CN101979506B

CN101979506B - 高通量水稻转基因方法

Info

Publication number: CN101979506B
Application number: CN2010102731126A
Authority: CN
Inventors: 安成才; 黄萍; 张旭; 付力文; 杨丽; 张起涛; 孔双蕾; 任姣; 孔寅飞; 高音; 于祥春
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-09-06
Filing date: 2010-09-06
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-09-06
Also published as: CN101979506A

Abstract

本发明公开了一种高通量水稻转基因方法。本发明还公开了一种用于基因转化的渗透培养基。该培养基溶剂是水，溶质包括5-10g/L的蔗糖、100-300μL/L Silwet L-77、1-5μg/L的赤霉素和0.1-0.5mg/L的细胞分裂素。本发明提供的水稻转基因方法是将含有待转基因的农杆菌转化液浸渍或淋冲水稻花序，成熟后收获种子，所述种子萌发得到所述转基因水稻；所述含有待转基因的农杆菌转化液的OD₆₀₀为1.0-1.2。本发明转化效率在2.9～3.6‰。本方法操作简便，可用于大规模基因转化与筛选，并具有效率高、成本低、周期短、通用性强、不受基因型影响，可在不同科、属、种的植物中推广应用，具有广泛的实际应用价值。

Description

高通量水稻转基因方法

技术领域

本发明涉及高通量水稻转基因方法。

背景技术

水稻是世界上最主要的粮食作物之一。传统的杂交育种技术为水稻品种改良作出了重要贡献，然而杂交育种技术难以打破物种的局限性，极大地限制了跨越物种的育种要求。随着DNA重组技术及植物遗传工程技术的发展，使得跨越物种间的分子育种成为可能。通过基因工程手段将目的基因转移到受体植物的基因组中，使外源基因在异源受体植物中稳定遗传，并赋予植物新的农艺性状(包括抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等)，已成为提高产量、改良品质等培育新品种、新品系的重要有效途径。

植物转基因技术包括农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、花粉管通道法等多种方法。目前水稻常用的转基因方法以农杆菌介导法为主，基因枪轰击法次之。这两种方法都以种子愈伤组织为转基因受体，通过农杆菌浸染或基因枪轰击，依靠转化细胞的脱分化和再分化这一组织培养的植株再生过程，实现外源基因的转移，获得转基因植株。但是该方法受植物种类、基因型、外植体再生能力、农杆菌的活力、严格的无菌环境、分化再生条件、人工气候室等诸多因素的影响，并存在着实验重复性差、遗传转化成本高，工作量大、周期长，以及在组织培养过程中可能导致体细胞变异、转基因植株的育性降低甚至丧失等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于基因转化的培养基。

本发明提供的培养基，溶剂是水，溶质包括5-10g/L的蔗糖、100-300μL/L SilwetL-77、1-5μg/L的赤霉素和0.1-0.5mg/L的细胞分裂素。

进一步，上述培养基是在MS基本培养液的基础上添加Silvet L-77、赤霉素、细胞分裂素得到的培养基；其中Silvet L-77、赤霉素和细胞分裂素在培养基的终浓度分别为100-300μL/L、1-5μg/L和0.1-0.5mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水，溶质如表1所示。

表1、MS基本培养液的溶质

上述Silwet L-77的优选浓度是200μL/L；所述赤霉素的优选浓度是3μg/L；所述细胞分裂素的优选浓度是0.1mg/L。

上述赤霉素是GA3；上述细胞分裂素是激动素KT。

本发明的另一目的在于提供一种水稻转基因方法。

本发明提供的水稻转基因方法包括如下步骤：将含有待转基因的农杆菌转化液浸渍或淋冲水稻花序，成熟后收获种子；

所述含有待转基因的农杆菌转化液是将含有待转基因的农杆菌悬浮于上述的培养基中得到的转化液；所述含有待转基因的农杆菌转化液的OD₆₀₀为1.0-1.2。

具体地讲，OD₆₀₀为1.0-1.2是将上述含有待转基因农杆菌以1∶100接菌于LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中，28℃、230rpm/h悬浮培养16h，再以1∶100转接于新鲜LB培养液、同样条件培养12小时(至OD₆₀₀在1.5-2.0)。经离心收集菌体后，加入等体积的上述培养基重悬至所述OD₆₀₀为1.0-1.2。

上述含有待转基因的农杆菌是将含待转基因的重组载体导入农杆菌中得到的；所述含待转基因的重组载体是将目的基因插入pCAMBIA1381或pJim19质粒的多克隆位点间得到的重组表达载体。

上述水稻花序为在初花期经人工授粉后的花序；所述浸渍或淋冲是在自所述人工授粉时起的3小时内进行的。

上述浸渍或淋冲的时间为20-40秒，优选是30秒。

进一步，上述方法还包括在所述收获种子步骤之后进行种子萌发，得到转基因水稻。

上述方法优选还包括在所述种子萌发后的筛选，所述筛选包括如下步骤：在所述收获种子后，将种子在含有潮霉素的抗性培养基上进行抗性筛选；所述潮霉素在所述抗性培养基中的浓度为40-60mg/L，优选是50mg/L；所述抗性筛选时间为20-30天。

上述筛选还包括所述抗性筛选后的分子生物学检测，优选是PCR检测、Southernblot检测和/或Western blot检测；所述PCR检测的引物是检测潮霉素抗性标记基因的引物和/或检测目的基因的引物。

本发明公开了一种具有较高转化率，并且操作简便、可用于高通量的水稻基因转化方法。本方法以原位生殖器官(花粉管、受精前后的配子及合子)为转基因受体，确定了水稻授粉后的合适生理时间、渗透液的组成及浓度、转化时间、筛选浓度、筛选时间，成功的利用农杆菌将目的基因整合到植物基因组中，通过生长发育获得T1代种子，经过潮霉素抗性筛选和分子检测，获得转基因阳性植株。本发明平均转化效率在3.0‰左右。本方法操作简便，可用于大规模基因转化与筛选，并具有效率高、成本低、周期短、通用性强、不受基因型影响，可在不同科、属、种的植物中推广应用，具有广泛的实际应用价值。

本发明方法的优点：

1、该转化方法操作简便、效率高、易于推广应用，可用于实施高通量的基因转化与筛选。避免了目前组培转化体系中所存在的繁琐、昂贵、周期长技术难题，具有成本低、流程简单、周期短、工作量小的优势。在南方及大棚温室等适宜的环境下可实现一年两季的基因转化工作。

2、该方法不受基因型影响，通用性强，适合各种水稻品种及品系的基因转化，尤其适用于某些难以实施组培方法或转化效率低的品种。

3、该方法对在体花组织实施基因转化，直接获得转基因T1代种子。

4、该方法筛选简便、操作简单、时间短，筛选出的阳性苗经短期炼苗即可移入室外土壤或置于温室大棚中培育管理。

附图说明

图1、水稻转化质粒pCACRE3-PAL的构建(A)及验证图(B：PCR检测图C：酶切图)。

图2、水稻转化质粒pJim19-OsCLP的构建(A)及验证图(B：PCR检测图C：酶切图)。

图3、表达质粒pCACRE3-PAL(A)和Jim19-OsCLP(B)的农杆菌转化及鉴定图；A：M：100bp DNA Ladder；pCPAL：pCACRE3-PAL农杆菌鉴定；B：M：λDNA HindIII/EcoRI分子量标准；pJCLP：pJim19-OsCLP农杆菌鉴定。

图4、水稻遗传转化的技术流程图。

图5、T1代种子的抗性筛选(A)及其阳性植株的移土培育(B和C)。

图6、抗性筛选T1代幼苗的PCR鉴定；

A：OsPAL抗性苗潮霉素抗性基因的分子检测；M：100bp DNA Ladder；P：质粒阳性对照；WT：野生型水稻对照；H₂O：阴性对照；Lane1-16：抗性筛选植株

B：OsPAL抗性苗中OsPAL特异区序列的分子检测；M：100bp DNA Ladder；P：质粒阳性对照；WT：野生型水稻对照；H₂O：阴性对照；Lane1-16：抗性筛选植株

C：OsCLP抗性苗中潮霉素抗性基因的分子检测；M：100bp DNA Ladder；P：质粒阳性对照；WT：野生型水稻对照；H₂O：阴性对照；Lane1-6：潮霉素抗性筛选植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、获得转基因水稻

1、实验材料

1.1 载体：pCAMBIA1381、pJim19均购自Takara。其余的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

1.2 受体水稻材料：爱知旭(记载过该材料的文献是Lin R-M.，Zhao W-S.，MengX-B.，Wang M.and Peng Y-L.Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domaintranscription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea.Plant Science，(2007)172：120-130，公众可从北京大学获得)的品种作为实验材料。该品种在温室大棚于3月初播种，7月中旬开始抽穗，7月下旬至8月上旬进入盛花期，可实施批量转化。

2.转化质粒pCACRE-PAL和pJim19-OsCLP的构建及农杆菌转化

2.1、pCACRE-PAL的构建

2.1.1、中间质粒pCAMBIA1381-ACRE3的构建

前期研究结果表明，OsPAL基因的启动子区域存在一个富含AC的增强诱导表达活性的顺式作用元件，我们将其命名为ACRE(AC-rich element)。

a.为增强目的基因的表达效果，我们采用人工合成的方法合成出含有三个串联重复ACRE的调控元件序列。为了方便随后的克隆过程，我们在序列的5’端添加了一个EcoRV酶切位点和相应的保护碱基，在序列的3’端添加了XbaI酶切位点和相应的保护碱基。该启动子调控区的序列如序列表中序列1所示。

b.利用EcoRV和XbaI同时双酶切合成的片段及空载体pCAMBIA-1381(购自http://www.biogo.net/sell/show-405714.html)；

c.PCR方法筛选阳性克隆，并挑取阳性菌落摇菌过夜培养；

d.经小量提取质粒DNA后进行酶切及测序鉴定，结果表明pCAMBIA1381-ACRE3构建成功；

2.1.2、转化质粒pCACRE-PAL的构建

(1)水稻cDNA合成。取五叶期水稻幼苗为材料，Trizol法提取总RNA，进行RT-PCR反应合成cDNA。

a.在RNase-free的PCR管中加入下列组分，并混匀：

5μl总RNA(2μg)

1μl Oligo dT₍₁₆₎(10pmol/μl)

5μl RNase-free Water

b.70℃，5min；

c.冰上2min，短暂离心；

d.依次加入下列组分，并混匀：

4μl 5x reaction buffer

1μl RI Block reverse RNAse inhibitor

2μl dNTP(10mM each)

e.70℃，5min；

f.各加入1μl M-MnLV；

g.置于42℃ 1h，70℃ 10min反应。

(2)OsPAL基因的克隆。分别设计并合成OsPAL-S-HindIII(序列2)和OsPAL-A-HindIII(序列3)引物，使之5’端和3’端均含有HindIII酶切位点。以cDNA文库为模板，经PCR扩增和测序验证，得到OsPAL的全长序列(2106bp)(序列4)。

PCR反应体系：

DNA模板 2.0μl

10μM正向引物 1.0μl

10μM反向引物 1.0μl

dNTPs 4.0μl

5×LA Buffer 10μl

2×GC BufferⅡ 25μl

LA Taq 0.5μl

ddH₂O 6.5μl

PCR反应条件：

(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后乙醇沉淀回收；

(4)利用HindIII同时酶切回收的DNA片段及载体pCAMBIA1381-ACRE3；

(5)酶切产物乙醇沉淀回收后进行连接，转化大肠杆菌DH5a菌株；

(6)PCR方法筛选阳性克隆，并挑取阳性菌落摇菌过夜培养；

(7)小量提取质粒后PCR检测(引物为序列5和序列6，如图1B中所示)、酶切(如图1C中所示)及测序鉴定，结果表明植物表达质粒pCACRE-PAL(图1A)构建成功；

2.2、pJim19-OsCLP的构建

a.在RNase-free的PCR管中加入下列组分，并混匀：

5μl总RNA(2μg)

1μl Oligo dT₍₁₆₎(10pmol/μl)

5μl RNase-free Water

b.70℃，5min；

c.冰上2min，短暂离心；

d.依次加入下列组分，并混匀：

4μl 5x reaction buffer

1μl RI Block reverse RNAse inhibitor

2μl dNTP(10mM each)

e.70℃，5min；

f.各加入1μl M-MnLV；

g.置于42℃ 1h，70℃ 10min反应。

(2)OsCLP基因的克隆：分别设计并合成OsCLP-S-XhoⅠ(序列7)和OsCLP-A-SpeⅠ(序列8)引物，使之5’端含有XhoⅠ酶切位点，3’端含有SpeⅠ酶切位点。以cDNA文库为模板，经PCR扩增和测序验证，得到OsCLP的全长序列(1428bp)(序列9)。

PCR反应体系：

DNA模板 2.0μl

10μM正向引物 1.0μl

10μM反向引物 1.0μl

dNTPs 4.0μl

5×LA Buffer 10μl

2×GC BufferⅡ 25μl

LA Taq 0.5μl

ddH₂O 6.5μl

PCR反应条件：

(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后乙醇沉淀回收；

(4)利用XhoⅠ和SpeⅠ同时双酶切回收的片段及空载体pJim19；

(6)PCR方法筛选阳性克隆，并挑取阳性菌落摇菌过夜培养；

(7)小量提取质粒后进行PCR检测(引物为序列7和序列8，如图2B)、酶切(如图2C中所示)及测序鉴定，结果表明植物表达质粒pJim19-OsCLP(图2A)构建成功。

2.3、表达质粒pCACRE-PAL及pJim19-OsCLP的农杆菌转化与鉴定

2.3.1、农杆菌转化：使用电击法将质粒pCACRE-PAL和pJim19-OsCLP转化农杆菌菌株EHA105，分别以pCACRE-PAL引物(引物为序列5和序列6)及pJim19-OsCLP引物(引物为序列7和序列8)进行PCR鉴定阳性克隆后，用于制备转基因的侵染菌液(如图3所示)

2.3.2、农杆菌转化液的制备：

将含有pCACRE3-PAL和pJim19-OsCLP表达质粒的农杆菌以1∶100接菌于LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中，28℃、230rpm/h悬浮培养16h，再以1∶100转接于新鲜LB培养液、同样条件培养12小时(至OD₆₀₀在1.5-2.0)。经离心收集菌体后，加入等体积的渗透培养基(在MS基本培养液的基础上，添加Silvet L-77、赤霉素GA3、细胞分裂素KT；其中Silvet L-77、GA3和KT在渗透培养基的终浓度分别为200μL/L、5μg/L和0.1mg/L，pH5.8)重悬至OD₆₀₀ 1.0-1.2，得到农杆菌转化液，备用于转化水稻。

MS基本培养液的溶剂是水，溶质如表1所示。

2、转化方法

转化技术流程图如图4所示(操作顺序依次如图4A、图4B、图4C、图4D、图4E和图4F)。

1)花蕾选择：选择植株健壮、长势良好、无病虫害、并处于初花期的水稻花序为转化受体，剪除花序上下两端尚未开放的花蕾和已开败的花朵。

2)人工授粉：选择晴天上午9-11点间用毛笔尖取花粉，充分授粉于当天开放花朵的柱头上，授粉完毕后在花序下端挂标牌注明授粉时间等。

3)基因转化：转化时间选定在授粉后3小时内。将上述制备好的农杆菌转化液倒入烧杯中，将水稻花序弯曲使整个花絮完全浸渍于菌液中浸花约30秒钟，对于枝条较短的花絮为防止浸花中折断，用1毫升移液器将菌液从花絮顶端向下直接充分淋冲花絮约30秒。待浸菌液渗透后，取硫酸纸袋套住花序，以保持遮光和一定的湿度，经24hr后去掉纸袋。转化操作宜在授粉后的3小时内完成。

4)种子发育及收获：转化后的水稻植株按照常规培育管理要求，进行浇灌、定期施肥和病虫害防止，以保证其正常生长发育，约50天后种子自然发育成熟，收获T1代种子。

二、T1代种子的抗性筛选及分子检测：

1、抗性筛选

将收获的T1代水稻种子经75％乙醇处理1min，无菌水清洗3次，10％次氯酸钠处理70min，无菌水清洗5次，用灭菌滤纸充分吸干水分、均匀种植于50mg/L潮霉素抗性MS培养基上，同时以未转基因野生型种子为阴性对照，在25-28℃、光照16hr/黑暗8hr环境下筛选培养。经过一周后具有潮霉素抗性的转基因种子可萌发出抗性幼苗，而不具潮霉素抗性的未转基因种子则不能萌发或发芽幼苗枯死。结果如图5所示，经培养30天后，选择幼苗保持绿色、并能继续生长良好的抗性植株用于分子检测。

2、抗性植株的分子鉴定

1)PCR检测

采用CTAB法分别从上述抗性筛选植株中提取总DNA，分别以潮霉素抗性标记基因为引物(序列10、序列11)以及外源OsPAL基因特异区域的引物(序列12、序列13)进行PCR检测(图6A)，同时以质粒DNA和野生型水稻为阳性及阴性对照进行比较分析，本批次最终从转化pCACRE3-PAL(图6B)和pJim19-OsCLP(图6C)的水稻T1代种子中分别鉴定出11株和4株转基因阳性植株，转化率分别为3.6‰和2.9‰(转化率＝分子生物学检测后的阳性苗数量/筛选时播种的种子数)。

综上所述，本发明提供的方法无需建立外植体的再生体系，在非离体的水稻活体花器官实施基因转化：即选取水稻花序为转基因受体浸染农杆菌，在体植物花组织中完成可遗传细胞的基因转化，通过对后代种子的筛选，获得转化植株。该方法的最大特点是操作简便、可用于大规模基因转化与高通量筛选，并具有效率高、成本低、周期短、通用性强、不受基因型影响，打破了种、属间的限制、可以在不同科、属、种的植物中推广应用等优势。我们应用本发明已成功地获得了转基因水稻植株，解决了不需繁杂的组培体系转化水稻的简便、快速的新途径，具有广泛的实际应用价值。

Claims

1.一种用于基因转化的培养基，其特征在于：所述培养基是在MS基本培养液的基础上添加Silvet L-77、赤霉素、细胞分裂素得到的培养基；其中Silvet L-77、赤霉素和细胞分裂素在培养基的终浓度分别为100-300μL/L、1-5μg/L和0.1-0.5mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水，溶质如下：

蔗糖 5g/L；

大量元素的50倍母液：

微量元素的1000倍母液：

EDTA-溶液的200倍母液：

FeSO₄·7H₂O 5.6g/L

Na₂EDTA 7.5g/L；

维生素的1000倍母液：

CaCl₂的1000倍母液：

CaCl₂·2H₂O 4.4g/L。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述Silwet L-77的浓度是200μL/L；所述赤霉素的浓度是3μg/L；所述细胞分裂素的浓度是0.1mg/L。

3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述赤霉素是GA3；所述细胞分裂素是激动素KT。

4.一种水稻转基因方法，包括如下步骤：将含有待转基因的农杆菌转化液浸渍或淋冲水稻花序，成熟后收获种子；

所述含有待转基因的农杆菌转化液是将含有待转基因的农杆菌悬浮于权利要求1-3中任一所述的培养基中得到的转化液；所述含有待转基因的农杆菌转化液的OD₆₀₀为1.0-1.2。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述含有待转基因的农杆菌是将含待转基因的重组载体导入农杆菌中得到的；所述含待转基因的重组载体是将目的基因插入pCAMBIA1381或pJim19质粒的多克隆位点间得到的重组表达载体。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述水稻花序为在初花期经人工授粉后的花序；所述浸渍或淋冲是在自所述人工授粉时起的3小时内进行的。

7.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述浸渍或淋冲的时间为20-40秒。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述浸渍或淋冲的时间为30秒。

9.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在所述收获种子步骤之后进行种子萌发，得到转基因水稻。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在所述种子萌发后的筛选，所述筛选包括如下步骤：在所述收获种子后，将种子在含有潮霉素的抗性培养基上进行抗性筛选；所述潮霉素在所述抗性培养基中的浓度为40-60mg/L，所述抗性筛选时间为20-30天。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述筛选还包括所述抗性筛选后的分子生物学检测。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述分子生物学检测是PCR检测、Southern blot检测和/或Western blot检测；所述PCR检测的引物是检测潮霉素抗性标记基因的引物和/或检测目的基因的引物。