CN1206435A - 印度水稻的转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种能够高效地对印度水稻进行转化的方法。本发明方法是利用土壤杆菌法对印度水稻未成熟胚细胞进行转化,并用培养基对已转化的细胞进行筛选。该培养基含有KNO32000～4000mg/l、MgSO460～200mg/l、KH2PO4200～600mg/l、CaCl2100～450mg/l、(NH4)2SO4200～600mg/l、H3BO31～7mg/l、MnSO42～20mg/l、EDTA或其盐20～50mg/l、Fe3～8mg/l、肌醇50～200mg/l、2,4－二氯苯氧乙酸0.5～10mg/l、细胞分裂素类0.01～5mg/l及糖类5000～8000mg/l,以及胶凝剂,其pH值为4.5～6.5。
Description
技术领域
本发明是关于使用土壤杆菌法对水稻进行转化的方法。
技术背景
对于水稻转化方法，已开发有通过原生质体的电击穿(エレクトロポレ-シヨ ソ)法和PEG法，使用的是容易培养的日本水稻。然而，这种方法，仅适用于由原生质体而来的分化系已经确定了的品种，对于培养困难的印度水稻，适用实例却很少。
粒子枪(パ-テイクルガン)法，由于不需要原生质体培养系统，所以作为适用于多种品种的新型转化方法，已在很多研究机构内广泛采用。一般认为印度水稻品种培养困难，但其中，占印度水稻中的大部分，称作groupl的品种群[Glaszmann J．C．(1987)亚洲水稻品种的同工酶和分类(lsozymes andclassification of Asian rice varieties)The or Appl．Genet．74：21-30]培养很困难。但是，利用Christou等人报导的粒子枪法[Christoup．Ford，T．L．andKofron．M(1992)用于水稻的各种独立基因转移法的进展(The deve lopment ofa variety-independent gene-transfer method for rice)TIB TECH 10：239-246]对Groupl品种的转化效率，未成熟胚芽低到2-3％，其他研究组近年来也报导，对于印度水稻没有获得高效转化系(LiL．Rongda．Q．Kochko A．，Fauquet，C．and Beachy，R．N．(1993)使用生物分解法的一种改进的水稻转化系统(An improved rice transformation system using the biolistic method)，PlantCell Report 12：250-255)。
另一方面，土壤杆菌法，对于双子叶植物，作为既简便又稳定的转化方法已得到广泛采用。但到目前为止，一直认为土壤杆菌法不适用于稻科等单子植物(Potryk US 1．，(1990)对禾谷类作物的基因转移(Gene transfer tocereals)an assessment Bio／technology 8：535-542)。近几年才明确，对于单子叶植物的水稻也可以进行转化(WO 94／00977；WO 95／06722；HieiY．，Ohta，S．，Komari，T．and Kumashiro．T．(1994)水稻的有效转化，(Efficienttransformation of rice)(Oryza Sativa L．)由土壤杆菌和T-DNA界面的序列分析所引起(mediated by transformation by Agrobacteri um and Sequence analysisof the boundaries of the T-DNA)The Plant Journal 6：271-282]，作为一种有用的转化方法期待着今后的研究发展。
另一方面，Rance等人公开了一种从印度水稻的成熟种子诱导具有再分化能力的愈伤组织(カルス)的有效培养基NB[lann M．Rance I．M．等人，部分干燥成熟胚衍生的愈伤组织，一种显著改进印度水稻再生能力的简便处理法(Partial desiccation of mature embryo-derived calli，a simple treatment thatdramatically enhances the regeneration ability of indica rice)plant cellReports(1994)13：647-651]。但是，关于筛选NB培养基对转化细胞的效果没有研究。使用粒子枪法，Li等人报导了使用类似于NB的培养基(不含有NAA，BA及L-谷氨酰胺)，对日本水稻具有很高的转化效率(Li L．等人，(1993)使用生物分解法的一种改进水稻转化体系(An improved ricetransformation system using the biloisticm ethod)Plant cell Report 12：250-255)。但是，也报导了，对于印度水稻不能有效地获得转化体。Li等人对这种培养基在土壤杆菌法中的适用性没有研究。
如上所述，运用原生质体的方法，存在的问题是对于不能由原生质体确立再分化系统的品种，因而不适用。就粒子枪法的报导而言，到目前为止，对于像印度水稻这样的培养困难的品种，转化效率仍很低。
我们认为土壤杆菌法适合于作为印度水稻的转化方法。如上所述，使用土壤杆菌法对日本水稻进行转化的方法已为众人所知。本发明人对适用于日本水稻的方法，是否也适用于印度水稻进行了研究。
如WO94／000977及Hiei等人(1994)所报导，利用土壤杆菌对水稻进行转化的方法，首先考虑的是采用脱分化组织的方法。因此使用属于Groupl多种印度水稻，将土壤杆菌向愈伤组织引入基因进行试验。结果发现虽然很少，但得到了转化体。然而还不能确立具有再现性的转化系。使用愈伤组织进行转化时，必须把细胞分裂活性很高、且具有再分化能力的愈伤组织用作材料。然而，就培养困难的水稻品种而言，诱导适于导入基因的高细胞分裂活性的愈伤组织，也并非容易。因此，把愈伤组织作为试验材料时，适用品种的范围受到限定，我们认为使用培养困难的品种，不能很容易地获得转化体。
又考虑愈伤组织之外的其它部分，我们认为可采用未成熟胚作材料的方法(WO 95／06722，EP-A-0672752)。然而，把WO 95／06722或EP-A0672752中记载的对日本水稻有效的方法，原封不动用于印度水稻时，转化效率很低，且不能确立实用的转化系。
发明描述
因此，本发明的目的是提供一种对印度水稻能高效地进行转化的方法。
本发明者们经过大量研究，结果发现，按WO 95／06722、EP-A-0672752中记载的、用土壤杆菌属细胞对水稻未成熟胚细胞进行转化的方法，筛选转化细胞工序中所用的培养基，通过将上述Rance等人的NB培养基用作基本培养基，这样可使印度水稻达到很高的转化效率，并完成本发明。
即，本发明提供的印度水稻转化方法，其特征是利用土壤杆菌法对印度水稻未成熟的胚细胞进行转化，并筛选转化的细胞。在水稻转化方法中，作为筛选转化的细胞的培养基，使用如下成分的培养基，即，含有KNO32000-4000mg／l、MgSO460-200mg／l、KH2PO4200-600mg／l、CaCl2100-450mg／l、(NH4)2SO4200-600mg／l、H3BO31-7mg／l、MnSO42-20mg／l、EDTA或其盐20-50mg／l、Fe3-8mg／l、肌醇50-200mg／l、2，4-二氯苯氧基醋酸0．5-10mg／l、细胞分裂素类0．01-5mg/l和糖类5000-80000mg／l，以及胶凝剂，其pH值为4．5-6．5。
用过去的方法转化效率低、不能进行再现性地转化印度水稻，根据本发明可以高效率进行转化。
附图的简单说明
图1是本发明方法中可理想使用的超二元载体(Super binaryvector)PTOK162及PTOK233的结构示意图。
实施发明的最佳方式
供本发明转化方法的细胞是印度水稻的未成熟的胚细胞。作为印度水稻，虽没有特别限定，但在过去的技术中，对属于转化特别困难的Groupl(Glaszmann、上面所述)的品种，适当使用时能发挥出特别的能力。属于Guoupl的印度水稻品种中，可列举有1R8、1R24、1R26、1R36、1R54、1R64、1R72、新青矮1、南京11、水原258等，但并不仅限于这些。
本发明中，所谓未成熟胚是指在受粉后逐渐成熟过程中的未成熟种子的胚。本发明方法用的未成熟胚的阶段(成熟期)没有特别限定，可在受粉后任何时期采取，最好是受精2天以后。未成熟胚最好是近交系(インブレツド)和近交系之间的F1、近交系和自然受粉品种间的F1和市售F1品种的未成熟胚。而且，最好是胚中的胚盘细胞。未成熟胚在和土壤杆菌属细菌接触前没有必要进行脱分化处理。这里所说的脱分化处理是指将植物组织已分化的细胞，在脱分化培养基中进行培养以得到无秩序繁殖的愈伤组织等未分化状态细胞块而进行的处理。
转化中使用的土壤杆菌属细菌，可以使用具有Ti质粒或Ri质粒，过去用于双子叶植物转化的细菌。其大多数具有来自根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti质粒的病毒(ウィルレ ンス)领域(vir领域)，该病毒领域含原来DNA领域的载体。承担付与植物形质的基因插入到该载体中，或者是这种所谓载体存在于别的质粒中，通过相同重组等在活体内使之插入到Ti质粒中。小鞠等人开发了一种载体，含有来自以下领域的DNA领域，即，在称作根瘤土壤杆菌A281的强病原性的、转化效率极高的株(Hodd，E．E．等人，1984；生物技术(Biotech)2：702-709、Hood，E．E．等人，1986；细菌学(J．Bacterilo．)168：1283-1290、Komari，T．等人．，1986；J．Bacteriol．166：88-94、Jin．S．等人．，1987；J．Bacteriol．169：4417-4425、Komari，T．，1989；植物科学(Plant Science)60：223-229、ATCC(37349)中所含的Ti质粒pTiBo542的病毒(ウィルレンス)领域(vir领域)(特开平4-222527号)。本发明把在根瘤土壤菌A281中所含的Ti质粒pTiBo542的病毒领域、土壤杆菌属细菌的Ti质粒或Ri质粒的T-DNA的左边缘和右边缘构型，及位于左边缘和右边缘之间所希望的基因的载体，称之为“超二元载体”。本发明能理想地使用这样的超二元载体。
作为这种超二元载体的实例，有pTOK162(特开平4-222527号、美国专利5591616、EP-A-0604662)。该构造示于图1。这种质粒是可在大肠菌和根瘤土壤杆菌中繁殖的称作pTOK154的质粒(由Ti质粒诱导的公知的pGA472质粒和由称作pVCK101的公知的广寄主范围质粒，利用后述方法构建的含T领域的质粒)中，组合进来自pTiBo542的病毒(ウィルレンス)领域的已克隆(クロ-ン)化的上述15．2kb的kpnl片段含(virB、VIRg、virC各种基因)。该pTOK154中排列着T领域的2个边界序列并要在其间导入印度水稻的耐卡那霉素的基因。该例是在含有来自pTiBo542病毒领域的已克隆化的DNA片段的质粒上，配置往印度水稻中要导入的遗传基因的实例。将从pTOK162和pGL2-1G诱导而来的耐潮霉素的基因(hpt)和付与蓖麻(ヒマ)的内含子(イントロン)的GUS基因，通过相同重组组入pTOK162的T-DNA领域中，得到的pTOK233(Hiei et al．上述)，也是一种理想的超二元载体。pTOK233的构造与图1所示相同。
要组入印度水稻中的所希望的基因，可以用常规方法组入到上述质粒的T-DNA领域中的限制酶的部位上，可根据质粒具有的耐药性等适当选择的标志(marker)进行选择。像图1所示的pTOK162那样，大型的，具有多个限制部位的，以通常的亚克隆化(サブクロ-ンニング)方法将所希望的DNA导入到T领域内有时也不一定容易。在这种情况下，通过利用根瘤土壤杆菌细胞内的在活体内进行相同重组(Herrera-Estrella，L．等人，1983；EMBOJ．2：987-995、Horsch，R．H．等人，1984；Science 223：496-498)，能够将目的DNA导入到pTOK162中。即，例如，首先，将pTOK162导入根瘤土壤杆菌中，再将这种菌导入已导入所希望DNA的称为pBR322的质粒(含有类似的质粒)中。pTOK162的DNA中，由于具有和pBR322相同的部分，所以通过相同排列的重组能将pBR322诱导体组入到pTOK162中。pBR322不同于pTOK162，在根瘤土壤杆菌中，由于不能复制，如果不是这种组入状态(称为pTOK162∷pBR322诱导体)，就不可能在根瘤土壤杆菌中生存。同样，如果对pTOK162和pBR322诱导体的各种特异性(耐药剂性等)进行选择，就能获得具有pTOK162∷pBR322诱导体的根瘤土壤杆菌。进而在研究将各种质粒导入到具有pTOK162的根瘤土壤杆菌中时，发现作为pBR322诱导体的筛选标志，最好来自转座子(トランスポゾン)Tn7(DeGreve，H．H．等人，1981；Plasmid 6：235-248)的耐奇霉素基因子(SP)。因此，所希望的基因已被克隆到pBR322中的情况下，如果将SP基因插入到它的质粒内，通过根瘤土壤杆菌内的相同重组，可以将所希望的基因导入到pTOK162的T领域内。在其它情况下，可考虑先准备由来自pBR322的DNA和SP基因构成的质粒，再将所希望的基因插入该质粒中的方法。这时，若运用T领域的边界排列，最终，在pTOK162上，也能将耐卡那霉素基因和所希望的基因配置在各个T领域中。将耐卡那霉素作为标志对植物进行转化的情况下，在两个T领域都导入时也能以相当的比例发生，所以目的基因完全能导入进去。另外，由于两个T领域有时也能组入到不同的染色体内，所以以后从耐卡那霉素基因分离目的基因也是可能的。
作为成为寄主的土壤杆菌细菌，虽没有特殊限定，但优选使用根瘤土壤杆菌。
将质粒导入到根瘤土壤杆菌等的土壤杆菌类细菌中的操作可按通常方法进行。例如可按细菌的三系杂交法(Ditta，G．等人，1980；Pro．Natl．Acad．Sci．USA77：7347-7351)进行。
这样调制的土壤杆菌属细菌中，由于含有来自pTOK162的病毒(ヴィルレ ンス)能力很高的DNA，所以能高效率地进行印度水稻的转化。
另外，本发明中，导入印度水稻中的基因，和现有技术一样，是被配置在T领域边界排列之间的，但在土壤杆菌属细菌中，可以配置在Ti质粒上，也可以配置在其它质粒上。
使用土壤杆菌属细菌对印度水稻未成熟胚进行转化的方法，可以通过使未成熟胚单独与土壤杆菌属细菌接触的方法进行。例如，配制细胞浓度为106-1011个细胞／ml的土壤杆菌属细菌悬浮液，将未成熟胚在该悬浮液中浸泡3-10分钟后，再在固体培养基上进行共存培养数天。在转化中的未成熟胚，没有必要在2，4-D存在下进行培养等的脱分化处理。
进行转化的未成熟胚，随后最好在脱分化状态下进行转化细胞的筛选、繁殖。筛选可根据上述所希望基因的发现和标志(耐药性等)进行。脱分化状态的细胞，最好是具有正常个体再生能力的愈伤组织。
本发明的方法是将转化细胞的筛选，在具有上述组成和pH值的培养基上进行。作为上述组成中作为细胞分裂素类的最好实例，有6-苯甲基氨基嘌呤。作为上述组成中糖的最好实例，有麦芽糖、蔗糖和葡萄糖，及它们的混合物。作为胶凝剂，有琼脂、琼脂糖、牻牛儿树胶(ゲランガム)等。这些都是使培养基胶凝化的物质，其配合量可按能胶凝化的适当量，对此没有特殊限定，通常为2-10g／l。优选使用含有如下组成的培养基，即在上述组成中再至少添加K10．5～2mg／l、ZnSO40．7～5mg／l、Na2MoO40．1～0．3mg／l、CuSO40．01～0．02mg／l、CoCl20．01～0．02mg／l、烟酸0．25～10mg／l、维生素B60．25～5mg／l、和维生素B10．05～20mg／l。在该组成中再至少添加酪蛋白氨基酸(カザシ)100～3000mg／l、脯氨酸100～3000mg／l、谷氨酸100～3000mg／l、和α-萘乙酸0．01～5mg／l也是优选使用的培养基。还可以使用，在上述各组成中再添加1000～60000mg/l糖醇的培养基。作为糖醇的最好实例，有甘露醇和山梨糖醇。另外，在根据耐药性进行筛选时，当然除上述组成以外要含有该药剂。筛选最好进行2-5次。这种情况下，一次筛选的时间最好为2-3周、二次筛选时间最好2周。进行多次筛选时，虽然任何一次筛选都是在上述培养基上进行，但也可以在上述范围内成分含量不同的培养基上进行筛选。
来自转化细胞的植物体再生，可按公知的方法(Rance等人，1994(上述))进行。这时，最好在再分化培养基上也添加筛选的药剂。这样获得所希望形质的植物体；最好是获得所希望的形质、而且具有正常能育性的转化植物体再生。这些具体的操作实例在下述实施例中详细论述。
以下根据实施例更具体地说明本发明。下述实施例仅仅为了示例而记载，从任何意义上讲，都不能作为限制的解释。
实施例1、比较例1-3
(1)土壤杆菌的菌系和质粒
寄主细菌，使用LBA4404(ATCC37349)载体使用上述pTOK233(参照图1)。
(2)试验用品种和组织
作为试验用的品种，有1R8、1R24、1R26、1R36、1R54、1R64、1R72、新青矮1、南京11、水原258。开花后10-14天去除未成熟种子的芽颖、在70％乙醇中进行数秒，在含有吐温20的1％次氯酸钠水溶液中进行15分钟灭菌处理。用灭菌水洗涤数次后，在体现显微镜下，摘取1．5-2mm长的未成熟胚。
(3)接种和共存培养
将在含有50mg／l潮霉素和50mg／l卡那霉素的AB培养基(Chilton M-D．等人(1974)Agrob acterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA notdetected in crown gall tumors．Proc．Natl．Sci．USA，71：3672-3776)上培养3-7天的土壤杆菌的菌落，用白金环采取，在AAM培养基(Hiei等人，1994．上述)中进行悬浮，制成接种液。菌密度配制为2～3×108／ml。
向摘取的未成熟胚上滴加1ml细菌悬浮液，旋转约30秒钟，静置5-10分钟后，将附着有细菌悬浮液的未成熟胚在共存培养用的NB-AS培养基上，使胚盘向上，置床，在25℃的黑暗处进行4-5天的共存培养。这里使用的NB-AS培养基的组成，是Rance等人(1994)(上述)所述的NB培养基，但去除L-谷氨酰胺、添加了乙酰丁香酮100μM、蔗糖20g／l、D-葡萄糖10g／l、海噬菌斑(Sea plaque)琼脂糖12．5g／l。即，该组成是KNO32830mg／l、MgSO4·7H2O185mg／l、KH2PO4400mg／l、CaCl2·2H2O166mg／l、(NH4)2SO4463mg／l、K10．7mg／l、H3BO33．0mg／l、MnSO4·H2O10mg／l、ZnSO4·7H2O2．0mg／l、Na2MoO42H2O0．25mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／l、CoCl2·6H2O0．025mg／l、Na2·EDTA37．3mg／l、Fe2SO4·7H2O27．8mg／l、肌醇100mg／l、烟酸1．0mg／l、盐酸维生素B61．0mg／l、盐酸维生素B110mg／l、酪蛋白氨基酸300mg／l、L-脯氨酸300mg／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、α-萘乙酸1mg／l、6-苯甲基氨基嘌呤1mg／l、乙酰丁香酮100μM、蔗糖2g／l、D-葡萄糖10g／l、海噬菌斑(Sea plaque)琼脂糖12．5g／l、pH值为5．2。
(4)转化细胞的筛选
共存培养后，用手术刀除去伸长的苗条，移植到含有3mg／l潮霉素的NBM培养基上，在30℃的黑暗处培养3-4天。接着将未成熟胚分别移植到含20-50mg／l潮霉素的NBM(实施例1)、2N6M(比较例1)、CCM(比较例2)、MSM(比较例3)的1次筛选培养基上，在30℃的明亮条件下培养2-3周。将在未成熟胚的胚盘上形成的耐潮霉素的愈伤组织，移植到含20mg／l潮霉素的NB2培养基上或含30mg／l潮霉素的CCM培养基上，2周内，在30℃明亮条件下进行2次筛选。使用相同的NB2培养基或浓度50mg／l潮霉素的CCM培养基，在10-14天间隔内进行1-3次(3-5次筛选)、在小盒(Compact)内进行球状胚胎发生的愈伤组织筛选和繁殖。以下列出了所用NBM、2N6M、CCM、MSM、NB2培养基的组成。另外，在这些筛选培养基里，下述组成中还添加了250mg／l的头孢氨噻(ヤフオタキシム)。
NBM培养基
KNO32830mg／l、MgSO4·7H2O185mg／l、KH2PO4400mg／l、CaCl2·2H2O166mg／l、(NH4)2SO4463mg／l、KI0．75mg／l、H3BO33．0mg／l、MnSO4·H2O10mg／l、ZnSO4·7H2O2．0mg／l、Na2MoO4·2H2O0．25mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／1、CoCl2·6H2O0．025mg／l、Na2．EDTA37．3mg／l、Fe2SO4·7H2O27．8mg／l、肌醇100mg／l、烟酸1．0mg／l、盐酸维生素B61．0mg／l、盐酸维生素B110mg／l、酪蛋白氨基酸300mg／l、L-脯氨酸300mg／l、L-谷氨酰胺300mg／l、2，4-二氯苯氧乙酸2mg／l、α-萘乙酸1mg／l、6-苯甲基氨基嘌呤1mg／l、D-麦芽糖30g／l、牻牛儿树胶(商品名Gelrite，Sigma公司制)2．5g／l、pH值为5．8。
2N6M培养基
在N6无机盐类，N6维生素[Chu C-C．(1978)N6培养基及其对谷类作物的其它培养中的应用(The N6 medium and its applications to anther cultureof cereal crops．)ln proc．Symp．Plant Tissue Culture Peking：Science Press，PP43-50]中，加入酪蛋白氨基酸1g／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、D-麦芽糖30g／l、牻牛儿树胶(商品名Gelrite Sigma公司制)2．5g／l。即KNO32830mg／l、MgSO4·7H2O185mg／l、KH2PO4400mg／l、CaCl2·2H2O166mg／l、(NH4)2SO4463mg／l、KI0．75mg／l、H3BO31．6mg／l、MnSO4·4H2O3．3mg／l、ZnSO4·7H2O1．5mg／l、Na2MoO4·2H2O0．25mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／l、Na2·EDTA37．3mg／l、Fe2SO4·7H2O27．8mg／l、烟酸0．5mg／l、盐酸维生素B60．5mg／l、盐酸维生素B11．0mg／l、酪蛋白氨基酸1g／l、甘氨酸2mg／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、D-麦芽糖30g／l、牻牛儿树胶(商品名Gelrite，Sigma公司制)2．5g／l、pH值为5．8。
CCM培养基
在CC培养基[Potrykus 1等人(1979)由谷类细胞培养物原生质体形成的愈伤组织(Callus formation from cell culture protoplasts of corn)(Zea maysL．)．Theor．Appl．Genet．54：209-214；Hartke S．等人(1989)来自各种印度水稻的体细胞的胚胎发生和植物再生(Somaic embryogenesis and plantregeneration from various indica rice)(Oryza SativaL．)genotypes．J．Genet＆Breed．43：205-214]中。加入D-麦芽糖30g／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、牻牛儿树胶(商品名Gelrite Sigma公司制)2．5g／l。即KNO31212mg／l、NH4NO3640mg／l、CaCl2·2H2O588mg／l、MgSO4·7H2O247mg／l、KH2PO4136mg／l、FeSO4·7H2O27．8mg／l、Na2EDTA37．3mg／l、H3BO33．1mg／l、MnSO4·4H2O11．15mg／l、ZnSO4·7H2O5．76mg／l、KI0．83mg／l、Na2MoO4·2H2O0．24mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／l、CoSO4·7H2O0．028mg／l、烟酸6mg／l、盐酸维生素B18．5mg／l、盐酸维生素B61mg／l、甘氨酸2mg／l、肌醇90mg／l、椰子水100ml/l(Gibco公司制)、甘露醇36．43g／l、D-麦芽糖30mg/1、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、牻牛儿树胶(商品名Gelrite．Sigma公司制)2．5g／l、pH值为5．8。
MSM培养基
在MS无机盐类、MS维生素[Murashige，T．and SKoog，F(1962)一种用于烟草组织培养物快速生长和生物检定的改良培养基(A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures)Physiol．Plant．15∶473-497]中，加入酪蛋白氨基酸1g／l、D-麦牙糖30g／l、2，4-二氟苯氧乙酸2mg /l、牻牛儿树胶(商品名Gelrite Sigma公司制)2．5g／l。即NH4NO31650mg／l、KNO31900mg／l、MgSO4·7H2O370mg／l、KH2PO4170mg／l、CaCl2·2H2O440mg／l、KI0．83mg／l、H3BO3 6．2mg／l、MnSO4·4H2O22．3mg／l、ZnSO4·7H2O8．6mg／l、Na2MoO4·2H2O0．25mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／l、CoCl2·6H2O0．025mg／l、Na2·EDTA37．3mg／l、Fe2SO4·7H2O27．8mg／l、肌醇100mg／l、烟酸0．5mg／l、盐酸维生素B60．5mg／l、盐酸维生素B10．1mg／l、甘氨酸2．0mg／l、酪蛋白氨基酸1g／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／l、D-麦芽糖30g／l、牻牛儿树胶(商品名Gelrite，Sigma公司制)2．5g／l、pH值为5．8。
NB2培养基
KNO32830mg／l、MgSO4·7H2O185mg／l、KH2PO4400mg／l、CaCl2·2H2O166mg／l、(NH4)2SO4463mg／l、KI0．7mg／l、H3BO33．0mg／l、MnSO4·H2O10mg／l、ZnSO4·7H2O2．0mg／l、Na2MoO4·2H2O0．25mg／l、CuSO4·5H2O0．025mg／l、CoCl2·6H2O0．025mg／l、Na2·EDTA37．3g／l、Fe2SO4·7H2O27．8mg／l、肌醇100mg／l、烟酸1．0mg／l、盐酸维生素B61．0mg／l、盐酸维生素B110mg／l、酪蛋白氨基酸300mg／l、L-脯氨酸300mg／l、L谷氨酰胺300mg／l、2，4-二氯苯氧醋酸2mg／1、α-萘乙酸1mg／16-苯甲基氨基嘌呤0．2mg／l、D-麦芽糖30g／l、D-甘露醇30g／l、牻牛儿树胶(商品名Gelrite，Sigma公司制)2．5g／l、pH值为5．8。
接着，将选取的愈伤组织移植到含有40mg／l潮霉素的NBM再分化前培养基上，在30℃明亮条件下培养约10天。
(5)转化体的再分化和GUS发现研究
将通过再分化前培养得到的，耐潮霉素的胚胎发生的愈伤组织，在铺有滤纸的培养皿中进行干燥处理后(Rance等人，1994(上述))移植到将RN培养基(Rance等人1994(上述)的糖源改为30g／l D-麦芽糖的RNA再分化培养基(含有30mg／l潮霉素)上。2-3周后，将再分化植物移植到含有30mg／l潮霉素的MSI(1／2浓度MS主要无机盐、MS微量无机盐、MS维生素、1g／l酪蛋白氨基酸、0．2mg／l吲哚酪酸、15g／l蔗糖、3g／lGelrite，pH5．8)生根培养基上，在25℃明亮条件下培养约3周。将得到的耐潮霉素的再分化植物的叶子，通过X-Glue处理，研究GUS发现(Hiei等人．1994(上述))。将再分化的个体再移植到50倍的Hyponex水溶液中，在25℃明亮条件下进行10天育苗后，再移植到温室内的花盆里。
(6)转化体的SaZan(サザン)分析和后代中导入基因的发现
将由显示GUS发现的再分化个体叶子中提取的DNA，用限制酶Hindlll或Kpnl进行处理，将hpt或GUS基因作为探针(プロ-ブ)进行SaZan分析。对于SaZan分析，按Sambrook等人(1990)所述方法进行(Sambrokk，J．等人，Molecular cloning：ALaboratory Manual，2nd Edn．Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press)。将转化体的自行繁殖下一代种子播种到无激素(ホルモンフソ-)的MS培养基上，发芽后，通过叶片的X-Gluc处理而研究GUS发现。再将这些相同的由种子得来的苗移植到含有50mg／l潮霉素、无激素的MS培养基上，研究抗潮霉素性能。
结果示检表1和表2。
表1 一次筛选中基本培养基的比较(品种：IR24、菌系：LBA4404／pTOK233)
*独立的GUS阳性植物的系统数(不含克隆)。
对二、三次筛选培养基使用NB2培养基(20mg／l潮霉素)。
对再分化前的培养基使用NBM培养基(40mg／l潮霉素)。
对再分化培养基使用RBM培养基(30mg／l潮霉素)。
表2 一次筛选中基本培养基的比较(品种：IR36、菌系：LBA4404／pTOK233)
*独立的GUS阳性植物的系统数(不含克隆)。
对二次筛选培养基使用CCM培养基(30mg／l潮霉素)。
对三-五次筛选培养基使用CCM培养基(50mg／l潮霉素)。
对再分化前的培养基使用NB培养基(40mg／l潮霉素)。
对再分化培养基使用RNM培养基(30mg／l潮霉素)。
表3用LBA4404／pTOK233对印度水稻进行转化的结果
*独立的GUS阳性植物系统数(不含克隆)。**：对二次筛选以后的培养基使用CCM培养基
| 品种 | 试验用未成熟胚数(A) | HygR愈伤组织筛选系统数 | 再分化系统数 | GUS+再生植物系统数(B)* | 转化效率(B/A:％) |
| IR8IR24IR26IR36**IR54IR64IR72**南京11水原258新青矮1 | 603212063359010042307950575740 | 3113763820375923387630313527 | 1911672815345220135328232519 | 1811632714335019135028212418 | 30.034.452.542.940.036.750.045.243.363.356.036.842.145.0 |
以下对上述实验结果进行说明。
(1)转化细胞的筛选
在1次筛选培养基上培养2-3周后，在NBM培养基上，与CCM、MSM和2N6M培养基相比得到非常高频率的耐潮霉素的愈伤组织(表1、表2)。对1次筛选过程中的未成熟胚，研究其用X-Gluc处理的GUS基因的发现，确认在用NBM培养基培养的未成熟胚的胚盘上形成的多个细胞块，都显示出一样的GUS发现。在使用CCM和MSM培养基的情况下，胚盘整体肥大，几乎见不到GUS发现领域的特异增殖。即，使用NBM培养基的情况下，由于导入基因领域显示出选择性的增殖，所以1个未成熟胚就能得到数个独立地耐潮霉素的细胞块。与此相比，使用CCM和MSM培养基的情况下，导入基因领域见不到选择性的增殖，胚盘的表层细胞整体有愈伤组织化的倾向。由于这个原因，使用CCM和MSM培养基进行1次筛选的情况下，要看清耐潮霉素的细胞块，进行筛选都是很困难的。
当CCM和MSM培养基的潮霉素浓度降低到20、30mg／l时，和不添加潮霉素的情况一样，胚盘整体显示出增殖。使用2N6M培养基的情况下，与NBM培养基相比，从未成熟胚中筛选的愈伤组织数少，见到的是生长迟缓的倾向。Christou等人，在粒子枪法中，虽然将MS和CC培养基用于转化细胞的筛选[ChristouP．等人，(1991)生产转基因水稻(Production oftransgenic rice)(Oryza SativaL．由通过放电粒子加速外源DNA进入未成熟的合子胚的农业上重要的印度和日本水稻品种所得的植物(plants formagronomically important indica and；aponica varieties via electeric disch argeparticle acceleration of exogenous DNA into immature zygoticembryos)Bio／technology 9：957-962；Chistou P．Ford，T．L．and KofronM．(1992)水稻用的各种独立基因转移法的进展(The development of a variety-indep endent gene-transfer method for rice)TIB TECH 10：239-246]、但和本比较例的情况一样，所得转化体的数量很少。
使用从NBM培养基中去除了NAA和BA只有2，4-D的单独培养基的情况下，获得具有再分化能力的、有耐性的胚胎发生的愈伤组织是很困难的。从此考虑，认为为了诱导有再分化能力的胚胎发生的愈伤组织，BA等细胞分裂素类是必需的。Li等人(1993)(上述)使用不含有NAA，BA和L-谷氨酰胺的NB培养基、进行转化细胞的筛选，据报导认为对于印度水稻，仅得到了极少的再生个体，与本比较例中的结果是一致的。
1次筛选的培养期间最好是2-3周、当超过该期限继续培养时，在未成熟胚的胚盘上形成的愈伤组织，其增殖也会超过需要，每个未成熟胚难以得到数个独立的筛选愈伤组织，此外，愈伤组织的形态也趋于不好。
(2)2次选取以后的培养
对于试验用的10个品种中的8个品种，在NB2培养基上，愈伤组织以胚胎发生的状态增殖。对于1R36、1R72的两个品种，其比较结果可知，与NB2培养基比，CCM培养基(30-50mg／l潮霉素、250mg／l头孢氨噻)能保持形态良好的愈伤组织。
使用NBM培养基进行1次筛选的试验区中，与其它培养基相比，在2，3次筛选中非常多的愈伤组织也都保持了耐性(表1、2)。2次筛选以后的培养大致进行2周，当继续3周以上培养时，愈伤组织产生温度，形态向不良方向发展。筛选进行3次或4次、5次后，进行再分化前的培养。
(3)再分化培养
10个品种都有效地得到了再分化个体、再分化困难的品种没有发现。在生根培养基方面，添加了1BA(0．2mg／l)的MSI培养基，与不含激素的培养基相比，明显地促进了生根，是最适宜的。向生根培养基里添加潮霉素(30mg／l)，对植物体阶段的耐潮霉素个体筛选非常有效。
(4)转化效率
大部分再分化的个体，在叶子中都显示出一样的GUS发现(表3)。在NBM培养基上，使用1次筛选的培养系时，对于10个试验用品种，每个未成熟胚芽都以30％以上的非常高的效率，得到耐潮霉素的、而且显示GUS发现的转化体(表1、2、3)。
(5)SaZan分析和对后代的遗传
通过SaZan分析结果，可以确认显示GUS发现的再生个体，确认在研究的所有个体上都导入了遗传基因。同时，确认了T-DNA导入到各个个体的水稻基因组的随机部位上。对后代GUS的发现和耐潮霉素性的研究结果，可以观察到适合于孟德尔遗传法则的遗传分离。
Claims (8)
1．一种印度水稻转化方法，其特征是，利用土壤杆菌法对印度水稻未成熟胚细胞进行转化、筛选被转化细胞、在水稻的转化方法中，筛选作为转化细胞的培养基，它含有KNO32000～4000mg／l、MgSO460～200mg／l、KH2PO4200～600mg／l、CaCl2100～450mg／l、(NH4)2SO4200～600mg／l、H3BO31～7mg／l、MnSO42～20mg／1、EDTA或其盐20～50mg／l、Fe3～8mg／l、肌醇50～200mg／l、2，4-二氯苯氧醋酸0．5～10mg／l、细胞分裂素类0．01～5mg／l和糖类5000～8000mg／l，以及胶凝剂，其pH值为4．5～6．5。
2．根据权利要求1所述方法，其特征是，上述细胞分裂素类是6-苯甲基氨基嘌呤。
3．根据权利要求1或2所述方法，其特征是，上述糖类是选自麦芽糖、蔗糖和葡萄糖中至少一种。
4．根据权利要求1-3中任一项所述方法，其特征是，上述培养基至少还含有KI0．5～2mg／l、ZnSO40．7～5mg／l、Na2MoO40．1～0．3mg／l、CuSO40．01～0．02mg／l、CoCl20．01～0．02mg／l、烟酸0．25～10mg／l、维生素B60．25～5mg／l、和维生素B10．05～20mg／l。
5．根据权利要求4所述方法，其特征是，上述培养基至少还含有酪蛋白氨基酸100～3000mg／l、脯氨酸100～3000mg／l、谷氨酰胺100～3000mg／l、及α-萘乙酸0．01～5mg／l。
6．根据权利要求1-5中任一项所述方法，其特征是，上述培养基还含有1000～60000mg／l的糖醇。
7．根据权利要求6所述方法，其特征是，上述糖醇是甘露醇或山梨糖醇。
8．根据权利要求1-7中任一项所述方法，其特征是，上述印度水稻属于Groupl。
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