CN104026001B

CN104026001B - 一种杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种的方法

Info

Publication number: CN104026001B
Application number: CN201410232872.0A
Authority: CN
Inventors: 高中山; 贾慧敏; 汪国云; 柴春燕; 焦云
Original assignee: Yuyao City South Characteristic Fruit Tree Research Institute; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Yuyao City South Characteristic Fruit Tree Research Institute; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2034-05-28
Also published as: CN104026001A

Abstract

本发明公开了一种杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种的方法，包括：以荸荠为母本，以东魁的雄花为父本，在荸荠盛花期授粉；待果实成熟后采集种子，将种子置于5℃下贮藏后播种，获得F₁代植株；从F₁代植株中筛选出真杂种。本发明首次实现了杨梅栽培品种荸荠和东魁的品种间杂交，并获得基因型确定的真杂种，为选育杨梅新品种提供了新技术途径；本发明通过扩增F₁代的特异表达SSR标记，对杂交后代进行杂种鉴定，鉴定过程简便快速、成本低，鉴定结果稳定可靠，填补了杨梅品种间杂交后代分子生物学鉴定技术的空白。

Description

一种杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种的方法。

背景技术

杨梅(MyricarubraSieb.&Zucc.)为杨梅科杨梅属植物，是我国南方的特色水果。2013年全国杨梅栽培面积达到30万公顷，产量120万吨，产值100亿元，主要分布在我国浙江，江苏、福建、江西、湖南、广东、贵州和云南各省，其中浙江的面积和产量为最，分别达到8万公顷和38.8万吨。杨梅果实中富含丰富的花青苷，具有较高的营养价值而被广泛关注。另外，杨梅作为山区造林绿化的“先锋树种”之一，具有保持水土、净化空气、增加收入等作用。

杨梅为雌雄异株植物，少有雌雄同株。杨梅花小，单性，无花被，为风媒花，雌花为葇荑花序，雌花自3月上旬至4月初渐次开放，3月中旬为盛花期，花期约20天。雄花为复葇荑花序，自2月下旬至4月上旬陆续开放，3月上旬为盛花期，花期长约45天。

目前杨梅产业生产以及广泛推广的两个品种是原产浙江省的荸荠和东魁。荸荠果实较小，色黑，肉质细软，味甜、浓香，品质优，鲜食与加工兼宜，不耐贮。东魁杨梅果实大，红色，肉质较硬，味酸、香气淡，较耐贮运，但沿海地区易发生裂果。此外在过去的10多年有一些选育的实生品系，如早荠蜜梅、晚荠蜜梅、甬选56，乌紫、黑晶、慈荠、洞庭细蒂等，都是来源于自然实生优系，与现有品种较为接近，没有重大突破，目前在生产上推广应用较少。

现代杨梅产业发展，急需培养特别创新性品种。杂交育种是品种培育的主要途径，通过杂交使得杂交亲本的遗传基础通过重组、分离和后代选择，育成有利基因更加集中的新品种。目前报道的杨梅杂交育种为栽培杨梅和矮杨梅，其目的在于改善树体矮化和提高砧木适应性。然而栽培品种之间的杂交目前尚未报道，其主要原因是由于杨梅栽培品种均为雌株，不易实现栽培品种的种间杂交。如果以普通的雄株进行杂交，那么杂交后代的果实品种没法预测，而且将有较大比例的雄株后代，育种效率低。

对于如何辨别F₁代为杂交种，早期主要依赖于各种形态标记从而将杨梅进行分类，然而杨梅作为多年生植物，基因型高度复杂，有性时间太长，通过形态标记进行筛选和分类耗时太长。近年来，随着分子标记的不断开发，应用共显性SSR分子标记对杨梅的遗传多样性和品种特异性指纹进行研究，同时进一步明确杨梅品种间的亲缘关系。为对F₁代进行杂种鉴定提供了基础。

发明内容

本发明提供了一种杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种的方法，首次实现了杨梅栽培品种的种间杂交，为选育新杨梅品种提供了新技术途径。

一种杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种的方法，包括：

(1)以荸荠为母本，以东魁的雄花为父本，在荸荠盛花期授粉；

(2)待果实成熟后采集种子，将种子置于5℃下贮藏后播种，获得F₁代植株；

(3)从F₁代植株中筛选出真杂种。

本发明的申请人偶然发现杨梅栽培品种东魁的植株上出现了雄花突变，并通过扩增SSR分子标记进行了确认。因此采集了雄性化枝条上的花粉，对荸荠雌花进行授粉，使得杨梅栽培品种荸荠和东魁种间杂交育种成为可能，填补了杨梅栽培品种种间杂交育种的空白。从F₁代植株中筛选出真杂种，即为本发明杂交育种想要获得的杨梅品种间杂交苗，在此基础上可以选择兼具两个亲本优良性状的新品种。

文献(朱天富，王荣飞，甘建平，何天良，陈建伟.东魁杨梅雌株雄性化与补救效果.浙江柑橘.2004年.21(4):28.)中记载，东魁杨梅出现雌株雄性化可能是因树体的水分供应不足和营养吸收失调所致的，供水不足造成树体的营养积累和运输的不良，严重影响花芽发育，甚至使有些雌株上的花芽萎缩。由于生物体的雌雄性共同存在，只不过是显性和隐性而已。所以当显性的雌花萎缩后，原来隐性的雄花就凸显出来了。

由此可见，东魁杨梅出现雌株雄性化一般是受环境影响，雌株上虽然出现雄花，但其基因组构成并未发生变化，当利用该东魁雄花向荸荠雌花授粉后，获得的F₁代植株基本均为雌株，将来会开雌花结果，很少出现雄花，从而大大提高育种效率。

具体地，本发明的杂交育种方法包括：

具体地，在荸荠初花期前5天，对荸荠枝条进行套袋(羊皮纸袋)；采集即将开放的东魁雄花，置于室内等待雄花开放并收集花粉；在荸荠盛花期进行授粉。

授粉可通过以下方法进行：先在套袋上插一个授粉孔(用注射器针头)，再用注射器(抽到最大量程)的针头蘸取花粉并将针头插入授粉孔，按压注射器将花粉喷射在袋内，同时轻轻抖动荸荠杨梅枝条，使花粉均匀地散落到雌花花柱上，最后用胶带封好授粉孔。

待杨梅果实膨大后去袋(大约在授粉后15天)，待杨梅果实完全成熟后采果，去除果肉取种子，用清水清洗干净，待种子阴干后放在冰箱冷藏室(温度设置为5℃)中贮藏11个月。

低温贮藏能有效解除种子休眠，在低温贮藏期间，种子中的抑制生长物质(脱落酸)含量下降，而刺激生长物质如赤霉素和细胞分裂素的含量则增加，有利于播种后提高种子发芽率。

播种时间选择在5月底，将种子用水浸泡1天，播种于育苗盆的泥炭蛭石土(将泥炭与蛭石以体积比5：1混合均匀)中，播种深度2cm。在育苗盆上覆盖四层报纸，避雨放置，同时保持育苗盆的土壤湿度。待第二年3月待种子萌发，长出2片真叶后再移栽至营养钵中。泥炭蛭石土中含有大量有机质，疏松，质轻，透气透水性能好，保水保肥能力强，无病害孢子和虫卵，有利于种子萌发。

(3)提取F₁代植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用SSR引物进行PCR扩增，根据扩增片段大小进行杂种鉴定，筛选出真杂种；

由于幼嫩的叶片新生组织中次生代谢物较少、DNA含量高、易于破碎，因此优选采集F₁代植株的幼嫩叶片并采用CTAB法以提取基因组DNA。

所述SSR引物有两对，其中，

第一对SSR引物(MRU155)为：

上游引物：5’-GATCTGATGGTCTAGAACGCAC-3’；

下游引物：5’-GTTTGAAAGCTTCTTTCCCTGGTG-3’；

第二对SSR引物(my0972)为：

上游引物：5’-GGAATCATCGAAGCCAGAAAA-3’；

下游引物：5’-TAAACAAAGAAATGCCAGAGGAAAG-3’。

从张水明等(ZhangSM,XuCJ,GaoZS,ChenKS,WangGY，DevelopmentandcharacterizationofmicrosatelitemarkersforChinesebayberry(MyricarubraSieb.&Zucc.)，ConservationGenetics,2009,10：1605-1607)已报道过的杨梅SSR引物中筛选出了MRU155引物和my0972引物，利用这两对引物对亲本进行PCR扩增时，母本与父本的扩增产物条带大小(基因型)均不相同，因此通过鉴定F₁代植株的基因型，即可进行杂种鉴定。F₁代植株的扩增产物中若含有任一父本具有的特异条带，则为真杂种，反之则为假杂种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明首次实现杨梅两个亲缘关系较远的优良栽培品种荸荠和东魁之间的杂交，并可以检测确认获得真正杂交后代，为选育杨梅新品种提供了新技术途径，可广泛用于今后的杨梅种质创新、杂交育种等；

(2)本发明通过扩增F₁代的特异表达SSR标记，对杂交后代进行杂种鉴定，鉴定过程简便快速、成本低，鉴定结果稳定可靠，填补了杨梅品种间杂交后代分子生物学鉴定技术的空白。

附图说明

图1a为杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种中套袋时的图片；

图1b为杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种中授粉时的图片；

图1c为杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种中授粉后的图片；

图2a为荸荠授粉10天后子房膨大的情形；

图2b为杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交果实膨大(授粉15天后)的图片；

图2c为杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种中未授粉的空白对照去袋后的图片；

图3a为梅栽培品种荸荠和东魁种交育种中采收的杂交果实图片；

图3b为梅栽培品种荸荠和东魁种交育种中F₁代幼苗的图片；

图4a为梅栽培品种荸荠和东魁种交育种中母本荸荠的扩增片段大小检测图；

图4b为梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种中父本东魁的扩增片段大小检测图；

图4c为梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种中真杂种BD-34的扩增片段大小检测图；

图4d为梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种中假杂种BD-40的扩增片段大小检测图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

一种杨梅栽培品种荸荠和东魁种间杂交育种的方法，包括：

具体包括：

①套袋：于2011年4月1日，选择花芽饱满较多、光照条件较好的荸荠种杨梅枝条进行套袋(羊皮纸袋)，共套袋120个(图1a)；

②花粉采集：于2011年4月2日,在野外采集即将开放的东魁种杨梅突变雄枝(雄性化枝条)，带回实验室将花苞摊放到羊皮纸上，使花粉开放散落于硫酸纸上，阴干并收集到小玻璃瓶中密封，放置于-80℃冰箱中保存；

③授粉：于2011年4月11日对荸荠种杨梅进行授粉，此时为荸荠种杨梅雌花的盛花期；

授粉方法是先将套袋上面弄出一个小的授粉孔，将注射器抽到最大量程后，用针头蘸取少量花粉，小心插入授粉孔并注射，在袋内的杨梅枝条上部轻轻抖动，使花粉均匀的散落到雌花花柱上(图1b)；以套袋不授粉为对照CK1。然后用胶布封好授粉孔，挂上标签(图1c)；

④去袋：授粉后10天检查发现子房膨大(图2a)，于2011年4月26日在杨梅果实膨大后去袋(图2b)，同时发现对照CK1没有果实(图2c)，然后挂好标签。

(2)待果实成熟后采集种子，对种子进行层积处理后播种，获得F₁代植株；

具体包括：

①采果并层积处理：果实完全成熟后，于2011年6月21日采果(图3a)，将果肉去除干净后，阴干，然后放置于5℃冰箱贮藏到次年5月20日；

②播种：在5月21日将种子用清水浸泡1天，将杨梅种子播种于育苗盆的泥炭蛭石土(泥炭与蛭石以体积比5：1均匀混合)中。

③采叶：待种子萌发并长出2片叶子后移栽到营养钵中，待长出5-6片叶子后，采集新叶(图3b)；同时采集杂交母本与父本幼叶用液氮处理后放置于-80℃冰箱。

(3)提取F₁代植株和亲本幼叶的基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用SSR引物进行PCR扩增，根据扩增结果进行杂种鉴定，筛选出真杂种；

具体包括：

1)提取基因组DNA

用CTAB法分别提取117个杂交后代和2个父母本的基因组DNA，具体方法如下：

①配制缓冲液：

CTAB溶液：2％CTAB，0.1MTris，20mMEDTA，1.4MNaCl，pH＝8.0；

TE缓冲液：10mMTris；1mMEDTA；pH8.0；

②用天平迅速称取约1.0g贮藏于-80℃冰箱中的杨梅幼嫩叶片组织，加少许PVP防止氧化，用液氮于研钵中充分研磨后将粉末快速转入盛有在65℃预热的4mlCTAB溶液与80μlβ-巯基乙醇的10ml离心管中，65℃水浴1h；

③向步骤②得到的混合物中加入4ml氯仿/异戊醇(24:1，V/V)，混匀，12,000rpm离心10min，取上清液于新10ml管中，再次加入4ml氯仿/异戊醇(24:1，V/V)，混匀，12,000rpm离心10min；

④将步骤③离心后所得的上清液转入新10ml管，并加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，在-20℃放置30min至DNA沉淀。10,000rpm离心2min，弃上清液；

⑤用75％的乙醇清洗步骤③得到的DNA沉淀物3次；

⑥将步骤⑤洗涤后的DNA晾干并溶于200μl的TE缓冲液中，加入2μlRNAase酶(10mg/ml)以除去RNA；

DNA检测采用紫外分光光度计(Beckmancoulter，USA)，确定其浓度和质量，同时取2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测；DNA原液保存于-20℃，工作液稀释为20ng/μl，备用。

2)引物筛选

从张水明等已报道过的杨梅SSR引物中筛选出两对SSR引物，由上海英潍捷基贸易有限公司合成；引物信息如表1。

表1

这两对SSR引物所扩增的SSR分子标记的基因型在父本和母本上均不相同，因此可用于对杂交后代进行杂种鉴定。

3)PCR扩增及产物检测

以各样本的基因组DNA为模板，分别利用上述SSR引物，进行PCR扩增，对2个亲本及其后代进行基因型检测，包括：

①反应体系：共20μl，包括：10×PCRbuffer(Mg²⁺)2μl，2mMdNTP0.2μl，5UrTaqDNApolymerase0.1μl，20ng/μlDNA模板1μl，去离子水16.7μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl；

②反应程序：94℃预变性5min，94℃(30s)/引物退火温度(30s)/72℃(30s)，35个循环，最后72℃延伸10min；

③扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测，紫外灯下观察并照相记录结果；

④将检测好的带有4种颜色的荧光产物分别吸取4μl混合均匀后吸取3μl加入到加有12μlFormamide和0.3μlLIZ500(75-500bp)荧光内标的96孔ABI3130上样板中，95℃变性5min，在ABI3130测序仪上进行毛细管电泳分析，利用Genemapper4.0软件进行片段大小读数，片段大小的读取结果见表2。

表2利用两个SSR标记鉴定杂交后代的真实性

由表2可见，在MRU11位点，荸荠的基因型为106/110，东魁的基因型为116/116，因此在MRU11位点，真杂种的基因型为160/116或者110/116；在my0972位点，荸荠的基因型为220/224，东魁的基因型为234/234，因此真杂种的基因型为220/234或224/234。因此扩增出其他片段大小的后代均为假杂种。对获得的117份杂交F₁代进行扩增检测后发现有89个后代为真杂种，28个后代为假杂种，真杂种占全部杂交F₁代的76％。

Claims

1.一种杨梅栽培品种荸荠和东魁杂交育种的方法，包括：

具体为：在荸荠初花期前5天，对荸荠枝条进行套袋；采集即将开放的东魁雄花，置于室内等待雄花开放并收集花粉；在荸荠盛花期进行授粉；

授粉的方法为：先在套袋上插一个授粉孔，再用注射器的针头蘸取花粉并将针头插入授粉孔，按压注射器将花粉喷射在袋内，同时轻轻抖动荸荠杨梅枝条，使花粉均匀地散落到雌花花柱上，最后用胶带封好授粉孔；

具体为：待杨梅果实膨大后去袋，待杨梅果实完全成熟后采果，去除果肉取种子，用清水清洗干净，待种子阴干后放在冰箱冷藏室中贮藏11个月；

其中，冰箱冷藏室的温度设置为5℃；

播种时间选择在5月底，将种子用水浸泡1天，播种于育苗盆的泥炭蛭石土中，播种深度2cm；在育苗盆上覆盖四层报纸，避雨放置，同时保持育苗盆的土壤湿度；待第二年3月待种子萌发，长出2片真叶后再移栽至营养钵中；

所述泥炭蛭石土是将泥炭与蛭石以体积比5：1混合均匀获得的；

(3)从F₁代植株中筛选出真杂种；

具体为：提取F₁代植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用SSR引物进行PCR扩增，根据扩增结果进行杂种鉴定，筛选出真杂种；

其中，基因组DNA的提取方法为：采集F₁代植株的幼嫩叶片并采用CTAB法以提取基因组DNA，

所述SSR引物有两对，其中，

第一对SSR引物为：

上游引物：5’-GATCTGATGGTCTAGAACGCAC-3’；

下游引物：5’-GTTTGAAAGCTTCTTTCCCTGGTG-3’；

第二对SSR引物为：

上游引物：5’-GGAATCATCGAAGCCAGAAAA-3’；

下游引物：5’-TAAACAAAGAAATGCCAGAGGAAAG-3’。