obtidas plantas partindo de calo não inoculado em meio líquido contendo tão pouco quanto 50 mg/L de paromomicina, enquanto 50% dos calos produziram plantículas em meio gelificado na mesma concentração de paromomicina. A paromomicina em uma concentração de 100 mg/L inibia o crescimento dos calos tanto em meio líquido quanto gelificado.
Otimização da Quantidade de Meio Líquido Utilizada no TIS. Os calos em desenvolvimento foram cultivados em uma de quatro quantidades diferentes de meio líquido (20 mL, 30 mL, 50 mL e 100 mL/recipiente).
Seleção e Regeneração no TIS. Após 3 dias de cocultivo no TIS, 20 mL de meio de seleção 212VRT (sais basais de N6 com 2 mg/L de 2,4-D, 1 mg/L de Tiamina HCI, 1 mg/L de Ácido Nicotínico, 0,91 g/L de L- Asparagina Monoidratada, 0,1 g/L de myo-inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI26H20, 0,1 g/L de hidrolisado de caseína, 0,69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarose, 0,01 mM de nitrato de prata, 500 mg/L de Carbenicilina e 100 mg/L de Paromomicina) foram injetados na câmara inferior do TIS. Os calos foram imersos durante um minuto uma vez a cada 12 horas. Após duas semanas de incubação, o meio 212VRT foi aspirado da câmara inferior utilizando uma bomba a vácuo e substituído por 20 mL de meio 212RT (sem nitrato de prata). Os calos foram imersos durante um minuto uma vez a cada 24 horas durante mais duas semanas. Após completar 4 semanas da fase de seleção, o meio de seleção foi substituído por meio com pulso de BAP 217A (sais basais de N6 com 1 mg/L de Tiamina HCI, 1 mg/L de Ácido Nico-tínico, 3,52 mg/L de BAP, 0,91 g/L de L-Asparagina Monoidratada, 0,1 g/L de myo-inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI2 6H20, 0,1 g/L de hidrolisado de caseína, 0,69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarose, 250 mg/L de Carbenicilina). Os calos foram tratados com meio 217A durante 7 dias com um minuto de imersão uma vez a cada 12 horas.
Para a regeneração da planta, o meio 217A foi substituído pelo meio 632AG (mistura de sais de MS, vitaminas de MS, 50 mg/L de myo-inositol, sacarose a 60 g/L, paromomicina a 50 mg/L e carbenicilina a 250 mg/L). O meio foi injetado na câmara superior do TIS e duas rodadas rápidas de um minuto de imersão foram realizadas para diluir qualquer meio 217A residual. As luzes no Percival foram ligadas em um ciclo de 16 h acesas / 8 h apagadas. O TIS foi mantido ocioso (sem qualquer imersão) durante 72 horas e, depois disso, os calos foram imersos uma vez a cada 24 horas até os brotos se desenvolverem até o tamanho de 5-20 mm.
Após 10-12 semanas de seleção e regeneração em um recipiente, as plantas transgênicas foram obtidas. Uma frequência de transformação de 5,9% foi conseguida no TIS. Esta se compara a 17,7% no controle. Exemplo 3 Uso de Placas de Petri Os calos obtidos como no Exemplo 1 foram lavados com o meio líquido 212V contendo 0,1 mM de AgN03 e transferidos para uma placa de Petri de 25 x 100 mm contendo papel de filtro ou uma placa de Petri rasa grande (240 x 240 mm) contendo duas camadas de feltro de acrílico (220 X 220 mm).
Os explantes foram então cultivados como descrito no TIS no Exemplo 2 com as diferenças sendo que as trocas de meios líquidos foram feitas manualmente. O meio líquido foi comparado com o meio gelificado. Na placa de Petri menor, o meio líquido forneceu uma frequência de transformação de 4,2% comparada com 6,6% com meio gelificado. Na placa de Petri maior, o meio líquido forneceu uma frequência de transformação de 7,8% comparada com 11,5% com meio gelificado. Isto demonstra que o meio líquido é uma alternativa viável para os protocolos padronizados de meio sólido. O meio líquido permitirá uma maior automatização.
Exemplo 4 Uso de Placas de Várias Cavidades como Recipiente As placas de várias cavidades também podem ser utilizadas como o sistema de um único recipiente. Foram feitos experimentos como descrito anteriormente exceto pelo uso de placas de várias cavidades ao invés de placas de Petri. As placas de várias cavidades da Costar (Corning Life Sciences, Acton, MA) foram utilizadas com ou sem seus insertos Transwell®. O tamanho dos poros de membrana utilizados (0,1 μ) permite que o meio penetre através da membrana no tecido de milho quando necessário, sem submergir o tecido. As portas de acesso das ponteiras de pipeta permitem que o meio seja rapidamente removido e adicionado nas cavidades para a troca do meio. Durante as transferências de meio, o meio dentro das cavidades é trocado aspirando o meio velho com uma mangueira a vácuo e pipetando ali o meio novo.
As placas de várias cavidades utilizadas nesta invenção vêm em um tamanho de 24 cavidades separadas (com insertos) por placa. Alternativamente, podem ser utilizadas placas de várias cavidades com um reservatório de meio comum oposto para separação. As placas são tipicamente embrulhadas com Nescofilm® ou Parafilm® ou deixadas não embrulhadas e armazenadas em incubadoras (27°C) da mesma maneira que é feita com a seleção em meio sólido. O fato de que as cavidades são separados um de cada outro é particularmente benéfico porque a contaminação bacteriana não se espalha para outros explantes, como poderia ser o caso em reservatórios de meio comuns, seleção líquida em feltro ou seleção em meio sólido. O vetor pMON 68410 foi utilizado para a transformação e continha o gene npfll como um marcador que pode ser selecionado e gfp como um marcador que pode ser classificado. O tecido de calo de LH244 foi utilizado como um explante. As etapas de transformação eram as mesmas que as divulgadas no Exemplo 8. Os experimentos também foram feitos nas placas de várias cavidades Costar com e sem matrizes diferentes para o fornecimento de suporte para o explante em meio líquido. As esferas de vidro, as esferas de silício, o feltro, a espuma e o meio sólido com meio líquido adicional foram utilizados. Os tratamentos de controle eram: cultura em meio sólido em placas de Petri (trt #1; Tabela 1) e apenas meio líquido em placas de várias cavidades (trt #2; Tabela 1). As matrizes diferentes foram utilizadas em quatro experimentos por quatro pessoas diferentes. Todos os tratamentos forneceram plantas transgênicas. Entretanto, o uso de matriz de esfera de silício e os feltros pequenos estavam de acordo com o tratamento de controle de cultura em meio sólido em placas de Petri.
Tabela 1. Uso de placas de várias cavidades com e sem matrizes para a produção de plantas de milho transgênicas partindo de explantes de calo. A Tabela 2 mostra que o sistema de várias cavidades com (trt n° 3 até 5) e sem (trt n° 6) matrizes também pode ser utilizado para a produção de plantas de milho transgênicas utilizando embriões imaturos como explan-tes e glifosato como um agente seletivo. O vetor pMON 92690 para este estudo continha os genes cp4 e gus. A transferência de meio em várias cavidades foi feita em uma base semanal.
Tabela 2. Uso de placas de várias cavidades com e sem matrizes para a produção de plantas de milho transgênicas partindo de explantes de embrião.
I | I_____________________ _______________________________________________ Exemplo 5 Uso de Uma Única Placa de Petri com Meio Sólido Seguido por Meio Líquido Um outro exemplo de um sistema de um único recipiente é o uso de uma única placa de Petri com meio sólido e subsequentemente a adição de meio líquido para facilitar a seleção e a regeneração na única placa sem a substituição do meio velho. O calo de milho foi obtido e inoculado como descrito no Exemplo 7. O calo foi então cocultivado em uma placa de Petri funda de 25 X 100 contendo um papel de filtro Whatman e 100 pL de meio 1/2 MSPL a 23°C. Após 3 dias, o calo foi transferido para o meio sólido 850QRT (4,33 g/L de sais de MS, 0,5 mg/L de tiamina HCI, 0,5 mg/L de piridoxina HCI, 0,5 mg/L de ácido nicotínico, 100 mg/L de myo-inositol, 0,5 g/L de hidrolisado de caseína, 1,38 g/L de prolina, 30 g/L de sacarose, 0,5 mg/L de 2,4-D, 10 pg/L de BAP, 20 pM de AgN03, 500 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de paromo-micina, pH 5,8, 6 g/L de ágar).
Após 14 dias, 7-10 mL de meio 850QRTT fresco (850QRT sem o ágar e com 200 mg/L de paromomicina) foram adicionados e as placas foram incubadas em luz baixa. Após 14 dias adicionais, 7-10 ml_ de meio 850RT fresco (4,33 g/L de sais de MS, 0,5 mg/L de tiamina HCI, 0,5 mg/L de piridoxina HCI, 0,5 mg/L de ácido nicotínico, 100 mg/L de myo-inositol, 0,5 g/L de hidrolisado de caseína, 1,38 g/L de prolina, 30 g/L de sacarose, 0,5 mg/L, 10 pg/L de BAP, 500 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de paromomicina, pH 5,8) foram adicionados e as placas foram adicionalmente incubadas em luz fraca.
Após mais 14 dias, os brotos regenerados foram transferidos para o meio 632AT (4,33 g/L de sais de MS, 0,5 mg/L de tiamina HCI, 0,5 mg/L de piridoxina HCI, 0,5 mg/L de ácido nicotínico, 50 mg/L de myo-inositol, 60 g/L de sacarose, 250 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de paromomicina, pH 5,8, 6 g/L de ágar). As plantas regeneradas foram então transferidas para phytatrays contendo o mesmo meio após 14 dias e então transferidas para o solo em 2 semanas.
As plantas selecionadas e regeneradas em meio sólido produziram aproximadamente 46% de plantas transformadas que podiam ser utilizadas comparadas com 47% de plantas transformadas que podiam ser utilizadas partindo do método de controle utilizando meio líquido sobre um suporte de feltro.
Exemplo 6 Transformação de Milho mediada por Aarobacterium Utilizando um novo Método de Cultura em Suspensão É conhecido na técnica que a produção de cultura de suspensão de células que podem ser transformadas é demorada e resulta frequentemente na produção de células não embrionárias. Este exemplo descreve um método altamente reproduzível (referido aqui como “cultura em suspensão curta” ou “SSC”) para a produção de uma cultura em suspensão rápida que é altamente embriogênica e muito competente para a transformação gênica mediada por Agrobacterium. A SSC como um explante combina as características desejáveis do calo (embrionário e fácil de utilizar) e de culturas em suspensão (uniformes, que podem ser altamente regeneradas e que podem ser aperfeiçoadas para a produção de alto rendimento). Neste exemplo não limitante, a neomicina fosfotransferase II (npfll) foi empregada como um marcador que pode ser selecionado e um sistema de vetor binário padronizado foi utilizado para a seleção e a regeneração eficientes dos eventos transgênicos estáveis mediados por Agrobacterium no milho.
Cepa, plasmídeo e cultura de Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens EHA 101 desarmado carregando o vetor binário pMON25457 foi utilizado neste experimento. O pMON25457 continha genes selecionáveis (npfll) e repórteres (uidk), cada um controlado por um promotor 35S intensificado (“e35S”) e seguido por um íntron hsp70 não traduzido. O gene uidA possui um íntron adicional dentro de sua sequência codificadora para minimizar a expressão bacteriana. Os plasmídeos foram introduzidos na cepa de Agrobacterium por eletroporação com um Bio-Rad Gene Pulser operado a 2,5 kV e 400 Ohms. As colônias transformadas foram selecionadas em meio Luria-Bertani (LB) sólido (Sambrook e Russell, 2001) contendo 100 mg/L de cada um de canamicina e gentamicina.
Indução e cultivo de Agrobacterium. As células de Agrobacterium utilizadas para a transformação foram pré-induzidas com acetossiringona (200 μΜ) e glicose (2%) em meio de indução à base de AB (0,1 M de MES, 0,5 mM de NaH2P04, 2% de glicose, 1 g/L de NH4CI, 300 mg/L de Mg-S04«7H20, 150 mg/L de KCI, 10 mg/L de CaCI2 anidro, 2,5 mg/L de Fe-S04»7H20, pH ajustado em 5,4 com NaOH).
Um procedimento geral para a indução de células de Agrobacterium é como a seguir. Uma alça cheia de colônias de bactérias foi coletada de uma placa fresca e cultivada a 28°C em 50 mL de meio LB contendo antibióticos apropriados. A densidade óptica em 660 nm da cultura de bactérias após aproximadamente 15 até 24 horas de cultivo era de aproximadamente 1,4. Uma alíquota de 10 mL da cultura foi transferida para 50 mL de meio LB fresco contendo antibióticos apropriados e cultivada durante 6 até 8 horas adicionais até uma densidade óptica em 660 nm de aproximadamente 1,2. As células de Agrobacterium foram centrifugadas a 4°C durante 10 min a 3250 x g. O pélete resultante foi ressuspenso no meio de indução até uma densidade óptica final em 660 nm de aproximadamente 0,2 e incubado a 28°C durante aproximadamente 12 até 15 horas. Antes do uso para transformação, as células de Agrobacterium foram centrifugadas a 4°C durante 10 min a 3250 x g. Após decantar o sobrenadante, o pélete foi ressuspenso em meio 1/2 MSVI (2,2 g/L de sal de MS (Gibco), 1 mL/L de estoque de vitaminas 1000x de MS, 115 mg/L de prolina, 10 g/L de glicose, 20 g/L de sa-carose, pH 5,4, esterilizados por filtração) e suplementado com 200 μΜ de acetossiringona. Pelo menos 100 mL de meio 1/2 MS VI suplementado com 200 μΜ de acetossiringona foram utilizados para cada 1 L de suspensão de Agrobacterium. As células suspensas foram aliquotadas em volumes menores, centrifugadas a 4 graus C durante 10 min a 3250 x g, o sobrenadante foi descartado e as pelotas foram armazenadas em gelo até o uso (até 4 horas). As pelotas foram ressuspensas até uma densidade óptica desejada com meio 1/2 MS VI suplementado com 200 μΜ de acetossiringona, com uma suspensão de aproximadamente 109 células/mL fornecendo uma densidade óptica em 660 nm de aproximadamente 0,2.
Crescimento de plantas de estoque e formação de calo. Os ge-nótipos de milho Hi-ll e FBLL foram crescidos na estufa em um período de dia de 16 h. Os cruzamentos envolvendo estes genótipos foram feitos e os embriões imaturos foram cortados sobre um meio N6 modificado (Chu e outros, 1976) suplementado com 1,0 mg/L de 2,4-D,1 mg/L de tiamina HCI, 0,5 mg/L de ácido nicotínico, 0,91 g/L de L-Asparagina Monoidratada, 100 mg/L de myo-inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI26H20, 100 mg/L de hidroli-sado de caseína, 0,69 g/L de prolina e 20 g/L de sacarose; o meio N6 modificado foi solidificado com 2 g/L de Gelgro (número de catálogo 150180, ICN Biomedicals) e o pH do meio foi ajustado em pH 5,8 com KOH (pré-autoclave). As mesmas condições de crescimento foram utilizadas para o genótipo de elite RBDQ2. As linhagens do híbrido FBLL x Hi-ll e de calo RBDQ2 foram subcultivadas em intervalos de duas semanas e mantidas a 28°C na escuridão durante até quatro meses no mesmo meio. Este protocolo de subcultura também funcionava com as linhagens Hi-ll e FBLL-MAB.
Formação de cultura em suspensão curta (SSC). Um protocolo geral para produzir uma SSC partindo de calos é como a seguir. Para iniciar a formação de SSC, aproximadamente 2 g de calos, duas semanas após o subcultivo, foram transferidos para um frasco com aletas de 250 mL contendo 80 mL de meio MS Fromm suplementado com 2,0 mg/L de 2,4-D, 20 g/L de sacarose, 150 mg/L de L-Asparagina, 100 mg/L de myo-inositol, 1 mL de estoque de vitaminas 1000x de MS Fromm contendo 650 mg/L de ácido ni-cotínico, 125 mg/L de piridoxina HCI, 125 mg/L de tiamina HCI e 125 mg/L de pantotenato de cálcio (pH do meio ajustado em 5,8 com KOH). As SSC foram geradas em um agitador giratório ajustado em 170 rpm e 28°C. Durante cada transferência subsequente, foi permitido que os tecidos assentassem por um curto período de tempo no fundo dos frascos para remover os tipos de células indesejáveis (por exemplo, células que estavam alongadas, com parede espessa, com baixo conteúdo citoplasmático ou que não estavam em divisão), antes da suspensão ser transferida com uma pipeta descartável esterilizada Falcon® de boca larga. No dia 1 após o início, o tecido do frasco foi transferido para um frasco novo contendo 80 mL de meio MS modificado e crescido durante mais dois dias; esta etapa de transferência foi repetida no dia 3 após o início. No dia 5 após o início, o tecido foi dividido igualmente entre dois frascos, fornecendo um volume de aproximadamente 2,5 mL de células compactadas (PCV) por frasco. Depois disso, o meio foi substituído a cada 3 dias. No dia 14 após o início, o volume de células compactadas resultante em cada frasco era de aproximadamente 6 mL (aproximadamente 4 g por frasco ou aproximadamente um aumento de quatro vezes no PCV total ao longo de duas semanas). Estas células (“SSC”) foram transferidas para meio fresco no dia 14 após o início e a transformação foi iniciada no dia 15 após o início. A troca relativamente frequente de meio ao longo de todo este procedimento de SSC permitiu uma rápida proliferação do tecido. Uma vantagem adicional do procedimento de SSC era que nenhuma seleção visual de tecidos era necessária em cada etapa de transferência, tornando este sistema tanto prático quanto reproduzível.
Inoculacão e cocultura. Três frascos contendo um total combinado de aproximadamente 18 mL de PCV foram utilizados em um estudo de trans- formação de explantes em SSC de híbridos de FBLL x Hi-ll. Experimentos pilotos foram realizados para melhorar os parâmetros envolvidos nas várias etapas de transformação. Uma técnica de cocultura modificada foi utilizada como descrito por Cheng e outros (2003), que é incorporado aqui como referência. Uma etapa de dessecação foi empregada após a infecção com Agmbacterium, que foi observada como aumentando enormemente a transferência de T-DNA assim como aumentando a recuperação de eventos transgênicos. O tecido em SSC do híbrido FBLL x Hi-ll de cada frasco junto com parte do meio líquido foi igualmente dividido e transferido para dois cavidades de uma placa de cultura de tecido de seis cavidades (Corning CoS-tar®, não tratada, peça número 9088) ou, alternativamente, para uma placa de Petri de 20 X 60 mm. O meio líquido foi removido de cada cavidade ou placa. Cinco mL da suspensão de Agrobacterium (DO660nm ~0,5) em meio 1/2 MS VI suplementado com 200 μΜ de acetossiringona foram adicionados em cada cavidade ou placa, seguidos por um período de inoculação de 1 h. No final do período de inoculação, a maior parte da suspensão de Agrobacterium foi cuidadosamente removida e as células em SSC inoculadas foram lavadas com 5 mL de meio 1/2 MS VI suplementado com 200 μΜ de acetossiringona. As células de cada cavidade ou placa foram transferidas para uma placa de Petri contendo 3 camadas de papel de filtro esterilizado para absorver o líquido em excesso das células e então divididas igualmente e transferidas para duas placas de Petri de 60 X 20 mm, cada uma contendo um pedaço de papel de filtro esterilizado de 5,5 cm de diâmetro (Baxter). Um total de 12 placas de cocultura contendo papel de filtro foi obtido dessa maneira (4 de cada frasco original). As células transferidas foram dispostas em 6 até 8 grupos sobre o papel de filtro. Uma cocultura de um diasob dessecação foi realizada utilizando um protocolo modificado de Cheng e outros (2003), que é incorporado aqui como referência em sua totalidade. Cem pL de meio 1/2 MS VI suplementado com 200 μΜ de acetossiringona foram adicionados em cada papel de filtro e as placas foram embrulhadas com Parafilm® e incubadas na escuridão a 23 graus C. A frequência de transformação foi calculada como o número de eventos independentes regenerados por mL de PCV.
Os experimentos de transformação foram realizados similarmente com explantes em SSC de RBDQ2, utilizando três volumes de células compactadas em réplicas (4,5 mL cada). O procedimento de transformação era geralmente o mesmo que o utilizado com os explantes em SSC de híbridos FBLL x Hi-ll, exceto pelo fato de que, para um dos dois cavidades por frasco, o meio 1/2 MS VI suplementado com 200 μΜ de acetossiringona e contendo 20 μΜ de AgNC>3 foi utilizado durante as etapas de inoculação e de lavagem.
Seleção e regeneração de plantas transqênicas. O protocolo para a transformação de SSC com nptll utilizando seleção com paromomicina envolvia um suporte de papel de filtro simples para a transferência de explantes durante a seleção, que diminuía o trabalho, garantia a eliminação rápida de Agrobacterium, aumentava a taxa de crescimento do tecido e re-sultava em uma seleção mais rápida.
Este procedimento foi realizado em SSC de híbridos FBLL x Hi-ll como a seguir. No dia 0 da transformação (que é no final da etapa de cocul-tura), foi realizada uma etapa de lavagem com 5 mL de meio MS Fromm suplementado com 1000 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, 100 mg/L de vancomicina e 40 mM de AgN03 que foram adicionados diretamente em cada uma das placas de cocultura e os grupos de células foram suavemente agitados utilizando uma espátula esterilizada para garantir a submersão. O meio de lavagem foi removido das placas e os papéis de filtro carregando as células foram transferidos para placas de Petri contendo meio “D” de Duncan sólido fresco contendo 3,0 mg/L de 2,4-D suplementado com 1000 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina e 40 micromolares de AgNC>3 como um meio de retardo. O meio “D” de Duncan contém sais basais e vitaminas do meio “D" como descrito por Duncan e outros (1985), que é incorporado aqui como referência; geralmente 500 mL de um estoque 2X deste meio foram preparados e adicionados em 500 mL de água destilada esterilizada autoclavada contendo 6 g de Phytagar. As células foram mantidas no meio de retardo durante 6 dias. No dia 6 de transformação, uma primeira etapa de seleção foi realizada com os papéis de filtro carregando as células transferidas para placas de Petri contendo o meio “D” de Duncan com 1,5 mg/L de 2,4-D suplementado com 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, 40 micromolares de AgN03 e 50 mg/L de paromomicina como um primeiro meio de seleção. Duas semanas após o final da etapa de cocultura, uma segunda etapa de seleção foi realizada com os papéis de filtro carregando as células transferidas para as placas de Petri contendo o meio “D” de Duncan com 1,5 mg/L de 2,4-D suplementado com 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, 40 micromolares de AgN03 e 100 mg/L de paromomicina como um segundo meio de seleção. Três semanas após o final da etapa de cocultura, uma terceira etapa de seleção foi realizada com grupos do tamanho de ervilhas de tecido removido de cada papel de filtro e plaqueados sobre um meio “D” de Duncan sólido com 1,5 mg/L de 2,4-D suplementado com 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina e 100 mg/L de paromomicina como um terceiro meio de seleção. Havia aproximadamente 4 até 6 grupos resultantes de células plaqueadas de cada papel de filtro e cada grupo de células foi tratado individualmente dali em diante nos experimentos. Um grupo plaqueado por papel de filtro foi analisado his-toquimicamente em relação ao tamanho do setor transgênico, que foi observado como sendo de aproximadamente 1 até 2 mm de diâmetro. Quatro semanas após o final da etapa de cocultura, uma quarta etapa de seleção foi realizada com cada grupo transferido para placas de Petri contendo meio “D” de Duncan suplementado com 1,5 mg/L de 2,4-D suplementado com 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina e 100 mg/L de paromomicina. No final deste quarto ciclo de seleção, foi obtido um total de 232 linhagens híbridas FBLL x Hi-ll resistentes à paromomicina. Sete semanas após o final da etapa de cocultura, uma etapa de seleção e pré-regeneração foi realizada com os calos resistentes transferidos para placas de Petri fundas (20 X 100 mm) contendo 3,52 mg/L de 6-BAP, 500 mg/L de carbenicilina e 100 mg/L de paromomicina durante uma semana. Finalmente, os tecidos em regeneração foram transferidos para um meio de regeneração MS durante duas semanas em placas de Petri, seguidas pela transferência para um Phytatray durante três semanas adicionais. O meio de regeneração MS consistia de meio MS modificado suplementado com 10 g/L de glicose, 20 g/L de sacaro- se, 100 mg/L de myo-inositol, 150 mg/L de L-Asparagina e 1 mL/L de estoque de vitaminas 1000x de MS Fromm contendo 650 mg/L de ácido nicotíni-co, 125 mg/L de piridoxina HCI, 125 mg/L de tiamina HCI e 125 mg/L de pan-totenato de cálcio e 6 g/L de Phytagar; o pH do meio foi ajustado em 5,8 com KOH pré-autoclave e 250 mg/L de carbenicilina e 100 mg/L de paromomícina foram adicionados pós-autoclave. Treze semanas após o final da etapa de cocultura, as plantículas resultantes foram transferidas para o solo.
Análise da progênie de plantas transqênicas. A atividade de ui-dA foi analisada em vários estágios de seleção e transformação, seguindo o procedimento histoquímico descrito por Jefferson (1987), que é incorporado aqui como referência, em vários estágios de transformação e crescimento vegetal. A detecção e a análise do número de cópias de nptll foram realizadas com ensaios INVADER® (Third Wave Technologies, Madison, Wl). Pelo menos sob as condições experimentais descritas anteriormente, foi observado que uma etapa de retardo seguida por um aumento em etapas na pressão de seleção era necessária para recuperar setores transgênicos de ex-plantes em SSC. Em geral, foi observado que a competência para a transformação mediada por Agrobacterium de células de milho era aumentada submetendo o calo a pelo menos uma fase líquida curta antes do início da transformação. Por exemplo, foi observado que os explantes em SSC de híbridos FBLL x Hi-ll eram aitamente competentes à transferência de T-DNA entre aproximadamente 5 dias até aproximadamente 14 dias após o início da SSC com 80% dos tecidos expressando gus 3 dias após a transformação. Também foi observado que culturas SSC mais velhas (2 meses) eram competentes à transformação, com aproximadamente 20% dos explantes exibindo coloração histoquímica em relação à atividade de uidA 3 dias após a transformação. Em contraste, foi observado que os calos de híbridos FBLL x Hi-ll mantidos em meio N6 modificado com 211 eram pouco competentes, com menos de 20% dos explantes exibindo coloração histoquímica em relação à atividade de UidA 3 dias após a transformação.
No caso do genótipo de híbridos FBLL x Hi-ll, foi obtido um total de 232 linhagens resistentes à paromomícina partindo dos três frascos origi- nais. Das 76 linhagens de calos resistentes testadas, foi observado que 56 (aproximadamente 74%) expressavam uidA. Um subconjunto de 35 linhagens resistentes à paromomicina foi regenerado; destas, foi observado que 24 de 25 eventos que foram regenerados em plantas continham uidA. Southern blots e ensaios histoquímicos de plantas com origem em vários experimentos em SSC confirmaram a integração do transgene na geração R1 e a herança dos transgenes pelas gerações RO e R1. No caso do genótipo RBDQ2, 3 frascos em réplica (cada um contendo aproximadamente 4 ml_ de PCV) forneceram um total de 37 supostos eventos positivos em relação a uidA resistentes à paromomicina. A frequência de transformação foi subestimada porque alguns tecidos foram sacrificados para os ensaios histoquímicos para UidA. Neste genótipo, o uso de AgNC>3 durante a inoculação ou a lavagem não aumentou a frequência de transformação, sugerindo que a supressão do crescimento de Agrobacterium por dessecação era suficiente para minimizar a toxicidade do Agrobacterium. Um total de 29 supostos calos resistentes à paromomicina foi gerado, do qual 18 supostos eventos foram transferidos para o solo. Foi observado que dezessete dos 18 eventos eram positivos em relação a uidA através de ensaios histoquímicos do tecido foliar. Assim, a frequência de transformação em SSC de RBDQ2 (com base nos supostos eventos) foi estimada como sendo de aproximadamente 1,4 evento/1 mL de PCV (17 eventos/12 mL de PCV).
Este procedimento de SSC foi assim capaz de estabelecer rapidamente culturas em suspensão do tipo II que podiam ser regeneradas, a-dequadas para a transformação estável mediada por Agrobacterium, partindo tanto do híbrido FBLL x Hi-ll quanto dos genótipos RBDQ2 de elite de propriedade. Os explantes em SSC podem ser especialmente úteis no desenvolvimento de um sistema de avaliação gênica de alto rendimento. Exemplo 7 Preparação de Agrobacterium para Transformação Através da Inoculação Direta de um Estoque em Glicerol Congelado de Agrobacterium em um Meio de Indução Este é um exemplo não limitante de um método de preparação de Agrobacterium para transformação. Mais especificamente, este exemplo descreve a inoculação direta de um estoque em glicerol congelado de Agrobacterium em um caldo de indução vir. A transferência de T-DNA para células vegetais utilizando o plasmídeo Ti requer a ativação dos genes vir que codificam as proteínas Vi-rA e VirG. Os sinais para a tivação de VirA incluem, por exemplo, pH ácido, compostos fenólicos (por exemplo, acetossiringona) e certos açúcares que atuam de forma sinérgica com compostos fenólicos. Convencionalmente, a pré-indução de genes vir envolve o cultivo de células de Agrobacterium (geralmente partindo de um estoque congelado) em um meio de cultivo durante um período de tempo variável, a medida da densidade de Agrobacterium, o ajuste até uma densidade desejada, o crescimento em meio de indução mínimo AB ou outro meio adequado para indução, a centrifugação e a lavagem das células e finalmente o ajuste da cultura de Agrobacterium até uma densidade desejada antes da inoculação. As várias etapas envolvidas requerem tempo e esforço consideráveis e fornecem oportunidades para variabilidade indesejável nos experimentos. É divulgado aqui um procedimento de indução direta de Agrobacterium em uma única etapa rápido que reduz o tempo, o esforço e a variabilidade nos experimentos de transformação. A redução no número de etapas necessárias para a indução também é vantajosa para as finalidades de controle de qualidade e para a redução de sobrecarga ergonômica.
Nas modalidades não limitantes descritas aqui, foi utilizado o vetor pMON 70801 que carrega um gene (cp4) para resistência ao glifosato (ver a Patente U.S. Ns 5.633.435, que é incorporada aqui como referência em sua totalidade); entretanto, muitos outros vetores de Agrobacterium poderíam ser utilizados, como é conhecido na técnica. As densidades ópticas (DO) foram medidas em 660 nanômetros. Procedimentos adequados adicionais, incluindo descrições de meios e reagentes, para a transformação de plantas utilizando a seleção com glifosato, foram divulgados, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente U.S. N- 2004/0244075 a Cai e outros, que é incorporada aqui como referência em sua totalidade.
Indução direta com meio de indução MS modificado. Em uma modalidade não limitante, o procedimento pode envolver a pré-indução de um estoque em glicerol de Agrobacterium congelado em um meio de indução MS contendo componentes de indução vir necessários. Após a pré-indução, as células de Agrobacterium são utilizadas diretamente nos experimentos de transformação. O Agrobacterium foi cultivado partindo de um estoque congelado com meio MS (sais de %MS, 100 μΜ de MES, 2% de glicose com 25% (v/v) de glicerol). O estoque congelado feito com sais de MS foi ressuspenso em um caldo de indução MS modificado contendo acetossiringona (sais de 1/4MS, 100 μΜ de MES, 2% de glicose) suplementado com antibióticos apropriados (Spec/Strep 50 pg/mililitro, Canamicina 50 pg/mililitro e Cloranfenicol 25 microgramas/mililitro e 200 pM de acetossiringona). Um total de 5 horas foi acompanhado com uma DO inicial de 0,4. Para a indução, foi utilizado um frasco (frasco com aletas de 250 mL) com 50 mililitros de meio de indução. No final da indução, a suspensão de Agrobacterium foi utilizada diretamente para a inoculação e foi suplementada com 20 pM de AgNÜ3 logo antes da inoculação. O protocolo de indução direta em MS modificado descrito anteriormente foi comparado com um protocolo convencional envolvendo as etapas a seguir: o Agrobacterium foi cultivado partindo de um estoque congelado durante 8 horas em LB líquido com antibióticos apropriados (Spec/Strep 100 microgramas/mililitro, canamicina 100 microgramas/mililitro e cloranfenicol 25 microgramas/mililitro). O Agrobacterium foi centrifugado e ressuspenso em um caldo de indução mínimo AB com antibióticos apropriados (spec/Strep 50 microgramas/mililitro, canamicina 50 microgramas/mililitro e cloranfenicol 25 microgramas/mililitro) e 200 micromolares de acetossiringona. Um total de indução de 13 horas foi acompanhado com uma DO inicial de 0,2. Para a indução, foi utilizado um frasco (frasco com aletas de 1 litro) contendo 300 mililitros de meio de indução. No final da indução o Agrobacterium foi centrifugado e ressuspenso com 1/4MSVI suplementado com 200 micromolares de acetossiringona até uma DO de 0,4. O AgNÜ3 foi adicionado até uma concentração final de 20 micromolares logo antes da inoculação.
Os explantes para este estudo eram calos derivados de uma linhagem de milho quase elite subcultivada em meio fresco 8 dias antes do início da transformação em meio 201 à base de N6. A inoculação foi realizada em placas fundas de 25 x 100 milímetros. Aproximadamente 6 gramas de calos foram transferidos para uma placa funda contendo 50 mililitros de ΛΑ MS VI (uma placa por tratamento). Os explantes foram lavados e todo o líquido foi removido. Vinte mililitros de suspensão de Agrobacterium (DO 0,4) suplementado com acetossiringona (concentração de final 200 micromolares) e AgN03 (concentração final de 20 micromolares) e uma inoculação de 1 hora foram utilizados. A suspensão de Agrobacterium foi removida após a inoculação e os explantes foram lavados com 15 mililitros de 1/4 MSVI suplementado até a concentração de 20 micromolares de AgN03 e 200 micromolares de acetossiringona. Os calos de cada placa de inoculação foram transferidos para uma placa funda contendo 10 papéis de filtro (7,5 milímetros; número de catálogo da Baxter 28313-046) para remover o líquido em excesso. Aproximadamente 0,5 grama (peso úmido) ou aproximadamente 2,5 gramas (peso seco) de calo foram transferidos para uma única placa de co-cultura (25 x 60 milímetros) contendo um único papel de filtro (5,5 milímetros; número de catálogo da Baxter 28297-868). Os explantes foram dispostos em quatro grupos voltados para a beira da placa de cocultivo. O cocultivo foi realizado com ou sem dessecação (1 mililitro de A MSVI foi adicionado) a 23°C durante 18 horas. Para cada tratamento, que é a indução convencional ou a indução com MS modificado, foram utilizadas sete réplicas (4 sem dessecação, 3 com dessecação). Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada entre os dois protocolos de indução. Foi mostrado que o protocolo de indução direta com MS modificado produzia aproximadamente o mesmo número de supostos eventos como produzia o protocolo convencional mais prolongado.
Indução direta com meio de indução AB. Em uma outra modalidade não limitante, o procedimento envolvia a pré-indução de um estoque em glicerol de Agrobacterium congelado em um meio de indução AB con- tendo os componentes de indução vir necessários. Após a pré-indução, as células de Agrobacteríum foram ajustadas até a densidade desejada e utilizadas diretamente nos experimentos de transformação. O Agrobacteríum foi cultivado partindo de um estoque congelado em LB regular com uma densidade óptica (DO) de Agrobacteríum de 3,0 medida em 660 nanômetros (concentração final).
Uma cultura de Agrobacteríum foi preparada e dividida em duas partes. Uma parte foi cultivada durante 4,5 horas adicionais até uma DO ~0,6 em 36 mililitros de meio 2XYT, centrifugada, ressuspensa em DO ~3,0 em meio mínimo AB contendo 20% de glicerol e congelada para uso em um protocolo de indução direta. Para a indução, 5 mililitros do estoque congelado foram descongelados, adicionados a 70 mililitros de meio mínimo AB contendo acetossiringona e induzidos durante a noite. A segunda parte da cultura de Agrobacteríum foi estriada sobre placas e incubada 3 dias; uma primeira cultura de semeadura preparada partindo destas placas foi crescida durante a noite. Esta foi seguida por uma segunda cultura de semeadura preparada partindo da primeira cultura de semeadura. Crescida durante um dia e induzida durante a noite a DO ~0,2 em meio mínimo AB contendo acetossiringona.
As duas preparações de Agrobacteríum induzidas foram utilizadas para inocular embriões de milho em experimentos paralelos. Os embriões de milho da metade de cada espiga foram cortados dentro de cada uma das preparações de Agrobacteríum (DO ~1,0) durante 15 minutos e então foi permitido que se acomodassem durante 5 minutos. Os embriões foram removidos e colocados sobre placas de cocultura. Utilizando o protocolo convencional, um total de 883 embriões foi inoculado, resultando em um total de 174 (20%) plantas no solo e uma frequência média de transformação de 17% (desvio padrão = 11,4). Utilizando o protocolo de indução direta, um total de 814 embriões foi inoculado, resultando em um total de 153 (19%) plantas no solo e uma frequência média de transformação de 19% (desvio padrão = 11,6). Foi observado que o número de cópias do transgene cp4 era similar entre os tratamentos.
Exemplo 8 Métodos para a Preparação de Calo de Milho para Subcultivo Através de Meios Mecânicos Um dos processos de maior sobrecarga ergonômica e demorados de um sistema de produção de transformação de milho é o estabelecimento e a manutenção do calo embrionário para a transformação mediada por Agrobacterium que requer a ruptura manual do calo durante a etapa de subcultura. Além disso, durante o processo de transformação, muitas células são transformadas em um único embrião imaturo ou um único pedaço de calo. Entretanto, as práticas de seleção e de regeneração atuais tratam cada população de células transformadas em um único embrião imaturo ou pedaço de calo como um único evento, regenerando geralmente uma planta por pedaço de tecido.
Para aliviar a sobrecarga ergonômica criada pela compressão manual através de fórceps do calo, especialmente do calo do tipo I, vários meios mecânicos tais como moedores de café, moinhos para alimentos para bebês, moedores de pimenta em grão, moedores de ervas, cortadores de alho e facas para recortes de decoração foram testados como um meio para romper ou cortar o calo para subcultura. Dentre estes meios, foi observado que o moedor de ervas e a faca para recortes de decoração são os mais adequados para romper ou cortar o calo e na produção de pedaços de calo adequados para subcultura e transformação. O uso de meios mecânicos para a preparação de calo de milho para a subcultura também pode ser feito para separar muitas células transformadas dentro de uma certa unidade de tecido através do corte ou da ruptura do tecido em unidades menores de células transformadas individualmente partindo das quais uma planta transformada pode ser regenerada sendo obtidas assim mais plantas transgênicas partindo da mesma unidade de tecido. O calo para este exemplo foi derivado do cultivo de embriões de milho imaturos em meio de calo 1074 (Tabela 3), que foram isolados dos grãos em desenvolvimento aproximadamente 10 dias após a polinização.
Um calo de cinco até nove semanas de idade foi tratado com um moedor de ervas e colocado em contato com Agrobacterium contendo um vetor carregando o gene nptll para a seleção durante até 60 minutos. O calo inoculado foi seco em blot e cocultivado/dessecado durante 2-3 dias a 23°C na escuridão. O tecido do calo foi então transferido para pedaços de feltro em meio de seleção líquido 1086 (Tabela 3) contendo aproximadamente 50 mg/L de paromomicina e cultivado durante até 30 dias a 27-28°C na escuridão para selecionar o tecido transformado contendo o gene marcador que pode ser selecionado npt\\. O tecido transformado foi então regenerado em plantas através do cultivo do tecido que sobreviveu à seleção em meio de brotamen-to 1087 (Tabela 3) contendo BAP para induzir a formação de brotos durante 5-7 dias a 27-28°C em 16 h de luz. O tecido em crescimento foi incubado em meio 1067 (Tabela 3) durante 2-3 semanas adicionais para induzir raízes. Os brotos saudáveis com ou sem raízes foram transferidos para Phytatrays contendo meio 1067 e subsequentemente para o solo para crescimento.
Tabela 3: Composições dos meios utilizados,_ Tabela 3: Composições dos meios utilizados._ _____ Os resultados indicam que o moedor de ervas pode ser utilizado de forma bem sucedida para romper o calo em pedaços adequados para a subcultura e para a transformação (Tabela 4).
Tabela 4. Uso de moedor de ervas para romper pedaços de calo para subcultura e para transformação.
Uma faca para recortes de decoração (Pickle Slicer, N° 4428 da International Culinary, Mystic, CT) foi também utilizada como um meio para cortar calo para reduzir a sobrecarga ergonômica de métodos de subcultura manuais. A faca para recortes de decoração consistia de 8 lâminas paralelas acopladas à extremidade de um cabo de plástico. A faca foi esterilizada com imersão em um alvejante brando, seguida por uma imersão em etanol e então deixada secar durante aproximadamente 30 minutos. Enquanto a faca estava secando, os calos de 4 semanas de idade (subcultivados manualmente em 2 semanas) foram colocados em uma placa de Petri de 150 x 15 mm e divididos em 3 até 4 pilhas menores dentro de cada placa, cada uma contendo aproximadamente 40 - 60 pedaços de calo. Trabalhando com uma pilha por vez, a faca foi utilizada para cortar ao longo do calo. Com um utensílio esterilizado, o calo foi empurrado para fora da faca que o tinha coletado entre as lâminas para a placa, onde foi cortado uma segunda vez. Outras pilhas de calos foram tratadas da mesma maneira. O calo cortado foi utilizado para a subcultura e para a transformação.
Os dados provenientes de vários experimentos com a faca para recortes de decoração exibiram uma frequência de transformação de 13,16%. Em testes adicionais, a frequência de transformação do calo subcul-tivado manualmente de 21,5% era comparável com a do calo preparado a-través da faca para recortes de decoração (18,9%). Ainda em outros 74 experimentos utilizando uma faca para recortes de decoração como um meio para cortar o calo por 5 usuários diferentes, as frequências médias de transformação entre todos os usuários eram de 19,4% indicando utilidade deste método.
Exemplo 9 Métodos para Inoculacão de Explantes com Aarobacterium Para Transformação Os presentes métodos para a transformação mediada por Agro-bacterium, por exemplo, de embriões imaturos de milho utilizam muitas etapas que envolvem o corte de um embrião em um momento dos grãos, a incubação do mesmo em suspensão de células de Agrobacterium, a remoção da suspensão de Agrobacterium, a transferência dos embriões para uma placa de cocultura para que a infecção ocorra, a orientação dos embriões e a colocação dos mesmos com a parte do escutelo voltada para cima e finalmente a transferência dos embriões para um meio de seleção ou de retardo para manipulações adicionais tais como seleção e regeneração. Muitas destas etapas são ergonomicamente adversas e também aumentam a possibilidade de danificar os embriões cortados e de maior incidência de morte celular relacionada com Agrobacteríum resultando assim em uma frequência de transformação reduzida. Portanto, há uma necessidade na técnica de transformação de milho para simplificar a etapa de inoculação, tal que seja ergonomicamente favoráveis e resulte em uma maior frequência de transformação.
Os inventores simplificaram agora a etapa de inoculação através da redução do número total de etapas inoculando os explantes que podem ser transformados, por exemplo, embrião imaturo, através de 1) imersão de uma espátula em suspensão de Agrobacterium antes de cortar o embrião com a espátula; 2) através de encharcamento da espiga de milho com a suspensão de Agrobacterium antes do corte do embrião; ou 3) através da combinação das duas etapas, por exemplo, através do encharcamento da espiga de milho com a suspensão de Agrobacterium seguido pelo corte dos embriões por uma espátula imersa na suspensão de Agrobacterium.
Em geral, foi utilizado o método de transformação a seguir. Os embriões de milho imaturos provenientes de uma linhagem de milho receptora foram dessecados partindo de grãos em desenvolvimento aproximadamente 10 dias após a polinização e inoculados através de incubação, espátula imersa (18,0%) ou encharcamento da espiga com Agrobacterium contendo o construto. Os embriões inoculados foram cocultivados em meio de cocultura 1514 (Tabela 5) durante aproximadamente 24 h a 23°C na escuridão. Os embriões foram então transferidos para seleção em meio de seleção 1278 (Tabela 5) contendo 0,1 mM de glifosato para selecionar o tecido transformado contendo o gene marcador que pode ser selecionado cp4 e 500 mg/L de Carbenicilina para inibir o crescimento de Agrobacterium através da incubação durante 2-3 semanas a 27°C na escuridão. O tecido de milho transformado foi então regenerado em plantas através da transferência dos pedaços de calo transformados para o primeiro meio de regeneração 1073 (Tabela 5) e cultivado durante 5-7 dias com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuridão e uma temperatura de 27°C. O tecido foi então transferido para o segundo meio de regeneração 1071 (Tabela 5) durante aproximadamente duas semanas. Os brotos regenerados foram transferidos para o meio de enraizamento 1084 (Tabela 5) em Phytatrays. As plantículas em desenvolvimento foram então transferidas para o solo, deixadas enrijecer em uma câmara de crescimento a 27°C, 80% de umidade e intensidade luminosa baixa durante aproximadamente uma semana e então transferidas para uma estufa e crescidas sob condições padronizadas de estufa. O Agrobacterium carregando o plasmídeo pMON 92689 contendo um gene CP4 aroA modificado para a seleção com glifosato (Patente U.S. Ne 5.627.061) foi crescido para inoculação partindo de um estoque congelado feito com meio de indução MS como descrito no Exemplo 7. Os grãos na espiga foram esterilizados com 80% de etanol e cortados na coroa e então lavados com 100 ml_ de MSVI e receberam aplicação de 20 ml_ de suspensão de Agrobacterium. Uma espátula foi imersa na suspensão de Agrobacterium e os embriões imaturos foram cortados e plaqueados no meio de cocultura 1514 durante 24 h a 23°C na escuridão. Estes tratamentos foram comparados com um tratamento padronizado em que os embriões foram cortados em um momento e incubados com a suspensão de Agrobacterium durante até 5 min. O tamanho dos embriões era de 1,5-1,8 mm. Entretanto, foi observado que o método funcionava bem com outros tamanhos de embrião também, por exemplo, tamanhos de embrião variando de 1,4 até 2,2 mm. Os eventos transgênicos podiam ser obtidos através da inoculação direta dos explantes com Agrobacterium enquanto os explantes ainda estavam aderidos ao tecido materno e através da inoculação dos explantes enquanto estes estavam sendo removidos da fonte. As frequências de transformação a seguir foram obtidas para cada tratamento: inoculação por incubação (20,7%), inoculação por espátula imersa (18,0%) e inoculação por encharcamento da espiga (17,0%).
Outros meios de colocar os explantes em contato com Agrobac- terium e a duração do contato podem ser previstos pelos versados na técnica. Por exemplo, uma faca imersa na suspensão de Agrobacteríum pode ser utilizada para a inoculação através do corte do tecido foliar ou de calo em pedaços menores ou uma agulha imersa pode ser utilizada para inocular o tecido da planta através da inserção da agulha no tecido da planta.
Foi observado que o método aumenta a frequência de transformação permitindo menor manipulação do tecido e menor morte celular relacionada com Agrobacteríum. Com 6 construtos diferentes, o método da espátula imersa produziu uma TF média de 14,3% acima do método de incubação padronizado que produziu uma TF de 9,2%.
Tabela 5: Composições dos meios utilizados.______________________________ Tabela 5: Composições dos meios utilizados.
Exemplo 10 Transformação Mediada por Aarobacterium de Milho Realizando Inoculação, cocultura e Seleção em uma Única Etapa Normalmente, os métodos de transformação mediada por Agro-bacterium envolvem 3 etapas distintas: inoculação de um explante com A-grobacterium, cocultivo do explante inoculado em um meio sem um antibiótico para permitir a sobrevivência de Agrobacterium e para aumentar a infecção do explante e seleção da célula transformada em um meio contendo um agente seletivo tal como canamicina e glifosato. Há sempre uma necessidade de reduzir o número de etapas necessárias em um método de transformação para aumentar as eficiências de produção. Os inventores forneceram agora um método para a transformação de milho mediada por Agrobacterium em que as etapas de inoculação, cocultura e seleção podem ser combinadas em uma única etapa através do plaqueamento dos explantes inocula- dos diretamente sobre um meio que contém agentes seletivos para a supressão do crescimento de Agrobacterium e para matar as células do ex-plante não transformadas permitindo assim a inoculação, a cocultura e a seleção em uma única etapa, aumentando dessa maneira as eficiências do sistema de produção de transformação.
Em geral, foi utilizado o método de transformação divulgado no Exemplo 9. O Agrobacterium que contém pMON65375 contendo um gene CP4 aroA modificado para seleção com glifosato (Patente U.S. N-5.627.061) para inoculação foi preparado partindo de um estoque congelado feito em meio de indução mínimo AB como divulgado no Exemplo 7. A espátula foi imersa na suspensão de Agrobacterium antes de cortar cada embrião e os embriões cortados foram plaqueados no meio de cocultura 1233 e então no meio de seleção 1278 ou plaqueados diretamente no meio de seleção 1278. Os resultados mostram que a transformação pode ser feita através da combinação da inoculação, da cocultura e da seleção em uma única etapa com uma variedade de concentrações de Agrobacterium e tamanhos de embrião.
Em uma outra modalidade, a transformação também foi conseguida cultivando primeiro os embriões on a meio de seleção e então aplicando a suspensão de Agrobacterium imediatamente aos embriões ao invés de primeiro aplicar Agrobacterium e então cultivar os embriões no meio de seleção. As plantas transgênicas poderíam também ser obtidas através da aplicação de Agrobacterium adicional durante o cocultivo e a seleção.
Exemplo 11 Seleção de Células Transformadas em Sorbarods e Desenvolvimento de Sistema de Alto Rendimento Explantes adequados tais como calos e embriões imaturos podem ser obtidos através de meios de corte mecânicos e manuais conhecidos na técnica e podem ser inoculados com Agrobacterium contendo um plasmí-deo que compreende qualquer gene de interesse conhecido na técnica. Em uma modalidade, a seleção de uma célula transformada é feita sobre um pedaço de feltro colocado no meio líquido e a regeneração é feita sobre um bloco de Sorbarod® (Baumgartner Papiers SA, Crissier-Lausanne, Suíça) colocado no meio líquido. Em uma outra modalidade, tanto a seleção quanto a regeneração da célula transformada são realizadas sobre um bloco de Sorbarod® colocado no meio líquido. A utilidade destas modalidades é demonstrada através de vários exemplos de dados fornecidos na Tabela 6. As composições dos meios utilizados são mostradas na Tabela 5 exceto que para os meios líquidos o Phy-tagel foi excluído. Embriões imaturos de milho da linhagem receptora foram dessecados de grãos em desenvolvimento e inoculados com Agrobacterium contendo o vetor binário pMON42073 compreendendo um gene CP4 para seleção com glifosato. Os embriões inoculados foram cocultivados em meio de cocultivo 1514 (ver a Tabela 5 para a composição) durante aproximadamente 24 h a 23°C na escuridão. Os embriões inoculados foram então transferidos para um pedaço de feltro quadrado de 5 X 5 cm (Consumer Products Enterprises (CPE) Inc., Union, South Carolina) ou um bloco de Sorbarod (I-LACON Limited, Kent, UK) colocado no meio de seleção líquido 1278 (ver a Tabela 5 para a composição) contendo 0,1 mM de glifosato para selecionar o tecido transformado. Após esta etapa, o meio líquido de seleção 1278 u-sado foi removido e substituído pelo primeiro meio de regeneração líquido 1073 (ver a Tabela 5 para a composição). O tecido foi cultivado durante 5-7 dias com 16 horas de luz a 27°C. Normalmente, esta etapa requer a transferência do tecido selecionado para o primeiro meio de regeneração sólido para cultivo adicional. Este método elimina esta etapa. O tecido parcialmente regenerado no primeiro meio de regeneração líquido foi então transferido para um bloco de Sorbarod colocado dentro de um segundo meio de regeneração líquido (ver a Tabela 5 para a composição) em um copo de Sundae para regeneração completa. Esta etapa de transferência foi eliminada se os embriões inoculados tivessem sido cultivados diretamente sobre o bloco de Sorbarod para iniciar. Em tal caso, o primeiro meio de regeneração líquido foi simplesmente removido e substituído pelo segundo meio de regeneração líquido. O tecido foi cultivado durante aproximadamente duas semanas. Normalmente, esta etapa requer a transferência do tecido em regeneração do primeiro meio de regeneração sólido para o segundo meio de regeneração sólido para cultivo adicional. Este método elimina esta etapa. Plantículas de milho menores completamente regeneradas no bloco de Sorbarod foram transferidas diretamente para o solo. Normalmente, esta etapa requer a transferência de uma plantícula menor completamente regenerada do segundo meio de regeneração sólido para o meio de enraizamento sólido 1084 (ver a Tabela 5 para a composição) para cultivo adicional. Este método elimina esta etapa. As plantículas em desenvolvimento foram deixadas enrijecer em uma câmara de crescimento a 27°C, 80% de umidade e intensidade luminosa baixa durante aproximadamente uma semana e então transferidas para uma estufa e crescidas sob condições de estufa padronizadas e testadas em relação à presença do gene CP4. A Tabela 6 mostra a produção de milho transgênico utilizando cultura líquida em combinação com feltro e bloco de Sorbarod e eliminando várias etapas de transferência. É desenvolvido um sistema de transformação de alto rendimento para o milho em que os recipientes são manipulados por braços robóticos em uma mesa de trabalho que pode ser livremente configurada que inclui incubadoras e agitadores que podem ser utilizados em adição a utensílios de laboratório padronizados. Várias ferramentas de manipulação de líquidos equipadas com uma ou mais ponteiras de pipeta são utilizadas para fornecer o meio fresco e para remover o meio gasto. A mesa de trabalho, os braços robóticos e as ferramentas de manipulação de líquidos são controlados por software através de um computador. Alternativamente, o meio líquido para a seleção e para a regeneração da célula transformada pode ser fornecido ao recipiente através de um ou mais tubos conectados a um recipiente de armazenamento de meio e removido através de um ou mais tubos conectados a um recipiente de descarte. O fornecimento e a remoção do meio líquido são controlados manualmente ou mecanicamente.
Tabela 6. Frequência de transformação (TF) de milho utilizando meio líquido em combinação com matrizes diferentes. A frequência de transformação é calculada como a porcentagem de embriões cultivados que produziram plantas transgênicas.
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REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. Processo para produção de uma planta de milho transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) obtenção de um explante de milho que pode ser transformado; b) cocultivo do explante de milho que pode ser transformado; c) seleção de uma célula de milho transformada proveniente do explante de milho que pode ser transformado em um meio de seleção; e d) regeneração da célula transformada em uma planta em um meio de regeneração, em que as etapas b), c) e d) são realizadas no mesmo recipiente.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o recipiente é selecionado do grupo que consiste em um biorrea-tor, uma placa de Petri, uma placa de várias cavidades, um frasco, um jarro, uma garrafa, uma moringa, um PlantCon, um sistema de imersão temporário, copo de Sundae e uma combinação dos mesmos.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o recipiente é fornecido com uma maneira de fornecer e remover o meio.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o explante é selecionado do grupo que consiste em um calo, um embrião e uma suspensão de células.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio é um meio líquido.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de seleção é um meio sólido e o meio de regeneração é um meio líquido disposto sobre o meio de seleção sólido.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o explante é colocado em contato com o meio temporariamente.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o explante é colocado com o meio de seleção e de regeneração durante aproximadamente 1 até aproximadamente 5 minutos aproximada- mente a cada 12 até aproximadamente 24 horas.
9. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o calo é um calo do tipo I.
10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas c) e d) são realizadas sobre uma matriz, em que a matriz é selecionada do grupo que consiste em feltro, bloco Sorbarod e uma combinação dos mesmos.
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