CN101528932B - 植物无选择转化 - Google Patents

植物无选择转化 Download PDF

Info

Publication number
CN101528932B
CN101528932B CN200780039999.9A CN200780039999A CN101528932B CN 101528932 B CN101528932 B CN 101528932B CN 200780039999 A CN200780039999 A CN 200780039999A CN 101528932 B CN101528932 B CN 101528932B
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
maize
cell
regeneration
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200780039999.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101528932A (zh
Inventor
J·R·劳特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Technology LLC
Original Assignee
Monsanto Technology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology LLC filed Critical Monsanto Technology LLC
Priority to CN201410643281.2A priority Critical patent/CN104357535B/zh
Publication of CN101528932A publication Critical patent/CN101528932A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101528932B publication Critical patent/CN101528932B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4684—Zea mays [maize]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
    • C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8265—Transgene containment, e.g. gene dispersal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

本发明提供用于鉴定再生转化植物和分化的转化植物部分的方法，所述方法在使植物细胞再生以得到分化组织之前，无需让植物细胞经历选择条件。在具体的实施方案中，所述植物细胞是玉米植物细胞。也提供了植物的培育和处理方法，包括对表现出特定目标性状的植物的鉴定方法。

Description

植物无选择转化
发明背景 
本申请要求于2006年8月31日申请的美国临时申请顺序号60/841,519的优先权，该临时申请所公开的全部内容都通过引用结合到本文中。 
1.发明领域 
本发明涉及植物生物技术领域。具体地讲，本发明涉及产生转基因植物的方法，该方法在得到再生植物或植物部分之前无需使用选择标记基因。 
2.相关技术的描述 
植物细胞的稳定转化和转基因植物的产生通常需要选择步骤，其中在接触一个或多个外源核酸序列(包括含有一个或多个编码目标基因和标记基因的序列的外源核酸序列)后，在选择剂存在下选择植物组织。经过这样的选择后，可使含有目标基因(GOI)的稳定转化植物再生并进行鉴定。然而，一旦产生含有GOI的转化植物后，通常就不再需要本身并非GOI的可选择或可筛选的标记基因，而且其存在可能使后续分析和产品开发工作变得复杂化。此外，需要强启动子以驱动选择标记，已经显示出会偏倚所需基因的表达(Yoo等，2005)。 
已经报道了产生无标记基因的转基因植物的各种方法，例如共转化、可转座元件、位点特异性重组和染色体内重组(例如Darbani等，2007)。然而，这些系统大部分既耗时又低效。Goldsbrough(2001)综述了在转基因植物的产生中避免使用或排除选择标记基因的方法。 
De Vetten等(2003；和美国专利申请公布说明书2005/0097641) 描述了营养体繁殖作物(例如马铃薯)的无标记转化方法，然而会产生嵌合植物。Palys等(PCT公布说明书WO2004/081184)介绍了番茄、莴苣和甘蓝的无选择转化。Francis和Spiker(2005)介绍了用基于PCR的筛选来鉴定转基因拟南芥(Arabidopsis)系，以免转基因整合中的选择偏倚。相比之下，本发明提供通过在获得再生玉米植物之前不需要存在选择剂或可筛选标记基因(例如目测标记基因)的方法而快速有效产生种系转化玉米植物的方法。 
发明概述 
一方面，本发明提供转基因玉米植物的鉴定方法，所述方法包括：(a)获得用含有目标核酸序列的DNA区段转化的玉米植物细胞；(b)不经过测定所述DNA区段存在的初次筛选，就从所述细胞再生出多个玉米植株或分化的玉米植物部分；和(c)从多个玉米植株或分化的玉米植物部分中鉴定出至少第一转基因玉米植物或转基因分化植物部分。在一些实施方案中，DNA区段不包含选择标记基因或目测标记基因。在其它实施方案中，植物在固体培养基、液体培养基或者固体与液体培养基组合上生长而得以再生。在具体的实施方案中，植物通过接触GOI之后仅在液体培养基上生长的细胞、而在鉴定转基因玉米植物或转基因分化植物部分之前就得以再生。在某些实施方案中，将接触GOI之后仅生长在液体培养基中的细胞、而在鉴定转基因植物或转基因植物部分之前的细胞转化频率，与接触GOI之后在固体培养基或土壤上生长的细胞、而在鉴定转基因植物或转基因植物部分之前的细胞转化频率进行比较，前者相对更高。 
在某些实施方案中，植物细胞是未成熟的玉米胚细胞。在具体的实施方案中，未成熟玉米胚的长度约1.5mm至约3.5mm，或长度约1.9mm至约2.3mm。 
在某些实施方案中，所述方法在步骤(b)与(c)之间还包括(1)将多个玉米植物或分化的植物部分放入装有生长培养基或水的培养管或生长穴盆(growth plug)中并保留玉米植物各自的识别标记；和(2)让植物或植物部分经历至少第一测定，看DNA区段是否存在，从而根据测定结果来鉴定一个或多个植物或植物部分是转基因的。测定还可选自DNA印迹杂交、PCR、DNA测序、RNA印迹、蛋白质印迹、免疫测定和DNA区段所编码的酶活性测定。在具体的实施方案中，在将再生植株植入土壤之前进行测定。在其它实施方案中，鉴定推定缺乏目标核酸序列的转化玉米植物或分化的植物部分，其中在包含汇集所述多个玉米植物或分化的植物部分的合并核酸亚类的植物组织上进行测定。 
在一些实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于6周使玉米植物或玉米植物部分再生。在其它实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于4周使玉米植物或玉米植物部分再生。在又一些实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于3周使玉米植物或玉米植物部分再生。在再一些实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于2周使玉米植物或玉米植物部分再生。在其它实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于1周使玉米植物或玉米植物部分再生。 
在某些实施方案中，通过细菌介导的转化、电穿孔、PEG介导的转化或粒子轰击法，将DNA区段引入玉米植物细胞中。在具体的实施方案中，细菌介导的转化是由选自土壤杆菌(Agrobacterium)细胞、根瘤菌(Rhizobium)细胞、中华根瘤菌(Sinorhizobium)细胞和中间根瘤菌(Mesorhizobium)细胞的细菌细胞介导的。 
该方法还可包括在植物或植物部分再生后、使从第一玉米植物细胞获取的玉米植物或植物部分经历培养条件的步骤，所述条件选择或允许筛选目标核酸序列的存在与否。在某些实施方案中，生长培养基是固体培养基。在又一些实施方案中，生长培养基是液体。在再一些实施方案中，生长培养基是土壤。在其它实施方案中，再生植物或分化的植物部分就DNA区段的存在而言是一致的。 
附图简述 
下列附图构成本说明书的组成部分，用于进一步证明本发明的某些方面。参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文所给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。 
图1.无选择(“no sel”)转化方案和2T转化方案的示意性比较。(有关2T策略的细节请参见Huang等，2004)。 
图2.用代表性再生品系的GUS进行的组织化学分析。 
图3.通过用草甘膦溶液喷洒各植株后“无选择”方法的草甘膦耐受性事件的恢复。 
图4.来自如实施例4所述的所选R0植物的代表性DNA印迹分析数据。 
图5.用R0花粉和与亲本系回交验证GUS基因的继代种系传递和分离。 
图6.所选独立转化事件后代的DNA印迹分析数据，证明转化序列(CP4基因)的稳定传递。 
图7.安排生长穴盆以允许在转基因序列存在的测定后容易鉴定各个植株。 
图8.利用半固体培养基-比较有选择方法和无选择方法的再生方案的示意图。 
图9.用获取再生植株之前的无选择液体培养的再生方案-增殖培养基的比较。 
发明详述 
许多现代遗传转化植物的产品开发都包括将多个转基因性状集中在一起，从而给农民们提供多个增值性状。该方法的一个主要瓶颈就是存在着选择标记基因，在转化期间这些基因与目标基因(GOI)一起携带，因为该过程通常依赖于使用选择标记基因以确保植物细胞的转化。尽管在转化后去除选择标记基因有多种方法可行，但这些方法通常都耗时且效率也不高。 
本发明通过开发无需使用选择标记基因的有效转化方法，以及用于推进无选择产生的转基因事件的有效的植物处理和筛选方法，从而消除了上述瓶颈。具体地讲，本发明涉及不用选择而提高植物转化效率和随后再生的方法，导致产生无标记转基因事件。这是产生转基因作物的一项重大突破，因为少标记的转化(以及随后在选择剂不存在时进行植物再生)避免了去除标记所带来的麻烦，避免了因需要启动选择标记基因表达而使所得转化事件遗传结构发生偏倚，同时也避免了后代生长期间的潜在困难(例如因为相应GOI与选择标记编码基因的转基因分离)。该方法也消除了对用于可选择或可筛选标记基因的额外表达盒的需要，因而降低了转化载体的大小并带来相关益处(例如降低了因重复性盒序列所致沉默机会，降低了启动子干扰并简化了转化载体的构建)。 
无选择标记转基因植物的高通量产生，需要转化体的有效产生。优选的是无选择转化、尤其是在获得再生苗或完整小植株(包含苗和根)之前的无选择转化，可以在选择剂不存在时进行。在某些实施方案中，转化到靶植物细胞的核酸序列可不包含选择标记基因。在其它实施方案中，可存在选择标记基因或目测标记基因，但转化细胞和再生组织仍然不经历选择剂，所述选择剂是选择标记基因所能耐受、抵抗或对其具有指定的其它可测定表型。 
此外，优选这些转化体对于GOI的存在而言是非嵌合的(即一致的)，因为对于GOI的存在而言是非一致的嵌合植物组织的存在，使得对含GOI的后代植物的进一步分析、产生和鉴定变得复杂化。因此，已经发现，对常规产生非嵌合转基因植物而言的无选择转化(包括随后的再生步骤)需要有效产生大的转基因部分并快速产生苗原基(shoot primordia)。 
此外，在选择压力不存在时，大量植物都可再生，它们许多或大 多数都缺乏GOI。因此，提供了用于再生、培育和鉴定潜在包含GOI的植物的有效方法。在某些实施方案中，植物的再生是在半固体培养基中进行，然后才将推定的转化体移栽到土壤中。在其它实施方案中，培养基可以是液体的。在又一些实施方案中，在再生期间，可采用半固体和液体培养基的组合，以便在筛选和移至组织培养期间所用的不同生长条件时进行植物的处理并能节省时间、金钱和费用。在再一些实施方案中，再生期间只使用液体培养基。在具体的实施方案中，在液体培养基上再生可提高目标基因所接触细胞的转化频率。 
在再生出转化植株的整个组织培养步骤中，选择剂的存在可使所选组织特性发生偏倚，所述偏倚基本上需要某水平的选择标记的表达，以使组织在选择压力下存活。举例来说，这可导致倾向得到异源核酸序列的多重或复合插入的转基因事件的偏倚。因此，本发明提供得到推定转化植物群体或系列的方法，所述方法不需要让植物在组织培养(例如愈伤组织增殖、预再生(pre-regeneration)和再生)阶段期间经历这样的选择压力，而且所述植物可表现出有利的GOI表达特性、和/或在指定事件中发现的转基因插入位点分子结构和遗传分离相关的有利特性。具体地讲，这样的有利特性可包括例如表现出GOI的有利表达水平的有效比例的转化事件，或表现出低拷贝数(即1-2拷贝)插入的有效比例的转化事件。在具体的实施方案中，低拷贝数转化事件缺乏oriV或其它载体骨架(backbone)序列，如果这些序列在转化过程开始最初接触植物细胞的原始转化构建体中存在的话。 
根据本发明方法，无这类选择的转化和再生是可重现且有效的。在某些实施方案中，转化频率(transformation frequency，TF)定义为所得到的稳定转化的一致(即非嵌合)植物的数量除以包含与异源核酸构建体接触的细胞的未成熟胚或其它外植体；转化频率为至少3％，根据胚的大小和培养条件(包括再生方法种类)的不同，转化频率的范围为约3％至约60％。在具体的实施方案中，TF的范围为约10％至约15％。或者，可用其它方式计算TF，例如根据所得转化植株数量除以 所述未成熟胚或其它外植体中再生并生长的植株数量而求出TF。 
在某些实施方案中，无选择转化的作物选自单子叶作物，包括禾本科(Poaceae)，例如玉米、水稻、高粱、小麦、黑麦、黍、甘蔗、燕麦、小黑麦、草坪草(turfgrass)和柳枝稷(switchgrass)植物。在一个具体的实施方案中，作物是玉米植物。在某些实施方案中，接触异源核酸序列的转化靶组织(例如外植体)包括分生组织，例如胚或苗分生组织(shoot meristem)。在某些实施方案中，外植体是胚。在具体的实施方案中，胚是未成熟胚。在再一些实施方案中，未成熟胚是未成熟玉米胚，大小介于约1.9-3.5mm之间，或大小介于约1.6-1.8mm之间。在具体的实施方案中，未成熟玉米胚的大小介于约1.9-2.5mm之间，优选约2.3mm。在其它实施方案中，未成熟玉米胚的大小为约2.5-3.2mm，或约2.8-4.0mm。根据其发育阶段或分离时间、授粉后的天数(DAP)(例如约9-14天DAP或约10-12DAP)，也可选择未成熟胚作为转化靶。 
为了启动本发明的转化过程，首先需要选择准备插入到植物细胞或组织中的遗传组件。遗传组件可包括用本发明方法引入到植物细胞或组织中的任何核酸。遗传组件可包括非植物DNA、植物DNA或合成DNA。 
在一个优选的实施方案中，将遗传组件掺入到DNA组成中，例如包含至少一个或更多以下类型的遗传组件的重组双链质粒或载体分子：(a)在植物细胞中起作用并导致产生RNA序列的启动子，(b)导致产生农艺学有用产物的编码RNA序列的结构DNA序列，和(c)在植物细胞中起作用并使聚腺苷酸化核苷酸添加到RNA序列3′端的3′非翻译DNA序列。 
载体可含有大量遗传组件以便转化植物细胞或组织并调节所需基因的表达。在一个优选的实施方案中，遗传组件是定向的，以便能表达mRNA，而在一个实施方案中可翻译为蛋白质。以双链形式存在的植物结构编码序列(基因，cDNA、合成DNA或其它DNA)的表达包 括通过RNA聚合酶从一条DNA链转录出信使RNA(mRNA)，然后在核内加工mRNA初级转录物。该加工涉及将聚腺苷酸化核苷酸添加到mRNA的3′端的3′非翻译区。 
含所需遗传组件的质粒或载体的制备方法是本领域众所周知的。载体通常由大量遗传组件组成，包括但不限于调节元件，例如启动子、前导序列、内含子和终止序列。根据元件与它们所控制的序列或基因的接近度，调节元件也称为顺式或反式调节元件。 
将DNA转录为mRNA是由通常称为“启动子”的DNA区调节的。启动子区含有这样的碱基序列：所述序列发信号给RNA聚合酶而使其与DNA缔合并启动转录为mRNA，用DNA链之一为模板制备相应的RNA互补链。 
文献中已经介绍了在植物细胞中具有活性的大量启动子。这些启动子可包括但不限于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)根瘤诱导质粒携带的胭脂碱合酶(NOS)和章鱼碱合酶(OCS)的启动子、花椰菜花叶病毒启动子(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子和35S启动子)以及玄参花叶病毒(FMV)35S启动子、增强型CaMV35S启动子(e35S)、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO，一种非常丰富的植物多肽)的光诱导型启动子。所有这些启动子都已用于产生各类DNA构建体，其已在植物中表达。 
也可构建启动子杂合体以增强转录活性(美国专利号5,106,739)，或与所需转录活性、诱导性和组织特异性或发育特异性结合。在植物中起作用的启动子包括但不限于所述诱导型启动子、病毒启动子、合成启动子、组成型启动子以及用于时间调节、空间调节和时空调节的启动子。本领域也已知组织增强型启动子、组织特异性启动子或发育调节型启动子等其它启动子，它们都可用于本发明的实践中。 
启动子可得自不同来源，例如来自植物和植物DNA病毒，包括但不限于CaMV35S和FMV35S启动子和从植物基因(例如ssRUBISCO基因)中分离的启动子。如下所述，优选的是所选具体启 动子应当能引起足够表达，导致产生有效量的目标基因产物。 
如有必要，可修饰本发明DNA构建体(例如嵌合/重组植物基因)中所用的启动子，以影响其控制特性。可通过与操纵子区连接、随机或控制诱变等方式来衍生启动子。此外，可改变启动子，使其含有多个“增强子序列”以便提高基因表达。 
本发明DNA构建体所产生的mRNA也可含有5′非翻译前导序列。该序列可衍生自选择用于表达基因的启动子，并可经过特异性修饰以增加mRNA的翻译。5′非翻译区也可得自病毒RNA、合适的真核基因或合成基因序列。这样的“增强子”序列有望提高或改变所得mRNA的翻译效率。本发明不限于这样的构建体：其中非翻译区得自启动子序列所伴随的5′非翻译序列。相反，非翻译前导序列可得自无关启动子或基因(参见例如美国专利5,362,865)。用于增强表达或影响基因转录或翻译的其它遗传组件也视为遗传组件。 
嵌合构建体3′非翻译区应含有转录终止子、或具有等同功能的元件以及在植物中起作用的聚腺苷酸化信号，以使聚腺苷酸化核苷酸添加到RNA的3′端。合适3′区的实例是(1)含有土壤杆菌根瘤诱导(Ti)质粒基因(例如胭脂碱合酶(NOS)基因)聚腺苷酸化信号的3′转录、非翻译区，和(2)植物基因例如大豆贮存蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)基因。优选的3′区的实例来自豌豆的ssRUBISCO E9基因(欧洲专利申请0385 962)。 
通常，位于聚腺苷酸化位点下游几百个碱基对的DNA序列的作用是终止转录。该DNA序列在本文中称为转录终止区。该区是转录信使RNA(mRNA)的有效聚腺苷酸化所必需的，称为3′非翻译区。RNA聚合酶通过聚腺苷酸化发生位点转录编码DNA序列。 
在一个实施方案中，T-DNA不包括可选择、可筛选或可记录的标记基因。或者，待转移的DNA可含有可选择、可筛选或可记录的标记基因，尽管在本发明的某些实施方案中，仅仅为了在再生发生后标记的存在而选择或筛选植物组织。这些遗传组件在本文中也称为功 能性遗传组件，因为它们产生在转化植物鉴定中起作用的产物或具有农艺学用途的产物。利用选择组分的DNA在可再生植物组织(尤其是已再生组织)中起作用，以产生赋予植物组织抵抗别的毒性化合物的化合物。用作可选择、可筛选或可记录标记的目标基因包括但不限于编码GUS的uidA、编码绿色荧光蛋白(GFP)的gfp、花色素苷生物合成相关基因(C1，B-peru)、萤光素酶(LUX)基因和赋予例如卡那霉素等抗生素抗性的基因(Dekeyser等，1989)和赋予例如草甘膦等除草剂抗性的基因(Della-Cioppa等，1987)。其它选择方法也可采用，包括但不限于草胺膦(phosphinothricin)耐受性、双丙氨膦耐受性和阳性选择机制，它们也都落入本发明的范围之内。 
本发明可以与任何合适的植物转化质粒或载体一起使用，所述质粒或载体含有可选择或可筛选标记和所述相关调节元件，以及一个或多个核酸，其表达方式足以赋予特定性状。本发明所包括的合适的具有农艺学价值的结构基因的实例包括但不限于昆虫或病虫害耐受性基因、除草剂耐受性基因、品质改良基因(例如产量、营养增强、环境或胁迫的耐受性)、或者在植物生理、生长、发育、形态或植物产物方面的任何所需改变的基因。 
或者，DNA编码序列可通过编码非翻译RNA分子而影响这些表型，其可导致对内源基因表达的定向抑制，例如通过反义或共抑制介导的机制(参见例如Bird等，1991)。RNA也可以是催化性RNA分子(例如核酶)，所述分子经改造可切割所需内源mRNA产物(参见例如Gibson和Shillitoe，1997)。更具体地讲，有关基因表达在植物细胞中的反义调节的描述，可参见美国专利5,107,065；有关植物中通过dsRNA转录所致的基因抑制的描述，可参见美国专利6,506,559、美国专利申请公布说明书号2002/0168707 A1和美国专利申请顺序号09/423,143(参见WO 98/53083)、09/127,735(参见WO 99/53050)和09/084,942(参见WO 99/61631)，所有这些文献都通过引用结合到本文中。因此，能产生表达目标表型或形态变化的蛋白质或mRNA的任何 基因都可用于本发明的实践。 
可通过本发明方法引入的示例性核酸包括例如来自另一物种的DNA序列或基因，或者甚至是原来存在于相同物种、但通过遗传工程方法(而非传统繁殖或育种技术)掺入到受体细胞的基因或序列。然而，术语外源也指在所转化的细胞中通常不存在的基因，或者仅在转化DNA区段或基因的某种形式、结构等中不存在的基因，或者是当人们需要时(例如过量表达)正常存在的基因。因此，术语“外源”基因或DNA是指引入受体细胞的任何基因或DNA区段，无论类似基因在所述细胞中是否已经存在。外源DNA所包括的DNA类型可包括植物细胞中已经存在的DNA、来自另一植物的DNA、来自不同生物体的DNA或外部产生的DNA(例如含基因的反义信息的DNA序列)或编码基因的合成或修饰形式的DNA序列。 
将DNA引入细胞的技术是本领域技术人员众所周知的，可分为包括但不限于下列类型：(1)化学方法；(2)物理方法，例如显微注射、电穿孔和微弹轰击；(3)病毒载体；(4)受体介导机制；和(5)根瘤菌介导(例如土壤杆菌介导)的植物转化方法(例如Broothaerts等，2005)。 
对于土壤杆菌介导的转化，在构建植物转化载体或构建体之后，将体外制备成DNA组分的所述核酸分子引入合适的宿主(例如大肠杆菌(E.coli))中并与另一合适宿主(例如土壤杆菌)交配，或直接转化到感受态土壤杆菌。这些技术是本领域技术人员众所周知的，已经描述了用于包括以下许多植物系统在内的所述技术：大豆、棉花和小麦(参见例如美国专利号5,569,834和5,159,135和WO 97/48814，通过引用全部结合到本文中)。 
本发明包括用细菌菌株将一个或多个遗传组件引入植物中。本领域技术人员将会知道土壤杆菌介导的转化方法在这类过程中的应用。携带Ti质粒或Ri质粒的根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的许多野生型菌株和解武装菌株(disarmed strain)可用于将基因传递给植物。优选的土壤杆菌宿主分别含有解武装Ti质粒和Ri 质粒(其不含引起根瘤或发根的癌基因)，所述质粒用作载体并含有随后引入植物的目标基因。优选的菌株可包括但不限于来自C58菌株的根癌土壤杆菌，胭脂碱型菌株(可用于介导将DNA传递给植物细胞)、章鱼碱型菌株(例如LBA4404)或琥珀碱型菌株(例如EHA101或EHA105)。可以修饰与植物具有天然相互作用的其它细菌(例如中华根瘤菌、根瘤菌和中间根瘤菌)以介导将基因传递给各种不同植物。可以使这些植物相关的共生菌成为感受态，用于通过同时得到解武装Ti质粒和合适双元载体而进行基因传递(Broothaerts等，2005)。这些菌株在植物转化中的应用已有报道，这些方法是本领域技术人员熟知的。 
外植体可来自单一基因型或来自基因型组合。任何可发芽的玉米种子都是有活力的原料。在一个优选的实施方案中，来自植物杂种的优良外植体可用作外植体。例如，可用含有几种基因型的杂种胚产生具有高培养响应(更高频率的胚性愈伤组织形成、生长率、植物再生率等)的快速生长的细胞系。在一个实施方案中，杂交育种的F1杂种或第一代后代可用作供体植物并与另一基因型杂交。本领域技术人员知道，当两个近交系杂交时会产生杂种优势(在本文中也称为“杂种活力”)。因此，本发明包括使用来自三系杂交的外植体，其中至少一个或更多近交系是高度可再生和可转化的，而且三系杂交外植体的转化和再生频率超过近交系各自的频率。其它组织也可用于本发明的实践。外植体可包括成熟胚、未成熟胚、分生组织、愈伤组织或可转化和可再生的任何其它组织。 
在转化过程中任何合适的植物培养基都可能使用。这些培养基的实例可包括但不限于Murashige和Skoog(1962)，N6(Chu等，1975)；Linsmaier和Skoog(1965)；Uchimiya和Murashige(1962)；Gamborg氏培养基(1968)，D培养基(Duncan等，1985)，McCown氏Woody植物培养基(McCown和Lloyd，1981)，Nitsch和Nitsch(1969)，以及Schenk和Hildebrandt(1972)或这些补充培养基的衍生物，以及以下描述的多种培养基。本领域技术人员知道，可以针对具体的目标变种来优化培 养基和培养基补充物(例如用于转化和再生的营养物和生长调节剂)和其它培养条件(例如培养时的光强度、pH和培养温度)。 
在包含苗、或者包含苗和根的小植株再生出来之后，可对小植株或小植株部分施用选择剂，例如如果选择标记基因与GOI一起转化到原始靶植物细胞中的话，或者如果GOI本身就编码选择标记的话。因此，当通过本发明方法产生植物后，可根据本发明将选择剂施用于所述植物，以便测定或鉴定显示有用特性的转化植物。 
本发明也包括有效处理再生植株的方法，所述方法允许鉴定含有GOI的转化植物。这些方法简化并理顺了再生和培育推定转化植物群体的过程，节省了过程所需的时间、空间和费用，并使该方法成为商业上可行的方法。 
在一个实施方案中，将植物靶组织(例如未成熟玉米胚(IE))与包含GOI的土壤杆菌菌株在23℃共培养例如1-3天，然后在相同的共培养培养基或愈伤组织增殖培养基上，在30℃继续再培养～7-10天。观察胚，以便鉴定哪些胚“有反应”，即产生可再生而形成小植株的胚性愈伤组织。然后，将具有愈伤组织的有反应的胚(通常是盾片愈伤组织)从共培养物中移入第一预再生培养基或第一再生培养基中，用合适的温度、光照和营养的培养条件，让愈伤组织进一步生长、分化和再生。可将愈伤组织放入半固体再生培养基中或放在其上。或者，可将它们放在接触液体再生培养基的支持物(例如培养板中的垫子(felt)和/或滤纸)上，使愈伤组织可以生长和分化。 
如有需要，可以培养接种的胚，例如在30℃暗培养1-2周，包括移至新鲜营养培养基。在暗培养后，培养物可在再生培养基中在光照黑暗交替周期中生长，例如在16/8光照/黑暗周期下生长1-3周，在约27℃，光强度为约100μE，或根据所研究的植物种或变种的合适条件和植物组织培养领域技术人员的知识。通常，在开始共培养的1-3周内植物开始再生，尤其是当存在生长的愈伤组织阶段(callus phase ofgrowth)时。该方法也可包括预再生步骤，其包括使用含有比愈伤组织 增殖培养基中的植物生长素水平更低的基础植物组织培养基。 
在半固体或液体培养基上培养和再生约2-3周后，可将从单个外植体(例如未成熟胚(IE))再生出的植株移入单个生长培养基容器中。一个这样的实例是PHYTATRAY(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，其包含半固体或液体植物组织培养再生培养基并让其生长约4周，然后将所得植株移入生长培养基(例如土壤中的生长穴盆)中以便进行壮苗。因为移栽到土壤中是时间和劳动密集型过程，所以最好在移栽之前筛选各植株，或者甚至在将它们放入PHYTATRAY之前就筛选出存在GOI或其它目标性状的植株。在选择压力不存在时，再生小植株的数量可以比在愈伤组织生长和植物再生期间使用了选择剂的类似实验高出20-50倍。因此，提供了处理大量植物的方法，例如将其从组织培养期移至非无菌条件下生长时。本发明的再一个实施方案是在非无菌条件下使用园艺穴盆或分离的培养管或盘，以允许小植株生长并进行分析。这些小植株还可以这样培养：无需标记所有单个植株、而是对生长的植株进行适当分组，以便容易找出给定植株及其组织之间的相关性，所述组织经历一种或多种测定或筛选以鉴定含GOI的转化植物。 
在一个实施方案中，可采用基于PCR的筛选，以便在移入生长培养基(包括液体生长培养基，例如在PHYTATRAY中)之前就能排除非转化植物。因此，例如在用细菌菌株转化时如果使用约5000个未成熟玉米胚，则可产生约25,000株植物，需要约5,000个PHYTATRAY。如果达到约10％的转化频率，处于PHYTATRAY生长期的再生植株的初次筛选将得到约2500株推定的转化植物，相当于500个有反应的胚或需要约500个PHYTATRAY，它们可移入土壤中的生长穴盆。筛选方法可包括将来自各个Phytatray或任何其它生长容器(例如穴盆)的再生植株的组织合并起来。设计合并的组织可用于通过分析多个合并组织来鉴定群体的单个成员，而无需单独分析群体的每个成员。一个合并的方法是将来自PHYTATRAY或类似生长容器中的外植体(优选IE)的所有植物分组，并弃去阴性容器，因而极大 地减少了植物处理和检测相关工作量。合并在一起的植株数量还可进一步增加到PCR测定的检出限。 
可处理生长穴盆或将其分组，以提高进一步筛选步骤的效率，而且不需要给每个再生植株做标签。例如可将穴盆分组排列，以对应于测定模式使用的微量滴定板，例如植物生长在96个穴盆组中，对应于96孔板。这可快速准确地建立测定结果与植物(测定组织正是自这些植物分离的)之间的关系。在某些实施方案中，在推定转化再生的无标记植物中检测GOI存在与否的测定可选自基于PCR的测定、DNA印迹杂交、DNA测序、RNA印迹、蛋白质印迹、免疫测定和在与土壤杆菌共培养期间接触靶组织的转基因DNA区段所编码的酶活性测定。在一个具体的实施方案中，测定是基于PCR的测定。在某些实施方案中，基于PCR的测定或其它测定是在自再生植株分离的植物组织上进行的，其中再生植株生长在PHYTATRAY或等同物上，随后才移栽到基于土壤的生长培养基上。 
对于得到无标记转基因植物而言，本发明的方法比其它典型方法更有效，所述其它方法例如土壤杆菌介导的方法，使用一个或多个含GOI的T-DNA和可选择或可筛选标记(图1)。本发明的各实施方案提供的优势包括： 
1.转化构建体较小，简化了克隆过程。 
2.标记基因表达盒的消除释放了标记盒所需的表达元件，减少了因重复元件存在所致的重组稳定性的有关问题。标记盒中重复调节元件的消除也可降低基因沉默的可能性。 
3.R0植物的筛选方法更简化。在现有方法中，必须筛选至少两个元件(GOI和选择标记基因)。在本发明方法中，无需筛选标记。另外，需要筛选GOI阳性植物以判定标记基因插入序列是否与GOI插入序列连锁，并且通常发现连锁，这会干扰对下一代缺乏选择标记的植物的鉴别能力。相反，连锁却并非本发明方法的问题。 
4.也发现在后代中效率提高。对于现有方法(例如2-T转化方法)， 必须筛选一大群F1植物或R1植物才能鉴定GOI阳性的无标记植物。对于通过本发明方法产生的植物，不需要标记基因的分离。 
5.允许更快速选出最好的含GOI事件、而不存在选择标记基因，因而有助于多个GOI的有效堆积，例如当选择标记基因编码目标农艺学性状时。 
本发明提供有效产生无标记转基因植物的方法，通常当原始靶外植体接触外源核酸后7-10周内，能够在基于土壤的培养基上生长。本发明的高通量方法允许开发有效的无选择转化系统。具体地讲，处理再生组织和再生植株的简化允许许多步骤的机械化并能节省时间、金钱和人机工程总费用。在每次转化实验中，本系统使用约100个胚，就可产生约4-6个可用的无标记转化事件(即单拷贝事件和无载体骨架事件)，因此加快了转化植物产物的流程。 
实施例
下列实施例用于说明本发明的实施方案。本领域技术人员应当知道，下列实施例中公开的技术代表本发明人发现的并在本发明实践中行之有效的技术。然而，根据本说明书，本领域技术人员应当知道，在不偏离本发明的构思、精神和范围的前提下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改动，而仍能得到同样或类似的结果。更具体地讲，应当清楚，某些化学和生理相关的试剂可以替代本文所述的试剂，而仍可达到相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改都视为在本发明的精神、范围和构思之内，如同所附权利要求书所限定的那样。 
实施例1 
无标记转化 
可通过根瘤菌介导的方案进行可再生的未成熟玉米胚的转化，所述方案的一般性描述例如参见Cai等(美国专利申请公布说明书 20040244075)。具体地讲，使用改进的土壤杆菌介导的方法。从玉米穗中选出大小范围为1.9-2.5mm(例如约2.3mm)的未成熟胚并与ABI土壤杆菌菌株C58共培养，以介导DNA向含有目标重组构建体(例如同时含有处于肌动蛋白启动子表达控制之下的GUS和CP4 EPSPS的pMON93040)的植物细胞转移，从而允许对转化细胞和部分(sector)两者进行目测分析，并允许使用WeathermaxTM草甘膦喷洒作为替代品，用于随后的再生后筛选，再进行转化植物的基于PCR的筛选的证实试验。也可使用较大的胚(例如大小为约2.5mm或最多至约3.2mm)，而且最好是通过在组织培养的预再生和再生期之前减少愈伤组织增殖而使每个胚产生很少植株。以下所用培养基组成见下表1。用土壤杆菌接种后，将胚移至Lynx 1947或Lynx 1898，在23℃共培养1-3天，然后在30℃在相同平板或愈伤组织增殖培养基(例如Lynx 1316)上培养7-14天，最后在预再生培养基(Lynx 1844；2232；2197)或再生培养基(Lynx 1344、2282、2379等)上培养。用下列两种方法进行植物的最后培育：1)将来自每个胚源性愈伤组织的植株移至含Lynx 1607的PhytatrayTM上或2)将来自每个胚源性愈伤组织的植株移至含液体Lynx 2168的PhytatrayTM上。让植株在PhytatrayTM中生长约4周，然后移至穴盆(Q Plugs，产自International Horticultural Technologies，Hollister，CA)。在将植株移栽到穴盆前1周，当植株仍在PhytatrayTM中时，自植株上采样并进行测定，以去除掉无GOI的植株。塞植后(post-plugging)大约10天，自各植株采样，进行DNA印迹分析，鉴定GOI阳性植株并保留它们，使其进一步生长发育。 
实施例2 
在愈伤组织增殖期间无选择压力下转基因部分(sector)的有效开发 
开发了用于在选择剂不存在时转基因植物有效再生的系统。外植体与土壤杆菌共培养(4天，在Lynx 1898培养基(表1)上)后，愈伤组织增殖在Lynx 1316(表1)进行10-14天，无选择。然后，愈伤组织在Lynx 1844培养基(表1)预再生10天，接着在Lynx 1344(表1)上再生10天，最后在Lynx 1471上再生3周(表1)。除了在Lynx 1471上培养之外，所有步骤都未使用选择剂；因此在共培养后4周在无选择剂下，发生愈伤组织的生长并再生出植株。最后一步在Lynx 1471上再生植株的生长是在低水平草甘膦(0.02mM，体积比)存在下进行至估计最大可能的转化频率。将组织移至Lynx 1471培养基之前，在转化后4周，将24个独立的来自胚的愈伤组织和相关组织染色以测定GUS活性。鉴定出4个GUS阳性苗，由此证明～16％转化效率。 
将组织移至Phytatray中的Lynx 1471，让植株进一步生长，共再生出43个转基因事件，它们全都存活至移栽土壤。转化和拷贝数分析见下表2。共有约14％的存活植株逃逸，但约45％的植株转化了1-2个插入序列。转化后5周，代表性再生愈伤组织系的组织化学分析见图2。 
表2.仅在植物再生最后步骤期间用有选择的有效转化表明形成了无选择的有效转化部分。 
实验 外植体 数量 移入土壤 数量(存活) 0-拷贝 1-拷贝 2-拷贝 ＞2拷贝 1拷贝和 oriV(-) 2拷贝和 oriV(-)
6678 200 43(21.5％) 6(14％) 12(28％) 7(16％) 8(19％) 9(21％) 4(9％)
实施例3 
额外的玉米转化和再生实验，对推定转化植物的筛选 
又进行了3项研究以证实在任何时期都不用选择时转基因部分的有效再生是常规可行的。所用质粒是如上所述的pMON93040。在Lynx 1898上共培养1天后，在Lynx 1316上进行愈伤组织增殖达10天，在Lynx 1844上预再生10天，然后在Lynx 1344上再生3天，接着在Lynx 1607上生长。用单个玉米穗分离胚，用于每次实验，所述胚的大小范围为2.8-3.2mm。在两项研究中，进行胚的接种，直接将分离胚接种到土壤杆菌悬液(在O.D.660＝1.0时)中，而在其它研究中，胚初次分离到下列成分的1ml液体Lynx 1013培养基(1升)中，接着用O.D.660＝1.0的土壤杆菌悬液进行接种：MS基础盐(Phytotech)：2.165g；MS维生素(100X；Phytotech)：10ml；蔗糖(Phytotech)：68.5g；脯氨酸(Fisher)：0.115g.；葡萄糖(Phytotech)36g，用KOH将培养基调节至pH5.4，然后过滤除菌。研究结果见下表3。 
表3.额外的玉米无选择转化。 
在再生周期结束时，将每次实验的植株移栽到穴盆中，超过95％的植株移栽成活，证明繁殖穴盆提供了处理大量植株的改良方式。移栽后约10天，用组织化学染色，对每棵植株叶片打孔测定GUS活性，再移栽GUS阳性植株，用于进一步生长和组织化学分析。为了进一步证明转化频率并提高方案的总效率，开发出一种基于PCR筛选的替代方法，其中将1％WeatherMaxTM(草甘膦)施用于GUS阴性植株。鉴定出另外5株耐草甘膦植株(从实验6700-2鉴定出3株，从实验6698-2和实验6688-2中分别鉴定出1株(参见图3的代表性植株)。共37株植物得自穴盆中的723株植物，每株植物的收率估计为5％的成功率 (表3)。用未成熟胚的无选择转化的结果表明，该方法是有效的，基于所筛选的植株数量计算具有平均为5％的转化频率。 
为了进一步证明无选择转化方案的重现性并提高方案的总效率，开发出一种基于PCR筛选的替代方法，其中在PHYTATRAY中的无选择再生周期结束以后施用1％WeatherMaxTM(草甘膦)。结果见下表4和表5。 
表4.有效并可重现的玉米无选择转化 
  实验   接种胚的   数量   IE大小   筛选  phytas   数量   估计植株   数量   cp4+事   件数量   事件数量/100  株植物   (估计)
  6705-1   130   2.8-3.2   19   380   9   2.4
  6705-2   140   2.8-3.2   13   260   7   2.7
  6706-3   110   1.8-2.0   22   440   35   8
  6829-1   100   2.8-3.0   28   560   27   4.8
  6829-2   100   2.8-3.0   30   600   43   7.2
  6829-3   80   2.8-3.2   10   200   11   5.5
  6829-4   80   2.8-3.2   9   180   3   1.7
  6829-5   80   2.8-3.2   8   160   4   2.5
  6829-6   80   2.8-3.2   7   140   2   1.4
    900     146   2920   141   4.8
表5.具有较低拷贝插入序列的事件从无选择转化中有效恢复。 
  实验   接种胚的数量   穴盆中存活的事件数量  总计(1-2个拷贝)
  6705-1   130   9  7(77.7％)
  6705-2   140   7  2(28.6％)
  6706-3   110   35  29(82.9％)
  6829-1   100   27  18(66.7％)
  6829-2   100   43  30(69.8％)
  6829-3   80   11  8(72.2％)
  6829-4   80   3   2(66.7％)
  6829-5   80   4   3(75.0％)
  6829-6   80   2   1(50.0％)
  总计   900   141   100(70.9％)
结果表明，在总共900个胚中，产生了141株耐草甘膦植株，包括具有较低目标基因拷贝数(1-2个拷贝)的100株，即基于所接种的未成熟胚的数量计算具有平均为约15％TF。 
进一步筛选(表6)表明，在通过表5所示的100个低拷贝数事件的DNA印迹分析筛选出的90个事件中，存在79个独立整合事件。姊妹事件是具有相同条带模式并来自同一外植体的事件。更高转化频率导致具有姊妹事件的转基因事件的更高百分率。然而，其频率非常低，而且DNA印迹分析揭示～5％表现出克隆性(clonality)，尤其是当TF＞30％时(表5和6)。 
表6.无选择转化效率-所产生的独立整合事件的数量。 
  实验   通过DNA印迹分析的事件数量   (1和2个拷贝)   姊妹事件数量
  6705-1   1   0
  6705-2   7   0
  6706-3   25   3
  6829-1   16   1
  6829-2   27   1
  6829-3   8   0
  6829-4   2   0
  6829-5   3   0
  6829-6   1   0
  总计   90   5
实施例4 
证实在无选择压力下转化和再生后，转移DNA的染色体整合 
使用例如Dellaporta(1983)所述方法，从R0植物叶片中分离基因组DNA。基因组DNA(20-30μg)用HindIII消化，在0.7％(重量/体积)琼脂糖凝胶上进行分离，再转移到带正电荷的尼龙膜(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)上。用非放射性的基于DIG的系统(Roche Molecular Biochemicals)，按照制造商的方案，进行膜的预杂交、杂交、洗涤和检测。CP4基因的DNA序列经PCR标记，以产生探针。HindIII酶在载体中切割一次(靠近CP4表达盒的5’端)，因此，DNA印迹条带数对应于CP4基因拷贝数。在所选植株上进行DNA印迹分析，见表3(即选择22个较低拷贝事件)。R0植物的代表性DNA印迹分析数据见图4。分析表明，从320个胚产生的共37个事件中产生了8个(单拷贝，oriV阴性)事件(表3)。为了进一步证实种系继代传递，将R0植物与亲本非转化近交玉米系杂交。在该项研究中，使用来自3种独立品系的R1植物；ZM_187694(4拷贝-cp4)；ZM_189983(0拷贝，cp-4-可能的cp4截短事件)；ZM_187738(3拷贝-cp4)。对发育中的穗的gus表达进行组织化学分析表明，阳性玉米粒与未表达玉米粒的比例为1∶1，表明转基因和连锁的种系传递(图5)。该结果证实用无选择产生的转基因事件的转基因种系传递。用CP4基因作为探针，也通过DNA印迹分析对3个额外独立事件ZM_187692、ZM_18997和ZM_18998的后代进行了分析(图6)，表明从这3种不同R0植物获得的所有后代都表现出预期模式，即转基因事件向下一代稳定传递。 
实施例5 
有效的植物处理 
有效处理多个植株的方法是在获得再生植株前不用选择剂的有效植物转化系统的一个重要组成部分。这是因为需要筛选大量植物，以鉴定具有合适的插入序列拷贝数和复杂性、以及GOI表达的转化植物。该“处理”(例如转移或移栽到培养基或土壤中以便进一步生长；和在筛选步骤期间保留识别标记)允许在一个放有独立穴盆或培养管 的容器内处理多个小植株，同时保留植株各自的识别标记，而且还有利于在无单个植物标签时进行数据采集。在“园艺穴盆”中培育植物、省略对每株植物分别做标签并开发用于采集测定数据的方案以鉴定和向前推动所需事件，这一系列工作加快了基于在基因转移和再生期间无选择的转化流程。总之，本发明涉及有效的植物无选择转化系统、植物处理和数据采集的开发。 
将从与含有目标基因的土壤杆菌菌株共培养的愈伤组织再生出的推定转化植株，从例如PhytatrayTM移栽到生长穴盆的土壤中。使用这些穴盆使植物的采样和分析更流畅并能节省生长空间。例如，将穴盆安排的模式对应于例如96孔微量滴定板的各孔(例如图7)，如果植物样品的测定在这样的微量滴定板中进行时。这允许方便地鉴定出具有目标测定表型的植物，而无需给每个植株单独做标签。 
通过基于PCR或其它分子筛选，完成不含GOI植株的早期排除，当植株在PHYTATRAY的半固体或液体培养基中再生时，然后再将植株移栽到生长穴盆或土壤。 
实施例6 
在转化植物再生期间用于培养的半固体培养基 
用于在转化和组织培养过程中愈伤组织生长、预再生和再生期间的培养用半固体培养基允许有效的组织操作。图8归纳了无选择剂时进行的转化研究(下图)，与在选择剂存在下培养植物组织的平行研究(上图)进行比较。参见表1和表7的培养基成分。愈伤组织增殖、预再生和再生期均在所示的半固体培养基中进行。在第二再生期后，将植株移栽到生长穴盆中，测定GOI的存在。 
表7.在现有方法中使用的含有半固体含草甘膦选择培养基的培养基组成(Cai等；美国专利申请公布说明书2004/00244075)。 
*含有1250mg/L烟酸(Sigma)，250mg/L盐酸吡哆醇(Sigma)，250mg/L盐酸硫胺素(Sigma)和250mg/L泛酸钙(Sigma)。 
实施例7 
转化植物再生期间的液体培养。 
在转化和组织培养过程中愈伤组织生长、预再生和再生期间的液体培养允许有效的组织操作。图9表明在再生前无选择剂时进行的转化和再生研究。愈伤组织增殖、预再生和再生期在所示的液体无草甘膦培养基中进行。在第二再生期(其也可在半固体培养基上发生)后，将植株移栽到生长穴盆中。GUS组织化学测定可以与基于PCR或其它筛选方法(例如用草甘膦的替代筛选)联用，以检测在再生植株组织中例如草甘膦耐受性的表达。用无标记基因的载体(即pMON97372)或有标记基因的载体(pMON93040)进行了这些实验。 
图9所示的用于研究的质粒是含cp4和gus基因的pMON93040。将来自各穗的胚分离到装有1ml液体Lynx 1013培养基的培养皿中，并在Lynx 1947上共培养。如下表8所示，将胚分为不同处理组，包括有选择8周(处理1)；无选择8周，液体培养，在PHYTATRAY中的固体培养基上生长(处理2)；和无选择8周，液体培养，在PHYTATRAY中的液体培养基上生长(处理3)。与用有选择获得的转化相比，用无选择的转化非常有效(～1/3X)。“液体穴盆”方法的结果归纳于下表8。当小的外植体样品仅用液体培养(即处理#3，，用Lynx2168作为最终生长培养基)培养时，效率更高，几乎与有选择所得到的一样高。如下表9所示，液体培养看来能促进转基因事件更有效再生。可能是不用继代培养，就可降低胁迫并加快植物再生。 
表8.用“液体穴盆方案”和无需使用选择的有效转化。 
表9.转化效率与再生效率的关系。 
实施例8 
转化效率与愈伤组织增殖期间持续时间的关系 
愈伤组织增殖期间持续时间对转化频率的作用见下表10。缩短愈伤组织期间的时间可提高TF，更快产生植物。 
表10.更长的愈伤组织增殖期对无选择转化的不利影响。 
  实验#   处理   IE大小   选择   数量   具有事件   的IE数量   ％TF
  7533-1   有选择-8周   液体培养   2.5-2.8   30   7   23.3
  7533-2   无选择-8周   (2周在Lynx 2133上)   2.5-2.8   104   8   7.7
  7533-3   无选择-8周   (1周在Lynx 2133上)   2.5-2.8   97   19   19.6
实施例9 
用无选择快速液体培养进行转化和再生 
为了进一步使过程更流畅，开发了长达6周的快速液体循环(RLC)方案，其中省略愈伤组织增殖步骤(Lynx 2133)。转化方案的步骤包括：预再生(Lynx 2197)和再生期(Lynx 2168和Lynx 1607，例如图9和表11)。含有Cp4和gus基因的pMON93040用于该项研究。将来自各穗的胚分离到装有液体培养基(Lynx 1013)的培养皿中，在Lynx 1947培养基上共培养，然后如下表11所示分为处理组。处理包括比较有选择或无选择的胚的TF，并比较在Lynx 2197增殖培养基上1周或2周的效果。如表11所示，缩短在Lynx 2197增殖培养基上的持续时间确实会影响TF。然而，当采用在预再生培养基上生长的最佳持续时间时，无选择转化所得到的TF与有选择所得到的TF类似。 
表11.用无选择的快速液体培养方案进行有效转化。 
在这些实验中，进一步缩短愈伤组织增殖、预再生和再生期的持续时间，并将使用选择与在非选择性培养基上生长进行比较。减少所需组织处理步骤进一步使该方法适合于自动化(另见下表15)。 
对如上所述获得的所选植物的表达水平进行比较，表明按照针对pinII 3’转录终止信号的基于PCR的测定得到类似表达水平(表12)。 
表12.对按照转基因拷贝数分类的植物进行表达分析。 
无选择的快速液体培养方案的总时间安排见下表13。 
表13.无选择的快速液体培养方案。 
  天数   培养基#   培养条件
  第0天   Lynx 1947   1天在23℃，黑暗；6天在30℃，黑暗
  第1周   Lynx 2197/2379/2282   30℃，黑暗
  第2周   Lynx 2168   30℃，黑暗
  第3周   Lynx 2168   27-28℃，光照
  第4周   Lynx 2168   27-28℃，光照
  第5周   Lynx 1607   将外植体移至PHYTATRAY
  ～第8周   移栽   壮苗
  移栽后10天   样品   用于草甘膦耐受性或用于GUS测定或   用于GOI的PCT测定
  移栽后20天   推进   确定事件数量并推进阳性事件
为了证实以上基于表13所述方案所得结果，用pMON93040转化，进行了3项实验。如下表14所示将胚分为不同处理组。在这些实验中，GUS测定在小植株上进行；不喷洒草甘膦。来自各穗的胚分离到装有1ml液体Lynx 1013培养基的培养皿中，并在Lynx 1947上共培养。如结果所示，与用有选择所得到的转化相比，用无选择的转化非常有效(＞60％)。 
表14.快速转化方案对有选择和无选择都有效。 
为了更好地理解细胞增殖的特性及其对无选择转化的影响，用两种不同的共培养培养基(含0.5mg/l 2，4-D的Lynx 1947和含0.2mg/l2，4-D的Lynx 2232)进行额外实验。将来自每种共培养培养基的胚平分为2组，移入预再生培养基(含0.2mg/l 2，4-D-Lynx 2197)或再生培养基(不含任何生长调节剂-Lynx 2282)中。用仅含uidA基因的少标记的转化载体(pMON97372)进行5次实验(8415-8419)。实验方法的概述见图9。植株在穴盆中定植后，将来自每个胚衍生品系的植物汇集在一起，染色测定GUS，以鉴定阳性品系。然后，对阳性克隆的每个品系进行进一步GUS染色，以鉴定GUS阳性事件。将每个穗的约1/5的胚分别与对照uidA+cp4载体(pMON97367)一起接种，然后按照RLC方案(例如表13)来比较有选择和无选择的转化结果(实验8420)。这些实验结果归纳于下表15和16。 
表15.用gus载体(pMON 97372)的有效的无选择转化。 
表16.用有选择的转化实验(pMON97367)，表明无选择转化是有效的。 
如表15所示，发现含2，4-D浓度比Lynx 2232更高的共培养培养基Lynx 1947更好。这些结果表明再生前细胞增殖有利于得到有效的无选择转化。此外，外植体在无生长调节剂的培养基(例如Lynx 2282)上再生、然后共培养并不会明显减少植物/胚数量。将采用RLC方案、用pMON97367转化的胚的转化频率进行比较，表明无选择转化是有效的。此外，拷贝数分析表明更高百分率的植物具有更低拷贝的插入 序列(表17)。 
表17：无选择转化产生更高％的单拷贝oriV阴性事件。 
    所测定的植株总数     ％单拷贝事件，缺乏oriV
    122     66(55％)
认为缺乏选择和/或更短的T-DNA可能是产生更高％可用事件的原因。对于无选择处理，优选胚的大小范围比RLC所用的胚大小范围(1.9-2.1mm)稍微大一些(2.0-2.3mm)。通过DNA印迹杂交而验证的～120个事件(表17)表明，所有事件都是独立的。这进一步强调在更早的发现：在低TF(～15％)下得到的大多数事件都是独立事件，表明在移栽生长穴盆前采用汇集策略，可进一步提高方案的效率。 
实施例10 
在移栽穴盆之前筛选植物，以排除非转基因植物，提高效率 
来自含最终生长培养基(Lynx 1607)的单个容器的植物汇集在一起，用组织化学GUS测定来检测gus并用PCR检测转基因的存在。GUS与PCR测定间有100％相关性。该研究允许排除无阳性事件的生长容器，因此极大降低了植物处理的负担并提高通量。 
*    *    *    *    *    * 
按照本说明书，无需过度实验就可制备和实施本文所公开和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管在优选的实施方案中已经描述了本发明的组合物和方法，但是本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的构思、精神和范围的前提下，可以对本文所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤顺序进行改动。更具体地讲，显而易见的是某些化学和生理相关的试剂可以替代本文所述的试剂，而仍可达到相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的所有这些类似 的替代和修改都视为在本发明的精神、范围和构思之内，如同所附权利要求书所限定的那样。 
参考文献 
下列参考文献通过引用结合到本文中，其程度是它们补充、解释、提供背景、或教导本文所用的方法、技术和/或组合物。 
美国专利5,362,865 
美国专利5,106,739 
美国专利5,107,065 
美国专利5,159,135 
美国专利5,569,834 
美国专利6,506,559 
美国专利申请顺序号09/423,143 
美国专利公布说明书2002/0168707 A1 
美国专利公布说明书20040244075 
美国专利公布说明书2005/0097641 
Bird等，Biotech Gen.Engin.Rev.，9：207-227，1991. 
Broothaerts等，Nature，433(7026)：583-584，2005. 
Chu等，Scientia Sinica，18：659，1975. 
Darbani等，Biotechnol.J.，2：83-90，2007. 
De Vetten等，Nat.Biotechnol.，21：439-442，2003. 
Dekeyser等，Plant Physiol.，90：217-223，1989. 
Della-Cioppa等，Bio/Technology，5：579-584，1987. 
Dellaporta Plant Mol.Biol.Rep.1：19-21，1983. 
Duncan等，Planta，165：322-332，1985. 
欧洲专利申请0385 962 
Francis和Spiker，Plant J.，41：464-471，2005. 
Gamborg等，Exp.Cell Res.，50：151，1968. 
Gibson和Shillitoe，Mol.Biotech.，7：125-137，1997. 
Goldsbrough，Methods for avoidance and removal of selectablemarker genes in crop transformation systems(避免和去除作物转化系统中的选择标记基因的方法) 
[www.defra.gov.uk/environment/acre/uti/08.htm]，2001. 
Huang等，Transgenic Res.13：451-61，2004. 
Linsmaier和Skoog，Physiol.Plant.，18：100，1965. 
McCown和Lloyd，HortScience，16：453，1981. 
Murashige和Skoog，Physiol.Plant，15：473-497，1962. 
Nitsch和Nitsch，Science，163：85-87，1969. 
PCT申请WO 09/084,942 
PCT申请WO 09/127,735 
PCT申请WO 2004/081184 
PCT申请WO 97/48814 
PCT申请WO 98/53083 
PCT申请WO 99/53050 
PCT申请WO 99/61631 
Schenk和Hildebrandt，Can.J.Bot.，50：199-204，1972. 
Uchimiya和Murashige，Plant Physiol.15：473，1962. 
Yoo等，Planta，221：523-530，2005. 

Claims (22)

1.一种鉴定转基因玉米植物的方法，所述方法包括： 
(a)获得用含有目标核酸序列的DNA区段转化的胚性愈伤组织玉米植物细胞； 
(b)从所述细胞再生出多个玉米植物或分化的玉米植物部分，在获得再生玉米植物之前不经过测定所述DNA区段存在的初次筛选或不需要利用可筛选标记基因的存在，其中再生的玉米植物或分化的玉米植物部分就所述DNA区段的存在而言是一致的；且 
(c)从多个再生的玉米植物或分化的玉米植物部分中鉴定出至少第一转基因玉米植物或转基因分化植物部分。 
2.权利要求1的方法，其中所述DNA区段不包含选择标记或目测标记基因。 
3.权利要求1的方法，其中所述植物在固体培养基、液体培养基或者固体与液体培养基组合上生长而得以再生。 
4.权利要求3的方法，其中所述植物通过仅在液体培养基上生长而得以再生，然后鉴定所述转基因玉米植物或转基因分化植物部分。 
5.权利要求4的方法，其中将细胞与目标基因接触之后、鉴定转基因植物或转基因植物部分之前仅生长在液体培养基中的细胞的转化频率，与将细胞与目标基因接触之后、鉴定转基因植物或转基因植物部分之前在固体培养基、半固体培养基、土壤或者固体培养基、半固体培养基、液体培养基和/或土壤的组合中生长的细胞的转化频率进行比较，前者相对更高。 
6.权利要求1的方法，其中所述玉米植物细胞是未成熟玉米胚细胞。 
7.权利要求6的方法，其中所述未成熟玉米胚的长度为1.5mm至3.5mm。 
8.权利要求7的方法，其中所述未成熟玉米胚的长度为1.9mm 至2.3mm。 
9.权利要求1的方法，所述方法在步骤(b)与(c)之间还包括： 
(1)将多个玉米植物或分化的玉米植物部分放入包含生长培养基或水的培养管或生长穴盆中，同时保留玉米植物各自的识别标记；和 
(2)让所述玉米植物或分化的玉米植物部分经历至少第一测定，看所述DNA区段是否存在，从而根据所述测定结果来鉴定一个或多个植物或植物部分是转基因的。 
10.权利要求9的方法，其中所述测定选自DNA印迹杂交、PCR、DNA测序、RNA印迹、蛋白质印迹、免疫测定和所述DNA区段所编码的酶活性测定。 
11.权利要求9的方法，其中所述测定是在将再生的植物移入土壤前进行的。 
12.权利要求10的方法，其中鉴定了缺乏目标核酸序列的推定转化的玉米植物或分化的植物部分，其中在包含来自所述多个玉米植物或分化的植物部分的合并核酸亚类的植物组织上进行所述测定。 
13.权利要求1的方法，其中在所述DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于6周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。 
14.权利要求1的方法，其中在所述DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于4周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。 
15.权利要求1的方法，其中在所述DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于3周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。 
16.权利要求1的方法，其中在所述DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于2周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。 
17.权利要求1的方法，其中在所述DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于1周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。 
18.权利要求1的方法，其中通过细菌介导的转化、电穿孔、PEG介导的转化或粒子轰击法，将所述DNA区段引入所述玉米植物细胞中。 
19.权利要求18的方法，其中所述细菌介导的转化是由选自土壤杆菌(Agrobacterium)细胞、根瘤菌(Rhizobium)细胞、中华根瘤菌(Sinorhizobium)细胞和中间根瘤菌(Mesorhizobium)细胞的细菌细胞介导的。 
20.权利要求1的方法，所述方法还包括在植物或植物部分再生后、使源自玉米植物细胞的第一转基因玉米植物或转基因植物部分经历培养条件的步骤，所述条件选择或允许筛选目标核酸序列的存在与否。 
21.权利要求1的方法，其中多个玉米植物生长在生长培养基上，并且所述生长培养基是固体培养基。 
22.权利要求21的方法，其中所述生长培养基是土壤。 
CN200780039999.9A 2006-08-31 2007-08-31 植物无选择转化 Active CN101528932B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410643281.2A CN104357535B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 植物无选择转化

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84151906P 2006-08-31 2006-08-31
US60/841,519 2006-08-31
PCT/US2007/077370 WO2008028121A1 (en) 2006-08-31 2007-08-31 Plant transformation without selection

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410643281.2A Division CN104357535B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 植物无选择转化

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101528932A CN101528932A (zh) 2009-09-09
CN101528932B true CN101528932B (zh) 2014-12-10

Family

ID=38779916

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007800400731A Active CN101528934B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 生产转基因植物的方法
CN201410460695.1A Active CN104232680B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 快速转化单子叶植物的方法
CN201410643281.2A Active CN104357535B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 植物无选择转化
CN200780039999.9A Active CN101528932B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 植物无选择转化
CN200780040000.2A Active CN101528933B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 快速转化单子叶植物的方法

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007800400731A Active CN101528934B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 生产转基因植物的方法
CN201410460695.1A Active CN104232680B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 快速转化单子叶植物的方法
CN201410643281.2A Active CN104357535B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 植物无选择转化

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780040000.2A Active CN101528933B (zh) 2006-08-31 2007-08-31 快速转化单子叶植物的方法

Country Status (12)

Country Link
US (16) US8581035B2 (zh)
EP (5) EP3269818A1 (zh)
JP (3) JP5242570B2 (zh)
CN (5) CN101528934B (zh)
AT (1) ATE497008T1 (zh)
AU (3) AU2007289111B2 (zh)
BR (4) BRPI0716373B1 (zh)
CA (8) CA2661825C (zh)
DE (1) DE602007012269D1 (zh)
MX (3) MX2009002250A (zh)
WO (3) WO2008028115A2 (zh)
ZA (3) ZA200901140B (zh)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040210958A1 (en) * 2003-03-19 2004-10-21 Monsanto Technology Llc A Novel Culture Method for Corn Transformation
US7682829B2 (en) * 2003-05-30 2010-03-23 Monsanto Technology Llc Methods for corn transformation
JP4525314B2 (ja) * 2004-11-26 2010-08-18 沖電気工業株式会社 光符号分割多重送受信方法及び光符号分割多重送受信装置
US8581035B2 (en) 2006-08-31 2013-11-12 Monsanto Technology Llc Plant transformation without selection
WO2009029852A2 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Monsanto Technology Llc Method and apparatus for substantially isolating plant tissues
JP2011120478A (ja) * 2008-03-31 2011-06-23 Japan Tobacco Inc アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
US8952219B2 (en) 2009-06-25 2015-02-10 Syngenta Participations Ag Methods for Agrobacterium-mediated transformation of sugar cane
KR101876401B1 (ko) * 2009-09-11 2018-08-09 임페리얼 이노베이션스 리미티드 미분화 식물세포로부터 리피 바이오매스를 생산하는 방법
AU2011271024A1 (en) 2010-06-24 2012-09-20 Queensland University Of Technology Methods for Agrobacterium-mediated transformation of sugar cane
EP3275308B1 (en) 2010-12-17 2022-05-11 Monsanto Technology LLC Methods for improving competency of plant cells
US20130091606A1 (en) * 2011-06-24 2013-04-11 Bayer Cropscience Lp Methods and compositions for enhanced Agrobacterium-mediated transformation Efficiency
US11807846B2 (en) * 2012-04-29 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Methods for transforming corn explants
US11713465B2 (en) 2013-11-21 2023-08-01 Monsanto Technology, Llc Methods for transforming wheat explants and compositions therefor
DE102013020605A1 (de) 2013-12-15 2015-06-18 Kws Saat Ag Selektionsmarker-freies rhizobiaceae-vermitteltes verfahren zur herstellung einer transgenen pflanze der gattung triticum
CN103766221B (zh) * 2014-02-10 2016-08-17 中国农业大学 一种单子叶植物的组织培养方法
WO2015134852A1 (en) 2014-03-07 2015-09-11 Pioneer-Bred International, Inc. Methods and systems for extracting monocot embryos
GB2533129A (en) * 2014-12-11 2016-06-15 Alkion Biopharma Sas Bioreactor
WO2016105185A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Keygene N.V. Plant callus populations
CN107683189A (zh) * 2015-06-29 2018-02-09 美国陶氏益农公司 用于自动化的外植体制备的系统及使用方法
JP6716876B2 (ja) * 2015-09-14 2020-07-01 住友ゴム工業株式会社 遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法、及びこの製造方法により作製された、遺伝的に改変された形質転換植物体
CA3001681A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Ajith Anand Methods and compositions for rapid plant transformation
CN105660422B (zh) * 2016-04-20 2017-09-29 遵义医学院 一种白及种苗的组织培养方法
EP3400962A1 (en) 2017-05-09 2018-11-14 Fraunhofer Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Inhibitors of il-38 for use in treating and/or preventing cancer in a subject
US20200087673A1 (en) * 2017-06-02 2020-03-19 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for automated transformation of a plant cell pack
CN110226517B (zh) * 2019-06-26 2021-06-01 北京市农林科学院 一种洋葱离体再生的方法及其使用的培养基
CN110607323A (zh) * 2019-09-24 2019-12-24 四川育良生物科技有限公司 一种农杆菌介导水稻遗传转化方法
AR127146A1 (es) * 2021-09-27 2023-12-20 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para la transformación de explantes de embriones extirpados de semillas de monocotiledóneas
AR127145A1 (es) * 2021-09-27 2023-12-20 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para la transformación de explantes de embriones extirpados de semillas de monocotiledóneas
AR127147A1 (es) * 2021-09-27 2023-12-20 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para la transformación de explantes de embriones extirpados de semillas de monocotiledóneas
WO2023118136A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Improved screening method for genome edited events
WO2023150657A2 (en) * 2022-02-03 2023-08-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Monocot leaf explant preparation

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006127A1 (en) * 1993-08-20 1995-03-02 Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus Method for the production of transgenic cereals
WO1997041228A2 (en) * 1996-05-01 1997-11-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of the green fluorescent protein as a screenable marker for plant transformation
US5767368A (en) * 1995-04-03 1998-06-16 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for producting a cereal plant with foreign DNA
WO1998051806A2 (en) * 1997-05-16 1998-11-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Recovery of transformed plants without selectable markers by nodal culture and enrichment of transgenic sectors
US6420630B1 (en) * 1998-12-01 2002-07-16 Stine Biotechnology Methods for tissue culturing and transforming elite inbreds of Zea mays L.
WO2002102979A2 (en) * 2001-06-15 2002-12-27 UNIVERSITY OF TOLEDO, THE a University instrumentality of the State of Ohio Transformation of mono- and di- cotyledonous plants

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1470850A (en) 1972-12-01 1977-04-21 Allied Chem Moulding poder
US3847888A (en) 1972-12-01 1974-11-12 Allied Chem Ultra-high molecular weight polyethylene molding powder and molding process
WO1983001176A1 (en) 1981-10-01 1983-04-14 Int Plant Research Inst Process for the genetic modification of cereals with transformation vectors
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
US4757011A (en) 1983-09-30 1988-07-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Herbicide resistant tobacco
WO1985001856A1 (en) 1983-11-03 1985-05-09 Johannes Martenis Jacob De Wet Method for the transfer of exogenous genes in plants using pollen as a vector
DE3405185A1 (de) 1984-02-14 1985-08-14 Plüss-Staufer AG, Oftringen, Aargau Verfahren und vorrichtung zur herstellung von kompaktlingen aus polymeren und additiven
JPS61501695A (ja) 1984-03-29 1986-08-14 アメリカン　ヘキスト　コ−ポレイシヨン 改良されたポリエチレン成形組成物およびその製法
NL8401048A (nl) 1984-04-03 1985-11-01 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten.
ATE73845T1 (de) 1984-05-11 1992-04-15 Ciba Geigy Ag Transformation von pflanzenerbgut.
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5177010A (en) * 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
US5004863B2 (en) * 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
ATE126005T1 (de) 1988-04-25 1995-08-15 Monsanto Co Insektenresistente salatpflanzen.
EP0419533A1 (en) 1988-06-01 1991-04-03 THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM Method for transforming plants via the shoot apex
US5990387A (en) * 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
ATE206462T1 (de) 1989-02-24 2001-10-15 Monsanto Technology Llc Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
JP3046063B2 (ja) * 1989-03-17 2000-05-29 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 遺伝子の発現の外部の調節
US5106739A (en) 1989-04-18 1992-04-21 Calgene, Inc. CaMv 355 enhanced mannopine synthase promoter and method for using same
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5225341A (en) 1990-07-19 1993-07-06 The Regents Of The University Of California Biologically safe plant transformation system using a ds transposon
DK0558676T3 (da) * 1990-11-23 2000-09-25 Aventis Cropscience Nv Fremgangsmåde til transformering af enkimbladede planter
US5484620A (en) 1990-12-22 1996-01-16 Schenk-Filterbau Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Method of manufacturing stabilizing and/or filtering aids for use in the processing of liquids, especially beverages
AU662202B2 (en) 1992-02-24 1995-08-24 Montell North America Inc. Polyolefin compositions having good transparency and impact resistance
DE4210351A1 (de) 1992-03-30 1993-10-07 Hoechst Ag Verfahren zum Pelletieren von ultrahochmolekularem Polyethylen
DE4211529A1 (de) 1992-04-06 1993-10-07 Herding Entstaubung Filterelement mit einem formstabilen, durchlässig-porösen Kunststoff-Formkörper
US5591616A (en) * 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
AU670316B2 (en) * 1992-07-27 1996-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of (agrobacterium)-mediated transformation of cultured soybean cells
GB9321557D0 (en) * 1992-11-03 1993-12-08 Zeneca Ltd Carboxamide derivatives
US6326527B1 (en) 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
WO1995006722A1 (fr) 1993-09-03 1995-03-09 Japan Tobacco Inc. Procede permettant de transformer une monocotyledone avec un scutellum d'embryon immature
CA2155570C (en) 1993-12-08 2007-06-26 Toshihiko Komari Method for transforming plant and vector therefor
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
DE19517465C1 (de) * 1995-05-12 1997-01-23 Degussa Percarbonsäurelösungen mit verbesserter Stabilität im Kontakt mit Edelstahl
CA2230216A1 (en) 1996-06-21 1997-12-24 Monsanto Company Methods for the production of stably-transformed, fertile wheat employing agrobacterium-mediated transformation and compositions derived therefrom
JPH10117776A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Tobacco Inc インディカイネの形質転換方法
CN1206435A (zh) * 1996-10-22 1999-01-27 日本烟草产业株式会社 印度水稻的转化方法
US5919999A (en) 1996-11-14 1999-07-06 Queen's University At Kingston Enhanced transport with a plastid membrane transport protein
US6002068A (en) * 1996-12-19 1999-12-14 Novartis Finance Corporation Methods for conferring insect resistance to a monocot using a perioxidase coding sequence
US5981840A (en) * 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
GB9710475D0 (en) 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
US6140555A (en) * 1997-06-06 2000-10-31 Mississippi State University Methods for maize transformation coupled with adventitious regeneration utilizing nodal section explants and mature zygotic embryos
FI104907B (fi) * 1997-09-18 2000-04-28 Univ Helsinki Licensing Rypsin Agrobacterium-välitteinen transformaatio
SG70124A1 (en) 1997-09-26 2000-01-25 Gen Electric Method for making thermoplastic resin pellets
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6043410A (en) 1998-02-06 2000-03-28 Calgene Llc Strawberry fruit promoters for gene expression
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
EP1068311B2 (en) 1998-04-08 2020-12-09 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
JP2000083680A (ja) 1998-07-16 2000-03-28 Nippon Paper Industries Co Ltd 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
CA2344700C (en) 1998-10-01 2005-03-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of plant transformation
US6825397B1 (en) * 1998-11-09 2004-11-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. LEC1 trancriptional activator nucleic acids and methods of use thereof
ATE434049T1 (de) * 1998-11-17 2009-07-15 Monsanto Technology Llc Phosphonat metabolisierende pflanzen
US6846970B1 (en) 1999-07-19 2005-01-25 Plant Bioscience Limited Transformation method and transgenic plants produced thereby
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
EP1111063A1 (en) 1999-12-24 2001-06-27 Coöperatieve Verkoop- en Productievereniging van Aardappelmeel en Derivaten 'AVEBE' B.V. Modified DHPS genes
WO2001064023A1 (en) 2000-03-02 2001-09-07 Auburn University Marker free transgenic plants: engineering the chloroplast genome without the use of antibiotic selection
DE60142470D1 (de) 2000-04-24 2010-08-12 Vertex Pharma Verfahren und zwischenprodukte zur herstellung von substituierten asparaginsäure-acetalen
US6492174B1 (en) * 2000-06-19 2002-12-10 Institute Of Paper Science & Technology Methods of initiating embryogenic cultures in plants
CA2418056C (en) * 2000-08-11 2012-10-16 Syngenta Participations Ag Methods for stable transformation of plants
US6995016B2 (en) 2000-08-17 2006-02-07 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Process for inducing direct somatic embryogenesis in immature scutella cells of pooideae, and rapidly regenerating fertile plants
AUPR143100A0 (en) 2000-11-10 2000-12-07 Bureau Of Sugar Experiment Stations Plant transformation
CN1356389A (zh) * 2000-12-08 2002-07-03 大连理工大学 一种无选择标记的植物转基因方法
US7098383B2 (en) 2000-12-19 2006-08-29 Sembiosys Genetics Inc. Methods for the production of multimeric immunoglobulins, and related compositions
DE10101276A1 (de) 2001-01-12 2002-07-18 Icon Genetics Ag Verfahren und Vektoren zur Transformation von Plastiden
US20030082580A1 (en) * 2001-07-06 2003-05-01 Dna Plant Technology Corporation Plant cell culture and selection system
US20030115641A1 (en) 2001-07-24 2003-06-19 Dobres Michael S. Transformation of plants by electroporation of cultured explants
JP2003047463A (ja) 2001-07-24 2003-02-18 Kumho Petrochem Co Ltd シバ成熟種子由来カルスのための植物体再生方法
EP1279737A1 (en) 2001-07-27 2003-01-29 Coöperatieve Verkoop- en Productievereniging, van Aardappelmeel en Derivaten AVEBE B.A. Transformation method for obtaining marker-free plants
US20030135891A1 (en) 2001-12-04 2003-07-17 The Texas A&M University System Method of transforming intact plants
EP1585384B1 (en) * 2002-02-20 2012-07-11 J.R. Simplot Company Precise breeding
US20030196219A1 (en) 2002-04-16 2003-10-16 Monsanto Technology Llc Novel Method for Agrobacterium Preparation for Plant Transformation
US7429691B2 (en) * 2002-09-03 2008-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for transformation and regeneration of maize
AU2003293407B2 (en) * 2002-12-06 2010-03-04 Del Monte Fresh Produce Company Transgenic pineapple plants with modified carotenoid levels and methods of their production
US20040210961A1 (en) 2003-03-07 2004-10-21 Palys Joseph Michael Markerless transformation
US20040210959A1 (en) * 2003-03-19 2004-10-21 Monsanto Technology Llc A Novel Method for Production of Transformed Dihaploid Corn Plants
US20040210958A1 (en) 2003-03-19 2004-10-21 Monsanto Technology Llc A Novel Culture Method for Corn Transformation
US7575917B2 (en) * 2003-04-09 2009-08-18 Monsanto Technology Llc DNA constructs and methods to enhance the production of commercially viable transgenic plants
US7682829B2 (en) * 2003-05-30 2010-03-23 Monsanto Technology Llc Methods for corn transformation
CA2528741A1 (en) 2003-06-17 2004-12-23 Sembiosys Genetics Inc. Methods for the production of insulin in plants
US7150993B2 (en) 2003-08-05 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Method for excision of plant embryos for transformation
US7560611B2 (en) 2003-08-05 2009-07-14 Monsanto Technology Llc Method and apparatus for substantially isolating plant tissues
TW200526778A (en) 2003-11-14 2005-08-16 Sembiosys Genetics Inc Methods for the production of apolipoproteins in transgenic plants
ATE553204T1 (de) 2004-04-20 2012-04-15 Temasek Life Sciences Lab Ltd Verfahren zur hocheffizienten transformation und regeneration von pflanzensuspensionskulturen
US7572635B2 (en) * 2004-06-25 2009-08-11 Monsanto Technology Llc Method for agrobacterium transformation for dihaploid corn plants
US8581035B2 (en) 2006-08-31 2013-11-12 Monsanto Technology Llc Plant transformation without selection
EP2127517B1 (en) 2007-02-28 2014-12-17 Japan Tobacco, Inc. Agrobacterium-mediated method for producing transformed plant without selection step
CA2916780C (en) 2007-04-02 2020-12-22 Esight Corp. An apparatus and method for augmenting sight
WO2009029852A2 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Monsanto Technology Llc Method and apparatus for substantially isolating plant tissues
MY145205A (en) 2007-12-28 2012-01-13 Mimos Berhad Vibratory sensor
JP2011120478A (ja) * 2008-03-31 2011-06-23 Japan Tobacco Inc アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
EP2110528B2 (en) 2008-04-18 2017-04-19 Daimler AG Apparatus for treating an exhaust gas stream with removable module
JP5615539B2 (ja) * 2009-12-08 2014-10-29 株式会社タイヨー製作所 連続式加熱処理方法及び連続式加熱処理装置
US20110162112A1 (en) * 2009-12-31 2011-06-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Increasing time-efficiency of high-throughput transformation processes

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006127A1 (en) * 1993-08-20 1995-03-02 Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus Method for the production of transgenic cereals
US5767368A (en) * 1995-04-03 1998-06-16 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for producting a cereal plant with foreign DNA
WO1997041228A2 (en) * 1996-05-01 1997-11-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of the green fluorescent protein as a screenable marker for plant transformation
WO1998051806A2 (en) * 1997-05-16 1998-11-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Recovery of transformed plants without selectable markers by nodal culture and enrichment of transgenic sectors
US6420630B1 (en) * 1998-12-01 2002-07-16 Stine Biotechnology Methods for tissue culturing and transforming elite inbreds of Zea mays L.
WO2002102979A2 (en) * 2001-06-15 2002-12-27 UNIVERSITY OF TOLEDO, THE a University instrumentality of the State of Ohio Transformation of mono- and di- cotyledonous plants

Also Published As

Publication number Publication date
CN104232680A (zh) 2014-12-24
CA2666821A1 (en) 2008-03-06
US20150013034A1 (en) 2015-01-08
CN101528933B (zh) 2014-10-22
MX2009002248A (es) 2009-03-16
CA3066436A1 (en) 2008-03-06
EP3269818A1 (en) 2018-01-17
BRPI0716225B1 (pt) 2017-10-10
US20120180166A1 (en) 2012-07-12
CN101528933A (zh) 2009-09-09
US20170253883A1 (en) 2017-09-07
JP5329412B2 (ja) 2013-10-30
AU2007289109A1 (en) 2008-03-06
MX2009002252A (es) 2009-03-16
CA2973552A1 (en) 2008-03-06
ZA200901405B (en) 2010-02-24
ZA200901174B (en) 2010-02-24
US8124411B2 (en) 2012-02-28
WO2008028115A2 (en) 2008-03-06
AU2007289109B2 (en) 2012-11-15
US20140059717A1 (en) 2014-02-27
US20080124727A1 (en) 2008-05-29
BRPI0716225A2 (pt) 2013-10-15
BRPI0716373A2 (pt) 2013-10-15
AU2007289111A1 (en) 2008-03-06
AU2007289111B2 (en) 2013-03-28
CA2661181A1 (en) 2008-03-06
MX2009002250A (es) 2009-03-16
US10233455B2 (en) 2019-03-19
US11091766B2 (en) 2021-08-17
US10006036B2 (en) 2018-06-26
US8581035B2 (en) 2013-11-12
CA2917034A1 (en) 2008-03-06
BRPI0716207A2 (pt) 2013-11-12
US20150017644A1 (en) 2015-01-15
ATE497008T1 (de) 2011-02-15
EP2390337B1 (en) 2017-10-11
WO2008028119A3 (en) 2008-04-17
US20190218562A1 (en) 2019-07-18
US20210171964A1 (en) 2021-06-10
JP2010502196A (ja) 2010-01-28
US20220010320A1 (en) 2022-01-13
CN101528932A (zh) 2009-09-09
US20130239253A1 (en) 2013-09-12
DE602007012269D1 (de) 2011-03-10
CN101528934A (zh) 2009-09-09
US20080057512A1 (en) 2008-03-06
AU2007289105A1 (en) 2008-03-06
BR122017012510B1 (pt) 2022-05-17
CN101528934B (zh) 2013-08-28
CA2884022C (en) 2017-08-29
CA2973552C (en) 2020-03-10
EP2390337A1 (en) 2011-11-30
CA2884022A1 (en) 2008-03-06
EP2057272A2 (en) 2009-05-13
US11718855B2 (en) 2023-08-08
CA2661825A1 (en) 2008-03-06
WO2008028119A2 (en) 2008-03-06
US9617552B2 (en) 2017-04-11
CA2884046A1 (en) 2008-03-06
US20180119157A1 (en) 2018-05-03
CA2661181C (en) 2015-07-21
CA2917034C (en) 2019-03-05
EP2054517A1 (en) 2009-05-06
EP2069510B1 (en) 2013-07-24
US8847009B2 (en) 2014-09-30
JP2010502193A (ja) 2010-01-28
US8513016B2 (en) 2013-08-20
JP5350246B2 (ja) 2013-11-27
CA2666821C (en) 2015-05-26
EP2069510A2 (en) 2009-06-17
JP5242570B2 (ja) 2013-07-24
US8395020B2 (en) 2013-03-12
BRPI0716373B1 (pt) 2017-10-10
EP2057272B1 (en) 2011-01-26
US10941407B2 (en) 2021-03-09
US20080118981A1 (en) 2008-05-22
WO2008028115A3 (en) 2008-06-19
US20140051078A1 (en) 2014-02-20
AU2007289105B2 (en) 2012-08-02
BRPI0716207B1 (pt) 2018-09-18
JP2010502197A (ja) 2010-01-28
CN104232680B (zh) 2021-04-27
ZA200901140B (en) 2010-02-24
US20150143587A1 (en) 2015-05-21
US20180273959A1 (en) 2018-09-27
US9783813B2 (en) 2017-10-10
WO2008028121A1 (en) 2008-03-06
CA2661825C (en) 2016-03-22
CA2884046C (en) 2017-02-21
CN104357535A (zh) 2015-02-18
US8962326B2 (en) 2015-02-24
US8853488B2 (en) 2014-10-07
EP2054517B1 (en) 2017-10-04
CN104357535B (zh) 2018-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101528932B (zh) 植物无选择转化
CN107129993B (zh) 一种修饰的抗草甘膦基因及抗草甘膦水稻的培育方法
CN111406117A (zh) 用于检测大豆植物dbn8002的核酸序列及其检测方法
CN102725414A (zh) 用于通过在转化过程中诱导bbm提供可育植物的方法
CN110881367A (zh) 一种玉米事件t抗-4及其使用方法
CN108018286B (zh) 玉米转化事件zm8-143的创制、检测与应用
CN112430684B (zh) 一种用于检测水稻植物h23的核酸序列及其检测方法
CN114540529A (zh) 一种半矮秆增产的玉米基因型、功能性分子标记InDel-K2及其应用
CN103348009A (zh) 一种制备育性减低植物的方法
CN106164277A (zh) 生产小麦属转基因植物用的无选择标记根瘤菌科介导方法
CN113512551B (zh) 调控大豆籽粒大小基因的克隆及应用
KR100464677B1 (ko) 활성 표지를 위한 인핸서 및 유전자 포획을 위한 리포터유전자를 포함하는 ｔ-ｄｎａ 표지 벡터로 단자엽 식물의형질전환체를 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된형질전환체
CN117947088A (zh) 调控栽培稻氮利用效率的基因OsNPF7.1b的分子标记及其应用
CN116445446A (zh) 野生甘蓝糖基转移酶BoUGT76C2基因及应用
CN112391407A (zh) 一种水稻稻瘟病抗性改良的育种方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant