CN101948869B

CN101948869B - 一种高通量的大豆转基因方法

Info

Publication number: CN101948869B
Application number: CN2010102731130A
Authority: CN
Inventors: 安成才; 黄萍; 杨扬; 任姣; 邬倩; 滑瑞; 何善平; 付力文; 张起涛; 于祥春
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-09-06
Filing date: 2010-09-06
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2030-09-06
Also published as: CN101948869A

Abstract

本发明公开了一种高通量大豆转基因方法。该方法，包括如下步骤：在大豆花的柱头上滴加基因转化液，成熟后收获种子。本方法避免了因剪切柱头带来的组织损伤，对T1代种子的结实率及发芽率的影响小。本发明提供的方法还包括筛选，该筛选包括如下步骤：在所述种子出苗后从真叶完全展开至第1三出叶展开之前，在叶面上喷洒除草剂；进一步筛选可以包括分子生物学检测，上述筛选方法操作流程简单、时间短、成本低，可用于实施高通量的筛选，而且筛选抗性苗的阳性率高，减少了分子检测的工作量。

Description

一种高通量的大豆转基因方法

技术领域

本发明涉及一种高通量的大豆转基因及筛选方法。

背景技术

大豆是重要的油料作物，也是植物蛋白质及油脂的重要来源。为了提高大豆抗病虫害及生理逆境的能力、改善大豆品质、增加大豆产量，除了采用传统的育种方法外，可通过基因工程手段实现有目的的遗传工程改良。大豆的遗传转化是研究大豆基因功能的关键，但由于大豆的组织培养体系不够完善，大豆组织对农杆菌不敏感等原因，使大豆的遗传转化难度大、效率低、至今成为世界性难题。

探索大豆转基因方法主要包括基因枪法、农杆菌介导法、电激法、PEG法、子房注射法等，其中以农杆菌介导法和基因枪法为研究较多。农杆菌介导的组培法，存在着遗传转化操作繁琐、成本高、工作量大、周期长、转化率低，而且受到基因型依赖和菌株特异性的限制；基因枪法操作简便、受体广泛、一次可转化多个细胞，但是由于基因整合频率不高，转化基因拷贝数不稳定，也受到基因型的限制，而且需要经过繁琐的组织培养体系才能得到再生植株，特别是其昂贵的设施条件及实施成本限制了广泛的推广应用。目前，大豆转化的主要障碍来自缺乏高效稳定的组培技术体统，因此，创建高效简便的花粉管通道法转化大豆具有重要意义。

花粉管通道法(pollen-tube pathway)是周光宇等(1978年)建立并在长期科学研究中发展起来的一种育种方法，目前已在国内外广泛应用。基本原理是花朵授粉后，花粉管通过珠心插入到胚囊中，外援基因沿着花粉管到达子房，整合到受精但未分化的合子细胞中，此时合子细胞壁尚不完整，处于感受态，易使外援基因转入。该方法无需建立外植体的组培再生体系，在非离体的大豆活体花器官实施基因转化，并通过对后代种子进行筛选，获得转化植株。该方法已在棉花中被广泛应用，在大豆(刘德璞等，申请号99123707.2)中已有成功报道。但是上述大豆花粉管通道转化方法中存在着两大缺陷：一是授粉后转化前需要进行对每朵花序做一一切去柱头处理的大量工作；二是通过繁琐的幼胚组织培养途径筛选或对收获种子经过初选、移植、再复选和分子鉴定等，其筛选程序繁琐、效率低、工作量大、筛选周期长等低效技术问题。因此，难以满足大规模高通量的基因转化与筛选的实际应用要求。同时，剪去柱头的繁琐操作可能导致以下影响：

1、大豆是自花授粉植物，其授粉发育进程并非同步。过早的切去柱头会影响花粉管的正常发育，影响授粉效率，降低胚珠受精机率，导致结实率下降，同时影响DNA分子经花粉管通道进入胚囊。

2、由于大豆花的形态结构特殊，花器中的柱头微小，切柱头的工作要求精细，操作不当容易引起子房受机械损伤，花粉管通道破坏，造成结实率降低，影响转化率。

3、柱头组织微小，切柱头的操作难度增加了繁琐的工作量，难以实现大规模高通量的遗传转化与实际推广应用的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量大豆转基因方法。该方法避免了农杆菌转化方法中繁杂的组织培养体系和转化效率低、周期长、受基因型依赖等问题，同时解决了以往花粉管通道转化大豆方法中需要修剪大量花柱头的操作，以及繁琐的抗性筛选程序及较长的筛选周期等技术缺陷。

本发明提供的大豆转基因方法，包括如下步骤：在大豆花的柱头上滴加基因转化液，成熟后收获种子。

上述基因转化液是含待转基因的质粒悬浮液。

进一步，上述含待转基因的质粒可以是将待转基因插入含Bar基因的pGREEN载体的多克隆位点间得到的重组质粒，具体可以是实施例中的pGREEN0229。

上述基因转化液是将待转基因的质粒置于0.1×SSC缓冲液中，得到所述基因转化液，所述待转基因的质粒在所述基因转化液中含量50-100ug/ml，优选是70ug/ml(也即上述含待转基因的质粒是以50-100ug/ml，优选是70ug/ml的浓度定溶于0.1×SSC缓冲液中的)。

上述含待转基因的质粒悬浮液滴加在所述柱头的体积是5-8μl。具体可以以在柱头上形成一最大液滴而不落下为最佳。

上述大豆花选择生长状态良好、发育健壮的花蕾。

上述花蕾的花冠高于花萼0-2mm。

上述大豆花的柱头上滴加基因转化液的步骤进行两次，两次间隔时间为2小时之内。

上述方法还包括在所述收获种子步骤之后进行种子萌发得到转基因大豆植株。

上述方法还包括所述种子萌发后的筛选，所述筛选包括如下步骤：在所述种子出苗后从真叶完全展开至第1三出叶展开之前，在叶面上喷洒除草剂。

上述除草剂是浓度为0.8-1.2‰(体积浓度)的草胺磷水溶液，所述除草剂喷洒量150毫升/平方米土，320棵/每平方土；所述叶面喷洒的次数为2次，2次间隔7天。

进一步，上述筛选还包括叶面喷洒除草剂后的分子生物学检测，优选是PCR检测、Southern blot检测和/或Western blot检测；所述PCR检测的所用引物是序列表中序列2和序列3。

本发明提供了一种操作简便、转化效率高、成本低，适用于大豆的大规模基因转化与高通量筛选的方法。采用本发明提供的方法，不需要剪切柱头，对已完成授粉的完整柱头顶端直接转化质粒DNA，减少了大量花序组织的前处理操作；不经过幼胚组织培养途径的繁琐的筛选操作或对种植幼苗的初选、移植和复选等反复的筛选程序，而是直接对T1代幼苗实施抗性筛选和分子生物学鉴定，当年可获得T1代阳性植株的筛选结果。采用本方法对大豆中品661进行转化和筛选，经PCR鉴定，其平均转化有效率达2.7％。

本发明方法的优点具体如下：

1、该转化方法操作简便、效率高、易于推广应用，可用于实施大规模的基因转化。该方法通用性强，不受基因型影响，适合各种大豆品种及品系的基因转化，而且成本低、流程简单、周期短、工作量小，避免了目前常规转化方法中所存在的组织培养、分化再生难于解决的问题，同时在南方及大棚温室等适宜的条件下可实现一年两季的基因转化工作。

2、该筛选方法操作流程简单、时间短、成本低，可用于实施高通量的筛选，而且筛选抗性苗的阳性率高，减少了分子检测的工作量。

3、充分利用大豆适宜的生长季节实施转化获得转基因T1代种子，可当年直接种植于土壤或温室中抗性筛选与分子检测，大大缩短了转化及筛选周期。

4、本方法避免了因剪切柱头带来的组织损伤，对T1代种子的结实率及发芽率的影响小。

5、筛选鉴定出的阳性苗无需炼苗和移苗，可继续在原位生长发育至收获种子。

附图说明

图1：pGreen-TriGLU质粒图谱(A)及鉴定图(B)。

图2：高通量法转化大豆技术流程。

图3：大豆T1代种子的抗性筛选，A：待筛选的T1代大豆幼苗；B：大豆幼苗的除草剂喷洒筛选；C和D：喷洒除草剂10天后的抗性大豆幼苗。

图4：T1代抗性幼苗的PCR鉴定。M：100bp DNA Ladder；P：质粒DNA阳性对照；N：水阴性对照；Lane2、5、6、7为PCR阳性植株；Lane1、3、4为阴性植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、获得转基因大豆

一、基因转化

1、实验材料

1)载体：下述实施例中所用载体为pGREEN0229，可以从http://www.pgreen.ac.uk/a-ord-fr.htm网站购置。产品编码：PBII0229(nos-Bar LB)。其余的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

2)TriGLUC基因的克隆

取幼嫩的栝楼叶组织(采集于北大校园)，利用Trizol法提取总RNA，并通过常规方法进行RT-PCR反应合成cDNA。以TriGLUC-5和TriGLUC-3为引物(TriGLUC-5：CCTCCATGGCTCTTTTGCCG、TriGLUC-3：CTCTCAATTGAACTTGACTGG)，

以栝楼cDNA为模板进行PCR反应克隆得到TriGLUC基因全序列(序列表中序列1)。

合成cDNA具体步骤：

(1)在RNase-free的PCR管中加入下列组分，并混匀；

2μl总RNA(1μg)

3μl 10pmol/μl Oligo dT(16)

11.5μl RNase-free Water

(2)72℃，5min；

(3)冰上2min；

(4)加入下列组分，并混匀；

5μl dNTP(10mM each)

2.5μl 5x M-MLV RT buffer

1μl M-MLV

共25μl体系

(5)42℃，60min；

PCR反应体系为

GoTaq Flexi 0.125μl

5×Flexi Buffer 5.0μl

MgCl₂(25μM) 3.0μl

cDNA模板 2.0μl

正向引物(TriGLUC-5) 0.5μl

反向引物(TriGLUC-3) 0.5μl

dNTPs 1.875μl

ddH₂O 12μl

反应条件：

3)转化质粒pGREEN-TriGLUC的构建：

经过测序鉴定的pTriGLUC目的DNA片段，连接到中间载体PBI121的启动子35S与终止子nos之间构建出PBI121-TriGLUC，然后用HindⅢ和EcoRⅠ同时酶切PBI121-TriGLUC和pGREEN，将35S-TriGLUC-NOS片段插入到pGREEN中，构建出植物转化质粒pGreen-TriGLU(图1A)，进而转入大肠杆菌DH5α中，经PCR筛选和测序验证无误。采用MN公司的NucleoBond Midi型试剂盒，从大肠杆菌中大量制备质粒DNA，经电泳检测验证后(图1B，Line 1：分子量marker；Line 2：pGreen-GLU；Line 3：pGreen-GLU)，以70ug/ml的浓度定溶于0.1X SSC缓冲液中，制备成pGreen-TriGLU质粒DNA悬浮液，备用于遗传转化。

4)受体实验材料：选择大豆中品661品种(购于中国农科院作物所)为受体材料，播种于装有中性花土(土壤/蛭石为2/1)的塑料盒中，按照常规栽培和施肥要求管理。经过三个多月后大豆进入盛花期，按上述条件选花，供大规模转化用。

2、转化方法

流程如图2所示(操作顺序依次如第一行图片从左往右的3幅图，然后是第二行图片从左往右的3幅图)。

1)花蕾选择：大豆的盛花期是早8点钟，当花冠展开时已自花授粉完毕。因此转化时间选择在上午8点开始。选择生长发育状态良好、并且花蕾的花冠高于花萼0-2mm的健壮花蕾作为转基因受体材料。根据生长状况每株可30-50个花序，每个花序留5-9个花蕾，本实施例中选40个花序，每花序选留7个花蕾，其余已开过或未授粉幼小花蕾全部摘除，且定期去除新花蕾。

2)去萼瓣：用左手夹住花蕾，右手用镊子先将萼片上半部摘除，再将花冠上部轻轻上拔，露出柱头，便于转化。

3)转化：为了防止滴入柱头的DNA溶液快速蒸发或避免转化后3小时内下雨而影响转化效果，转化时间宜选择晴天上午10点之前。同时为避免DNA的损伤，转化期间质粒DNA置于加冰的保温瓶内保存。转化时用微量移液器在柱头顶端滴入5-8微升pGreen-TriGLU质粒DNA悬浮液(尽可能在柱头形成一大液滴而不落下)，使得下半部的花萼托住滴液，使其慢慢渗透，经半小时渗透完毕后再滴入第二遍，以提高转化效率。待DNA溶液渗透完毕后，挂牌标明转化时间、质粒名称等。

4)种子发育及收获：授粉1周后，若发育正常子房开始膨大。在发育期间及时浇灌，要保持土壤充足的水分，同时可适当施用硼肥提供充足的营养。待种子成熟后，及时收获豆荚，通风晾干脱粒后，将种子同标牌一起装入种子袋中，放入干燥器中妥善保存。

二、筛选

1、转基因种子的除草剂抗性筛选：

将上述收获的成熟种子播种于装有中性花土(土/蛭石：2/1)的塑料盒中(每盒40粒种子为单位，每盒的底部面积为1/8m²)，未转基因的野生种子为阴性对照。当种子出苗后从真叶完全展开至第1三出叶展开之前，叶面均匀喷洒浓度为0.8～1.2‰(体积比)草胺膦水溶液进行初次筛选，喷洒量为150毫升/平方米，一周后进行复筛(浓度、用量同前)，观察幼苗的生长状态。经过约10天后，不具抗性的敏感植株变黄枯萎而被淘汰，筛选出的抗性幼苗仍保持叶片绿色并继续生长(图3)。待其生长至三出叶完全展开后，移入花盆中继续培养，并取部分叶片组织进行PCR检测。

2、抗性幼苗的分子检测：

PCR检测

采用常规的CTAB法，从上述筛选的部分抗性植株中选取幼嫩叶片提取总DNA，以除草剂(basta)抗性筛选标记基因(BAR)(上游引物：ATTTCGGTGACGGGCAGGAC；下游引物：GCACCATCGTCAACCACTACATC)为引物，同时设置质粒DNA和水分别作为阳性和阴性对照，通过PCR鉴定得到转基因阳性大豆植株(图4)，其平均转化率为2.7％(转化率＝分子生物学检测后的阳性苗数量/筛选时播种的种子数)。表明所创建的高通量花粉管通道法转化大豆技术的成功有效。然后将转基因阳性植株精心管理，收获T2代种子。

Claims

1.一种大豆转基因方法，包括如下步骤：在大豆花的柱头上滴加基因转化液，成熟后收获种子；所述大豆花是花冠高于花萼0-2mm的花蕾；

所述方法还包括在所述收获种子步骤之后进行种子萌发得到转基因大豆植株；

所述方法还包括在所述种子萌发后的筛选，所述筛选包括如下步骤：在所述种子出苗后从真叶完全展开至第1三出叶展开之前，在叶面上喷洒除草剂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基因转化液是含待转基因的质粒悬浮液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含待转基因的质粒是将待转基因插入到含Bar基因的pGREEN载体的多克隆位点间得到的重组质粒。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基因转化液是将待转基因的质粒置于0.1×SSC缓冲液中，得到所述基因转化液，所述待转基因的质粒在所述基因转化液中含量是70ug/ml。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含待转基因的质粒悬浮液滴加在所述柱头的体积是5-8μl。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述大豆花的柱头上滴加基因转化液的步骤进行两次，两次间隔时间为2小时之内。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述除草剂是体积浓度为0.8-1.2‰的草胺磷水溶液；所述除草剂喷洒量150毫升/平方米土，每平方土种植320棵苗；所述叶面喷洒的次数为2次，2次间隔7天。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述筛选还包括叶面喷洒除草剂后的分子生物学检测，所述分子生物学检测是PCR检测、Southern blot检测和/或Westernblot检测；所述PCR检测的所用引物是序列表中序列2和序列3。