CN109169266B - 一种高通量的耐热水稻筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通量的耐热水稻筛选方法，该方法包含：(1)以开花期热敏感水稻为受体，以耐热水稻为供体，获得F2代、DH系、BC1F2或RIL种子；(2)将种子处理后穴盘密植，秧苗培育，得到遗传分离群体；将亲本和F1代按照相同方法种植；(3)待拔节孕穗期时，各单株保留1个有效分蘖，若群体抽穗相近，则在见穗前，在人工气候室进行耐热筛选处理，待群体所有分蘖全部抽穗、开花完毕，在正常环境下灌浆结实；(4)若抽穗期差异较大，则全部抽穗后割兜留桩，一起再抽穗耐热筛选；(5)待单穗蜡熟后，统计耐热结实率，完成群体单株的耐热表型筛选。本发明的方法利用密植控蘖技术和割兜，迅速、可靠地进行高通量耐热筛选。

Description

一种高通量的耐热水稻筛选方法

技术领域

本发明涉及一种耐热筛选方法，具体涉及一种高通量的耐热水稻筛选方法。

背景技术

随着全球气候变暖的趋势加剧，我国的夏季高温热害频发，对我国夏季作物生产造成极大的危害，尤其是长江流域的水稻生产频繁遭遇高温热害的威胁。2003年，长江流域沿线浙、皖、苏、鄂等省水稻抽穗期极端高温超过40℃，持续高温天气达14～16d，水稻产量普遍降低20％～30％，经济损失近百亿元，受高温热害影响当年全国稻谷产量降至近20年来的最低点。2013年和2016年长江流域稻区又接连遭受长时间高温热害，导致水稻严重减产。2017年的极端高温更是从7月15日一直到8月20日。不容乐观的是，在全球气候变化的大环境中，我国长江流域夏季极端高温天气将会更加频繁出现，持续时间将会更长，高温热害引起的水稻生产风险也将持续。

开展耐热新品种选育是解决水稻高温热害最经济、最有效的途径，但由于水稻花期耐热基因的基础研究滞后，导致能够提供给耐热育种使用的耐热基因和耐热资源严重不足，水稻耐热育种也进展缓慢。

水稻耐热基因研究滞后的一个重要原因是缺乏有效的耐高温鉴定方法。传统的耐热研究依靠自然耐热鉴定，耐热处理条件不稳定，加上遗传定位群体生育期不一致，耐热表型鉴定极不准确。植物的高温耐受性大都是由数量性状基因位点控制的复杂性状，进行耐热基因的遗传定位和基因分离工作必须首先保证有可靠的表型鉴定数据，确保重复性好的实验结果。

自然条件的高温鉴定普遍存在高温发生的不确定性和不可控性。一些人工气候室鉴定由于人工气候室的面积较小，传统的盆栽方法，将水稻植株直接栽种在营养钵内，占地面积较大，难以安排较大的遗传群体同时进行表型分型。同时，群体抽穗期的不一致也造成热处理时间过长，单株之间不能保证高温处理对应相同的生育期。因此，传统方法在人工气候室内难以对杂交育种的分离世代进行大群体筛选，也就无法保证筛选出的抗高温材料确实具有优良的耐热性状。所以，建立一种高通量的高温环境耐热鉴定方法对于水稻耐热基础研究和育种都有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量的耐热水稻筛选方法，该方法解决了现有方法在人工气候室内难以对杂交育种的分离世代进行大群体筛选，以及群体抽穗期的不一致的问题，利用密植控蘖技术，显著减少了群体的种植面积，并采用割兜方法来统一抽穗时间，可以迅速、可靠地进行耐热筛选，达到高通量的筛选要求。

为了达到上述目的，本发明提供了一种高通量的耐热水稻筛选方法，该方法包含：

(1)以开花期热敏感水稻为受体材料，以耐热水稻为供体材料，获得F2代、DH系、BC1F2或RIL种子；

(2)将所述F2代、DH系、BC1F2或RIL种子消毒、浸种、催芽处理后，播种在铺好育苗基质的穴盘中密植，所述穴盘置于含有水或营养液的容器中，在水稻适宜的生长条件下进行秧苗培育，得到F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体；将亲本和F1代群体也按照对所述F2代、DH系、BC1F2或RIL种子的处理方法种植，作为筛选实验的对照；

(3)待所述F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体长至拔节孕穗期时，每个单株只保留1个有效分蘖，若群体内单株抽穗期相近，则在群体见穗前，将所述容器移入人工气候室，设定分离群体的耐热筛选处理温度：白天温度一时间段为37～38℃，晚上温度一时间段为28～30℃，待所有分蘖全部抽穗、开花完毕，将所述容器移出人工气候室，让群体在正常环境下灌浆结实；

(4)若群体中单株的抽穗期差异较大，则让群体在正常环境中全部抽穗完毕时，将群体整体割兜，留桩，待群体一起再抽穗时，按照步骤(3)进行耐热筛选处理；

(5)待所述F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体的单株的单穗蜡熟后，将单株编号，收获每个单株的单穗，进行单穗的耐热结实率统计，完成群体单株的耐热表型筛选，同时对单株的叶片按编号冷冻保存，作为基因分型时提取单株DNA备用；

(6)将所述亲本和F1代群体按照步骤(3)-(5)处理，待所述F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体、亲本和F1代群体的耐热结实率统计结束，根据耐热结实率表现依次选择F2代、DH系、BC1F2或RIL群体中耐热结实率最好的若干单株，均和亲本同时进行割兜，并在室温下生长抽穗后，和轮回亲本进行回交，以构建耐热近等基因系。

优选地，在步骤(1)中，所述F2代是通过亲本杂交得到的F1代单株自交获得的；所述的单株自交采用套袋自交。

优选地，在步骤(2)中，所述的育苗基质为营养土；所述营养液为0.5X的MS营养液。

优选地，在步骤(2)中，播种所述F2代、DH系、BC1F2或RIL种子600～700粒。

优选地，步骤(2)中，所述F2代、DH系、BC1F2或RIL种子播种的行距和列距为4厘米×4厘米；所述穴盘为128目穴盘。

优选地，在步骤(2)中，所述水稻适宜的生长条件为：28～32℃且75％的空气相对湿度。

优选地，在步骤(3)中，在保留1个有效分蘖时，去除多余的分蘖及其叶片；所述容器在群体见穗前1天移入人工气候室。

优选地，在步骤(3)中，所述差异较大指抽穗时间相差7天以上。

优选地，在步骤(3)中，所述耐热筛选处理在9:00-16:00时段设定温度为37～38℃，16:00-9:00时段设定温度为28～30℃。

优选地，在步骤(3)中，所述留桩为15cm。

本发明的高通量的耐热水稻筛选方法，解决了问题，具有以下优点：

(1)本发明的方法是一种进行水稻遗传群体开花期耐热性状的高通量表型筛选方法，其适合进行遗传群体单株耐热表型筛选，可以对所有的遗传分离群体迅速、可靠地进行高通量化的花期耐热筛选；同时，该方法也可作为耐热育种的筛选方法；

(2)本发明的方法不仅实现了利用人工气候室进行遗传分离大群体的花期耐热表型筛选，而且保证了筛选的效果和效率，本发明应用3年的数据表明，耐热表型筛选的正确率可达到95％以上；

(3)本发明的采用单株的行距和列距为4厘米×4厘米，该设计通过密植保证了人工气候室内单位面积的植株量较大，从而在面积有限的人工气候室中可对较大群体进行高温抗性筛选；

(4)本发明提高了空间利用率，可利用几平方米的人工气候室空间实现水稻大群体(600株以上)的高温抗性筛选和鉴定，远远高于传统的田间鉴定方法。

(5)本发明的方法采用合理密植，既能保证群体单株正常抽穗，又大大减少了后期结实率统计的工作量；密植后，控制单株的有效分蘖，见穗前保留1个分蘖，后期结实率统计工作量为1个单穗，为传统耐热鉴定方法中统计2-3个分蘖减少了50-66％的工作量，故该方法实现了水稻花期耐热鉴定的高通量化；

(6)本发明的方法提供了解决水稻遗传分离大群体可能产生的单株间抽穗期不同而导致鉴定时间不一致的问题，该方法采用群体齐穗后，统一割兜，并一致留桩，可以保证分离群体单株的再生穗在较一致的时期内抽穗，确保了单株耐热鉴定表型数据的可靠性。

具体实施方式

术语解释：

近等基因系：指一组遗传背景相同或相近，而某个特定性状或其遗传基础有差异的一组品系。

分蘖：指禾本科等植物在地面以下或近地面处所发生的分枝。

水稻的生长发育：水稻的一生要经历两个时期：营养生长和生殖生长，其中，营养生长期主要包括：秧苗期和分蘖期；生殖生长期包括：拔节孕穗期、抽穗开花期和灌浆结实期。

秧苗期：指种子萌发开始到拔秧这段时间。

分蘖期：指秧苗移栽返青到拔节这段时间，分蘖前期产生有效分蘖，这一时期称有效分蘖期，而分蘖后期所产生的是无效分蘖，称无效分蘖期。

有效分蘖：水稻返青后分蘖开始发生，直到开始拔节时分蘖停止，一部分分蘖具有一定量的根系，以后能抽穗结实，称为有效分蘖。

无效分蘖：一部分出生较迟的分蘖以后不能抽穗结实或渐渐死亡，这部分分蘖称为无效分蘖。

拔节孕穗期：指幼穗分化开始到长出穗为止。

抽穗开花期：指稻穗从顶端茎鞘里抽出到开花齐穗这段时间。

灌浆结实期：指稻穗开花后到谷粒成熟的时期，又可分为乳熟期、蜡熟期和完熟期。

回交：指亲本杂交产生的杂种再与亲本之一进行杂交；一般在第一次杂交时选具有优良特性的品种作母本，而在以后各次回交时作父本，这亲本在回交时叫轮回亲本。

DH系：也称DH群体、纯系群体，指由单倍体加倍获得的双单倍体，可直接用于育种，极大地缩短育种周期。

BC1F2群体：指回交一代自交两代获得的群体。

RIL群体：Recombinant Inbred Lines，重组自交系，生物学中用于遗传分析及作图的一类群体，由F2群体的个体多代自交产生，群体中每个株系都是纯合的。

以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

一种高通量的耐热水稻筛选方法，该方法包含：

(1)以开花期热敏感水稻为受体材料，以耐热水稻为供体材料，将两者杂交得到F1代种子，种植F1代种子，并进行单株自交，得到F2代种子；

(2)将F2代、DH系、BC1F2或RIL种子消毒、浸种、催芽处理后，播种在铺好育苗基质的穴盘中密植，穴盘置于含有水或营养液的容器中，在水稻适宜的生长条件下进行秧苗培育，得到F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体；将亲本和F1代群体也按照对F2代、DH系、BC1F2或RIL种子的处理方法种植，作为筛选实验的对照；

(3)待F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体长至拔节孕穗期时，每个单株只保留1个有效分蘖，若群体内单株抽穗期相近，则在群体见穗前，将容器移入人工气候室，设定分离群体的耐热筛选处理温度：白天温度一时间段为37～38℃，晚上温度一时间段为28～30℃，待所有分蘖全部抽穗、开花完毕，将容器移出人工气候室，让群体在正常环境下灌浆结实；

(4)若群体中单株的抽穗期差异较大，则让群体在正常环境中全部抽穗完毕时，将群体整体割兜，留桩，待群体一起再抽穗时，按照步骤(3)进行耐热筛选处理；

(5)待F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体的单株的单穗蜡熟后，将单株编号，收获每个单株的单穗，进行单穗的耐热结实率(耐热结实率＝实粒数/总粒数×100％)统计，完成群体单株的耐热表型筛选，同时对单株的叶片按编号冷冻保存，作为基因分型时提取单株DNA备用；

(6)将亲本和F1代群体按照步骤(3)-(5)处理，待F2代遗传分离群体、亲本和F1代群体的耐热结实率统计结束，根据耐热结实率表现依次选择F2代、DH系、BC1F2或RIL群体中耐热结实率最好的若干单株，均和亲本同时进行割兜，并在室温下生长抽穗后，和轮回亲本进行回交，以构建耐热近等基因系。

进一步地，在步骤(1)中，F2代是通过亲本杂交得到的F1代单株自交获得的；单株自交采用套袋自交。

进一步地，在步骤(2)中，育苗基质为营养土；营养液为0.5X的MS营养液。

进一步地，在步骤(2)中，播种F2代、DH系、BC1F2或RIL种子600～700粒。

进一步地，步骤(2)中，F2代、DH系、BC1F2或RIL种子播种的行距和列距为4厘米×4厘米；穴盘为128目穴盘。

进一步地，在步骤(2)中，水稻适宜的生长条件为：28～32℃且75％的空气相对湿度。

进一步地，在步骤(3)中，在保留1个有效分蘖时，去除多余的分蘖及其叶片；容器在群体见穗前1天移入人工气候室。

进一步地，在步骤(3)中，差异较大指抽穗时间相差7天以上。

进一步地，在步骤(3)中，耐热筛选处理在9:00-16:00时段设定温度为37～38℃，16:00-9:00时段设定温度为28～30℃。

进一步地，在步骤(3)中，留桩为15cm，有利于高位分蘖芽生长和抽穗。

本发明的方法利用密植控蘖技术，显著减少了群体的种植面积，采用割兜，解决了分离群体抽穗不整齐的问题。由于在人工气候室进行，加上直播和密植，鉴定周期比传统的大田盆栽要短，且可以全年进行，统计工作量大大减少，鉴定条件的一致性和稳定性增加，数据的可重复性也增加，可对分离世代的水稻遗传大群体进行高效的耐热性筛选，实现了耐热表型筛选的高通量化。

实施例1

材料来源：

不抗高温的水稻材料华润2号：由发明人湖北省农业科学院粮食作物研究所选育，2014年获湖南省审定。

抗高温水稻WD16343：为非洲耐热资源材料。

不抗高温的水稻材料9311：由江苏里下河农科所选育。

营养液：0.5X的MS营养液(NH₄NO₃:825mg/L,KNO₃:950mg/L,CaCl₂·2H₂O:220mg/L,MgSO₄·7H₂O:185mg/L,KH₂PO₄:85mg/L)

一种高通量的耐热水稻筛选方法，该方法以不抗高温的水稻材料华润2号和9311作为受体材料，抗高温水稻WD16343为供体材料，依次按照以下步骤进行：

(1)2015年夏季，在武汉分别以9311和华润2号为母本，WD16343为父本，进行杂交得到两个组合(“9311/WD16343”和“华润2号/WD16343”)的F1代种子，冬季在海南种植F1代，每个组合种植40株F1代植株，收获F1代单株自交种子，获得F2代种子；

(2)2017年春，分别于2月20、3月20日、4月20日将收获保留的不同F2代种子经强氯精消毒、无菌水浸种，再催芽，以保证种子发芽率，防止种苗后期发生病虫害；在武汉播种于方形塑料盒，每个F1单株来源的种子至少需要播种600颗种子于128目穴盘，温室中长成F2代水稻群体，用水和营养液浇灌，直到孕穗期，然后对所有单株进行修整，每个单株只保留1个有效分蘖；

(3)2月20日播种的F2代水稻群体在5月底开始抽穗，其中“华润2号/WD16343”组合的F2代水稻群体抽穗期较整齐，直接进行37-38℃的高温处理；另一个组合：“9311/WD16343”的群体由于单株抽穗期时间差异较大，待6月下旬F2群体齐穗后，再整体割兜留桩15厘米等待再生，待7月20日群体再生穗统一见穗，进行花期高温处理：见穗前设置人工气候室温度为37-38℃开始进行耐热筛选，直到群体抽穗完毕，移出高温处理气候室；

待群体灌浆结实后，对其他播种批次的群体按照上述割兜再生处理，在统一见穗后依次排队进行花期高温处理，其中“华润2号/WD16343”的F2代水稻群体抽穗较整齐，直接进行上述花期高温处理，不用割兜；

到8月中旬，所有批次的分离群体处理完毕；

(4)9月初，单株编号，收获结实单穗，并保留叶片冷冻保存备用；

(5)对单株的结实率进行统计，以及完成花期高温处理后的表型数据收集；

(6)根据统计结果，按耐热结实率表现依次选取群体中结实率最高的5株单株，再在温室中抽穗后，和热敏感亲本华润2号回交，构建后续耐热基因定位需要用的近等基因系。

通过应用3年的数据表明，耐热表型筛选的正确率可达到95％以上。

综上所述，本发明的高通量的耐热水稻筛选方法利用密植控蘖技术，显著减少了群体的种植面积，并采用割兜后统一抽穗，迅速、可靠地进行高通量耐热筛选。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (4)

1.一种高通量的耐热水稻筛选方法，其特征在于，该方法包含：

（1）以开花期热敏感水稻为受体材料，以耐热水稻为供体材料，获得F2代、DH系、BC1F2或RIL种子；

（2）将所述F2代、DH系、BC1F2或RIL种子消毒、浸种、催芽处理后，播种在铺好育苗基质的穴盘中密植，所述穴盘置于含有水或营养液的容器中，在水稻适宜的生长条件下进行秧苗培育，得到F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体；将亲本和F1代群体也按照所述F2代、DH系、BC1F2或RIL种子的处理方法种植，作为筛选实验的对照；

（3）待所述F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体长至拔节孕穗期时，每个单株只保留1个有效分蘖，若群体内单株抽穗期相近，则在群体见穗前，将所述容器移入人工气候室，设定分离群体的耐热筛选处理温度：白天温度一时间段为37~38℃，晚上温度一时间段为28~30℃，待所有分蘖全部抽穗、开花完毕，将所述容器移出人工气候室，让群体在正常环境下灌浆结实；

（4）若群体中单株的抽穗期差异较大，则让群体在正常环境中全部抽穗完毕时，将群体整体割兜，留桩，待群体一起再抽穗时，按照步骤（3）进行耐热筛选处理；

（5）待所述F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体的单株的单穗蜡熟后，将单株编号，收获每个单株的单穗，进行单穗的耐热结实率统计，完成群体单株的耐热表型筛选，同时对单株的叶片按编号冷冻保存，作为基因分型时提取单株DNA备用；

（6）将所述亲本和F1代群体按照步骤（3）-（5）处理，待所述F2代、DH系、BC1F2或RIL遗传分离群体、亲本和F1代群体的耐热结实率统计结束，根据耐热结实率表现依次选择F2代、DH系、BC1F2或RIL群体中耐热结实率最好的若干单株，均和亲本同时进行割兜，并在室温下生长抽穗后，和轮回亲本进行回交，以构建耐热近等基因系；

在步骤（2）中，播种所述F2代、DH系、BC1F2或RIL种子600~700粒；

在步骤（2）中，所述F2代、DH系、BC1F2或RIL种子播种的行距和列距为4厘米×4厘米；所述穴盘为128目穴盘；

在步骤（3）中，在保留1个有效分蘖时，去除多余的分蘖及其叶片；所述容器在群体见穗前1天移入人工气候室；

在步骤（4）中，所述差异较大指抽穗时间相差7天以上；

在步骤（3）中，所述耐热筛选处理在9:00-16:00时段设定温度为37~38℃，16:00-9:00时段设定温度为28~30℃；

在步骤（4）中，所述留桩为15cm。

2.根据权利要求1所述的高通量的耐热水稻筛选方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述F2代是通过亲本杂交得到的F1代单株自交获得的；所述单株自交采用套袋自交。

3.根据权利要求1所述的高通量的耐热水稻筛选方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的育苗基质为营养土；所述营养液为0.5X的MS营养液。

4.根据权利要求1所述的高通量的耐热水稻筛选方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述水稻适宜的生长条件为：28~32℃且75%的空气相对湿度。