MX2009002252A - Transformacion de plantas sin seleccion. - Google Patents

Abstract

La invención provee métodos para identificar plantas transformadas regeneradas y partes de plantas transformadas diferenciadas, obtenidas sin someter células de la planta a condiciones selectivas antes de la regeneración de las células para obtener tejidos diferenciados; en modalidades particulares, las células de la planta son células de la planta de maíz; se proveen también métodos para cultivar y manejar plantas, incluyendo la identificación de plantas que demuestran rasgos específicos de interés.

Description

TRANSFORMACION DE PLANTAS SIN SELECCION ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional de E.U.A. número de serie 60/841 ,519, presentada en agosto 31 de 2006, cuya descripción completa se incorpora en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere al campo de biotecnología vegetal. En particular, la invención se refiere a métodos para producir plantas transgénicas que no requieren el uso de un gen marcador seleccionable antes de que se obtenga una planta o parte de la planta regenerada.

DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA La transformación estable de células de la planta y la producción de plantas transgénicas ha requerido típicamente un paso de selección, en donde se selecciona tejido de la planta en presencia de un agente de selección después de haber sido puesto en contacto con una o más secuencias de ácido nucleico exógeno, incluyendo una que comprenda una secuencia o secuencias que codifiquen para un gen de interés y un gen marcador. Después de dicha selección, pueden regenerarse e identificarse plantas establemente transformadas que comprenden un gen de interés (GOI). Sin embargo, tras la creación de una planta transformada que comprende un GOI, un gen marcador seleccionable o identificable que no es por sí mismo un GOI típicamente deja de ser necesario, y su presencia puede complicar análisis subsiguientes y esfuerzos de desarrollo de productos. Además, se ha mostrado que la necesidad de un promotor fuerte que dirige un marcador seleccionable, desvía la expresión del gen deseado (Yoo et al., 2005). Se ha reportado una amplia gama de métodos para crear plantas transgénicas libres de genes marcadores, por ejemplo, co-transformación, elementos transponibles, recombinación específica de sitio y recombinación intracromosómíca (véase, por ejemplo, Darbani et al. , 2007). Sin embargo, la mayoría de estos sistemas consumen tiempo y son ineficientes. Goldsbrough (2001 ) revisa métodos para evitar el uso de genes marcadores seleccionabas, o eliminar los mismos, en la creación de plantas transgénicas. De Vetten et al. (2003; y la solicitud de patente de E.U.A. publicación 2005/0097641 ), describen métodos para la transformación libre de marcadores, de un cultivo propagado vegetativamente, tal como papa resultando, sin embargo, en plantas quiméricas. Palys et al. (publicación del PCT WO 2004/081 1 84), describen la transformación de tomate, lechuga y col sin selección. Francis y Spiker (2005) describen la identificación de líneas de Arabidopsis transgénicas usando un tamiz basado en PCR, que evita la propensión de la selección en la integración de transgenes. En contraste, la presente invención provee métodos para la producción rápida y eficiente de plantas de maíz transformadas de la línea germinal obtenidas por medio de métodos que no requieren la presencia de un agente selectivo o un gen marcador seleccionable, tal como un gen marcador visual, antes de que se obtengan plantas de maíz regeneradas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención provee un método para identificar plantas de maíz transgénicas, que comprende: (a) obtener células de la planta de maíz transformadas con un segmento de ADN que comprenda una secuencia de ácido nucleico de interés; (b) regenerar una pluralidad de plantas de maíz o partes de la planta de maíz diferenciadas de las células sin que primero se seleccionen para la presencia de dicho segmento de ADN; y (c) identificar por lo menos una primera planta de maíz transgénica o parte de la planta diferenciada, de la pluralidad de plantas de maíz o partes de la planta de maíz diferenciadas. En algunas modalidades, el segmento de ADN no comprende un gen marcador seleccionable o un gen marcador visual. En otras modalidades, las plantas son regeneradas por crecimiento en medios sólidos, medios líquidos, o una combinación de medios sólidos y líquidos. En modalidades particulares, las plantas son regeneradas por crecimiento solamente en medios líquidos subsiguiente a la puesta en contacto de las células con un GOI y antes de la identificación de la planta de maíz transgénica o parte de la planta diferenciada transgénica. En ciertas modalidades, la frecuencia de transformación de células que crecen solamente en medios líquidos subsiguiente a la puesta en contacto de las células con un GOI y antes de la identificación de plantas transgénicas o partes de plantas transgénicas, se mejora respecto a la frecuencia de transformación observada cuando las células crecen en medios sólidos o suelo subsiguiente a la puesta en contacto de las células con un GOI y antes de la identificación de plantas transgénicas o partes de plantas transgénicas. En ciertas modalidades, las células de la planta son células de embrión de maíz inmaduro. En modalidades particulares, los embriones de maíz inmaduros son de aproximadamente 1 .5 mm a aproximadamente 3.5 mm en longitud, o de aproximadamente 1 .9 mm a aproximadamente 2.3 mm en longitud. En ciertas modalidades, el método comprende además, entre los pasos (b) y (c), (1 ) poner la pluralidad de plantas de maíz o partes de plantas diferenciadas en tubos de cultivo o tapones de crecimiento que comprenden un medio de crecimiento o agua, mientras que se mantiene la identidad individual de las plantas de maíz; y (2) someter las plantas o partes de la planta a por lo menos una primera prueba para la presencia del segmento de ADN, para identificar una o más plantas o partes de la planta como transgénicas con base en los resultados de la prueba. La prueba puede seleccionarse además del grupo que consiste de hibridación Southern, PCR, secuenciación de ADN, northern blotting, western blotting, un ¡nmunoensayo, y una prueba para la actividad enzimática codificada por el segmento de ADN. En modalidades particulares, la prueba se realiza antes de que pongan las plantas regeneradas en suelo. En otras modalidades, las plantas de maíz putativamente transformadas o partes de la planta diferenciadas que carecen de la secuencia de ácido nucleico de interés son identificadas, en donde la prueba se realiza en tejido de la planta que comprenda subgrupos agrupados de ácidos nucleicos de dicha pluralidad de plantas de maíz o partes de la planta diferenciadas. En algunas modalidades, las plantas de maíz o partes de la planta de maíz son regeneradas no después de 6 semanas después de que el segmento de ADN es transformado en las células de la planta de maíz. En otras modalidades, las plantas de maíz o partes de la planta de maíz son regeneradas no después de 3 semanas después de que el segmento de ADN es transformado en las células de la planta de maíz. En otras modalidades, las plantas de maíz o partes de la planta de maíz son regeneradas no después de 2 semanas después de que el segmento de ADN es transformado en las células de la planta de maíz. En otras modalidades, las plantas de maíz o partes de la planta de maíz son regeneradas no después de 1 semana después de que el segmento de ADN es transformado en las células de la planta de maíz. En ciertas modalidades, el segmento de ADN es introducido en la célula de la planta de maíz mediante transformación mediada por bacterias, electroporación, transformación mediada por PEG o bombardeo de partículas. En modalidades particulares, la transformación mediada por bacterias es mediada por una célula bacteriana seleccionada del grupo que consiste de una célula de Agrobacterium, una célula de Rhizobium, una célula de Sinorhizobium y una célula de Mesorhizobium. El método puede comprender además el paso de someter una planta de maíz o parte de la planta de maíz derivada de la célula de la primera planta de maíz, a condiciones de cultivo que seleccionen para, o permitan la identificación de, la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico de interés después de la regeneración de una planta o parte de la planta. En ciertas modalidades, el medio de crecimiento es un medio sólido. En otras modalidades, el medio de crecimiento es líquido. En otras modalidades, el medio de crecimiento es suelo. En otras modalidades, la planta regenerada o parte de la planta diferenciada es uniforme con respecto a la presencia del segmento de ADN.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación, y se incluyen para demostrar además ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas en la presente.

Figura 1 . Comparación esquemática de protocolos de transformación sin selección ("sin sel") y 2T. (Para más detalles sobre la estrategia 2T, favor de ver Huang et al., 2004). Figura 2. Análisis histoquímico usando GUS de líneas de regeneración representativas. Figura 3. Recuperación de eventos tolerantes a glifosato a través del procedimiento "sin selección" después de rociar las plantas con solución de glifosato. Figura 4. Datos representativos del análisis Southern de plantas R0 seleccionadas como se describe en el ejemplo 4. Figura 5. La transmisión de la línea germinal y la segregación del gen GUS a la siguiente generación, fue validada usando polen R0 y retrocruzamiento con la línea progenitora. Figura 6. Datos del análisis Southern de la progenie de eventos de transformación independientes seleccionados, que demuestran la transmisión estable de secuencias transformadas (gen de CP4). Figura 7. Disposición de tapones de crecimiento que permite la fácil identificación de plantas individuales después de prueba para la presencia de la secuencia transgénica. Figura 8. Diagrama esquemático de protocolos de regeneración que usan medios semisólidos - comparación de procedimientos de selección y sin selección. Figuras 9A-9B. Protocolos de regeneración usando cultivo líquido sin selección antes de que se obtenga una planta regenerada -comparación de los medios de proliferación.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El desarrollo de muchos productos modernos de plantas genéticamente transformadas, implica el apilamiento de rasgos transgénicos múltiples para proveer rasgos de valor agregado múltiples para los agricultores. Un cuello de botella importante en este procedimiento es la presencia de genes marcadores seleccionares, los cuales son llevados junto con un gen de interés (GOI) durante la transformación, ya que el procedimiento ha dependido típicamente del uso de un gen marcador seleccionare que asegure la transformación de las células de la planta. Aunque varios métodos están disponibles para remover genes marcadores seleccionabas después de la transformación, estos métodos con frecuencia consumen tiempo y no son altamente eficientes. La presente invención elimina el cuello de botella mencionado anteriormente, a través del desarrollo de un procedimiento de transformación eficiente sin que se requiera el uso de un gen marcador seleccionable, así como métodos eficientes para la identificación y el manejo de plantas para mejorar eventos transgénicos producidos sin selección. En particular, la invención se refiere a métodos para mejorar la eficiencia de transformación de plantas y regeneración subsiguiente sin el uso de selección, llevando a la producción de eventos transgénicos libres de marcadores. Este es un descubrimiento significativo en la producción de plantas de cultivo transgénicas, ya que la transformación sin marcadores (así como la regeneración subsiguiente de plantas en ausencia de un agente selectivo) evita la complejidad asociada con la remoción de marcadores, evita desviar la estructura genética de eventos de transformación resultantes debido a una necesidad para la expresión inicial de un gen marcador seleccionable, y evita también dificultades potenciales durante el procedimiento de mejora de la progenie (por ejemplo, debido a la segregación de transgenes que corresponden a un GOI respecto a aquellos que codifican para un marcador seleccionable). El procedimiento elimina también la necesidad del uso de un cassette de expresión adicional para el gen marcador seleccionable o identificable, reduciendo de esta manera el tamaño del vector de transformación, y proveyendo beneficios asociados tales como la reducción de las oportunidades de silenciamiento debido a secuencias de cassettes repetitivas, interferencia del promotor y construcción simplificada de vectores de transformación. La producción de alto rendimiento de plantas transgénicas libres de marcadores seleccionares, requiere la producción eficiente de transformantes. Es preferible que la transformación sin selección, más específicamente sin selección antes de la obtención de brotes regenerados o plántulas enteras (comprendiendo brotes y raíces), se lleve a cabo en ausencia de un agente selectivo. En ciertas modalidades, las secuencias de ácido nucleico transformadas en una célula de la planta objetivo pueden no comprender genes marcadores seleccionables. En otras modalidades, un gen marcador seleccionable o gen marcador visual puede estar presente, pero las células transformas y los tejidos en regeneración no son sin embargo sometidos a un agente selectivo al cual el gen marcador seleccionable especifica tolerancia, resistencia u otro fenotipo analizable. Además, estos transformantes son de preferencia no quiméricos (es decir, uniformes) con respecto a la presencia de un GOl, dado que la presencia de tejidos de la planta quiméricos, que no son uniformes con respecto a la presencia de un GOl, complican el análisis, producción e identificación adicionales de plantas de la progenie que comprenden el GOl. De esta manera, se ha encontrado que la transformación, incluyendo pasos de regeneración subsiguientes, sin selección para producir habitualmente plantas transgénicas no quiméricas, requiere la producción eficiente de grandes sectores transgénicos y la rápida producción de primordios de brotes. Además, en ausencia de presión selectiva, pueden regenerarse grandes números de plantas, muchas o la mayoría de las cuales carecen de un GOl. De esta manera, se proveen métodos eficientes para regenerar, desarrollar e identificar plantas que comprenden potencialmente un GOl. En ciertas modalidades, se realiza la regeneración de plantas en un medio semisólido antes del transplante de transformantes putativos en suelo. En otras modalidades, los medios pueden ser líquidos. En otras modalidades, puede usarse una combinación de medios semisólidos y líquidos durante el procedimiento de regeneración, para facilitar el manejo de las plantas, y para ahorrar tiempo, dinero y costos durante la identificación, y transferencias a las diferentes condiciones de crecimiento usadas durante el procedimiento de cultivo de tejidos. En otras modalidades, sólo se usan medios líquidos durante el procedimiento de regeneración. En modalidades particulares, la regeneración en medios líquidos puede mejorar la frecuencia de transformación de las células puestas en contacto con un gen de interés. La presencia de un agente selectivo a través de los pasos del cultivo de tejidos que llevan a una planta transformada regenerada, puede desviar las características del tejido seleccionado, esencialmente requiriendo un cierto nivel de expresión del marcador seleccionable para que el tejido sobreviva a la presión selectiva. Esto puede resultar, por ejemplo, en una propensión hacia la obtención de eventos transgénicos con inserciones múltiples o complejas de una secuencia de ácido nucleico heteróloga. De esta manera, la invención provee un método para obtener una población o serie de plantas putativamente transformadas, sin que las plantas hayan sido sometidas a dicha presión selectiva durante las fases del cultivo de tejidos, tales como proliferación de cayos, pre-regeneración y regeneración, y cuyas plantas pueden exhibir un perfil de expresión ventajoso de un GOI, y/o características ventajosas relacionadas con la estructura molecular y la segregación genética de los sitios de inserción del transgen encontrados en un evento dado. En particular, dicha característica ventajosa puede incluir, por ejemplo, que una proporción significativa de eventos de transformación exhiba un nivel de expresión ventajoso de un GOI, o que una proporción significativa de eventos de transformación exhiba inserciones de bajo número de copias (es decir, 1 a 2 copias). En modalidades particulares, los eventos de transformación de bajo número de copias carecen de oriV u otras secuencias de la estructura de base del vector, si dichas secuencias estuvieran presentes en la construcción de transformación original que inicialmente entró en contacto con las células de la planta al inicio del procedimiento de transformación. La transformación y regeneración sin dicha selección, de conformidad con los métodos de la presente invención, es reproducible y eficiente. En ciertas modalidades, la frecuencia de transformación (TF) expresada, por ejemplo, sobre la base del número de plantas uniformes establemente transformadas (es decir, no quiméricas) obtenidas, por embrión inmaduro u otro explante que comprenda células puestas en contacto con una construcción de ácido nucleico heteróloga, es de por lo menos 3%, y puede variar de aproximadamente 3% a aproximadamente 60%, dependiendo del tamaño del embrión y las condiciones de cultivo, incluyendo el tipo de métodos de regeneración. En modalidades particulares, la TF puede variar de aproximadamente 10% a aproximadamente 1 5%. En forma alternativa, la TF puede calcularse de otras formas, por ejemplo, con base en el número de plantas transformadas obtenidas, por número de plantas regeneradas y el crecimiento de dichos embriones inmaduros u otros explantes. En ciertas modalidades, la planta de cultivo que está siendo transformada sin selección se selecciona de entre plantas de cultivo monocotiledóneas, incluyendo las Poaceae, tales como plantas de maíz, arroz, sorgo, trigo, centeno, mijo, caña de azúcar, avena, triticale, pasto para céspedes y Panicum virgatum. En una modalidad particular, la planta de cultivo es una planta de maíz. En ciertas modalidades, el tejido objetivo de transformación, por ejemplo, explante, puesto en contacto con una secuencia de ácido nucleico heteróloga, comprende tejido meristemático, tal como un embrión, o un meristemo de brote. En ciertas modalidades, el explante es un embrión. En modalidades particulares, el embrión es un embrión inmaduro. En otras modalidades, el embrión inmaduro es un embrión de maíz inmaduro, y está entre aproximadamente 1 .9 y 3.5 mm en tamaño, o entre aproximadamente 1 .6 a 1 .8 mm en tamaño. En modalidades particulares, el embrión de maíz inmaduro está entre aproximadamente 1 .9 y 2.5 mm, y de preferencia es de aproximadamente 2.3 mm en tamaño. En otras modalidades, el embrión de maíz inmaduro tiene aproximadamente 2.5 a 3.2 mm en tamaño, o aproximadamente 2.8 a 4.0 mm en tamaño. El embrión inmaduro puede seleccionarse también como un objetivo de transformación con base en su etapa de desarrollo, o la oportunidad de su aislamiento, días después de la polinización (DAP), por ejemplo, aproximadamente 9 a 14 DAP o aproximadamente 10 a 12 DAP. Para iniciar un procedimiento de transformación de conformidad con la presente invención, es primero necesario seleccionar componentes genéticos que van a ser insertados en las células o los tejidos de la planta.

Componentes genéticos pueden incluir cualquier ácido nucleico que sea introducido en una célula o tejido de la planta usando el método de conformidad con la invención. Los componentes genéticos pueden incluir ADN no de plantas, ADN de plantas o ADN sintético. En una modalidad preferida, los componentes genéticos son incorporados en una composición de ADN tal como una molécula de vector o plásmido de doble cadena recombinante que comprenda por lo menos uno o más de los siguientes tipos de componentes genéticos: (a) un promotor que funcione en células de la planta para causar la producción de una secuencia de ARN, (b) una secuencia de ADN estructural que cause la producción de una secuencia de ARN que codifique para un producto de utilidad agronómica, y (c) una secuencia de ADN no traducida que funcione en células de la planta para causar la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de la secuencia de ARN. El vector puede contener muchos componentes genéticos que faciliten la transformación de la célula o tejido de la planta y regulen la expresión de los genes deseados. En una modalidad preferida, los componentes genéticos son orientados de modo que expresen un ARN mensajero, que en una modalidad pueda ser traducido en una proteína. La expresión de una secuencia codificante estructural de la planta (un gen, ADNc, ADN sintético u otro ADN) que existe en forma de doble cadena, implica la transcripción de ARN mensajero (ARNm) de una cadena del ADN por la enzima ARN polimerasa, y el procesamiento subsiguiente del transcrito primario de ARN mensajero dentro del núcleo. Este procesamiento implica una región no traducida 3' que añade nucleótidos poliadenilados a los extremos 3' del ARN mensajero. Métodos para preparar plásmidos o vectores que contienen a los componentes genéticos deseados, son bien conocidos en la técnica. Los vectores consisten típicamente de muchos componentes genéticos que incluyen, pero no están limitados a, elementos reguladores tales como promotores, guías, intrones y secuencias de terminador. Los elementos reguladores son referidos también como elementos reguladores cis o trans, dependiendo de la proximidad del elemento a las secuencias o genes que controlan. La transcripción de ADN en ARN mensajero es regulada por una región de ADN referida usualmente como el "promotor". La región de promotor contiene una secuencia de bases que le señala a la ARN polimerasa se asocie con el ADN, e inicie la transcripción en ARN mensajero usando una de las cadenas de ADN como molde para producir una cadena de ARN complementaria correspondiente. Muchos promotores que son activos en células de las plantas se han descrito en la literatura. Dichos promotores incluirían, pero no estarían limitados a, los promotores de nopalina sintasa (NOS) y octopina sintasa (OCS) que son llevados en plásmidos inductores de tumores de Agrobacterium tumefaciens, los promotores de caulimovirus tales como los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (FMV), el promotor 35S mejorado del CaMV (e35S), el promotor inducible por la luz de la subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido de plantas muy abundante). Todos estos promotores se han usado para crear varios tipos de construcciones de ADN que han sido expresadas en plantas. Pueden construirse también híbridos de promotor que mejoran la actividad de transcripción (véase la patente de E.U.A. No. 5,106,739), o que combinan actividad de transcripción, inducibilidad y especificidad por el tejido o especificidad de desarrollo deseada. Promotores que funcionan en plantas incluyen, pero no están limitados a, promotores que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos según se describe, y temporalmente regulados, espacialmente regulados y espacio-temporalmente regulados. Otros promotores que son mejorados en tejidos, específicos de tejidos o regulados por el desarrollo se conocen también en la técnica, y se prevé que tienen utilidad en la práctica de esta invención. Pueden obtenerse promotores de una variedad de fuentes tales como plantas y virus de ADN de plantas e incluyen, pero no están limitados a, los promotores 35S del CaMV y 35S del FMV, y promotores aislados de genes de plantas tales como los genes de ssRUBISCO. Como se describe más adelante, se prefiere que el promotor particular seleccionado deba ser capaz de causar expresión suficiente que resulte en la producción de una cantidad efectiva del producto génico de interés. Los promotores usados en las construcciones de ADN (por ejemplo, genes de plantas recombinantes/quiméricos) de la presente invención pueden ser modificados, si se desea, para afectar sus características de control. Pueden derivarse promotores por medio de ligación con regiones del operador, mutagénesis aleatoria o controlada, etc. Además, los promotores pueden ser alterados para contener "secuencias de intensificado!-" múltiples que ayudan en la elevación de la expresión génica. Un ARN mensajero producido por una construcción de ADN de la presente invención puede contener también una secuencia guía no traducida 5'. Esta secuencia puede derivarse del promotor seleccionado que expresa el gen, y puede ser modificado específicamente para incrementar la traducción del ARN mensajero. Las regiones no traducidas 5' pueden obtenerse también de moléculas de ARN virales, de genes eucarióticos adecuados, o de una secuencia génica sintética. Dichas secuencias de "intensificador" pueden ser deseables para incrementar o alterar la eficiencia de traducción del ARN mensajero resultante. La presente invención no se limita a construcciones en donde la región no traducida se deriva de la secuencia no traducida 5' que acompaña a la secuencia de promotor. Más bien, la secuencia guía no traducida puede derivarse de genes o promotores no relacionados (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,362,865). Otros componentes genéticos que sirven para mejorar la expresión o afectar la transcripción o traducción de un gen, se prevén también como componentes genéticos. La región no traducida 3' de las construcciones quiméricas debe contener un terminador de transcripción, o un elemento que tenga función equivalente, y una señal de poliadenilación que funcione en plantas para causar la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' del ARN. Ejemplos de regiones 3' adecuadas son (1 ) las regiones no traducidas transcritas 3' que contienen la señal de poliadenilación de genes de plásmidos inductores de tumores (Ti) de Agrobacterium, tales como el gen de nopalina sintasa (NOS), y (2) genes de plantas tales como los genes de proteínas de almacenamiento de la soya y la subunidad pequeña del gen de ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO). Un ejemplo de una región 3' preferida es aquel del gen E9 de ssRUBISCO del chícharo (véase la solicitud de patente europea 0385 962). Típicamente, secuencias de ADN localizadas unos cuantos cientos de pares de bases hacia el extremo 3' del sitio de poliadenilación, sirven para terminar la transcripción. Las secuencias de ADN son referidas en la presente como regiones de terminación de la transcripción. Las regiones se requieren para la poliadenilación eficiente del ARN mensajero transcrito, y se conocen como regiones no traducidas 3'. La ARN polimerasa transcribe una secuencia de ADN codificante a través de un sitio en donde ocurre la poliadenilación. En una modalidad, el ADN T no comprende un gen marcador seleccionable, identificable o analizable. En forma alternativa, el ADN que va a ser transcrito puede contener un gen marcador seleccionable, identificable o analizable, aunque en ciertas modalidades de la invención, tejidos de la planta son sólo seleccionados o identificados para la presencia del marcador después de que ha ocurrido la regeneración. Estos componentes genéticos son referidos también en la presente como componentes genéticos funcionales, ya que generan un producto que cumple una función en la identificación de una planta transformada, o un producto de utilidad agronómica. El ADN que sirve como un dispositivo de selección funciona en un tejido de la planta regenerable, en particular un tejido regenerado, para producir un compuesto que conferiría en el tejido de la planta resistencia a un compuesto de otra manera tóxico. Genes de interés para su uso como un marcador seleccionare, identificable o analizable incluirían, pero no estarían limitados a, uidA que codifica para GUS, gfp, que codifica para proteína fluorescente verde (GFP), genes relacionados con la biosíntesis de antocianina (C1 , B-peru), luciferasa (LUX), y genes que especifican resistencia a antibióticos tales como kanamícina (Dekeyser et al., 1989) y herbicidas tales como glifosato (Della-Cioppa et al., 1987). Otros métodos de selección pueden implementarse también e incluyen, pero no están limitados a, tolerancia a fosfinotricina, bialafós, y mecanismos de selección positiva, y estarían aún dentro del alcance de la presente invención. La presente invención puede usarse con cualquier vector o plásmido de transformación en plantas adecuado, que contenga un marcador seleccionable o identificable y elementos reguladores asociados según se describe, junto con uno o más ácidos nucleicos expresados en una manera suficiente para conferir un rasgo particular. Ejemplos de genes estructurales adecuados de interés agronómico previstos por la presente invención incluirían, pero no estarían limitados a, genes para tolerancia a insectos o plagas, tolerancia a herbicidas, genes para mejoras de calidad tales como rendimiento, aumentos nutricionales, tolerancias al ambiente o el estrés, o cualquier cambio deseable en la fisiología, crecimiento, desarrollo o morfología de las plantas o productos de plantas. En forma alternativa, el ADN que codifica para secuencias puede afectar estos fenotipos codificando para una molécula de ARN no traducible que cause la inhibición dirigida de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo, por medio de mecanismos antisentido o mediados por co-supresión (véase, por ejemplo, Bird et al., 1991 ). El ARN podría ser también una molécula de ARN catalítica (por ejemplo, una hbozima) diseñada para cortar un producto de ARN mensajero endógeno deseado (véase, por ejemplo, Gibson y Shillítoe, 1997). Más particularmente, para una descripción de la regulación antisentido de la expresión génica en células de las plantas, véase la patente de E.U.A. No. 5, 107,065, y para una descripción de la supresión de genes en plantas por transcripción de un ARNds, véase la patente de E. U.A. No. 6,506,559, la solicitud de patente de E.U.A. publicación No. 2002/0168707 A1 , y las solicitudes de patente de E.U.A. Nos. de serie 09/423, 143 (véase el documento WO 98/53083), 09/127,735 (véase el documento WO 99/53050) y 09/084,942 (véase el documento WO 99/61631 ), todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. De esta manera, cualquier gen que produzca una proteína o ARN mensajero que exprese un fenotipo o cambio de morfología de interés, es útil para la práctica de la presente invención. Ejemplos de ácidos nucleicos que pueden introducirse mediante los métodos abarcados por la presente invención incluyen, por ejemplo, secuencias de ADN o genes de otra especie, o incluso genes o secuencias que se originen con, o estén presentes en, la misma especie, pero son incorporados en células receptoras mediante métodos de ingeniería genética más que técnicas clásicas de reproducción o mejoramiento genético. Sin embargo, se pretende también que el término exógeno se refiera a genes que no están normalmente presentes en la célula que está siendo transformada, o quizá simplemente no presentes en la forma, estructura, etc., como se encuentran en el gen o segmento de ADN transformante, o genes que están normalmente presentes pero que se desee, por ejemplo, que hayan sido sobreexpresados. De esta manera, se pretende que el término ADN o gen "exógeno" se refiera a cualquier gen o segmento de ADN que es introducido en una célula receptora, sin considerar si un gen similar puede ya estar presente en dicha célula. El tipo de ADN incluido en el ADN exógeno puede incluir ADN que está ya presente en la célula de la planta, ADN de otra planta, ADN de un organismo diferente, o un ADN generado externamente, tal como una secuencia de ADN que contenga un mensaje antisentido de un gen, o una secuencia de ADN que codifique para una versión sintética o modificada de un gen. Tecnologías para la introducción de ADN en células son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden dividirse en categorías que incluyen, pero no están limitadas a, (1 ) métodos químicos; (2) métodos físicos tales como microínyección, electroporación y bombardeo de microproyectíles; (3) vectores virales; (4) mecanismos mediados por el receptor; y (5) métodos de transformación en plantas mediados por Rhizobium (por ejemplo, transformación mediada por Agrobacterium) (véase, por ejemplo, Broothaerts er a/., 2005). Para transformación mediada por Agrobacterium, después de la construcción del vector o construcción de transformación en plantas, dicha molécula de ácido nucleico, preparada como una composición de ADN in vitro, es introducida en un hospedero adecuado tal como E. coli, y apareada en otro hospedero adecuado tal como Agrobacterium, o transformada directamente en Agrobacterium competente. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la materia, y se han descrito para muchos sistemas de plantas que incluyen soya, algodón y trigo (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,569,834 y 5,159,135 y el documento WO 97/48814, los cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia). La presente invención abarca el uso de cepas bacterianas para introducir uno o más componentes genéticos en plantas. Los expertos en la técnica reconocerían la utilidad de métodos de transformación mediada por Agrobacterium en dicho procedimiento. Muchas cepas desarmadas y de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes que albergan plásmidos Ti o R¡, pueden usarse para la transferencia de genes en plantas. De preferencia, los hospederos Agrobacterium contienen plásmidos Ti y Ri desarmados que no contienen los oncogenes que causan tumorigénesis o rizogénesis, respectivamente, que se usan como los vectores y contienen los genes de interés que son introducidos subsiguientemente en plantas. Cepas preferidas incluirían, pero no estarían limitadas a, Agrobacterium tumefaciens derivada de la cepa C58, una cepa tipo nopalina que se usa para mediar la transferencia de ADN en una célula vegetal, cepas tipo octopina tales como LBA4404 o cepas tipo succinamopina, por ejemplo, EHA101 o EHA105. Otras bacterias tales como Sinorhizobium, Rhizobium y Mesorhizobium que interactúan con plantas naturalmente, pueden ser modificadas para mediar la transferencia de genes a muchas plantas diversas. Puede hacerse que estas bacterias simbióticas asociadas con plantas sean competentes para la transferencia de genes mediante la adquisición de un plásmido Ti desarmado y un vector binario adecuado (Broothaerts et al., 2005). Se ha reportado el uso de estas cepas para la transformación en plantas, y los métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los explantes pueden ser de un genotipo individual o de una combinación de genotipos. Cualquier semilla de maíz que pueda germinar, es un material de partida viable. En una modalidad preferida, pueden usarse explantes superiores de plantas híbridas como explantes. Por ejemplo, puede generarse una línea de células de rápido crecimiento con una alta respuesta de cultivo (mayores frecuencia de formación de callos embriogénicos, velocidad de crecimiento, frecuencia de regeneración de la planta, etc.), usando embriones híbridos que contengan varios genotipos. En una modalidad, puede usarse un híbrido O progenie de la primera generación de fecundación cruzada como una planta donadora, y puede ser cruzado con otro genotipo. Los expertos en la técnica están al tanto de que ocurre heterosis, referida también en la presente como "vigor híbrido", cuando dos endógamos son cruzados. La presente invención abarca de esta manera el uso de un explante que resulta de una cruza tridireccional, en donde por lo menos uno o más de los endógamos son altamente regenerables y transformables, y la frecuencia de regeneración y transformación del explante de la cruza tridireccional excede las frecuencias de los endógamos individualmente. Se prevé también que otros tejidos tienen utilidad en la práctica de la presente invención. Los explantes pueden incluir embriones maduros, embriones inmaduros, meristemos, tejido calloso o cualquier otro tejido que sea transformable y regenerable. Cualquier medio de cultivo de plantas adecuado puede usarse potencialmente durante el procedimiento de transformación. Ejemplos de dichos medios incluirían, pero no estarían limitados, a medios de Murashige y Skoog (1962), N6 (Chu et al., 1975); Linsmaier y Skoog (1965); Uchimiya y Murashige (1962); medios de Gamborg (1968), medio D (Duncan et al., 1985), medios para plantas leñosas de McCown (McCown y Lloyd, 1981 ), Nitsch y Nitsch (1969) y Schenk y Hildebrandt (1972), o derivaciones de estos medios complementados en consecuencia, así como los numerosos medios descritos más adelante. Los expertos en la técnica están al tanto de qué medios y complementos de medios tales como nutrientes y reguladores de crecimiento para su uso en transformación y regeneración y otras condiciones de cultivo tales como intensidad de luz durante la incubación, pH y temperaturas de incubación, pueden ser optimizados para la variedad particular de interés. Después de la regeneración de plántulas que comprenden brotes, o brotes y raíces, un agente selectivo puede aplicarse a las plántulas, o partes de las plántulas, por ejemplo, si un gen marcador seleccionable estuvo siendo transformado en las células iniciales de la planta objetivo junto con un GOl o, en forma alternativa, si el GOl mismo codifica para un marcador seleccionable. De esta manera, después de que una planta ha sido producida mediante los métodos de la presente invención, un agente selectivo puede aplicarse a la misma, de conformidad con la presente invención, para facilitar la realización de pruebas o de otra manera identificar una planta transformada que exhibe características útiles. La presente invención comprende también métodos para el manejo eficiente de plantas regeneradas, que permiten la identificación de plantas transformadas que comprenden el GOl. Estos métodos simplifican y modernizan el procedimiento para regenerar y desarrollar la población de plantas putativamente transformadas, ahorrando tiempo, espacio y costos requeridos por el procedimiento, y haciendo que el procedimiento sea comercialmente factible. En una modalidad, tejido objetivo de la planta, tal como embriones de maíz inmaduros (lEs), son co-cultivados con una cepa de Agrobacterium que comprenda un GOI, por ejemplo, por 1 a 3 días a 23°C, seguido de cultivo a 30°C por aproximadamente otros 7 a 10 días en el mismo medio de co-cultivo o en un medio de proliferación de callos. Los embriones pueden observarse para identificar qué embriones están "respondiendo", es decir, produciendo callo embriogénico que puede ser regenerado para formar una plántula. Los embriones respondedores con callo, típicamente callo escutelar, son transferidos entonces del co-cultivo a un primer medio de pre-regeneración, o un primer medio de regeneración, con condiciones de cultivo adecuadas de temperatura, luz y nutrientes que permitan más crecimiento de callo, y diferenciación y regeneración. Los callos pueden ponerse sobre o en un medio de regeneración semisólido. En forma alternativa, pueden ponerse sobre un soporte, tal como fieltro y/o papel filtro en una placa de cultivo que esté en contacto con un medio de regeneración líquido, de modo que el callo pueda crecer y diferenciarse. Según sea necesario, los embriones inoculados pueden cultivarse, por ejemplo, en la oscuridad por 1 a 2 semanas a 30°C, incluyendo transferencia a medio nutritivo fresco. Después de incubación en la oscuridad, los cultivos pueden desarrollarse en medios de regeneración bajo períodos alternos de luz y oscuridad, por ejemplo, 1 a 3 semanas de crecimiento bajo un ciclo de 16/8 horas de luz/oscuridad a aproximadamente 27°C con intensidad de luz de aproximadamente 100 µ?, o según sea adecuado, con base en la especie o variedad de planta en cuestión y el conocimiento de los expertos en la técnica de cultivo de tejidos de plantas. Típicamente, el inicio de la regeneración de la planta comienza dentro de 1 a 3 semanas del inicio del co-cultivo, especialmente si está presente una fase de crecimiento del callo. El método puede comprender también un paso de pre-regeneración, que comprende el uso de un medio de cultivo de tejidos de plantas basal complementado con niveles reducidos de auxinas que se usa en el medio de proliferación de callos. Después de aproximadamente 2 a 3 semanas de cultivo y regeneración en medios semisólidos o líquidos, las plantas que se regeneran de un explante individual, por ejemplo, de embriones inmaduros (lEs), pueden ser transferidas a un contenedor de medio de crecimiento individual. Uno de dichos ejemplos es un PHYTATRAY (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), que comprende medio de regeneración líquido o semisólido para el cultivo de tejidos de plantas, y crecimiento por aproximadamente 4 semanas antes de que las plantas resultantes sean transferidas a medios de crecimiento para el robustecimiento de las plantas, tales como tapones de crecimiento en suelo. Debido a que el transplante a suelo es un procedimiento intensivo en tiempo y mano de obra, puede ser preferible identificar plantas individuales antes de su transplante, e incluso antes de que sean puestas en un PHYTATRAY, para la presencia del GOI u otro rasgo de interés. El número de plántulas regeneradas en ausencia de presión selectiva puede ser 20 a 50 veces mayor que el que se encontraría en un experimento similar, usando un agente selectivo durante el crecimiento de callos y la regeneración de la planta. De esta manera, se provee un procedimiento para el manejo de grandes números de plantas, por ejemplo, para transferirlas de la fase de cultivo de tejidos a crecimiento bajo condiciones no estériles. El uso de tapones hortícolas o bandejas o tubos de cultivo individuales bajo condiciones no estériles que permiten el crecimiento y el análisis de plántulas, es otra modalidad de la invención. Estas plántulas pueden cultivarse además sin que necesariamente sean marcadas todas las plantas individuales, mediante la agrupación adecuada de las plantas en crecimiento que permita la fácil correlación entre una planta dada y su tejido que esté siendo sometido a una o más pruebas o tamices para identificar plantas transformadas que comprenden el GOI. En una modalidad, puede usarse un tamiz basado en PCR para eliminar plantas no transformadas antes de su transferencia a medios de crecimiento, incluyendo medios de crecimiento líquidos, por ejemplo, en PHYTATRAYs. De esta manera, por ejemplo, si se usan aproximadamente 5,000 embriones de maíz inmaduros en la transformación con una cepa bacteriana, pueden producirse aproximadamente 25,000 plantas, que requieren aproximadamente 5,000 PHYTATRAYs. Si se lograra una frecuencia de trasformación de aproximadamente 10%, un tamiz inicial de las plantas en regeneración en la etapa de crecimiento en el PHYTATRAY resultaría en aproximadamente 2,500 plantas putativamente transformadas, que corresponden a 500 embriones respondedores o que requieren aproximadamente 500 PHYTATRAYs, que serían transplantados a tapones de crecimiento en suelo. El método de identificación puede incluir agrupación de tejidos de plantas en regeneración de Phytatrays individuales o cualquier otro contenedor de crecimiento tal como tapones de crecimiento. Los grupos se diseñan de modo que, a través del análisis de grupos múltiples, puedan identificarse los miembros individuales de una población sin la necesidad de análisis individual de cada miembro de la población. Un método de agrupación es agrupar todas las plantas derivadas de un explante, de preferencia un IE, en un PHYTATRAY o recipiente de crecimiento similar, y los contenedores negativos son desechados, reduciendo ampliamente de esta manera los esfuerzos asociados con la realización de pruebas y el manejo de plantas. El número de plantas agrupadas podría incrementarse además, hasta el límite de detección de una prueba de PCR. Los tapones de crecimiento pueden manejarse o agruparse para aumentar al máximo la eficiencia de otros pasos de identificación, y para evitar el requerimiento de marcar individualmente a las plantas regeneradas. Por ejemplo, los tapones pueden agruparse y orientarse para que correspondan con una prueba formateada que usa una placa de microtítulo, por ejemplo, una placa de 96 cavidades, haciendo crecer las plantas en grupos de 96 tapones. Esto permitiría que se hagan correlaciones rápidas y precisas entre los resultados de una prueba y las plantas de las cuales se aisló el tejido de prueba. En ciertas modalidades, las pruebas que determinan la presencia o ausencia de un GOI en una planta libre de marcadores regenerada putativamente transformada, pueden seleccionarse del grupo que consiste de una prueba basada en PCR, hibridación Southern, secuenciación de ADN, northem blotting, western blotting, un inmunoensayo, y una prueba para una actividad enzimática codificada por el segmento de ADN transgénico que entró en contacto con el tejido objetivo durante el co-cultivo con Agrobacterium. En una modalidad particular, la prueba es una prueba basada en PCR. En ciertas modalidades, la prueba basada en PCR u otra prueba se realiza en tejido de la planta aislado de plantas regeneradas que crecen en PHYTATRAYs o su equivalente, antes del transplante a un medio de crecimiento basado en suelo. Los presentes métodos son más eficientes que otros métodos típicos para obtener plantas transgénicas libres de marcadores, por ejemplo, procedimientos mediados por Agrobacterium, usando una o más moléculas de ADN T que comprendan un GOI, y un marcador seleccionable o ¡dentificable (figura 1 ). Las ventajas provistas por varias modalidades de la invención incluyen: 1 . La construcción de transformación es más pequeña, simplificando el procedimiento de clonación. 2. La eliminación del cassette de expresión de genes marcadores libera los elementos de expresión que habrían sido requeridos por el cassette marcador, reduciendo inquietudes acerca de la estabilidad de recombinación debido a la presencia de elementos repetidos. La eliminación de elementos reguladores repetitivos del cassette marcador, reduce también al mínimo la posibilidad del silenciamiento de genes. 3. El procedimiento de identificación para plantas Ro es más simple. En los procedimientos previos, por lo menos dos elementos deben identificarse, el GOl y el gen marcador seleccionable. En el presente método, no hay necesidad de identificar un marcador. Además, las plantas positivas para un GOl necesitan ser identificadas para determinar si la inserción del gen marcador está enlazada a la inserción del GOl, y con frecuencia se encontró ligamiento, que interfiere con la capacidad para identificar plantas que carecen del marcador seleccionable en una generación subsiguiente. En contraste, el ligamiento no es un problema en el presente método. 4. Se encuentran también eficiencias mejoradas en las generaciones de la progenie. Para métodos previos tales como los métodos de transformación 2-T, debe identificarse una gran población de plantas F-\ o R-\ para identificar plantas libres de marcadores positivas para el GOl. Para las plantas producidas mediante el presente método, no se necesita segregación de un gen marcador. 5. Permiten la selección más rápida de los mejores eventos que contienen al GOl sin la presencia del gen marcador seleccionable, facilitando de esta manera el apilamiento eficiente de GOls múltiples, por ejemplo, cuando el gen marcador seleccionable codifica para un rasgo agronómico de interés. La invención provee métodos que producen eficientemente plantas transgénicas libres de marcadores, generalmente capaces de crecer en un medio basado en suelo, dentro de 7 a 10 semanas después de que un explante objetivo inicial es puesto en contacto con un ácido nucleico exógeno. Los métodos de alto rendimiento de la presente invención permiten el desarrollo de un sistema de transformación eficiente sin selección. En particular, la simplificación del manejo de tejidos en regeneración y plantas regeneradas permite la mecanización de muchos pasos, y ahorra tiempo, dinero y carga ergonómica. El sistema puede producir aproximadamente 4 a 6 eventos de transformación libres de marcadores utilizables (es decir, eventos de una sola copia y eventos libres de la estructura de base del vector) por experimento de transformación usando aproximadamente 100 embriones, apresurando de esta manera una línea de productos de plantas transformadas.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar modalidades de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes, representan técnicas descubiertas por el inventor y funcionan bien en la práctica de la invención. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen, y que obtienen aún un resultado igual o similar sin que se aparten del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos en la presente, mientras que se obtendrían los mismos resultados o resultados similares. Se considera que dichos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención, según se define mediante las reivindicaciones anexas.

EJEMPL0 1 Transformación libre de marcadores La transformación de embriones de maíz inmaduros regenerables puede realizarse por medio de un protocolo mediado por Rhizobium, por ejemplo, como es descrito generalmente por Cai et al. (solicitud de patente de E.U.A. publicación 20040244075). En particular, se usó un método modificado mediado por Agrobacterium. Embriones inmaduros con una escala de tamaño de 1 .9 a 2.5 mm, por ejemplo, aproximadamente 2.3 mm, se seleccionaron de mazorcas de maíz y se co-cultivaron con una cepa C58 de Agrobacterium de ABI que media la transferencia de ADN en las células de la planta que contienen a la construcción recombinante de interés, por ejemplo, pMON93040 que contiene a GUS y EPSPS de CP4 bajo el control de expresión de un promotor de actina, que permite el análisis visual de células y sectores transformados, y permite el uso de un rocío de glifosato Weathermax™ como un sustituto de un tamiz post-regeneración posterior seguido de una prueba de confirmación mediante un tamiz basado en PCR para plantas transformadas. Pueden usarse también embriones más grandes, por ejemplo, de aproximadamente 2.5 mm o hasta aproximadamente 3.2 mm en tamaño, y pueden ser preferibles en donde se producen pocas plantas por embrión reduciendo la proliferación de callos antes de la pre-regeneración, y fases de regeneración de cultivo de tejidos. La composición de los medios usados más adelante se da en el cuadro 1. Después de la inoculación con Agrobacterium, los embriones fueron transferidos a Lynx 1947 o Lynx 1898 para co-cultivo por un período de 1 a 3 días a 23°C, seguido de otros 7 a 14 días a 30°C en la misma placa o en un medio de proliferación de callos (por ejemplo, Lynx 316), seguido de crecimiento en un medio de pre-regeneración (Lynx 1844; 2232; 2197) o un medio de regeneración (Lynx 1344, 2282, 2379, etc.). El crecimiento final de las plantas puede lograrse mediante dos métodos: 1 ) transferencia de plantas de cada callo derivado del embrión a un Phytatray™ que contenga Lynx 1607, o 2) transferencia de plantas de cada callo derivado del embrión a un Phytatray™ que contenga Lynx 2168 líquido. Se dejó que las plantas crecieran en el Phytatray™ por un período de aproximadamente 4 semanas, antes de transferirlas a tapones de crecimiento (tapones Q por International Horticultural Technologies, Hollister, CA). Una semana antes de transferir las plantas a tapones de crecimiento, se toman muestras de las plantas mientras las plantas están aún dentro del Phytatray™, y se ponen a prueba para remover plantas sin el GOl. Se tomaron muestras de cada planta aproximadamente 10 días post-crecimiento en tapones de crecimiento para análisis de ADN, y se identificaron y retuvieron las plantas positivas para el GOl para crecimiento y desarrollo adicionales.

CUADRO 1 Composición de los medios usados en varios aspectos de la presente invención. Se identifica la función de medios representativos Componentes de 898 1316 1844 1344 los medios/L Co- 1947 Proliferación 2133 2232 2197 2282 2379 P re- 2168 r 1 607 , 1471 Regeneración Crecimiento (proveedores) cultivo de callos regeneración Sales básales MS 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g (Phytotech) Vitaminas MS (100X) 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL (Phytotech) Vitaminas MSFromm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 mL 0 0 0 (1000X)* Clorhidrato de 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg 0 0 0 0 0 0 tiamina (Sigma) 2,4-D (Phytotech) 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg 0.2 mg 0.2 mg 0 0 0.2 mg 0 0 0 0 Sacarosa 30 g 30 g 30 g 30 g 50 g 50 g 50 g 60 g 40 g 30 g 60 g 60 g 60 g (Phytotech) Prolina (Sigma) 1.38 g 1.38 g 1.38 g 1.38 g 1 .38 g 0 0 0 0 1.38 g 0 0 0 Casaminoácidos 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0 0 0.5 g 0 0 0 (Difco) pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 Agarosa de bajo 5.5 g 5.5 g 0 5.5 g 5.5 g 0 0 0 0 0 0 0 0 EEO (Sigma) Phytagel (Sigma) 0 0 3.0 g 0 0 0 0 0 0 3.0 g 0 0 0 Phytagar (Gibco) 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 6 6 CUADRO 1 (CONTINUACION) Aditivos post-tratamiento en autoclave Carbenicilina 500 500 500 500 500 50 mg 50 mg 500 mg 100 50 mg (Phytotech) 500 mg 250 mg 00 mg mg mg mg mg mg mg Acetosiringona 200 200 200 200 uM 0 0 0 0 0 (Aldrich) 0 0 0 0 uM uM uM 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 BAP (Sigma) 0.02 0 0.01 mg 0 3.5 mg 0 0 mg mg mg mg mg mg mM Glifosato (Gateway 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Chemical) Nitrato de plata 3.4 mg 3.4 mg 3.4 mg 3.4 mg 3.4 mg 3.4 mg 3.4 mg 0 0 0 0 0 (Sigma) 0 Acido abscisico 0 0 0 0 0 0 0 0 0.26 mg 0 0 0 0 * 1000X la existencia contienen ácido nicotinico - 1.25 g; clorhidrato de piridoxina 0.25 g; clorhidrato de tiamina 0.25 g; pantotenato de calcio 0.25 g. 00 EJEMPLO 2 Desarrollo eficiente de sectores transqénicos sin presión de selección durante la proliferación de callos Se desarrolló un sistema para la regeneración eficiente de plantas transgénicas en ausencia de un agente de selección. Después del co-cultivo de un explante con Agrobacterium (4 días en medio Lynx 1898, cuadro 1 ), la proliferación de callos comenzó en Lynx 1316 (cuadro 1 ), por 10 a 14 días, sin selección. Después, la pre-regeneración de tejido calloso se realizó por 10 días en medio Lynx 1844 (cuadro 1 ), seguido de regeneración en Lynx 1344 (cuadro 1 ) por 10 días, y Lynx 1471 por 3 semanas (cuadro 1 ). Todos los pasos, salvo el cultivo en Lynx 1471 , se realizaron sin el uso de un agente selectivo; de esta manera, el crecimiento de callos y la regeneración de plantas ocurrieron sin un agente selectivo por aproximadamente 4 semanas después del co-cultivo. El crecimiento de plantas en regeneración en el último paso, en Lynx 1471 , se realizó en presencia de un bajo nivel de glifosato (0.02 mM, en v/v) para estimar la frecuencia de transformación posible máxima. Antes de transferir los tejidos a medios Lynx 1471 , 24 callos derivados de embriones independientes y tejidos asociados fueron teñidos para actividad de GUS a 4 semanas post-transformación. Se identificaron cuatro brotes positivos para GUS, demostrando de esta manera una eficiencia de transformación de aproximadamente 16%. Más crecimiento de las plantas se logró transfiriendo los tejidos a Lynx 1471 en Phytatrays, y se regeneró un total de 43 eventos transgénicos, todos los cuales sobrevivieron después de la transferencia a suelo. La transformación y el análisis del número de copias se muestran en el cuadro 2. Aproximadamente 14% del total de plantas que sobrevivieron fueron escapes, pero aproximadamente 45% de las plantas fueron transformadas con 1 a 2 inserciones. El análisis histoquímico de líneas de callos en regeneración representativas, 5 semanas post-transformación, se muestra en la figura 2.

CUADRO 2 La transformación eficiente usando selección sólo durante el últi paso de la regeneración de plantas, indica formación eficiente de sectores transformados sin selección EJEMPLO 3 Experimentos adicionales de regeneración y transformación del maíz, e identificación de plantas transformadas putativas Se realizaron tres estudios más para confirmar que la regeneración eficiente de sectores transgénicos fue habitualmente posible sin la aplicación de selección en etapa alguna. El plásmido usado fue pMON93040, descrito anteriormente. Después de co-cultivo en Lynx 1898 por 1 día, se realizó proliferación de callos en Lynx 1316 por 10 días, pre-regeneración en Lynx 1844 por 10 días y regeneración en Lynx 1344 por 3 días, seguido de crecimiento en Lynx 1607. Una mazorca de maíz individual se usó para aislar los embriones de cada experimento, y los embriones variaron en tamaño de 2.8 a 3.2 mm. En dos de los estudios, se realizó inoculación de los embriones directamente aislando embriones en suspensión de Agrobacterium a D.0.66o = 1 0, mientras que en el otro estudio se aislaron primero embriones en 1 mi de medio Lynx 1013 líquido (1 litro: sales básales MS (Phytotech): 2.165 g; vitaminas MS (100X; Phytotech): 10 mi; sacarosa (Phytotech): 68.5 g; prolina (Fisher): 0.1 15 g; glucosa (Phytotech) 36 g. Se ajustó el medio a pH 5.4 con KOH, y se esterilizó por filtración), seguido de inoculación usando una suspensión de Agrobacterium a D.O.66o = 1 .0. Los resultados de los estudios se enlistan en el cuadro 3.

CUADRO 3 Transformación adicional del maíz sin selección # de plantas # de plantas # de eventos/100 Experimento # de IES en tapones de positivas para plantas (estimado) crecimiento GUS/CP4 6688-2 1 10 (48)* 230 8 3.5 6698-2 10 (52)* 240 9 3.8 6700-2 100 (50)* 253 20 7.9 Promedio/100 plantas 5.1 * Los datos entre paréntesis indican el número de embriones respondedores; aproximadamente 50% de los embriones respondieron al cultivo. "# de IES" = número de embriones inmaduros inoculados.

Al final del ciclo de regeneración, las plantas de cada experimento fueron transplantadas en tapones de crecimiento, y más de 95% de las plantas sobrevivieron a la transferencia, demostrando que los tapones de propagación ofrecen una forma mejorada de manejar grandes números de plantas. Aproximadamente diez días post-transplante, discos foliares de plantas individuales fueron puestos a prueba para actividad de GUS usando tinción histoquímica, y plantas positivas para GUS fueron transplantadas para más crecimiento y análisis histoquímico. Para demostrar mejor la frecuencia de transformación y para mejorar la eficiencia general del protocolo, se desarrolló un sustituto de un tamiz basado en PCR, por el cual se aplicó WeatherMax™ (glifosato) a 1 % a plantas negativas para GUS. Se identificaron otras cinco plantas tolerantes a glifosato (3 del experimento 6700-2, 1 del experimento 6698-2 y 1 del experimento 6688-2 (véase la figura 3 para plantas representativas). Se obtuvo un total de 37 plantas de 723 plantas en los tapones de crecimiento, dando un índice de éxito de 5% estimado sobre una base por planta (cuadro 3). Los resultados de transformación sin selección, usando embriones inmaduros, demuestran que el procedimiento es eficiente, con una frecuencia de transformación de 5% promedio basada en el número de plantas identificadas. Para demostrar mejor la reproducibilidad del protocolo de transformación sin selección, y para mejorar la eficiencia general del protocolo, se desarrolló un sustituto para un tamiz basado en PCR, por el cual se aplicó WeatherMax™ (glifosato) a 1 % después del término de la fase de regeneración que se llevó a cabo sin selección en PHYTATRAYs. Los resultados se muestran en los cuadros 4 y 5.

CUADRO 4 Transformación eficiente y reproducible del maíz sin selección CUADRO 5 Recuperación eficiente de eventos con inserciones de menor número de copias a partir de transformación sin selección # de eventos que # de sobrevivieron en Total (1 a 2 Experimento embriones tapones de copias) inoculados crecimiento 6705-1 130 9 7 (77.7%) 6705-2 140 7 2 (28.6%) 6706-3 1 10 35 29 (82.9%) 6829-1 100 27 18 (66.7%) CUADRO 5 (CONTINUACION) Los resultados indican que de un total de 900 embriones, se obtuvieron 141 plantas tolerantes a glifosato, incluyendo 100 con menor número de copias (1 a 2 copias) del gen de interés, es decir, un promedio de aproximadamente 15% de TF con base en el número de embriones inmaduros inoculados. Otro examen (cuadro 6) mostró que, de los 90 eventos identificados por análisis Southern de los 100 eventos de bajo número de copias mostrados en el cuadro 5, estuvieron presentes 79 eventos de integración independiente. Eventos hermanos son eventos con el mismo patrón de bandas, y provienen de los mismos explantes. Una mayor frecuencia de transformación lleva a un mayor porcentaje de eventos transgénicos con eventos hermanos. Sin embargo, la frecuencia fue muy baja, y el análisis Southern reveló que aproximadamente 5% exhiben clonalidad, especialmente cuando la TF es >30% (cuadros 5 y 6).

CUADRO 6 Eficiencia de transformación sin selección - número de eventos de integración independiente producidos EJEMPLO 4 Confirmación de la integración cromosómica de un ADN transferido después de transformación y regeneración sin presión selectiva Se aisló ADN genómico de hojas de plantas Ro, por ejemplo, usando procedimientos descritos por Dellaporta (1983). ADN genómico (20-30 pg) fue digerido con H/ndlll, separado sobre un gel de agarosa a 0.7% (en p/v) y transferido a membranas de nylon cargadas positivamente (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN). Se llevaron a cabo pre-hibridación, hibridación, lavado y detección de las membranas, usando un sistema no radiactivo basado en DIG (Roche Molecular Biochemicals) siguiendo los protocolos del fabricante. La secuencia de ADN del gen de CP4 fue marcada mediante PCR para producir sondas. La enzima Hind\\\ corta una vez en el vector (cerca del extremo 5' del cassette de expresión de CP4; por lo tanto, el número de bandas mediante Southern blot corresponde al número de copias del gen de CP4. Se realizó análisis Southern en plantas seleccionadas descritas en el cuadro 3 (es decir, se seleccionaron 22 eventos de menor número de copias). Datos representativos del análisis Southern de plantas R0 se muestran en la figura 4. El análisis reveló que se produjeron ocho eventos (una sola copia, negativo para oriV) de la población de 37 eventos producidos a partir de 320 embriones (cuadro 3). Para confirmar mejor la transmisión de la línea germinal a la siguiente generación, plantas R0 fueron cruzadas con la línea de maíz endógama no transformada progenitora. En este estudio, se usaron plantas Ri de tres líneas independientes; ZM_187694 (4 copias-cp4); ZM_189983 (0 copias, cp4 - un evento truncado de cp4 posible); ZM_187738 (3 copias -cp4). El análisis histoquímico de la expresión de GUS de las mazorcas en desarrollo indicó una relación de 1 :1 de granos positivos a granos sin expresión, indicando la transmisión de la línea germinal del transgen y ligamiento (figura 5). Este resultado confirma la transmisión de la línea germinal de un transgen usando eventos transgénicos producidos sin selección. La progenie de tres eventos independientes adicionales, ZM_187692, ZM_18997 y ZM_18998, se analizó también mediante análisis Southern blot usando el gen de CP4 como sonda (figura 6), mostrando que todas la progenies derivadas de tres plantas R0 diferentes mostraron el patrón esperado, es decir, transmisión estable del evento transgénico a la siguiente generación.

EJEMPLO 5 Manejo eficiente de las plantas Un método para el manejo eficiente de plantas múltiples, es un componente importante de un sistema eficiente de transformación de plantas que no usa un agente selectivo antes de la obtención de una planta regenerada. Esto es porque puede ser necesario identificar un gran número de plantas para identificar plantas transformadas con adecuado número de copias y complejidad de inserciones, así como la expresión del GOL Este "manejo" (por ejemplo, transferencia o transplante a medios o suelo para mayor crecimiento; y mantenimiento de la identidad durante los pasos de la identificación), permite que plántulas múltiples sean procesadas dentro de un contenedor que contiene a los tapones de crecimiento o tubos de cultivo individuales, mientras que mantiene la identidad individual de las plantas, y facilita también la captura de datos sin la marcación de plantas individuales. La combinación de plantas en crecimiento en "tapones hortícolas", pasando por alto la marcación de plantas individuales, y el desarrollo de un protocolo para capturar datos de prueba para identificar y avanzar los eventos deseados, facilita la línea de transformación basada en no selección durante la regeneración y transferencia de genes. En resumen, la presente invención se refiere al desarrollo de un sistema eficiente de transformación de plantas sin selección, manejo de plantas y captura de datos. Plantas putativamente transformadas, regeneradas de callos que han sido co-cultivados con una cepa de Agrobacterium que comprende un gen de interés, pueden ser transplantadas, por ejemplo, de un Phytatray™ en suelo en tapones de crecimiento. El uso de estos tapones puede modernizar el muestreo y el análisis de las plantas, y ahorrar espacio para el crecimiento.

Por ejemplo, los tapones son dispuestos en un patrón que corresponde a las cavidades, por ejemplo, de una placa de microtítulo de 96 cavidades (véase, por ejemplo, la figura 7), si pruebas de muestras de las plantas se van a realizar en dichas placas de microtítulo. Esto permite la fácil identificación de plantas que exhiben un fenotipo de prueba de interés, sin la necesidad de marcar plantas individuales. La eliminación temprana de plantas que no comprenden el GOI se logra mediante un tamiz basado en PCR u otro tamiz molecular, mientras que las plantas están siendo regeneradas en PHYTATRAYs en medios semisólidos o líquidos, y antes del transplante de las plantas a tapones de crecimiento o suelo.

EJEMPLO 6 Medios semisólidos para cultivo durante la regeneración de plantas transformadas Medios semisólidos para cultivo durante las fases de crecimiento de callos, pre-regeneración y regeneración del procedimiento de cultivo de tejidos y transformación, permiten la manipulación eficiente de tejidos. La figura 8 resume un estudio de transformación llevado a cabo sin un agente selectivo (panel inferior), en comparación con un estudio paralelo en donde se hizo crecer tejido de la planta en presencia de un agente selectivo (panel superior). Véase los cuadros 1 y 7 para componentes de los medios. Las fases de proliferación de callos, pre-regeneración y regeneración se llevaron a cabo en medios semisólidos, según se muestra. Después de la segunda fase de regeneración, las plantas son transplantadas en tapones de crecimiento y puestas a prueba para la presencia de un GOI.

CUADRO 7 Composiciones de los medios usados en un método previo que comprende medios de selección semisólídos que contienen glifosato (véase Cai ef a/.; solicitud de patente de E.U.A. publicación 2004/00244075) Componentes de 1073 1071 1233 1278 1084 los medios/L (1 a. (2a. (co-cultivo) (selección) (enraizamiento) (proveedores) regeneración regeneración) Sales básales MS 2.165 g 4.33 g 4.33 g 4.33 g 2.165 g (Phytotech) Vitaminas MS (100X) 10 mL 10 mL 0 0 0 (Phytotech) Vitaminas MSFromm 0 0 1 mL 1 mL 0 (1000X)* BAP (Sigma) 0 0.01 mg 3.5 mg 0 0 Clorhidrato de tiamina 0.5 mg 0.5 mg 0 0 0 (Sigma) 2,4-D (Phytotech) 3 mg 0.5 mg 0 0 0 NAA (Sigma) 0 0 0 0 0.5 mg IBA (Sigma) 0 0 0 0 0.75 mg Sacarosa (Phytotech) 20 g 30 g 30 g 0 20 g Glucosa (Phytotech) 10 g 0 0 10 g 0 Maltosa (Phytotech) 0 0 0 20 g 0 Prolina (Sigma) 1 15 mg 1 .38 g 1 .38 g 0 0 Casaminoácidos 0 0.5 g 0.05 g 0.5 g 0 (Difco) CUADRO 7 (CONTINUACION) "Comprendiendo 1250 mg/L de ácido nicotínico (Sigma), 250 mg/L de clorhidrato de piridoxina (Sigma), 250 mg/L de clorhidrato de tiamina (Sigma) y 250 mg/L de pantotenato de calcio (Sigma).

EJEMPLO 7 Cultivo líquido durante la regeneración de plantas transformadas El cultivo líquido durante las fases de crecimiento de callos, pre-regeneración y regeneración del procedimiento de cultivo de tejidos y transformación, permite la manipulación eficiente de los tejidos. Las figuras 9A-9B ilustran estudios de transformación y regeneración llevados a cabo sin un agente selectivo antes de la regeneración. Las fases de proliferación de callos, pre-regeneración y regeneración, se llevaron a cabo en medios líquidos libres de glifosato, según se muestra. Después de la segunda fase de regeneración, que puede ocurrir en forma alternativa en un medio semisólido, las plantas fueron transplantadas en tapones de crecimiento. Pueden combinarse pruebas histoquímícas de GUS con tamices basados en PCR u otros tamices, tales como un tamiz sustituto con, por ejemplo, glifosato, para detectar la expresión de, por ejemplo, tolerancia a glifosato en el tejido de la planta regenerada. Estos experimentos se llevaron a cabo usando un vector sin un gen marcador (es decir, pMON97372) o con un gen marcador (pMON93040). El plásmido para el estudio ilustrado en las figuras 9A-9B fue pMON93040 que contenía genes de cp4 y gus. Embriones de cada mazorca se aislaron en cajas de Petri con 1 mi de medio Lynx 1013 líquido, y se co-cultivaron en Lynx 1947. Los embriones se dividieron entre varios tratamientos como se muestra en el cuadro 8 siguiente, incluyendo 8 semanas con selección (tratamiento 1 ); 8 semanas sin selección, cultivo líquido, con crecimiento en medio sólido en PHYTATRAY (tratamiento 2); y 8 semanas sin selección, cultivo líquido, con crecimiento en medio líquido en PHYTATRAY (tratamiento 3). La transformación no usando selección fue bastante eficiente (~ 1/3 X) en comparación con la que se logró usando selección. Un resumen de los resultados del método de "tapón líquido" se muestra en el cuadro 8. Cuando una pequeña muestra de explantes se llevó hacia adelante usando sólo cultivo líquido (es decir, tratamiento número 3, usando Lynx 2168 como el medio de crecimiento final), la eficiencia fue mayor y casi tan alta como la que se obtuvo con selección. El cultivo líquido parece promover la regeneración más eficiente de eventos transgénicos como es evidente del cuadro 9. Es probable que la eliminación del subcultivo reduzca el estrés y apresure la regeneración de las plantas.

CUADRO 8 Transformación eficiente usando el "esquema de tapón líquido" y sin el uso de selección #de # de lEs Tamaño Experimento # Tratamiento explantes con % de TF del IE (lEs) eventos 7530-1 2.5-2.8 30 14 46.7 Selección en 7531-1 1.9-2.1 30 16 53.3 tapón liquido - 7532-1 1.9-2.2 30 4 13.3 8 semanas 7533-1 2.5-2.8 30 7 23.3 Total 120 41 34.2 7529-1 Transformación 2 60 5 8.3 7530-2 sin selección 2.5 -2.8 88 16 18.2 7531-2 usando cultivo 1.9-2.1 68 13 19.1 líquido con un paso de PHYTATRAY 7532-2 + examen de 1.9 - 2.2 127 11 8.7 rocío de glifosato Total 343 45 13.1 7530-3 Transformación 2.5 - 2.8 21 9 42.9 7531-3 sin selección 1.9 - 2.1 18 10 55.6 usando cultivo líquido con examen de rocío de 7532-3 glifosato 1.9-2.2 22 4 18.2 después del transplante en tapones de crecimiento Total 61 23 37.7 CUADRO 9 Eficiencia de transformación relacionada con la eficiencia de regeneración # de # de lEs # de plantas en # de % de Tratamiento explantes con tapones de eventos/100 TF (lEs) eventos crecimiento plantas 7530- Transformación sin selección usando 21 9 42.9 208 4.3 7531 - cultivo líquido con examen de rocío de 18 10 55.6 208 4.8 7532- glifosato después del transplante en 22 4 18.2 208 1 .9 3 tapones de crecimiento Total 61 23 37.7 624 3.7 EJEMPLO 8 Eficiencia de transformación relacionada con la duración de la fase de proliferación de callos La función de la duración de la fase de proliferación de callos sobre la frecuencia de transformación, se ilustra en el cuadro 10. La reducción de la duración de la fase de proliferación de callos mejoró la TF, produciendo plantas más rápido.

CUADRO 10 La fase de proliferación de callos más larga tiene un impacto negativo sobre la transformación sin selección EJEMPLO 9 Transformación y regeneración usando cultivo líquido rápido sin selección Para modernizar más el procedimiento, se desarrolló un protocolo de ciclo de cultivo líquido rápido (RLC), de 6 semanas de duración, en donde se omitió el paso de proliferación de callos (Lynx 2133). Los pasos en el esquema de transformación incluyeron: fases de pre-regeneración (Lynx 2197) y fases de regeneración (Lynx 2168 y Lynx 1607, por ejemplo, figuras 9A-9B y cuadro 1 1 ). Para este estudio se usó pMON93040, que contenía genes de Cp4 y gus. Embriones de cada mazorca se aislaron en una caja de Petri con medio líquido (Lynx 1013), se co-cultivaron en medio Lynx 1947, y se dividieron entre los tratamientos mostrados en el cuadro 1 1 . Los tratamientos incluyeron comparación de la TF de los embriones con o sin selección, y comparación del efecto de 1 ó 2 semanas en medio de proliferación Lynx 2197. Como se muestra en el cuadro 1 1 , una reducción de la duración en el medio de proliferación Lynx 2197 afectó la TF. Sin embargo, la transformación sin selección resultó en una TF comparable a la TF lograda usando selección cuando se usó una duración de crecimiento óptima en el medio de pre-regeneración.

CUADRO 11 Transformación eficiente usando el protocolo de cultivo líquido rápido, sin selección # de # de plantas para Eventos/ Experimento # de lEs con % de Tratamiento explantes tapones de 100 # eventos TF (lEs) crecimiento plantas 7962-3 Selección - 6 semanas en 65 37 56.9 7963-1 cultivo líquido 65 16 24.6 N/A N/A Total: selección - 8 semanas en cultivo líquido 130 53 40.8 7965-1 6 semanas sin selección con 2 60 27 45.0 548 4.9 7963-2 semanas en Lynx 2197 60 18 30.0 342 7 Total: sin selección - 2 semanas en Lynx 2197 120 45 37.5 890 5.1 7965-1 6 semanas sin selección con 1 60 12 20 493 2.4 7963-2 semana en Lynx 2197 60 13 21 .7 274 4.7 Total: sin selección - 1 semana en Lynx 2197 120 25 20.8 767 3.2 En estos experimentos, la duración de las fases de proliferación de callos, pre-regeneración y regeneración fue reducida aún más, y el uso de selección se comparó con el crecimiento en medios no selectivos. La reducción en los pasos requeridos del manejo de tejidos, hace más que este método sea sujeto a automatización (véase también el cuadro 15). Una comparación del nivel de expresión de plantas seleccionadas obtenidas como se describió anteriormente, reveló niveles de expresión comparables (cuadro 12) después de la prueba basada en PCR para la señal de terminación de la transcripción pinll 3'.

CUADRO 12 Análisis de expresión de plantas agrupadas por número de copias del transgen Un resumen de la línea de tiempo del protocolo de cultivo líquido rápido sin selección, se da en el cuadro 13.

CUADRO 13 Protocolo de cultivo líquido rápido sin selección Para validar los resultados anteriores con base en el protocolo descrito en el cuadro 13, se llevaron a cabo tres experimentos usando transformación con pMON93040. Se dividió a los embriones entre varios tratamientos como se muestra en el cuadro 14. En estos experimentos, se realizaron pruebas de GUS en plántulas; no se roció glifosato. Embriones de cada mazorca se aislaron en una caja de Petri con 1 mi de medio Lynx 1013 líquido, y se co-cultivaron en Lynx 1947. Como es evidente de los resultados, la transformación no usando selección es bastante eficiente (>60%) en comparación con la lograda usando selección.

CUADRO 14 El protocolo de transformación rápida funciona eficientemente con selección y sin selección # de Promedio # de # de Eventos/ Desviación Experimento # Tratamiento explantes TF (%) de eventos plantas 100 plantas estándar (lEs) plantas/IE 8105-4 55 24 43.6 RLC, con 8106-4 80 34 42.5 selección N/A 8107-4 60 27 45 Promedio 195 85 43.6 8108-1 75 23 30.7 347 6.6 3.3 5.5 RLC, sin 8108-2 60 18 30 387 4.7 3.5 6.5 selección 8108-3 60 14 23.3 373 3.8 3.3 7.2 Promedio 195 55 28.2 369 5 3.4 6.4 Para entender mejor la naturaleza de la proliferación de células y su efecto sobre la transformación sin selección, se llevaron a cabo otros experimentos usando dos diferentes medios de co-cultivo (Lynx 1947 con 0.5 mg/l de 2,4-D y Lynx 2232 (con 0.2 mg/l de 2,4-D). Embriones de cada medio de co-cultivo fueron divididos igualmente en dos grupos y transferidos a medio de pre-regeneración (con 0.2 mg/l de 2,4-D - Lynx 2197) o medio de regeneración (sin regulador de crecimiento alguno - Lynx 2282). Se llevaron a cabo cinco experimentos (84 5-8419) usando un vector de transformación sin marcadores (pMON97372) que contenia sólo el gen uidA. Un esbozo del procedimiento experimental se da en las figuras 9A-9B. Después del establecimiento de las plantas en tapones de crecimiento, plantas de cada una de las líneas derivadas de embriones fueron agrupadas y teñidas para GUS para identificar líneas positivas. Después, se realizó más tinción de GUS de líneas individuales a partir de los clones positivos para identificar eventos positivos para GUS. Aproximadamente una quinta parte de los embriones de cada mazorca fue inoculada por separado con un vector uidA+cp4 control (pMON97367) y se siguió el protocolo de RLC (véase, por ejemplo, el cuadro 1 3) para comparar los resultados de transformación con y sin selección (experimento 8420). Los resultados de estos experimentos se resumen en los cuadros 1 5 y 16.

CUADRO 15 Transformación eficiente sin selección usando un vector de gus (pMON 97372) % de TF # total de (con base % de TF # de plantas # de lEs Experimento Tamaño # para en el (con base Tratamiento explantes para con # del IE Phytatrays número en el # de (lEs) tapones de eventos para Phytatrays) crecimiento selección) 2.3 60 30 273 9 15 30 8415-1 2 60 37 273 9 15 24 8416-1 2.4 60 42 281 3 5 7.1 Co-cultivo en Lynx 1947 - 1 .9 60 40 342 8 13.3 20 8417- 1 1 a. regeneración 8418- 1 en Lynx 2197 2.1 60 37 405 7 1 1 .7 18.9 8419- 1 Total 300 186 1574 36 12 19.4 CUADRO 15 (CONTINUACION) 2.3 60 34 8415-2 295 9 15 26.5 2 60 34 274 7 11.7 20.6 8416-2 2.4 60 45 290 Co-cultivo en 7 11.7 15.6 Lynx 1947 - 1.9 60 34 232 9 15 26.5 8417-2 1a. regeneración 8418-2 en Lynx 2282 2.1 60 41 445 5 8.3 12.2 8419-2 Total 300 188 574 37 12.3 19.7 8416-3 2 45 36 398 7 15.6 19.4 Co-cultivo en 2.4 45 28 239 3 6.7 10.7 8417-3 Lynx 2232 - 1.9 45 22 276 5 11.1 22.7 1a. 8418-3 regeneración en Lynx 2197 2.1 40 37 256 4 10 10.8 8419-3 Total 175 123 1169 37 10.9 15.4 CUADRO 15 (CONTINUACION) 8416-4 2 45 28 297 2 4.4 7.1 Co-cultivo en 2.4 45 30 208 4 8.9 13.3 841 7-4 Lynx 2232 - 1 .9 45 33 226 4 8.9 12.1 1 a. 8418-4 regeneración en Lynx 2282 2.1 45 35 342 6 13.3 17.1 8419-4 Total 180 126 1073 16 8.9 12.7 CUADRO 16 Los experimentos de transformación usando pMON97367 con selección, indican que la transformación sin selección es eficiente Como es evidente del cuadro 15, se encontró que el medio de co-cultivo Lynx 1947 con mayor concentración de 2,4-D que Lynx 2232, es superior. Estos resultados indican que la proliferación de células antes de la regeneración contribuye a la obtención de transformación eficiente sin selección. Además, la regeneración de explantes en un medio libre de reguladores de crecimiento (por ejemplo, Lynx 2282) después de co-cultivo, no redujo apreciablemente el número de plantas/embrión. La comparación de la frecuencia de transformación con embriones que fueron transformados con pMON97367 usando el protocolo de RLC, demuestra que la transformación sin selección es eficiente. Además, el análisis del número de copias indica un mayor porcentaje de plantas con inserción de menor número de copias (cuadro 7).

CUADRO 17 La transformación sin selección resultó en mayor por ciento de eventos negativos para oriV de una sola copia Se piensa que la ausencia de selección y/o el ADN T más corto, podrían ser razones para el mayor por ciento de producción de eventos utilizables. Para los tratamientos sin selección, la escala preferida de tamaño del embrión es ligeramente mayor (2.0 a 2.3 mm) que la escala de tamaño del embrión (1 .9 a 2.1 mm) usada para RLC. La validación mediante hibridación Southern de aproximadamente 120 eventos (cuadro 17), indicó que todos los eventos son independientes. Esto enfatiza más el hallazgo temprano de que bajo baja TF (-15%), la mayor parte de los eventos producidos son eventos independientes, indicando que la adopción de una estrategia de agrupación antes del transplante a tapones de crecimiento, puede mejorar más la eficiencia del protocolo.

EJEMPLO 10 La identificación de plantas antes del transplante a tapones de crecimiento para eliminar plantas no transgénicas, mejora la eficiencia Plantas de un contenedor individual que contenía al medio de crecimiento final (Lynx 1607), fueron agrupadas y puestas a prueba para GUS usando la prueba de GUS histoquímica y la presencia del transgen usando PCR. Se obtuvo una correlación de 100% entre las pruebas de PCR y GUS. Este estudio permitió la eliminación de contenedores de crecimiento sin evento positivo, reduciendo ampliamente de esta manera la carga de manejo de plantas y mejorando el rendimiento. Todas las composiciones y/o métodos descritos y reclamados en la presente, pueden obtenerse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Mientras que las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en la presente, sin que se aparten del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos en la presente, y que se lograrían los mismos resultados o resultados similares. Se considera que dichos sustitutos similares y modificaciones evidentes para los expertos en la técnica, están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define mediante las reivindicaciones anexas.

REFERENCIAS Las referencias enlistadas a continuación se incorporan en la presente como referencia, al grado de que complementan, explican, proveen una base o enseñan metodología, técnicas y/o composiciones usadas en la presente. Patente de E.U.A. 5,362,865 Patente de E.U.A. 5,106,739 Patente de E.U.A. 5,107,065 Patente de E.U.A. 5,159,135 Patente de E.U.A. 5,569,834 Patente de E.U.A. 6,506,559 Solicitud de patente de E.U.A. Serie 09/423,143 Publicación de patente de E.U.A. 2002/0168707 A1 Publicación de patente de E.U.A. 20040244075 Publicación de patente de E.U.A. 2005/0097641 Bird et al., Biotech Gen. Engin. Rev. , 9: 207-227, 1991 . Broothaerts et al., Nature, 433(7026): 583-584, 2005. Chu et al., Scientia Sínica, 18: 659, 1975. Darbani et al., Biotechnol. J., 2: 83-90, 2007. De Vetten et al., Nat. Biotechnol., 21 : 439-442, 2003. Dekeyser et al., Plant Physiol., 90: 217-223, 1989. Della-Cioppa et al., Bio/Technology, 5: 579-584, 1987.

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Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- Un método para identificar plantas de maíz transgénicas, que comprende: (a) obtener células de la planta de maíz transformadas con un segmento de ADN que comprenda una secuencia de ácido nucleico de interés; (b) regenerar una pluralidad de plantas de maíz o partes de la planta de maíz diferenciadas de las células sin que primero se seleccionen para la presencia de dicho segmento de ADN; y (c) identificar por lo menos una primera planta de maíz transgénica o parte de la planta diferenciada, de la pluralidad de plantas de maíz o partes de la planta de maíz diferenciadas. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el segmento de ADN no comprende un marcador seleccionable o gen marcador visual. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las plantas se regeneran mediante crecimiento en medios sólidos, medios líquidos, o una combinación de medios sólidos y líquidos. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque las plantas se regeneran mediante crecimiento solamente en medios líquidos antes de la identificación de la planta de maíz transgénica o parte de la planta diferenciada transgénica. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la frecuencia de transformación de células cultivadas solamente en medios líquidos subsiguiente a la puesta en contacto de las células con un GOI y antes de la identificación de plantas transgénicas o partes de plantas transgénicas, se mejora respecto a la frecuencia de transformación observada cuando las células se cultivan en medios sólidos, medios semisólidos, suelo, o una combinación de medios sólidos, medios semisólidos, medios líquidos y/o suelo, subsiguiente a la puesta en contacto de las células con un GOI, y antes de la identificación de plantas transgénicas o partes de plantas transgénicas. 6. - El método de conformidad con la reivindicación , caracterizado además porque las células de la planta son células de embrión de maíz inmaduro. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque los embriones de maíz inmaduros son de aproximadamente 1 .5 mm a aproximadamente 3.5 mm en longitud. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque los embriones de maíz inmaduros son de aproximadamente 1 .9 mm a aproximadamente 2.3 mm en longitud. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende, entre los pasos (b) y (c), (1 ) poner la pluralidad de plantas de maíz o partes de plantas diferenciadas en tubos de cultivo o tapones de crecimiento que comprenden un medio de crecimiento o agua, mientras que se mantiene la identidad individual de las plantas de maíz; y (2) someter las plantas o partes de la planta a por lo menos una primera prueba para la presencia del segmento de ADN, para identificar una o más plantas o partes de la planta como transgénicas con base en los resultados de la prueba. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la prueba se selecciona del grupo que consiste de hibridación Southern, PCR, secuenciación de ADN, northern blotting, western blotting, un inmunoensayo, y una prueba para la actividad enzimática codificada por el segmento de ADN. 1 1. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la prueba se realiza antes de poner las plantas regeneradas en suelo. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque se identifican plantas de maíz putativamente transformadas o partes de plantas diferenciadas que carecen de la secuencia de ácido nucleico de interés, en donde la prueba se realiza en tejido de la planta que comprenda subgrupos agrupados de ácidos nucleicos de dicha pluralidad de plantas de maíz o partes de plantas diferenciadas. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las plantas de maíz o partes de las plantas de maíz se regeneran no más de 6 semanas después de que el segmento de ADN es transformado en las células de la planta de maíz. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las plantas de maíz o partes de las plantas de maíz se regeneran no más de 4 semanas después de que el segmento de ADN es transformado en las células de la planta de maíz. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las plantas de maíz o partes de las plantas de maíz se regeneran no más de 3 semanas después de que el segmento de ADN es transformado en las células de la planta de maíz. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las plantas de maíz o partes de las plantas de maíz se regeneran no más de 2 semanas después de que el segmento de ADN es transformado en las células de la planta de maíz. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las plantas de maíz o partes de las plantas de maíz se regeneran no más de 1 semana después de que el segmento de ADN es transformado en las células de la planta de maíz. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el segmento de ADN es introducido en las células de la planta de maíz mediante transformación mediada por bacterias, electroporacíón, transformación mediada por PEG o bombardeo de partículas. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la transformación mediada por bacterias es mediada por una célula bacteriana seleccionada del grupo que consiste de una célula de Agrobacterium, una célula de Rhizobium, una célula de Sinorhizobium y una célula de Mesorhizobium. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende el paso de someter una planta de maíz o parte de la planta de maíz derivada de la célula de la primera planta de maíz a condiciones de cultivo que seleccionan para, o que permiten la identificación para, la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico de interés después de la regeneración de una planta o parte de la planta. 21 . - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio de crecimiento es un medio sólido. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el medio de crecimiento es suelo. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la planta regenerada o parte de la planta diferenciada es uniforme con respecto a la presencia del segmento de ADN.